MİKROBİYOLOJİK TARAMA SİSTEMLERİ VE MEKANİZMALARI. Dr. Nafiz KOÇAK GATA Haydarpaşa Eğt.Hst.

Transkript

1 MİKROBİYOLOJİK TARAMA SİSTEMLERİ VE MEKANİZMALARI Dr. Nafiz KOÇAK GATA Haydarpaşa Eğt.Hst.

2 Mikrobiyolojik donör tarama testleri Transfüzyonla bulaşan enfeksiyonlar yönünden bağışlanan kanların taranması, kan güvenliği ve kullanılabilirliği stratejilerinin bir parçasını oluşturmaktadır.

3 Son 30 yıl içinde kan taramalarında kullanılmak üzere çeşitli tipte mikrobiyolojik testler geliştirilmiştir. En yaygın kullanılan testler enfeksiyon ajanlarına karşı oluşan antikor, antijenler veya nükleik asiti belirlemek üzere tasarlanmışlardır. Geliştirilmiş olan bütün testler her durum için uygun olmayıp, her bir testin kısıtlamaları mevcuttur, bu sebeple test seçerken bunların göz önünde bulundurulması gerekmektedir.

4 Kan taramasında kullanılan başlıca test tipleri İmmuntestler Enzim immunassay (EIA) Kemilüminesans immunoassay (CLIA) Hemaglutinasyon (HA)/partikül aglutinasyon (PA) testleri Hızlı/ basit tek kullanımlık testler (hızlı testler) Nükleik asit amplifikasyon teknolojisi (NAT) prensibine dayanan testler

5 Testlerin Duyarlılık, özgüllük, Maliyet Kolay kullanım gibi kritik özeliklerine göre her bir enfeksiyöz etken için uygun test tipinin seçilmesi gerekmektedir. Ayrıca son zamanlarda test üreticileri, otomasyon ile duyarlılık ve özgüllükleri yükselen ürün geliştirmeye devam etmektedir.

6 FDA (Food and Drug Administration), kan kaynaklarının güvenliğinden emin olmak için lisanslı tarama testlerinin kullanılması gerektiğini ifade etmektedir

7 Kan donörlerinde enfesiyöz etken taramasında kullanılan testler Serolojik tarama testleri Nükleik asit testleri (NAT) HBsAg Anti-HBc Anti-HCV Anti-HIV-1 Anti-HIV-1/2 Anti-HIV-2 Anti-HTLV-I/II Anti- Treponema pallidum (Sifiliz antikorları) Anti-CMV Kombo testler Anti-HIV-1/2 testi ve HIV-1 Antigen HBV-DNA NAT HCV-RNA NAT HIV-1-RNA NAT West Nile Virus-RNA NAT Multipleks testler

8 Ülkemizde kullanılan mikrobiyolojik donör tarama testleri: Ülkemizde şu anda yürürlükte olan 9/1/2007 tarih ve sayılı Resmi Gazetede yayınlanmış olan Kan ve Kan Ürünleri Yönetmeliği ne göre Donör kanlarına uygulanan zorunlu mikrobiyolojik tarama testleri; HBsAg, anti-hcv, anti-hiv-1/2 sifiliz (RPR/VDRL) markırlarını içermektedir. Sağlık Bakanlığı tarafından onaylanmış test kitlerinden seçilmeli ve üretici firmanın önerdiği çalışma prosedürleri takip edilerek gerçekleştirilmelidir.

9 İmmunteknikler İmmunteknikler, antijen, antikor veya her ikisinin tespit edilmesinde kullanılabilen, çeşitli test formatlarında temin edilebilen test sistemleridir. Antikor belirleyen testler, Antijen belirleyen testler, donör örneğinde bulunan spesifik antikoru yakalayan immobilize antijenlerin kullanımına dayanmaktadır (indirekt immunoassay). örnekte bulunan patojene spesifik antijenleri yakalayan immobilize antikorların kullanımı prensibine dayanmaktadır. İmmunteknikler, orta ölçekli laboratuvarlarda tam otomasyon, küçük ölçekli laboratuvarlarda yarı otomasyon gibi farklı şekillerde kullanılabilmektedir.

10

11 Antikor belirleyen testler

12 Antijen belirleyen testler

13 Günümüzde en mekanizmaları yaygın kullanılan serolojik test Enzim immunassay (EIA) Kemilüminesans immunassay (CLIA) EIA ve CLIA ların tasarımı benzerdir. Sadece oluşan immun komplekslerin belirlenme şekli farklılık göstermektedir. EIA.renk oluşumu CLIA..kimyasal reaksiyonun ürettiği ışığın ölçümü değerlendirilmektedir. Yüksek duyarlılıktaki bu testlerden herhangi biri, kan taramalarının uygun bir şekilde değerlendirmesi için gerekli olan hedef enfeksiyon markırlarını belirlemektedir.

