DOĞAL ANTİOKSİDANLAR, YAPI-ETKİNLİK BAĞINTILARI ve ANALİZLERİ

Transkript

1 ÇMÜ FBE Kimya Anabilim Dalı Yüksek Lisans Semineri Hazırlayan: Ferah CÖMERT Danışman: Prof. Dr. Mehmet AY 17/01/2011 DĞAL ATİKSİDALAR, YAPI-ETKİLİK BAĞITILARI ve AALİZLERİ

2 İÇERİK-1- (giriş) Reaktif ksijen Türler nedir(rs)? asıl oluşurlar? edenleri, Etki Alanları ve Sonuçları Lipid peroksidasyonu hangi ara yolları kullanır? Biyomoleküller için oksidatif hasar ve oksidanların metal aracılı oluşumu ksidatif stresten organizma savunması ve ATİKSİDALAR Animasyon gösterisi Antioksidan savunma sistemleri ne şekilde gerçekleşir? Sentetik ve DĞAL ATİKSİDALAR nelerdir?...

3 Reaktif ksijen Türler (RS) ormal oksijen metabolizması sırasında az miktarda oluşurlar Serbest radikaller ve radikal olmayan türevler 2 H 2 2, H, vb. Zincir reaksiyonlarını başlatırlar Hücrede çeşitli karbon merkezli serbest organik radikaller oluştururlar Sonuç: ksidatif stres

4 ksidanlar (serbest radikaller) nasıl oluşur??? 2 + e - + H +. H 2. H 2 H H + + e - H 2 2 H e - H - + H. (Hidroperoksil radikali) (Süperoksit anyon radikali) (Hidrojen peroksit) (Hidroksil radikali) RS türlerini oluşturmak için hızlıca diğer moleküllerle etkileşir Çoğunluğu mitokondride oluşur H. + e - + H + H H H H. Harber Weiss Reaksiyonu Fe 2+ + H 2 2 Fe 3+ + H. + H - Fenton Reaksiyonu toksisitesi, 2 -. ile bağlantılı (Peroksinitrit anyonu) DA Parçalanması ve lipid oksidasyonu

5 Mitokondride RS EDELERİ Çevresel faktörler, İlaçlar, Metal iyonları, Radyasyon, İltihabi süreçler, Aşırı egzersiz SERBEST RADİKALLER Membran lipidler, ükleik asitler, Proteinler, Karbonhidratlar RS SUÇLARI Kanser, CVD, Sinir dokusu bozulumu, Diyabet, Yaşlanma süreci, Akciğer hastalıkları, Eklem iltihabı RS ETKİ ALALARI

6 Hücre bileşenlerinin şematik gösterimi Seçici, geçirgen rganeller Mitokondri vb vardır özellikte Hücre membranı oluşur Lipidler, Proteinler, glikolipid ve glikoprotein yapısında KH lar oluşur HÜCRE oluşur çekirdek bulunur Kalıtsal madde oluşur vardır sitoplazma gerçekleşir gerçekleşir DA sentezi ve onarımı, RA sentezi Çeşitli fonksiyonları Yaşamsal olaylar

7 Reaktif ksijen Türler Yüksek konsantrasyonlarda; Hücre ölümleri Hücre yapıları, Lipidler, Proteinler ve ükleik asitleri harap eden lipid peroksidasyonunu başlatır. Düşük ve ılımlı konsantrasyonlarda; Hücre çoğalması in vivo fizyolojik rol oynarlar Enerji üretimi, Hücre gelişmesi, Bulaşıcı ajanlara karşı fagositoz vb. 2.- H 2.- H. H 2 2 Lipid peroksidasyonu, Ribonükleotid hasarı Membranı geçip doku hasarı Sitotoksik ajan; canlı dokularda her moleküle hasar verir DA hasarı, membran parçalanması, Ca +2 iyonlarının serbest kalması

8 Lipid Peroksidasyonu nedir, hangi ara yolları kullanır??

9 Biyomoleküller için ksidatif hasar!!!!! H. Radikali; Pürin ve pirimidin bazları ile deoksiriboz temelini hasara uğratır Sonuç: Genetik materyalin kalıcı modifikasyonu, İlk adımda mutasyonların meydana gelmesi, Kanser ve yaşlanma H 2 H H + H H 2 H H H H oksidasyon H 2 H H H guanin 8- hidroksiguanin

10 ksidanların metal aracılı oluşumu Vücutta ağır metallerin miktarlarının artması ile oluşan risk Fe; CVD, kanser ve nörolojik hastalıklar, Cu; yüksek konsantrasyonda kanser hücrelerinin yayılması, Co(II) kompleksleri; kalp toksisitesine sebep olan oksijen radikalleri RS. RMAL HÜCRE Başlama DA hasarı DA tamiri DA hasarı üzerine RS in etkileri ve kanser oluşmasındaki rolü. HASARLAA HÜCRE Gelişme Çoğalma Apoptosis.... TÜMÖR MERKEZ DKU BZUKLUĞU eoplazma hücre durumu İlerleme Swaran J.S. Flora, xidative Medicine and Cellular Longevity 2:4, ; 2009

11 ksidatif stres ten organizma savunması!!! Antioksidanların özellikleri Serbest radikalleri süpürebilme yeteneği, Diğer antioksidanlarla etkileşime girmeli (yenilenmeli), Gen ekspresyonu üzerinde pozitif etkiye sahip olmalı, Kolayca absorblanmalı, Fizyolojik olarak dokular ve biyo sıvıları içinde belirgin bir konsantrasyona sahip olmalı, Sulu ve/veya lipid membran alanlarının her ikisinde de işlev görmeli.

