TÜRKİYE ENDEMİĞİ VERBASCUM LYDIUM VAR. LYDIUM BİTKİSİNİN IN VITRO ÇİMLENMESİ ÜZERİNE FARKLI IŞIK, SICAKLIK VE BESİ

Transkript

1 EGE ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ (YÜKSEK LİSANS TEZİ) TÜRKİYE ENDEMİĞİ VERBASCUM LYDIUM VAR. LYDIUM BİTKİSİNİN IN VITRO ÇİMLENMESİ ÜZERİNE FARKLI IŞIK, SICAKLIK VE BESİ ORTAMLARININ ETKİLERİ VE ELDE EDİLEN BİTKİLERİ DOĞAYA AKTARMA ÇALIŞMALARI Nilay ORUÇ Tez Danışmanı : Yrd. Doç. Dr. Esin AKÇAM OLUK Biyoloji Anabilim Dalı Bilim Dalı Kodu : Sunuş Tarihi : Bornova-İZMİR 2012

2

3 iii Nilay Oruç tarafından yüksek lisans tezi olarak sunulan Türkiye Endemiği Verbascum lydium var. lydium Bitkisinin In vitro Çimlenmesi Üzerine Farklı Işık, Sıcaklık ve Besi Ortamlarının Etkileri ve Elde Edilen Bitkileri Doğaya Aktarma Çalışmaları başlıklı bu çalışma E.Ü. Lisansüstü Eğitim ve Öğretim Yönetmeliği ile E.Ü. Fen Bilimleri Enstitüsü Eğitim ve Öğretim Yönergesi nin ilgili hükümleri uyarınca tarafımızdan değerlendirilerek savunmaya değer bulunmuş ve tarihinde yapılan tez savunma sınavında aday oybirliği/oyçokluğu ile başarılı bulunmuştur. Jüri Üyeleri: İmza Jüri Başkanı : Raportör Üye : Üye :......

4

5 v ÖZET TÜRKİYE ENDEMİĞİ VERBASCUM LYDIUM VAR. LYDIUM BİTKİSİNİN IN VITRO ÇİMLENMESİ ÜZERİNE FARKLI IŞIK, SICAKLIK VE BESİ ORTAMLARININ ETKİLERİ VE ELDE EDİLEN BİTKİLERİ DOĞAYA AKTARMA ÇALIŞMALARI ORUÇ, Nilay Yüksek Lisans Tezi, Biyoloji Bölümü Tez Yöneticisi: Yrd. Doç. Dr. Esin AKÇAM OLUK Şubat 2011, 45 sayfa Verbascum L. cinsi Scrophulariaceae familyası üyesi olup, ülkemizde 185 i endemik 233 tür ile temsil edilmektedir. Bu çalışmada, bu endemik türlerden Bozdağ (Ödemiş, İzmir: 1600 m) dan toplanan ve yakın tehdit altında (NT) kategorisinde yer alan Verbascum lydium var. lydium tohumlarının in vitro şartlarda çimlenme ve çimlenen tohumlardan gelişen fidelerin gelişim yetenekleri araştırılmıştır. Bu amaçla tohumların çimlenmesi ve ortaya çıkan fidelerin gelişimi için farklı besi ortamları (besleyici içermeyen sulu agar (0.8% [w/v]), yarım ve tam kuvvet Murashige-Skoog (MS)) ile farklı çevresel koşullar (sıcaklık: 19 ve 25 C; ışık: aydınlık (16/8 fotoperiyod) ve karanlık) denenmiştir. Tohumlar, ikinci haftanın sonunda en yüksek oranda (% 84) sulu agarda, 25 C sıcaklık ve 16/8 fotoperiyodda sağlanan aydınlık şartlarda çimlenmiştir. En iyi fide gelişimi (KA/TA oranı: % 8.4) yine 25 C sıcaklık ve aydınlıkta, ancak besi ortamı olarak tam kuvvet MS de kaydedilmiştir. Yaklaşık 6 aylık fideler, yeterli kök gelişimi de gözlendiği için, Bitki toprağı içeren kültür kaplarında aklimatize edilmişlerdir. Hayatta kalma başarıları % 67 olarak tespit edilmiştir. Anahtar sözcükler: Çimlenme, Verbascum lydium var. lydium, endemik, ışık, sıcaklık.

6

7 vii ABSTRACT EFFECTS OF DIFFERENT LIGHT, TEMPERATURE AND CULTURE MEDIA ON IN VITRO GERMİNATION OF TURKISH ENDEMIC VERBASCUM LYDIUM VAR. LYDIUM PLANT AND ACCLIMATIZATION OF THE CULTURED PLANTS TO THE OUTDOOR CONDITIONS ORUÇ, Nilay MSc in Biology Supervisor: Assis. Prof. Dr. Esin AKÇAM OLUK February 2011, 45 pages The genus Verbascum L., which belongs to the Scrophulariaceae family, is represented by 233 species, 185 of which are endemics, in Turkey. In this study, in vitro germination and development of grown seedlings of endemic and 'near threatened' (NT) plant Verbascum lydium var. lydium was researched. Seeds of the plant has been gathered from Bozdağ (Ödemiş, İzmir: 1600 m). The germination of the seeds and the development of the seedlings was examined with different mediums (water agar (0.8 % [w/v], half and full strength Murashige-Skoog (MS)) and environmental conditions (temperature: 19 and 25 C; light: light(16/8 photoperiod and dark). After fourteen days, the highest germination ratio was in water agar, 25 C and light conditions (84 %). The best seedling development (DW/FW ratio: 8.4 %) was recorded in 25 C and light conditions, but in full strength MS medium. 6 months old seedlings, when sufficient root development was observed, they were acclimatised in culture pots which contains Plant soil. It was found that survival percentage of plants was % 67 at the greenhouse conditions. Keywords: Germination, Verbascum lydium var. lydium, endemic, temperature, light.

8

9 ix TEŞEKKÜR Gerek bilime, gerekse hayata dair sabır, samimiyet ve özveri içinde sunduğu öğretilerinden dolayı değerli hocam Yrd. Doç Dr. Esin Akçam Oluk a, hiçbir zaman desteklerini esirgemeyen aileme ve özellikle Şiar Alpdündar a, değerli katkılarından ve yardımlarından dolayı Buğra Bahçeci, Volkan Eroğlu, Kalbiye Dalgıç ve Efe Şamlı ya teşekkürü bir borç bilirim.

10

11 xi İÇİNDEKİLER Sayfa ÖZET... v ABSTRACT... vii TEŞEKKÜR... ix ŞEKİLLER DİZİNİ... xiii ÇİZELGELER DİZİNİ... xvii SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ... xix 1.GİRİŞ MATERYAL VE METOT Bitkisel Materyal Denemelerde Kullanılan Besi Ortamları, Cam Eşya ve Sterilizasyonları Tohumların in vitro Çimlendirilmesi Fidelerin Büyüme ve Gelişmeleri (İleri Safha) Aklimatizasyon BULGULAR Çimlenme Oranına İlişkin Bulgular Fidelerin Kök, Hipokotil ve Gövde Boylarına İlişkin Bulgular... 17

12 xii İÇİNDEKİLER (devam) Sayfa 3.3 Fidelerin Taze ve Kuru Ağırlıklarına İlişkin Bulgular Aklimatizasyona İlişkin Bulgular SONUÇ VE TARTIŞMA KAYNAKLAR ÖZGEÇMİŞ... 45

13 xiii ŞEKİLLER DİZİNİ Şekil Sayfa 1.1 IUCN kategorileri Verbacum lydium var. lydium bitkisinin doğal habitatındaki genel görünüşü Doğal habitatında, Verbacum lydium var. lydium bitkisinin çiçekleri Verbacum lydium var. lydium bitkisi ve toplandığı habitat Agar besi ortamında gelişen, 7 günlük Verbascum lydium var. lydium fideleri Agar ortamındaki 14 günlük Verbacum lydium var. lydium fideleri V. lydium var. lydium tohumlarının 3,7 ve 14. günlerdeki çimlenme oranları(%) Çimlenip, gelişen 14 günlük V. lydium var. lydium fidelerinin hipokotil (h) ve kök (k) uzunlukları (mm) Çimlenip, gelişen 14 günlük Verbascum lydium var. lydium fidelerinin kök uzunluk (k) / hipokotil uzunluk (h) oranı (%) Tam kuvvet MS besi ortamında gelişen 14 günlük Verbascum lydium var. lydium fideleri Tam kuvvet MS besi ortamında gelişen 30 günlük Verbascum lydium var. lydium fideleri... 20

