LİKENLERDEN İZOLE EDİLEN USNİK ASİDİN GASTROPROTEKTİF ÖZELLİKLERİ ÜZERİNE ZEYTİNYAĞININ ETKİSİNİN VE BİYOKİMYASAL MEKANİZMALARININ BELİRLENMESİ

Transkript

1 LİKENLERDEN İZOLE EDİLEN USNİK ASİDİN GASTROPROTEKTİF ÖZELLİKLERİ ÜZERİNE ZEYTİNYAĞININ ETKİSİNİN VE BİYOKİMYASAL MEKANİZMALARININ BELİRLENMESİ Serkan UYANIK Eczacılık Biyokimya Anabilim Dalı Tez Danışmanı Yrd. Doç. Dr. Fehmi ODABAŞOĞLU Yüksek Lisans Tezi

2 T.C. ATATÜRK ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ LİKENLERDEN İZOLE EDİLEN USNİK ASİDİN GASTROPROTEKTİF ÖZELLİKLERİ ÜZERİNE ZEYTİNYAĞININ ETKİSİNİN VE BİYOKİMYASAL MEKANİZMALARININ BELİRLENMESİ Serkan UYANIK Eczacılık Biyokimya Anabilim Dalı Yüksek Lisans Tezi Tez Danışmanı Yrd. Doç. Dr. Fehmi ODABAŞOĞLU ERZURUM 2014

3

4 İÇİNDEKİLER TEŞEKKÜR... IV ÖZET... V ABSTRACT... VI SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ... IIX ŞEKİLLER DİZİNİ... IX TABLOLAR DİZİNİ... XI 1.GİRİŞ GENEL BİLGİLER Likenler Usnea longissima Usnik Asit Zeytinyağı Ülser İndometazinle Oluşturulan Ülserler Antioksidanlar Serbest Radikaller Serbest Radikal Çeşitleri Serbest Radikallerin Kaynakları Serbest Radikallerin Etkileri Antioksidan Savunma Sistemleri I

5 Endojen (Doğal) Antioksidanlar Ekzojen Antioksidanlar Gıda Antioksidanları Antioksidan Etki Tipleri MATERYAL VE METOT Deneylerde Kullanılan Kimyasallar Deneylerde Kullanılan Cihazlar Deneylerde Kullanılan Çözeltiler ve Hazırlanışları Deney Bitkileri Usnea longissima dan Usnik Asidin İzolasyonu Kolon kromatografisi Deney Hayvanları Ratlarda İndometazin-Ülserinin Oluşturulması ve UA nın Verilmesi Mide Dokusunun Makroskopik İncelenmesi Mide Dokusunun Biyokimyasal İncelenmesi Doku Homojenatlarının Hazırlanması İstatistiksel Analizler BULGULAR UA nın Saflaştırılması ve Spektral Verilerle Yapısının Aydınlatılması Makroskopik Bulgular Biyokimyasal Bulgular Katalaz Aktivitesi Üzerine UA nın Etkileri II

6 Süperoksit Dismutaz Aktivitesi Üzerine UA nın Etkileri MPx Aktivitesi Üzerine UA nın Etkileri LPO Miktarı Üzerine UA nın Etkileri TARTIŞMA SONUÇ VE ÖNERİLER..70 KAYNAKLAR EKLER EK 1. ÖZGEÇMİŞ EK 2. ETİK KURUL ONAY FORMU III

7 TEŞEKKÜR Yüksek Lisans tezi olarak sunduğum bu çalışmayı, değerli bilgi ve katkıları ile yöneten, tezimin her aşamasında yardımlarını esirgemeyen hocam Sayın Yrd. Doç. Dr. Fehmi ODABAŞOĞLU na en derin saygı ve şükranlarımı sunarım. İzolasyon ve karakterizasyon çalışmalarını yapan hocam Sayın Prof. Dr. Ahmet ÇAKIR a, biyokimyasal çalışmalarda yardımcı olan Sayın Arş. Gör. Özlem AYDIN BERKTAŞ ve Arş. Gör. Zerrin KUTLU KOTAN a, çalışmalarım sırasında ilgi ve desteklerini esirgemeyen çalışma arkadaşlarıma, yoğun eğitim dönemim boyunca sabırla beni destekleyen aileme teşekkür ederim. Serkan UYANIK IV

8 ÖZET Likenlerden İzole Edilen Usnik Asidin Gastroprotektif Özellikleri Üzerine Zeytinyağının Etkisinin Ve Biyokimyasal Mekanizmalarının Belirlenmesi Amaç: Bu çalışmada, ratlarda İND ile oluşturulan ülser modeli kullanılarak Usnea longissima liken türünden saflaştırılan UA in (in vivo) antiülserojen etkisi araştırıldı. Materyal ve Metot: 25, 50, 100 ve 200 mg/kg dozlarda UA, 50 mg/kg dozda RAN, pozitif kontrol, 30 mg/kg dozda LAN, pozitif kontrol ve 25 mg/kg dozda İND negatif kontrol oral yolla verilirken, UA yı süspansiyon haline getirmek için kullanılan zeytinyağı İND ile birlikte ayrı bir grup olarak deneye alındı. Zeytinyağının ülser oluşumuna etkisini gözlemek için bir deney grubu da 6 ml/kg dozda zeytinyağı tek başına uygulandı. Çalışmalarda kontrol grubu olarak kullanılmak üzere bir gruba da musluk suyu verildi. Daha sonra tüm gruplardaki mide dokuları çıkarılarak CAT, SOD, MPx enzim aktiviteleri ile LPO miktarları ölçüldü. Bulgular: İND ile muamele edilen grupta meydana gelen ülserin, uygulanan RAN, LAN, zeytinyağı ve UA nın her dört dozu vasıtasıyla önemli oranda (p<0.05) azaltıldığı belirlendi. Diğer yandan, antioksidant savunma sistemlerinin antiülserojen aktivite üzerine olan etkilerini açıklamak için, gastrik hasarlı, UA, RAN, LAN ve zeytinyağı ile muamele edilmiş rat mide dokularında antioksidan enzimlerden SOD, CAT ve MPx enzimlerinin aktiviteleri ile LPO miktarları belirlendi. Bulgular, kontrol grupları ile karşılaştırılarak değerlendirildi. İND uygulanan dokularda LPO miktarları ile CAT ve MPx enzim aktiviteleri kontrol (sağlıklı) gruplarına göre arterken, SOD nin ise aksine azaldığı tespit edildi. Sonuç: Usnea longissima dan saflaştırılan UA nın zeytinyağı ile birlikte uygulanan dozları, RAN, LAN ve zeytinyağı ile muamele edilmiş dokularda, İND nin aksine bu maddeler antioksidan savunma sisteminin olumlu yönde etkilendiği ve gastrik mukozada üretilen ROS radikallerinin ülser oluşumundaki olumsuz etkilerinin azalttığı belirlenmiştir. Anahtar Kelimeler: Antioksidan, peptic ülser, rat, usnik asit V

9 ABSTRACT The determination of effect olive oil on the gastroprotective properties and biochemical mechanisms of the Usnic Acid isolated from lichens Objective: The antiulcerogenic effect of UA isolated from Usnea longissima, a lichen species, on indomethacine-induced gastric lesions was investigated in rats. Materials and Methods: 25, 50, 100 and 200 mg/kg doses of UA, 50 mg/kg dose of RAN, positive control, 30 mg/kg dose of LAN, positive control and 25 mg/kg dose of IND (negative control) were orally administered, Olive oil used to make suspension UA with IND were tested in a separate group. The olive oil alone administered to observe the effect of olive oil on ulcer in a test group of dose of 6ml/kg. A group to be used as a control group was given tap water in studies. Stomach tissue samples were obtained in all groups and of CAT, SOD, MPx enzyme activity with quantities of LPO was measured. Results: The present results show that all doses of DA, RAN, LAN, olive oil had significant gastroprotective effect against the gastric damages caused by indomethacin. On the other hand, to explain the effects of antioxidant defense systems on antiulcerogen activity, administration UA, RAN, LAN, and olive oil in stomach tissues of rats gastric damage, antioxidant enzymes such as SOD, CAT and MPx with enzyme activities quantities of LPO was determined. The findings were compared with control groups. The quantities of LPO and CAT MPx enzyme activity increased according to control (healthy) groups, SOD were decreased on the contrary in tissue administration IND. Conclusion: In the administration with olive oil all of doses UA isolated from Usnea longissima, RAN, LAN and tissues were treated with olive oil were determined that effect positive the antioxidant defense system contrast to IND. ROS produced in the gastric mucosa were determined to reduce in negative effects of the formation of ulcers Key Words: Antioxidant, peptic ulcer, rat, usnic acid VI

10 SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ ADP AMP BSA CAT CCl 4 CC 3 COX DNA GPx GR GSH GST H 2 O 2 HO. HO 2 - LPO İND LAN MDA MPx NAD NADPH NO. : Adenozin di fosfat : Adenonin mono fosfat : Sığır Serum Albumin : Katalaz : Karbontetraklorür : Triklorometil : Siklooksijenaz enzimi : Deoksiribonükleik asit : Glutatyon peroksidaz : Glutatyon redüktaz : Glutatyon : Glutatyon S-Transferaz : Hidrojen peroksit : Hidroksil : Peroksil : Lipit peroksidasyonu : İndometazin : Lansaprazol : Malondialdehit : Miyeloperoksidaz : Nikotinamid adenin dinükleotid : Nikotinamid adenin dinükleotid hidrojen fosfat : Nitrik oksit VII

11 NO + NO 2 - NSAID NBT O 2 : Nitronyum iyonu : Azot protoksit : Steroid olmayan antienflamatuar ilaçlar : Nitro blue tetrazolium : Süperoksit radikali 1 O 2 : Singlet oksijen PGE RAN RNA RO. ROO. ROS RSO.. RSO 2 SOD UA UV WHO : Prostaglandin : Ranitidin : Reoksiribo nükleik asit : Alkoksil radikalleri : Peroksil radikalleri : Reaktif Oksijen türleri : Sülfenil : Tiyol peroksil : Süperoksit dismutaz : Usnik asit : Ultra viyole : Dünya Sağlık Teşkilatı VIII

12 ŞEKİLLER DİZİNİ Şekil No Sayfa No Şekil 2.1. Usnea longissima nın doğal ortamında çekilmiş resmi... 7 Şekil 2.2. Usnik asidin kimyasal yapısı... 8 Şekil 2.3. Zeytinyağının genel görünümü... 9 Şekil 2.4. Mide, özofagus ve duodenum ülserlerini gösteren resim...11 Şekil 2.5. Çeşitli kimyasalların oluşturduğu gastrik erozyon ve ülserlerin patojenezinde vasküler hasarın önemi Şekil 2.6. Araşidonik asit metabolizması esnasında üretilen serbest radikaller Şekil 2.7. GSH nin molekül yapısı Şekil 3.8. Araştırmada kullanılan Wistar ratları gösteren fotoğraf Şekil 3.9. LPO miktarlarının belirlenmesinde kullanılan standart grafik Şekil Usnik asitin (XS-I) IR (CHCl 3 ) spektrumu Şekil Usnik asitin 1 H-NMR (CDCl 3, 200 MHz) spektrumu Şekil Usnik asitin 13 C-NMR (CDCl 3, 200 MHz) spektrumu Şekil İND (25 mg/kg) tarafından oluşturulan gastrik hasarlı dokudan (A) ve UA (200 mg/kg) ile muamele edilmiş gruptan alınan (B) rat mideleri 56 Şekil İND (25 mg/kg), UA (25, 50, 100 ve 200 mg/kg), RAN (50 mg/kg), LAN (30 mg/kg), zeytinyağı (6 ml/kg) ve kontrol gruplarından alınan mide örneklerindeki ülser alanlarını gösteren diyagram Şekil İND (25 mg/kg), UA (25, 50, 100 ve 200 mg/kg), RAN (50 mg/kg), LAN (30 mg/kg), zeytinyağı (6 ml/kg) ve kontrol gruplarından alınan IX

13 mide örneklerindeki CAT aktivitelerinin karşılaştırılmasını gösteren diyagram Şekil İND (25 mg/kg), UA (25, 50, 100 ve 200 mg/kg), RAN (50 mg/kg), LAN (30 mg/kg), zeytinyağı (6 ml/kg) ve kontrol gruplarından alınan mide örneklerindeki SOD aktivitelerinin karşılaştırılmasını gösteren diyagram Şekil İND (25 mg/kg), UA (25, 50, 100 ve 200 mg/kg), RAN (50 mg/kg), LAN (30 mg/kg), zeytinyağı (6 ml/kg) ve kontrol gruplarından alınan mide örneklerindeki MPx aktivitelerinin karşılaştırılmasını gösteren diyagram Şekil İND (25 mg/kg), UA (25, 50, 100 ve 200 mg/kg), RAN (50 mg/kg), LAN (30 mg/kg), zeytinyağı (6 ml/kg) ve kontrol gruplarından alınan mide örneklerindeki LPO miktarlarının karşılaştırılmasını gösteren diyagram X

14 TABLOLAR DİZİNİ Tablo No Sayfa No Tablo 4.1. IND (25 mg/kg) tarafından oluşturulan gastrik hasar üzerine farklı dozlarda uygulanan UA (25, 50, 100 ve 200 mg/kg), zeytinyağı (6ml/kg), RAN (50 mg/kg) ve LAN (30mg/kg) nın etkilerini gösteren ölçüm sonuçları Tablo 4.2. İND (25 mg/kg), UA (25, 50, 100 ve 200 mg/kg), RAN (50 mg/kg), LAN (30 mg/kg), zeytinyağı (6 ml/kg) ve kontrol gruplarından alınan mide dokularındaki CAT aktivitelerini gösteren sonuçlar Tablo 4.3. İND (25 mg/kg), UA (25, 50, 100 ve 200 mg/kg), RAN (50 mg/kg), LAN (30 mg/kg), zeytinyağı (6 ml/kg) ve kontrol gruplarından alınan mide dokularındaki SOD aktivitelerini gösteren sonuçlar Tablo 4.4. İND (25 mg/kg), UA (25, 50, 100 ve 200 mg/kg), RAN (50 mg/kg), LAN (30 mg/kg), zeytinyağı (6 ml/kg) ve kontrol gruplarından alınan mide dokularındaki MPx aktivitelerini gösteren sonuçlar Tablo 4.5. İND (25 mg/kg), UA (25, 50, 100 ve 200 mg/kg), RAN (50 mg/kg), LAN (30 mg/kg), zeytinyağı (6 ml/kg) ve kontrol gruplarından alınan mide dokularındaki LPO seviyelerini gösteren sonuçlar XI

15 1. GİRİŞ Ülser; mide ve duodenumun multifaktöriyel-kronik inflamatuvar hastalığıdır. Hastalığı meydana getiren faktörler asit sekresyonu ve koruyucu mukoza bariyerindeki bozukluklara ilave olarak genetik yatkınlık (irsiyet), stres, kortizon türü ilaçlar, sigara, alkol, aspirin ve indometazin gibi NSAİD (Non steroid antienflamatuar ilaçlar) ler, Helicobacter pylori ve Herpes Simplex Virüsü (Tip I / HSV-1) dür. 1 Ülseri meydana getiren önemli sebeplerden biri düzenli NSAİD kullanımıdır. NSAİD lerin ülser yapıcı etkileri, enflamatuar bozukluklardaki kullanımlarının en büyük dezavantajı olmaya devam etmektedir. NSAİD ler tarafından uyarılan gastrik mukozal ülserasyon temel olarak sitoprotektif prostaglandinlerin eksikliğine bağlanır. Bu prostaglandinlerin eksikliği midede gastrik asitlerin, safra tuzlarının ve etil alkolün tahrip edici etkilerini artırmaktadır. Aspirin ve indometazin'in siklooksijenaz (COX) enzim sistemini inhibe ederek antienflamatuar aktivite gösterdikleri düşünülmektedir. Aspirin ve indometazin gibi antienflamatuar ilaçların COX enzim sistemini bloke etmesi ise prostaglandin biyosentezinin baskılanması ve gastrik mukozal bariyerin bozulması sonucu gastrik hasarın oluşumuna neden olur. Daha önceki araştırmalarda COX enziminin engellenmesi sonucunda araşidonik asit metabolizmasının 5- lipoksijenaz yolunda bir artış meydana geldiği ve bunun da lökotrienlerin ve hidroperoksieikozatetraenoik asidin oksijeninden türevlenen gastrik mukozada tahribata sebep olan radikallerin aşırı üretimi ile sonuçlandığı kaydedilmiştir. 1-4 Daha önce de belirtildiği gibi ülser midedeki koruyucu ve saldırgan faktörlerin etkileşimi sürecindeki düzensizlikten meydana gelmektedir. İndometazin uyarmalı ülser oluşumunun COX inhibisyonuyla ilişkili olduğu ve COX inhibisyonun da prostaglandin biyosentezini baskılayarak gastrointestinal hasara karşı bir savunma faktörü olan mukus oluşumunu engellediği rapor edilmiştir. 5-7 Bununla beraber indometazin uyarımlı mide ülserlerinin 1

