METANOL EKSTRELERİNİN. Ecz. Başak KARAKUŞ AYAS. Danışman Yrd. Doç. Dr. Fehmi ODABAŞOĞLU. Yüksek Lisans Tezi Erzurum 2007

Transkript

1 1 TC. ATATÜRK ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ECZACILIK FAKÜLTESİ BİYOKİMYA ANABİLİM DALI DENEYSEL OLARAK ÜLSER OLUŞTURULAN RATLARDA LOBARİA PULMONARİA (L.) HOFFM. İSİMLİ LİKENDEN ELDE EDİLEN METANOL EKSTRELERİNİN ANTİOKSİDANT ENZİM AKTİVİTELERİ ÜZERİNE ETKİSİ Ecz. Başak KARAKUŞ AYAS Danışman Yrd. Doç. Dr. Fehmi ODABAŞOĞLU Yüksek Lisans Tezi Erzurum 2007

2 2 TC. ATATÜRK ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ECZACILIK FAKÜLTESİ BİYOKİMYA ANABİLİM DALI DENEYSEL OLARAK ÜLSER OLUŞTURULAN RATLARDA LOBARİA PULMONARİA (L.) HOFFM. İSİMLİ LİKENDEN ELDE EDİLEN METANOL EKSTRELERİNİN ANTİOKSİDANT ENZİM AKTİVİTELERİ ÜZERİNE ETKİSİ Ecz.Başak KARAKUŞ AYAS Tezin Enstitüye Verildiği Tarih : Tezin Sözlü Savunma Tarihi : Tez Danışmanı : Yrd. Doç. Dr. Fehmi ODABAŞOĞLU Jüri üyesi : Prof. Dr. İrfan KÜFREVİOĞLU Jüri üyesi : Prof. Dr. Leyla YILDIZ Jüri üyesi : Doç. Dr. Halis SÜLEYMAN Jüri üyesi : Yrd.Doç.Dr. Ali ASLAN Enstitü Müdürü : Prof. Dr. Adnan TEZEL Tez Yöneticisi Yrd. Doç. Dr. Fehmi ODABAŞOĞLU Yüksek Lisans Tezi Erzurum 2007

3 3 Sayfa No : İÇİNDEKİLER... TEŞEKKÜR... ŞEKİLLER LİSTESİ... TABLOLAR LİSTESİ... KISALTMALAR... ÖZET... SUMMARY... I IV V VII VIII X XI GİRİŞ VE AMAÇ GENEL BİLGİLER LİKENLER LOBARİA PULMONARİA (L.) HOFFM ÜLSER İNDOMETAZİN İLE OLUŞTURULAN ÜLSERLER LİKENLER VE ÜLSER ANTİOKSİDANLAR SERBEST RADİKALLER SERBEST RADİKAL ÇEŞİTLERİ SERBEST RADİKALLERİN KAYNAKLARI SERBEST RADİKALLERİN ETKİLERİ ANTİOKSİDAN SAVUNMA SİSTEMLERİ ENDOJEN ANTİOKSİDANLAR PRİMER ANTİOKSİDANLAR SEKONDER ANTİOKSİDANLAR... 39

4 EKSOJEN ANTİOKSİDANLAR GIDA ANTİOKSİDANLARI ANTİOKSİDAN ETKİ TİPLERİ MATERYAL METOD DENEYLERDE KULLANILAN KİMYASALLAR DENEYLERDE KULLANILAN CİHAZLAR DENEYLERDE KULLANILAN ÇÖZELTİLERİN HAZIRLANIŞI DENEY BİTKİLERİ DENEY HAYVANLARI BİTKİ EKSTRAKTININ HAZIRLANMASI RATLARDA İNDOMETAZİN-ÜLSERİNİN OLUŞTURULMASI VE 50 EKTRELERİN VERİLMESİ MİDE DOKUSUNUN MAKROSKOBİK İNCELENMESİ MİDE DOKUSUNUN BİYOKİMYASAL İNCELENMESİ DOKU HOMOJENATLARININ HAZIRLANMASI KATALAZ AKTİVİTESİNİN ÖLÇÜMÜ SÜPEROKSİT DİSMUTAZ AKTİVİTESİNİN ÖLÇÜMÜ GLUTATYON PEROKSİDAZ AKTİVİTESİNİN ÖLÇÜMÜ MİYELOPEROKSİDAZ AKTİVİTESİNİN ÖLÇÜMÜ TOTAL GSH MİKTARI ÖLÇÜMÜ LPO MİKTARI ÖLÇÜMÜ LOBARİA PULMONARİA (L.) HOFFM IN METANOL EKSTRESİ 58 (LPME) NİN ANTİOKSİDANT ÖZELLİKLERİ LPME NİN ANTİOKSİDANT AKTİVİTESİ (TAA) NIN 58

5 5 BELİRLENMESİ BİTKİ EKSTRAKTINDAKİ TOTAL FENOLİK BİLEŞİKLERİN 59 MİKTARLARININ BELİRLENMESİ BİTKİ EKSTRAKTINDAKİ İNDİRGEME KUVVETİNİN 60 BELİRLENMESİ İSTATİKSEL ANALİZLER BULGULAR MAKROSKOBİK BULGULAR BİYOKİMYASAL BULGULAR LPO MİKTARI ÜZERİNE LPME NİN ETKİLERİ SÜPEROKSİT DİSMUTAZ AKTİVİTESİ ÜZERİNE LPME NİN ETKİLERİ CAT AKTİVİTESİ ÜZERİNE LPME NİN ETKİLERİ GPx AKTİVİTESİ ÜZERİNE LPME NİN ETKİLERİ GSH MİKTARI ÜZERİNE LPME NİN ETKİLERİ MPx AKTİVİTESİ ÜZERİNE LPME NİN ETKİLERİ LPME NİN ANTİOKSİDAN ÖZELLİKLERİ TARTIŞMA KAYNAKLAR... 86

6 6 TEŞEKKÜR Tezimin planlanmasında, yürütülmesinde ve hazırlanmasında, rehberlik eden ve desteklerini esirgemeyen danışman hocam Yrd. Doç. Dr. Fehmi ODABAŞOĞLU na ve Araştırma Grubumuzdan Arş. Gör. Mesut B.HALICI, Okt. Yasin BAYIR, Sevil TANAS, Murat KOÇ ve Fadime ATALAY a, Tıp Fakültesi, Farmakoloji A.B.D. Başkanı sayın Prof. Dr. Fatma GÖÇER ve bu çalışmanın ortaya çıkmasında çok büyük emekleri olan ve çalışmalarım esnasında hayvanlarla çalışmayı öğreten, kıymetli hocam; sayın Doç. Dr. Halis SÜLEYMAN a, bilgi ve becerileriyle her zaman yanımda olan hocam Yrd. Doç. Dr. Zekai HALICI ya, çalışmamız esnasında desteklerini esirgemeyen Yrd. Doç. Dr. Ahmet HACIMÜFTÜOĞLU na, Arş. Gör. Elif ÇADIRCI ya ve tüm Tıp Fakültesi Farmakoloji A.B.D. ekibine, Çalışmalarımın başından sonuna kadar her türlü desteği sağlayan ve bu çalışmanın ortaya çıkmasında çok büyük emekleri olan, her türlü sıkıntımda yanımda olan ve bilimin ne derece meşakkatli ve bir o kadar da keyifli olduğunu bana öğreten, sayın Doç. Dr. Ahmet ÇAKIR a, bir çok zorluklara katlanarak dağ, bayır topladığı likenlerle çalışmama hüviyet kazandıran sayın Yrd. Doç. Dr. Ali ASLAN a, Çalışmalarım esnasında kapılarını sonuna kadar açan Tıbbi Deneysel Uygulama ve Araştırma Merkezi (ATADEM) müdürü Doç.Dr. Derviş ÖZDEMİR nezdinde tüm ATADEM personeline, Yüksek lisans tezi olarak sunduğum ve Atatürk Üniversitesi Eczacılık Fakültesi nde gerçekleştirilen bu çalışmanın ortaya çıkmasında desteklerini esirgemeyen Fakültemiz Dekanı sayın Prof. Dr. Yunus KARA, Temel Bilimler Bölüm Başkanı sayın Prof. Dr. Yücel KADIOĞLU ve nezdinde tüm Eczacılık Fakültesi personeline, Eğitim hayatım boyunca benden maddi ve manevi desteklerini hiçbir zaman esirgemeyen, eşime ve aileme de sonsuz teşekkür ve şükranlarımı sunarım.

7 7 ŞEKİLLER LİSTESİ Sayfa No : Şekil 1. Lobaria pulmonaria (L.) Hoffm nın doğal ortamında çekilmiş resimleri 7 Şekil 2. Mide, özofagus ve duodenum ülserlerini gösteren resim 9 Şekil 3. Çeşitli kimyasalların oluşturduğu gastrik erozyon ve ülserlerin patojenezinde vasküler hasarın önemi. 16 Şekil 4. Araşidonik asit metabolizması esnasında üretilen serbest radikaller 27 Şekil 5. Glutatyon un Molekül Yapısı 39 Şekil 6. GSH miktarlarının belirlenmesinde kullanılan standart grafik. 57 Şekil 7. LPO miktarlarının belirlenmesinde kullanılan standart grafik. 58 Şekil 8. Toplam fenolik bileşiklerin miktarının belirlenmeinde kullanılan gallik asit standart grafiği. Şekil 9. IND (25 mg/kg) tarafından oluşturulan gastrik hasarlı dokudan (A) ve LPME ile muamele edilmiş grupdan alınan (B) rat mideleri Şekil 10. LPME nin farklı dozları ve ranitidin (RAN, 50 mg/kg) in indometazin (IND, 25 mg/kg) ile oluşturulan gastrik ülserleri engelleyici etkilerinin 64 karşılaştırılması. Şekil 11. LPME nin farklı dozları, ranitidin (RAN, 50 mg/kg) ve indometazin (IND, 25 mg/kg) in rat mide dokularındaki lipit peroksidasyon (LPO) miktarları 66 üzerine etkisi. Şekil 12. LPME nin farklı dozları, ranitidin (RAN, 50 mg/kg) ve indometazin (IND, 25 mg/kg) in rat mide dokularındaki SOD enzim aktiviteleri üzerine etkisi. Şekil 13. LPME nin farklı dozları, ranitidin (RAN, 50 mg/kg) ve indometazin (IND,25 mg/kg) in rat mide dokularındaki CAT enzim aktiviteleri üzerine etkisi

8 8 Şekil 14. LPME nin farklı dozları, ranitidin (RAN, 50 mg/kg) ve indometazin (IND, 25 mg/kg) in rat mide dokularındaki glutatyon peroksidaz enzim 70 aktiviteleri üzerine etkisi. Şekil 15. LPME nin farklı dozları, ranitidin (RAN, 50 mg/kg) ve indometazin (IND, 25 mg/kg) in rat mide dokularındaki total glutatyon (GSH) miktarları 72 üzerine etkisi. Şekil 16. LPME nin farklı dozları, ranitidin (RAN, 50 mg/kg) ve indometazin (IND, 25 mg/kg) in rat mide dokularındaki miyeloperoxidaz enzim aktiviteleri 73 üzerine etkisi. Şekil. 17. Lobaria pulmonaria (L.) Hoffm nın metanol ekstresi (LPME) nin, trolox un ve askorbik asitin antioksidan aktivitelerinin saatlere bağlı olarak 75 değişimi.

9 9 TABLOLAR LİSTESİ Sayfa No : Tablo 1. LPME ve RAN in rat midelerinde IND ile deneysel olarak oluşturulan hasarlar üzerine koruyucu etkileri. Tablo 2. LPME, RAN ve IND ile muamele edilmiş rat midelerindeki lipid peroksidasyon (LPO) miktarlarını gösteren sonuçlar. Tablo 3. LPME, RAN ve IND ile muamele edilmiş rat midelerindeki süperoksit dismutaz (SOD) enzim aktivitelerini gösteren sonuçlar. Tablo 4. LPME, RAN ve IND ile muamele edilmiş rat midelerindeki katalaz enzim aktivitelerini gösteren sonuçlar. Tablo 5. LPME, RAN ve IND ile muamele edilmiş rat midelerindeki glutatyon peroksidaz (GPx) enzim aktivitelerini gösteren sonuçlar. Tablo 6. LPME, RAN ve IND ile muamele edilmiş rat midelerindeki total glutatyon (GSH) miktarlarını gösteren sonuçlar. Tablo 7. LPME, RAN ve IND ile muamele edilmiş rat midelerindeki miyeloperoksidaz (MPx) enzim aktivitelerini gösteren sonuçlar Tablo 8. Lobaria pulmonaria (L) Hoffm ın metanol ekstresi (LPME) nin total antioksidan aktivitesinin, indirgeme gücünün ve fenolik bileşik miktarının 75 karşılaştırılması.

10 10 KISALTMALAR ADP : Adenozin difosfat AMP BSA CAT CCl 4 CCl 3 COX DNA GAE GSSG GPx GR GSH GST H 2 O 2 HSV HO. HO 2 - IND LPO MDA MPx NAD + : Adenozin monofosfat : Sığır Serum Albumin : Katalaz : Karbontetraklorür : Triklorometil : Siklooksijenaz enzimi : Deoksiribonükleik asit : Gallik Asit eşdeğeri : Yükseltgenmiş glutatyon : Glutatyon peroksidaz : Glutatyon redüktaz : Glutatyon : Glutatyon S-Transferaz : Hidrojen peroksit : Herpes simplex virüs : Hidroksil Radikali : Peroksil : İndometazin : Lipit peroksidasyonu : Malondialdehit : Miyeloperoksidaz : Nikotinamid adenin dinükleotid

11 11 NADPH NO. NO + NO 2 - NSAID NBT O 2 : Nikotinamid adenin dinükleotid hidrojen fosfat : Nitrik oksit : Nitronyum iyonu : Azot protoksit : Steroid olmayan antienflamatuar ilaçlar : Nitro blue tetrazolium : Süperoksit radikali 1 O 2 : Singlet oksijen PGE PMN PUFA RAN RNA RO. ROO. ROS RSO.. RSO 2 SOD TAA TBA TFB WHO : Prostaglandin : Polimorfo nükleer : Polidoymamış yağ asiti : Ranitidin : Ribo nükleik asit : Alkoksil radikalleri : Peroksil radikalleri : Reaktif Oksijen türleri : Sülfenil radikali : Tiyol peroksil radikali : Süperoksit dismutaz : Total antioksidan aktivite : Tiyobarbütirik asit : Toplam fenolik bileşikler : Dünya Sağlık Teşkilatı

12 12 ÖZET Bu çalışmada, Lobaria pulmonaria (L.) Hoffm liken türünün metanol ekstresi (LPME) nin ratlarda indometazin (IND) ile oluşturulan ülser modelindeki koruyucu etkisi (in vivo) araştırıldı. Her bir deney grubu 6 şar rattan oluşturuldu. 50, 100, 200, 500 ve 1000 mg/kg dozlarda LPME, 50 mg/kg dozda ranitidin (RAN, pozitif kontrol) ve 25 mg/kg dozda IND (negatif kontrol) oral yolla verildi. Çalışmalarda sağlıklı kontrol grubu olarak kullanılmak üzere bir gruba da musluk suyu verildi. İND ile muamele edilen grupta meydana gelen ülserin, uygulanan LPME nin 50 mg/kg dozu (p>0.05) hariç, diğer dört dozu vasıtasıyla önemli oranda (p<0.05) azaltıldığı belirlendi. Diğer yandan, antioksidant savunma sistemlerinin ülser gelişimindeki rolünün belirlenmesi amacıyla, rat mide dokularında katalaz (CAT), süperoksit dismutaz (SOD), glutatyon peroksidaz (GPx) ve miyeloperoksidaz (MPx) enzim aktiviteleri ile total glutatyon (GSH) ve lipit peroksidasyon (LPO) miktarları belirlendi. Bulgular, kontrol grupları ile karşılaştırılarak değerlendirildi. İND uygulanan dokularda GSH miktarı ile SOD ve GPx enzim aktiviteleri azalırken, CAT ve MPx aktivitesiyle LPO miktarının arttığı tespit edildi. Elde edilen sonuçlar, gastrik hasar oluşumunda serbest radikallerin üretildiğini ve IND nin antioksidan savunma sistemini olumsuz etkileyerek ülser oluşumuna katkı sağladığını göstermektedir. LPME ve RAN ile muamele edilmiş dokularda, bu maddelerin IND nin aksine antioksidan savunma sistemini olumlu yönde etkilediğini ve gastrik mukozada üretilen reaktif oksijen (ROS) radikallerinin ülser oluşumundaki olumsuz etkilerinin azaltıldığı bulunmuştur.