14 EIA ve CLIA CLIA;; Çok sayıda örneğin taranması için uygundur özel ekipman gerektirmektedir. Manuel veya özel olarak tahsis edilmemiş otomatize test sistemlerinde gerçekleştirilebilmektedir (açık sistem) Özel olarak belirli otomatize üretilebilmektedir (kapalı sistem) sistemler için de

15 EIA ve CLIA lar, antijen veya antikoru immobilize eden değişik katı fazlar içermektedir En yaygın kullanılan katı fazlar Polistiren mikrokuyucukların taban veya kenarları Polistiren veya diğer materyallerin yüzeyi Mikropartiküller Otomatize, kapalı test sistemlerinde kullanılan özel tek kullanımlık araçların yüzeyleri; bunlar üretici firmaya göre değişmekte olup, genelde polistiren yapıdadır

16 Günümüzde, kan kaynaklarının güvenliğinden emin olmak için kullanılan FDA lisanslı veya FDA tarafından açıklanmış zorunlu donör tarama testlerine ulaşılabilmektedir

17 Ticari test isim(leri) Yöntem Üretici Onay yılı EIA EIA EIA Abbott Laboratories Bio-Rad Laboratories Ortho-Clinical Diagnostics, Inc Abbott Laboratories 2006 Hepatit B virus (HBV) HBsAg testleri (Hepatit B yüzey antijenini belirler) Auszyme Monoclonal* Genetic Systems HbsAg EIA 3.0 ORTHO Antibody to HbsAg ELISA Test System 3 Abbott Prism HbsAg Assay CLIA *Donör tarama için lisans almıştır, ancak temin edilemeyebilir HBsAg nin rutin taraması, katı fazı Anti-HBs ile kaplı mikroplaklarda gerçekleşmektedir. EIA prensibi ile çalışan test örneğinde; enzimatik reaksiyon sonucu oluşan renk yoğunluğu mikroplak okuyucularında spektrofotometrik olarak okunmaktadır. CLIA prensibi ile çalışan test örneğinde; örnekler, fare monoklonal anti-hbs antikorları ile kaplı mikropartiküllerin bulunduğu reaksiyon kuyularında inkube olmaktadır. Mikropartiküllerdeki antijen-antikor kompleksi, akridinium ile işaretli (keçi) poliklonal anti-hbs konjugatı ile tespit edilmektedir.

18 Sandwich ELISA (antijen) 4. Substrat eklenir, renk gelişmesine neden olur 1. Ab kaplı mikroplak tabanı Y 3. Konjugat eklenir (genelde anti-insan Ab) Y 5. Renk gelişiminin (reaksiyonun) durdurulmasında genelde asit solüsyonu kull. OD okunur. 2. Hasta örneğinde Antijen (var ise) antikora bağlanır 5 3 1&2 4

19 Reaktif bulunan örnekler için doğrulama testi yapılmalıdır. HBsAg doğrulama testi, anti-hbs (insan) nötralizasyon yapılmaktadır. antikorlarının doğrulama kullanıldığı, lisanslı prosedürü ile Nötralizasyon testi doğrulanan örnekler HBsAg pozitif olarak kabul edilmektedirler.

20 Anti-HBc Testleri (Hepatit B kor antijenine karşı oluşan toplam antikorları (IgG+IgM) belirler) CORZYME* EIA Abbott Laboratories 1991 Ortho HBc ELISA Test System EIA Ortho-Clinical Diagnostics, Inc 1991 ABBOTT PRISM HBcore CLIA Abbott Laboratories 2005 *Donör tarama için lisans almıştır, ancak temin edilemeyebilir HBsAg den hemen sonra ortaya çıkan bu antikor, HBsAg temizlenmesini takiben tespit edilebilir hale gelir. HBsAg nin kaybolduğu ve anti-hbs nin ortaya çıkması geciktiğinde, anti-hbc; yakın zamanda geçirilmekte olan HBV enfeksiyonunun tek markırı olabilmektedir.