16 oluşum mekanizması ayrıntılı olarak henüz aydınlatılmıştır. Bu konuda alternatif sebepler üzerine tartışmalar hala devam etmektedir. Prostaglandin biyosentezinin inhibisyonu, lokal kan akışının azalması, topikal tahriş, yeniden yapılanma ve doku onarımının engellenmesi bu sebeplerden bazılarıdır Son zamanlarda indometazin gibi NSAİD ler tarafından uyarılan akut gastrik deneysel lezyonlarda oksijenden türevlenen serbest radikallerin (ROS) de önemli rol oynadığını gösteren çalışmalar yayımlanmıştır Bu çalışmalarda önemli miktarlarda üretilen oksijen metabolitlerinin ise dokuyu dejenere ederek ülsere sebep oldukları bildirilmiştir. 3, 4 Diğer birçok doku hasarı gibi gastrik ülser de süperoksit anyonlarının oluşumuyla ilgilidir. Ayrıca gastrik mukozadaki ülserin tedavisinde antioksidan enzimlerin koruyucu etkilerine ve karşılıklı olarak bu enzimlerin birbirlerini etkilemelerine de dikkat çekilmiştir Canlı dokulardaki hücreler ROS hasarlarını önleyebilecek veya tamir edebilecek pek çok savunma mekanizmasına sahiptir. ROS un tahribatları, primer olarak süperoksit dismutaz (SOD), katalaz (CAT), glutatyon S- transferaz (GST), glutatyon redüktaz (GR) ve glutatyon peroksidaz (GPx) gibi enzimler ve sekonder olarak da antioksidan vitaminler, glutatyon (GSH), birçok makro ve mikro moleküller tarafından azaltılır Şayet süperoksit (O.- ), hidroksil (OH ) ve hidrojen peroksit (H 2 O 2 ) gibi ROS üyeleri aşırı üretilirse, membran lipitlerinin, proteinlerin, nükleik asitlerin ve ekstraselüler matriks glikozaminoglikanlarının zarar görmesine bağlı olarak doku hasarı prosesi başlayabilir. Gastrik ülser oluşumunu tetikleyen mekanizmalardan birisinin de bu mekanizma olabileceği pek çok araştırmacı tarafında öne sürülmüştür , 18, 23, 29, 35 Serbest radikalleri etkisizleştiren sekonder moleküllerden biri olan GSH, gastro intestinal dokuları makro molekül içeren lipitlerin 15, 18, 35, oksidatif hasarlarından korumada önemli görev üstlenmiştir. 2

17 Bu gün bilinen pek çok etken maddenin indometazin ile uyarılan gastrik hasar üzerine pozitif etkileri gösterilmiştir. 15, 19, 25-27, 30, 34, 35, Diğer yandan çok sayıda bitki ekstrelerinin antiülserojen etkileri de rapor edilmiştir Likenler, mantar ve alglerin bir araya gelerek teşkil ettikleri simbiyotik (ortak yaşayan) bir bitki grubudur. Günümüzde den fazla alt türe sahip olduğu bilinen likenlerin, ülkemizdeki florası henüz tamamlanmamış olup bölgemiz ile ilgili yapılan çalışmalar ise son derece Likenlerin çok sayıda madde sentezlemekte oldukları ve bu maddelerin çoğunun biyolojik aktivitelere sahip oldukları tespit edilmiştir. 75, 76 Liken ve liken metobolitlerinin gösterdiği aktivitelerden bir kısmı; antiviral, 77 antibakteriyel, 78, 79 antitümör, 80, 81 alerjen, 82 bitki büyüme inhibitörü, 83 antiherbivor, 84 enzim inhibitörü, 85, 86 şeklinde sıralanabilir. Parfüm sanayinde, 87 kozmetik krem sanayinde, 88 hava kirliliğinin belirlenmesinde 89, 90 faydalanılan likenler pek çok ülkede de besin olarak kullanılmaktadır. 91 Likenlerin üstün yaşam mukavemeti kendi bünyelerinde ürettikleri çok özel moleküllerden ileri gelmekte 92 ve yapılan biyolojik aktivite ölçümlerinde liken metabolitlerinin her geçen gün yeni özellikleri keşfedilmektedir. Üstelik bu maddelerin genellikle sitotoksik özelliklerinin az olması, ilaç özelliklerinin araştırılmasında önemli yer tutmaktadır. Literatürde liken ekstrelerinin ve liken metabolitlerinin antiülserojen etkilerinin incelendiği çok az sayıda araştırmaya rastlanmıştır rastlanmıştır. 93, 94 Antiülserojenik etki sürecinin mekanizmaları hakkında ise bilgiler oldukça sınırlıdır. Bu açıdan bakıldığında bu çalışma ülserin önlenmesinde oksidatif süreç üzerinde bir liken metaboliti olan usnik asit (UA) in etkili olup olmadığının tespit edilmesi açısından önemli bir eksikliği tamamlayacaktır. Bu araştırmada; sıçanlarda indometazin ile oluşturulan ülser modeli kullanarak bir liken türü olan Usnea longissima dan izole edilen UA nın invivo antiülser etkisi ve antioksidan etkisi; katalaz (CAT), 3

18 myelopreoksidaz (MPx) ve süperoksit dismutaz (SOD) enzimleri, lipit peroksidasyon (LPO) düzeyleri) tespit edilmeye çalışıldı. 4

19 2. GENEL BİLGİLER 2.1. Likenler Likenler, en az iki organizmadan (fungus ve alg) oluşan bitkilerdir. Fungus avcıdır, kendi karbonhidratını üretemez, avı ise fotosentez partneri olan alg ve cyanobakterilerdir. Bunlar da ekosistem için çalışır ve fungus için glukoz üretirler. Cyanobakteriler ise azot üretir. İki organizma da tek başlarına yaşayamayacakları yerlerde beraber kolonize olup yaşayabilirler. Likenler, dünyada ve ülkemizde çok eski zamanlardan beri halk hekimliğinde birçok hastalığın tedavisinde kullanılmıştır. Dünya Sağlık Teşkilatı nın (WHO) birçok ülkedeki yayınlara dayanarak hazırladığı bir araştırmaya göre, dünyada tedavi amacıyla kullanılan tıbbi bitkilerin toplam tür sayısı civarındadır. 72, 74 Ülkemizde 9000 e yakın bitki türünün doğal olarak yetiştiği ve bunların kimyasal içerikleri hakkındaki çalışmaların yok denecek kadar az olduğu da vurgulanmaktadır. 95 Bitkisel organizmalar içerisinde incelenen likenler de antik çağlardan beri tıbbi özellikleri itibariyle değerlendirilmişlerdir. 96 Fungus (mycobiont) ve alg (phycobiont) partnerlerinin oluşturduğu simbiyotik bitkiler olan likenler, yavaş üremelerinden kaynaklanan rekabette zayıf kalma dezavantajlarını, ürettikleri özel maddeler sayesinde telafi ederler. Özellikle aromatik yapılı sekonder metabolitler, onların en güçlü antagonistik maddelerini oluşturmaktadır. Diğer taraftan likenlerin boya ve parfümeri sanayisinde hammadde olarak 97, 98 ve hava kirliliği indikatörü olarak 89, 90, 99, 100 kullanıldıkları da kaydedilmiştir. Her ne kadar likenlerin global krizlerde besin kaynağı olarak kullanılabileceği teklif edilmişse de, doğal yolla üremeleri çok yavaş olduğundan, bu tür bir değerlendirmenin ekonomik olmadığı ifade edilmiştir. 101 Likenler, yeterli nemin bulunduğu kızgın çöllerde, arktik ve antartik bölgeler de yüksek dağların dondurucu soğuklarında, diğer bitkilerin yaşayamadığı taşlar, verimsiz 5

20 topraklar, kuru ağaç kabukları ve kiremitler üzerinde dahi yetişebilmektedirler. Bu özelliklerinden dolayı dünyanın hemen her yerinde yayılış gösterdikleri rapor edilmiştir edilmiştir. 76 Türkiye florası likenler bakımından oldukça zengin olmasına rağmen taksonomik, floristik ve kimyasal liken metabolitleri üzerinde çalışmalar son yıllarda başlamıştır. Avrupa ülkelerinde, likenlerin 16. yüzyıldan beri, çeşitli hastalıkların tedavisinde dekoksiyon veya infüzyon şeklinde kullanıldığına dair birçok kayıt 80, 102 bulunmaktadır. İkinci Dünya Savaşı ndan sonra mevcut antibiyotiklerin azlığı üzerine, likenler üzerinde antimikrobiyal araştırmaların yapılmasına yol açmıştır. Likenlerde bulunan antimikrobiyal etki, yapılarında bulunan asitlerden ileri gelmektedir. Farklı liken türlerinden izole edilmiş protolikesterinik asit, pulvinik asit türevleri, depsid grubundan evernik, olivetorik asit, tridepsid grubundan giroforik asit, depsidon grubundan fisodik, lobarik, fumarprotosetrarik asitler ile dibenzofuran türevlerinden usnik asitin antimikrobiyal etkileri saptanmıştır. 103 Likenlerde bulunan maddelerin çoğu asit özelliği gösterdiği için bunlara karakteristik liken asitleri denilmektedir. Likenlerin kayaları parçalama özelliğini sentezledikleri bu asitler vasıtası ile gerçekleştirdiklerine inanılmaktadır. Likenlerin bu asidik maddeleri % 1-5 oranında, çoğu zaman da % 25 oranında içermeleri bu maddelerin izolasyonunu kolaylaştırmakta, dolayısıyla da likenlerin bu yönüyle tohumlu bitkilerden daha fazla önem kazanmasına neden olmaktadır. 74 Uzun zamandır hastalıkların önlenmesinde kullanılan likenlerin iyileştirici özelliklerinin, yapılarında bulunan asitlerden kaynaklandığı düşünülmektedir. 103 Liken primer metabolitleri yalnız algler tarafından fotosentezle sentezlenmektedir. Likenlere özgü çeşitli polisakkaritlerin yanı sıra çeşitli amino asit, amin ve proteinler de likenlerden izole edilmiş primer metabolitlerdir. 104 Likenler tarafından sentezlenen bulunan alifatik ve aromatik bileşikler ise sekonder metabolitler olup günümüze kadar 300 den fazla sekonder 6

21 metobolitin saflaştırılarak yapısı spektroskopik yöntemlerle aydınlatılarak karakterize 87, 92, 105 edilmiştir. Şekil 2.1. Usnea longissima nın doğal ortamında çekilmiş resmi Usnea longissima Usnea longissima tallusu asılı durur, oldukça uzundur (Şekil 2.1). Ağaçlar üzerinde bulunur (epifit). Genellikle gölge ve nemli bölgeleri sever, kirliliğe en duyarlı likenlerden biridir. Varlığı saf havaya delalet ettiği gibi, yokluğu da hava kalitesinin düştüğünü gösterir. Konifer yağmur ormanları gibi bolca bulunduğu bölgelerde geleneksel olarak çocuk bezi imalatında kullanılmıştır. Ayrıca, kadınlara yönelik hijyen ürünlerinin yapımında ve çeşitli ilaçların terkibinde yer almıştır. Çin ve Hindistan'da ekspektoran, Avrupa'da ise saçları güçlendirmek için kullanılmıştır. 106 Hindistan da yerliler tarafından bazen astım oluşturdukları düşünülen yastık ve minderlerin doldurulmasında kullanılan maddelere alternatif olarak kullanılmışlardır. 107 Ayrıca İngiliz Kolombiyası nda Queen Charlotte Adaları yerlileri tarafından sıcak katranın ilaç olarak kullanılmadan önce safsızlıklarının giderilmesi amacıyla da kullanmışlardır 108 ve mevsimlik kamplarda hijyenik yatak olarak kullanılmıştır. 109 Vancouver Adası nın batı kıyısındaki Nitinaht yerlileri tarafından absorban özellikleri 7

22 dolayısıyla bebek bezi, kadınlar için sağlık ürünleri (hijyenik ped), ve som balığının temizlenmesinde, 110 Hindistan da ise kemik kırıklarının tedavisinde kullanıldıkları rapor edilmiştiri. 107 Bir liken türü olan Usnea longissima telemeyi, baş dönmesini, üşümeyi, ağrıyı ve balgamı önlemek amacıyla kullanılmasının yanı sıra üriner sistem için de faydalı olduğu ve dişi genital sistemi şişmesini önlediği bilinmektedir. 111 Ekspektoran 103, 112 olarak kullanımının yanı sıra ülsere karşıda kullanılmıştır. Bu likenden izole edilen bazı bileşikler usnik asit, barbatik asit, difraktaik asit, 4- O-dimetilbarbatik asit(±), evernik asit, ß-orsinol, ß-orsinolkarboksilik asit, squamatic asid (±), atranorin (±) ve yağ asitleri (±) 113, 114 ve likenin 105 olarak sıralanabilir Usnik Asit O 18 CH 3 17 HO O OH H 3 C OH CH 3 13 O 14 CH 3 15 O Şekil 2.2. Usnik asitin kimyasal yapısı Usnik asit birçok liken türünde biyolojik olarak sentezlenen bir sekonder metabolittir (Şekil 2.2). Daha önceki çalışmalarda usnik asitin; antiviral, 115 antiprotozoal, 78 antibiyotik, 116 anti-inflamatuar, antipiretik ve analjezik, 117, 118 antitümoral 119 ve hepatotoksik 120 özelliklerinin olduğu gösterilmiştir. Bu araştırmada Usnea longissima dan izole edilip saflaştırılan usnik asitin, antiülserojen ve antioksidan özellikleri araştırılmıştır. Elde edilen veriler dünya literatüründe ilk kez yer alacaktır. 8

23 2.2. Zeytinyağı (Olive Oil ) Zeytinyağı, insan için büyük önem taşıyan yağ asitlerinin yanı sıra, vücudumuzdaki zararlı maddelerin neden olduğu tahribatı önleyen antioksidan elementleri içerir. Bunlar da hormonlara destek olup, hücre farklılaşmasının gelişimine, hücre zarının oluşumuna yardımcı olurlar. Zeytin ağacının; dalları, yaprakları ve reçinesi olduğu kadar, yağı da yıllardır ilaçların bileşimlerinde yer alan doğal maddelerden birisidir. Doğal bir ilaçtır. Zeytinyağının sağlığa faydalı etkileri, içerdiği tekli doymamış yağ asitleri ve yüksek miktarda antioksidan madde ihtiva etmesinden ileri gelmektedir Zeytinyağı, esas olarak triaçilgliserolleri (trigliserit veya yağ) oluşturan küçük ve serbest yağlı asitlerin bileşiminde oluşur. Triaçilgliserol'ler bitki ve hayvanlar için önemli bir enerji rezervi vardır. Şekil 2.3. Zeytinyağının genel görünümü Zeytinyağının içerdiği bu bileşikler; -Hücrelerdeki oksidatif hasarı ve sağlıklı kalmayı sağlayıcı, hastalıklardan koruyucu, hastalıkları iyileştirici, -Kandaki kolesterol seviyesini azaltıcı, 9

24 -Lipit peroksidasyonu önleyici, -Düşük yoğunluklu lipoproteinlerin (LDL) oksidasyonunu önleyici ve miktarını düşürücü, -Kardiyovasküler kalp hastalıklarının önlenmesini, -Çeşitli kanser (kolon, prostat ve göğüs) ve trombik (pıhtılaşma) hastalıkların oluşumunu engellemede, -Merkezi sinir sistemi dejenerasyonunu önlemekte ve serbest radikalleri yok ederek yaşlanmayı geciktirmede, (Peroksil, alkil, süperoksit ve hidroksil, sitotoksil serbest radikallere örnek olarak verilebilir.) -İltihap kurutucu ve kanamayı durdurucu, - İnsan eritrositlerini oksidatif tehlikeye karşı korumada önemlidir. Besinler, vücudumuzda enerjiye çevrilirken, oksidan denilen bazı maddeler açığa çıkar. Hücre gelişimini olumsuz yönde etkileyen oksidanlar, yaşlanma sürecini de hızlandırır. Antioksidanlar ise, oksidanların olumsuz etkisini ortadan kaldırırlar. Diğer bir ifadeyle de, antioksidanlar, serbest radikaller denilen vücudumuzdaki zararlı maddeleri etkisiz hale getirmeleri ve hücrenin tahrip edilmesini engellemeleri bakımından son derece önemli maddelerdir. Aslında organizmamız, doğuştan elde ettiği antioksidan enzimleri sayesinde, kendi kendini koruyabilecek durumdadır. Ancak bu servet tükenmez değildir. Bu nedenle bedenin, dışarıdan beta-karoten, C ve E vitaminleri, selenyum, çinko ve polifenoller içeren, antioksidanlar alması zorunludur. Antioksidan açığı ortaya çıkarsa, hücreler vaktinden önce yaşlanırlar. Başta E vitamini olmak üzere çok sayıda antioksidan madde içeren zeytinyağı, hücreleri yeniler, doku ve organların yaşlanmasını geciktirir. Zeytinyağının içeriğindeki polifenoller güçlü antioksidanlardır. Zeytinyağı, hücre cidarları, hücre oluşumu ve hücre farklılaşmasının 10