13 13 SUMMARY The effects of methanol extract of a lichen species, Lobaria pulmonaria (L.) Hoffm., on the activities of antioxidant enzymes in the indomethacin-induced gastric tissues of rats. In this study, the gastro-protective effect of methanol extratct of a lichen species Lobaria pulmonaria (L.) Hoffm (MELP) in indomethacin induced ulcer model in rats was investigated, in vivo. Each of the experimental groups consisted from 6 rats. MELP at 50, 100, 200, 500 and 1000 mg/kg doses, ranitidine at 50 mg/kg dose (positive control) and indomethacin at 25 mg/kg dose (negative control) administrated per orally. And one group is separated as (healthy) control group and only tap water is given to this group. It is determined that ulcers occurred in indomethacin administrated tissues were decreased significantly by all doses of MELP except 50 mg/kg group (p<0.05). In order to discuss the role of antioxidant defence systems on ulcer progress, activities of antioxidant enzymes such as catalase (CAT), superoxide dismutase (SOD), glutathione peroxidase (GPx) and myeloperoxidase (MPx), and total glutathione (GSH) and lipid peroxidation (LPO) amounts were determined in rat stomach tissues. Results appreciated by comparing with control groups. In indomethacin administrated tissues, increased CAT, MPx activity and LPO amount in contrast to decreased activities of SOD and GPx and GSH amount were determined. These results suggested that free radicals are produced in the gastric mucosal damage and indomethacin also contributes ulcer formation by effecting negatively to the antioxidant defence systems. It is appeared that, in MELP and ranitidine administratedtissues, antioxidant defence system was affected affirmative in contrast to indomethacineadministrated tissues, and negative effects of reactive oxygen (ROS) radicals, produced in gastric mucosa were reduced.

14 14 GİRİŞ VE AMAÇ Ülser; mide ve duodenumun multifaktöriyel-kronik inflamatuvar hastalığıdır; gastrointestinal sistemin herhangi bir yerinde asit-pepsinle temas etmiş bir mukoza deliği olarak da tanımlanmaktadır 1. Ülser midedeki koruyucu ve saldırgan faktörlerin etkileşimi sürecindeki düzensizlikten meydana gelmektedir. Asit sekresyonu ve koruyucu mukoza bariyerindeki bozukluklara ilave olarak genetik yatkınlık (irsiyet), stres, kortizon türevi ilaçlar, sigara, alkol, aspirin ve indometazin gibi NSAID (non steroid antienflamatuar ilaç) ler, Helicobacter pylori ve Herpes simplex virüsü (Tip I/HSV 1) 2 hastalığı meydana getiren faktörlerdir. Ülseri meydana getiren önemli sebeplerden biri düzenli NSAID kullanımıdır. NSAİD lerin ülser yapıcı etkileri, enflamatuar bozukluklardaki kullanımlarının en büyük dezavantajı olmaya devam etmektedir. NSAID ler tarafından uyarılan gastrik mukozal ülserasyon temel olarak sitoprotektif prostaglandinlerin eksikliğine bağlanır. Bu prostaglandinlerin eksikliği midede gastrik asitlerin, safra tuzlarının ve etil alkolün tahrip edici etkilerini artırmaktadır. Aspirin ve indometazin'in siklooksijenaz (COX) enzim sistemini inhibe ederek antienflamatuar aktivite gösterdikleri düşünülmektedir. Aspirin ve indometazin gibi antienflamatuar ilaçların COX enzim sistemini bloke etmesi ise prostaglandin biyosentezinin baskılanması ve gastrik mukozal bariyerin bozulması sonucu gastrik hasarın oluşumuna neden olur. Daha önceki araştırmalarda COX enziminin inhibisyonu sonucunda araşidonik asit metabolizmasının 5-lipoksijenaz yolunda bir artış meydana geldiği ve bunun da lökotrienlerin ve hidroperoksieikozatetraenoik asidin oksijeninden türevlenen gastrik mukozada tahribata sebep olan radikallerin aşırı üretimi ile sonuçlandığı kaydedilmiştir 3-7.

15 15 İndometazin uyarmalı ülser oluşumunun COX inhibisyonuyla ilişkili olduğu ve COX inhibisyonun da prostaglandin biyosentezini baskılayarak gastrointestinal hasara karşı bir savunma faktörü olan mukus oluşumunu engellediği rapor edilmiştir Ancak indometazin uyarımlı mide ülserlerinin oluşum mekanizması tam olarak henüz aydınlatılamamıştır. Prostaglandin biyosentezinin inhibisyonu, lokal kan akışının azalması, topikal tahriş, yeniden yapılanma ve doku onarımının engellenmesi bu sebeplerden bazılarıdır Son zamanlarda indometazin gibi NSAID ler tarafından uyarılan akut gastrik deneysel lezyonlarda oksijenden türevlenen serbest radikallerin (ROS) de önemli rol oynadığını gösteren çalışmalar yayımlanmıştır Bu çalışmalarda önemli miktarlarda üretilen oksijen metabolitlerinin ise dokuyu dejenere ederek ülsere sebep oldukları bildirilmiştir 6,7. Diğer birçok doku hasarı gibi gastrik ülser de süperoksit anyonlarının oluşumuyla ilgilidir. Ayrıca gastrik mukozadaki ülserin tedavisinde antioksidan enzimlerin koruyucu etkilerine ve karşılıklı olarak bu enzimlerin birbirlerini etkilemelerine de dikkat çekilmiştir Hücreler ROS (reaktif oksijen sınıfları) hasarlarını önleyebilecek veya tamir edebilecek pek çok mekanizmaya sahiptir. ROS nin tahribatları, primer olarak enzimler [Süperoksit dismutaz (SOD), katalaz (CAT), glutatyon s-transferaz (GST), glutatyon redüktaz (GR) ve glutatyon peroksidaz (GPx)]; sekonder olarak da antioksidant vitaminler, glutatyon (GSH) ve birçok makro ve mikro moleküller tarafından azaltılarak serbest radikallerin hücrelerde düşük ve belirli konsantrasyonlarda tutulmaları sağlanır Şayet süperoksit (O.- ), hidroksil (HO.) ve hidrojen peroksit (HOOH) gibi ROS üyeleri aşırı üretilirse, membran lipitlerinin, proteinlerin, nükleik asitlerin ve ekstraselüler matriks glikozaminoglikanlarının zarar görmesine bağlı olarak doku hasarı prosesi başlayabilir.

16 16 Gastrik ülser oluşumunu tetikleyen mekanizmalardan birisinin de bu mekanizma olabileceği pek çok araştırmacı tarafında öne sürülmüştür 16-18,21,26,32,38. Serbest radikalleri etkisizleştiren sekonder moleküllerden GSH ise, gastrointestinal dokuları makromolekül içeren lipitlerin oksidatif hasarlarından korumada önemli görev üstlenmiştir 18, 21, 38, 36, Bu gün bilinen pek çok etken maddenin indometazin ile uyarılan gastrik hasar üzerine pozitif etkileri gösterilmiştir 18,22,28 30,33,37, Diğer yandan çok sayıda bitki ekstrelerinin antiülserojen etkileri de rapor edilmiştir Likenler, mantarlar ve alglerin bir araya gelerek teşkil ettikleri simbiyotik (ortak yaşayan) bir bitki grubudur. Günümüzde den fazla türe sahip olduğu bilinen likenlerin, ülkemizdeki florası henüz tamamlanmamış olup bölgemiz ile ilgili yapılan çalışmalar ise son derece azdır Likenlerin çok sayıda madde sentezlemekte oldukları ve bu maddelerin çoğunun biyolojik aktivitelere sahip oldukları tespit edilmiştir Bu aktivitelerden bir kısmı; antiviral 85, antibakteriyel 86-91, antitümöral 92-94, allerjen 95, bitki büyüme inhibitörü 96, antiherbivor 97, enzim inhibitörü şeklinde sıralanabilir. Parfüm sanayiinde 81, kozmetik krem sanayiinde 105, hava kirliliğinin belirlenmesinde faydalanılan likenler pek çok ülkede de besin olarak kullanılmaktadır 82. Likenlerin üstün yaşam mukavemeti kendi bünyelerinde ürettikleri çok özel moleküllerden ileri gelmekte 81 ve yapılan biyolojik aktivite ölçümlerinde liken metabolitlerinin her geçen gün yeni özellikleri keşfedilmektedir. Üstelik bu maddelerin genellikle sitotoksik özelliklerinin az olması, ilaç özelliklerinin araştırılmasında önemli yer tutmaktadır. Literatürde liken ekstrelerinin ve liken metabolitlerinin antiülserojen etkilerinin incelendiği çok sayıda araştırmaya rastlanamamıştır ve mevcut araştırmaların

17 17 çoğunluğu da bizim araştırma ekibimiz tarafından gerçekleştirilmiştir Antiülserojenik etki sürecinin mekanizmaları hakkında ise bilgiler oldukça sınırlıdır. Bu açıdan bakıldığında bu çalışma ülserin önlenmesinde oksidatif süreç üzerinde likenlerin etkili olup olmadığının tespit edilmesi açısından önemli bir eksikliği tamamlayacaktır. Bu araştırma; antioksidant potansiyele sahip olduğunu belirlenen Lobaria pulmonaria (L.) Hoffm liken türünün gastroprotektif etkisinin olup olmadığının, şayet gastroprotektif etkiye sahip ise bu etkinin oksidatif süreçten nasıl etkilendiğinin ve bu liken türünün gastroprotektif potensiyelinin ilaç çalışmaları yapılabilmesi için yeterli olup olmadığının tespit edilmesi amacıyla gerçekleştirilmiştir.

18 18 1. GENEL BİLGİLER 1.1. Likenler Likenler alglerle fungus hiflerinin oluşturdukları simbiyotik birliklerdir. Dünyanın hemen her yerinde yayılış gösterirler. Çünkü yeterli nemin bulunduğu kızgın çöllerde, Arktik ve Antartik bölgeler ile yüksek dağların dondurucu soğuklarında diğer bitkilerin yaşayamadığı taşlar, verimsiz topraklar, kuru ağaç kabukları ve kiremitler üzerinde dahi yetişebilmektedirler 84. Likenler, en az iki organizmadan (fungus ve alg) oluşan bitkilerdir. Funguslar, kendi karbonhitratını üretemez, fotosentez partneri olan alg ve cyanobakterilerden hazır olarak alırlar. Bunlar da ekosistem için çalışır ve fungus için glukoz üretirler. İki organizma da tek başlarına yaşayamayacakları yerlerde beraber kolonize olup yaşayabilirler. Likenler, dünyada ve ülkemizde çok eski zamanlardan beri halk hekimliğinde birçok hastalığın tedavisinde kullanılmıştır. Dünya Sağlık Örgütünün (WHO) birçok ülkedeki yayınlara dayanarak hazırladığı bir araştırmaya göre, dünyada tedavi amacıyla kullanılan tıbbi bitkilerin toplam tür sayısı civarındadır Ülkemizde 9000 e yakın bitki türünün doğal olarak yetiştiği ve bunların kimyasal içerikleri hakkındaki çalışmaların yok denecek kadar az olduğu da vurgulanmaktadır 112. Bitkisel organizmalar içerisinde incelenen likenler de antik çağlardan beri tıbbi özellikleri itibariyle değerlendirilmişlerdir 113. Fungus (mycobiont) ve alg (phycobiont) partnerlerinin oluşturduğu simbiyotik bitkiler olan likenler, yavaş üremelerinden kaynaklanan rekabette zayıf kalma dezavantajlarını, ürettikleri özel maddeler sayesinde telafi ederler. Özellikle aromatik yapılı sekonder metabolitler, onların en güçlü antagonistik maddelerini oluşturmaktadır. Diğer taraftan likenlerin boya ve parfümeri sanayisinde ham madde olarak ve hava kirliliğini belirlemek amacıyla ,116,117

19 19 kullanıldıkları da kaydedilmiştir. Her ne kadar likenlerin global krizlerde besin kaynağı olarak kullanılabileceği teklif edilmişse de, doğal yolla üremeleri çok yavaş olduğundan, bu tür bir değerlendirmenin ekonomik olmadığı ifade edilmiştir 118. Son yıllardaki araştırmalar, liken metabolitleri ve onların antimikrobiyal etkileri üzerinde yoğunlaşmıştır. Araştırmalar sonucunda 300 e yakın liken metabolitinin yapısı aydınlatılmış ve bunlardan özellikle protolikesterinik asit, pulvinik asit, fisodik asit, lobarik asit, fumarprotosetrarik asit ve usnik asitin en yüksek antimikrobiyal etki gösteren liken maddeleri olduğu saptanmıştır 89,90. İkinci Dünya Savaşı ndan sonra ilkel funguslardan elde edilen antibiyotiklerin kıtlığı, likenler üzerinde benzer araştırmaların yapılmasına yol açmıştır. Likenlerdeki bu antimikrobiyal etki, yapılarında bulunan asitlerden ileri gelmektedir. Farklı liken türlerinden izole edilmiş protolikesterinik asit, pulvinik asit türevleri, depsid grubundan evernik, olivetorik asit, tridepsid grubundan giroforik asit, depsidon grubundan fisodik, lobarik, fumarprotosetrarik asitler ile dibenzofuran türevlerinden usnik asitin antimikrobiyal etkileri saptanmıştır 119. Öte yandan likenlerin tıbbi önemleri bilim adamlarının ilgisini çekmekte ve likenlerin tıbbi kullanım alanları, araştırmacıların likenler üzerinde yoğunlaşmasını sağlamaktadır. Likenlerde bulunan maddelerin çoğu asit özelliği gösterdiği için bunlara karakteristik liken asitleri denilmektedir. Likenlerin kayaları parçalama özelliğini sentezledikleri bu asitler vasıtası ile gerçekleştirdiklerine inanılmaktadır. Likenlerin bu asidik maddeleri %1 5 oranında, çoğu zaman da %25 oranında içermeleri bu maddelerin izolasyonunu kolaylaştırmakta, dolayısıyla da likenlerin bu yönüyle tohumlu bitkilerden daha fazla önem kazanmasına neden olmaktadır 78. Likenlerde bulunan maddelerin çoğu asit özelliği gösterdiği için bunlara karakteristik liken asitleri denilmektedir. Likenlerin kayaları parçalama özelliğini sentezledikleri bu asitler vasıtası

20 20 ile gerçekleştirdikleri bilinmektedir. Likenlerin bu asidik maddeleri %1 5 oranında, çoğu zaman da %25 oranında içermeleri bu maddelerin izolasyonunu kolaylaştırmakta, dolayısıyla da likenlerin bu yönüyle tohumlu bitkilerden daha fazla önem kazanmasına neden olmaktadır 78. Cladonia, Evernia, Cetraria, Usnea, Alectoria, Ramalina cinsleri antibiotik özelliğe sahip asitler yönünden önemlidir. Bu maddeler grampozitif koklara, verem basiline ve difteriya karşı etkilidir 120. Likenlerin primer metabolitleri yalnız algler tarafından fotosentezle sentezlenmektedir. Likenlere özgü çeşitli polisakkaritlerin yanı sıra çeşitli aminoasit, amin ve proteinler de likenlerden izole edilmiş primer metabolitlerdir 121. Likenler tarafından sentezlenen alifatik ve aromatik bileşikler ise sekonder metabolitler olup günümüze kadar 300 den fazla sekonder metobolitin saflaştırılmış ve yapısı spektroskopik yöntemlerle aydınlatılarak karakterize edilmiştir 80,81, Lobaria pulmonaria (L.) Hoffm. Şekil 1. Lobaria pulmonaria (L.) Hoffm nın doğal ortamında çekilmiş resmi. Sinonimleri: Sticta pulmonacea Ach. Tallus kuru iken kahverengi, nemli halde parlak yeşil renkte, yapraksı yapıdadır. Loplar (kenardaki çıkıntılar) derin oyuklu ve dalgalı retikulat (ağsı bir yapı) çukurlu,

21 21 damarlı, bu damarların üzeri veya lop kenarları sored veya izidler ile kaplıdır. Alt yüzey gri ya da kahverengi, çoğunlukla tomentoz (keçemsi) yapı gösterir. Apotesyum a ender rastlanır. Geniş yapraklı ağaç kabukları, silikat taşlar, karayosunları üzerinde, nemli yerler, özellikle fazla tahrip edilmemiş ormanlar ve hava kirliliğinin bulunmadığı yerlerde yaygındır. Borealden Akdeniz havzasının güneyine kadar yayılış gösterir. Ülkemizde genel olarak Doğu Karadeniz bölgesinde yaygın olarak bulunmaktadır 123. Lobaria pulmonaria (L.) Hoffm Avrupa, Kuzey Amerika, Avustralya nın dağlık kesimlerinde ve ağaçlarda yerleşim gösterirler. Bu bitki halk tıbbında egzama, solunum sistemi ile ilgili hastalıklar ve artrit gibi çeşitli hastalıkların tedavisinde kullanılmaktadır. Diğer yandan bazı ülkelerde yiyecek olarak kullanımının yanı sıra kozmetik sanayinde de kullanılmaktadır 124,125,84. Parfüm sanayinde koku verici olarak kullanılır 116. Fransa'da bu türden orman çayı adı verilen bir tür aromatik içki yapılmaktadır 120. Lobaria pulmonaria (L.) Hoffm dan hazırlanan çay laksatif (barsak gevşetici) olarak da kullanılmıştır. Bu likenden hazırlanan ilaçlar uzun süre solunum düzensizliklerinin tedavi edilmesinde kullanılmıştır. Ayrıca laksatif bir kremi de hazırlanmıştır 120, 126. Lobaria pulmonaria (L.) Hoffm biranın mayalanmasında şerbetçi otu (Humulus lupulus) yerine kullanılmıştır. Bu liken ile yapılan biranın şerbetçi otu ile yapılan birayla tamamen aynı olduğu tespit edilmiştir. Yalnız organizmayı daha çok uyuşturucu özelliği olduğu vurgulanmıştır 116. Veteriner homeopatisinde (benzeri benzerle tedavi), gıda ürünü olarak kullanılabilen türlerde ana tentür oral veya parenteral kullanım için olmaktadır. Bu tentürün düşük konsantrasyonları insan homeopatisinde de kullanılır 127. Bu likenin başlıca komponentleri gryrophoric asit, stictic asit ve norstictic asittir 79, 80. Bunlardan