21 Donörlerde anti-hbc taranması (IgG ve IgM) rekombinant-hepatit B kor antijeni (rhbcag) ile kaplı plaklarda gerçekleştirilmektedir EIA prensibi ile çalışan test örneklerinde; Enzimatik reaksiyon sonucu oluşan renk yoğunluğu mikroplak okuyucularında spektrofotometrik olarak okunmaktadır. CLIA prensibi ile çalışan test örneklerinde, rekombinant HBc antijeni ile kaplı mikropartiküller kullanılır Antijen-antikor kompleksi akridinium ile işaretli insan anti-hbc konjugatı ile belirlenmektedir. Reaktif bulunan örneklerin tekrar test edilmesi gerekmektedir Tekrarında da pozitif bulunan donör örnekleri pozitif olarak kabul edilmektedir.

22 indirekt ELISA (antikor) Hasta serumundaki antikorlar antijen Substrat kullanımı ile renk değişimi Anti-human antikoru + -

23 ANTİ HCV TANISINDA ELISA TESTLERİ Her yöntemden bir sonra çıkan yeni jenerasyon kitler HCV serolojisini bir adım daha ileriye götürmüştür. 1 nci kuşak Rekombinant antijen C (NS3 ve NS4) HCV epidemiyolojisindeki ilk bilgiler bu testlerle elde edilmiştir. Duyarlılık ve özgüllükleri düşük olup, serokonversiyonu saptamada yetersiz testlerdir. Günümüzde kullanımdan kalkmış olan testlerdir. 2 nci kuşak Rekombinant antijenler C C-22 (kor bölg.) C-33-c (NS3) daha duyarlı ve özgül destekleyici testlere ihtiyaç var Herhangi bir 2 nci kuşak ELISA kiti ile alınan sonucun farklı bir antijenik yapı gösteren başka bir kit ile doğrulanması gerekmektedir. 3 üncü kuşak Rekombinant antijenler C C-22 (kor bölg.) C-33-c (NS3) NS5 antijenleri HCV genomunun uç bölgelerindeki antijenleri içerdiği için; infeksiyonun herhangi döneminde tanıyı daha olanaklı kılmaktadır. bir da

24 Hepatit C virus (HCV) Anti-HCV testleri (HCV ye karşı oluşan antikorları belirler) Chiron RIBA HCV 3.0 Strip Immunoblot Assay Abbott HCV EIA 2.0 Abbott PRISM HCV Ortho HCV Version 3.0 ELISA Test System SIA 1999 EIA Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc Abbott Laboratories CLIA Abbott Laboratories 2007 Ortho-Clinical Diagnostics, Inc 2009 EIA 2004

25

26 EIA ile çalışan test örneğinde; plak kuyu yüzeyleri rekombinant antijenleri ile kaplıdır. HCV protein Testte 3 rekombinant HCV antijeni kullanılmaktadır: (i) c22-3 proteini...kor bölgesi (ii) c200 proteini...ns3 ve NS4 (ii) NS5 proteini.hcv replikasyon enzimini (viral polimeraz) kodlayan, yapısal olmayan gen bölgesi

27 CLIA ile çalışan test örneğinde; Reaksiyon kuyularında mikropartiküller içerir. rekombinant antijenler ile kaplı Kullanılan rekombinant antijenler; c100-3 proteini...ns3 ve NS4 HCr43 proteini...kor (1-150 aa) ve NS3 ( aa ) NS5 proteini ( aa) Ag-Ab kompleksi, akridinium ile işareti konjugat (anti-insan IgG) ile belirlenir. Reaktif sonuçlar tekar edilir. Tekrar testlerinde de reaktif bulunan donasyon örneklerin doğrulaması; Kalitatif RIBA-immunblot strip test (SIA) ile yapılır.

28 İnsan immun yetmezlik virus (HIV)-1 ve -2 Anti-HIV-1/2 Testleri (HIV tip 1 ve2 ye karşı oluşan antikorları belirler) Genetic Systems HIV-1/HIV-2 Plus O EIA HIVAB HIV-1/ HIV-2 (rdna) EIA ABBOTT PRISM HIV O Plus EIA Bio-Rad Laboratories 2003 EIA Abbott Laboratories 2004 CLIA Abbott Laboratories 2009 Anti-HIV-1 testleri (HIV-1 e karşı oluşan antikorları belirler) Genetic Systems rlav EIA HIV-1 (Western Blot) EIA EIA Bio-Rad Laboratories Cambridge Biotech Corp Bio-Rad Laboratories 1990 Anti-HIV-2 testi (HIV-2 ye karşı oluşan antikorları belirler) Genetic Systems HIV-2 EIA EIA

29 EIA test örneği (1); HIV-1 ve HIV-2 env (zarf) HIV-1 ve HIV-2 pol (polimeraz) gen ürünlerinin korunmuş immunodominant bölgelerinden üretilmiş sentetik 4 peptit karışımı kullanılmaktadır. EIA test örneği (2); HIV-1 kor ve env HIV-2 env viral proteinlerinden üretilen rekombinant DNA (rdna) kullanılmaktadır HIV-1/2 ye karşı oluşan IgG ve IgM antikorlarını birlikte belirleyebilmektedir. CLIA test örneği; HIV-1 grup M env, HIV-1 grup O env HIV-2 env viral proteinlerinden üretilmiş rdna HIV-2 env sentetik peptidi kullanılmaktadır.