12 ATİKSİDALARI, KSİDALARA ETKİSİ Daha zayıf yeni bir moleküle dönüştürme; antioksidan enzimler ksidanlara bir hidrojen aktararak inaktive etme; vitaminler, flavonoidler Hb ve ağır mineraller oksidanları kendilerine bağlar ksidatif hasar görmüş biyomolekülleri onarır

13

14 Serbest radikallere karşı hücresel savunma!!! ATİKSİDA SAVUMA SİSTEMLERİ Enzimatik Enzimatik olmayan DĞAL SD kat GPx ve Gred H + SD H katalaz 2H 2 2 2H GSH + H 2 2 2GSH + RH GPx GPx GSSG + 2H 2 GSSG + RH + H 2 Vitamin C ve E, Karotenoidler, Tiyol antioksidanlar, Flavonoidler, Melatonin, Lipoik asit CoQ10 Fitokimyasallar SETETİK BHT ve BHA, Propil gallat, p-ter-bütil vb.

15 İnsan vücudu doğal olarak antioksidanları üretir (%100 etkili değildir), Meyveler, sebzeler ve tıbbi bitkiler en zengin antioksidan kaynakları, Doğal ürünler antioksidanların geniş bir bölümünü sağlayan kaynaklardır, Fitobileşenler önemli antioksidan kaynağı (serbest radikal zincir reaksiyonlarını sonlandırır) CVD kanser Bozulmuş hücre homeostazı RS in birikmesi

16 İÇERİK-2- (gelişme) 1. Yaygın DĞAL ATİKSİDALAR ın Literatürdeki çalışmalarla örneklendirilmesi; Vitamin C ve E, Melatonin, Glutatiyon, Karotenoidler, Selenyum, Polifenolik bileşikler 2. Yapı-etkinlik bağıntıları ve antioksidan işbirliği, 3. Bitki numunesinin maruz kaldığı aşamalar? 4. Antioksidanların gıdalardan ve destek ürünlerinden alınması sonucunda neden aynı etkiyi göstermedikleri

17 Vitamin C Askorbik asit Vitamin E α-tokoferol Vücudun sulu ortamında çalışır, iyonlaşabilen 2 H grubuna sahiptir.- 2 ve H. uzaklaştırır, ortamdan Düşük konsantrasyonlarda serbest radikal rxn. larının katalisti veya pro- oksidan olarak değerlendirilir, Yüksek konsantrasyonlarda güçlü antioksidan, Görevi: oksidatif DA, lipid ve protein hasarının oluşumunu indirgemek Zincir kırıcı antioksidan olarak bilinir, GPx ile Vit E; serbest radikallere karşı birbirlerini tamamlayıcı etki gösterirler GPx: oluşmuş peroksitleri ortadan kaldırır Vit E: peroksitlerin sentezini engeller Selenyumun organizmadan kaybını önler ve Se ihtiyacını azaltır tokoferol türlerinin antioksidan aktiviteleri alfa > beta > gama > delta şeklindedir. Görevi: lipid peroksidasyonuna karşı koruma Antioksidan işbirliği Sinerjistik etki

18 DÖR % 99.9 AscH 2 AscH - Asc 2- H H H H pk= 4.1 H pk=11.8 H H H - H - - -e H H AscH. H Asc -. H -H +. R. H +H + pk = RH α-tokoferol CH 3 α-tokotrienol CH 3 H H H CH 3 CH 3 H CH 3 3 H CH 3 CH 3 CH 3 CH 3 3

19 Epifiz bezinin en önemli ürünü MELATİ ve ATİKSİDA GÜCÜ 5-Metoksi--asetiltriptamin H 3 C H CH 3 İki şekilde etki; H. H H 3 C H H İndolil radikali H.. H CH H H H H CH 3 Reseptörden bağımsız olarak oksidan maddeye elektron sağlar (doğrudan süpürücü etki) H 2 2, 2 -. H H H Siklik 3-hidroksi melatonin CH 3 İdrarla atılım H 3 C H CH3 H Ṅ. H Endojen kaynaklı mekanizmaları reseptör bağımlı olarak harekete geçirerek gösterdiği indirekt etki (İS enzimini inhibe eder ve miktarı düşer)