22 22 gyrophoric asit anti-proliferatif etki göstermektedir 93. Bu likenden elde edilen bir polisakkaritin kemik iliği hücrelerini radyasyona karşı koruduğu ve hematopoetik kök hücrelerini desteklediği de belirlenmiştir Ülser: Şekil 2. Mide, özofagus ve duodenum ülserlerini gösteren resim. Mide, yiyecekleri sindiren ve hormon salgılayan hem ekzokrin hem de endokrin bir organdır 129. Sindirim sisteminin en geniş yerini teşkil eden mide, iç yüzü mide mukozası ile kaplı kastan (düz kas) yapılmış, oldukça geniş bir torbadır. Kendisinden sonra onikiparmak barsağıyla (duodenum) devam eder. Yukarıda yemek borusu ile birleşir. Torba şeklinde olduğundan şekli; doluluk derecesine, kasının kasılma durumuna (tonus), solucanvari hareketlerine, vücut yapısına, ayakta ya da yatar vaziyette oluşuna, komşu organların durumuna göre değişir. Midenin iki ucu vardır. Her iki ucu da sfinkter dediğimiz birer büzük(kapak) ile içindekileri içinde tutmağa çalışır. Diyafram ile göğüs boşluğundan ayrılır. Midenin başlıca iki fizyolojik aktivitesi vardır;

23 23 1- Midenin hareketi (motilite); Yiyilen yiyeceklerin depo edilmesi, öğütülmesi, birbirleriyle ve mide sıvısıyla karışmalarını sağlayarak oluşan materyalin 12 parmak barsağına, düzenli bir şekilde geçirilmesi. 2- Midenin asit ve pepsin salgılaması; Besinlerin parçalanmasını ve birbirine iyice karışmasına yardımcı olması 130. Mide ve duedonumda (ince barsakların ilk parçası) meydana gelen enflamasyonlar sonucunda peptik ülser oluşur (Şekil 2). Peptik ülser; travma, stres, sepsis, hemorajik şok, yanıklar, pulmoner ve karaciğer hastalıkları, rezerpin, epinefrin, steroidler, sigara kullanımı, NSAID ve alkol gibi iyi bilinen pek çok faktörün sebep olduğu bir hastalıktır. Hastaların yaklaşık %60-80 ninde etiyolojik faktör bilinmemektedir 2,131. Stres 2, etanol 132,133, NSAID ler 132,134 ve özellikle de iskemi reperfüzyon 135 ile ilişkili gastrik mukozal hasarda oksijen kökenli serbest radikaller patojen faktörler olarak kabul edilmektedirler 136. Etanolle oluşturulan gastro duodenal hasarlarda serbest radikal oluşumunun patojenik faktörlerden biri olduğu birçok araştırmacı tarafından da doğrulanmıştır 132,135,137,138. İnsanlarda tüm aerobik hücrelerde üretilen oksijen türevli serbest radikaller olan süperoksit (O 2 ) ve hidroksil (OH ) radikalleri ile bu radikallerin kaynakları veya ürünü olan singlet oksijen ( 1 O 2 ) ve hidrojen peroksit (H 2 O 2 ) pek çok zararlı etkiye sahiptir. Eğer hemen ortamdan uzaklaştırılmazlarsa, biyolojik sistemlere toksik etki yaparlar. Toksik etki protein inaktivasyonuna, DNA hasarına ve lipit peroksidasyonuna sebep olarak hücrenin yapısal ve fonksiyonel aktivitelerini oksidatif hasara uğratır. Bu hasarı önlemek üzere SOD, CAT, GPx ve GR gibi enzimler radikal süpürücü olarak görev yaparlar Dokularda normalde de az miktarda oluşan serbest radikallere karşı korunmak için SOD, CAT, GR, MPx ve GPx gibi enzimler mevcuttur Fakat bu

24 24 enzimler ekstraselüler sıvıda fazla miktarda bulunmadığı için insan ve diğer tüm memeli hücreleri in vitro olarak ekstraselüler oksijen kökenli radikallere maruz kaldığından tahrip olurlar. Respiratuar ve gastrointestinal kanalı döşeyen hücreler oksijen kökenli radikallere sıkça maruz kalırlar. Askorbat ve demir tuzları gibi maddelerin aşırı tüketimi veya akciğerlerin birkaç yıl sigara içimine maruz kalması ile gözlenebilen bir hasar oluşması için yıllar geçmesi gerekir. Oysa oksijene maruz kalmış izole hücrelerde benzer hasarlar birkaç dakika veya birkaç saatte oluşabilmektedir. Bu farklılığı açıklayacak faktörlerden birisi de epitelyal hücre hasarından sonra yüzey epitelinin in vivo olarak hızla çoğalabilmesidir. Bu süre zedelenmiş gastrik mukozada birkaç saatten az bir süredir. Büyük gastrik mukozal hasarlara sebep olan oksijen radikallerinin mekanizması tam olarak aydınlatılamamıştır. Oksidan maddeler, polidoymamış yağ asitleri, kükürt içeren aminoasitli proteinler ve nükleik asitlerle kolayca reaksiyona girerler 141. Bu durum membranın vital özelliklerini değiştirerek, epitelin ve endotelin bariyer özelliğini tahrip edebilir. Oksijen radikalleri, araşidonik asit metabolizmasının ürünleri ile de etkileşerek tromboksan oluşumunu sitümüle (uyarma) eder ve gastrik mukozayı sekonder mekanizmalar aracılığı ile tahrip eder. Tromboksan ise mukozal ve submukozal damarları kontrakte ederek gastrik mukozal kan akışını durdurur 142,143. Oksijen radikallerinin diğer bir kaynağı da polimorfo nükleer (PMN) lökosit lerdir. Nötrofillerin süperoksit'e bağlı birikim ile nötrofil kökenli oksidanların sebep olduğu mikro vasküler rezistanstaki artış da gastrik mukozada oksijen radikallerinin sebep olduğu hasarların patojenik faktörlerinden biridir Bu nedenle, akut gastrik mukozal hasarların gelişmesine karşı korunmada endojen antioksidan savunma mekanizmaların oldukça önemli olduğu tespit edilmiştir. Tripeptit yapısında

25 25 olan GSH, özellikle insan ve sıçan gastrik mukozasında yüksek konsantrasyon da bulunan endojen bir antioksidandır 132,136,147. Glutatyon un doğal bir süperoksit radikali toplayıcısı olduğu ve sellüler bütünlüğün devamı için gerekli olan protein-tiol gruplarını oksidasyona karşı koruduğu bilinmektedir 136. Gastrointestinal mukusun da fizyolojik bir antioksidan olduğu düşünülmektedir. Çünkü mukus epitel hücrelerini tamamen kapatarak lümen ile epitel arasında fizyolojik bir bariyer oluşturur 139 mukus, OH radikali ve H 2 O 2 ile reaksiyona girerek alttaki epiteli oksidatif hasardan korur. Etanol, sıçanlarda nonprotein sülfidril konsantrasyonunda anlamlı bir düşme yaparak gastrik mukozal hasara sebep olmaktadır 136, İnsanlarda da % 80 etanol ile oluşturulan gastrik mukozal hasarın nedeninin GSH ve sistein gibi total sülfidrillerin (nonprotein-protein) antrum ve gastrik korpusta azalışı ile yakından ilgili olduğu belirtilmiştir 149. Endojen sülfidril eksikliğinde gastrik mukus hücrelerinin oksijen metabolitlerine ve aside karşı hassasiyeti artmaktadır 136,149, Bu yüzden glutatyonun normal doku da konsantrasyonunun sabit tutulabilmesi sonucu etanolün oluşturduğu oksijen metabolitleri uzaklaştırılacak ve bu suretle mukozal hasar inhibe edilebilecektir 155. Ayrıca parenteral GSH nin gastrik mukozal kan akımında artışa, mukus üretiminin stimülasyonuna veya sülfidril içeren proteazların inhibisyonuna yardım ettiği rapor edilmiştir Bu yüzden endojen GSH gastrik mukozal bütünlüğün devamında önemli bir rol oynamaktadır 148,149. Gastrointestinal mukusun da fizyolojik bir antioksidan olduğu düşünülmektedir. Çünkü mukus epitel hücrelerini tamamen kapatarak oksidatif hasardan korur ve ayrıca lümen ile epitel arasında fizyolojik bir bariyer oluşturur 139. Redoks reaksiyonları ile hızlanan süperoksit radikali üretimi SOD enziminin katalizörlüğünde H 2 O 2 ye dönüşür.

26 26 Mukus meydana gelen H 2 O 2 ve. OH radikali ile reaksiyona girerek alttaki epitele antioksidan koruma sağlar. Ayrıca kobay gastrik musininin etkili bir hidroksil radikali toplayıcısı olduğu da belirlenmiştir 160,161. Yapı olarak birbirinden farklı pek çok kimyasal madde insanlar ve deney hayvanlarında midenin asit üreten kısmındaki mukozal epitelde hemoraji ve nekroza sebep olur. Etanol tüketimi de erkeklerde akut gastroduodenal hasarların predispozan faktörlerinden biridir. Kimlerde ve ne zaman ülser gelişeceği ve bu ülserin nerede lokalize olacağı önceden tahmin edilemez, bu sadece hayvan modellerinde veya in vitro sistemlerde oluşturulabilir. Oysa hem ülser hastalarında hem de hayvan modellerinde tedavi evresine etki edilebilir. Genel olarak akut evrede bir ülseri nelerin aktive ettiği veya ülserin nasıl iyileşeceği bilinmektedir. Fakat maalesef kronik evrede primer ve sekonder faktörler karışıktır. Bu sebeple etiyolojinin ne ile ilişkili olduğu hasarlara cevabın ne olduğunu bilmek imkansızdır. Sıçanlara intragastrik verilen etanol ile oluşturulan gastrik mukozal lezyonlar, insanda oluşan ülseratif hastalığın hem patojenezini hem de tedavisini ortaya koymak için kullanılabilir. Hayvanlarda ayrıca aspirin, indometazin gibi antiinflamatuar ajanlar, stres, iskemi-reperfüzyon ile de ülser oluşturulabilir. Mukozal lezyonların patolojisinin iyi bilinmesi, ülser hastalığına başarılı bir farmakolojik yaklaşım sağlayabilir. Etyolojik hikayenin başlangıcından itibaren yapılan tedavi ve önlemler her hastalık için en uygun müdahale şeklidir. Etanol (%50 100) protektif ajanların varlığında bile gastrik mukozaya hızlı bir şekilde penetre olur 162. Hücre ve plazma membran hasarına sebep olan etanol, sodyum ve suyun intrasellüler birikimine yol açan membran permeabilitesini de artırır. Leakey membran (delik membran) hücre hasarının gelişmesinde iyi bilinen bir evredir 156.

27 27 Membran permeabilitesi arttığı zaman intrasellüler ve ekstraselüler kopartmanlar arasındaki normal elektrolit dağılımı bozulur. İntrasellüler kalsiyum birikimi gastrik mukozal hasarların patojenezinde önemli bir basamaktır. Gastrik mukozadaki bu değişiklikler hücre ölümü ve yüzeysel epitel de eksfolyasyona sebep olarak erozyon oluşturur. Lamina propriya ve submokozadaki yapılar (mast hücreleri, makrofajlar, kan damarları gibi) lüminal hasar verici ajanlara maruz kaldığında bu değişiklikler mukozal permeabilitedeki artışla sonuçlanır. Sıçanlarda etanolün intragastrik verilişinden 1 dakika sonra vasküler hasarlar meydana gelir. Öncelikle gastrik pitlerdeki süperfisyal, subepitelyal mukozal kapillerde belirlenen vasküler lezyonların hem mukozaya penetre olan etanolün direk etkisi hem de mast hücreleri ve diğer doku veya hücrelerden (makrofaj, lökosit, trombosit gibi) vazoaktif aminlerin salınımı ile indirek olarak oluşturulduğu belirgindir 157. Çeşitli formlardaki gastrik ülserlerde mast hücre degranülasyonunun önlenmesinin etanolün oluşturduğu gastrik erozyonları azaltacağı ileri sürülmektedir. Üstelik genetik olarak mast hücre cevabı az olan farelerde alkolün yaptığı gastrik mukozal hasar kontrolden daha azdır. Ülsere en büyük nedenlerden biride "Helicobacter pylori" adlı bir etkenidir. Birçok ülser Helicobacter pylori mikrobunun varlığı ile meydana gelir. Bu bakteri midede mukus tabakası ile mide epiteli arasına yerleşerek yaşamını sürdüren kıvrık veya spiral şekilli bir bakteridir. Helicobacter pylori mide asidini nötralize eden enzimler salgılayarak asidik mide ortamında yaşayabilme yeteneğine sahiptir. Bu mekanizma ile bakteri koruyucu mukus tabakasına kadar ulaşan bakteri spiral şekilli olmasından dolayı kıvrılarak mukus tabakası boyunca ilerler ve koruyucu mukus tabakasını zayıflatarak mide asidinin duyarlı alt tabakalara geçmesine olanak sağlar.

28 28 Böylece mide asidi ve bakterinin kendisi birlikte bu tabakada doku hasarı meydana getirerek ülser oluşumuna neden olur 6,21,66, İndometazinle oluşturulan ülserler Diğer nonsteroidal antiinflamatuar ilaçlar gibi indometazin de siklooksijenaz enzimini üzerinden prostaglandin sentezini inhibe eder. Sikloksijenaz enziminin vücutta iki izozimi vardır. Bunlar COX 1 ve COX 2 dir. Vücutta predominant olan tip COX-l olup, fizyolojik uyarılarla aktive olan formdur. COX 1 damar endoteli, mide mukozası, böbrek, kalp ve trombositlerde bulunur. COX 2 ise enflamatuar uyarılarla aktive olan formdur. Makrofajlarda ve diğer enflamatuar hücrelerde bulunur ve iltihap etkenleri ile indüklenebilir. Aspirin ve indometazin, COX-l i daha fazla inhibe ederken COX 2 üzerine etkileri nisbeten daha azdır. Halbuki flurbiprofenin COX 1 e olan inhibitör etkisi COX 2 ye göre daha düşüktür. COX 2 üzerine olan inhibitör etkileri COX 1 e göre daha fazla olan NSAID lardan meloksikam, tenoksikam ve nabumeton halen tıbbi kullanımı yaygın olan ilaçlardır. Gastrik bikarbonat ve mukus sekresyonunun azalması indometazinin hasarlayıcı etkisine yardım eder. Vasküler hasar etanol veya indometazin tarafından indüklenen şiddetli gastrik mukozal lezyonların patojenezinde hız sınırlayıcı bir basamak gibi görünmektedir 156,162. Son zamanlarda yapılan çalışmalarda etanol veya aspirin tarafından gastrik mukozada oluşturulan vasküler lezyonları önleyen prostaglandin analogları veya sülfhidril ilaçların hemorajik erozyon ve ülserleri de yok ettiği ve bariz bir şekilde azalttığı doğrulanmıştır. Eğer vasküler hasar mevcutsa, süperfisyal mukozal kapiller kan akımı düşer ve dolaşımdan plazma sızar. Bu durum mukozal kan damarlarında dolaşımın tamamen durması sonucu konjesyonu hızlandırır. Nekrotik yüzey epitelinin dökülmesi ile oluşan