14 xiv ŞEKİLLER DİZİNİ (devam) Şekil Sayfa Tam kuvvet MS besi ortamında gelişen 45 günlük Verbascum lydium var. lydium fideleri ve 45 günlük Verbascum lydium var. lydium fidelerinin gövde (g) ve kök (k) uzunlukları (mm) ve 45 günlük Verbascum lydium var. lydium fidelerinin kök uzunluk (k) / gövde uzunluk (g) oranı (%) Çimlenip, gelişen 14 günlük Verbascum lydium var. lydium fidelerinin taze (TA) ve kuru ağırlıkları (KA) (mg) Çimlenip, gelişen 14 günlük Verbascum lydium var. lydium fidelerinde kuru ağırlık (KA) / taze ağırlık (TA) oranı (%) ve 45 günlük Verbascum lydium var. lydium fidelerinin taze (TA) ve kuru ağırlıkları (KA) (mg) ve 45 günlük Verbascum lydium var. lydium fidelerinin kuru ağırlık (KA) / taze ağırlık (TA) oranı (%) Tam kuvvet MS besi ortamında gelişen 45 günlük Verbascum lydium var. lydium fideleri Kum kültüründeki 18 haftalık Verbascum lydium var. lydium fideleri Bitki toprağı (BT) içeren viyollere aktarılmış Verbascum lydium var. lydium fideleri... 29

15 xv ŞEKİLLER DİZİNİ (devam) Şekil Sayfa Serada 8 aylık Verbascum lydium var. lydium fideleri... 30

16 xvi

17 xvii ÇİZELGELER DİZİNİ Çizelge Sayfa Tam kuvvet Murashige -Skoog (MS) (1962) besi ortamı Verbascum lydium var. lydium tohumlarının 3,7 ve 14. günlerdeki çimlenme oranları (%) Çimlenip, gelişen 14 günlük V. lydium var. lydium fidelerinin hipokotil (h) ve kök (k) uzunlukları ile kök uzunluklarının, hipokotil uzunluklarına oranı (h/k) ve 45 günlük Verbascum lydium var. lydium fidelerinin gövde (g) ve kök (k) uzunlukları ile kök uzunluklarının, gövde uzunluklarına oranı (k/g) Çimlenip, gelişen 14 günlük Verbascum lydium var. lydium fidelerinin taze ağırlıkları (TA) ve kuru ağırlıkları (KA) ile kuru ağırlıklarının, taze ağırlıklarına oranı (KA/TA) ve 45 günlük Verbascum lydium var. lydium fidelerinin taze (TA) ve kuru ağırlıkları (KA) ile kuru ağırlıkların taze ağırlıklara oranı (KA/TA))... 25

18 xviii

19 xix KISALTMALAR DİZİNİ Kısaltmalar Açıklama A Agar MS Murashige-Skoog besi ortamı Y Yarım kuvvet MS M Tam kuvvet MS D Karanlık L Aydınlık h Hipokotil uzunluğu k Kök uzunluğu g Gövde uzunluğu TA Taze ağırlık KA Kuru ağırlık BT Bitki toprağı

20 xx

21 1 1. GİRİŞ Bugün yeryüzünde in üzerinde bitki türü olduğu ve bu bitkilerin yaklaşık inin tehlike altında olduğu düşünülmektedir (Benson, 1999; Ekim vd., 2000). Türkiye, coğrafik konum itibariyle Asya ve Avrupa arasında bir köprü konumundadır. Çeşitli iklimsel faktörlerin etkisi, topografik ve jeolojik yapısı, çok değişik toprak tiplerinin bulunması ülkemizin çok zengin bir floraya sahip olmasına neden olmuştur. Ayrıca, Anadolu ya doğudan İran-Turan, güneyden Akdeniz ve kuzeyden Avrupa-Sibirya elementlerinin girerek popülasyonlar oluşturmaları, bu zenginliğin başlıca nedenleridir (Davis, 1982). Yapılan son kayıtlarla birlikte Türkiye de yaklaşık bitki türü olduğu bunların da yaklaşık % 35 inin endemik olduğu belirtilmiştir (Güner vd., 2000). Bu yüksek endemizm, ülkemizi önemli bir gen kaynağı haline getirmektedir. Endemik bitkiler uç şartlara bağlı olarak belirli bölgelere uyum sağlamış ve bunun dışında başka yerde bulunmayan bitki türleri olarak tanımlanmaktadır. Dolayısı ile canlılıklarını sürdürebildikleri bu sınırlı şartlardaki değişimlere oldukça hassastırlar ve bu sebeple Türkiye nin sahip olduğu bu yüksek endemizm oranı aynı zamanda bu türlerin yaşamlarının devamı için yüksek riski beraberinde getirmektedir. Aslında her endemik bitki türünün yok olma tehlikesinin olmamasına karşın, daha dar alanlarda sıkışmış ve birey sayıları oldukça azalmış olan endemik türler tehlike altında olabilmektedir. Gerek endemik gerekse endemik olmayan çoğu bitki türü nesillerini devam ettirme sürecinde, sanayileşme ve şehirleşme, tarım alanlarının genişletilmesi, doğadan çeşitli amaçlar için toplanma, zararlılarla mücadele, yangın gibi tehlikelerle karsı karsıya kalmaktadırlar. Bunun yanı sıra, endemik bitkilerimizin birçoğu bozkır ya da yüksek çayırlarda ve ormanlık alanlarda bulunmaktadır. Bunlardan bozkır ve yüksek dağ çayırlarında bulunanları aşırı otlatma, ormanlarda bulunanları ise aşırı tahribin tehdidi altındadır. Gerek bitki biyoçeşitliliği, gerekse yüksek endemizm oranı ve bu bitkilerin karsı karsıya oldukları tehlikeler göz önüne alındığında ülkemize ait güncel koruma stratejileri belirlenmesinin gerekliliği ortaya çıkmaktadır. Bu anlamda, birçok önemli ve endemik bitki türünün yeterince korunması, tehlike altına girmemesi veya yok olmaması

22 2 konusunda araştırıcılara büyük sorumluluklar düşmektedir. Böyle türlerin korunmasına ilişkin in situ ve ex situ olarak ayrımlanmış farklı stratejiler bilim dünyası tarafından kullanılmaktadır. En uygun stratejinin hangisi olduğu ise türden türe değişiklik göstermektedir (Fay, 1994). In situ koruma, tehdit altındaki türlerin doğal rezervlerde yani ait oldukları bölgede korunma altına alınmasını kapsamaktadır. Milli parklar, doğayı koruma alanları, doğa parkları, doğa anıtları, biyogenetik rezerv alanları, yaban hayatı koruma alanları, üretme istasyonları, gen koruma alanları ve özel çevre koruma bölgeleri bu yöntem içinde değerlendirilmektedir. Bu yöntemde genler ve türler, doğal yasama ortamlarında diğer canlılarla birlikte, biyolojik bütünlük içinde korunur. Doğal çevrede devamlılık sağlamanın yararlarından biri, sorunlu türlerin kendi doğal fizyolojik ve biyolojik çevreleriyle ilgili olarak gelişmesinin sağlanmasıdır (Krogstrup et al., 1992). Ex situ koruma, bitki türlerinin doğal habitatlarından uzaklaştırılarak biyolojik çeşitliliğin doğal ortamlar dışında korunmasıdır. Tohum bankaları, klon bankaları, doku kültürü koleksiyonları, koleksiyon bahçeleri, botanik bahçeleri, arboretumlar, gibi tesisler ex situ korumanın temel unsurlarındandır. Bu yöntemle materyaller kontrollü koşullarda korunabilmektedir; ancak bu yöntemin en önemli dezavantajlarından biri doğal evrimin durması ve yapay seleksiyon baskıyı zorlaması olasılığıdır (Ashton, 1987). Ex situ çalışmalarda başlangıç materyali olarak tohum kullanılması ucuz ve etkili bir yoldur (Cerabolini et al., 2004). Koruma çabaları içinde, tohum geniş bir genetik temel sağladığı için bitkisel materyal kaynağı olarak tercih. Ayrıca eğer bitkiler tohumdan çoğaltılırsa lokal ekotiplerin genetik farklılığı arttırılabilmektedir (Fay and Muir, 1990; Fay, 1992). Ancak populasyonların ex situ güçlendirilmesi için başlangıç materyali olarak tohum kullanılmasında dikkat edilecek pek çok nokta, populasyonların güçlendirilmesi çalışmalarının olumlu sonuç vermesi açısından oldukça önem taşımaktadır. Tohumların lokalitelerinden doğal olarak dağılmadan önce toplanması, canlı tohum hayatının kısa olup, tohum kalitesinin ve çimlenme yüzdesinin bilinememesi, tohumların meyveden ayıklanıp