30 Reaktif bulunan örnekler, tekrar testine alınmalı İkinci testte de reaktif bulunduklarında doğrulama testlerinin yapılması gereklidir. Doğrulama testi, HIV-1 Western blot yöntemi Ancak test HIV-1 ve HIV-2 yapamamaktadır. reaktivitesinin ayrımını

31 HIV-1/2 taramasında son yıllarda kullanıma giren kombo test örnekleri; Kemilüminesans mikropartikül immunassay (CMIA) veya EIA prensibi ile çalışmaktadır. Ticari test isim(leri) Yöntem Anti-HIV-1/2 ve HIV-1 antijen testi ARCHITECT HIV Ag/Ab Combo CMIA Üretici Abbott Laboratories Bio-Rad GS HIV Ag/Ab Combo EIA EIA Bio-Rad Laboratories Chemi-luminescent Microparticle Immunoassay (CMIA) Onay yılı

32 CMIA HIV p24 antijeni + HIV-1 (grup M ve grup O) ve/veya HIV-2 antikorlarının birlikte kalitatif belirlenmesine imkan tanımaktadır. Sonuçlar kemilüminesan reaksiyonun ölçülmesi ile elde edilmektedir. EIA HIV-1 p24 antijeni + HIV-1 (grup M ve O) + HIV-2 antikorlarını taramaktadır

33 Reaktif bulunan örneklerde test tekrarı yapılmaktadır. Tekrarda reaktif bulunan örnekler büyük ihtimal pozitif olarak kabul edilmektedir. Ancak enfeksiyonun düşük prevelansta görüldüğü yerlerde non-spesifik reaksiyonlardan dolayı, immun blot testleri, antijen testleri HIV NAT ile doğrulanması gerekmektedir. Kombo testler akut veya primer HIV-1/2 enfeksiyonunun tanısını desteklemek için kullanılmaktadır. Kombo test ile reaktif bulunan sonuçlarda belirlenen p24 antijeni, HIV-1 veya HIV-2 antikor ayrımı yapılamamaktadır. Şu an donör serum veya plazma örneklerinin taranmasında etkinlikleri tam olarak ortaya konulmadığı için rutin kullanımları yoktur.

34 Human T-Lymphotrophic Virus Types I ve II Anti-HTLV-I/II Testleri Abbott HTLV-I/HTLV-II EIA EIA Abbott Laboratories 1997 Vironostika* HTLV-I/II Microelisa System ABBOTT PRISM HTLV-1/HTLV-II Assay EIA biomerieux, Inc 1998 Abbott Laboratories 2008 CLIA *Donör tarama için lisans almıştır, ancak temin edilemeyebilir

35 HTLV-I/II EIA; mikroplak kuyu tabanları pürifiye HTLV-I ve HTLV-II viral lizatı rekombinant HTLV-I p21e antijeni ile kaplıdır. HTLV-I/II CLIA; katı faza sabitlenmiş viral antijenler Ancak HTLV-I ve HTLV-II reaktivitelerinin ayrımını yapamamaktadır. Test tekrarında (farklı örnek) reaktif bulunduğunda; Doğrulama testleri; Western Blot RIPA (radyoimmunopresipitasyon Bu testlerin kombinasyonları HTLV kor (gag), p24 ve env (gp46, gp61/68) antijenlerine karşı oluşan atikorların ayrımını yapabilmektedir.

36 Sifilizin günümüzde kan transfüzyonu ile taşınması, soğuk saklama koşullarında 72 saatten daha fazla yaşayamadığı için çok nadirdir. Bu sebeple transfüzyon riski göz ardı edilebilmektedir. Non-treponemal flokülasyon kart testi Rapid plazma reagin (RPR) test Veneral disease research laboratory (VDRL) test Test, enfeksiyonun erken dönemleride hasara uğrayan hücrelerden salınan reagin olarak adlandırılan lipoidal materyallere ve T. pallidum lipidlerine karşı oluşan IgG ve IgM anti-lipid antikorlarının flokülasyon prensibi ile ölçmektedir. Non-treponemal testler sifiliz tanısında faydalı olsa da, spesifik değildir.