20 KSİDATİF FSFRİLASY ETKİLİĞİİ ARTTIRIR KSİJEDE TÜREYE RADİKALLERİ DETKSİFİYE EDER ADEZY MLEKÜLLERİİ AZALTIR GEİŞ ve YAYGI HÜCRE İÇİ DAĞILIM GÖSTERİR H 3 C H H CH 3 ATİKSİDA EZİMLERİ UYARIR MELATİ TÜM MRFFİZYLJİK BARİYERLERİ GEÇER HÜCRE MEMBRAII STABİLİZE EDER İTRJEDE TÜREYE RADİKALLERİ DETKSİFİYE EDER

21 Piper hispidinervum karabiber bitkisi safrol Karsinojen olmasından dolayı yasaklanmıştır isosafrol Kansere sebep olan safrol ün DA üzerine hasar oluşturucu etkisini MELATİ inhibe eder İsosafrol türevi de sanayide bir çeşit boya olan heliotropin in sentezinde kullanılmış, ama ecstasy gibi psikoaktif maddelerin sentezlerinin başlangıç maddesi olarak kullanılmasının ardından sadece tıpta kullanımına izin verilmiştir. H ecstasy

22 Tiyol antioksidanların ATİKSİDA gücü SH H - - H H 3 + Glutamat Sistein Glisin Glutatiyon (GSH) GSH + R. GS. + GS. GS. + RH GSSG Hücre içinde birikir, GSH/GSSG oranı oksidatif stresin iyi bir ölçümüdür Tek e- kaybına kolaylıkla uyum sağlayan Sülfür atomu S S Lipoik asit(la) CH SH HS Dihidrolipoik asit(dhla) CH farkı Su ve yağda çözünebildiğinden hücresel membranlarda geniş bir şekilde dağıldığından, güçlü antioksidanlardır. Dokularda hızlıca indirgenmiş formuna dönüştürülür. ksidanları söndürme etkisi vardır, vitamin C ve E, glutatiyon u yeniler, oksitlenmiş proteinleri tamir eder CVD, sinir sistemi bozulması, HIV infeksiyonları vb birçok hastalığı engeller Fenton reaksiyonunda oluşan H. miktarını azaltır

23 Karotenoidler (likopen, lutein) ve glukozinolatlar H 3 C H 3 C CH 3 CH 3 CH 3 CH 3 CH 3 H 3 C CH 3 CH 3 Glukozinolatlar Trans β-karoten Antioksidan etkisi konjuge çift bağlarından ileri gelir, etkili yüksek kons.da peroksidatif hasardan lipidleri korur, Kanser hücreleri üzerinde antiproliferatif etkiye (hücre bölünmesi yoluyla çoğalma) sahiptir Cruciferous (turpgiller) familyasında (brokoli, lahananın tüm çeşitleri, karnabahar) bol miktarda bulunan önemli fitokimyasallar, bitki hücre duvarının parçalanmasından sonra açığa çıkarlar, endojen tiyoglukozidazlar tarafından enzimatik hidrolize maruz kalırlar, çok değişik biyolojik aktiviteler ile yapısal olarak farklı bileşik ürünleri (izotiyosiyanatlar, tiyosiyanatlar ve nitriller) üretirler, Bu aktif bileşikler sitokrom P450 nin inhibisyonunu sağlar.

24 Selenyumun ATİKSİDA etkisi ormal hücrelerin kanserli hücrelere dönüşümünü önleyen antimutajenik ajan, Seleno enzimleri; oksijen metabolizması, kanser hücrelerinde apoptosisin başlaması, hücre bölünmesinin kontrolünde ve bağışıklık sisteminin işlevini yerine getirmesinde rol oynar. Kansere karşı koruyucu etkisi Amerika da araştırılmış; günlük dozun 200 µg olması ile kanser hastalığı riskini azaltmadığı görülmüştür. Ancak Çin de β-karoten ve α-tokoferol ile 50 µg Se kombine edildiğinde mide kanserini engellediği gözlenmiştir. in vitro çalışmalar oksidatif stresten DA hasarını azalttığını raporlamıştır. Son çalışmalar: kanser büyüme hücreleri, kültürler üzerindeki apoptosis, dozuna ve oluşumuna bağlı olarak hayvanlarda kanser oluşumu üzerine inhibisyon etkisini göstermiştir. Clara Balsano, Current Pharmaceutical Design, 2009, 15,

25 Polifenolik (PP) bileşiklerin temel sınıfları ile gerçekleştirdiği biyosentetik arayolu H resveratrol H fenilalanin H p-kumarik asit H H Üzüm ve kırmızı şarapta Fungal infeksiyonlar, CVD, yaşlanma vb. etkili LDL kolesterolünün (kötü kolesterol) oksidasyonunu inhibe eder, serbest radikal süpürücü aktivitesi oldukça yüksektir stilbenler sinnamik asitler H kalkonlar flavonoidler H prosiyanidinler antosiyaninler H H narinjenin kalkon H H kersetin H H H PP değildir, bazı fonksiyonel özellikleri PP lere benzer H H + H H H siyanidin