25 gelişimine yardım eder. Hücre farklılaşmasına katkısı, zeytinyağının tüm bileşiminin bir arada yaptığı etki neticesinde olur Ülser Sindirim sisteminin en geniş yerini teşkil eden mide, iç yüzü mide mukozası ile kaplı kastan (düz kas) yapılmış, oldukça geniş bir torbadır. Kendisinden sonra onikiparmak barsağıyla (duodenum) devam eder. Yukarıda yemek borusu ile birleşir. Torba şeklinde olduğundan şekli; doluluk derecesine, kasının kasılma durumuna (tonus), solucanvari hareketlerine, vücut yapısına, ayakta ya da yatar vaziyette oluşuna, komşu organların durumuna göre değişir. Midenin 2 ucu vardır. Her iki ucu da sfinkter dediğimiz birer büzük ile içindekileri içinde tutmağa çalışır. Diyafram ile göğüs boşluğundan ayrılır. Midenin başlıca 2 fizyolojik aktivitesi vardır; 1- Midenin hareketi (motilite); Yiyilen yiyeceklerin depo edilmesi, öğütülmesi, birbirleriyle ve mide sıvısıyla karışmalarını sağlayarak oluşan materyalin 12 parmak barsağına, düzenli bir şekilde geçirilmesi. 2- Midenin asit ve pepsin salgılaması; Besinlerin parçalanmasını ve birbirine iyice karışmasına yardımcı olması. 122 Şekil 2.4. Mide, özofagus ve duodenum ülserlerini gösteren resim Peptik ülser mide ve duedonumda (ince barsakların ilk parçası) oluşan enflamasyonlardır (Şekil 2.4). Peptik ülser; travma, stres, sepsis, hemorajik şok, 11

26 yanıklar, pulmoner ve karaciğer hastalıkları, rezerpin, epinefrin, steroidler, sigara kullanımı, nonsteroidal antienflamatuar ilaçlar ve alkol gibi iyi bilinen pek çok faktörün sebep olduğu bir hastalıktır. Hastaların yaklaşık % inde etiolojik faktör bilinmemektedir. 123, 124 Stres, 123 etanol, 125, 126 NSAID ler 125, 127 ve özellikle de iskemi reperfüzyon 128 ile ilişkili gastrik mukozal hasarda oksijen kökenli serbest radikaller patojen faktörler olarak kabul edilmektedirler. 129 Etanolle oluşturulan gastro duodenal hasarlarda serbest radikal oluşumunun patojenik faktörlerden biri olduğu birçok 125, 128, 130, 131 araştırmacı tarafından da doğrulanmıştır. İnsanlarda tüm aerobik hücrelerde üretilen oksijen türevli serbest radikaller olan süperoksit (O 2 ) ve hidroksil (OH ) radikalleri ile bu radikallerin kaynakları veya ürünü olan singlet oksijen ( 1 O 2 ) ve hidrojen peroksit (H 2 O 2 ) pek çok zararlı etkiye sahiptir. Eğer hemen ortamdan uzaklaştırılmazlarsa, biyolojik sistemlere toksik etki yaparlar. Toksik etki protein inaktivasyonuna, DNA hasarına ve lipit peroksidasyonuna sebep olarak hücrenin yapısal ve fonksiyonel aktivitelerini oksidatif hasara uğratır. Bu hasarı önlemek üzere SOD, CAT, GPx ve GR gibi enzimler radikal süpürücü olarak görev yaparlar. 132, 133 Dokularda normalde de az miktarda oluşan serbest radikallere karşı korunmak için SOD, CAT, GR, MPx ve GPx gibi enzimler mevcuttur. 132, 134 Fakat bu enzimler ekstraselüler sıvıda fazla miktarda bulunmadığı için insan ve diğer tüm memeli hücreleri in vitro olarak ekstraselüler oksijen kökenli radikallere maruz kaldığından tahrip olurlar. Respiratuar ve gastrointestinal kanalı döşeyen hücreler oksijen kökenli radikallere sıkça maruz kalırlar. Askorbat ve demir tuzları gibi maddelerin aşırı tüketimi veya akciğerlerin birkaç yıl sigara içimine maruz kalması ile gözlenebilen bir hasar oluşması için yıllar geçmesi gerekir. Oysa oksijene maruz kalmış izole hücrelerde benzer hasarlar birkaç dakika veya birkaç saatte oluşabilmektedir. Bu farklılığı açıklayacak faktörlerden birisi de epitelyal hücre hasarından sonra yüzey epitelinin in 12

27 vivo olarak hızla çoğalabilmesidir. Bu süre zedelenmiş gastrik mukozada birkaç saatten az bir süredir. Diğer taraftan oksijen radikallerinin sebep olduğu büyük gastrik mukozal hasarların mekanizması tam olarak aydınlatılamamıştır. Oksidan maddeler, polidoymamış yağ asitleri, kükürt içeren amino asitli proteinler ve nükleik asitlerle kolayca reaksiyona girerler. 134 Bu durum membranın vital özelliklerini değiştirerek, epitelin ve endotelin bariyer özelliğini tahrip edebilir. Oksijen radikalleri, araşidonik asit metabolizmasının ürünleri ile de etkileşerek tromboksan oluşumunu sitümüle (uyarma) eder ve gastrik mukozayı sekonder mekanizmalar aracılığı ile tahrip eder. Tromboksan ise mukozal ve submukozal damarları kontrakte ederek gastrik mukozal kan akımını 133, 135 durdurur durdurur. Oksijen radikallerinin diğer bir kaynağı da polimorfo nükleer (PMN) lökosit lerdir. Nötrofillerin süperoksit'e bağlı akümülasyonu ile nötrofil kökenli oksidanların sebep olduğu mikro vasküler rezistanstaki artış da gastrik mukozada 133, 136 oksijen radikallerinin sebep olduğu hasarların patojenik faktörlerinden biridir. Bu nedenle, akut gastrik mukozal hasarların gelişmesine karşı korunmada endojen antioksidan savunma mekanizmaların oldukça önemli olduğu tespit edilmiştir. Tripeptit yapısında olan GSH, özellikle insan ve sıçan gastrik mukozasında yüksek 125, 129, 137 konsantrasyon da bulunan endojen bir antioksidandır antioksidandır. Glutatyon un doğal bir süperoksit radikali toplayıcısı olduğu ve sellüler bütünlüğün devamı için gerekli olan protein-tiol gruplarını oksidasyona karşı koruduğu bilinmektedir bilinmektedir. 129 Gastrointestinal mukusun da fizyolojik bir antioksidan olduğu düşünülmektedir. Çünkü mukus epitel hücrelerini tamamen kapatarak lümen ile epitel arasında fizyolojik bir bariyer oluşturur 132 ve ayrıca mukus OH. radikali ve H 2 O 2 ile reaksiyona girerek alttaki epiteli oksidatif hasardan korur. 13

28 Ülsere en büyük nedenlerden biride "Helicobacter pylori" adlı bir infeksiyondur. Birçok ülser Helicobacter pylori mikrobunun varlığı ile meydana gelir. Bu bakteri midede mukus tabakası ile mide epiteli arasına yerleşerek yaşamını sürdüren kıvrık veya spiral şekilli bir bakteridir. H.pylori mide asidini nötralize eden enzimler salgılayarak asidik mide ortamında yaşayabilme yeteneğine sahiptir. Bu mekanizma ile bakteri koruyucu mukus tabakasına kadar gider. Mukus tabakasına ulaşan bakteri spiral şekilli olmasından dolayı kıvrılarak mukus tabakası boyunca ilerler ve koruyucu mukus tabakasını zayıflatarak mide asidinin duyarlı alt tabakalara geçmesine olanak sağlar. Böylece mide asidi ve bakterinin kendisi birlikte bu tabakada doku hasarı meydana 3, 18, 63, 65 getirerek ülser oluşumuna neden olur İndometazinle Oluşturulan Ülserler İndometazin, diğer nonsteroidal antienflamatuar ilaçlar gibi siklooksijenaz enzimini inhibe ederek prostaglandin sentezini azaltır. Sikloksijenaz enziminin vücutta iki izoenzimi vardır. Bunlar COX-1 ve COX-2'dir. Vücutta predominant olan tip COX-l olup, fizyolojik uyarılarla aktive olan formdur. COX-1 damar endoteli, mide mukozası, böbrek, kalp ve trombositlerde bulunur. COX-2 ise enflamatuar uyarılarla aktive olan formdur. Makrofajlarda ve diğer enflamatuar hücrelerde bulunur ve iltihap etkenleri ile indüklenebilir. Aspirin ve indometazin, COX-l i daha fazla inhibe ederken COX-2 üzerine etkileri nispeten daha azdır. Halbuki flurbiprofenin COX-1 e olan inhibitör etkisi COX-2 ye göre daha düşüktür. COX-2 üzerine olan inhibitör etkileri COX-1 e göre daha fazla olan NSAİD lerden meloksikam, tenoksikam ve nabumeton halen tıbbi kullanımı yaygın olan ilaçlardır. Gastrik bikarbonat ve mukus sekresyonun azalması indometazinin hasarlaştırıcı etkisine yardım eder. Vasküler hasar etanol veya indometazin tarafından uyarılan şiddetli gastrik mukozal lejyonların patojenizinde hız 136, 137 sınırlayıcı bir basamak gibi görünmektedir. 14

29 Eğer vasküler hasar mevcutsa, süperfisyal mukozal kapiller kan akımı düşer ve dolaşımdan plazma sızar. Bu durum mukozal kan damarlarında dolaşımın tamamen durması sonucu konjesyonu hızlandırır. Nekrotik yüzey epitelinin dökülmesi ile oluşan erozyon hipoksik ortamda genişler ve böylece hemorajik derin erozyon ve ülser oluşur (Şekil 2.5). Eğer vasküler hasar minimal derecede ise veya yoksa kan akımı devam eder ve süperifisyal mukozal hücre hasarına rağmen gastrik pit deki proliferatif zon çabucak hasarı karşılar ve hücre proliferasyonu gelişir. Eğer vasküler hasar yoksa veya az ise süperfisyal epitelin % 95 i etanolle yıkıldığı halde hasardan dakika sonra derindeki küboidal hücreler yüzeyi kaplar. Vasküler hasar ve derin hemorajik erozyon veya ülserlerin yokluğunda, gastrik mukozanın epitelyal yenilenmesi son derece hızlı ve yeterlidir. Başka bir değişle eğer vasküler hasarı farmakolojik olarak dikkate alırsak, gastrik mukozal epitel doğal ve yeterli tamir kapasitesinden dolayı kendi kendine iyileşir. Böylece vasküler endotel, gastrik lezyonları önlediği veya azalttığı düşünülen yeni ilaçlar için terapötik bir hedef olarak gösterilmektedir. 138 Şekil 2.5. Çeşitli kimyasalların oluşturduğu gastrik erozyon ve ülserlerin patojenezinde vasküler hasarın önemi 15

30 2.4. Antioksidanlar Serbest Radikaller Kuantum kimyasına göre ancak iki elektron bir bağın yapısına girebilir. Ayrıca iki elekronun zıt spinli olması gerekir. Elektron çiftleri oldukça kararlıdır ve insan vücudunun neredeyse tüm elektronları elektron çifti halinde bulunur. Bir bağ koptuğunda elektronlar ya birlikte kalır (heterolitik parçalanma) ya da ayrılırlar (homolitik parçalanma). Eğer birlikte kalırlarsa kimyasal bağ heterolitik olarak parçalanır, homolitik olarak parçalanır ise serbest radikaller oluşur. Bu eşleşmemiş elektronlar yüksek enerjilidir ve eşleşmiş elektronları ayırıp onların fonksiyonlarına engel olurlar. Bu özellikleri serbest radikalleri hem tehlikeli hem de kullanışlı yapmaktadır. Bu nedenle, serbest radikaller yaşam için gereklidir ve elektron transferinin de, enerji üretiminde ve pek çok diğer metabolik olaylarda önemli ürünlerdir. Şayet zincir reaksiyonu kontrolsüz bir davranış gösterirse hücrede hasarlara neden olur. Bilim adamları 1954' lerden beri serbest radikallerin yaşlanma ve dejeneratif hastalıklara neden olduğunu bilmektedirler. Çoğu elektronlar çift halde bulunurken, serbest radikaller bu elektronları birbirinden ayırarak reaksiyonu durdururlar. Ama sonuçta serbest radikal kendine bir çift elektron alarak elektron çifti haline geçer, diğer elektron serbest radikal olur. Bu tip moleküller ortaklanmamış elektronlarından dolayı oldukça aktiflerdir ve bu yüzden nüfuz edici özelliğe sahiptirler. 139 Serbest radikaller üç yolla meydana gelirler: 1 - Kovalent bağlı bir molekülün her bir grubunda ortak elektronlardan birinin kalarak homolotik olarak bölünmesi. 16

31 X : Y X. + Y. 2 - Bir molekülden tek bir elektronun kaybı veya bir molekülün heterolitik bölünmesi. Heterolitik bölünmede kovalent bağı oluşturan her iki elektron atom veya atom gruplarının birinde kalırlar. Böylece serbest radikaller değil iyonlar meydana gelir. X : Y X + Y Bir moleküle tek bir elektronun eklenmesi A + e - A. Biyolojik sistemlerdeki en önemli serbest radikaller, oksijenden oluşan radikallerdir. Serbest oksijen radikali biyokimyasında anahtar rolü oynayan maddeler oksijenin kendisi, süperoksit, hidrojen peroksit, geçiş metallerinin iyonları ve hidroksil radikalleridir. 132 Bunlardan ilk dördünün çeşitli reaksiyonları sonuncu genellikle hidroksil radikalleri meydana gelir. Oksijen molekülünün elektronları o şekilde dağılmışlardır ki bu elektronlardan iki tanesi eşleşmemiştir. Bu yüzden oksijen bazen bir di radikal olarak değerlendirilmektedir. Oksijenin bu özelliği onun diğer serbest radikallerle kolayca reaksiyona girmesini sağlarken, radikal olmayan maddelerle ise nispeten daha yavaş tepkime vermesini sağlar. Oksijenin kısmi indirgenmesi sonucu çok sayıda reaktif ürün oluşmasına rağmen son indirgenme ürünü sudur Serbest Radikal Çeşitleri Süperoksit Radikali: Hemen hemen tüm aerobik hücrelerde enerji metabolizmasında, oksidasyon sırasında ya da oksidazlar gibi bazı enzimlerin aktivitesi sonucunda oksijenin bir elektron alması sonucu serbest süperoksit radikal anyonu (O 2 ) meydana gelir. O 2 + e O 2 17

32 Süperoksit bir radikal olmakla birlikte, kendisi direkt olarak zarar vermez. Süperoksitin zararlı etkileri çok iyi anlaşılamamasına rağmen, yüksek derecede toksik 140, 141 olduğuna dair birçok deliller bulunmaktadır bulunmaktadır. Oksidatif hasarda nadiren rol almalarının nedeni hızlı bir şekilde süperoksit dismutaz (SOD) enzimi tarafından hidrojen perokside (H 2 O 2 ) dönüştürülmeleridir. Buna ilaveten asidik durumlarda H 2 O 2 ve peroksil (HO.- 2 ) radikalleri üreten spontan protonasyona da uğrarlar. 142 Süperoksit radikallerinin asıl zararları, yukarıda da bahsedildiği gibi hidrojen peroksit kaynağı ve geçiş metalleri iyonlarının indirgeyicisi olmalarıdır. O 2 + O2 + 2H + H 2 O 2 + O 2 Süperoksit fizyolojik bir serbest radikal olan nitrik oksit ile birleşmesi sonucu reaktif bir oksijen türevi olan peroksinitrit meydana getirir. O 2 + NO. ONOO Böylece NO. deaktive edilmiş olur. Bununla beraber, peroksinitritlerin doğrudan - proteinlere zararlı etkilerinin yanı sıra azot protoksit (NO 2 ), hidroksil radikali (OH. ) ve nitronyum iyonu (NO + ) gibi başka toksik ürünlerin oluşumunu katalizlerler. Süperoksit anyonu hem oksitleyici (yükseltgeyici) hem de indirgeyici özelliğe sahiptir. Adrenalin, dopamin, askorbat ve hidroksil amini oksitler, nitrobluetetrazolium ve sitokrom c'yi indirger. Redüktan(indirgeyici) olarak görev yaptığında, ferrisitokrom c nin redüksiyonunda bir elektron kaybeder ve oksijene okside olur. Oksidan olarak görev yaptığında ise epinefrinin oksidasyonunda bir elektron alır ve hidrojen perokside indirgenir indirgenir. 139 Süperoksit ile perhidroksil radikali birbirleriyle reaksiyona girince biri okside olurken diğeri indirgenir. Bu dismutasyon reaksiyonu sonucu oksijen ve hidrojen peroksit meydana gelir gelir. 133 HO 2. + O 2 + H + H 2 O 2 + O 2 18

33 Diğer taraftan indirgenmiş geçiş metallerinin oto oksidasyonu da süperoksit meydana getirebilmektedir. 131 Fe +2 + O 2 Fe +3 + O 2 Cu + + O 2 Cu +2 + O 2 Bu reaksiyonlar geriye dönüşlü redoks reaksiyonları olarak kabul edilmektedir ve serbest radikal reaksiyonlarının hızlanmasında çok büyük öneme sahiptir. 140 Hidrojen Peroksit: Asidik ortamda moleküler oksijenin çevresindeki moleküllerden iki elektron alması veya süperoksitin bir elektron alması sonucu hidrojen 133, 143 peroksit meydana gelir. O 2 + e - + 2H + H 2 O 2 O 2 + 2e - + 2H + H 2 O 2 Ancak biyolojik sistemlerde hidrojen peroksidin asıl üretimi süperoksitin dismutasyonu ile olur. Süperoksit molekülü proton alarak hidrojen peroksit ve moleküler oksijeni oluşturur. 131 Bu dismutasyon ya spontandır ya da süperoksit dismutaz enzimi tarafından katalizlenir. Spontan dismutasyon ph 4.8 'de en hızlıdır. Süperoksit dismutaz tarafından katalizlenen dismutasyon ise daha geniş bir ph aralığında olur. 2O 2 + 2H + H 2 O 2 + O 2 H 2 O 2 kendi başına serbest radikal değildir, çünkü ortaklanmamış bir elektron 140, 144 içermemektedir. Hidrojen peroksit serbest bir radikal olmadığı halde, reaktif oksijen türleri içine girer ve serbest radikal biyokimyasında önemli bir rol oynar. Çünkü Fe ve Cu gibi geçiş metalleri varlığında süperoksit ile reaksiyona girerek en reaktif ve 19