37 Treponemal testler Hemaglutinasyon testi Mikrohemaglutinasyon testi (otomatize mikroplak sistemlerinde T. pallidum antikorlarının taranması) Test, Aglutinasyon ve patern tanımına prensibine dayanmaktadır. Testte T. pallidum ile sensitize edilmiş tavuk eritrositleri kullanılır. Donör örnekleri ile sensitize eritrositler karıştırılır, etkene karşı antikorların varlığında hemagutinasyonun oluşması beklenir. Reaktif örnekler T. pallidum a karşı IgG ve/veya IgM antikorlarının varlığını gösterir. Tekrar pozitif sonuçların lisanslı doğrulama testi ile değerlendirilmesi gereklidir. Bir örneği, EIA ile çalışmaktadır ve T. pallidum a karşı IgG antikorları kalitatif olarak belirlemektedir.

38 Non-treponemal test pozitif olarak belirlendiğinde treponemal doğrulama testi (floresan treponemal absorbsiyon testi, FTA-ABS) ile tekrar analiz edilmelidir Bu örnekler treponemal testte negatif bulunduğunda örnek negatif olarak kabul edilmektedir. Treponemal testler ile pozitif bulunan donörler donasyon için uygun değillerdir.

39 Sifiliz yönünden donör taramalarında FDA tarafından açıklanmış tanısal serolojik testlerin yeterli olduğu belirtilmektedir Ticari test isim(leri) Yöntem Üretici Açıklanmış serolojik donör tarama testleri Capture -S Olympus PK TP System ASI TPHA Test CAPTIA TM Syphilis (T. Pallidum)-G Non-treponemal Treponemal Treponemal Treponemal Immucor Fujirebio Inc. Arlington Scientific, Inc Trinity Biotech FTA-ABS Test System Treponemal SCIMEDX Corporation REMEL RPR Card Test Non-treponemal ASI VDRL Antigen Test ASI RPR Card Test TRUST (Toluidine Red Unheated Serum Test) Non-treponemal Non-treponemal Non-treponemal Abbott Laboratories, Diagnostic Division Arlington Scientific, Inc Arlington Scientific, Inc New Horizons Diagnostics Corporation Açıklanmış serolojik doğrulama testleri Açıklanmış tanısal serolojik testler Açıklanma yılı

40 CMV için de FDA tarafından açıklanmış donör tarama testleri bulunmaktadır. CMV tarama testleri IgG ve IgM total antikorları belirlemektedir. CMV taşınma riskinin yeterince azaltılması için taramaların lökositten zengin doku, hücre ve plazmalardan test edilmesi gerekmektedir. CMV reaktif bulunan antikor testlerinin donörün uygun olmadığı anlamına gelmemektedir Ticari test isim(leri) Yöntem Üretici Anti-CMV testi (CMV ye karşı oluşan antikorları belirler) BD CMVscan Card Test Lateks Aglutinasyon Capture - CMV Solid phase red cell adherence Solid phase enzyme immunoassay Passive particle agglutination Abbott CMV* Total AB EIA Olympus PK CMV-PA System *Donör tarama için lisans almıştır, ancak temin edilemeyebilir Becton, Dickinson & Company Immucor, Inc. Abbott Laboratories, Diagnostic Division Fujirebio, Inc. Açıklanma yılı

41 Partikül aglutinasyon testleri Test örneğindeki spesifik antikor veya antijenin varlığını, komplementer spesifik antijen veya antikor ile kaplı partiküllerin aglutinasyonu yolu ile belirlemektedirler.

42 Aglutinasyon testlerinde, özellikle antikor testlerinde eritrosit (hemaglutinasyon) ile jelatin ve lateks gibi inert partiküller kullanılmaktadır. Bu inert partiküllerin kullanılması krosreaktivite gösteren eritrosit antijenlerine karşı, nonspesifik reaksiyonları azalttığı için avantaja sahiptir. Hemaglutinasyon ve partikül aglutinasyon testlerinin temel prensibi, kullanılan partikül tiplerine bakılmaksızın aynıdır.

43 Partikül aglutinasyon testleri, sifiliz antikorlarının belirlenmesinde halen yaygınlıkla kullanılmaktadır. Bu testler, çok basamaklı değildirler veya yıkama ekipmanına ihtiyaç duyulmamaktadır. Manuel sistemde, test sonuçları görsel olarak okunmaktadır ve değerlendirme subjektiftir. Test sonuçlarının kalıcı kaydı yapılamadığı için saklanamamaktadır.