23 3 temizlenmesinin, tohum ekstraksiyonunun zor olması, dormansi gibi bir takım problemler başarıyı sınırlayan önemli faktörler arasındadır. Bu çalışmalarda, öncelikle yapılması gerekenin türün çimlenme özellikleri ile ilgili ayrıntıların ortaya konması olduğu önerilmektedir. Tohum dağılımı ve çimlenme, türün ortamla uyumu için büyük öneme sahip olan üreme döngüsü evreleridir (Navarro and Guitian, 2003). Bitki hayatının başlangıç safhası olan çimlenme, tohumda büyümenin beslenmesi ve yedek besin maddelerinin embriyo büyümesinde kullanılmak üzere harekete geçerek, embriyonun tohum kabuğundan dışarı çıkması olayıdır (Çelik et al., 1995). Değişen çevresel şartlara adaptasyonun bir sonucu olarak her tür, çimlenme için belirli koşullara ihtiyaç duyar (Meyer and Monsen, 1991; Schütz and Milberg, 1997). Ancak çimlenme için gereken koşulları genel olarak iç ve dış koşullar olmak üzere iki bölümde toplamak mümkündür. İç koşul, tohumun oluşum ve yapı bakımından gelişebilme yeteneğinde olmasıdır. İçsel olarak gelişimini tamamlamış bir tohumun çimlenebilmesi, uygun dış koşulların bulunmasını gerektirir (Harper et al., 1970; Stebbins, 1971). Ortamın her türlü etmenini kapsayan dış koşullar ise, basta su olmak üzere sıcaklık, ışık ve oksijendir. Çimlenmenin başlayabilmesi için öncelikle tohumun su alıp şişmesi gerekir. Su olmadan tohumun endosperminde, perisperminde ve embriyosunda depo edilmiş besin maddeleri mobil sekle dönüşemez. Tohumun su içeriği artınca, kabukta karbondioksit ve oksijen geçirgenliği son derece artar (Fenner, 1985). Tohum su almaya baslar başlamaz, tohumda meydana gelen ilk değişim solunum oranındaki artıştır; sonrası ise sırasıyla depo maddelerinin yıkımı, yıkılan ürünlerin embriyoya taşınması ve oluşan hidroliz ürünlerini kullanarak embriyonun yeni metabolik ürünleri sentezlemesiyle içeriğinde meydana gelen değişimdir. Tohumdaki depo ürünlerinde meydana gelen bu değişimler, kuru tohumlarda var olan, ancak su alınımı sürecinde aktifleşen enzimler sayesinde olur (Mayer and Poljakoff- Mayber, 1989). Çimlenme için gereken dış koşulların en önemlilerinden biri de sıcaklıktır. Sıcaklık ihtiyacı türden türe değişiklik göstermektedir. Bazı türlerin tohumları yüksek sıcaklıkta çimlenirken, bazılarınınki ise düşük sıcaklıkta çimlenebilmektedir (Kaska ve Yılmaz 1974; Bewley and Black 1978; Günay 1992; Martinez-Ghersa et al.,2000; Tobe et al.,2000). Çimlenmeye geçişte bir diğer önemli faktör ışıktır. Işığın şiddeti, dalga boyu ve süresi çimlenmeyi

24 4 etkilemektedir (Kaska ve Yılmaz 1974, Andersson et al., 1997, Benvenuti and Macchia 1997; Densmore 1997; Noranha et al.,1997, Leinonen and Chantal 1998). Bazı türlerin tohumları çimlenme için ışığa gereksinim göstermesine rağmen, bazı türlerde ışıkta bırakma çimlenmeyi engellemektedir (Devlin, 1975). Tohum gelişimindeki yetersizlikler, çimlenme engelleri ve çimlenme koşulları özgül bir çimlenme fizyolojisi alanını oluşturmaktadır. Bu olayı, ülkemize özgü endemik bitkiler boyutunda ele aldığımızda, konu üzerindeki araştırmaların çok kısıtlı olduğu görülmektedir. Oysaki nadir, endemik ve tehdit altındaki türlerin üreme döngülerindeki farklı evrelerin (tohum dağılımı, çimlenme v.b.) üzerine detaylı bilgilerin ortaya çıkarılışı, nadirlik fenomeninin kapsamlı biçimde anlaşılmasına katkı sağlayabilir ve türlerin korunmasının yönetimi için alınacak kararlara ışık tutabilir (Menges, 1986). Populasyonların ex situ güçlendirilmesi çalışmaları kapsamında, Maunder (1992) mevcut teknikleri gözden geçirirken, in vitro tekniklerin öneminden de söz etmektedir. Çünkü, in vitro kültür son derece kontrollü bir ortamda yapılır ve nadir veya soyu tehdit altındaki türlerin korunmasında ya da çimlenmesi zor olan tohumların çimlenme oranlarını arttırmada kullanılabilen güçlü bir araçtır (Willis et al., 2003; Buyun et al., 2004; Lopez et al., 2004). Bitki doku kültürleri aseptik şartlarda, yapay bir besin ortamında, bütün bir bitki, organ (apikal meristem, kök vb.), doku (çeşitli bitki kısımları=eksplant) veya hücre (meristematik hücreler, süspansiyon veya kallus hücreleri) gibi bitki kısımlarından yeni doku, bitki veya bitkisel ürünlerin (metabolitler gibi) üretilmesi olarak tanımlanabilir. Doku kültüründe en uygun eksplant kaynağını, daha önceden steril edilmiş tohumlardan elde edilen steril fideler oluşturur. Bu şekilde elde edilen eksplantların sterilizasyona ihtiyacı olmamakta ve yüzey sterilizasyonu işleminin zararlı etkilerinden sakınılmaktadır. Tohumların sterilizasyonu tohum kabuğu varlığından dolayı kolayca sağlanabilmekte ve böylece in vitro çalışmalarda yararlanabilecek çok sayıda steril bitki elde edilebilmektedir. Ayrıca uzun süreli ex situ çimlenme denemelerinde kontaminasyon, çimlenme yüzdesini düşürmektedir. Oysaki in vitro koşullarda,

25 5 uygun bir sterilizasyon prosedürü oluşturulmuş tohumların kullanıldığı çimlenme denemelerinde bu risk oldukça azalmaktadır. Türkiye de bulunan endemik bitkilerin tamamı ile, endemik olmayıp soyu tehdit altında olan türler, 1994 yılında IUCN (International Union for Conservation of Nature and Naturel Resources =Dünya Koruma Birligi) tarafından teklif edilen RED DATA BOOK KATEGORİLERİ ne göre sınıflandırılmış ve Türkiye Bitkileri Kırmızı Kitabı adı ile yayınlanmıştır (Ekim et al., 2000). Adı geçen eserde hazırlanan listeler, doğa korumacılarının neyi korumalarını göstermesi açısından büyük önem taşımaktadır. Scrophulariaceae familyasına ait endemik bir bitki olan Verbascum lydium var. lydium, red data list book a göre (Ekim vd, 2000) NT (Şekil 1.1) kategorisinde olan yani şu anda tehlikede olmayıp yakın gelecekte VU, EN veya CR gibi tehlike altındaki türler kategorisine girmeye adaydır. Şekil 1.1 IUCN kategorileri Scrophulariaceae, ülkemizde de 30 cins ve 466 türü bulunan 200 den fazla cins ve 3000 kadar türe sahiptir (Heywood, 1979). Verbascum cinsi dünyada 360 kadar tür ile temsil edilmektedir ve bu türler Kuzey Yarıkürede ılıman bölgelere yayılmış olup kuru, açık ve kayalık habitatları tercih etmektedir (Juan et al., 1997; Heywood,1979). Verbascum sp. ülkemizde sığırkuyruğu, kral şamdanı olarak bilinmektedir ve 185 i endemik olmak üzere 233 türü bulunmaktadır (Davis,1978; Davis et al., 1988; Güner vd, 2000). Verbascum kelimesinin, bitkinin yapraklarının tüylülüğünü anımsatması nedeniyle, kaba tüylü anlamına gelen Latince barba kelimesinden türeyen barbascum sözcüğünden kökenlendiği düşünülmektedir. Cinsin adını Linnaeus vermiştir. Verbascum cinsine ait türler bir, iki veya çok yıllık otsu, nadiren küçük çalı şeklinde olup alternat, çok nadiren oppozit, basit veya parçalı yapraklı, taban