26 Bitkilerde bol miktarda bulunan Flavonoidlerin ATİKSİDA kimyası H A C ' H H B 6' 3' 4' 5' H Elektron delokalizasyonuna etki ederek yüksek kararlılıkta flavonoid radikalini oluşturur 3' H Konjugasyon B halkasının elektron delokalizasyonuna katkı sağlar H H A H C ' H B 6' 4' 5' Dragan Amic, Current Medicinal Chemistry, 2007, 14, Max. radikal uzaklaştırma etkisi sağlar

27 3,4 -dih flavonoidlerin antioksidan etkilerinin mekanizması H H H. H R. RH H H bağlı kararlı Flavonoid fenoksil radikali H H H H H. H H R. RH Kararlı kinon yapısı H H H H Dragan Amic, Current Medicinal Chemistry, 2007, 14,

28 Flavonoidlere metal iyon bağlanmasında katkıda bulunan konumlar H +n Me H H 3, 4 dih konumları H Me +n H Me +n C-3 ve C-5 H grupları ve 4-okso grubu Dragan Amic, Current Medicinal Chemistry, 2007, 14,

29 Flavonoidlerin yaygın yapı sınıfları (2-fenilbenzopiranlar) ' 5' 4' 3' 2' ' 5' 4' 3' 2' H ' 5' 4' 3' 2' ' 5' 4' 3' 2' H ' 5' 4' 3' 2' H Flavon (apigenin) Flavonol (kersetin) Flavanon (hesperetin) flavan-3-ol (kateşin) Flavanonol (Taxifolin) İsoflavon (genistein) ' 5' 4' 3' 2'

30 Kersetin in oksidasyonu ve glutatyon (GSH) ile işbirliği H H SH H H H Kersetin - H H 3 + GSH H - [] H H H kersetin o-kinon H QQ H H kersetin p-kinon Tiyol gruplarını arillemesi nedeniyle çeşitli toksik etkiler gösterir + GSH H SG H H 6-glutatiyonil kersetin (6-GSQ) H H SG H H H 8-glutatiyonil kersetin (8-GSQ) H H GSH; QQ ya karşı korur Tiyollerle QQ nun bağlanması membran geçirgenliğinin artması gibi toksik etkilere neden olur Awad et al., 2002

31 Kersetin in in vivo ve in vitro toksik ve yararlı etkilerinin şematik gösterimi R 1 R 2 R 4 R 3 Yararlı etkileri H Kersetin Toksik etkileri Kinon oluşumu in vitro Genotoksisite in vitro

32 Yeşil çay kateşinleri ve antioksidatif etkileri Lipid peroksidasyonunu durdurur ve metallerin bağlandığı öncelikli konumlar H H H H H H H H H H (-)-epikateşin -H sayısı azaldıkça Antioksidan etki azalır H (-)-epikateşin-3-gallat H H H H H H H H H H H Etkisi fenolik grupların düzenlenmesine ve sayısına bağlıdır H H (-)-epigallokateşin H (-)-epigallokateşin-3-gallat H Etki sırası: EGCG>EGC>ECG>EC o-trihidroksi grupları ve 3-gallat esteri katkı sağlar

33 Flavonoidlerin pro-oksidan aktivitesi 2 Kararlı flavonoid fenoksil radikali prooksidan etki gösterir -H grupları ayrıca kanser gelişiminde önemli prosesler olan İmmün endotel hücre adezyonu ve damar gelişimi gibi biyolojik olaylarda rol oynarlar H. 1 H H Kinonları ve süperoksit anyon radikalini oluşturmak için oksijenle etkileşir ve zincir reaksiyonu sonlanır Yüksek miktarda geçiş metal iyonlarının varlığında gözlenir H H -H + H H 4 Aynı bileşik A-H ve P- özellik gösterebilir Pro-oksidan aktivite H gruplarının toplam sayısı ile orantılıdır

34 Bitki örneği hangi aşamalardan geçip, bileşenlerine ayrılır!!! Bitki örneği kurutulup öğütülür petrol eteri Ekstraksiyon Ekstrakt Kalıntı Metanol yağlar, steroidler, terpenler, klorofil Ekstrakt Ekstraksiyon Kalıntı Su pigmentler, alkaloidler, flavonoidler, taninler Ekstrakt Ekstraksiyon Kalıntı tuzlar, şekerler, amino asitler, bazı proteinler, çok polar bileşikler yağlar, steroidler, terpenler, klorofil

35 Flavonoidler, bitkilerden nasıl elde edilirler? Seçici özütleme yöntemi; Bitki örnegi süzme apolar çözücülerle ekstraksiyon Ekstrakt Bitki kalintisi dietileterle ekstraksiyon Bitki kalintisi etilasetatla ekstraksiyon Dietil eter ekstrakti Bitki kalintisi Etilasetat ekstrakti etanol veya metanolle Bitki kalintisi Etanol veya metanol ekstrakti FLAVIDLER

36 Polygonum hidropiper (çoban ekmeği) bitkisinden elde edilen antioksidatif flavonoidlerin etkileri nasıldır? R 1 R 2 R 4 H R 3 her biri α-tokoferolden daha aktiftir R 1 R 2 R 3 R 4 a CH 3 H H CH 3 7,4 --dimetilkersetin b H CH 3 H H 3 --metilkersetin c H H H H Kersetin d H H -Glc H İsokersitrin Antioksidatif etkileri: d>a>c>b