34 zarar verici serbest oksijen radikali olan hidroksil radikali oluşturmak üzere kolaylıkla yıkılabilir. 133 Fe +2 veya Cu + H 2 O 2 + O 2.- OH + OH - + O 2 Bu reaksiyona Haber - Weiss reaksiyonu adı verilir. Haber - Weiss reaksiyonu katalizör varlığında veya katalizörsüz cereyan eder. Fakat katalizörsüz reaksiyon oldukça yavaş ilerler. Demirle katalizlenen ikinci şekli ise çok hızlıdır. Bu reaksiyonda önce ferri demir (Fe +3 ) süperoksit tarafından ferro demire (Fe +2 ) indirgenir. Sonra bu ferro demir kullanılarak Fenton reaksiyonu ile hidrojen peroksitten OH. ve OH - üretilir üretilir 145. Reaksiyon mekanizması aşağıdaki şekildedir. 134 O 2 + Fe +3 O 2 + Fe +2 Fe +2 + H 2 O 2 Fe +3 + OH. + OH - Hidroksil Radikali: Suyun hidroliziyle (yüksek enerjili iyonize edici reaksiyona maruz kalması) ya da parçalanmasıyla hidrojen radikalleri ve hidroksil radikalleri oluşturabilir Hidroksil radikali (OH. ) hidrojen peroksidin geçiş metallerinin varlığında indirgenmesiyle de (Fenton reaksiyonu) meydana gelir. 133 H - O H H. + OH. Son derece reaktif bir oksidan radikaldir. Oluştuğu yerde büyük hasara neden olur. Hidroksil radikali birçok biyolojik molekülden hidrojen atomu koparır. Bunlardan birisi de tiollerdir. R-SH + OH. RS. + H 2 O 20

35 . Meydana gelen sülfür radikali oksijenle birleşerek RSO 2 ve RSO. gibi oksisülfür radikallerini meydana getirir. Bu radikaller de biyolojik moleküllerde hasar yapıcı etkiye sahiptir. Belki de hidroksil radikalinin en iyi tanımlanmış biyolojik hasarı lipit peroksidasyonu nu artırmasıdır. Bu durum hidroksil radikallerinin membranlara yakın bir yerde üretilmesi ve membran fosfolipid zincirinin yağ asidi tabakasına atak yapması ile meydana gelir. Bu radikalin araşidonik asit gibi doymamış yağ asitlerine olan ilgisi daha fazladır. Singlet Oksijen: Singlet oksijen ( 1 O 2 ) ortaklanmamış elektronu olmadığı için radikal olmayan reaktif oksijen molekülüdür. Serbest radikal reaksiyonları sonucu meydana geldiği gibi serbest radikal reaksiyonlarının başlamasına da sebep olur. Singlet oksijen elektronlarından birinin enerji alarak ters spinli başka bir orbitale uyarılması sonucu oluşur. 139 Diğer Radikaller: Serbest oksijen radikallerinin etkisi sonucu karbon merkezli radikaller (R. ), peroksil radikalleri (ROO. ), alkoksil radikalleri (RO. ), tiyol radikalleri (RS. ) gibi önemli serbest radikaller de oluşabilir. Bunlardan özellikle polidoymamış yağ asitlerinden meydana gelen peroksil radikali yarı ömrü uzun olan bir radikaldir. Tiyol radikalleri ise oksijenle tekrar reaksiyona girerek sülfenil (RSO. ) veya tiyol peroksil (RSO. 2 ) vb. gibi radikalleri oluşturabilirler Serbest Radikallerin Kaynakları Biyolojik Kaynakları: 134, Aktive olmuş fagositler: (Respiratory Burst) - Antineoplastik ajanlar: Nitrofurantoin, bleomisin, doksorubisin ve adriamisin. - Radyasyon

36 - Bağımlılık yapan maddeler: Alkol ve uyuşturucular. - Çevresel ajanlar: Hava kirliliği yapan fotokimyasal maddeler, hiperoksitler, pestisitler, sigara dumanı, solventler, anestezikler ve aromatik hidrokarbonlar. - Stres: Streste katekolamin düzeyi artar. Katekolaminlerin oksidasyonu ise serbest radikal kaynağıdır. Bu olay, stresin hastalıkların patojenezindeki rolünün serbest radikal üretimiyle ilgili olabileceğini göstermesi bakımından önemlidir. İntrasellüler kaynakları: - Küçük moleküllerin oto oksidasyonu: Tioller, hidrokinonlar, katekolaminler, 143, 144, 146, 147 flavinler, tetrahidropterinler, antibiyotikler. - Enzimler ve proteinler: Ksantin oksidaz, dioksijenaz, hemoglobin. Birçok enzimin katalitik siklusu esnasında serbest radikaller açığa çıkar. Ksantin oksidaz serbest radikal oluşturan enzimler içinde en çok araştırılmış olanıdır. 134 Normalde NAD (Nikotinamid adenin dinükleotid) bağımlı dehidrojenaz olarak etki eder ve herhangi bir serbest radikal üretimine sebep olmaz. Fakat, in vivo olarak oluşturulan iskemi, enzimin dehidrojenaz formundan oksidaz formuna dönüşmesine ve süperoksit radikalinin üretimine sebep olur olur. 143 Aldehit oksidaz da yapı itibariyle ksantin oksidaza benzer ve substratlarının çoğu aynı olup, süperoksit radikali üretir. Benzer şekilde triptofan dehidrojenaz gibi 134, 148 enzimler de radikal oluşumuna sebep olurlar. - Mitokondriyal elektron transportu: Normalde hücrelerde en büyük serbest radikal kaynaklarından biri elektron transport zincirinden elektron sızıntısıdır. Mitokondri iç zarında yerleşmiş oksidatif fosforilasyon zinciri bileşenleri büyük oranda indirgendiği zaman mitokondriyal süperoksit radikal üretimi artar. 134 Böylece NAD + bağlı substratlar, süksinat, ADP (Adenozin di fosfat) ve oksijen gibi endojen faktörler oksidatif fosforilasyonu regüle ederek mitokondriyal radikal üretimine etki ederler. 22

37 - Endoplazmik retikulum ve nükleer membran elektron transport sistemleri: (Sitokrom P-450, sitokrom b 5 ) Endoplazmik retikulum ve nükleer membranda ise serbest radikal üretimi membrana bağlı sitokromların oksidasyonundan kaynaklanır. Membrana bağlı sitokrom P-450 ve b 5, doymamış yağ asitleri ve ksenobiyotikleri redükte ederken dioksijen ve diğer substratları ise okside ederler. - Peroksizomlar, oksidazlar, flavoproteinler: Peroksizomlar çok önemli hücre içi H 2 O 2 kaynağıdırlar. Bu organeldeki D-amino asit oksidaz, ürat oksidaz, L-hidroksil asit oksidaz ve yağ asidi açil COA oksidaz gibi oksidazlar süperoksit üretmeden bol miktarda H 2 O 2 üretimine sebep olurlar. Ancak peroksizomlarda katalaz aktivitesi de çok yüksek olduğu için bu organelden sitozole ne kadar H 2 O 2 geçtiği bilinmemektedir Aktive olmuş fagositler: Bakterisidal rollerinin sonucu olarak süperoksit üretirler 133, 136, 146 üretirler. - Plazma membranı: Plazma membranı serbest radikal oluşum reaksiyonlarının kritik bir bölgesidir. Ekstraselüler olarak üretilen serbest radikaller diğer hücre komponentleri ile reaksiyona girmeden önce plazma membranını geçmek zorundadırlar. Bu geçiş sırasında membranda toksik maddeleri üreten reaksiyonlar başlatabilirler. Membrandaki fosfolipitlerin, glikolipitlerin, gliseridlerin ve sterollerin bünyesinde bulunan ve doymamış yağ asitleriyle okside olabilen transmembran proteinleri serbest radikal hasarından çabuk etkilenirler. Lipit peroksidasyonu veya yapısal olarak önemli proteinlerin oksidasyonunun sebep olduğu artmış membran permeabilitesi; transmembran iyon gradiyentinin bozulmasına, sekretuar fonksiyonlarının kaybına ve integre sellüler metabolik proseslerin inhibisyonuna sebep olur. 134 Hidrojen peroksit, membranları neredeyse su kadar kolay geçebilme özelliğine sahiptir. Saldırgan O 2 radikal anyonu ise membranları ve transmembranal anyon 23

38 kanallarını geçerek hücreye girer. Aynı zamanda polianyonik hücre yüzeyi, çevre doku sıvısından 2-3 ph daha düşük olduğu tahmin edilen, bir mikro çevre sağlayan, çoğu çözünmüş H + den oluşan son derece zıt bir konsantrasyonu çeker. Bu pratik çevre O 2 nin protonla reaksiyonu sonucu perhidroksil radikalinin oluşumunu sağlar. 134 H - + O 2. - HO HO -. 2, O - 2 den daha güçlü bir oksidandır, bu nedenle lipitlerin ve proteinlerin hidrofobik kısımlarını daha iyi parçalayabileceği ve toksik etkisini daha fazla olabileceği düşünülmektedir. Bu sebeple saldırgan oksijen radikallerine karşı bir bariyer oluşturan hücre yüzeyleri, diğer radikal türlerine reaktif bir forma modifiye eden ve daha permeabl bir kapı görevi görür. Serbest radikallerin fagositik hücre plazma membranında, NADPH (Nikotinamid adenin dinükleotid hidrojen fosfat)-oksidaz aracılı üretimi, serbest radikallerin önemli bir biyolojik kaynağıdır. 133 Fagosit kökenli serbest radikaller hem oluştukları hücreye, hem de yakınında bulunan hücrelere hasar verirler. Lipoksijenaz ve siklooksijenaz gibi plazma membranıyla bağlantılı enzimler ile mikrozomlar tarafından serbest radikal üretimi, bu enzimlerin predominant substratı olan araşidonik asit metabolizması ile ilişkili pek çok yeni buluş ve biyolojik açıdan önemli ürünlerin meydana gelmesinden dolayı ilginçtir. Bu ürünler prostaglandinleri, tromboksanları, lökotrienleri ve anaflaksinin slow-reakting substratını içerir (Şekil 2.6). 24

39 Şekil 2.6. Araşidonik asit metabolizması esnasında üretilen serbest radikaller Şekil 2.6 dan da anlaşılacağı gibi araşidonik asit metabolizması reaktif oksijen metabolitlerinin önemli bir kaynağıdır. 134 Araşidonik asitin biyoaktif ürünlere dönüşümü esnasında geniş spektrumlu oksijen, karbon ve hemoprotein radikalleri oluşur ve bunlar doku hasarına yol açarlar. 149 Prostaglandin sentezi esnasında hidroksil radikali veya diğer radikallerin üretimi, siklooksijenazın (COX) feed-back regülasyonuna yol açar, prostaglandin biyosentezinin hız ve süresini modüle eder ve prostaglandin sentezinden sonra ikinci ulak ve sitotoksik etkilerini hızlandırır. COX, ksenobiyotikleri daha toksik 150, 151 türlere metabolize etme yeteneğine de sahiptir. Trombositlerde tromboksan sentezinin imidazol ve nordihidroguiaretik asit gibi radikal toplayıcılarla inhibe edilmesi, prostaglandin endoperoksitinin tromboksanlara dönüşümünün bir serbest radikal reaksiyonu sonucu olabileceği düşüncesini kuvvetlendirmektedir. 134 Lipoksijenaz kaynaklı peroksitler oksidan-sensitif siklooksijenaz aktivitesini modüle edebilir. 151 Bu sebeple, prostaglandin ve tromboksanların biyosentezi, biyosentetik enzimin kendisi ve diğer hücre komponentleri 25

40 ile reaksiyon yeteneğine sahip hemoprotein-oksijen ve karbon merkezli serbest radikallerin oluşmasıyla sonlanır. Yukarıdaki bilgilere dayanarak serbest radikallerle prostaglandin metabolizması birbirleriyle yakından ilişkili olduğunu kolayca söyleyebiliriz. Reaktif oksijen metabolitleri fosfolipaz aktivasyonu yolu ile prostaglandin E 2, F 2, 6-keto PGF1 ve TXB 2 sentezini gerçekleştirirler. PGE 2 ve I 2 adenilat siklazı aktive ederek camp sentezini artırırlar ki, süperoksit de camp sentezini artırıcı etkiye sahiptir. Bu bilgiler reaktif oksijen türlerinin prostaglandin sentezi yolu ile camp konsantrasyonunu artırdıklarını doğrulamaktadır Hayvan hücrelerinde süper oksitin bir başka kaynağı da askorbik asit, tioller (sistein gibi), adrenalin ve flavin koenzimleri gibi bileşiklerin oto oksidasyonudur Oksidatif stres yapıcı durumlar: İskemi, travma, intoksikasyon. 139 Hücrelerde serbest radikal üretimi bazı yabancı toksik maddeler tarafından da büyük oranda artırılabilir. Bu tip maddeler dört grupta toplanmıştır Toksinin kendisi bir serbest radikaldir. Kirli havanın koyu rengini veren azot dioksit 157 gazını buna örnek verebiliriz. NO. 2 gazı radikalik bir madde olup aynı zaman da iyi bir lipit peroksidasyonu başlatıcısıdır. 2- Toksin bir serbest radikale metabolize olur. Mesela toksik bir madde olan karbontetraklorür (CCl 4 ) karaciğerde sitokrom P-450 tarafından triklorometil (CC 3 ) serbest radikaline dönüştürülür. Bu radikalin oksijenle reaksiyonu sonucu meydana gelen peroksil radikali de güçlü bir lipit peroksidasyonu başlatıcısıdır. CCl 3 + O 2 CCl 3 O 2 3- Toksinin metabolizması sonucu serbest oksijen radikali meydana gelir. Bunun tipik bir örneği paraquattır. 26

41 4- Toksin antioksidan aktiviteyi düşürür. Mesela parasetamolün karaciğerde sitokrom P- 450 tarafından metabolizması sonucu oluşan ürün glutatyon ile reaksiyona girer ve miktarını azaltan bir ürün meydana getirir Serbest Radikallerin Etkileri Serbest radikaller; hücre membranı proteinlerini yıkarak hücreleri öldürür, membran lipit ve proteinlerini yok ederek hücre membranını sertleştirip hücre fonksiyonunu engeller, nuklear membranı yararak nukleusta ki genetik materyale etki edip DNA'yı kırılma ve mutasyonlara açık hale getirir, bağışıklık sistemindeki hücreleri yok ederek bağışıklık sistemini zorlar ve enzimleri aktifleştirir veya inaktive eder. 140 Ayrıca mitokondrideki aerobik solunumu ve kapiller permeabiliteyi bozup, hücrenin potasyum kaybını ve trombosit agregasyonunu artırırlar. Membran Lipitlerine Etkileri (Lipit peroksidasyonu) : Biyomoleküllerin tüm büyük sınıfları serbest radikaller tarafından etkilenmesine karşın, bunlar arasında en hassas olanı lipitlerdir. Lipit peroksidasyonu bir serbest radikal kaynağıdır, oksijenle karşılaşan lipitlerin peroksidasyona uğraması (oto oksidasyonu) sadece besinlerin bozulmasından (acıma) sorumlu olmayıp aynı zamanda, kanser, yangısal hastalıklar, ateroskleroz, yaşlanma vb. gibi olaylara neden olabilen doku hasarından da sorumludur. Bu yıkıcı etkiler metilenle kesintiye uğramış çift bağlar içeren doymamış yağ asitlerinden, peroksit oluşması sırasında üretilen serbest radikaller (ROO., RO., OH. ) tarafından başlatılır. Membranlardaki kolesterol ve yağ asitlerinin doymamış(çift) bağları serbest radikallerle kolayca reaksiyona girerek peroksidasyon ürünleri oluştururlar. Lipit radikallerinin hidrofobik yapıda olması yüzünden reaksiyonların çoğu membrana bağlı moleküllerde meydana gelir. Bundan da membran permeabilitesi ve mikro vizkozitesi ciddi bir şekilde etkilenir. Polidoymamış yağ asitlerinin (PUFA) oksidatif yıkımı lipit peroksidasyonu (LPO) 27

42 olarak bilinir ve oldukça zararlıdır. Çünkü LPO kendi kendini devam ettiren zincir reaksiyonu şeklinde ilerler ve bu oto katalitik reaksiyonu sonucu oluşan lipit peroksit, membranının stabilizasyonunu ortadan kaldırarak, hızlı hücre ve doku bozulmalarına neden olurken lipit, alkol ve aldehitler gibi istenmeyen yan ürünler 134, 152, 153 oluşur. Bu ürünlerin ya hücre düzeyinde metabolize edilirek veya başlangıçtaki etki alanlarından diffüze olup hücrenin diğer bölümlerine hasarı yayarak birçok hastalığa ve doku hasarına neden olurlar. 154 Bu ürünlerden en çok bilineni malondialdehittir (MDA) 155, 156 Serbest radikaller tarafından zar lipitlerine direkt saldırı reversibl ve irreversibl kardiyak etkilerin oluşumuna yol açar. LPO sonucunda, bazıları serbest radikal aktivitesinin göstergeleri olarak kullanılan, birçok ürün oluşur. LPO nun başlangıç aşamalarında dien konjugatlarının oluşumu ile bir moleküler düzenlenme oluşur. İnsanlarda en sık görülen linoleik asitin 9,11 izomeridir. Daha sonraki yayılma evresinde daha ileri LPO ve fragmentasyon (parçalanma) oluşur. Ortaya çıkan son ürünlerden biri yukarıda bahsedildiği gibi MDA dır. 157 Olayın tamamı aşağıdaki şekilde özetlenebilir: 1. Başlama safhası LOOH + metal (n)+ LOO + metal (n-1)+ + H + X + LH L + XH 2. İlerleme safhası L + O 2 LOO LOO + RH LOOH + LO, vb 3. Sonlanma safhası LOO + LOO LOOL + O 2 28