26 6 yapraklar rozet oluşturmuştur. Bitki çıplak veya guddeli veya guddesiz tüylü, basit veya dallanmış tüylüdür. Çiçekler uçta rasemoz, spika veya panikula durumundadır. Kaliks eşit veya çok nadiren eşit bölünmemiştir. Korolla sarı, nadiren menekşe rengi veya mor, kahverengi veya sarımsı veya mavimsi yeşil; tekerleksi, aktinomorf veya bazen zigomorf simetrilidir. Stamenler 4 veya 5, bazen 4 verimli ve 1 verimsiz; filamentler ince, uzun, yumuşak tüylü, sarımsı veya mor menekşe renkli tüylü, veya nadiren çıplak, hepsi eşit veya öndeki 2 tanesi daha uzun ve daha incedir. Arkadaki (üstteki) 2 veya 3 stamenin anterleri her zaman reniform ve enine olarak ortadan bağlıdır. Öndeki 2 stamen benzer veya boyu eninden uzun, boyuna bağlı ve aşağı doğru ilerleyici veya nadiren meyilli bağlıdır. Stilus tek, iplik şeklinde veya hemen hemen çomak şeklinde, stigma yarı küremsi, obovat veya spatulattır. Kapsüller, septumlar boyunca yarılan küremsi, oblong-ovoid veya silindiriktir. Tohumlar çok sayıda ve küçüktür. Türkiye deki türlerde ters koni- prizma şeklinde, enine çukurludur (Davis P.H., 1978). Literatür incelendiğinde özellikle çok tanınan türler olan V. thapsus (Warashina et al., 1991), V. phlomoides (Klimek, 1996), V. lychnitis (Serdyuk et al., 1976) ve V. nigrum (Klimek et al., 1992) üzerine çalışmalar göze çarpmaktadır. Bugüne dek araştırılan çeşitli Verbascum türlerinde saponozit, flavonoit, iridoit, feniletanoit ve fenilpropanoit glikozitler, steroit, seskiterpen asit, makrosiklik dimer lakton ve alkaloitler gibi sekonder metabolitlerin olduğu saptanmıştır (Seifert et al., 1991; Afifi et al., 1993; Abougazar et al., 2003). Bu sekonder metabolit çeşitliliği Verbascum türlerinde farklı aktivitelerin olabileceğini ve Verbascum türlerinin potansiyel tıbbi bitkiler olarak değerlendirilebileceğini düşündürmektedir. Nitekim içerdiği sekonder metabolitler paralelinde bitkinin ekspektoran, diüretik, demulsan, sedatif etkilere sahip olduğu (Tatlı ve Akdemir, 2004) ve bu etkileri nedeniyle geleneksel olarak dahilen ve haricen kullanıldığı rapor edilmektedir. Yanısıra çeşitli türlerinden elde edilen özütlerin antibakteriyel, antiviral, antifungal özellikleri de bu bitkinin çok sayıda çalışmaya konu oluşturmasına neden olmuştur (Magiatis et al., 2001; Türker and Camper, 2002). Birçok Verbascum türünün çiçek ve yapraklarının geleneksel tıpta kullanım dökümanlarına Avrupa, Asya, Afrika ve Kuzey Amerika toplumlarında rastlanmıştır (Geyid et al., 2005).

27 7 V. thapsus, V. thapsiforme, V. phlomoides gibi türlerin çiçekleri müsilaj taşımaları sebebiyle boğaz irritasyonu ve öksürük tedavisinde etkilidir. Çiçeklerinden hazırlanan çay günde birkaç kez içilebilmektedir. Ayrıca soğuk algınlığı tedavisi sebebiyle bitki; Almanya da yayınlanan Commission E monograflarında da yer almaktadır (Robbers and Tayler, 1999). Kuzey Amerika da 18 farklı kabile incelenerek yapılan etnobotanik bir çalışma sonucunda bu kabilelerin soğuk algınlığı, öksürük, zafiyet, astım gibi akciğer hastalıklarını, V. thapsus un (İng. common mullein) yapraklarının dekoksiyonunu içerek tedavi ettikleri ortaya çıkmıştır. Antiviral etkisinden dolayı nezle, kabakulak ve ateş gibi hastalıklarda (McCutcheon et al., 1995), bunun yanısıra diyare, hemoroid, zatürre, ateş, kan toplanması, allerji, migren, tümörlere karşı, nezle, boğaz hastalıkları, deri rahatsızlıkları, bağırsak ve karın ağrılarında; antienflamatuar etkisiyle üriner sistemde de kullanılmaktadır. Yaprak ve çiçeklerinin bronşit, kuru öksürük, tüberküloz, astım ve ses kısılması gibi hastalıklarda ekspektoran ve demulsan etkili olduğu bilinmektedir. Bitkinin ekspektoran etkisi içerdiği saponozitlerden kaynaklanmaktadır. Avrupa da yaygın olarak bulunan V. nigrum (İng. dark müllein) un çiçek ve yapraklarının halk tıbbında, homeopatik olarak (bir hastalığın, hastalık belirtilerini sağlam bir insanda ortaya çıkarabilecek maddelerin çok düşük dozlarda hastaya verilmesiyle tedavi edilebileceği inancına dayanan alternatif tıp yöntemi) öksürük kesici amaçlı kullanımı yaygındır (Klimek et al., 1992). V. phlomoides türünden elde edilen Flos Verbasci drogundan öksürük kesici çay hazırlanıp ekspektoran olarak kullanıldığı literatürde kayıtlıdır (Klimek, 1996). Ghorbani (2005), İran ın kuzeyinde Türkmen Sahra bölgesinde çeşitli amaçlarla kullanılan bitkileri ve bu bitkilerin kullanım şekillerini içeren etnobotanik tarama çalışması yapmıştır. Taranan 136 bitkinin 84 ünün tıbbi kullanımının olduğunu belirtmiştir. Tıbbi amaçlı kullanılan bu bitkilerin içinde V. grossypinum dan yılan sokmasına, ishale karşı ve ayrıca antiseptik özelliğinden dolayı da yararlanıldığı belirtilmiştir (Ghorbani, 2005). Ülkemizde de V. thapsus, V. phlomoides ve V. thapsiforme türleri halk arasında diüretik, ekspektoran, sedatif etkileri sebebiyle kullanılmaktadır (Gürbüz

28 8 et al., 2005). Ayrıca tohumları, içerisinde bulunan saponozitlerden ötürü zehirli olduğundan balık avcılığında kullanılmakta ve bu nedenle Anadolu nun kuzeyinde Verbascum türlerine balık bitkisi adı verilmektedir (Dülger ve Gönüz, 2004). Verbascum lydium Boiss. iki yıllık bir bitki olup uzunluğu 40 ila 130 cm arasında değişmektedir (Şekil 1.2). Yoğun olarak uzun, dallanmış, kolayca düşen yünsü bir tüy örtüsü ve kısa düşmeyen salgı tüyleri ile örtülmüştür. Tabanda bulunan yapraklar oblong, obovat-oblong ve lanseolattır, boyutları x 4-16 cm dir, kaba krenat, sesil ya da 5 cm e kadar kanatlı petiollüdürler. Üst gövdede ise yapraklar, yuvarlak ya da tabanda aurikulat, krenat-dentat, akut ya da akuminattır. Çiçek durumu gevşek, dallanmış, nadiren basit, 6-7 çiçekle kümelenmiştir. Alt brakteler lanseolat, akuminat, dentikulat, üsttekiler linearsetaya benzerdir. Pediseller 2-7 mm boyutundadır; brakteoller linear-lanseolattır. Kaliks 5-8 mm boyutlarındadır ve loblar lanseolatdan linear-lanseolata, akuttur. Korolla sarı (Şekil 1.3), mm çapında, şeffaf guddeli, dış yüzde seyrek olarak tomentozdur. Stamenler 5, anterlerin hepsi reniform ya da öndeki 2 tane dekurrent, filamentler mor-viola yünsü, öndeki 2 de apeksin yanında tüysüz. Kapsul genişçe eliptikten hemen hemen küremsiye, 5-6 x 4-5 mm boyutlarında, tomentoz, az çok çıplaklaşır. Otlaklar, yol kenarları, çam ormanları, makilerde m ler arasında bulunur. Bitkinin botanik özelliklerine göre iki alt türü bulunmaktadır. Buna göre, eğer iki kısa stamenin anterleri dekurrent; gövde yaprakları bazen kısa dekurrent ise var. heterandrum dan; bütün anterler reniform, ortadan bağlı; gövde yaprakları dekurrent değil ise var. lydium dan sözedilir (Davis P.H., 1978).