37 Antioksidanlar neden aynı etkiyi göstermiyorlar??? Antioksidan destek ürünleri neden risk oluşturur? Veya besinler yoluyla alınan antioksidanların destek amaçlı alınan eşdeğerlerinden farkı ne? Besinlerdeki vitaminlerin, minerallerin ve antioksidanların bir birliktelik içinde bu yararı sağladıkları bir olasılık olarak düşünülüyor. Doğal antioksidanlar besinlerde en az iki kimyasal formda bulunuyor. Vitamin C nin dehidroaskorbik asit formunu içeren antioksidanların vücutta depolanmış demir kanalıyla serbest radikallerin oluşumunu tetikleyici etkisi olduğu ve besinlerdeki etkiyi göstermeyeceği belirtiliyor. Besinlerde cis- ve trans- formlarında bulunan β-karoten, destek ürünlerinde trans formunda bulunuyor, bunun sonuçta sigara içenlerde akciğer kanseri riskini %28, kalp hastalıklarını da %17 arttırdığı iddia ediliyor.

38 İÇERİK-3 ve SUÇ Antioksidan Aktivite Ölçüm Metotları nelerdir? asıl uygulanırlar? Tez kapsamında seçilen yöntemlerin karşılaştırılması ve neden seçildikleri Enzim-aktivite ilişkisi ve sitotoksisite, Antioksidan çalışmalar nereye gidiyor? Gelecekteki yeri?

39 Antioksidan aktivite ölçüm yöntemleri TEST ÖLÇÜM YÖTEM Peroksit değeri (PV) Peroksitler ve hidroperoksitler İyodometrik titrasyon (indikatör nişasta) Dien konjugasyonu Lipid oksidasyonu içindeki 1,4- dienler Tiyobarbitürik asit reaktif maddeler (TBARS testi) Lipid oksidasyonu Örneğin kütle yüzdesindeki absorbansın artışıyla ( nm) TBA ile MDA nın kondensasyonu sonucunda pembe pigmentli kromofor ( nm) LP-586 testi Lipid oksidasyonu -metil-2-fenilindol ile MDA nın kondensasyonu ile kromofor oluşumu (586 nm) Anisidin değeri (AV) Aldehitler İsooktan-asetik asit çözücü sistemi (350 nm de absorbans) Epoksitler, ketonlar, HC lar vb son ürünler Lipid oksidasyonu Linoleik asitin sulu çözeltisi, karoten, antioksidan karıştırılır ( nm) Fikoerithirin testi Hidroksil radikallerine karşı Kımızı deniz yosunlarından elde edilen boya maddesi βfikoerithirin (yüksek floresan protein) kullanılır. (floresans şiddeti)

40 Antioksidan aktivite ölçüm yöntemleri reaksiyonlarına dayanır Elektron Transfer (ET) Antioksidanın indirgeyici yeteneğini ölçer Hidrojen Atom Transfer (HAT) Antioksidanın hidrojen verebilme yeteneğini ölçer Zincir kırma kapasitesinin ölçümü ile ilişkili Bileşiğin antioksidan kapasitesi veya radikal yakalama yeteneği H atom verebilme kolaylığı ile alakalı Folin-Ciocalteu (F-C) ayıracı ile Toplam fenoliklerin ölçümü, (TEAC) Trolox Eşiti Antioksidan Kapasite, (FRAP) Demir İyonu İndirgeyici Antioksidan Güç, CUPRAC (ksidan olarak Cu(II) kullanan toplam antioksidan potansiyel yöntemi, DPPH yöntemi RAC (ksijen Radikal Absorbans Kapasitesi) TRAP (Toplam Radikal Yakalayıcı Antioksidan Parametre)

41 HAT esaslı yöntemler; RAC (ksijen Radikal Absorbans Kapasitesi) Fitokimyasalların, bitkisel maddelerin, gıdaların antioksidan kapasitesinin ölçülmesinde çok faz kullanılır, Cao ve Prior tarafından geliştirilmiştir, Plazma ve doku homojenatlarında bulunan çeşitli doğal antioksidanların ölçümü, Peroksil radikalinin neden olduğu oksidasyonun, antioksidan tarafından inhibisyonunu temel alır, TRAP (Toplam Radikal Yakalayıcı Antioksidan Parametre) Wayner ve ark.ları tarafından geliştirilmiştir, Azo bileşiğin sıcaklıkla bozulması ile oluşturulan kontrollü lipid peroksidasyonu boyunca oksijen tüketiminin ölçülmesini temel alır, Plazmaya AAPH (2,2-azobis-(2-amidinpropan) dihidroklorür) eklendikten sonra okside olabilen materyalin oksidasyonu, reaksiyon süresince tüketilen oksijen yoluyla izlenir.