29 29 erozyon hipoksik ortamda genişler ve böylece hemorajik derin erozyon ve ülser oluşur. (Şekil 3). Eğer vasküler hasar minimal derecede ise veya yoksa kan akımı devam eder ve süperifisyal mukozal hücre hasarına rağmen gastrik pit deki proliferatif zon çabucak hasarı karşılar ve hücre proliferasyonu gelişir. Eğer vasküler hasar yoksa veya az ise süperfisyal epitelin % 95 i etanolle yıkıldığı halde hasardan dakika sonra derindeki küboidal hücreler yüzeyi kaplar. Vasküler hasar ve derin hemorajik erozyon veya ülserlerin yokluğunda, gastrik mukozanın epitelyal yenilenmesi son derece hızlı ve yeterlidir. Başka bir değişle eğer vasküler hasarı farmakolojik olarak dikkate alırsak, gastrik mukozal epitel doğal ve yeterli tamir kapasitesinden dolayı kendi kendine iyileşir. Böylece vasküler endotel, gastrik lezyonları önlediği veya azalttığı düşünülen yeni ilaçlar için terapötik bir hedef olarak gösterilmektedir 163. Orta dereceli konjesyorı Artan permeabilite Şiddetli konjesyon İskemi ve hemoraji Erozyon ülser Var VASKÜLER HASAR Yok veya minimal Kan akımının devamı Şiddetli nekrozun olmayışı Resisutasyon ve hücre proliferasyonu için proliferatif zonun zararı Sadece yüzey hücre hasarı ve hızlı Şekil 3. Çeşitli kimyasalların oluşturduğu gastrik erozyon ve ülserlerin patojenezinde vasküler hasarın önemi Likenler ve ülser Likenler yapılanmaları, yaşadıkları çevre koşulları, temizliğine, tutundukları kayanın minerallerine ve iklim koşullarına kadar birçok etkiye göre renk ve gelişme gösterdiklerinden, meraklı bakışlara kendileri ile birlikte çevrelerinin sırlarını da açığa vururlar. Likenlerin üstün yaşam mukavemeti kendi bünyelerinde ürettikleri çok özel

30 30 moleküllerden ileri gelmekte ve yapılan biyolojik aktivite ölçümlerinde liken maddelerin her geçen gün yeni özellikleri keşfedilmekte, üstelik bu maddelerin sitotoksik özelliklerinin az olması da ilaç özelliklerinin araştırılmasında ön planda tutulmaktadır. Liken ekstrelerinin ve likenlerden elde edilen moleküllerin antiülserojen etkilerinin incelendiği çok az sayıda araştırma vardır 109,164,98,165. Antiülserojenik etki sürecinin mekanizmaları hakkında ise bilgiler oldukça sınırlıdır Antioksidanlar Serbest radikaller Kuantum kimyasına göre ancak iki elektron bir bağın yapısına girebilir. Ayrıca iki elekronun zıt spinli olması gerekir. Elektron çiftleri oldukça kararlıdır ve insan vücudunun neredeyse tüm elektronları elektron çifti halinde bulunur. Bir bağ koptuğunda elektronlar ya birlikte kalır (heterolitik parçalanma) ya da ayrılırlar (homolitik parçalanma). Eğer birlikte kalırlarsa kimyasal bağ heterolitik olarak parçalanır, homolitik olarak parçalanır ise serbest radikaller oluşur. Bu eşleşmemiş elektronlar yüksek enerjilidir ve eşleşmiş elektronları ayırıp onların fonksiyonlarına engel olurlar. Bu özellikleri serbest radikalleri hem tehlikeli hem de kullanışlı yapmaktadır. Bu nedenle, serbest radikaller yaşam için gereklidir ve elektron transferinin de, enerji üretiminde ve pek çok diğer metabolik olaylarda önemli ürünlerdir. Şayet zincir reaksiyonu kontrolsüz bir davranış gösterirse hücrede hasarlara neden olur. Bilim adamları 1954'lerden beri serbest radikallerin yaşlanma ve dejeneratif hastalıklara neden olduğunu bilmektedirler. Çoğu elektronlar çift halde bulunurken, serbest radikaller bu elektronları birbirinden ayırarak reaksiyonu durdururlar. Ama sonuçta serbest radikal kendine bir çift elektron alarak elektron çifti haline geçer, diğer

31 31 elektron serbest radikal olur. Bu tip moleküller ortaklanmamış elektronlarından dolayı oldukça aktiflerdir ve bu yüzden nüfuz edici özelliğe sahiptirler 166. Serbest radikaller üç yolla meydana gelirler: 1 - Kovalent bağlı bir molekülün herbir atom, kovalent bağı oluşturan elektron çiftinden birer elektron alır ve genellikle yüksüz atomlar ya da atom grupları oluşur. Bu bölünme şekline homolotik olarak bölünme denir. Bu bölünme sonucunda oluşan atom veya atom gruplarına radikal denir. X: Y X + Y 2 - Bir molekülden tek bir elektronun kaybı veya bir molekülün heterolitik bölünmesi. Heterolitik bölünmede kovalent bağı oluşturan her iki elektron atom veya atom gruplarının birinde kalırlar. Böylece serbest radikaller değil iyonlar meydana gelir. X: Y X - + Y Bir moleküle tek bir elektronun eklenmesi A + e - A - Biyolojik sistemlerdeki en önemli serbest radikaller, oksijenden oluşan radikallerdir. Serbest oksijen radikali biyokimyasında anahtar rolü oynayan maddeler oksijenin kendisi, süperoksit, hidrojen peroksit, geçiş metallerinin iyonları ve hidroksil radikalleridir 139. Bunlardan ilk dördünün çeşitli reaksiyonları sonuncu genellikle hidroksil radikalleri meydana gelir. Oksijen molekülünün elektronları o şekilde dağılmışlardır ki bu elektronlardan iki tanesi eşleşmemiştir. Bu yüzden oksijen bazen bir di radikal olarak değerlendirilmektedir. Oksijenin bu özelliği onun diğer serbest radikallerle kolayca reaksiyona girmesini sağlarken, radikal olmayan maddelerle ise nispeten daha yavaş tepkime vermesini sağlar. Oksijenin kısmi indirgenmesi sonucu çok sayıda reaktif ürün oluşmasına rağmen son indirgenme ürünü sudur.

32 Serbest radikal çeşitleri Süperoksit Radikali (O 2 ): Hemen hemen tüm aerobik hücrelerde enerji metabolizmasında, oksidasyon sırasında ya da oksidazlar gibi bazı enzimlerin aktivitesi sonucunda oksijenin bir elektron alması sonucu serbest süperoksit radikal anyonu (O 2 ) meydana gelir. O 2 + e O 2 Süperoksit bir radikal olmakla birlikte, kendisi direkt olarak zarar vermez. Süperoksitin zararlı etkileri çok iyi anlaşılamamasına rağmen, yüksek derecede toksik olduğuna dair birçok deliller bulunmaktadır 167,168. Oksidatif hasarda nadiren rol almalarının nedeni hızlı bir şekilde süperoksit dismutaz (SOD) enzimi tarafından hidrojen perokside (H 2 O 2 ) dönüştürülmeleridir. Buna ilaveten asidik durumlarda H 2 O 2 ve peroksil (HO 2 ) radikalleri üreten spontan protonasyona da uğrarlar 168. Süperoksit radikallerinin asıl zararları, yukarıda da bahsedildiği gibi hidrojen peroksit kaynağı ve geçiş metalleri iyonlarının indirgeyicisi olmalarıdır. O 2 + O2 + 2H + H 2 O 2 + O 2 Süperoksit fizyolojik bir serbest radikal olan nitrik oksit ile birleşmesi sonucu reaktif bir oksijen türevi olan peroksinitrit meydana getirir. O 2 + NO ONOO Böylece NO deaktive edilmiş olur. Bununla beraber, peroksinitritlerin doğrudan proteinlere zararlı etkilerinin yanı sıra azot protoksit (NO 2 ), hidroksil radikali (OH ) ve nitronyum iyonu (NO + ) gibi başka toksik ürünlerin oluşumunu katalizlerler. Süperoksit anyonu hem oksitleyici (yükseltgeyici) hem de indirgeyici özelliğe sahiptir. Adrenalin, dopamin, askorbat ve hidroksil amini oksitler, nitrobluetetrazolium

33 33 ve sitokrom C'yi indirger. Redüktan (indirgeyici) olarak görev yaptığında, ferrisitokrom C nin redüksiyonunda bir elektron kaybeder ve oksijene okside olur. Oksidan olarak görev yaptığında ise epinefrinin oksidasyonunda bir elektron alır ve hidrojen perokside indirgenir 166. Süperoksit ile perhidroksil radikali birbirleriyle reaksiyona girince biri okside olurken diğeri indirgenir. Bu dismutasyon reaksiyonu sonucu oksijen ve hidrojen peroksit meydana gelir 142. HO 2 + O 2 + H + H 2 O 2 + O 2 Diğer taraftan indirgenmiş geçiş metallerinin oto oksidasyonu da süperoksit meydana getirebilmektedir 141. Fe +2 + O 2 Fe +3 + O 2 Cu + + O 2 Cu +2 + O 2 Bu reaksiyonlar geriye dönüşlü redoks reaksiyonları olarak kabul edilmektedir ve serbest radikal reaksiyonlarının hızlanmasında çok büyük öneme sahiptir 161. Hidrojen Peroksit (H 2 O 2 ): Asidik ortamda moleküler oksijenin çevresindeki moleküllerden iki elektron alması veya süperoksitin bir elektron alması sonucu hidrojen peroksit meydana gelir 142,169. O 2 + e - + 2H + H 2 O 2 O 2 + 2e - + 2H + H 2 O 2 Ancak biyolojik sistemlerde hidrojen peroksidin asıl üretimi süperoksitin dismutasyonu ile olur. Süperoksit molekülü proton alarak hidrojen peroksit ve moleküler oksijeni oluşturur 141. Bu dismutasyon ya spontandır ya da süperoksit dismutaz enzimi tarafından katalizlenir. Spontan dismutasyon ph 4,8 de en hızlıdır.

34 34 Süperoksit dismutaz tarafından katalizlenen dismutasyon ise daha geniş bir ph aralığında olur. 2O 2 + 2H + H 2 O 2 + O 2 H 2 O 2 kendi başına serbest radikal değildir, çünkü ortaklanmamış bir elektron içermemektedir 167,170. Hidrojen peroksit serbest bir radikal olmadığı halde, reaktif oksijen türleri içine girer ve serbest radikal biyokimyasında önemli bir rol oynar. Çünkü Fe ve Cu gibi geçiş metalleri varlığında süperoksit ile reaksiyona girerek en reaktif ve zarar verici serbest oksijen radikali olan hidroksil radikali oluşturmak üzere kolaylıkla yıkılabilir 142. Fe +2 veya H 2 O 2 + O 2 OH + OH + O 2 Cu + Bu reaksiyona Haber - Weiss reaksiyonu adı verilir. Haber - Weiss reaksiyonu katalizör varlığında veya katalizörsüz cereyan eder. Fakat katalizörsüz reaksiyon oldukça yavaş ilerler. Demirle katalizlenen ikinci şekli ise çok hızlıdır. Bu reaksiyonda önce ferri demir (Fe +3 ) süperoksit tarafından ferro demire (Fe +2 ) indirgenir. Sonra bu ferro demir kullanılarak Fenton reaksiyonu ile hidrojen peroksitten OH ve OH - üretilir 156. Reaksiyon mekanizması aşağıdaki şekildedir 141. O 2 + Fe +3 O 2 + Fe +2 Fe +2 + H 2 O 2 Fe +3 + OH + OH Hidroksil Radikali (OH ): Suyun hidroliziyle (yüksek enerjili iyonize edici reaksiyona maruz kalması) ya da parçalanmasıyla hidrojen radikalleri ve hidroksil radikalleri oluşturabilir Hidroksil radikali (OH ) hidrojen peroksidin geçiş metallerinin varlığında indirgenmesiyle de (Fenton reaksiyonu) meydana gelir 142. H - O H H + OH

35 35 Son derece reaktif bir oksidan radikaldir. Oluştuğu yerde büyük hasara neden olur. Hidroksil radikali birçok biyolojik molekülden hidrojen atomu koparır. Bunlardan birisi de tiollerdir. R-SH + OH RS + H 2 O. Meydana gelen sülfür radikali oksijenle birleşerek RSO 2 ve RSO. gibi oksisülfür radikallerini meydana getirir. Bu radikaller de biyolojik moleküllerde hasar yapıcı etkiye sahiptir. Belki de hidroksil radikalinin en iyi tanımlanmış biyolojik hasarı lipit peroksidasyonunu artırmasıdır. Bu durum hidroksil radikallerinin membranlara yakın bir yerde üretilmesi ve membran fosfolipid zincirinin yağ asidi tabakasına atak yapması ile meydana gelir. Bu radikalin araşidonik asit gibi doymamış yağ asitlerine olan ilgisi daha fazladır. Singlet Oksijen ( 1 O 2 ): Singlet oksijen ( 1 O 2 ) ortaklanmamış elektronu olmadığı için radikal olmayan reaktif oksijen molekülüdür. Serbest radikal reaksiyonları sonucu meydana geldiği gibi serbest radikal reaksiyonlarının başlamasına da sebep olur. Singlet oksijen elektronlarından birinin enerji alarak ters spinli başka bir orbitale uyarılması sonucu oluşur 166. Nitrik oksit (NO. ) ve nitrojen dioksit (NO. 2 ): Nitrik oksit ve nitrojen dioksit eleşmemiş elektronları ile birer radikaldirler. Nitrojen dioksit, nitrik oksitin oksijen ile reaksiyona girmesi sonucu meydana gelir. NO 2 oldukça zehirli ve çok güçlü bir oksidandır. Oksijen redüksiyonu sırasında NO 2 ye maruz kalması durumunda araşidronik asit metabolizmasının NO 2 konsantrasyonuna bağlı olarak değiştiği görülmektedir. Düşük miktarda NO 2 nin araşidronik asit metabolizmasını büyük oranda artırdığı gözlenmiştir

36 36 Nitrik oksit L-arjinin amino asitinden in vivo olarak üretilmektedir. NO kokusuz, renksiz ve az indirgenebilen oksidan bir gazdır. Son yıllarda radikal olan nitrik oksit üzerinde oldukça fazla durulmaya başlanmıştır. Nitrik oksit eleşmemiş elektronları sayesinde süperoksit, thiol grupları ve nitrojen dioksit ile hızlı reaksiyonlar oluşturmaktadır. Diğer radikallerle birlikte diabetes mellitus, septik şok, kalp bozuklukları, Alzheimer hastalığı ve gastrik ülserlerin oluşumunda etkili olduğu düşünülmektedir 171,172,174. 2NO + O 2 2NO 2 ya da NO + O 2 NO 2 O NO ONOO - ( peroksinitrit) ONOO - + H +. OH + NO 2 Diğer Radikaller: Serbest oksijen radikallerinin etkisi sonucu karbon merkezli radikaller (R ), peroksil radikalleri (ROO ), alkoksil radikalleri (RO ), tiyol radikalleri (RS ) gibi önemli serbest radikaller de oluşabilir. Bunlardan özellikle polidoymamış yağ asitlerinden meydana gelen peroksil radikali yarı ömrü uzun olan bir radikaldir. Tiyol radikalleri ise oksijenle tekrar reaksiyona girerek sülfenil (RSO ) veya tiyol peroksil (RSO 2 ) vb. gibi radikalleri oluşturabilirler Serbest radikal kaynakları Biyolojik kaynakları: - Aktive olmuş fagositler: (Respiratory Burst) 141, Antineoplastik ajanlar: Nitrofurantoin, bleomisin, doksorubisin ve adriamisin. - Radyasyon Bağımlılık yapan maddeler: Alkol ve uyuşturucular.

37 37 - Çevresel Ajanlar: Hava kirliliği yapan fotokimyasal maddeler, hiperoksitler, pestisitler, sigara dumanı, solventler, anestezikler ve aromatik hidrokarbonlar. - Stres: Streste katekolamin düzeyi artar. Katekolaminlerin oksidasyonu ise serbest radikal kaynağıdır. Bu olay, stresin hastalıkların patojenezindeki rolünün serbest radikal üretimiyle ilgili olabileceğini göstermesi bakımından önemlidir. İntrasellüler kaynakları: a- Küçük moleküllerin otooksidasyonu: Tioller, hidrokinonlar, katekolaminler, flavinler, tetrahidropterinler, antibiyotikler 169,170,175. Enzimler ve proteinler: Ksantin oksidaz, dioksijenaz, hemoglobin. Birçok enzimin katalitik siklusu esnasında serbest radikaller açığa çıkar. Ksantin oksidaz serbest radikal oluşturan enzimler içinde en çok araştırılmış olanıdır 141. Normalde NAD (Nikotinamid adenin dinükleotid) bağımlı dehidrojenaz olarak etki eder ve herhangi bir serbest radikal üretimine sebep olmaz. Fakat in vivo olarak oluşturulan iskemi, enzimin dehidrojenaz formundan oksidaz formuna dönüşmesine ve süperoksit radikalinin üretimine sebep olur 169. Aldehit oksidaz da yapı itibariyle ksantin oksidaza benzer ve substratlarının çoğu aynı olup, süperoksit radikali üretir. Benzer şekilde triptofan dehidrojenaz gibi enzimler de radikal oluşumuna sebep olurlar 141,176. b- Mitokondriyal elektron transportu: Normalde hücrelerde en büyük serbest radikal kaynaklarından biri elektron transport zincirinden elektron sızıntısıdır. Mitokondri iç zarında yerleşmiş oksidatif fosforilasyon zinciri bileşenleri büyük oranda indirgendiği zaman mitokondriyal süperoksit radikal üretimi artar 141. Böylece NAD + bağlı substratlar, süksinat, ADP (Adenozin di fosfat) ve oksijen gibi endojen faktörler oksidatif fosforilasyonu regüle ederek mitokondriyal radikal üretimine etki ederler.