29 Şekil 1.2 Verbacum lydium var. lydium bitkisinin doğal habitatındaki genel görünüşü (Ödemiş/Bozdağ, 1600 m; Foto: Nilay Oruç) 9

30 10 Şekil 1.3 Doğal habitatında, Verbacum lydium var. lydium bitkisinin çiçekleri (Ödemiş/Bozdağ, 1600 m; Foto: Nilay Oruç) Bitkinin dahil olduğu familya ve cinsinin tüm bu özellikleri dikkate alınarak gerçekleştirilen bu araştırmada, Verbascum lydium var. lydium tohumlarının in vitro çimlenmeleri ve çimlenen tohumlardan ortaya çıkan fidelerin gelişimi için gerekli koşulların belirlenmesine çalışılmıştır. Böylece, endemik ve yakın tehdit altında bulunan Verbascum lydium var. lydium türünün doğal populasyonlarının güçlendirilmesi çalışmalarına katkı sağlanması amaçlanmıştır.

31 11 2. MATERYAL ve METOT 2.1 Bitkisel Materyal Bitkisel materyal olarak tez çalışmamızın in vitro çimlenme denemelerinde Verbascum lydium Boiss. var. lydium Boiss. bitkisinin tohumları kullanılmıştır. Tohumlar, Ekim ayında İzmir Bozdağ dan (1600 m) toplanmıştır (Şekil 2.1.1). Şekil Verbacum lydium var. lydium bitkisi ve toplandığı habitat 2.2 Denemelerde kullanılan besi ortamları, cam eşya ve sterilizasyonları Çimlenme ve büyüme-gelişme denemelerinde besi ortamı olarak 1 litre suda 6-7 g agar çözülerek hazırlanan sulu agar (A), yarım (½) (Y) ve tam (M) kuvvet Murashige-Skoog (MS) (1962) (Çizelge 2.2.1) kullanılmıştır. İn vitro şartlarda tohum çimlenmesiyle elde edilen ve büyüme gelişme ortamlarından gelen fidelerin ilk aklimatizasyon aşamasında, destek materyali olarak kum kullanılmıştır. Kum, kullanılmadan önce yarı yarıya sulandırılmış HCl ile yıkanarak olası besleyicilerinden arındırılmış ve sonra asidin uzaklaştırılması için sırasıyla çeşme suyu ve saf suyla yıkanmıştır. Daha sonra bu kum hava kurusu kurutularak 1 l lik kavanozlara 200 g olacak şekilde paylaştırılmıştır. İkinci akilimatizasyon aşaması için fidelerin, doğal ortamlarındakine yakın bir

32 12 toprakkarışımı hazırlanmıştır. BT (Bitki toprağı) adı verilen bu karışım eşit oranlarda dere kumu (1): mil (1): kil (1) den oluşmuştur. Cam eşya olarak, çimlenme denemelerinde 100 ml lik erlenler, büyüme ve gelişme denemeleri ile ilk aklimatizasyon denemelerinde 1 litrelik kavanozlar kullanılmıştır. Besi ortamları 100 ml lik erlenlere 20 şer, 1 litrelik kavanozlara 50 şer ml olarak; ilk aklimatizasyon aşamasında büyüme ortamı olarak kullanılan kum da 1 litrelik kavanozlara 200 g olacak şekilde paylaştırılmıştır. Tüm kültürlerin (besi ortamları + cam eşya ve kum + cam eşya) sterilizasyonu, 121 C sıcaklık ve 1.1 atm basınç altında 15 dk otoklavlanarak gerçekleştirilmiştir. Her bir uygulama için 20 şer deney kabı kullanılmıştır. Çizelge Tam kuvvet Murashige -Skoog (MS) (1962) besi ortamı Bileşik mg/l NH 4 NO KNO CaCl MgSO 4.7H 2 O 370 KH 2 PO H 3 BO 3 6,20 MnSO 4.4H 2 O 22,30 ZnSO 4.7H 2 O 8,60 Na 2 -EDTA 37,23 FeSO 4.7H 2 O 27,95 KI 0.83 NaMoO 4 2 H 2 O 0.25 CuSO 4 5H 2 O CoCl 2 6H 2 O myo-inositol nikotinik acid 0.5 tiamin HCl 0.1 pridoksin HCl 0.5 Glisin 2.0 Sükroz Agar 7000

33 Tohumların in vitro Çimlendirilmesi Tohumlar in vitro ekilmek üzere, yüzey sterilizasyonlarının gerçekleştirilmesi için ilk olarak % 5 NaOCl içeren % 20 (v/v) lik ticari çamaşır suyunda 15 dakika bekletilmiş ve ardından steril saf suyla üç kez çalkalanmıştır. Daha sonra % 70 lik (v/v) etanolde 1 dk bekletilerek ardından yine üç kez saf ve steril sudan geçirilmişlerdir. Sterilizasyon işleminden sonra tohumlar A,Y ve M besi ortamı içeren erlenlere 15 tohum/erlen olacak şekilde ekilmişlerdir. Tüm uygulamalar için toplamda 1800 tohum kullanılmıştır. Kültürler büyüme odasında iki farklı sıcaklık (19 C ve 25 C ) ve iki farklı ışık (aydınlık (16/8 fotoperiyod) ve karanlık) uygulamasına maruz bırakılmışlardır. Farklı sıcaklık ve ışık şiddeti ile farklı besin ortamlarına ekilen tohumların çimlenme oranları, 3., 7. ve son çimlenmenin kaydedildiği 14. günde çimlenen tohumlar sayılarak % değerlerinin hesaplanması ile elde edilmiştir. Çimlenme kriteri olarak radikulanın ilk ortaya çıkışı kabul edilmiştir (Simanton and Jordan, 1986, Coopland and McDonald, 1995). 14 günlük fidelerde ayrıca kök, hipokotil uzunluğu ile taze ve kuru ağırlık değerleri gibi erken safha büyümesine ilişkin morfolojik ölçümler alınmıştır. Köksürgün uzunluk oranı kök uzunluğunun, sürgün uzunluğuna bölünmesiyle (Mucciarelli et al., 2003), kuru-taze ağırlık oranı ise kuru ağırlığın, taze ağırlığa bölünmesiyle (Takayama and Misawa, 1979) elde edilmiştir. Fidelerin kuru ağırlığı, taze ağırlığı saptanan materyalin 80 C lik etüvde 24 saat bekletilmesiyle belirlenmiştir (Romano and Martins Loução, 2001). 2.4 Fidelerin büyüme ve gelişmeleri (ileri safha) Çimlenme denemelerinden elde edilen bulgular ışığında öncelikle A ortamında bitkinin tohumları çimlendirilmiştir. 3 günlük fideler ileri safha büyüme ve gelişmesine etkilerinin incelenmesi için Y ve M ortamlarına aktarılarak 16/8 fotoperyod aydınlık ve 25 C sıcaklık şartlarındaki büyüme odasına yerleştirilmişlerdir. Fidelerin 30 gün sonunda taze ortamlara bir kez altkültürleri yapılmıştır. Bu 30 gün ve altkültür sonrası taze ortamda geçirdikleri

34 14 15 (toplam 45) günün sonunda fidelerde morfolojik değerler (kök, gövde uzunluğu ile taze ve kuru ağırlık değerleri) belirlenmiştir. 45. günün sonundaki morfolojik ölçümlerin ışığında fideler sadece M ortamına aktarılmış ve bu ortamda 3 haftada bir 4 kez altkültüre alınmak suretiyle gelişmeleri takip edilmiştir. 2.5 Aklimatizasyon M ortamında 3 haftada bir 4 kez altkültüre alınarak büyüyen 12 haftalık fideler öncelikle içinde 200 g kum bulunan 1 litrelik kavanozlara aktarılmıştır (birinci aklimatizasyon aşaması). Kavanozların ağzı alüminyum folyodan hazırlanan kapaklarla kapatılmıştır. Kültürler bu haliyle yine 25 C sıcaklık ve 16/8 fotoperiyoda sahip çimlenme odasına yerleştirilmişler ve haftada bir 30 ml sıvı MS çözeltisiyle beslenmişlerdir. 1 haftanın sonunda bitkileri dış ortam koşullarına kademeli olarak alıştırmak amacıyla kavanozların alüminyum kapakları üzerinde pens ucu büyüklüğünde delikler açılmıştır. Bu şekilde de 1 hafta büyüme odasında kalan kültürlerin kapakları bu sürenin sonunda tamamen çıkarılmış ve bitkiler büyümeye bırakılmıştır. Kültür kaplarının kapakları açıldıktan sonra geçen 4 hafta sonunda toplamda 18 haftalık (M ortamında 12 hafta + Kum kültüründe 6 hafta) olan bitkiler bu kez BT içeren viyollere aktarılmış ve ihtiyaçlarına göre belli aralıklarla çeşme suyuyla sulanarak bir 6 hafta daha 25 C sıcaklık ve 16/8 fotoperiyod şartlarına sahip büyüme odasında tutulmuşlardır (ikinci aklimatizasyon aşaması). Toplamda 24 haftalık ( 6 aylık) olan fideler bu ikinci aklimatizasyon aşamasından sonra BT ortamında seraya yerleştirilmişlerdir. Tüm denemeler 3 kez tekrar edilmiştir. 3. BULGULAR Verbascum lydium var. lydium Boiss. türüne ait tohumların in vitro çimlenme oranına farklı besi ortamı, sıcaklık ve ışık uygulamalarının etkisi ile çimlenen tohumlardan yetişen fidelerin gelişimlerine 2 farklı besi ortamının etkileri ve doğal koşullara aktarımlarına (aklimatizasyon) ilişkin bulgularımız aşağıdaki gibidir.