44

45 Hızlı/basit tek kullanımlı testler (hızlı testler) Hızlı/basit tek kullanımlı testler kullanıldıktan sonra atılmaktadırlar. Bu testlerin çok sayıda farklı hazırlanış şekilleri vardır. Birçok hızlı test immunokromatografik şekilde olup, örnek, sabit bir strip üzerine eklenmektedir ve daha önce immobilize edilen reaktif ile reaksiyona girmektedir. Örnekler serum, plazma veya bazı durumlarda tam kan olabilmektedir. Pozitif reaksiyon strip üzerinde nokta veya band şeklinde gözlenmektedir. Testlerin çoğu, her bir testte sonuçların değerlendirilebilmesi için kontrol noktası veya bandı da içermektedir

46

47 Reaktif Negatif

48 Hızlı testlerın kullanımı basittir ve test kiti içinde gelenler dışında başka reaktifler gerektirmemektedir. Sonuçlar görsel olarak okunmaktadır ve dakikalar içinde basit kalitatif sonuç vermektedir. Sonuçların okunması subjektif değerlendirmeye bağlıdır ve sonuçların saklanması için orijinal testin kalıcı kaydı yapılamamaktadır. Hızlı testler, çok sayıda kan örneğinin taranması için genelde uygun değildirler

49 Nükleik asit amplifikasyon teknolojisi (NAT) prensibine dayanan testler Kan taramasında kullanılan NAT, donasyon örneklerinde; viral nükleik asit, DNA veya RNA nın varlığını belirlemektedir. Bu teknolojide, virusun spesifik RNA/DNA parçası hedeflenmektedir ve in-vitro amplifiye edilmektedir. Amplifikasyon basamağı, orijinal örnekte düşük seviyelerde bulunan virusun miktarını artırarak tespit edilebilir düzeye getirmektedir. Spesifik nükleik asitin varlığı, virusun varlığını gösterir ve donasyon muhtemelen enfeksiyözdür.

50 NAT teknikleri, bireysel (tek) donasyonlarda veya mini havuzlarda gerçekleştirilebilmektedir. Genellikle kullanılan NAT testleri HBV-DNA HCV-RNA HIV-1-RNA WNV-RNA

51 NAT teknolojisi emek yoğun olduğu için kan endüstrisi genellikle mini havuz test algoritmalarını benimsemiştir Donasyon örnekleri lü havuzlarda test edilmektedir. Pozitif çıkan havuzlar sonra pozitif örneği bulmak için tek tek analiz edilmektedir.

52 FDA onaylı NAT prensibine dayanan donör tarama testleri Ticari test isim(leri) Yöntem HBV NAT (Direkt HBV DNA yı belirler) Üretici Onay yılı Procleix Ultrio Plus assay TMA Gen-Probe, Inc COBAS AmpliScreen HBV Test PCR Roche Molecular Systems Inc UltraQual HBV PCR Assay PCR National Genetics Institute 2011 UltraQual HCV RT-PCR Assay PCR National Genetics Institute 2001 Procleix Ultrio TMA Gen-Probe, Inc HCV RT-PCR assay PCR BioLife Plasma Services 2007 COBAS Ampliscreen HCV Test Version 2.0 PCR Roche Molecular Systems 2007 HCV NAT (HCV RNA yı direkt belirler)

53 HIV-1 NAT (HIV-1 RNA yı direkt belirler) UltraQual HIV-1 RT-PCR Assay PCR Versant HIV-1 RNA 3.0 (bdna) Signal amplification nucleic acid probe TMA Procleix Ultrio National Genetics Institute 2001 Siemens Healthcare Diagnostics, Inc 2002 Gen-Probe, Inc APTIMA HIV-1 RNA Qualitative Assay HIV-1 RT-PCR Assay TMA Gen-Probe, Inc PCR BioLife Plasma Services 2007 COBAS AmpliScreen HIV-1 Test, version 1.5 PCR Roche Molecular Systems 2007 Abbott RealTime HIV-1 Amplification Kit PCR ABBOTT Molecular, Inc 2007 Procleix WNV Assay TMA Gen-Probe, Inc 2005 Cobas TaqScreen West Nile Virus Test PCR Roche Molecular Systems, Inc WNV NAT (WNV RNA sını direkt belirler)