42 ET esaslı yöntemler; Folin-Ciocalteu (F-C) ayıracı ile Toplam fenoliklerin ölçümü Fenolik bileşikler ve diğer indirgeyici bileşiklerden molibdenyuma elektron transfer edilmesine dayanmaktadır, Mavi renkli kompleks oluşumu nm de spektrofotometrik olarak belirlenir, Standart bileşik olarak genellikle gallik asit kullanılır ve sonuçlar gallik asit eşiti (mg/l) olarak verilir., Protein analizi için tasarlanan bir yöntemdir, Sonradan Singleton ve ark.ları şaraptaki toplam fenolleri ölçmek için bu yöntemi kullanmıştır, Fenolik bileşikler sadece ph 10 da F-C ayıracı ile reaksiyona girer. (TEAC) Troloks Eşiti Antioksidan Kapasite Yöntemi Miller ve ark.ları tarafından geliştirilmiştir, 660, 734 ve 820 nm de maksimum olan karakteristik uzun dalga boylu absorpsiyon spektrumu gösteren ABTS radikal anyonun absorbansının antioksidan tarafından inhibisyonuna dayanır 2,2-azinobis(3-etilbenzothiazollin-6-sulfonik asit)

43 H 2 2 ile metmiyoglobinin aktivasyonu sonucu ferrilmiyoglobin radikali oluşur, Bu bileşik daha sonra ABTS ABTS - oluşmasına neden olur, Test edilecek örnek ABTS - oluşumundan önce eklenir böylece radikallerin oluşumu önlenir. - 3 S S S S 3 -. antioksidan C 2 H 5 ABTS.- C 2 H 5-3 S S S S 3 - C 2 H 5 C 2 H 5 ABTS 2- (renkli)

44 FRAP (Demir İyon İndirgeyici Antioksidan Güç Yöntemi) Düşük ph ta Fe +3 Fe +2 renkli ferröz- tripiridiltriazin [Fe (III) (TPTZ) 2 Cl 3 (TPTZ)= 2,4,6-tripiridil-s-triazin) = Herein] kompleksini oluşturur, bu demir tuzu oksidan olarak kullanılır, Asidik ortamda antioksidan varlığında kompleks Fe +2 indirgenir, renkli çözelti 595 nm de asorbansda artışa neden olur. (CUPRAC) ksidan larak Cu(II) Kullanılan Toplam Antioksidan Kapasite Yöntemi Prof. Dr. Reşat APAK tarafından geliştirilen bu yöntem; Örnekte bulunan antioksidanlar tarafından Cu(II) nin Cu(I) e indirgenmesini temel alır, Kromojenik ayıraç olan bathocuproin (2,9-dimetil-4,7-difenil-1,10- fenanthrolin) kullanılır, Cu(I) ile kompleks oluşturur 490 nm de max absorbans Askorbik asit, gallik asit ve kersetin için birkaç dk.da tamamlanır

45 antioksidan DPPH Testi (2,2-difenil-1-pikrilhidrazil) Cu 2+ oksidan Ticari olarak elde edilebilen kararlı organik nitrojen radikali, 515 nm de max absorbans, Molekülde serbest elektronun yer değiştirmesi menekşe renginin oluşmasına neden olur, Cu + A-H tarafından DPPH serbest radikaline proton transferi 517 nm de absorbansın azalmasına neden olur, Cu (II) Cu (I) 2 Bu süreç görünür alanda absorbans sabitlenene kadar takip edilir A-H H DPPH radikalinin A-H ile rxn.u A.

46 Teucrium ramosissimum (verem otu) bitki yapraklarından elde edilen ekstraktların Antioksidan aktivitesini DPPH ve TEAC yöntemleriyle incelediklerinde elde edilen grafiksel sonuçlar DPPH radikalinin karakteristik mor rengi 517 nm de spektrofotometrik olarak takip edilmiştir. Metanol ve sulu ekstraktlar, % 84,25 ve % 81,56 DPPH standart çözelti absorbansının düşme yüzdesi ile güçlü radikal süpürücüler olmuşlardır. Potasyum persülfat tarafından oluşturulan ABTS serbest radikali üzerine ekstraktların süpürücü aktivitesi Trolox un standart miktarı ile birleştirilmiştir, Sulu ekstrakt yüksek TEAC değeri sergilemiştir Environmental toxicology and pharmacology 3 1 (2011 )

47 Tez aşamasında yapılması planlanan TEAC, CUPRAC, FRAP, DPPH, F-C reaktifi ile Toplam fenoliklerin tayini metotları EDE seçildi??? Avantajları ve dezavantajları ELER??? TEAC FRAP Hem sulu hemde lipid fazda kullanılır, Fitokimyasalların antioksidan aktivitelerinde Çok kullanışlıdır, Basit ve hızlıdır, geniş ph aralığında uygulanabilir, Lipofilik ve hidrofilik bileşiklerin antioksidan kapasitesi belirlenebilir Ayrıca örnek başına 10 dk. yeterli, Fazla uzmanlık gerektirmez, Ayıraçlar çok ucuz Aralarında çok fazla fark yoktur, Sadece TEAC nötr, FRAP asidik ph ta gerçekleştirilir, Basit, hızlı, ucuz ve özel aletler gerektirmez. Bakır reaksiyon kinetikleri demirden daha hızlı, GELECEĞİ YÖTEMİ, CUPRAC-FRAP farkı F-C REAKTİFİ İLE DPPH AMAÇ: sadece toplam fenolikleri belirlemek, bazen uygun olmayabilir Uzun zaman alır TEAC ve DPPH ile bağlantılı Çok kullanılır, basit ve hızlı, Uzun ömürlü radikaldir, birçok antioksidan DPPH ile yavaş rxn.a girebilir hatta hiç