35 Çimlenme Oranına İlişkin Bulgular Bu amaçla 3., 7. ve 14. günlerde gözlem yapılmıştır. Bu gözlemlerin ışığında, 3. günde en yüksek çimlenme oranı % 68 ile 25 C de aydınlık uygulamasında A besi ortamında ortaya çıkmış, 19 C de bulunan tüm uygulamalarda ve 25 C karanlık uygulamasında M besi ortamında hiç çimlenme kaydedilmemiştir (Çizelge ve Şekil 3.1.3). 7. günde en yüksek çimlenme oranı % 81 ile yine 25 C de aydınlık uygulamasında A besi ortamında, en düşük çimlenme oranı ise 19 (% 6,7) ve 25 C lerdeki ( % 13,4) karanlık uygulamalarında M besi ortamlarında gözlenmiştir (Çizelge ve Şekil 3.1.1, 3.1.3). Şekil Agar besi ortamında gelişen, 7 günlük Verbascum lydium var. lydium fideleri Son çimlenmenin kaydedildiği 14. günde, en yüksek çimlenme oranı 25 C de aydınlık uygulamasında A besi ortamındaki tohumlarda % 84 e çıkmış, en düşük çimlenme oranı ise % 6 ile 19 C de karanlık uygulamasında M besi ortamında meydana gelmiştir (Çizelge ve Şekil 3.1.2, 3.1.3).

36 16 Şekil Agar ortamındaki 14 günlük Verbascum lydium var. lydium fideleri Çizelge Verbascum lydium var. lydium tohumlarının 3,7 ve 14. günlerdeki çimlenme oranları (%) 19 C 25 C GÜN D L D L A Y M A Y M A Y M A Y M D: Karanlık L: Aydınlık A: Agar Y: Yarım kuvvet MS M: Tam kuvvet MS

37 17 D: Karanlık L: Aydınlık A: Agar Y: Yarım kuvvet MS M: Tam kuvvet MS Şekil Verbascum lydium var. lydium tohumlarının 3,7 ve 14. günlerdeki çimlenme oranları (%) 3.2 Fidelerin Kök, Hipokotil ve Gövde Boylarına İlişkin Bulgular A, Y ve M ortamları ile farklı ışık ve farklı sıcaklık şartlarında çimlenen tohumlardan gelişen 14 günlük fidelerde, yapılan ölçümlere göre, en uzun hipokotil boyu 25 C de aydınlık uygulamasında ve Y besi ortamında (7,95 mm), en kısa hipokotil boyu 25 C de karanlık uygulamasında M besi ortamında (3,83 mm) kaydedilmiştir (Çizelge ve Şekil 3.2.1). En uzun kök boyu 25 C de aydınlık uygulamasında ve Y besi ortamında (26,28 mm), en kısa kök boyu ise 19 C de aydınlık uygulamasında A besi ortamında (5,92 mm) ölçülmüştür. 19 C de karanlık uygulamasındaki ortamlarda çimlenme olmuş ancak büyüme olmadığı için ölçüm alınamamıştır (Çizelge ve Şekil 3.2.1). En fazla k/h oranı ise (% 3.58) 25 C, aydınlık uygulaması ve M ortamında ortaya çıkmıştır (Şekil ve 3.2.3).

38 18 Çizelge Çimlenip, gelişen 14 günlük Verbascum lydium var. lydium fidelerinin hipokotil (h) ve kök (k) uzunlukları ile kök uzunluklarının, hipokotil uzunluklarına oranı (h/k) UZUNLUK 19 C 25 C D L D L A Y M A Y M A Y M A Y M h (mm) ,68 0,01 k (mm) ,92 0,04 k/h (%) ,04 0,01 7,50 0,02 7,53 0,01 1,00 0,03 5,88 0,03 8,44 0,02 1,43 0,01 7,59 0,04 11,04 0,01 1,45 0,02 5,83 0,01 17,63 0,03 3,02 0,01 3,83 0,03 13,71 0,01 3,57 0,04 5,16 0,02 6,50 0,01 1,25 0,02 7,95 0,02 26,28 0,03 3,30 0,01 D: Karanlık L: Aydınlık A: Agar Y: Yarım kuvvet MS M: Tam kuvvet MS 6,92 0,01 24,83 0,02 3,58 0,03 D: Karanlık L: Aydınlık A: Agar Y: Yarım kuvvet MS M: Tam kuvvet MS Şekil Çimlenip, gelişen 14 günlük Verbascum lydium var. lydium fidelerinin hipokotil (h) ve kök (k) uzunlukları (mm)

39 19 D: Karanlık L: Aydınlık A: Agar Y: Yarım kuvvet MS M: Tam kuvvet MS Şekil Çimlenip, gelişen 14 günlük Verbascum lydium var. lydium fidelerinin kök uzunluk (k) / hipokotil uzunluk (h) oranı (%) Şekil Tam kuvvet MS besi ortamında gelişen 14 günlük Verbascum lydium var. lydium fideleri

40 20 30 günlük fidelerde Y besi ortamındaki gövde (8,77 mm) ve kök boyunun (23,14 mm), M ortamındaki gövde (8,58 mm) ve kök boyuna (19,58 mm) oranla daha yüksek olduğu kaydedilmiştir (Çizelge ve Şekil 3.2.4, 3.2.6, 3.2.7). Şekil Tam kuvvet MS besi ortamında gelişen 30 günlük Verbascum lydium var. lydium fideleri 45 günlük fidelerde de, Y besi ortamındaki gövde (21,09 mm) ve kök boyunun (33,76 mm), M ortamındaki gövde (13,33 mm) ve kök boyuna (24 mm) oranla daha yüksek olduğu belirlenmiş, ancak bu sürenin sonunda, k/g oranı M ortamında en yüksek olarak bulunmuştur (% 1,80) (Çizelge ve Şekil 3.2.5, 3.2.6, 3.2.7).

41 21 Şekil Tam kuvvet MS besi ortamında gelişen 45 günlük Verbascum lydium var. lydium fideleri Çizelge ve 45 günlük Verbascum lydium var. lydium fidelerinin gövde (g) ve kök (k) uzunlukları ile kök uzunluklarının, gövde uzunluklarına oranı (k/g). 25 C AYDINLIK UZUNLUK 30 günlük 45 günlük Y M Y M g (mm) 8,77 0,02 8,58 0,01 21,09 0,03 13,33 0,01 k (mm) 23,14 0,01 19,58 0,02 33,76 0,01 24,00 0,02 k/g (%) 2,63 2,28 1,60 1,80 Y: Yarım kuvvet MS M: Tam kuvvet MS

42 22 Y: Yarım kuvvet M M: Tam kuvvet MS Şekil ve 45 günlük Verbascum lydium var. lydium fidelerinin gövde (g) ve kök (k) uzunlukları (mm) Y: Yarım kuvvet M M: Tam kuvvet MS Şekil ve 45 günlük Verbascum lydium var. lydium fidelerinin kök uzunluk (k) / gövde uzunluk (g) oranı (%)