54 Birden fazla virusa ait DNA veya RNA yı aynı anda belirleyebilen multipleks NAT tarama testleri geliştirilmiştir Ticari test isim(leri) Yöntem Üretici Onay yılı Procleix HIV-1/HCV Assay/Nucleic Acid Pooled Testing/Synthetic TMA Gen-Probe, Inc 2004 COBAS TaqScreen MPX Test HBV, HCV, HIV-1 (Grup 0 ve M RNA), HIV-2 PCR Roche Molecular Systems, Inc. 2008

55 Günümüzde, NAT kullanan ülkeler; ABD, Kanada, Fransa, Avustralya, Yeni Zelanda, Güney Afrika, Avrupa ve Asya

56 PCR ve TMA NAT-tarama teknolojisi; PCR (polymerase chain reaction) TMA (transcription-mediated amplification) prensibi ile çalışılmaktadır.

57 En yaygın kullanılan NAT testlerinden biri, HBV-DNA, HCV ve HIV-1 RNA yı TMA prensibi ile amplifiye etmekte ve amplifikasyon ürünlerinin tespiti hibridizasyon prensibine dayanmaktadır. TMA, transkripsiyon temelli nükleik asit amplifikasyonudur. MMLV revers transkriptaz ve T7 RNA polimeraz enzimleri kullanılmaktadır. Revers transkriptaz.. DNA kopyasını (T7 RNA polimeraz için promoter dizi içermektedir) oluşturmakta, T7 RNA polimeraz.dna kalıplarından birçok RNA amplikonları üretmektedir. Tespit ise kemilüminesan ile işaretli tek zincirli nükleik asit problarının hibridizasyonu ile olmaktadır.

58 Yaygın kullanılan diğer test PCR tabanlı HBV, HCV ve HIV-1 testleridir. Amplikonların tespiti biotin ile işaretli hibridizasyonu prensibine dayanmaktadır. probların

59 Tarama platformları Tam entegre ve otomatize, Yarı-otomatize Modüler otomatize Bireysel donör testleri; Örnek dilüsyonu yapılmadan, bağışlanan her bir kan ünitesine yapılır. Bu sebeple NAT testi için en duyarlı yöntemdir. Pencere dönemi süresince viral titre genellikle düşüktür ve bireysel donör testleri yüksek duyarlılığını bu süreçte devam ettirmektedir. Havuzlanmış test; Birçok donörden alınan örneklerin test edilmeden önce birleştirildiği havuzlanmış test ise, büyük hacimde kan işleyen birçok kan merkezi tarafından tercih edilir

60 Tarama testi olarak NAT kullanımı Pozitif test sonucu için antikor yanıtının başlamasını gerektirmediği için konvansiyonel testlerden daha duyarlı bir test metodu İnfeksiyon meydana geldiğinde bulunan düşük seviyelerde virus genetik materyalini belirleyebilmekte Pencere dönemi veya donörün virusa maruz kalması ile antikorların ortaya çıkması arasında kalan süreyi belirgin biçimde düşürmektedir. Pencere döneminin azalması ile enfeksiyon etkenlerinn daha erken belirlenmesine izin vermekte ve böylece transfüzyon ile bulaş olasılığı azalmaktadır. Ayrıca mutantları (immunovaryant viruslar), okkült olguları (kronik taşıyıcılar) ve serolojide yanlış negatiflikleri de belirleyebilmektedir.

61 Test seçimi Uygun testlerin seçilmesi, tarama programlarının önemli bir parçasıdır. Güvenilir sonuçlar, geçerliliği olan etkin testlerin tutarlı (sürekli) kullanılmasına bağlıdır. Birçok faktör test seçimine etki etmektedir. Tarama ihtiyaçları ve mevcut kaynaklar (mali durum, uzman personel, ekipman, tek kullanımlık sarf malzemeler) arasında denge sağlanması gerekir

62 Her bir tarama sisteminin avantaj ve kısıtlamaları mevcuttur, bu sebeple test seçerken bunların göz önünde bulundurulması gereklidir. Bazı kısıtlamalar şunlardır; Enfeksiyonun, tarama testlerinin belirleyemediği pencere dönem uzunluğu Donasyonların boşa harcandığı ve gereksiz donör reddine sebep olan, yanlış pozitiflik oranı Otomasyon gerektiren bazı sistemlerin karmaşıklığı

63 EIA, CLIA ve partikül aglutinasyon testleri Birçok durumda, nisbeten küçük taranmasında uygun testlerdir. veya çok sayıda örneğin Bu test formatları, sonuçların hızlı testlerden daha objektif analiz edilmesine ve kayıt altında tutulmasına izin vermektedir. Ancak, kullanım öncesi bütün testlerin sıkı bilimsel değerlendirmeden geçmesi, duyarlılık ve özgüllük bakımından uygunluğunun belirlenmesi gerekmektedir. Birçok EIA ve CLIA testi, partikül aglutinasyon testleri veya hızlı testlerden daha yüksek duyarlılık ve özgüllüğe sahiptir. Bütün rutin markırlar için, ticari yüksek kalitede partikül aglutinasyon testleri mevcut değildir.