48 Humulus lupulus L. bitkisinden izole edilen harika bir antioksidan XATHHUML RS leri süpürme, CX enzimlerinin inhibisyonu, karsinojenlerin zehir etkisini giderme, Antioksidan radikal süpürücü aktivite için anahtar olan fenolik grubun yanında elektrofilik α,β-doymamış keton özelliğindedir. Hızlıca düşük aktiviteye sahip iso- formuna dönüşür. Claus Jacob, Vincent Jamier and Lalla Aicha Ba, Current pinioninchemicalbiology 2010, 15:1 7

49 HUVEC, A549 ve HFL-1 hücrelerinin büyüme eğrileri çıkarılarak MTT testi gerçekleştirilecektir. MTT yöntemi hücre çoğalmasının ve mitokondriyal fonksiyonun bir belirteci olarak kullanılır. Mitokondrilerde bulunan dehidrojenazların (süksinat dehidrojenaz) aktivitesini ölçer. Hücreler gerekli sürelerde inkübasyona bırakıldıktan sonra, besiyerleri gerekli inkübasyon sürelerinin sonunda hücrelerden uzaklaştırılacak ve MTT ilavesi yapılarak test maddelerinin hücre çoğalmasına olan etkileri saptanacaktır Tez kapsamında yapılması planlanan Enzim-Aktivite ve Sitotoksisite çalışmaları Enzimler 1 ksidoredüktaz 2 Transferazlar 3 Hidrolazlar 4 Liyazlar 5 Izomerazlar Enzymes 6 Ligazlar Lipoksijenaz Tirozinaz Asetilkolinesteraz Beta-laktamaz Proteaz Enzymes Hiyaluronidaz Sitotoksisite testi; toksik olduğu düşünülen maddenin, uygun hücre kültüründe, hücre büyüme oranı ve hücre tahribatı üzerindeki etkisi dikkate alınarak değerlendirme yapılan testler

50 DĞAL ATİKSİDA çalışmalar nereye gidiyor??? Gelecekteki yeri!!! Sentetik antioksidanlar daha ucuz ve kolay elde edilebildiklerinden dolayı hala kullanılmaktadırlar, ancak karsinojenik etkilerinin olması; çalışmaları, doğal antioksidanlara karşı daha fazla yönlendirmiştir. Kronik hastalıkların tedavisinde ve bunlardan korunmada; meyve ve sebzelerde bulunan biyoaktif antioksidan bileşiklerden faydalanılmaktadır, Doğal antioksidanların kombinasyonunun daha etkili olduğu görülmüştür, Beyin fonksiyonunu geliştirici özelliği olan ve doğal antioksidan olarak bilinen en iyi flavonoid Ginko biloba ya (en eski ağaç türü) olan ilgi 2000 yılından beri çok fazla artmıştır. MELATİ ile ilgili gelecekte yapılabilecek yeni araştırma alanları olarak; Antioksidan enzimlerin mra düzeyleri üzerine MEL ve metabolitlerinin etkisi, MEL ve sinyal iletimi, Doku ve hücrelerdeki MEL düzeyleri, MEL yapısının modifiye edilmesi, ksidatif stresle ilişkili pek çok hastalığın MEL ile tedavisi, Ultraviyole ışınlarının yaptığı deri hasarının MEL ile önlenmesi düşünülmektedir.

51 Son literatür çalışmaları; doğal ürünlerden daha farklı biyoaktif bileşik(ler) elde etmeyi ve bunların etki alanlarını genişletmeyi hedeflemiş olup, antioksidan aktivite ölçüm metotlarını ise daha yeni tekniklerle denemeye yönlendirmiştir. İlgi gün geçtikçe artmaktadır, ancak işlem süreci uzun olduğundan çalışmalar zaman almaktadır. Son literatür çalışmaları Enzim-aktivite çalışmalarının olmazsa olmazlardan olduğunu göstermiştir. Ek olarak; mikroorganizmalar ve deniz ürünlerinden de doğal bileşikler elde edilmektedir, ama bitki de olduğu gibi bunların çalışmaları fazla dikkat çekmemiştir.