38 38 c- Endoplazmik retikulum ve nükleer membran elektron transport sistemleri: Endoplazmik retikulum ve nükleer membranda ise serbest radikal üretimi membrana bağlı sitokromların oksidasyonundan kaynaklanır. Membrana bağlı sitokrom P 450 ve b 5, doymamış yağ asitleri ve ksenobiyotikleri redükte ederken dioksijen ve diğer substratları ise okside ederler. d- Peroksizomlar, oksidazlar, flavoproteinler: Peroksizomlar çok önemli hücre içi H 2 O 2 kaynağıdırlar. Bu organeldeki D-amino asit oksidaz, ürat oksidaz, L-hidroksil asit oksidaz ve yağ asidi açil COA oksidaz gibi oksidazlar süperoksit üretmeden bol miktarda H 2 O 2 üretimine sebep olurlar. Ancak peroksizomlarda katalaz aktivitesi de çok yüksek olduğu için bu organelden sitozole ne kadar H 2 O 2 geçtiği bilinmemektedir 141. e- Aktive olmuş fagositler: Bakterisidal rollerinin sonucu olarak süperoksit üretirler 142,145,146. f- Plazma membranı: Plazma membranı serbest radikal oluşum reaksiyonlarının kritik bir bölgesidir. Ekstraselüler olarak üretilen serbest radikaller diğer hücre bileşenleri ile reaksiyona girmeden önce plazma membranını geçmek zorundadırlar. Bu geçiş sırasında membranda toksik maddeleri üreten reaksiyonlar başlatabilirler. Membrandaki fosfolipitlerin, glikolipitlerin, gliseridlerin ve sterollerin bünyesinde bulunan ve doymamış yağ asitleriyle okside olabilen transmembran proteinleri serbest radikal hasarından çabuk etkilenirler. Lipit peroksidasyonu veya yapısal olarak önemli proteinlerin oksidasyonunun sebep olduğu artmış membran permeabilitesi; transmembran iyon gradiyentinin bozulmasına, sekretuar fonksiyonlarının kaybına ve intresellüler metabolik olayların inhibisyonuna sebep olur 141. Hidrojen peroksit, membranları neredeyse su kadar kolay geçebilme özelliğine sahiptir. Saldırgan O 2 radikal anyonu ise membranları ve transmembranal anyon

39 39 kanallarını geçerek hücreye girer. Aynı zamanda polianyonik hücre yüzeyi, çevre doku sıvısından 2 3 ph daha düşük olduğu tahmin edilen, bir mikro çevre sağlayan, çoğu çözünmüş H + den oluşan son derece zıt bir konsantrasyonu çeker. Bu pratik çevre O 2 nin protonla reaksiyonu sonucu perhidroksil radikalinin oluşumunu sağlar 141. H + + O 2 HO 2 HO 2, O 2 den daha güçlü bir oksidandır, bu nedenle lipitlerin ve proteinlerin hidrofobik kısımlarını daha iyi parçalayabileceği ve toksik etkisinin daha fazla olabileceği düşünülmektedir. Bu sebeple saldırgan oksijen radikallerine karşı bir bariyer oluşturan hücre yüzeyleri, diğer radikal türlerini reaktif bir forma modifiye eden ve daha permeabl bir kapı görevi görür. Serbest radikallerin fagositik hücre plazma membranında, NADPH (Nikotinamid adenin dinükleotid hidrojen fosfat)-oksidaz aracılı üretimi, serbest radikallerin önemli bir biyolojik kaynağıdır 142. Fagosit kökenli serbest radikaller hem oluştukları hücreye, hem de yakınında bulunan hücrelere hasar verirler. Lipoksijenaz ve siklooksijenaz gibi plazma membranıyla bağlantılı enzimler ile mikrozomlar tarafından serbest radikal üretimi, bu enzimlerin predominant substratı olan araşidonik asit metabolizması ile ilişkili pek çok yeni buluş ve biyolojik açıdan önemli ürünlerin meydana gelmesinden dolayı ilginçtir. Bu ürünler prostaglandinleri, tromboksanları, lökotrienleri ve anaflaksinin slow-reakting substratını içerir (Şekil 4). Son zamanlarda araşidonat metabolizmasında yer alan bu enzimatik olayların otokatalitik lipit peroksidasyonuna öncülük etmesi bu konuya olan ilgiyi artırmıştır 141.

40 40 Araşidonik Asit Siklooksijenaz (COX) 5- Lipooksijenaz Prostaglandin H OH. Porfirin Radikali Peroksitler Serbest radikal ara ürünleri 5-HPETE Prostaglandinler Tromboksan Prostasiklinler Lökotienler Şekil 4. Araşidonik asit metabolizması esnasında üretilen serbest radikaller Şekil 4 dende anlaşılacağı gibi araşidonik asit metabolizması reaktif oksijen metabolitlerinin önemli bir kaynağıdır 141. Araşidonik asitin biyoaktif ürünlere dönüşümü esnasında geniş spektrumlu oksijen, karbon ve hemoprotein radikalleri oluşur ve bunlar doku hasarına yol açarlar 177. Prostaglandin sentezi esnasında hidroksil radikali veya diğer radikallerin üretimi, siklooksijenazın (COX) feed-back regülasyonuna yol açar, prostaglandin biyosentezinin hız ve süresini modüle eder ve prostaglandin sentezinden sonra ikinci ulak ve sitotoksik etkilerini hızlandırır. COX, ksenobiyotikleri daha toksik türlere metabolize etme yeteneğine de sahiptir 157,178. Trombositlerde tromboksan sentezinin imidazol ve nordihidroguiaretik asit gibi radikal toplayıcılarla inhibe edilmesi, prostaglandin endoperoksitinin tromboksanlara dönüşümünün bir serbest radikal reaksiyonu sonucu olabileceği düşüncesini kuvvetlendirmektedir 141. Lipoksijenaz kaynaklı peroksitler oksidan-sensitif

41 41 siklooksijenaz aktivitesini değiştirebilir 178. Bu sebeple, prostaglandin ve tromboksanların biyosentezi, biyosentetik enzimin kendisi ve diğer hücre komponentleri ile reaksiyon yeteneğine sahip hemoprotein-oksijen ve karbon merkezli serbest radikallerin oluşmasıyla sonlanır. Yukarıdaki bilgilere dayanarak serbest radikallerle prostaglandin metabolizması birbirleriyle yakından ilişkili olduğunu kolayca söyleyebiliriz. Reaktif oksijen metabolitleri fosfolipaz aktivasyonu yolu ile prostaglandin E 2, F 2, 6-keto PGF1 ve TXB 2 sentezini gerçekleştirirler. PGE 2 ve I 2 adenilat siklazı aktive ederek camp sentezini artırırlar ki, süperoksit de camp sentezini artırıcı etkiye sahiptir. Bu bilgiler reaktif oksijen türlerinin prostaglandin sentezi yolu ile camp konsantrasyonunu artırdıklarını doğrulamaktadır Hayvan hücrelerinde süper oksitin bir başka kaynağı da askorbik asit, tioller (sistein gibi), adrenalin ve flavin koenzimleri gibi bileşiklerin oto oksidasyonudur Oksidatif stres yapıcı durumlar: İskemi, travma, intoksikasyon 166. Hücrelerde serbest radikal üretimi bazı yabancı toksik maddeler tarafından da büyük oranda artırılabilir. Bu tip maddeler dört grupta toplanmıştır Toksinin kendisi bir serbest radikaldir. Kirli havanın koyu rengini veren azot dioksit 149 gazını buna örnek verebiliriz. NO 2 gazı radikalik bir madde olup aynı zaman da iyi bir lipit peroksidasyonu başlatıcısıdır. 2- Toksin bir serbest radikale metabolize olur. Mesela toksik bir madde olan karbontetraklorür (CCl 4 ) karaciğerde sitokrom P 450 tarafından triklorometil (CCI 3 ) serbest radikaline dönüştürülür. Bu radikalin oksijenle reaksiyonu sonucu meydana gelen peroksil radikali de güçlü bir lipit peroksidasyonu başlatıcısıdır. CCl 3 + O 2 CCl 3 O 2

42 42 3- Toksinin metabolizması sonucu serbest oksijen radikali meydana gelir. Bunun tipik bir örneği paraquattır. 4- Toksin antioksidan aktiviteyi düşürür. Mesela parasetamolün karaciğerde sitokrom P 450 tarafından metabolizması sonucu oluşan ürün glutatyon ile reaksiyona girer ve miktarını azaltan bir ürün meydana getirir Serbest radikallerin etkileri Serbest radikaller hücrelerin lipit, protein, DNA, karbohidrat ve enzim gibi tüm önemli bileşenlerine etki ederler. Mitokondrideki aerobik solunumu ve kapiller permeabiliteyi bozarlar ve hücrenin potasyum kaybını ve trombosit agregasyonunu artırırlar. Proteaz, fosfolipaz, elastaz, siklooksijenaz, ksantin oksidaz, Lipoksijenaz, triptofan dioksijenaz ve galaktoz oksidaz gibi litik enzimleri aktifleştirirken alfa 1- antitripsin gibi bazı savunma sistemlerini de inaktive ederler 167. Membran lipitlerine etkileri (Lipit peroksidasyonu): Biyomoleküllerin tüm büyük sınıfları serbest radikaller tarafından etkilenmesine karşın, bunlar arasında en hassas olanı lipitlerdir. Membranlardaki kolesterol ve yağ asitlerinin doymamış bağları serbest radikallerle kolayca reaksiyona girerek peroksidasyon ürünleri oluştururlar. Polidoymamış yağ asitlerinin (PUFA) oksidatif yıkımı lipit peroksidasyonu olarak bilinir ve oldukça zararlıdır. Çünkü lipid peroksidasyonu kendi kendini devam ettiren zincir reaksiyonu şeklinde ilerler ve bu otokatalitik reaksiyon sonucu lipit peroksit, lipit alkol ve aldehitler gibi istenmeyen yan ürünler oluşur 141,179. Lipid peroksidasyonu, organizmada oluşan bir serbest radikalin etkisi sonucu membran yapısında bulunan polidoymamış yağ asidi zincirinden bir hidrojen atomu

43 43 uzaklaştırılmasıyla başlar. Bunun sonucu yağ asidi zinciri bir lipid radikali niteliği kazanır. Oluşan lipid radikali kararlı değildir ve bir dizi değişikliğe uğrar. Molekül içi çift bağların pozisyonlarının değişmesiyle konjuge dienler ve takibinde lipid radikalinin moleküler oksijenle etkileşmesi sonucu da lipid peroksit radikali meydana gelir. Bu, membran yapısındaki diğer polidoymamış yağ asitlerini etkileyerek yeni lipid radikallerinin oluşumuna yol açar. Lipit peroksit radikalleri de açığa çıkan hidrojen atomlarını alarak hidroperoksidlere dönüşürler 166. Plazma membranı ve organel lipid peroksidasyonu, serbest radikal kaynaklarının tümüyle stimüle edilebilir ve metal varlığında katalizlenebilir 141. Lipid hidroperoksidleri yıkıldığında çoğu biyolojik olarak aktif olan aldehidlere dönüşür. Bu bileşikler ya hücre düzeyinde metabolize edilirler ya da hücrenin diğer kısımlarına yayılarak zarar verirler 166. Lipid radikallerinin hidrofobik yapıda olması yüzünden reaksiyonların çoğu membrana bağlı moleküllerde meydana gelir. Bundan da membran permeabilitesi ve mikrovizkozitesi ciddi bir şekilde etkilenir. Proteinlere etkileri: Serbest radikallerin doymamış ve sülfür içeren moleküllerle olan reaktivitesi sebebiyle, triptofan, tirozin, fenil alanin, histidin, metiyonin ve sistein gibi amino asit içeren proteinler bu serbest radikallerden kolayca etkilenirler. Bu etkilenmenin sonucunda da sülfür radikalleri ve karbon merkezli radikaller oluşur 141. Bu istenmeyen reaksiyonlar sonucu immünoglobulin G ve albümin gibi çok sayıda disülfid bağı bulunduran proteinlerin üç boyutlu yapıları bozulur ve normal fonksiyonlarını yerine getiremezler. Nitekim serum proteinlerinde, kataraktlı lens proteinlerinde ve enflamatuar eklem hastalığı olan kişilerin sinoviyal sıvılarındaki IgG lerinde serbest radikal hasarı tespit edilmiştir 166. Sitoplazmik ve membran proteinleri, ozon ve protoporfirin IX gibi okside edici ajanlara maruz kaldıktan sonra çapraz bağlanarak

44 44 dimerleşir veya büyük agregatlara dönüşür. Prolin ve lizin; süperoksit radikali, hidrojen peroksit ve hidroksil radikali üreten reaksiyonlara maruz kaldıklarında nonenzimatik hidroksilasyona uğrayabilmektedirler 166. Hem proteinleri de serbest radikallerden. önemli oranda zarar gören proteinlerdendir. Örneğin; oksi hemoglobinin O - 2 veya H 2 O 2 ile reaksiyonu methemoglobin oluşumuna sebep olmaktadır 141,142.. O HbFe +2...O 2 2H + Hb-Fe +3 + H 2 O 2 + O 2 H 2 O 2 + 2Hb-Fe +2 -O 2 2H + 2Hb-Fe H 2 O + O 2 Nükleik asit ve DNA ya etkileri: İyonize edici radyasyonla oluşan serbest radikaller DNA yı etkileyerek hücrede mutasyona ve ölüme yol açarlar. Sitotoksite büyük oranda, nükleik asit baz modifikasyonundan doğan kromozom değişikliklerine veya DNA daki diğer bozukluklara bağlıdır 140,166. OH. radikalinin hem prokaryotik hem de ökaryotik hücrelerde, radyasyonun sebep olduğu hücre ölümünden büyük oranda (% 80 oranında) sorumlu bir ajan olduğu düşünülmektedir 141. Aktivite olmuş nötrofillerden kaynaklanan H 2 O 2 membranlardan kolayca geçtikten sonra hücre çekirdeğine ulaşarak DNA hasarına, hücre disfonksiyonuna ve hatta ölümüne yol açabilir. Bu yüzden DNA serbest radikallerden kolay zarar görülebilen açık bir hedeftir. Süperoksite maruz kalan DNA molekülleri hayvanlara enjekte edildiğinde daha fazla antijenik özellik gösterirler ki bu oldukça önemli bir etkidir. Çünkü otoimmün bir hastalık olan sistemik lupus eritematosuz (SLE) ve romatoid artritte (RA) dolaşımında anti-dna antikorları bulunur. Süperoksit ve hidrojen peroksitin enzimatik toplayıcıları, (. OH) prekürsörlerinin konsantrasyonunu azaltarak DNA yı korur 166.

45 45 Karbohidratlara etkileri: Serbest radikallerin karbohidratlar üzerine de önemli etkileri vardır. Monosakkaritlerin oto oksidasyonu sonucu hidrojen peroksit, peroksitler ve okzalaldehitler meydana gelir. Bu maddeler diyabet ve sigara içimi ile ilişkili kronik hastalıkların patolojik proseslerinde de önemli rol oynarlar 166. Okzalaldehitler DNA, RNA ve proteinlere bağlanabilme ve aralarında çapraz bağlar oluşturabilme özelliklerinden dolayı antimitotik etkiye sahiptirler. Böylece kanser ve yaşlanma olaylarında da önemli rol oynarlar 166. Serbest radikaller enflamatuar cevap ve sekonder doku hasarının modülasyonunda da önemli rol oynar. İltihap hücreleri ile ilişkili doku hasarında risk altında bulunan kollagen ve hiyaluronik asit gibi ekstraselüler doku komponentlerinin, enflamatuar osteoatiritle etkilendikleri görülmüştür 141. Kıkırdak dokunun esas öğesi olan kollagen O 2 ile hasarlanır ve jelasyonu önlenir 162. SOD kollagen jelasyonunu süperoksit inhibisyonundan korur. Eklem sıvısının vizkositesinin devamı için gerekli olan hiyaluronik asit O 2 ile depolimerize edilebilir 180,181. O 2, H2 O 2 ve OH. toplayıcıları süperoksit oluşturan sistemden hyaluronik asitin depolimerizasyonunu önler. ekstraselüler sıvının çok düşük seviyede SOD ve CAT aktivitesine sahip olması nedeniyle redükte oksijen türlerinin küçük miktarları bu bölümlerde yaygın hasara sebep olabilirler 141. Revers, pasif Arthus reaksiyonunun, carragenan le indüklenen bacak ödeminin inhibisyonu aktive olmuş lökositlere bağlı akciğer kapiller endotelyal hücre hasarı ve pulmoner ödemin azalması süperoksit dismutazın antiinflamatuar etkilerinin örnekleridir 144,153.