43 LOO + L LOOL L + L LL Olayı başlatan moleküler öncüller genel olarak hidroperoksit ürün LOOH olduğundan LPO, potansiyel yıkıcı etkileri olan bir zincir tepkimesidir. Gerek insanlar ve gerek doğada LPO yu denetlemek ve azaltmak için antioksidanlar kullanılır. Propil gallat, butillenmiş hidroksianizol (BHA) ve butillenmiş hidroksitoluen (BHT) antioksidan olarak kullanılan gıda katkılarıdır. Doğada görülen antioksidanlar yağda çözünen ß-karoten ile E vitaminini (tokoferol), ve suda çözünen C vitaminini kapsar. 139, 153 Proteinlere Etkileri : Serbest radikallerin doymamış ve sülfür içeren moleküllerle olan reaktivitesi sebebiyle, triptofan, tirozin, fenilalanin, histidin, metiyonin ve sistein gibi amino asit içeren proteinler bu serbest radikallerden kolayca etkilenirler. Bu etkilenmenin sonucunda da sülfür radikalleri ve karbon merkezli radikaller oluşur. 137 Bu istenmeyen reaksiyonlar sonucu immünoglobulin G ve albümin gibi çok sayıda disülfid bağı bulunduran proteinlerin üç boyutlu yapıları bozulur ve proteinlerin konfigürasyonlarını bozarak vücuttaki normal metabolik aktivitelerini engeller. Nükleik Asit ve DNA ya Etkileri: İyonize edici radyasyonla oluşan serbest radikaller DNA yı etkileyerek hücrede mutasyona ve ölüme yol açarlar. Sitotoksisite büyük oranda, nükleik asit baz modifikasyonundan doğan kromozom değişikliklerine veya DNA daki diğer bozukluklara bağlıdır. 139, 158 OH. radikalinin hem prokaryotik hem de ökaryotik hücrelerde, radyasyonun sebep olduğu hücre ölümünden büyük oranda (% 80 oranında) sorumlu bir ajan olduğu düşünülmektedir. 134 Aktive olmuş nötrofillerden kaynaklanan H 2 O 2 membranlardan kolayca geçtikten sonra hücre çekirdeğine ulaşarak DNA hasarına, hücre disfonksiyonuna ve hatta ölümüne yol 29

44 açabilir. Bu yüzden DNA serbest radikallerden kolay zarar görülebilen açık bir hedeftir. Süperoksite maruz kalan DNA molekülleri hayvanlara enjekte edildiğinde daha fazla antijenik özellik gösterirler ki bu oldukça önemli bir etkidir. Çünkü otoimmün bir hastalık olan sistemik lupus eritematosuz (SLE) ve romatoid artritte (RA) dolaşımda anti-dna antikorları bulunur. Süperoksit ve hidrojen peroksitin enzimatik toplayıcıları, (OH. ) prekürsörlerinin konsantrasyonunu azaltarak DNA yı korur. 139 Karbonhidratlara Etkileri: Serbest radikallerin karbohidratlar üzerine de önemli etkileri vardır. Monosakkaritlerin oto oksidasyonu sonucu hidrojen peroksit, peroksitler ve okzalaldehitler meydana gelir. Bu maddeler diyabet ve sigara içimi ile ilişkili kronik hastalıkların patolojik proseslerinde de önemli rol oynarlar. 139 Okzalaldehitler DNA, RNA ve proteinlere bağlanabilme ve aralarında çapraz bağlar oluşturabilme özelliklerinden dolayı antimitotik etkiye sahiptirler. Böylece kanser ve yaşlanma olaylarında da önemli rol oynarlar Antioksidan Savunma Sistemleri Reaktif oksijen türlerinin oluşumu ve bunların meydana getirdiği hasarı önlemek için vücutta birçok savunma mekanizmaları gelişmiştir. Bunlar antioksidan savunma sistemleri veya kısaca antioksidanlar olarak bilinir. Antioksidanlar, endojen ve ekzojen kaynaklı olabilmektedirler. Antioksidanlar aynı zamanda serbest radikal oluşumunu engelleyen ve mevcut radikalleri etkisiz hale getirenler şeklinde de ikiye ayrılırlar. Ayrıca enzim ve enzim olmayanlar şeklinde de sınıflandırılan antioksidanlar hücrelerin hem sıvı hem de membran kısmında bulunurlar Endojen (Doğal) Antioksidanlar A) Primer Antioksidanlar (Enzimler) Katalaz (CAT-EC ): 30

45 Doğada yaygın bir şekilde mevcut olduğu ilk defa 1901 'de O. Leew tarafından bulunmuştur. Yine ilk defa 1937' de Summer ve Dounce tarafından karaciğerden kristal formda izole edilmiştir. Molekül kütlesi Daltondur. Dört alt üniteden oluşmuştur. Peroksizomlarda, lizozomlarda ve mitokondride bulunur. Kandaki CAT aktivitesi büyük ölçüde eritrositlerden kaynaklanmaktadır. Bu nedenle insan eritrositleri CAT yönünden çok zengindir. GPx esas olarak mitokondri ve sitozolde bulunurken, CAT peroksizomlarda bulunur. Eritrositlerde mitokondri olmadığı halde yüksek aktivitede CAT ve GPx vardır. CAT 4 tane hem grubu bulunan bir hemoproteindir. Peroksidaz etkinliğine sahip olmasına ek olarak bir molekül H 2 O 2 yi elektron verici substrat, diğer H 2 O 2 yi ise elektron alıcı substrat olarak kullanabilir. Peroksizomlarda lokalizedir lokalizedir 158. Peroksizomal enzimler, mitokondriyal ve mikrozomal elektron taşıyıcı sistemler ve keza ksantin oksidazın H 2 O 2 kaynağı olarak kabul edilmesi zorunludur. 153 Büyük moleküllü lipit hidroperoksidlere etki etmezken, hidrojen peroksidi oksijen ve suya parçalar H 2 O CAT 2 2H 2 O + O 2 Glutatyon Peroksidaz (GPx-EC ): GPx hidroperoksidlerin indirgenmesinden sorumlu, tetramerik 4 selenyum atomu ihtiva eden sitozolik bir enzimdir. Memeli eritrositlerinden ilk defa Mills ve arkadaşları tarafından karakterize edilmişlerdir. Daha sonra yapılan araştırmalarla enzim hakkındaki bilgiler artırılmıştır. Dominant olarak sitozolik bir enzimdir ve mitokondride düşük düzeylerde bulunur. GPx aktivitesindeki azalma, hidrojen peroksitin ve lipit peroksitlerin artmasına ve bu da hücre hasarına yol açar. GPx' in beyin düzeyleri düşüktür. Prostetik grup olarak selenyum (Se) içeren metalloenzimdir. Beyinde, beyin selenyumunun çok az bir kısmını içerdiğinden dolayı diyetle elde edilebilirliğinden çok 31

46 fazla etkilenmez. GPx sitozolik hasara karşı etkin koruyucu bir mekanizma sağlar. Bu enzim, H 2 O 2 'i ve lipit peroksitlerini GSH'yi kullanarak redüksiyon yoluyla uzaklaştırır. GPx aşağıdaki reaksiyonları katalize eder. 158 H 2 O 2 + 2GSH ROOH + 2GSH GPx GPx GSSG + 2H 2 O GSSG + ROH + H 2 O Fosfolipid hidroperoksit glutatyon peroksidaz da (PLGPx) monomerik, selenyum atomu ihtiva eden sitozolik bir enzimdir. Membran fosfolipid hidroperoksitlerini alkollere indirger. 139, 158 Membrana bağlı en önemli antioksidan olan vitamin E yetersiz olduğu zaman, PLGPx membranı peroksidasyona karşı korur. Süperoksit Dismutaz (SOD-EC ): Süperoksitin, hidrojen peroksit ve moleküler oksijene dönüşümünü katalizleyen bu enzim, beyinde yaygın bir şekilde bulunur ve aktivitesi yaş artışıyla beraber artar. İnsanlarda iki tipi vardır. Bunlar sitozolde bulunan dimerik Cu ve Zn ihtiva eden CuZnSOD ile mitokondri de bulunan ve tetramerik Mn ihtiva eden MnSOD 158 izomerleridir. Mitokondriyal SOD hemen hemen total SOD nin % 60 ' ini içerir. Zira süperoksit sitozole göre mitokondride hemen hemen iki kat daha fazla oluşur. Tüm SOD'ler fizyolojik şartlarda 134, 158 izomerlerdir. SOD nin Fe ihtiva eden izomeri (FeSOD) ise sadece mikroorganizmalarda ve bazı bitkilerde bulunur. Genel olarak hücrede en bol bulunan izomer sitozolik Cu, Zn-SOD dir. Cu, Zn- SOD ilk defa, 1969' da, Mc Cord ve Fridovic tarafından hayvan, bitki dokuları ve mayadan saflaştırılmış ve tanımlanmıştır. Molekül kütlesi daltondur. İki alt ünitesi vardır ve bunların her birinde bir Cu ve bir Zn atomu bulunmaktadır. Ayrıca her alt birimde bir zincir içi disülfür köprüsü, bir sülfidril grubu ve bir de asetillenmiş terminal amino grubu bulunmaktadır. Cu, Zn-SOD enziminin ayrı formları 32

47 bulunmaktadır. Mn-SOD mitokondrial bir enzimdir ve prokaryatların sitozolünden elde edilebilmektedir. İlk kez 1970 yılında Keele ve arkadaşları tarafından izole edilmiştir. Buradaki mangan +3 değerliklidir ve iki alt birimden oluşmuştur. Her alt birimde bir Mn atomu vardır ve dalton süperoksite karşı etkin bir koruma sağlarlar. 142 Her iki enzimin katalizlediği reaksiyon aynıdır. Enzimin fizyolojik fonksiyonu lipit peroksidasyonunu inhibe ederek oksijeni metabolize eden hücreleri süperoksit serbest radikallerinin zararlı etkilerine karşı korumaktır. 134, 158 Normalde metabolizma sırasında hücreler tarafından fazlaca süperoksit üretilmesine rağmen bu enzim sayesinde intrasellüler düzeyleri düşük tutulur. SOD fagosite edilmiş bakterilerin intrasellüler öldürülmesinde de rol oynar. Bu yüzden SOD granülosit fonksiyonu için çok önemlidir. Lenfositlerde de granülositlerden daha fazla oranda SOD bulunur. Fagositik hücrelerin solunum patlaması NADPH-Oksidazı kapsar ve bakterilerin öldürülmesine yardım eder, yani nötrofiller ve diğer fagositik hücreler bakterileri yuttuğunda oksijen tüketiminde ani bir artış görülür bu olay solunum patlaması olarak bilinir. Bu hızlı oksijen tüketimi olayı (15-20 saniyelik boş bir aradan sonra ) O.- 2, H 2 O 2, OH, HOCI - (hipoklorit iyonu) gibi tepki veren türevlerin büyük miktarda üretilmesi ile kendini gösterir. Bu ürünlerden bazıları güçlü mikrop öldürücü ajanlardır. Solunum patlamasından sorumlu elektron taşıma zincir sistemi bir flavoprotein, NADPH: O 2 - oksidoredüktaz (Çoğunlukla NADPH oksidaz olarak bilinir) ve bir b-tipi sitokrom içerir. Bu sistem oksijenin süperoksit anyona tek elektron ile indirgenmesini sağlar. Sistem nötrofiller ve diğer fagositik hücrelerin plazma zarına yerleşiktir. NADPH pentoz fosfat yolu üzerinden üretilir ve bu döngü etkinliği fagositoz sırasında belirgin şekilde artar. 2 O 2 SOD + 2 H+ H 2 O 2 + O 2 33

48 Süperoksit iyonu hücre dışına veya yutulan bakteri ile karşılaşacağı fagolizomlar içine itilir. Bakterilerin fagolizomlar içinde öldürülmesi görüldüğü kadarıyla artmış ph süperoksit iyonu veya daha ileri oksijen türevlerinin (H 2 O 2, OH., HOCI - ) karma etkisine fagositik hücrelerde bulunan bazı bakterisidal peptidlere (defensinler) ve diğer proteinlerin etkisine bağlıdır. Fagositik hücrenin sitozolüne giren herhangi bir süperoksit yukarda gösterilmiş olan kendiliğinden dismutasyonun aynı olan bir tepkimeyi kataliz eden SOD etkisiyle H 2 O 2 ye çevrilir. H 2 O 2 daha sonra miyeloperoksidaz (MPx) tarafından kullanılır veya GPx veya CAT ile yok edilir. 153 Glutatyon Redüktaz (GR-EC ): Glutatyon redüktaz daltonluk subunitlere sahip bir dimerdir. Görevi yükseltgenmiş glutatyonu (GSSG) indirgenmiş (GSH) hale çevirmektir. Bu indirgenme işlemi sırasında NADPH dan gelen elektronlar okside glutatyonun disülfid bağına direkt olarak transfer edilemezler. Sıklıkla önce NADPH dan sıkıca bağlı bulunan FAD ye transfer edilirler. Daha sonraki subinitteki 2 sistein arasında bulunan disülfid köprüsüne transfer edilmek suretiyle okside glutatyona aktarılmış olurlar. Her bir subunit 3 tane yapısal alan içerir, bunlar: FAD bağlayıcı olan, NADPH bağlayıcı olan ve ara yüz alanıdır. FAD alanı ve NADP+ alanı birbirine benzer ve diğer dehidrojenazlardaki nükleotid bağlayıcı alanlara benzerler. FAD ve NADP+ nin izoalloksozin ve nikotinamid halkaları birbirine geçecek şekilde geniş ölçüde aralarında bağlanırlar. Oksidize glutatyon için bağlayıcı alanın bir subutinin FAD alanı ile diğer subunitin ara yüz alanından meydana geldiği belirtmek gerekir. 159 GR GSSG + NADPH + H + 2GSH + NADP + 34

49 Alyuvarlardaki pentoz fosfat yolu ise, GR nin GSSG yi GSH ye çevrimi için gereken NADPH ı sağlar. 153 Glutatyon S-Transferaz (GST-EC ): GST ler, sisteinin sülfür atomu üzerinden çeşitli elektrofillere glutatyonu aktaran proteinlerdir. GST, bunun yanı sıra hem, bilirubin, polisiklik aromatik hidrokarbonlar ve deksametazon gibi hidrofobik bileşiklere de yüksek bir afiniteyle bağlanabilmektedir. E.coli den insana kadar çok çeşitli türlerden GST saflaştırılabilmesine rağmen en çok sıçan karaciğerinden saflaştırılmıştır. GST ler en az 7 alt üniteden oluşan homodimer veya heterodimerlerdirler. Spesifik GST alt ünitelerinin fenobarbitol, 3-metilşolantren, trans-stilben oksit gibi çeşitli ksenobiyotikler tarafından indüklenmesinden ve dokuya spesifik bir tarzda ekspresse olmasından beri, GST gen ailesi gen ekspresyonunun dokuya özel düzenlenmesi ve indüksiyonunun araştırılmasında yararlı bir model sistemi olmuştur. 160 GST ler başta araşidonik ve lineolat hidroperoksitleri olmak üzere lipit peroksitlerine karşı Se-bağımsız GSH peroksidaz aktivitesi göstererek bir koruyucu mekanizma oluştururlar. 158 GST ler antioksidan aktivitelerine ilave olarak çok önemli biyokimyasal fonksiyonlara da sahiptirler. Katalitik ve katalitik olmayan çok sayıda fonksiyona sahip GST lerin tüm canlı hücrelerde bulunması hayati önemlerinin bir göstergesidir. Hem detoksifikasyon yaparlar, hem de hücre içi bağlayıcı ve taşıyıcı rolleri vardır. Katalitik olarak, yabancı maddeleri glutatyondaki sisteine ait -SH grubu ile bağlayarak onların elektrofilik bölgelerini nötralize eder ve ürünün daha fazla suda çözünür hale gelmesini sağlarlar. Oluşan bu GSH konjugatları böylece organizmadan atılabilir ve daha ileri bir ürüne metabolize olabilirler. GSH den glutamat ve glisinin koparılmasından sonra sisteinin serbest amino grubu asetillenerek merkaptürik asitlere dönüştürülür. 35