52 KAYAKLAR-1- Clara Balsano, and Anna Alisi, Antioxidant Effects of atural Bioactive Compounds. Current Pharmaceutical Design, 2009, 15, Eitan Fibach and Eliezer A. Rachmilewitz, The role of antioxidants and iron chelators in the treatment of oxidative stress in thalassemia. Ann..Y. Acad. Sci (2010) c 2010 ew York Academy of Sciences. Agnes W. Boots, Guido R.M.M. Haenen, Aalt Bast, Health effects of quercetin: From antioxidant to nutraceutical. European Journal of Pharmacology 585 (2008) Saikat Sen, Raja Chakraborty, C. Sridhar, Y. S. R. Reddy, Biplab De, Free radicals, antioxidants, diseases and phytomedicines: Current Status and Future Prospect. International Journal of Pharmaceutical Sciences Review and Research Volume 3, Issue 1, July August 2010; Article 021. M. Valko a, C.J. Rhodes, J. Moncola, M. Izakovic, M. Mazura, Free radicals, metals and antioxidants in oxidative stress-induced cancer. Chemico-Biological Interactions 160 (2006) Dragan Amic, Dusanka Davidovic-Amic, Drago Beclo, Vesna Rastija, Bono Luğic and enad Trinajstic, SAR and QSAR of the Antioxidant Activity of Flavonoids. Current Medicinal Chemistry, 2007, 14, Swaran J.S. Flora, Structural, chemical and biological aspects of antioxidants for strategies against metal and metalloid exposure, xidative Medicine and Cellular Longevity 2:4, ; September/ctober 2009

53 KAYAKLAR-2- Patricia M. Aron and James A. Kennedy, Flavan-3-ols: ature, occurrence and biological activity. Mol. utr. Food Res. 2008, 52, Pon Velayutham Anandh Babu and Dongmin Liu, Green Tea Catechins and Cardiovascular Health: An Update, Current Medicinal Chemistry, 2008, 15, Claus Jacob, Vincent Jamier and Lalla Aicha Ba, Redox active secondary metabolite, Current pinionin Chemical Biology 2010, 15:1 7. Turgut Topal, Şükrü Öter, Ahmet Korkmaz, Melatonin ve kanserle ilişkisi. Gülhane Askeri Tıp Akademisi Fizyoloji Anabilim Dalı, Ankara. D. E. Stevenson and R. D. Hurst, Polyphenolic phytochemicals just antioxidants or much more? Cell. Mol. Life Sci. 64 (2007) Thomas Szekeres & Monika Fritzer-Szekeres & Philipp Saiko & Walter Jäger, Resveratrol and Resveratrol Analogues Structure Activity Relationship, Pharm Res (2010) 27: Jeremy P. E. Spencer, utrition Society Silver Medal Lecture Beyond antioxidants: the cellular and molecular interactions of flavonoids and how these underpin their actions on the brain. Proceedings of the utrition Society (2010), 69, Klaudia Jomova, Dagmar Vondrakova, Michael Lawson, Marian Valko, Metals, oxidative stress and neurodegenerative disorders. Mol Cell Biochem (2010) 345: Mena Soory, Relevance of utritional Antioxidants in Metabolic Syndrome, Ageing and Cancer: Potential for Therapeutic Targeting. Infectious Disorders - Drug Targets 2009, 9,

54 KAYAKLAR-3- J.E. Slemmer, J.J. Shacka, M.I. Sweeney and J.T. Weber, Antioxidants and Free Radical Scavengers for the Treatment f Stroke, Traumatic Brain Injury and Aging. Current Medicinal Chemistry, 2008, 15, Isabel C.F.R. Ferreira, Lillian Barros and Rui M.V. Abreu, Antioxidants in Wild Mushrooms. Current Medicinal Chemistry, 2009, 16, Michael Antolovich, Paul D. Prenzler, Emilios Patsalides, Suzanne McDonald and Kevin Robards, Methods for testing antioxidant activity. Analyst, 2002, 127, DEJIA HUAG, BXI U, AD RALD L. PRIR, The Chemistry behind Antioxidant Capacity Assays. J. Agric. Food Chem. 2005, 53, Sevil ALBAYRAK, sman SAĞDIÇ, Ahmet AKSY, Bitkisel ürünlerin ve gıdaların antioksidan kapasitelerinin belirlenmesinde kullanılan yöntemler. Erciyes Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Dergisi 26(4): (2010). Şevket Gökpınar, Tufan Koray, Eren Akçiçek, Tolga Göksan, Yaşar Durmaz, Algal Antioksidanlar. E.Ü. Su Ürünleri Dergisi İsmet Yılmaz, Antioksidan İçeren Bazı Gıdalar ve ksidatif Stres, İnönü Üniversitesi Tıp Fakültesi Dergisi 17 (2) (2010). M. Ben Sghaiera, J. Boubakera, I. Skandrania, I. Bouhlela, I. Limema, K. Ghediraa, L. Chekir-Ghedirab, Antimutagenic, antigenotoxic and antioxidant activities of phenolicenriched extracts from Teucrium ramosissimum: Combination with their phytochemical composition. Environmental toxicology and pharmacology 31 (2011) Guohua Cao, Emin Sofic and Ronald L. Prior, ATIXIDAT AD PRXIDAT BEHAVIR F FLAVIDS: STRUCTURE-ACTIVITY RELATISHIPS. Free Radical Biology & Medicine, Vol. 22, o. 5, pp , 1997

55 DİLEDİĞİİZ İÇİ TEŞEKKÜR EDERİM