43 Fidelerin Taze ve Kuru Ağırlıklarına İlişkin Bulgular 14 günlük fidelerden alınan ölçümlerden elde edilen sonuçlara göre, en yüksek taze ağırlık 25 C de aydınlık uygulamasında ve Y besi ortamında (18,07 mg), en düşük taze ağırlık 19 C de aydınlık uygulamasında A besi ortamında (0,54 mg) kaydedilmiştir. En yüksek kuru ağırlık 25 C de aydınlık uygulamasında, Y besi ortamında (1,36 mg), en düşük kuru ağırlık ise 25 C de karanlık uygulamasında A besi ortamında (0,06 mg) kaydedilmiştir. 19 C de karanlık uygulamasında ise A,Y ve M besi ortamlarının herhangi birinde fide gelişimi gözlemlenmediği için ölçüm alınamamıştır (Çizelge ve Şekil 3.3.1). KA/TA oranı 19 C ve aydınlık şartlarındaki A, Y ve M ortamlarında yüksek görünmesine karşılık fidelerin taze ve kuru ağırlıklarının çok düşük oluşu sonuçlar ve tartışmada tartışılacaktır (Çizelge ve Şekil 3.3.2). Çizelge Çimlenip, gelişen 14 günlük Verbascum lydium var. lydium fidelerinin taze ağırlıkları (TA) ve kuru ağırlıkları (KA) ile kuru ağırlıklarının, taze ağırlıklarına oranı (KA/TA) AĞIRLIK 19 C 25 C D L D L A Y M A Y M A Y M A Y M TA (mg) ,54 0,01 KA (mg) ,07 0,02 KA/TA (%) ,129 0,03 1,65 0,03 0,18 0,01 0,109 0,02 1,54 0,02 0,23 0,01 0,149 0,01 0,84 0,01 0,06 0,03 0,071 0,01 8,55 0,01 0,66 0,01 0,077 0,02 4,28 0,02 0,35 0,02 0,081 0,01 0,76 0,01 0,08 0,02 0,105 0,03 18,07 0,02 1,36 0,01 0,075 0,02 D: Karanlık L: Aydınlık A: Agar Y: Yarım kuvvet MS M: Tam kuvvet MS 15,7 0,02 1,35 0,03 0,085 0,01

44 24 D: Karanlık L: Aydınlık A: Agar Y: Yarım kuvvet MS M: Tam kuvvet MS Şekil Çimlenip, gelişen 14 günlük Verbascum lydium var. lydium fidelerinin taze (TA) ve kuru ağırlıkları (KA) (mg) D: Karanlık L: Aydınlık A: Agar Y: Yarım kuvvet MS M: Tam kuvvet MS Şekil Çimlenip, gelişen 14 günlük Verbascum lydium var. lydium fidelerinde kuru ağırlık (KA) / taze ağırlık (TA) oranı (%) 30 günlük fidelerde, Y besi ortamındaki taze (23,22 mg) ve kuru ağırlığın (1,75 mg), M ortamındaki taze (21,05 mg) ve kuru ağırlığa (1,74 mg) oranla daha yüksek olduğu kaydedilmiştir (Çizelge ve Şekil 3.3.3).

45 25 45 günlük fidelerde de, Y besi ortamındaki taze (177,32 mg) ve kuru ağırlığın (13,31 mg), M ortamındaki taze (142,35 mg) ve kuru ağırlığa (12 mg) oranla daha yüksek olduğu kaydedilirken KA/TA oranı gerek 30 (% 0.082) gerekse 45 günün (% 0.084) sonunda M ortamında yüksek çıkmıştır (Çizelge ve Şekil 3.3.3, 3.3.4, 3.3.4). Çizelge ve 45 günlük Verbascum lydium var. lydium fidelerinin taze (TA) ve kuru ağırlıkları (KA) ile kuru ağırlıkların taze ağırlıklara oranı (KA/TA) 25 C AYDINLIK AĞIRLIK 30 günlük 45 günlük Y M Y M TA (mg) 23,22 0,02 21,05 0,01 177,32 0,02 142,35 0,03 KA (mg) 1,75 0,01 1,74 0,01 13,31 0,03 12,00 0,01 KA/TA (%) 0,075 0,082 0,075 0,084 Y: Yarım kuvvet MS M: Tam kuvvet MS Y: Yarım kuvvet MS M: Tam kuvvet MS Şekil ve 45 günlük Verbascum lydium var. lydium fidelerinin taze (TA) ve kuru ağırlıkları (KA) (mg)

46 26 Y: Yarım kuvvet M M: Tam kuvvet MS Şekil ve 45 günlük Verbascum lydium var. lydium fidelerinin kuru ağırlık (KA) / taze ağırlık (TA) oranı (%) Şekil Tam kuvvet MS besi ortamında gelişen 45günlük Verbascum lydium var. lydium fideleri

47 Aklimatizasyona İlişkin Bulgular 6 hafta süreyle haftada bir sıvı M ortamıyla sulanan kum kültüründeki fideler (18 haftalık) bu sürenin sonunda, 16/8 fotoperyod ve 25 C sıcaklık şartlarına sahip büyüme odasındaki ilk aklimatizasyonlarında tümüyle hayatta kalmayı başarmışlardır (Şekil 3.4.1). Yaklaşık 4,5 aylık olan bu fideler bu kez BT içeren viyollere aktarılmış (Şekil 3.4.2) ve 6 hafta süreyle 25 C sıcaklık ve 16/8 fotoperiyod şartlarına sahip büyüme odasında tutularak haftada bir çeşme suyuyla sulanmışlardır. Şekil Kum kültüründeki 18 haftalık Verbascum lydium var. lydium fideleri

48 28 Şekil Bitki toprağı (BT) içeren viyollere aktarılmış Verbascum lydium var. lydium fideleri

49 29 Bu ikinci aklimatizasyon aşamasından sonra viyollerde gelişen 6 aylık fideler % 67 lik hayatta kalma oranıyla seraya yerleştirilmişlerdir. Seradaki yaklaşık iki aylarının sonunda da bitkilerin hayatta kalma seviyelerini % 60 oranında korudukları belirlenmiştir (Şekil 3.4.3). Şekil Serada 8 aylık Verbascum lydium var. lydium fideleri

50 30 4. SONUÇ VE TARTIŞMA Biyoçeşitlilik, bir bölgedeki ya da dünya çapındaki hayatın değişkenlik miktarı anlamına gelen bir terimdir. Biyolojik Çeşitlilik Düzenlemesine göre birbirleriyle çok ilişkili olmak üzere üç farklı biyoçeşitlilik kademesi vardır: Ekosistem çeşitliliği, tür çeşitliliği ve genetik çeşitlilik (Glowka et al., 1994). Etik ve estetik anlam haricinde bile, biyoçeşitliliğin, bitkilerin medikal, besin ve diğer kullanım alanları dolayısıyla, ekonomiye birçok direkt ve indirekt etkileri vardır. Habitat tahribatı, kirlilik ve bitkisel kaynaklardan aşırı yararlanılması birçok türü kaçınılmaz yok oluşlarının eşiğine yaklaştırmıştır. Günümüzde bitki nesli tükenme oranı, insan etkisi nedeniyle doğanın normal oranından kat kadar fazla olan günde bire kadar ilerlemiştir (Hilton Taylor, 2000). Bu gidişat 50 yıl içerisinde bitki türünün yok oluşuyla sonuçlanabilir. Bugün dünya çapında yapılan çalışmalarda IUCN kriterlerine göre dünya florasının hemen hemen yarısının yok olma tehdidi altında olduğu belirtilmektedir (Pitman and Jorgensen, 2002). Yakın zamanda mevsimsel rutinlerde fark edilen değişimler de biyolojik çeşitliliğin yok oluşunu hızlandıracak gibi görünmektedir. Geleceğe dönük klimatik değişim beklentileri, bitkilere, habitatlarında yaratacağı farklılıklardan dolayı çok etki edecektir. Bu etkilerin içerisinde sıcaklık artışı, yağış düzenindeki değişiklikler, çölleşme, deniz seviyesinin yükselmesi, bitkilerin çimlenme mevsimlerindeki kaymalar, polinasyonu ve tohum taşınımını sağlayan etmenlerin kaybı, ekstrem hava olaylarının (yani kuraklık, sel, fırtınalar gibi) artan frekansı gibi faktörlere özellikle dikkat çekilmektedir (Jackson and Kennedy, 2009). Ex situ koruma, bitkilerin çeşitliliğinin korunması konusunda etkili bir yöntem olarak konuyla ilgili araştırmacılar tarafından rağbet görmektedir (Guarino et al., 1995). Bir bitki doğadan yok olduğunda, bu bitkinin yeniden yetiştirilebilmesi ve habitatına geri kazandırılabilmesi ex situ popülasyonlarla sağlanabilmektedir. Bu yönüyle ex situ popülasyonlar, çeşitli etmenlerle bozulan habitatların iyileştirilmesi ve bitkilerin yeniden bu habitatlara kazandırılması açısından da kritik önem arz etmektedir (Maunder et al., 2004).