50 Ksenobiyotiklerin klasik atılım ürünü olan bu merkaptürik asitler safra ile atılır. Bu yol GST' lerin kanserojen, mutajen ve diğer zararlı kimyasalların hücre içi detoksifikasyonunda rolleri olduğunu gösterir. Metabolize edilmeyen lipofilikhidrofobik pek çok bileşiği bağlama özellikleri bu enzimlerin hücre içinde sınırlı çözünürlüğe sahip moleküller için depo ve taşıma rolü üstlendiğini gösterir. Lökotrien C 4 ün sentezi GST tarafından katalizlenmekte olup, GST ler prostaglandin sentezinde PG izomeraz etkisine sahiptirler. 158 B) Sekonder Antioksidanlar (Enzim Olmayanlar) Lipit fazda bulunanlar antioksidanlar α (-) tokoferol (E - vitamini) ve α - karoten dir. Sıvı fazda (hücre sitozolü veya kan plazmasında) bulunanlar ise askorbik asit, miyoglobulin, melatonin, hemoglobin, üre, ferritin, sistein, metionin, seruloplazmin, albümin, laktoferrin, bilirubin ve glutatyondur. Glutatyon (GSH): GSH, birçok hücrede bulunur ve bir tripeptiddir: γ-l-glutamil-l-sisteinilglisin (Şekil 2.7) GSH L-glutamat, L-sistein ve glisinden iki basamakta sentezlenir. Oluşan her peptid bağı için bir molekül ATP harcanır. 161 Şekil 2.7. GSH nin molekül yapısı L-Glutamat + L-Sistein + ATP -Glutamilsistein sentetaz -Glutamil sistein + ADP +P i -Glutamil sistein + Glisin +ATP Glutatyon sentetaz GSH + ADP + P i 36

51 GSH, hemoglobin ve diğer eritrosit proteinlerinde bulunan sistein rezidülerini indirgenmiş halde tutarak sülfhidril tamponu görevini görür. Kırmızı kan hücrelerinde GSH/GSSG oranı yaklaşık 500 dür. İndirgenmiş glutatyon yani GSH, aktif bölgesinde selenyum iz elementini içeren bir enzim olan GPx enzimi katalizörlüğünde H 2 O 2 ve organik peroksitlerle reaksiyona girerek antioksidant etki sergiler ve H 2 O 2 yi alyuvarlardan uzaklaştırır. H 2 O 2 birikmesi hemoglobinin methemoglobine oksidasyon hızını artırarak alyuvarların yaşama süresini azaltabildiğinden bu tepkime çok önemlidir. Ayrıca alyuvarlarda hemoglobinin methemoglobine otooksidasyonu ile süperoksit oluşurken diğer dokularda ise bu sitokrom P 450 redüktaz ve ksantin oksidaz 153, 161, 162 gibi enzimlerle oluşur. GSH, hidrojen peroksidi veya organik oksitleri kimyasal olarak detoksifiye (zehirsizleştirme) edebilir. GSH yi peptid bağından dolayı düşük enerjili bileşikler arasında kabul edebiliriz. 163 GSH, hücre proteinlerini indirgemiş şekilde tutan disülfitsülfidril değişimi tepkimelerinde etki gösterir. Belirli oksidaz tepkimeleriyle oluşan hidrojen peroksidi uzaklaştıran enzim GPx e substratlık yaparak proteinlerin sülfidril gruplarını da korur. GSH yokluğunda hidrojen peroksit birikir. GSSG, GR tarafından sürekli GSH ye indirgenerek GSH miktarı düzenlenir. 163 Moleküler oksijenden türeyen oksidatif radikaller iki mekanizmayla uzaklaştırılır. Birincisi, toksik radikallerin enzimatik inaktivasyonudur. Örneğin GPx ve CAT, reaktif oksijen ara ürünlerini suya indirger. İkinci mekanizma ise oksijen radikallerini kimyasal olarak inaktive eden vitamin -C, -E ve B-karoten gibi diyetle alınan antioksidanlarla ilgilidir

52 Birçok enzimin şayet sistein tiyol grubu (-SH) oksitlenecek olursa inaktive ya da inhibe olur. GSH, Gama-glutamilsisteinilglisin, duyarlı ve esansiyel SH gruplarını içeren enzimlerin doğal aktivatörüdür. Glutatyon hücrede bir ko-enzimden ziyade var olan amino asit öncüllerinden kolayca sentezlenen doğal bir antioksidandır. Fenilalanin ve tirozinin oksidatif yıkımında görev alan maleilasetoasetat izomeraz da dahil olmak üzere glutatyon çok az sayıda enzim için spesifik bir koenzimdir. Glutatyonun hücre içi derişimi kontrol edilerek birçok enzimin aktivitesi düzenlenebilir. 163 C) Diğer Sekonder Antioksidanlar İnsan vücudunda oldukça az miktarlarda bulunmasına karşın vitaminlerin vücuttaki etkinlikleri oldukça fazladır. Bunların bir bölümü, besinlerle aldığımız karbonhidrat, yağ ve proteinden enerji ve hücrelerin oluşması ile ilgili biyokimyasal olayların düzenlenmesine yardımcı olurlar. A, E ve C vücut hücrelerinin hasarını önleyerek normal işlevlerini sürdürmeleri ve bazı zararlı maddelerin etkilerinin azaltılmasında (Antioksidan etki) yardımcı olurlar. Antioksidanlar, hücremizi, serbest radikalleri nötürleştirerek korurlar. Bunlar uyum içerisinde çalışan bir takım gibi radikalik saldırılara karşı koyarlar. ß-Karotenin, askorbik asitin ve tokoferolün antioksidan etkileri yıllardan beri bilinmektedir. ß-Karoten organizmada A vitaminin öncülü olmasının yanı sıra bir antioksidan olarak görev yapar. Bununla beraber, 15 torr da 150 torr dan daha iyi antioksidan olduğu, 760 torr da ise prooksidan olarak davrandığı bildirilmiştir. Hücrelerin dışında ß-Karoten nöbet tutarken; hücre duvarından, içeri girmek isteyen saldırganlara karşı savunmayı ise eser elementlerden selenyumun da yardımıyla E vitaminini üstlenmiştir. Suda çözünen vitaminlerden birisi olan askorbik asit yapı itibariyle en basit vitaminlerden biridir. Bir şeker asidinin laktonundan ibarettir. Yüksek yapılı hayvanların pek çoğu ve bitkiler kolayca askorbik asidi glukozdan sentezleyebilmektedirler. Hücre içerisindeki C vitamini serbest 38

53 radikallere son darbeyi vurmakta ve bu şekilde radikallerin tesirleri ortadan kaldırılmaya çalışmaktadır. E vitamini yağda çözünen bir vitamin olup temel görevi lipitleri oksidatif hasardan korumaktır. İnce barsaklardan kolayca emilir ve vücudun tüm dokularına taşınarak hücre membranları etrafında depolanır. Böylece hücre membranında koruyucu bir tabaka oluşturmuş olur Ekzojen Antioksidanlar 1. Ksantin oksidaz inhibitörleri: Tungsten, allopürinol, oksipürnol, folik asit ve pterin aldehit 2. Soya fasulyesi inhibitörleri: Ksantin dehidrojenazın proteolitik etki sonucu ksantin oksidaza dönüşümünü inhibe ederler. 3. NADPH oksidaz inhibitörleri: Adenozin lokal anestezikler, kalsiyum kanal blokerleri, non-steroid antienflamatuar ilaçlar, cetiedil ve difenilin iyodoniyum 4. Recombinant süperoksit dismutaz 5. Troloks-c: E vitamini analoğu 6. Endojen antioksidan aktiviteyi artıran maddeler: Glutatyon peroksidaz aktivitesini artırırlar. Bunlar; Ebselen ve asetil sisteindir. 7. Diğer nonenzimatik serbest radikal toplayıcıları: Mannitol ve albümin 8. Demir redoks döngüsünün inhibitörleri: Desferroksamin ve seruloplazmin 9. Nötrofil adezyon inhibitörleri 10. Sitokinler - Tümör Nekroz Faktör (TNF) - Interlökin Barbitüratlar 12. Demir şelatörler

54 Gıda Antioksidanları - Butillenmiş hidroksitoluen (BHT) - Etoksiguin - Butillenmiş hidroksianisol (BHA) - Propilgalat - Sodyum benzoat -Fe- superoksid dismutaz Antioksidan Etki Tipleri 139, 165, 166 Antioksidanlar dört ayrı şekilde etki ederler. 1. Toplayıcı etki (scavenging etki): Serbest oksijen radikallerini etkileyerek onları tutma veya reaktif olamayan yeni bir moleküle çevirme işlemine toplayıcı etki denir. 2. Bastırıcı etki (quencher etki): Serbest oksijen radikalleri ile etkileşip onlara bir hidrojen atarak aktivitelerini azaltan veya inaktif şekle dönüştüren etkiye bastırıcı etki denir. 3. Onarıcı etki (repair etki: Genellikle DNA daki hasarların tamir edilmesinde bu etki devamlı geçerlidir. 4. Zincir kırıcı etki (chain breaking etki ): Serbest oksijen radikallerini kendilerine bağlayarak zincirlerini kırıp fonksiyonlarını engelleyici etkiye zincir kırıcı etki denir. Serbest radikaller ve bunları etkisizleştirmek için kullanılan veya üretilen antioksidantlar hakkında mevcut bilgiler arttıkça bunlara olan ilgi de bilim adamları tarafından her geçen gün artmaktadır. Bu bağlamda hemen her sahada yapılan çalışmaların antioksidant özellikler ile birlikte değerlendirme çalışmaları da ön plana çıkmaktadır. 40

55 3. MATERYAL VE METOT 3.1. Deneylerde Kullanılan Kimyasallar Deneylerde kullanılan bütün kimyasal malzemeler Sigma Chemicals Company (Germany) den temin edilmiştir Deneylerde Kullanılan Cihazlar Soğutmalı santrifüj : Hettich Universal 32 R UV-Visible Spektrofotometre : Thermo Spectronic-HEλIOS β ph metre : Schott CG 842 Hassas terazi : Scaltec SPB Derin dondurucu : Sanyo MDF 235 Magnetik karıştırıcılar : Boeco MSH 300 Otomatik pipetler : Eppendorf Buzdolabı : Profilo Saf su cihazı : GFL 2012 Çalkalayıcılı su banyosu : Memmert Homojenizatör : Ika-Werke Döner Buharlaştırıcı (Evaporatör) : BSI Kompresör : Milipore UV Lambası 254nm - 366nm : Model Mineralight Deneylerde Kullanılan Çözeltiler ve Hazırlanışları 1. CAT Homojenat Tamponu (50 mm ph 7.8, %1 Triton x-100 içeren Fosfat Tamponu) 1.7 g KH 2 PO 4 ve 2,5 ml Triton x-100 alınarak 200 ml saf suda çözüldü. ph 7.8 e ayarlanarak son hacim saf su ile 250 ml ye tamamlandı. 2. CAT Ölçüm Karışımı (40 mm ph 7 de H 2 O 2 içeren 50 mm Fosfat Tamponu) 1020 μl H 2 O 2 ve 1.7 g KH 2 PO ml saf suda çözüldü ve ph 7 e ayarlandıktan sonra son hacim 250 ml ye tamamlandı. 3. SOD Homojenat Tamponu (50 mm ph 7.8, 10 mm EDTA içeren Fosfat Tamponu) 41

56 1.7 g KH 2 PO 4 ve 0.73 g EDTA alınarak 200 ml saf suda çözüldü ve ph 7.8 e ayarlandıktan sonra son hacim distile su ile 250 ml ye tamamlandı. 4. SOD Ölçüm Karışımı: A mm Ksantine: g Ksantine alınarak hacmi distile su ile 40 ml ye tamamlandı. B mm EDTA: g EDTA alındı ve hacmi distile su 20 ml ye tamamlandı.(2 damla 5 M NaOH ile çözünür) C 150 μm NBT (Nitro blue tetrazolium): g NBT alınarak 20 ml distile suda çözüldü. D 0.4 M Na 2 CO 3 : g alınarak 12 ml distile suda çözüldü. E 1.2 g / L BSA (Bovine Serum Albumine) : g tartıldı ve 6 ml distile suda çözüldü. 5. SOD enziminin aktivitesini ölçmek için gereken çözelti (167 U/L Xanthine oksidaz): Orijinal ambalajından (1 ml sinde 32 mg protein ve 0,3 U enzim ihtiva eden enzim) μl alındı ve üzerine 2 ml soğuk 2 M (NH 4 ) 2 SO 4 çözeltisi eklendi. 6. SOD enziminin aktivitesini ölçmek için gereken çözelti ( 2 M (NH 4 ) 2 SO 4 ) 0,7928 g (NH 4 ) 2 SO 4 alındı ve 3 ml distile suda çözüldü. (bu çözelti her seferinde taze olarak hazırlandı ve soğuk olarak kullanıldı). 7. SOD enziminin aktivitesini ölçmek için gereken çözelti (0.8 mm CuCl 2 ) g CuCl 2 alındı ve 100 ml distile suda çözüldü. 8. LPO Homojenatı Tamponu (% 10 KCI) 9. LPO Ölçüm karışımı 10 g KCI alınarak 100 ml saf suda çözüldü. 42

57 A - % 8 Sodyum lauril sülfat (SLS) : 0,8 gr SLS alınıp distile su ile 10 ml de çözüldü. B - % 0,08 Tiyobabütirik (TBA) : 0,48 gr TBA alınarak 1-2 damla 1 M NaOH ilavesi ile hacmi 60 ml ye tamamlandı. C % 20 Asetik asit: 13 ml glasiyel asetik asit alındı üzerine 65 ml distile su eklendi. 10. MPx Homojenat Tamponu (50 mm ph 6.0, % 0.5 HTAB (MA, hexadecy three methyl ammonium bromide) içeren Fosfat Tamponu: 1.02 g KH 2 PO 4 ve 0.75 g HTAB alınarak 125 ml saf suda çözüldü, ph ı ph metre ile 6.0 a ayarlandı ve hacmi saf su ile 150 ml ye tamamlandı. 11. MPx Ölçüm karışımı 50 mm KH 2 PO 4 ph 6 sı (MA, ) olan mg/ml o- dianizidin-hcl ve % H 2 O 2 içeren 45 ml ölçüm karışımı): A mg/ ml o-dianizidin-hcl 45 ml: (MA, 317.2), 7.5 mg o-dianizidin- HCl B - % H 2 O 2 (%30 luk tan) 45 ml için: 83.3 μl % 30 luk H 2 O 2 den alınarak 500 ml ye tamamlanmış çözeltiden 4,5 ml alındı. C 50 mm KH 2 PO 4 ph 6,0: g KH 2 PO4 alındı. Bu üç tartım alındı, 40 ml saf suda çözüldü, ph ı 6,0 a ayarlandı ve hacmi saf su ile 45 ml ye tamamlandı Deney Bitkileri Bu araştırmada çalışma materyali olarak bölgemizde yeterli düzeyde elde edebileceğimiz bir liken türü olan Usnea longissima Ach. tercih edildi. Liken örnekleri, Gümüşhane ili, Torul ilçesi, Serenay yaylasından enlem, boylamda 14 Temmuz 2003 tarihinde Dr. Ali ASLAN tarafından toplandı ve uluslararası 43

58 teşhis yöntemleri kullanılarak tür teşhisi yapıldı. 167 Türün herbaryum örneği Atatürk Üniversitesi, Kazım Karabekir Eğitim Fakültesi Herbaryumu nda depolanmıştır Usnea longissima dan Usnik Asidin İzolasyonu Liken örnekleri toplandıktan sonra yabancı maddelerden temizlendi ve oda sıcaklığında, gölgede kurutuldu. Kuru örnekler bir havanda sıvı azot ile öğütülerek toz haline getirildi. 250 g öğütülmüş liken örneği çalkalayıcılı bir su banyosunda iki gün süreyle geri soğutucu altında dietileter ile ekstrakte edildi ( 37 o C, 200 ml x 5). Dietileter evaparatörde uzaklaştırıldı ve gr ham ekstre (% verim: 7.5) elde edildi. Ham ekstre ince tabaka kromatografisinde değişik çözücü sistemleri ile kontrol edildi ve ekstrenin major iki bileşik ihtiva ettiği belirlendi. Bu iki major bileşiği saflaştırmak için silika jel kolon kromatografisi yapıldı Kolon kromatografisi Kolon kromatografisi için silika jel G-60 ( mesh, mm) kullanıldı. Kullanılan silika jel miktarı : 210 gr Kullanılan kolon ebatları : 3 x 80 cm Kullanılan elüent : CHCI 3 :n-hekzan (80:20 ve 90:10) Elüent hacmi : 30 ml Silika jel kolona gr ekstre kuru tatbik ile yüklendi. Alınan her fraksiyon preparatif ince tabaka kromatografisi yöntemi ile (Merck silika jel G-60 F 254, 2 mm) kontrol edildi. İnce tabaka kromatografisinde (İTK) CHCI 3 :n-hekzan (90:10, 75:25, 70:30) ve CHCI 3 :MeOH (90:10) yürütücü faz olarak kullanıldı. İTK daki lekeler UV-254 nm de görüntülendi. Bu işlemlerin sonucunda gr usnik asit ve 3.75 gr difraktaik asit saflaştırıldı. Usnik asitin Rf değeri CHCl3:metanol çözücü sisteminde 0.72 olarak tespit edildi. Saflaştırılan usnik asitin erime noktası olarak belirlendi. Molekül yapısı UV, IR, MS, 1H-NMR, 13C-NMR, APT-NMR ve DEPT-NMR spektroskopik 44