46 Antioksidan savunma sistemleri: Antioksidan savunma sistemleri başka deyişle antioksidanlar reaktif oksijen türlerinin oluşumu ve bunların meydana getirdiği hasarı önlemek için vücutta birçok savunma mekanizmaları geliştirmiştir. Antioksidanlar, endojen ve ekzojen kaynaklı olabilmektedirler. Antioksidanlar aynı zamanda serbest radikal oluşumunu engelleyen ve mevcut radikalleri etkisiz hale getirenler şeklinde de ikiye ayrılırlar. Ayrıca enzim ve enzim olmayanlar şeklinde de sınıflandırılan antioksidanlar hücrelerin hem sıvı hem de membran kısmında bulunurlar Endojen Antioksidanlar: Primer Antioksidanlar (Enzimler): Katalaz (CAT) (EC ): Doğada yaygın bir şekilde mevcut olup, ilk defa 1901 'de O. Leew tarafından bulunmuştur. Yine ilk defa 1937'de Summer ve Dounce tarafından karaciğerden kristal formda izole edilmiştir. Molekül kütlesi Daltondur. Dört alt üniteden oluşmuştur. Peroksizomlarda, lizozomlarda ve mitokondride bulunur. Kandaki CAT aktivitesi büyük ölçüde eritrositlerden kaynaklanmaktadır. Bu nedenle insan eritrositleri CAT yönünden çok zengindir. GPx esas olarak mitokondri ve sitozolde bulunurken, CAT peroksizomlarda bulunur. Eritrositlerde mitokondri olmadığı halde yüksek aktivitede CAT ve GPx vardır. CAT, 4 tane hem grubu bulunan bir hemoproteindir. Peroksidaz etkinliğine sahip olmasına ek olarak bir molekül H 2 O 2 yi elektron verici substrat, diğer H 2 O 2 yi ise elektron alıcı substrat olarak kullanabilir. Peroksizomal enzimler, mitokondriyal ve mikrozomal elektron taşıyıcı sistemler ve keza ksantin oksidazın H 2 O 2 kaynağı olarak kabul edilmesi zorunludur 182.Büyük

47 47 moleküllü lipit hidroperoksidlere etki etmezken, hidrojen peroksidi oksijen ve suya parçalar 163. CAT 2H 2 O 2 2H 2 O + O 2 Glutatyon peroksidaz (GPx) (EC ): GPx hidroperoksidlerin indirgenmesinden sorumlu, tetramerik 4 selenyum atomu ihtiva eden sitozolik bir enzimdir. Memeli eritrositlerinden ilk defa Mills ve arkadaşları tarafından karakterize edilmişlerdir. Daha sonra yapılan araştırmalarla enzim hakkındaki bilgiler artırılmıştır. Baskın olarak sitozolik bir enzimdir ve mitokondride düşük düzeylerde bulunur. GPx aktivitesindeki azalma, hidrojen peroksitin ve lipit peroksitlerin artmasına ve bu da hücre hasarına yol açar. GPx'in beyin düzeyleri düşüktür. Prostetik grup olarak selenyum (Se) içeren metalloenzimdir. Beyinde, beyin selenyumunun çok az bir kısmını içerdiğinden dolayı diyetle elde edilebilirliğhn en çok fazla etkilenmez. GPx sitozolik hasara karşı etkin koruyucu bir mekanizma sağlar. Bu enzim, H 2 O 2 'i ve lipit peroksitlerini GSH'yi kullanarak redüksiyon yoluyla uzaklaştırır. GPx aşağıdaki reaksiyonları katalize eder 140. H 2 O 2 + 2GSH GPx GSSG + 2H 2 O ROOH + 2GSH GPx GSSG + ROH + H 2 O Fosfolipid hidroperoksit glutatyon peroksidaz da (PLGPx) monomerik, selenyum atomu ihtiva eden sitozolik bir enzimdir. Membran fosfolipid hidroperoksitlerini alkollere indirger 140,166.Membrana bağlı en önemli antioksidan olan vitamin E yetersiz olduğu zaman, PLGPx membranı peroksidasyona karşı korur. Süperoksit dismutaz (SOD) (EC ): Süperoksitin, hidrojen peroksit ve moleküler oksijene dönüşümünü katalizleyen bu enzim, beyinde yaygın bir şekilde

48 48 bulunur ve aktivitesi yaş artışıyla beraber artar. İnsanlarda iki tipi vardır. Bunlar sitozolde bulunan dimerik Cu ve Zn ihtiva eden Cu,Zn-SOD ile mitokondri de bulunan ve tetramerik Mn ihtiva eden Mn-SOD 140 izomerleridir. Mitokondriyal SOD hemen hemen total SOD nin % 60 'ini içerir. Zira süperoksit sitozole göre mitokondride hemen hemen iki kat daha fazla oluşur. Tüm SOD'ler fizyolojik şartlarda 140,141 birbirlerinin izomeridir. SOD nin Fe ihtiva eden izomeri (Fe-SOD) ise sadece mikroorganizmalarda ve bazı bitkilerde bulunur. Genel olarak hücrede en bol bulunan izomer sitozolik Cu, Zn-SOD dir. Cu, Zn- SOD ilk defa, 1969'da, Mc Cord ve Fridovic tarafından hayvan, bitki dokuları ve mayadan saflaştırılmış ve tanımlanmıştır. Molekül kütlesi daltondur. İki alt ünitesi vardır ve bunların her birinde bir Cu ve bir Zn atomu bulunmaktadır. Ayrıca her alt birimde bir zincir içi disülfür köprüsü, bir sülfidril grubu ve bir de asetillenmiş terminal amino grubu bulunmaktadır. Cu/Zn-SOD enziminin ayrı formları bulunmaktadır. Mn-SOD mitokondrial bir enzimdir ve prokaryatların sitozolünden elde edilebilmektedir. İlk kez 1970 yılında Kedde ve arkadaşları tarafından izole edilmiştir. Buradaki mangan, +3 değerliklidir ve iki alt birimden oluşmuştur. Her alt birimde bir Mn atomu vardır ve dalton süperoksite karşı etkin bir koruma sağlarlar 168. Her iki enzimin katalizlediği reaksiyon aynıdır. Enzimin fizyolojik fonksiyonu lipit peroksidasyonunu inhibe ederek oksijeni metabolize eden hücreleri süperoksit serbest radikallerinin zararlı etkilerine karşı korumaktır 140,141. Normalde metabolizma sırasında hücreler tarafından fazlaca süperoksit üretilmesine rağmen bu enzim sayesinde intrasellüler düzeyleri düşük tutulur. SOD fagosite edilmiş bakterilerin intrasellüler öldürülmesinde de rol oynar. Bu yüzden SOD granülosit fonksiyonu için çok önemlidir. Lenfositlerde de granülositlerden daha fazla oranda SOD bulunur.

49 49 Fagositik hücrelerin solunum patlaması NADPH-Oksidazı kapsar ve bakterilerin öldürülmesine yardım eder, yani nötrofiller ve diğer fagositik hücreler bakterileri yuttuğunda oksijen tüketiminde ani bir artış görülür bu olay solunum patlaması olarak bilinir. Bu hızlı oksijen tüketimi olayı (15 20 saniyelik boş bir aradan sonra) O 2 -, H 2 O 2, OH, HOCI - (hipoklorit iyonu) gibi tepki veren türevlerin büyük miktarda üretilmesi ile kendini gösterir. Bu ürünlerden bazıları güçlü mikrop öldürücü ajanlardır. Solunum patlamasından sorumlu elektron taşıma zincir sistemi bir flavoprotein, NADPH: O 2 -oksidoredüktaz (Çoğunlukla NADPH oksidaz olarak bilinir) ve bir b-tipi sitokrom içerir. Bu sistem oksijenin süperoksit anyona tek elektron ile indirgenmesini sağlar. Sistem nötrofiller ve diğer fagositik hücrelerin plazma zarına yerleşiktir. NADPH pentoz fosfat yolu üzerinden üretilir ve bu döngü etkinliği fagositoz sırasında belirgin şekilde artar. 2O H + SOD H 2 O 2 + O 2 Süperoksit iyonu hücre dışına veya yutulan bakteri ile karşılaşacağı fagolizozomlar içine itilir. Bakterilerin fagolizozomlar içinde öldürülmesi görüldüğü kadarıyla artmış ph süperoksit iyonu veya daha ileri oksijen türevlerinin (H 2 O 2, OH, HOCI - ) karma etkisine fagositik hücrelerde bulunan bazı bakterisidal peptidlere (defensinler) ve diğer proteinlerin etkisine bağlıdır. Fagositik hücrenin sitozolüne giren herhangi bir süperoksit yukarıda gösterilmiş olan kendiliğinden dismutasyonun aynı olan bir tepkimeyi kataliz eden SOD etkisiyle H 2 O 2 ye çevrilir. H 2 O 2 daha sonra miyeloperoksidaz (MPx) tarafından kullanılır veya GPx veya CAT ile yok edilir 182. Glutatyon redüktaz (GR) (EC ): Glutatyon redüktaz daltonluk alt birimlere sahip bir dimerdir. Görevi yükseltgenmiş glutatyonu (GSSG) indirgenmiş

50 50 (GSH) hale çevirmektir. Bu indirgenme işlemi sırasında NADPH dan gelen elektronlar okside glutatyonun disülfid bağına direkt olarak transfer edilemezler. Sıklıkla önce NADPH dan sıkıca bağlı bulunan FAD ye transfer edilirler. Daha sonraki alt birimlerdeki 2 sistein arasında bulunan disülfid köprüsüne transfer edilmek suretiyle okside glutatyona aktarılmış olurlar. Her bir subunit 3 tane yapısal alan içerir, bunlar: FAD bağlayıcı olan, NADPH bağlayıcı olan ve ara yüz alanıdır. FAD alanı ve NADP + alanı birbirine benzer ve diğer dehidrojenazlardaki nükleotid bağlayıcı alanlara benzerler. FAD ve NADP + nin izoalloksozin ve nikotinamid halkaları birbirine geçecek şekilde geniş ölçüde aralarında bağlanırlar. Oksidize glutatyon için bağlayıcı alanın bir alt biriminin FAD alanı ile diğer alt birimin ara yüz alanından meydana geldiği belirtmek gerekir 183. GR GSSG + NADPH + H + 2GSH + NADP + Alyuvarlardaki pentoz fosfat yolu ise, GR nin GSSG yi GSH ye çevrimi için gereken NADPH ı sağlar 182. Glutatyon S-transferaz (GST) (EC ): GST ler, sisteinin sülfür atomu üzerinden çeşitli elektrofillere glutatyondan elektron aktaran proteinlerdir. GST, bunun yanı sıra hem, bilirubin, polisiklik aromatik hidrokarbonlar ve deksametazon gibi hidrofobik bileşiklere de yüksek bir afiniteyle bağlanabilmektedir. E.coli den insana kadar çok çeşitli türlerden GST saflaştırılabilirken en çok da sıçan karaciğerinden saflaştırılmıştır. GST ler en az 7 alt üniteden oluşan homodimer veya heterodimerlerdirler. Spesifik GST alt ünitelerinin fenobarbitol, 3-metilşolantren, trans-stilben oksit gibi çeşitli

51 51 ksenobiyotikler tarafından indüklenmesinden ve dokuya spesifik bir tarzda ekspresse olmasından beri, GST gen ailesi gen ekspresyonunun dokuya özel düzenlenmesi ve indüksiyonunun araştırılmasında yararlı bir model sistemi olmuştur 184. GST ler başta araşidonik ve lineolat hidroperoksitleri olmak üzere LPO lara karşı Se-bağımsız GSH peroksidaz aktivitesi koruyucu mekanizma oluştururlar 140. ROOH + 2GSH GST GSSG + ROH + H 2 O GST ler antioksidan aktivitelerine ilave olarak çok önemli biyokimyasal fonksiyonlara da sahiptirler. Katalitik ve katalitik olmayan çok sayıda fonksiyona sahip GST lerin tüm canlı hücrelerde bulunması hayati önemlerinin bir göstergesidir. Hem detoksifikasyon yaparlar, hem de hücre içi bağlayıcı ve taşıyıcı rolleri vardır. Katalitik olarak, yabancı maddeleri glutatyonda ki sisteine ait -SH grubu ile bağlayarak onların elektrofilik bölgelerini nötralize eder ve ürünün daha fazla suda çözünür hale gelmesini sağlarlar. Oluşan bu GSH konjugatları böylece organizmadan atılabilir ve daha ileri bir ürüne metabolize olabilirler. GSH den glutamat ve glisinin koparılmasından sonra sisteinin serbest amino grubu asetillenerek merkaptürik asitlere dönüştürülür 140. Lökotrien C 4 ün sentezi GST tarafından katalizlenmekte olup, GST ler prostaglandin sentezinde PG izomeraz etkisine de sahiptirler 140. Miyeloperoksidaz (MPx): Nötrofil granüllerde bol mitarda bulunan MPx enzimi H 2 O 2 den hipoklorik asit (HOCl) oluşturmak üzere etki eder. Asidik ph oluşumuna bağlı olarak MPx aktivitesi artmakta ve membranı kolayca geçen H 2 O 2 bakteriye toksik etki yapmakta ya da hidroksil (OH. ) radikaline dönüşmektedir. Bu tepkimede HOCl yer

52 52 almaktadır. H 2 O 2 ile MPx Cl - iyonlarını HOCl ye dönüştürmektedir. Çok reaktif olan HOCl birçok biyolojik molekülü oksitlemektedir 185,182. H 2 O 2 + Cl - + H + HOCl + O 2.- HOCl + H 2 O O 2 + OH. + Cl Sekonder Antioksidanlar (Enzim Olmayanlar): Lipit fazda bulunanlar antioksidanlar α(-) tokoferol (E - vitamini) ve β - karoten dir. Sıvı fazda (hücre sitozolü veya kan plazmasında) bulunanlar ise askorbik asit, miyoglobulin, melatonin, hemoglobin, üre, ferritin, sistein, metionin, seruloplazmin, albümin, laktoferrin, bilirubin ve glutatyondur. Glutatyon (GSH): GSH, birçok hücrede bulunur ve bir tripeptiddir. GSH L-glutamat, L-sistein ve glisinden iki basamakta sentezlenir. Oluşan her peptid bağı için bir molekül ATP harcanır 186. Şekil 5. Glutatyon un Molekül Yapısı L-Glutamat + L-Sistein + ATP γ-glutamilsistein sentetaz γ-glutamil sistein + ADP +P i γ-glutamil sistein + Glisin +ATP Glutatyon sentetaz GSH + ADP + P i

53 53 GSH, hemoglobin ve diğer eritrosit proteinlerinde bulunan sistein rezidülerini indirgenmiş halde tutarak sülfhidril tamponu görevini görür. Eritrosit hücrelerinde GSH/GSSG oranı yaklaşık 500 dür. İndirgenmiş glutatyon yani GSH, aktif bölgesinde selenyum iz elementini içeren bir enzim olan GPx enzimi katalizörlüğünde H 2 O 2 ve organik peroksitlerle reaksiyona girerek antioksidan etki sergiler ve H 2 O 2 yi alyuvarlardan uzaklaştırır. H 2 O 2 birikmesi hemoglobinin methemoglobine oksidasyon hızını artırarak alyuvarların yaşama süresini azaltabildiğinden bu tepkime çok önemlidir. Ayrıca alyuvarlarda hemoglobinin methemoglobine otooksidasyonu ile süperoksit oluşurken diğer dokularda ise bu sitokrom P 450 redüktaz ve ksantin oksidaz gibi enzimlerle oluşur 186,182,187. GSH, hidrojen peroksidi veya organik oksitleri kimyasal olarak detoksifiye edebilir. GSH yi peptid bağından dolayı düşük enerjili bileşikler arasında kabul edebiliriz. GSH, hücre proteinlerini indirgemiş şekilde tutan disülfit-sülfidril değişimi tepkimelerinde etki gösterir. Belirli oksidaz tepkimeleriyle oluşan hidrojen peroksidi uzaklaştıran enzim GPx e substratlık yaparak proteinlerin sülfidril gruplarını da korur. GSH yokluğunda hidrojen peroksit birikir. GSSG, GR tarafından sürekli GSH ye indirgenerek GSH miktarı düzenlenir 188. Moleküler oksijenden türeyen oksidatif radikaller iki mekanizmayla uzaklaştırılır. Birincisi, toksik radikallerin enzimatik inaktivasyonudur. Örneğin GPx ve CAT, reaktif oksijen ara ürünlerini suya indirger. İkinci mekanizma ise oksijen radikallerini kimyasal olarak inaktive eden askorbik asit, α-tokoferol ve B-karoten gibi diyetle alınan antioksidanlarla ilgilidir 189. Birçok enzimin şayet sistein tiyol grubu ( SH) oksitlenecek olursa inaktive ya da inhibe olur. GSH, Gama-glutamilsisteinilglisin, duyarlı ve esansiyel SH gruplarını içeren enzimlerin doğal aktivatörüdür. Glutatyon hücrede bir ko-enzimden ziyade var