64 Hızlı/basit tek kullanımlık testler Kan taramasında kullanımları tavsiye edilmemektedir. Bu testler esas olarak tanısal amaçlı olup, az sayıda örneklerin hızlı biçimde test edilmesi için tasarlanmışlardır. Manuel teknikler ile çalışıldığı için orta laboratuarlarda kullanımı sınırlı olabilmektedir. ve büyük ölçekli Hızlı sonuç almak için acil durumlarda kullanıldıklarında, testin daha sonra EIA, CLIA veya partikül aglutinasyon testlerinden biri kullanarak tekrar edilmesi gerekmektedir.

65 NAT uygulamaları NAT enfeksiyonun pencere dönemini azaltmasına rağmen, enfeksiyonun düşük insidanslı olduğu ülkelerde, donasyon sırasında pencere dönemindeki donör sayısı düşük olduğu için kazanç (verim) minimaldir. Ancak enfeksiyonun yüksek insidanslı oluğu ülkelerde, NAT ile pencere dönemindeki çok sayıda donasyon belirlenebilmektedir. Bu sebeple, pencere döneminde toplanan kan ünitelerinin transfüzyon riski NAT ile azaltılabilmektedir.

66 Yeterli kaynaklara sahip ülkeler için, NAT antikor/antijen testleri ile kombine edildiğinde önemli fayda sunmaktadır.

67 Testlerin önemi özellikleri Özgüllük ve duyarlılığın mümkün veya mevcut en yüksek seviyede olması gereklidir. Her bir testin, kullanılacağı ülke veya bölgede, test performansı ile ilgili teknik veriler doğrulanarak ve mümkün ise diğer çalışmaların verileri analiz edilerek değerlendirilmelidir. Testin güvenilirliği ve uyumunu, test ve kullanıldığı laboratuvar ile ilgili birçok faktör belirlemektedir. Her bir testin kullanılacağı yerde, değerlendirme sonuçlarının performansına göre onaylanması gerekmektedir.

68 Teste spesifik faktörler: Test tanıtımı Talimatların anlaşılırlığı Kullanım kolaylığı Test özellikleri (duyarlılık ve özgüllük gibi) Örnek hacmi Örnek ve reaktif takibi Dayanıklılık Test tekrarlanabilirliği ve hassasiyeti Her teknik için test sayısı Kit ölçüsü Toplam test süresi

69 Laboratuvara spesifik faktörler: Test edilen örnek sayısı Personel seviyesi: Personel yeterliliği Mevcut ekipman Laboratuvar kalite sistem düzeyi

70 Tedarik ile ilgili dikkat edilmesi gerekenler: Bayi seçimi ve geçerlilik Fiyat İhale sistemi Test kitleri ve reaktif kaynaklarına ulaşılabilirlik ve güvenilirliği Kit ve reaktiflerin raf ömrü Altyapı: örn., kontrollü depolama koşulları ve kesintisiz güç kaynakları Sorun çözme için teknik destek Ekipman bakımı, servis ve onarım

71 Testlerin gerçekleştirilmesinde otomasyon kullanımı Otomasyon kullanımı, çok sayıda tarama testi gerçekleştiren kan transfüzyon servislerinde büyük önem taşımaktadır. EIA ler için basit düzeyde otomasyon gerekse de (otomatik plak yıkayıcı ve okuyucu), örneklemeden sonuçların okunmasına kadar tüm aşamaları gerçekleştiren bazı komplike otomatize tarama sistemleri de bulunmaktadır. Mikroplak tabanlı olan ve ekipman veya test ile bağlantılı olmayan bu test sistemler açık sistemler olarak adlandırılmaktadır. Özel kapalı sistemler ise tamamen otomatizedir ve ekipman üreticisi tarafından temin edilen reaktif ve kontroller ile çalışmaktadır. Tamamen otomatize bu sistemler, kullanıcı hatalarını azaltmak ve test performansını artırmak için yoğun merkezlerde tavsiye edilmektedir. Bununla birlikte açık sistemlerin maliyeti daha azdır