59 yöntemleri ile aydınlatıldı. Aynı zamanda usnik asit gaz kromatografisinde de yürütülerek saflığından iyice emin olundu. Böylece, bileşiğin molekül yapısı daha 77, 168 önceki literatür bilgileri ile de doğrulandı Deney Hayvanları Tez çalışmamız için g ağırlıktaki toplam 54 adet Wistar erkek rat kullanılmıştır. Deney hayvanları (Şekil 3.8), Atatürk Üniversitesi, Tıp Fakültesi, Farmakoloji Anabilim Dalı ve Atatürk Üniversitesi- Tıbbi Deneysel Uygulama ve Araştırma Merkezi Laboratuarlarından temin edilmiştir. Hayvanlar deneye alınmadan önce gruplara ayrılmış ve standart şartlar altında muhafaza edilmiştir. Şekil 3.8. Araştırmada kullanılan Wistar ratları gösteren fotoğraf 3.7. Ratlarda İndometazin-Ülserinin Oluşturulması ve UA nın Verilmesi İndometazin ile uyarılan gastrik hasarlı (ülserli) doku üzerine Usnea longissima dan saflaştırılan usnik asit in antiülserojen etkilerini araştırmak üzere yapılan bu çalışma, Guidobono ve arkadaşları nın 127 yöntemi esas alınarak gerçekleştirildi. 6 adet rattan oluşturulan deney grupları bir gün süreyle aç bırakıldıktan sonra; her bir grupta bulunan ratlara sırasıyla 25, 50, 100 ve 200 mg/kg dozlarda zeytinyağında süspanse edilerek uygulandı. Diğer yandan bir gruba zeytinyağı (6 ml/kg) ve pozitif kontrol grubuna da saf su içerisinde çözülen ranitidin (50 mg/kg) ve 45

60 lansoprazol (30 mg/kg) verildi. Bir gruba ise sadece musluk suyu (sağlıklı grup) verilmek suretiyle deneyler gerçekleştirildi. UA, RAN, LAN, zeytinyağı ve musluk suyu yukarıda belirtilen doz ve miktarlarda oral olarak verildikten 5 dakika sonra da indometazin (25 mg/kg) yine aynı şekilde oral yola verildi. Uygulamalardan 6 saat sonra yüksek dozda anestezik madde (thiopental sodium, 50 mg/kg) kullanılarak hayvanlar sakrifie edildi ve ratların mideleri çıkarıldı. Mideler büyük kuvartur boyunca açılarak serum fizyolojik ile yıkandı ve makroskopik olarak mide incelendikten sonra mide dokuları biyokimyasal incelemeler için -20 o C de saklandı. UA nın antiülserojen etkileri, makroskopik ve biyokimyasal analizlere dayandırılmak suretiyle belirlendi. UA, İND, LAN, RAN ve zeytinyağı gruplarından elde edilen sonuçlar kontrol grubu ile mukayese edildi Mide Dokusunun Makroskopik İncelenmesi Gastrik lezyonların belirlenmesi için makroskopik değerlendirmeye alınan rat mideleri, büyük kuvartur boyunca açılarak serum fizyolojik ile yıkandıktan sonra ülser sayısı ve alanları belirlendi. Alan genişlikleri ise milimetrik kâğıt kullanılarak bir büyüteç yardımıyla tespit edildi Mide Dokusunun Biyokimyasal İncelenmesi Rat mideleri makroskopik olarak incelendikten sonra mide dokuları biyokimyasal incelemeler için -20 o C de saklandı. Dokuların enzim aktivitelerini ölçmek için üç gün içerisinde mide dokusu homojenatları hazırlandı. Mide dokusu homojenatlarından elde edilen süpernatantlarda CAT, MPx, SOD enzim aktiviteleri ve LPO miktarları literatürlere dayalı, uygun metotlar kullanılmak suretiyle tespit edildi. Tüm ölçümler oda sıcaklığında gerçekleştirildi. 46

61 Doku Homojenatlarının Hazırlanması Mide dokuları bir havan içinde sıvı azot ile öğütülerek toz haline getirildikten sonra mide dokularından 0.5 g tartılarak üzerine 4.5 ml tampon çözeltiler (her parametre için farklı bir tampon sistemi kullanılarak) ilave edildi ve sonra da bir ultra-turraks homojenizatörde 10 dakika süreyle buz üzerinde homojenize edildi. Homojenatlar bir süzgeç kağıdından süzüldükten sonra soğutmalı santrifüj kullanılarak her enzim için literatürlerde belirtilen hızlarda 4 o C de santrifüj edildi ve üstte kalan berrak kısım da 169, 170 (süpernatant) enzim aktiviteleri tayin edildi. CAT Aktivitesinin Ölçümü Ölçüm Prensibi: Aktivite ölçüm ortamındaki H 2 O 2 'nin CAT vasıtasıyla H 2 O'ya dönüşümü sağlanırken meydana gelen absorbans azalmasının 240 nm'de ölçülmesi esasına dayanmaktadır. Harcanan H 2 O 2 miktarından CAT aktivitesi aşağıda bahsedilen yönteme göre hesaplanmıştır. CAT Ölçümü: CAT aktivitesi, Aebi (1984) 'nin belirttiği metoda göre ölçüldü g doku üzerine 4.5 ml 50 mm K-fosfat tamponu (ph 7.8) ilave edilerek homojenize edildi 169. Homojenatlar, g de 60 dakika santrifüj edildi ve süpernatantlar CAT aktivitesi ölçümünde enzim kaynağı olarak kullanıldı. Kuvartz spektrofotometre küveti içerisine son konsantrasyonu 20 mm olacak şekilde H 2 O 2 çözeltisinden 2 ml konularak numune çözeltisinden 1 ml ilave edilir edilmez kronometre çalıştırıldı. Alt üst etme sonrası spektrofotometrede 240 nm dalga boyundaki absorbans azalması, 15 saniye aralıklarla 3 dakika süreyle, köre karşı kaydedildi. CAT Aktivitesi nin Hesaplanması: Ölçümlerde lineer olarak absorbans azalması olan aralıktan dakika başına absorbans azalması hesaplandı. Işık yolu (b)= 10mm, ekstinksiyon katsayısı (ɛ H2O2 ), (mmol -1 x mm -1 ) alınarak A = ɛ.b.c 47

62 formülünden 240 nm'de, dakikada 1 mmol H 2 O 2 'nin harcanmasını sağlayan enzim miktarı (=EÜ) hesaplandı. 171 Formül pratik olarak mmol/min= A/39,4 x 30 şekline getirildi ve bütün aktiviteler bu formülde yerine konulan absorbans değerlerinden hesaplandı. CAT aktivitesi, seyrelme faktörleri dikkate alınarak mmol.dakika -1.mg doku - 1 olarak tarif edildi. Deneyler 3 paralel tekerrür halinde yapıldı. Miyeloperoksidaz (MPx) Aktivitesinin Ölçümü: Ölçüm prensibi: MPx enzimleri nötrofillerin solunum patlaması esnasında H 2 O 2 vasıtası ile hipoklorik asit üretirler ve kofaktör olarak Hem e ihtiyaç duyarlar. Aktivite ölçüm ortamındaki H 2 O 2, MPx vasıtasıyla harcanırken oluşan hipoklorit absorbansta bir artışa sebep olur. Ölçüm prensibi, meydana gelen absorbans artışının 460 nm de ölçülmesi esasına dayanır. Oluşan hipoklorit miktarından MPx aktivitesi hesaplanabilir. MPx ölçümü: MPx aktivitesi Bradley in belirttiği yöntem esas alınarak ölçüldü ,1 g doku alınarak üzerine 10 ml 50 mm fosfat tamponu (ph 6.0) ilave edilerek homojenize edildi. Oluşan homojenat 3500 g 4 o C de 30 dakika santrifüj edilerek süpernatantlar MPx aktivitesi ölçümünde enzim kaynağı olarak kullanıldı. Kuvartz spektrofotometre küveti içerisine 2,8 ml ölçüm tamponu, 0,12 ml homojenat tamponu ve 0,12 ml numune çözeltisinden ilave edildiği anda kronometre çalıştırıldı. Kuvartz küvet spektrofotometrede 460 nm dalga boyunda 30 saniye aralıklarla ve 5 dakika süreyle ölçülerek absorbans azalması köre karşı kaydedildi. MPx aktivitesi nin hesaplanması: Ölçümlerde lineer olarak absorbans azalması olan aralıktan dakika başına absorbans azalması hesaplandı. Işık yolu (b)= 10mm, ekstinksiyon katsayısı (ɛ H2O2 ), 0,00394 (µmol -1 x mm -1 ) alınarak A = ɛ.b.c formülünden 460 nm de, dakikada 1 mmol H 2 O 2 nin harcanmasını sağlayan enzim miktarı (EÜ) hesaplandı. Formül pratik olarak mmol/min= A/39,4 x 30 şekline getirildi 48

63 ve bütün aktiviteler bu formülde yerine konulan absorbans değerlerinden hesaplandı. MPx aktivitesi, seyrelme faktörleri dikkate alınarak µmol/dakika/mg doku olarak tarif edildi. Deneyler 3 tekrar yapılarak verildi. Süperoksit Dismutaz Aktivitesinin Ölçümü Ölçüm Prensibi: Ksantin, ksantin oksidaz enzimi vasıtasıyla ürik aside dönüştürülürken meydana gelen süperoksit radikalleri, şayet ortamda NBT (nitro blue tetrazolium) mevcutsa, NBT ile reaksiyona girerek formazon boyası oluştururlar. Bu bileşik 560 nm dalga boyunda maksimum absorbans verir. Şayet ortamda SOD enzimi varsa süperoksit radikalleri bu enzim tarafından H 2 O 2 ye dönüştürüldüğü için formazon oluşumu azalacak buna bağlı olarak da 560 nm de ölçülen absorbans azalacaktır. Absorbanstaki azalmanın miktarı bize SOD aktivitesini verecektir. Özetle; SOD aktivitesi aşağıda verilen II nolu reaksiyonun inhibe edilme derecesiyle ölçülebilmektedir. I KSANTİN ÜRİK SOD DD.- ASİT + SÜPEROKSİT (O 2 ) II NBT O 2 - FORMAZON III 2O H + SOD O 2 + H 2 O 2 DD SOD Ölçümü: SOD aktivitesi Sun ve arkadaşları (1988) tarafından tarif edilen yönteme göre ölçüldü. 173 Mide dokuları homojenize edildikten sonra g de 1 saat santrifüj edildi 169. Cam bir spektrofotometre küvetine 2450 μl ölçüm karışımı (0.3 mm Xanthine, 0.6 mm EDTA, 150 μm NBT, 0.4 M Na 2 CO 3, 1.2 g / L BSA), 500 μl 49

64 supernatant, 50 μl ksantin oksidaz eklendikten sonra karıştırılarak yaklaşık 20 dakika inkubasyon bırakıldı ve 1000 μl CuCl 2 ilave edilerek reaksiyon sonlandırıldı. SOD Aktivitesi nin Hesaplanması: Oluşan formazon miktarları 560 nm de 3 ml lik quartz küvetler kullanılarak okundu ve seyreltme katsayıları dikkate alınarak aşağıdaki geliştirilen formülden aktivite değerleri (EU) elde edildi ve SOD aktivitesi, mmol.dakika -1.mg doku -1 olarak tarif edildi. Her bir faktörün etkisi 3 tekerrür yapılarak verildi. ΔA Kör -ΔA numune EU/mg.doku = ( 1- ) x 100 ΔA Kör LPO Miktarı Ölçümü Ölçüm Prensibi: Serbest radikallerin hücre zarında oluşturduğu lipit peroksidasyonunun son ürünlerinden olan malondialdehit (MDA) 155, 156 düzeyini belirlemek için kullanılan yöntemlerin çoğu MDA nın tiyobarbitürik asit (TBA) ile verdiği reaksiyonu temel alır. Bir molekül MDA iki molekül TBA ile stabil kırmızı renk oluşturmak üzere reaksiyona girer. LPO ölçümü, Ohkawa ve arkadaşlarının metoduna göre MDA nın asidik ortamda tiyobarbütirik (TBA) asitle oluşturduğu rengin 532 nm de optik dansitesinin ölçülmesi prensibine dayanarak yapıldı. 174 LPO Ölçümü: Ohkawa ve arkadaşlarının geliştirdiği yöntem esas alınarak gerçekleştirildi g doku üzerine 4.5 ml % 10 KCl ilave edilerek homojenize edildi 169. Homojenatlar, 5000 g de 20 dakika santrifüj edildi ve bu süpernatantlar, LPO miktarının belirlenmesinde kullanıldı. Kapaklı deney tüpleri içerisine 250 μl homojenat, 100 μl % 8 sodium lauryl sulphate (SLS), 750 μl % 20 asetik asit, 750 μl % 0.08 TBA ve 150 μl saf su pipetlenerek vortekslendi. Karışım 100 o C ta 60 dakika inkubasyona bırakıldıktan sonra üzerine n-bütanol ilave edildi ve ölçüm alındı. 50

65 LPO Miktarının Hesaplanması: Oluşan kırmızı renk miktarları 532 nm de 3 ml lik cam küvetler kullanılarak okundu ve seyreltme katsayıları dikkate alınarak önceden hazırlanan MDA stok çözeltisi kullanılarak oluşturulan standart grafikten yararlanarak ölçümler yapıldı (Şekil 3.9). Numunelerin LPO miktarları, nmol MDA/g doku olarak tarif edildi. Her bir faktörün etkisi 3 tekerrür yapılarak verildi. Şekil 3.9. LPO miktarlarının belirlenmesinde kullanılan standart grafik 3.8. İstatistiksel Analizler İstatistiksel analizler SPSS 20.0 software programı kullanılarak yapıldı. Bütün ölçümlerde istatistiksel farklılıklar ve önem seviyeleri one-way variance analyzes (ANOVA) testi ile belirlendi ve p<0.05 seviyesindeki sonuçlar önemli kabul edildi. Çoklu karşılaştırmalarda Scheffe s multiple comparison testi uygulandı. 51

66 4. BULGULAR Yaptığımız çalışmalardan elde ettiğimiz veriler, bu bölümde tablo ve şekiller ile gösterilmiş, kontrole göre mukayeseler % kontrol olarak ifade edilmiştir. Deneylerde pozitif kontrol olarak ranitidin ve lansoprazol, negatif kontrol olarak indometazin kullanılmıştır. Her deneye ait veriler ait tablo halinde ve değişik muamele grupları arasındaki farkın daha iyi görülmesi amacıyla da tablonun hemen altında diyagramlar halinde sunulmuştur. Bulgular kısmında tablo halinde sunulan veriler, 3 tekerrür olarak yapılan deney sonuçlarının ortalaması ± standart sapma (SD) olarak sunulmuştur. Bütün verilere SPSS 20.0 software kullanılarak one-way variance analyzes (ANOVA) testi uygulanmış ve p<0.05 seviyesindeki sonuçlar önemli kabul edilmiştir. Çoklu karşılaştırmalarda ise Scheffe s multiple comparison testi uygulanmıştır UA nın Saflaştırılması ve Spektral Verilerle Yapısının Aydınlatılması UA, Usnea longissima nın dietileter ekstresinden kromatografik yöntemlerle beyaz renkli, toz halinde izole edildi. İzole edilen UA, ince tabakada yürütüldü ve görünür ışıkta renksiz, UV 254 nm de ise mor renkli olduğu tespit edildi. Bileşiğin CHCI 3 çözeltisi UV-Visible spektrofotometrede geniş bir aralıkta ( nm) tarandı ve aromatik bileşiklerin spektrumuna uygun olarak 253 ve 315 nm de maksimum absorbanslar verdiği belirlendi. UA nın UV-Visible spektrumu Şekil 4.10 da verilmiştir. 52

67 Şekil Usnik asitin (XS-I) IR (CHCl 3 ) spektrumu IR : ν max : 2982, 2930 cm -1 (alifatik C-H titreşim bantları), 1630 cm -1 (C=O titreşim bantları), cm -1 (aromatik C=C titreşim bantları), 1190 cm -1 (C-O gerilme bandı). O 18 CH 3 17 HO O OH H 3 C OH CH 3 13 O 14 CH 3 15 O Şekil Usnik asitin 1 H-NMR (CDCl 3, 200 MHz) spektrumu 53

68 O 18 CH 3 17 HO O OH H 3 C OH CH 3 13 O 14 CH 3 15 O Şekil Usnik asitin 13 C-NMR (CDCl 3, 200 MHz) spektrumu 4.2. Makroskopik Bulgular Altışar rattan oluşturulan deney grupları bir gün süreyle aç bırakıldıktan sonra her bir grupta bulunan ratlara sırasıyla UA (25, 50, 100 ve 200 mg/kg), ranitidin (50 mg/kg), lansoprazol (30 mg/kg), zeytinyağı (6 ml/kg) ve musluk suyu oral olarak verildikten 5 dakika sonra da indometazin (25 mg/kg) yine aynı şekilde, oral olarak verildi. Uygulamalardan 6 saat sonra yüksek dozda anestezik madde (thiopental sodium, 50 mg/kg) kullanılarak hayvanlar sakrifie edildi ve sonra da mideleri çıkarıldı. Mide büyük kuvartur boyunca açılarak serum fizyolojik ile yıkandı ve mide dokusu makroskopik olarak incelendi. Makroskopik inceleme sonuçları Tablo 4.1 ve Şekil 4.13 de sunulmuştur. 54