54 54 olan amino asit öncüllerinden kolayca sentezlenen doğal bir antioksidandır. Fenilalanin ve tirozinin oksidatif yıkımında görev alan maleilasetoasetat izomeraz da dahil olmak üzere glutatyon çok az sayıda enzim için spesifik bir koenzimdir. Glutatyonun hücre içi derişimi kontrol edilerek birçok enzimin aktivitesi düzenlenebilir 188. Diğer sekonder antioksidanlar: İnsan vücudunda oldukça az miktarlarda bulunmasına karşın vitaminlerin vücuttaki etkinlikleri oldukça fazladır. Bunların bir bölümü, besinlerle aldığımız karbonhidrat, yağ ve proteinden enerji ve hücrelerin oluşması ile ilgili biyokimyasal olayların düzenlenmesine yardımcı olurlar. A, E ve C vücut hücrelerinin hasarını önleyerek normal işlevlerini sürdürmeleri ve bazı zararlı maddelerin etkilerinin azaltılmasında (Antioksidan etki) yardımcı olurlar. Antioksidanlar, hücremizi, serbest radikalleri nötürleştirerek korurlar. Bunlar uyum içerisinde çalışan bir takım gibi radikalik saldırılara karşı koyarlar. ß-Karotenin, askorbik asitin ve tokoferolün antioksidan etkileri yıllardan beri bilinmektedir. ß- Karoten organizmada A vitaminin parsiyal oksijen öncülü olmasının yanı sıra bir antioksidan olarak görev yapar. Bununla beraber, 15 torr da 150 torr dan daha iyi antioksidan olduğu, 760 torr da ise prooksidan olarak davrandığı bildirilmiştir. Hücrelerin dışında ß-Karoten nöbet tutarken; hücre duvarından, içeri girmek isteyen saldırganlara karşı savunmaġ ise esar elementlerden selenyumu da yardımıyla E vitaminini üstlenmiştir. Suda çözünen vitaminlerden birisi olan askorbik asit yapı itibariyle en basit vitaminlerden biridir. Bir şeker asidinin laktontndan i"`rettir. Yüksek yapılı hayvanların pek çoğu ve bitkiler kolayca askorbik asidi glukozdan sentezleyebilmektedirler. Hücre içerisindeki C vitamini serbest radikallere son darbeyi vurmakta ve bu şekilde radikallerin tesirleri ortadan kaldırılmaya çalışmaktadır. E

55 55 vitamini yağda çözünen bir vitamin olup temel görevi lipitleri oksidatif hasardan korumaktır. İnce barsaklardan kolayca emilir ve vücudun tüm dokularına taşınarak hücre membranları etrafında depolanır. Böylece hücre membranında koruyucu bir tabaka oluşturmuş olur Ekzojen antioksidanlar: 1. Ksantin oksidaz inhibitörleri: Tungsten, allopürinol, oksipürnol, folik asit ve pterin aldehit 2. Soya fasulyesi inhibitörleri: Ksantin dehidrojenazın proteolitik etki sonucu ksantin oksidaza dönüşümünü inhibe ederler. 3. NADPH oksidaz inhibitörleri: Adenozin, lokal anestezikler, kalsiyum kanal blokerleri, non-steroid antienflamatuar ilaçlar, cetiedil ve difenilin iyodoniyum 4. Recombinant süperoksit dismutaz 5. Troloks-C: E vitamini analoğu 6. Endojen antioksidan aktiviteyi artıran maddeler: Glutatyon peroksidaz aktivitesini artırırlar. Bunlar; ebselen ve asetil sisteindir. 7. Diğer nonenzimatik serbest radikal toplayıcıları: Mannitol ve albümin 8. Demir redoks döngüsünün inhibitörleri: Desferroksamin ve seruloplazmin 9. Nötrofil adezyon inhibitörleri 10. Sitokinler: - Tümör Nekroz Faktör (TNF) - Interlökin Barbitüratlar 12. Demir şelatörleri 191 (BULUCU D,1998).

56 Gıda Antioksidanları - Butillenmiş hidroksitoluen (BHT) - Etoksiguin - Butillenmiş hidroksianisol (BHA) - Propilgalat - Sodyum benzoat - Fe-superoksit dismutaz Antioksidan Etki Tipleri Antioksidanlar dört ayrı şekilde etki ederler 166,190,191 ; 1. Toplayıcı etki (scavenging etki): Serbest oksijen radikallerini etkileyerek onları tutma veya reaktif olamayan yeni bir moleküle çevirme işlemine toplayıcı etki denir. 2. Bastırıcı etki (quencher etki): Serbest oksijen radikalleri ile etkileşip onl`ba bir hidrojen atarak aktivitelerini azaltan veya inaktif şekle dönüştüren etkiye bastırıcı etki denir. 3. Onarıcı etki (repair etki): Genellikle DNA daki hasarların tamir edilmesinde bu etki devamlı geçerlidir. 4. Zincir kırıcı etki (chain breaking etki): Serbest oksijen radikallerini kendilerine bağlayarak zincirlerini kırıp fonksiyonlarını engelleyici etkiye zincir kırıcı etki denir. Serbest radikaller ve bunları etkisizleştirmek için kullanılan veya üretilen antioksidanlar hakkında mevcut bilgiler arttıkça bunlara olan ilgi de bilim adamları tarafından her geçen gün artmaktadır. Bu bağlamda hemen her sahada yapılan çalışmaların antioksidan özellikler ile birlikte değerlendirme çalışmaları da ön plana çıkmaktadır.

57 57 2. MATERYAL VE METOD 2.1.Deneylerde Kullanılan Kimyasallar Deneylerde kullanılan bütün kimyasal malzemeler Sigma Chemicals Company (Germany) den temin edilmiştir. 2.2.Deneylerde Kullanılan Cihazlar Masa santrifüjü : Hettich-EBA 20 Soğutmalı santrifüj UV-Visible Spektrofotometre : Suprafuge 22 - Heraeus Sephatech : Thermo Spectronic-HEλIOS β ph metre : Schott CG 842 Hassas terazi : Scaltec SPB 31 Derin dondurucu : Sanyo MDF Magnetik karıştırıcılar : Boeco MSH 300 Otomotik pipetler Buzdolabı : Eppendorf : Profilo Saf su cihazı : GFL 2012 Çalkalayıcılı su banyosu Liyofilizatör Homojenizatör Döner Buharlaştırıcı (Evaporatör) : Memmert : Labconco : Ika-Werke : BSI

58 Deneylerde Kullanılan Çözeltilerin Hazırlanışı mm ph 7.8, %1 Triton x-100 içeren Fosfat Tamponu (CAT enziminin aktivitesini ölçmek için gereken homojenat tamponu): 1.7 g KH 2 PO 4 ve 25 µl Triton x-100 alınarak 200 ml saf suda çözüldü. ph 7.8 e ayarlanarak son hacim saf su ile 250 ml ye tamamlandı. 2. CAT Ölçüm Karışımı: ph 7 de 40 mm H 2 O 2 içeren 50 mm Fosfat Tamponu: 1020 µl H 2 O 2 ve 1.7 g KH 2 PO ml saf suda çözüldü ve ph 7 e ayarlandıktan sonra son hacim 250 ml ye tamamlandı mm ph 7.8, 10 mm EDTA içeren Fosfat Tamponu (SOD enzimlerinin aktivitesini ölçmek için gereken homojenat tampon): 1.7 g KH 2 PO 4 ve 0.73 g EDTA alınarak 200 ml saf suda çözüldü ve ph 7.8 e ayarlandıktan sonra son hacim saf su ile 250 ml ye tamamlandı. 4. SOD Ölçüm karışımı: A mm Ksantine: g Ksantine alınarak hacmi saf su ile 50 ml ye tamamlandı. B mm EDTA: 0.01 g EDTA alındı ve hacmi 10 ml ye tamamlandı. C µm NBT (Nitro blue tetrazolium): g NBT alınarak 50 ml saf suda çözüldü. D 0.49 M Na 2 CO 3 : 2.59 g alınarak 50 ml saf suda çözüldü. E 1.2 g / L BSA (Bovine Serum Albumine): g tartıldı ve 50 ml saf suda çözüldü U/L Xanthine oksidaz (SOD enziminin aktivitesini ölçmek için gereken çözelti) : Orijinal ambalajından 5.65 µl alındı ve üzerine 43.4 ml (NH 4 ) 2 SO 4 çözeltisi eklendi.

59 M Amonyum sülfat, (NH 4 ) 2 SO 4 ; (SOD enziminin aktivitesini ölçmek için gereken çözelti): 13.2 g (NH 4 ) 2 SO 4 alındı ve 50 ml distile suda çözüldü. (bu çözelti her seferinde taze olarak hazırlandı ve soğuk olarak kullanıldı) mm CuCl 2 (SOD enziminin aktivitesini ölçmek için gereken çözelti): g CuCl 2 alındı ve 100 ml distile suda çözüldü. 8. GPx Homojenat Tamponu (50 mm ph 7.8, 30 mm KCI içeren Fosfat Tamponu): 0,6804 g KH 2 PO 4 ve g KCI alınarak 1-2 damla 5 M NaOH ile 90 ml saf suda çözüldü ve ph 7.8 ye ayarlandıktan sonra son hacim saf su ile 100 ml ye tamamlandı. 9. GPx Ölçüm Karışım: A - 50 mm Fosfat tamponu: g KH 2 PO 4 alınarak hacmi saf su ile 100 ml ye tamamlandı. B - 1 mm EDTA: g EDTA alındı ve hacmi 10 ml ye tamamlandı. (1 damla 5 M NaOH ile çözünür) C 1 mm GSH: g GSH alınarak 10 ml saf suda çözüldü. D 0.2 mm B-NADPH: g alınarak 10 ml saf suda çözüldü. E 1 mm NaN 3 : g tartıldı ve 100 ml saf suda çözüldü. F 1 EU/ml Glutatyon redüktaz: 5,2 µl Glutatyon redüktaz alınır 10 ml saf suda çözüldü. 10. GPx enziminin aktivitesini ölçmek için gereken çözelti (0.25 mm H 2 O 2 ): 25,53 µl H 2 O 2 alınarak ve hacmi 1000 ml ye distile su ile tamamlandı. 11. GSH Homojenat Tamponu ( 50 mm ph 7.4, Tris - HCI Tamponu ): g Tris- HCI alınarak 200 ml saf suda çözüldü ve ph 7.4 e ayarlandıktan sonra son hacim distile su ile 250 ml ye tamamlandı.

60 GSH Ölçüm Tamponu (200 mm ph 8.2, 0,2 mm EDTA içeren Tris-HCI Tamponu): 6,05 g Tris-HCI ve 0,0146 g EDTA alınarak 200 ml saf suda çözüldü ve ph 8.2 ye ayarlandıktan sonra son hacim distile su ile 250 ml ye tamamlandı. 13. GSH miktarını ölçmek için gereken çözelti ( 10 mm DTNB ): 0,03963 g DTNB alındı ve 10 ml ye metanol ile tamamlandı. 14. LPO Homojenatı Tamponu ( % 10 KCI ): 10 g KCI alınarak 100 ml saf suda çözüldü. 15. LPO Ölçüm karışımı: A - % 8 Sodyum lauril sülfat (SLS) : 0,8 gr SLS alınıp distile su ile 10 ml de çözüldü. B - % 0,08 Tiyobabütirik (TBA) : 0,48 gr TBA alınarak 1-2 damla 1 M NaOH ilavesi ile hacmi 60 ml ye tamamlandı. C % 20 Asetik asit: 13 ml glasiyel asetik asit alındı üzerine 65 ml distile su eklendi. 16- MPx Homojenat Tamponu (50 mm ph 6.0, % 0.5 HTAB (MA, hexadecy three methyl ammonium bromide)içeren Fosfat Tamponu: 1.02 g KH 2 PO 4 ve 0.75 g HTAB alınarak 125 ml saf suda çözülür ph 6.0 yapılarak son hacim saf su ile 150 ml ye tamamlandı. 17- MPx Ölçüm karışımı 50 mm KH 2 PO 4 ph 6 sı (MA, ) olan 0,167 mg/ml o- dianizidin-hcl ve % H 2 O 2 içeren 45 ml ölçüm karışımı): A mg/ ml o-dianizidin-hcl 45 ml: (MA, 317.2), 7.5 mg o-dianizidin-hcl B % H 2 O 2 (%30 luk tan) 45 ml: 83,3 µl % 30 luk tan alınır 500 ml ye tamamlandı ve ardından bundan 4,5 ml alındı. C 50 mm KH 2 PO 4 ph 6: 0,3062 gr KH 2 PO 4 alındı.

61 61 Bu üç tartım alınır 40 ml de çözülülerek ph 6 ya ayarlanıp 45 ml ye tamamlandı M Fosfat Tamponu (ph 7). (Bitki ekstraktlarının antioksidant aktivitesini ölçmek için gereken homojenat tampon): 2,72 g KH 2 PO 4 90 ml saf suda çözüldü ve ph 7 e ayarlandıktan sonra son hacim 100 ml ye tamamlandı. 19. Linoleik asit çözeltisi (Bitki ekstraktlarının antioksidant aktivitesini ölçmek için gereken çözelt!:.2804 g lhnoleik asit, g Tween 20 ve 45 ml homojenat tamponu karıştırıldı ve ph 7 e ayarlandıktan sonra son hacim 50 ml ye tamamlandı. 20. %30 Amonyum tiyosiyanat çözeltisi (Bitki ekstraktlarının anthmksidant aktivitesini ölçmek için gerekli çözelti): 4.5 g amonyum tiyosiyanat 15 ml saf suda çözüldü M Fosfat Tamponu, ph 6.6 (Bitki ekstraktlarının indirgeme kuvvetlerini ölçmek için gereken homojenat tampon): 2.72 g KH 2 PO 4 90 ml saf suda çözüldü ve ph 7 e ayarlandıktan sonra son hacim 100 ml ye saf su ile tamamlandı. 22. %1 Potasyum ferrisiyanit çözeltisi (Bitki ekstraktlarının indirgeme kuvvetlerini ölçmek için gereken çözeltisi): g potasyum ferrisiyanit 50 ml saf suda çözüldü. 23. %10 TCA çözeltisi (Bitki ekstraktlarının indirgeme kuvvetlerini ölçmek için gereken çözelti): 5 g TCA 50 ml saf suda çözüldü. 24. % 0.1 Demir III klorür, FeCl 3, çözeltisi (Bitki ekstraktlarının indirgeme kuvvetlerini ölçmek için gereken çözeltisi):0.1 g FeCl ml saf suda çözüldü. 25. % 7.5 Na 2 CO 3 çözeltisi (Bitki ekstraktlarının toplam fenolik bileşiklerini ölçmek için gereken çözeltisi): 7.5 g Na 2 CO ml saf suda çözüldü. 26. Folin Ciocalteu Çözeltisi (Bitki ekstraktlarının toplam fenolik bileşiklerini ölçmek için gereken çözeltisi): Orijinal ambalajdan hazır olarak kullanıldı.

62 Deney Bitkileri: Bu araştırmada çalışma materyali olarak bölgemizde yeterli düzeyde elde edebileceğimiz bir liken türü olan Lobaria pulmonaria (L.) Hoffm tercih edildi. Liken örnekleri, Giresun çevresinden Haziran-Eylül 2005 aylarında muhtelif zaman aralıklarıyla, Dr. Ali Aslan tarafından toplandıktan sonra uluslar arası teşhis yöntemleri kullanılarak tür teşhisi yapıldı 77,192. Türün herbaryum örneği Atatürk Üniversitesi- Kazım Karabekir Eğitim Fakültesi Herbaryumu nda depolanmıştır Deney Hayvanları Tez çalışmamız için g ağırlıktaki toplam 48 adet erkek Sprague- Dawley rat kullanılmıştır. Deney hayvanları, Atatürk Üniversitesi, Tıbbi Deneysel Uygulama ve Araştırma Merkezi (ATADEM) Laboratuvarlarından temin edildi. Tez kapsamındaki farmakolojik analizler ve deneyler Tıp Fakültesi, Farmakoloji A.B.D. laboratuvarlarında yapıldı. Hayvanlar deneye alınmadan önce gruplara ayrılmış ve standart şartlar altında muhafaza edilmiştir 193. Etik Kurul Onayı: Mevcut araştırmanın etik kurallara uygun olduğu ATADEM Etik Kurulu (B.30.2.ATA.0.70/72 4) tarafından onaylanmış ve bu onay Sağlık Bilimleri Enstitüsü Etik Kurulu tarafından kabul edilmiştir Bitki Ekstraktının Hazırlanması Liken örnekleri toplandıktan sonra yabancı maddelerden temizlendi ve oda sıcaklığında kurutuldu. Kuru örnekler bir havanda sıvı azot ile öğütülerek toz haline getirildi. 100 g öğütülmüş liken örneği çalkalayıcılı bir su banyosunda iki gün süreyle devam ettirilerek metanol ile ekstrakte edildi (50 C, 250 ml x 4). Metanol ekstresindeki

63 63 lipofilik maddeleri uzaklaştırmak için ekstre üzerine 60 o C da sıcak su ilave edildi ve süzüldü. Lipofilik maddeler süzgeç kağıdının üzerinde kalırken diğer maddeler su fazına geçti. Su daha sonra 5 µm-hg basınç altında liyofilize edilerek uzaklaştırıldı ve (% 2.67 verimle) 2.67 g liyofilizat elde edildi. Elde edilen liyofilizatlar deneyler yapılıncaya kadar -20 o C ta muhafaza edildi. Elde edilen ekstre LPME olarak isimlendirildi Ratlarda İndometazin Ülserinin Oluşturulması ve Ekstrelerin Verilmesi İndometazin ile uyarılan gastrik hasarlı (ülserli) doku üzerine LPME nin antiülserojen etkilerini araştırmak üzere yapılan bu çalışma, Guidobono ve arkadaşları 134 nın yöntemi esas alınarak gerçekleştirildi. 6 şar rattan oluşturulan deney grupları bir gün süreyle aç bırakıldıktan sonra; her bir grupta bulunan ratlara sırasıyla liken ekstreleri (50, 100, 200, 500 ve 1000 mg/kg dozlarda), ranitidin (50 mg/kg) ve musluk suyu oral olarak verildikten 5 dakika sonra da indometazin (25 mg/kg) yine aynı şekilde oral yolla verildi. Uygulamalardan 6 saat sonra yüksek dozda anestezik madde (thiopental sodium, 50 mg/kg) kullanılarak hayvanlar sakrifie edildikten sonra mideleri çıkarıldı. Mideler büyük kuvartur boyunca açılarak serum fizyolojik ile yıkandı. Makroskopik olarak mide incelendikten sonra mide dokuları biyokimyasal incelemeler için -20 o C de saklandı. LPME nin antiülserojen etkileri makroskopik ve biyokimyasal analizler yapılmak suretiyle belirlendi. Sonuçlar indometazin, ranitidin ve kontrol grupları ile mukayese edildi. Sağlıklı hayvan grubu kontrol grubu olarak değerlendirmeye alınacağından dolayı bu gruba yalnızca musluk suyu verildi. Böylece sağlıklı doku (kontrol) ile ekstrakt, ranitidin ve indometazin verilen gruplar arasındaki korelasyonların istatistiksel olarak analizleri yapıldı.