51 31 Medikal bitkiler, geniş kullanım alanları ve insan sağlığına faydaları nedeniyle, insanoğlunun biyoçeşitlilikten belki de en doğrudan faydalandığı alanlardan biridir. Bu amaçla tıbbi bitkiler doğadan genellikle kontrolsüzce toplanır ve bu olay bitkinin genetik çeşitliliğini tehlikeye atar. Bu durumun önüne geçilebilmesi yönünde in vitro koruma stratejileri alternatif bir yaklaşım sunmaktadır. Nitekim son zamanlarda tıbbi bitkilerin üretiminde in vitro kültür tekniklerine artan bir ilgi söz konusudur (Balaraju et al., 2009; Baskaran and Jayabalan, 2008; Singh et al., 2009; Thomas and Shankar, 2009). Biz de bu çalışmamızda, tıbbi öneme sahip Verbascum cinsinin, endemik ve IUCN kategorilerine göre yakın tehdit altında (NT) bulunan Verbascum lydium var. lydium türünün in vitro koruma biyolojisi üzerine bir deneme yürüttük. İlgili literatüre bakıldığında bu türe ait daha önce yapılan herhangi bir çalışmaya rastlanmamaktadır. Bu nedenle çalışmamız Verbascum lydium var. lydium türü ile yapılan ilk in vitro çalışma olarak önem arz etmektedir. Verbascum lydium var. lydium tohumlarının in vitro çimlenmeleri ve çimlenen tohumlardan ortaya çıkan fidelerin gelişimi için gerekli koşulların belirlenmesiyle, türün doğal populasyonlarının güçlendirilmesi çalışmalarına katkı sağlanmasını amaçlayan çalışmamızda, ilk olarak bitkinin İzmir Ödemiş, Bozdağ (1600 m)'dan Ekim ayında tohumları toplanmıştır. Tohumlar, in vitro ekilmek üzere sterilize edilip, farklı besi ortamlarının etkilerini gözlemlemek üzere agar (A), yarım kuvvet MS (Y) ve tam kuvvet MS (M) besi ortamlarına ekilmiştir. İki farklı sıcaklık (18 ve 25 C) ve iki farklı ışık (karanlık ve aydınlık (16/8 fotoperiyod)) koşulları altında kültüre edilen tohumlarda çimlenme oranları gözlemlenmiş ve 14. günde çimlenmenin tüm guruplarda sona ermesiyle değerler kaydedilmiştir. Sonuçlar incelendiğinde, 14. günde en yüksek çimlenme oranının, % 84 ile agar besi ortamında, 25 C sıcaklık ve aydınlık koşullarında; en düşük çimlenme oranının ise, % 6 ile tam kuvvet MS besi ortamında 19 C sıcaklık ve karanlık koşullarında ortaya çıktığı görülmektedir (Çizelge 3.1.1, Şekil 3.1.3).

52 32 Çalışmamızda, sıcaklığın çimlenmeyi etkilediği gözlemlenmiştir. 25 C' de ilk radikula 1. gün görülürken, 19 C' de ise 5. günde rastlanmıştır. İki hafta sonunda 25 C' deki uygulamalarda, toplam çimlenme oranı % 47 iken, 19 C' deki uygulamalarda ise % 33' tür. Sıcaklık, tohumların su alınımının başlangıç süreçlerini ya da sonrasındaki, hücre bölünmesine sebebiyet veren biyokimyasal süreçleri etkilemiş olabilir (Bewley and Black, 1978; Kermode, 1990). Zhigang et al. (2010), Piper nigrum tohumlarının çimlenmesi üzerine farklı sıcaklık (20, 25, 30, 35, 40 ve 45 C) ve ışık (karanlık ve 12/12 fotoperyod aydınlık) etkilerini araştırdıkları çalışmalarında, çimlenmenin, uygulama seviyelerine göre nispeten düşük (20 C) ve yüksek (40 ve 45 C) sıcaklıklarda değil optimum kabul edilebilecek sıcaklıkta (30 C) gerçekleştiğini belirtmişlerdir. Denemelerimizde ışık koşulları da belirgin olarak çimlenme oranlarını etkilemiştir. 25 C' de aydınlık uygulamasında toplam çimlenme oranı % 63 iken karanlık uygulamasında % 30' dur. 19 C' de ise aydınlık uygulamasında toplam çimlenme oranı % 52 iken karanlık uygulamasında % 14' tür. Çimlenmede ışık gereksinimi bir çok küçük tohumlu bitki için geçerlidir (Plummer and Bell, 1997; Clarke et al., 2000). Bunker (1994), Brachycome iberidifolia bitkisiyle yaptığı denemelerde, ışığın bitkinin tohumlarının çimlenme oranını arttırdığını bulmuştur. Bizim çalışmamızda en uygun çevresel koşullar olduğu saptanan 25 C sıcaklık ve aydınlık uygulamasındaki farklı besi ortamlarının etkilerine göz atıldığında ise en iyi çimlenme oranının % 84 ile agar (A), en düşük çimlenme oranının ise % 46 ile tam kuvvet MS (M) besi ortamında olduğu saptanmıştır (Çizelge 3.1.1, Şekil 3.1.3). Denemelerimizde in vitro şartlarda test edilen farklı besi ortamlarının çimlenmeye etkisi incelendiğinde görülmüştür ki, ortamdaki tuzların oranı arttıkça bitkimiz tohumlarının in vitro çimlenme oranını azalmıştır. Bu durumda V. lydium var. lydium tohumlarının çimlenme oranının tuzlulukla ters orantılı olduğunu söyleyebiliriz. Bunun da nedeni, tuzluluk artışının, ortamdaki ozmotik potansiyelde artış meydana getirmesi olabilir (Kaufman, 1969). Bu olay su girişine ve çimlenmeye engel olmaktadır. Birçok çalışmada da, farklı türlerin çimlenmesinde, düşük tuz konsantrasyonuna sahip ortamların daha faydalı olduğu gösterilmiştir (Hu ve Zanettini, 1995; Chang ve Yang, 1996; Fregene et al., 1999).

53 33 Nitekim denemelerimizde de görülen en düşük çimlenme cevabı, tüm şartlarda, M ortamında meydana gelmiş; en uygun ortam ise A olarak belirlenmiştir. Öte yandan, çimlenme sürecinde duyulan mineral ihtiyacı türden türe değişiklik gösterir ve muhtemelen tohumdaki rezervlere bağlıdır (Padilla and Encina, 2003). Görülmüştür ki V. lydium var. lydium tohumları çimlenme aşamasında ortamdan alınacak minerallere ihtiyaç duymamaktadırlar. Buradan, bitkinin tohumlarının, besin rezervlerinin tohumun çimlenmesine yetecek düzeyde olduğu; in vitro şartlarda çimlenmeye ihtiyaç duyulduğunda, basitçe, agar kullanılmasının yeterli olacağı söylenebilir. Ayrıca çimlenme ile ilgili tüm sonuçlar göz önüne alındığında, en iyi çimlenmenin A ortamında, 25 C sıcaklıkta ve aydınlık şartlarda gerçekleştiğini söyleyebiliriz. A, Y ve M ortamlarına ekilen ve farklı ışık ve sıcaklık şartlarına yerleştirilen tohumların çimlenmesiyle ortaya çıkan fidelerin 14. günlerinin sonunda, yani erken büyüme safhalarında, gelişimlerini incelemek üzere, çeşitli morfolojik ölçümler (kök, hipokotil uzunluğu ile taze ve kuru ağırlık değerleri) yapılmıştır. Bu ölçümlerden anlaşıldığına göre, en yüksek hipokotil (7,95 mm) ve kök (26,28 mm) uzunluğu 25 C sıcaklık ve aydınlık uygulamasında, yarım kuvvet MS (Y) besi ortamında; daha sonra M ortamında (hipokotil: 6,92 mm; kök: 24,83 mm) en düşük olarak da (hipokotil: 5,16 mm; kök: 6,5 mm) agar (A) ortamında ortaya çıkmıştır (Çizelge 3.2.1, Şekil 3.2.1). Kök uzunluğunun, hipokotil uzunluğuna bölünmesiyle elde edilen kök/hipokotil uzunluk oranlarına bakıldığında ise en yüksek oran M (% 3,58 ) ortamında ve ona yakın şekilde Y ortamında (% 3,30) görülmektedir. En düşük oranın, herhangi bir besleyici içermeyen agarda (A) (% 1,25), ortaya çıkışı çok da şaşırtıcı olmamıştır (Çizelge 3.2.1, Şekil 3.2.2). En yüksek taze ağırlık (18,07 mg) ve kuru ağırlık (1,36 mg) değerleri de yine öncelikle Y ortamında (25 C sıcaklık ve aydınlık), onu takiben M ortamında (TA: 15,7 mg; KA: 1,35 mg) (25 C sıcaklık ve aydınlık); en düşük taze ağırlık (0,76 mg) ve kuru ağırlık (0,08 mg) ise A ortamında kaydedilmiştir (Çizelge 3.3.1, Şekil 3.3.1). Kuru ağırlığın, taze ağırlığa bölünmesiyle elde edilen kuru/taze