69 A B Şekil İND (25 mg/kg) tarafından oluşturulan gastrik hasarlı dokudan (A) ve UA (200 mg/kg) ile muamele edilmiş gruptan alınan (B) rat mideleri Tablo 4.1 den görüldüğü üzere sadece musluk suyu verilen grup ülser oluşmazken İND ile muamele edilen mideler de 30.75±0.004 mm 2, RAN grubunda 8.38±0.05 mm 2, LAN grubunda 2.20±0.1 mm 2, zeytinyağı grubunda 9.13±0.01 mm 2, UA nın 25, 50, 100 ve 200 mg/kg dozları ile muamele edilen gruplarda ise sırası ile 0.63±6.01, 0.50±0.01, 0.00±0.00 ve 0.25±0.01 mm 2 ülser alanı tespit edilmiştir. Bu sonuçlara göre zeytinyağı, UA, LAN ve RAN ın İND ile oluşturulan ülseri bütün dozlarda önemli oranda (P<0.05) azaltmıştır (Tablo 4.1). Tablo 4.1 den de çok net bir şekilde görülebileceği üzere İND grubunda meydana gelen ülser, uygulanan zeytinyağı, RAN, LAN ve UA nın her dört dozu vasıtasıyla önemli oranda (p<0.05) azaltılmıştır. İND nin meydana getirdiği ülser dikkate alındığında ranitidinin % 72.7, lansoprazolun % 92.9, zeytinyağının % 70.3, UA nın 25, 50, 100 ve 200 mg/kg dozlarının ise sırasıyla % 98.0, % 98.4, % 100 ve % 99.2 oranında ülseri engellediği belirlenmiştir. 55

70 Ülser alanı a (mm2) Tablo 4.1. İND (25 mg/kg) tarafından oluşturulan gastrik hasar üzerine farklı dozlarda uygulanan UA (25, 50, 100 ve 200 mg/kg), RAN (50 mg/kg), LAN (30 mg/kg) ve zeytinyağını (6 ml/kg) etkilerini gösteren ölçüm sonuçları. Gruplar Doz (mg/kg) N Ülser alanı a (mm 2 ) % İnhibisyon IND-UA ±0.01d ±0.01c ±0.00a ±0.01b 99.2 IND-ZY ±0.01g 70.3 IND-RAN ±0.05f 72.7 IND-LAN ±0.1e 92.9 IND ±0.004h - Sağlıklı grup ±0.00a - Kontrol : Musluk suyu ile muamele edilmiş mide dokularındaki ülser alanları İND : İndometazin ile muamele edilmiş mide dokularındaki ülser alanları UA : Usnik asit ile muamele edilmiş mide dokularındaki ülser alanları ZY : Zeytinyağı ile muamele edilmiş mide dokularındaki ülser alanları RAN : Ranitidine ile muamele edilmiş mide dokularındaki ülser alanları LAN : Lansoprazol ile muamele edilmiş mide dokularındaki ülser alanları N : Deneylerde kullanılan rat sayısı s% Azalma: ((İND-Uygulama/İND)*100) formülüne göre belirlenmiştir. 32 h d IND+UA (25 mg/kg) c IND+UA (50 mg/kg) a IND+UA (100 mg/kg) b IND+UA (200mg/kg) g IND+ZY (25mg/kg) f IND+RAN (50mg/kg) e IND+LAN (30mg/kg) IND (25 mg/kg) a Sağlıklı Şekil İND (25 mg/kg), UA (25, 50, 100 ve 200 mg/kg), RAN (50 mg/kg), LAN (30 mg/kg), zeytinyağı (6 ml/kg) ve kontrol gruplarından alınan mide örneklerindeki ülser alanlarını gösteren diyagram. 56

71 4.3. Biyokimyasal Bulgular Rat mideleri makroskopik olarak incelendikten sonra mide dokuları biyokimyasal incelemeler için -20 o C de saklandı ve dokuların enzim aktiviteleri en geç üç gün içerisinde analiz edildi. Mide dokusu homojenatlarından elde edilen süpernatantlarda SOD, CAT ve MPx enzim aktiviteleri ile LPO miktarları literatürlere göre uygun metodlar kullanılarak tespit edildi Katalaz Aktivitesi Üzerine UA nın Etkileri Zeytinyağı ile süspanse edilerek uygulanan UA (25, 50, 100 ve 200 mg/kg), zeytinyağı, RAN, LAN, İND ve sağlıklı gruplarının mide dokularında belirlenen CAT aktivitelerini gösteren sonuçlar Tablo 4.2 ve Şekil 4.15 de gösterilmiştir. Tablo 4.2 den görüldüğü üzere CAT aktiviteleri sağlıklı grupta ± 0.04, indometazin grubu midelerinde ± 0.04, ranitidin grubunda ± 0.04, lansoprazol grubunda ± 0.04, zeytinyağı grubunda ± 0.04 ve İND ile birlikte uygulanan UA nın 25, 50, 100 ve 200 mg/kg dozları ile muamele edilen gruplarda ise sırası ile ± 0.1, ± 0.1, ± 0.02 ve ± 0.01 olarak tespit edilmiştir. Bu sonuçlara göre İND nin önemli oranda (P<0.05) artırdığı CAT aktivitesini, İND ile birlikte uygulanan UA, LAN, RAN ve zeytinyağının önemli oranda azalttığı (P<0.05) tespit edildi. 57

72 CAT (mmol/min/mg doku) Tablo 4.2. İND (25 mg/kg), UA (25, 50, 100 ve 200 mg/kg), RAN (50 mg/kg), LAN (30 mg/kg), zeytinyağı (6 ml/kg) ve kontrol gruplarından alınan mide dokularındaki CAT aktivitelerini gösteren sonuçlar. Sonuçlar, paralel altı ölçümün ortalaması (± p < 0.05 seviyesinde istatistiksel olarak önemli kabul edilmiştir. Gruplar N CAT (mmol/min/ % Aktivite mg doku) IND+UA (25 mg/kg) ±0.1b 96.9 IND+UA (50 mg/kg) ±0.1c 96.1 IND+UA (100 mg/kg) ±0.02f IND+UA (200 mg/kg) ±0.01g IND+ZY (25 mg/kg) ±0.04h IND+RAN (50 mg/kg) ±0.04a 54.3 IND+LAN (30 mg/kg) ±0.04e IND (25 mg/kg) ±0.04ı Sağlıklı ±0.04d UA dört; RAN, LAN ve zeytinyağı ise tek doz olarak verilmiş ve sonuçlar 6 rat taki (N) ölçümün ortalaması [± standart hata (SE)] olarak gösterilmiştir. Aynı harfe sahip olan değerler Duncan testine göre istatistiksel olarak farksızdır (α=0.05). IND grubu ile mukayese edildiğinde istatiksel açıdan farklı gruplar (p<0.05) * ile gösterilmiştir. % olarak IND ye göre hasar alanlarındaki inhibisyon miktarını ifade etmektedir. 115 ı b c f g h e d IND+UA (25 mg/kg) IND+UA (50 mg/kg) IND+UA (100 mg/kg) IND+UA (200mg/kg) IND+ZY (25mg/kg) a IND+RAN (50mg/kg) IND+LAN (30mg/kg) IND (25 mg/kg) Sağlıklı Şekil İND (25 mg/kg), UA (25, 50, 100 ve 200 mg/kg), RAN (50 mg/kg), LAN (30 mg/kg), zeytinyağı (6 ml/kg) ve kontrol gruplarından alınan mide örneklerindeki CAT aktivitelerinin karşılaştırılmasını gösteren diyagram. 58

73 Tablo 4.2 ve Şekil 4.15 den de çok net bir şekilde görülebileceği üzere kontrol grubuna göre İND ile muamele sonrası meydana gelen CAT aktivitesinde ki artışı (p<0.05) İND ile birlikte uygulanan 200 mg/kg UA tarafından net bir şekilde azaltmış ve kontrol grubundaki seviyeye getirilmiştir (p>0.05). Bu bulgular DA, RAN, LAN ve zeytinyağının CAT aktivitesi üzerine inhibisyon etkisine sahip olduğunu göstermektedir Süperoksit Dismutaz Aktivitesi Üzerine UA nın Etkileri Zeytinyağı ile süspanse edilerek uygulanan UA (25, 50, 100 ve 200 mg/kg), RAN, LAN, zeytinyağı, İND ve sağlıklı gruplarının mide dokularında belirlenen SOD aktivitelerini gösteren sonuçlar Tablo 4.3 ve Şekil 4.16 da gösterilmiştir. Tablo 4.3 den görüldüğü üzere SOD aktiviteleri sağlıklı grubunda ± 0.01, indometazin grubu midelerinde ± 0.1, ranitidin grubunda ± 0.01, lansoprazol grubunda ± 0.02, zeytinyağı grubunda ± 0.1 ve İND ile birlikte uygulanan UA nın 25, 50, 100 ve 200 mg/kg dozları ile muamele edilen gruplarda ise sırası ile ± 0.34, ± 0.02, ± 0.01 ve ± 0.2 olarak tespit edilmiştir. Tablo ve şekilden de görüleceği gibi İND nin önemli oranda (P<0.05) azalttığı SOD aktivitesini, UA, LAN, RAN ve zeytinyağının yeniden kontrol grubu seviyesine (P>0.05) artırdığı tespit edilmiştir. 59

74 SOD (mmol/min/mg doku) Tablo 4.3. İND (25 mg/kg), UA (25, 50, 100 ve 200 mg/kg), RAN (50 mg/kg), LAN (30 mg/kg), zeytinyağı (6 ml/kg) ve kontrol gruplarından alınan mide dokularındaki SOD sapma) olarak verilmiş ve p < 0.05 seviyesinde istatistiksel olarak önemli kabul edilmiştir. Gruplar N SOD (mmol/min/ mg % Aktivite doku) IND+UA (25 mg/kg) ±0.34f IND+UA (50 mg/kg) ±0.02e IND+UA (100 mg/kg) ±0.01e IND+UA (200 mg/kg) ±0.2g IND+ZY (25 mg/kg) ±0.1d IND+RAN (50 mg/kg) ±0.01c IND+LAN (30 mg/kg) ±0.02h IND (25 mg/kg) ±0.1a 69.3 Sağlıklı ±0.01b UA dört; RAN, LAN ve zeytinyağı ise tek doz olarak verilmiş ve sonuçlar 6 rat taki (N) ölçümün ortalaması [± standart hata (SE)] olarak gösterilmiştir. Aynı harfe sahip olan değerler Duncan testine göre istatistiksel olarak farksızdır (α=0.05). IND grubu ile mukayese edildiğinde istatiksel açıdan farklı gruplar (p<0.05) * ile gösterilmiştir. % olarak IND ye göre hasar alanlarındaki inhibisyon miktarını ifade etmektedir f IND+UA (25 mg/kg) e IND+UA (50 mg/kg) e IND+UA (100 mg/kg) g IND+UA (200mg/kg) d IND+ZY (25mg/kg) c IND+RAN (50mg/kg) h IND+LAN (30mg/kg) a IND (25mg/kg) b Sağlıklı Şekil İND (25 mg/kg), UA (25, 50, 100 ve 200 mg/kg), RAN (50 mg/kg), LAN (30 mg/kg), zeytinyağı (6 ml/kg) ve kontrol gruplarından alınan mide örneklerindeki SOD aktivitelerinin karşılaştırılmasını gösteren diyagram. 60

75 MPx Aktivitesi Üzerine UA nın Etkileri Zeytinyağı ile süspanse edilerek uygulanan UA (25, 50, 100 ve 200 mg/kg), RAN, LAN, zeytinyağı, İND ve sağlıklı gruplarının mide dokularında belirlenen MPx aktivitesini gösteren sonuçlar Tablo 4.4 ve Şekil 4.17 de gösterilmiştir. Tablo 4.4 den görüldüğü üzere MPx aktivitesi sağlıklı grupta 9.31 ± 0.02, indometazin grubu midelerinde ± 0.22, ranitidin grubunda 4.23 ± 0.02, lansoprazol grubunda 8.80 ± 0.03, zeytinyağı grubunda 9.16 ± 0.13 ve İND ile birlikte uygulanan UA nın 25, 50, 100 ve 200 mg/kg dozları ile muamele edilen gruplarda ise sırası ile 8.67 ± 0.03, 8.39 ± 0.01, 3.03 ± 0.04 ve 7.05 ± 0.05 olarak tespit edilmiştir. Bu sonuçlara bize İND nin önemli oranda (P<0.05) artırdığı MPx aktivitesini, İND ile birlikte uygulanan RAN, LAN ve zeytinyağının kontrol seviyesine azalttığı (P>0.05) göstermektedir. Tablo 4.4. İND (25 mg/kg), UA (25, 50, 100 ve 200 mg/kg), RAN (50 mg/kg), LAN (30 mg/kg) ve kontrol gruplarından alınan mide dokularındaki MPx aktivitelerini gösteren sonuçlar. Sonuçlar, verilmiş ve p < 0.05 seviyesinde istatistiksel olarak önemli kabul edilmiştir. Gruplar N MPx (µmol/min/ % Aktivite mg doku) IND+UA (25 mg/kg) ±0.03e 93.1 IND+UA (50 mg/kg) ±0.01d 90.1 IND+UA (100 mg/kg) ±0.04a 32.6 IND+UA (200 mg/kg) ±0.05c 75.7 IND+ZY (25 mg/kg) ±0.13f 98.4 IND+RAN (50 mg/kg) ±0.02b 45.4 IND+LAN (30 mg/kg) ±0.03e 94.5 IND (25 mg/kg) ±0.22g Sağlıklı ±0.02f UA dört; FAM, LAN ve zeytinyağı ise tek doz olarak verilmiş ve sonuçlar 6 rat taki (N) ölçümün ortalaması [± standart hata (SE)] olarak gösterilmiştir. Aynı harfe sahip olan değerler Duncan testine göre istatistiksel olarak farksızdır (α=0.05). IND grubu ile mukayese edildiğinde istatiksel açıdan farklı gruplar (p<0.05) * ile gösterilmiştir. % olarak IND ye göre hasar alanlarındaki inhibisyon miktarını ifade etmektedir. 61

76 MPx (µmol/min/ mg doku) e d a c g f e f b 0 IND+UA (25 mg/kg) IND+UA (50 mg/kg) IND+UA (100 mg/kg) IND+UA (200mg/kg) IND+ZY (25mg/kg) IND+RAN (50mg/kg) IND+LAN (30mg/kg) IND (25mg/kg) Sağlıklı Şekil İND (25 mg/kg), UA (25, 50, 100 ve 200 mg/kg), RAN (50 mg/kg), LAN (30 mg/kg), zeytinyağı (6 ml/kg) ve kontrol gruplarından alınan mide örneklerindeki MPx aktivitelerinin karşılaştırılmasını gösteren diyagram LPO Miktarı Üzerine UA nın Etkileri Zeytinyağı ile süspanse edilerek uygulanan UA (25, 50, 100 ve 200 mg/kg), RAN, LAN, zeytinyağı, İND ve sağlıklı gruplarının mide dokularında belirlenen MDA miktarlarını gösteren sonuçlar Tablo 4.4 ve Şekil 4.18 de gösterilmiştir. Tablo 4.4 den görüldüğü üzere LPO nun göstergesi olan MDA miktarları sağlıklı grupta ± 0.01, indometazin grubu midelerinde ± 0.4, ranitidin grubunda ± 0.01, lansoprazol grubunda ± 0.1, zeytinyağı grubunda ± 0.04 ve İND ile birlikte uygulanan UA nın 25, 50, 100 ve 200 mg/kg dozları ile muamele edilen gruplarda ise sırası ile ± 0.34, ± 0.02, 7.37 ± 0.01 ve 7.31 ± 0.02 olarak tespit edilmiştir. Bu sonuçlara bize İND nin önemli oranda (P<0.05) artırdığı LPO miktarını, İND ile birlikte uygulanan RAN, LAN ve zeytinyağının kontrol seviyesine azalttığı (P>0.05) göstermektedir. 62

77 LPO (nmol/g tissue) Tablo 4.5. İND (25 mg/kg), UA (25, 50, 100 ve 200 mg/kg), RAN (50 mg/kg), LAN (30 mg/kg), zeytinyağı (6 ml/kg) ve kontrol gruplarından alınan mide dokularındaki LPO aktivitelerini gösteren sonuçlar. Sonuçlar, paralel altı ölçümün ortalaması (± p < 0.05 seviyesinde istatistiksel olarak önemli kabul edilmiştir. LPO %Aktivite Gruplar N (nmol/g doku) IND+UA (25 mg/kg) ±0.34d IND+UA (50 mg/kg) ±0.02b 94.8 IND+UA (100 mg/kg) ±0.01a 59.3 IND+UA (200 mg/kg) ±0.02a 58.9 IND+ZY (25 mg/kg) ±0.04e IND+RAN (50 mg/kg) ±0.01b,c 96.6 IND+LAN (30 mg/kg) ±0.1f IND (25 mg/kg) ±0.4g Sağlıklı ±0.01c UA dört; FAM, LAN ve zeytinyağı ise tek doz olarak verilmiş ve sonuçlar 6 rat taki (N) ölçümün ortalaması [± standart hata (SE)] olarak gösterilmiştir. Aynı harfe sahip olan değerler Duncan testine göre istatistiksel olarak farksızdır (α=0.05). IND grubu ile mukayese edildiğinde istatiksel açıdan farklı gruplar (p<0.05) * ile gösterilmiştir. % olarak IND ye göre hasar alanlarındaki inhibisyon miktarını ifade etmektedir. 19 f d b e b,c g c 9 7 a a 5 IND+UA (25 mg/kg) IND+UA (50 mg/kg) IND+UA (100 mg/kg) IND+UA (200mg/kg) IND+ZY (25mg/kg) IND+RAN (50mg/kg) IND+LAN (30mg/kg) IND (25 mg/kg) Sağlıklı Şekil İND (25 mg/kg), UA (25, 50, 100 ve 200 mg/kg), RAN (50 mg/kg), LAN (30 mg/kg), zeytinyağı (6 ml/kg) ve kontrol gruplarından alınan mide örneklerindeki LPO miktarlarının karşılaştırılmasını gösteren diyagram. 63