64 Mide dokusunun makroskobik incelenmesi: Gastrik lezyonların belirlenmesi için makroskopik değerlendirmeye alınan rat mideleri, büyük kuvartur boyunca açılarak serum fizyolojik ile yıkandıktan sonra ülser sayısı ve alanları belirlendi. Alan genişlikleri milimetrik kağıt kullanılarak bir büyüteç yardımıyla belirlendi Mide dokusunun biyokimyasal incelenmesi: Rat mideleri makroskopik olarak incelendikten sonra mide dokuları biyokimyasal incelemeler için -20 o C de saklandı. Dokuların enzim aktiviteleri en geç üç gün içerisinde analize alındı. Mide dokusu homojenatlarından elde edilen süpernatantlarda CAT, SOD, GPx ve MPx enzim aktiviteleri ile GSH ve LPO miktarları literatürlere dayalı olarak uygun metotlar kullanılmak suretiyle tespit edildi. Tüm ölçümler oda sıcaklığında gerçekleştirildi Doku homojenatlarının hazırlanması: Mide dokuları bir havan içinde sıvı azot ile öğütülerek toz haline getirildikten sonra Mide dokularından 0.5 g tartılarak üzerine 4.5 ml tampon ilave edildi ve sonra da bir ultra-turraks homojenizatörde 15 dakika süreyle buz üzerinde homojenize edildi. Homojenatlar bir süzgeç kağıdından süzüldükten sonra soğutmalı santrifüj kullanılarak her enzim için literatürlerde belirtilen hızlarda 4 o C de santrifüj edildikten sonra üstte kalan berrak kısım (süpernatant) enzim aktivitelerinin 22 belirlenmesi için kullanıldı Katalaz (CAT) aktivitesinin ölçümü: Ölçüm prensibi: Aktivite ölçüm ortamındaki H 2 O 2 'nin CAT vasıtasıyla H 2 O ya dönüşümü sağlanırken meydana gelen absorbans azalmasının 240 nm'de ölçülmesi

65 65 esasına dayanmaktadır. Harcanan H 2 O 2 miktarından CAT aktivitesi aşağıda bahsedilen yönteme göre hesaplanmıştır. CAT ölçümü: CAT aktivitesi, Aebi (1984) 'nin belirttiği metoda göre ölçüldü ,5 g doku üzerine 4,5 ml 50 mm K-fosfat tamponu (ph 7,8) ilave edilerek homojenize edildi 22. Homojenatlar, g de 60 dakika santrifüj edildi ve süpernatantlar CAT aktivitesi ölçümünde enzim kaynağı olarak kullanıldı. Kuvartz spektrofotometre küveti içerisine son konsantrasyonu 20 mm olacak şekilde H 2 O 2 çözeltisinden 1,5 ml konularak numune çözeltisinden 1,5 ml ilave edilir edilmez kronometre çalıştırıldı. Alt üst etme sonrası spektrofotometrede 240 nm dalga boyundaki absorbans azalması, 15 saniye aralıklarla 3 dakika süreyle, köre karşı kaydedildi. CAT aktivitesi nin hesaplanması: Ölçümlerde lineer olarak absorbans azalması olan aralıktan dakika başına absorbans azalması hesaplandı. Işık yolu (b)= 10mm, ekstinksiyon katsayısı (ɛ H2 O 2 ), (mmol-1 x mm-1) alınarak A = ɛ.b.c formülünden 240 nm'de, dakikada 1 mmol H 2 O 2 'nin harcanmasını sağlayan enzim miktarı (=EÜ) hesaplandı 194. Formül pratik olarak mmol/min= A/39,4 x 30 şekline getirildi ve bütün aktiviteler bu formülde yerine konulan absorbans değerlerinden hesaplandı. CAT aktivitesi, seyrelme faktörleri dikkate alınarak mmol/dakika/mg doku olarak tarif edildi. Deneyler 3 paralel tekerrür halinde yapıldı Süperoksit dismutaz (SOD) aktivitesinin ölçümü: Ölçüm prensibi: Ksantin, ksantin oksidaz enzimi vasıtasıyla ürik aside dönüştürülürken meydana gelen süperoksit radikalleri, şayet ortamda NBT (nitro blue tetrazolium) mevcutsa, NBT ile reaksiyona girerek formazon boyası oluştururlar. Bu bileşik 560 nm dalga boyunda maksimum absorbans verir. Şayet ortamda SOD enzimi varsa süperoksit

66 66 radikalleri bu enzim tarafından H 2 O 2 ye dönüştürüldüğü için formazon oluşumu azalacak buna bağlı olarak da 560 nm de ölçülen absorbans azalacaktır. Absorbanstaki azalmanın miktarı bize SOD aktivitesini verecektir. Özetle; SOD aktivitesi aşağıda verilen II nolu reaksiyonun inhibe edilme derecesiyle ölçülebilmektedir. I KSANTİN XO ÜRİK ASİT + O 2 O 2 II NBT - FORMAZON III 2O 2 + 2H + SOD DD O 2 + H 2 O 2 SOD ölçümü: SOD aktivitesi Sun ve arkadaşları (1988) tarafından tarif edilen yönteme göre ölçüldü 189. Mide dokuları homojenize edildikten sonra g de 1 saat santrifüj edildi 21. Cam bir spektrofotometre küvetine 2450 µl ölçüm karışımı (0.3 mm Xanthine, 0.6 mm EDTA, 150 µm NBT, 0.4 M Na 2 CO 3, 1.2 g / L BSA), 500 µl supernatant, 50 µl ksantin oksidaz eklendikten sonra karıştırılarak yaklaşık 20 dakika inkubasyon bırakıldı ve 1000 µl CuCl 2 ilave edilerek reaksiyon sonlandırıldı. SOD aktivitesi nin hesaplanması: Oluşan formazon miktarları 560 nm de 3 ml lik quartz küvetler kullanılarak okundu ve seyreltme katsayıları dikkate alınarak aşağıdaki geliştirilen formülden aktivite değerleri (EU) elde edildi ve SOD aktivitesi, mmol/dakika/mg doku olarak tarif edildi. Her bir faktörün etkisi 3 tekerrür yapılarak verildi. A EU/mg.doku = ( 1- Kör - A numune ) x 100 A Kör

67 Glutatyon peroksidaz (GPx) aktivitesinin ölçümü: Ölçüm prensibi: Aktivite ölçümü GPx ve GR arasındaki dönüşümlü tepkimelere dayandırılmıştır. GPx ortamdaki GSH ve H 2 O 2 yi H 2 O ya dönüştürerek GSSG sentezler. GR ise oluşan GSSG yi pentoz fosfat yolundan gelen NADPH ı kullanarak tekrar GSH ye dönüştürür. Bu esnada harcanan NADPH miktarı 340 nm de belirlenebilir. Absorbans azalması ile GPx aktivitesi arasında doğrudan bağlantı kurulması esasına dayanarak ölçüm yapıldı. GPx ölçümü: GPx aktivitesi, Lawrence (1976) 'nin belirttiği metot kullanılarak ölçüldü g doku üzerine 4.5 ml 50 mm K-fosfat tamponu (30 mm KCl içerir ve ph 7.8) ilave edilerek homojenize edildi 22. Homojenatlar, g de 20 dakika santrifüj edildi ve süpernatantlar GPx aktivitesi ölçülmünde enzim kaynağı olarak kullanıldı. Kuvartz spektrofotometre küveti içerisine 200 µlölçüm karışımı (son konsantrasyonlar 50 m KH 2 PO 4, 1 mm EDTA, 1 mm GSH, 0.2 mm β-nadph, 1 mm NaN 3 ve 1 EU/ml GR olacak şekilde) ve 300 µl supernatant konularak birkaç dakika inkubasyona bırakıldı ve sonpa 0 µl 0.25 mm H 2 O 2 konulur konulmaz kronometre çalıştırıldı. Alt üst etme sonrası spektrofotometre de 340 nm dalga boyundaki absorbans azalması, 15 saniye aralıklarla 5 dakika süreyle, köre karşı kaydedildi. GPx aktivitesi nin hesaplanması: Ölçümlerde lineer olarak absorbans azalması olan aralıktan dakika başına absorbans azalması hesaplandı. Işık yolu (b)= 10mm, ekstinksiyon katsayısı (ɛ NADPH ), 6.22 (mmol -1 x mm -1 ) alınarak A = ɛ.b.c formülünden 340 nm'de, dakikada 1 µmol NADPH'nin harcanmasını sağlayan enzim miktarı (EÜ)

68 68 hesaplandı 188. GPx aktivitesi, seyrelme faktörleri dikkate alınarak µmol/dakika/mg doku olarak tarif edildi. Deneyler 3 paralel tekerrür halinde yapıldı Miyeloperoksidaz (MPx) aktivitesinin ölçümü: Ölçüm prensibi: MPx enzimleri nötrofillerin respiratuar (solunum) patlaması esnasında H 2 O 2 vasıtası ile hipoklorik asit üretirler ve kofaktör olarak Hem e ihtiyaç duyarlar. Aktivite ölçüm ortamındaki H 2 O 2, MPx vasıtasıyla harcanırken oluşan hipoklorit absorbansta bir artışa sebep olur. Ölçüm prensibi meydana gelen absorbans artışının 460 nm'de ölçülmesi esasına dayanır. Oluşan hipoklorit miktarından MPx aktivitesi hesaplanabilir. MPx ölçümü: Miyeloperoksidaz aktivitesi Bradley (1982) 'nin belirttiği yöntem esas alınarak ölçüldü g doku alınarak üzerine 10 ml 50 mm fosfat tamponu (ph 6.0) ilave edilerek homojenize edildi 197. Oluşan homojenat 3500 rpm de 30 dakika santrifüj edilerek süpernatantlar MPx aktivitesi ölçümünde enzim kaynağı olarak kullanıldı. Kuvartz spektrofotometre küveti içerisine 2,8 ml ölçüm tamponu, 0,12 ml homojenat tamponu ve 0,12 ml numune çözeltisinden ilave edildiği anda kronometre çalıştırıldı. Kuartz küvet spektrofotometrede 460 nm dalga boyunda 30 saniye aralıklarla 5 dakika süreyle ölçülerek absorbans azalması köre karşı kaydedildi. MPx aktivitesi nin hesaplanması: Ölçümlerde lineer olarak absorbans azalması olan aralıktan dakika başına absorbans azalması hesaplandı. Işık yolu (b)= 10mm, ekstinksiyon katsayısı ( H2O2 ), (µmol -1 x mm -1 ) alınarak A =.b.c formülünden 460 nm'de, dakikada 1 mmol H 2 O 2 'nin harcanmasını sağlayan enzim miktarı (=EÜ) hesaplandı 198. Formül pratik olarak mmol/min= A/39,4 x 30 şekline getirildi ve bütün aktiviteler bu formülde yerine konulan absorbans değerlerinden

69 69 hesaplandı. MPx aktivitesi, seyrelme faktörleri dikkate alınarak µmol/dakika/mg doku olarak tarif edildi. Deneyler 3 paralel tekerrür halinde yapıldı Total glutatyon (GSH) miktarı ölçümü: Ölçüm prensibi: Ölçüm ortamındaki DTNB [5,5'-Ditiyobis (2-nitrobenzoik asit)] disülfit bir kromojendir ve sül&hidril gruplu bileşikler tarafından kolayca indirgenir. Meydana gelen sarı renk 412 nm spektrofotometrik olarak ölçülebilir. GSH miktarının ölçülmesi: Sedlak ve arkadaşlarının geliştirdiği yöntem esas alınarak'drçekleştirildi g doku üzerine 4.5 ml 50 mm Tris-HCl (ph 7.4) ilave edilerek homojenize edildi 22. Homojenatlar, g de 10 dakika santrifüj edildi ve süpernatantlar, GSH miktarının belirlenmesinde kullanıldı. Kapaklı deney tüpleri içerisine 1500 µl ölçüm tamponu (0.2 mm EDTA içeren 200 mm Tris-HCl, ph = 8.2), 500 µl süpernatant, 100 µl DTNB ve 7900 µl metanol pipetlenerek vortekslendi. Karışım 37 o C ta 30 dakika inkubasyona bırakıldı ve sonra ölçümleri alındı. GSH miktarının hesaplanması: Oluşan sarı renk miktarları 412 nm de 3 ml lik quartz küvetler kullanılarak okundu ve seyreltme katsayıları dikkate alınarak önceden hazırlanan GSH stok çözeltisi kullanılarak oluşturulan standart grafikten (Şekil 6) yararlanarak ölçümler yapıldı. Numunelerin GSH miktarları, nmol/mg doku olarak tarif edildi. Her bir faktörün etkisi 3 tekerrür yapılarak verildi.

70 70 GSH Standart Grafiği Absorbans (412 nm) 1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 y = 0,7879x - 0,0154 R 2 = 0, ,5 1 1,5 2 2,5 GSH Konsantrasyonları (nm) Şekil 6. GSH miktarlarının belirlenmesinde kullanılan standart grafik Lipid peroksidasyon (LPO) miktarı ölçümü: Ölçüm prensibi: Serbest radikallerin hücre zarında oluşturduğu lipit peroksidasyonunun son ürünlerinden olan malondialdehit (MDA) 200,201 düzeyini belirlemek için kullanılan yöntemlerin çoğu MDA nın tiyobarbitürik asit (TBA) ile verdiği reaksiyonu temel alır. Bir molekül MDA iki molekül TBA ile stabil kırmızı renk oluşturmak üzere reaksiyona girer. LPO ölçümü, Ohkawa ve arkadaşlarının metoduna göre MDA nın asidik ortamda tiyobarbütirik (TBA) asitle oluşturduğu rengin 532 nm de optik dansitesinin ölçülmesi prensibine dayanarak yapıldı 202. LPO ölçümü: Ohkawa ve arkadaşlarının geliştirdiği yöntem esas alınarak gerçekleştirildi g doku üzerine 4,5 ml % 10 KCl ilave edilerek homojenize edildi 22. Homojenatlar, 5000 g de 20 dakika santrifüj edildi ve bu süpernatantlar, LPO miktarının belirlenmesinde kullanıldı. Kapaklı deney tüpleri içerisine 250 µl homojenat, 100 µl % 8 sodium dodesil sulphate (SDS), 750 µl % 20 asetik asit, 750 µl % 0.08 TBA

71 71 ve 150 µl saf su pipetlenerek vortekslendi. Karışım 100 o C ta 60 dakika inkubasyona bırakıldıktan sonra üzerine 2,5 ml n-bütanol ilave edildi ve ölçüm alındı. LPO miktarının hesaplanması: Oluşan kırmızı renk miktarları 532 nm de 3 ml lik cam küvetler kullanılarak okundu ve seyreltme katsayıları dikkate alınarak önceden hazırlanan MDA stok çözeltisi kullanılarak oluşturulan standart grafikten yararlanarak ölçümler yapıldı (Şekil 7). Numunelerin LPO miktarları, nmol MDA/g doku olarak tarif edildi. Her bir faktörün etkisi 3 tekerrür yapılarak verildi. LPO Standart Grafiği 0,7 Absorbans (532 nm) 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 y = 64,79x + 0,01 R 2 = 0, ,002 0,004 0,006 0,008 0,01 0,012 MDA Konsantrasyonları (nm) Şekil 7. LPO miktarlarının belirlenmesinde kullanılan standart grafik Lobaria pulmonaria (L.) Hoffm ın metanol ekstraktı (LPME) nin antioksidant özellikleri LPME nin antioksidant aktivitesi (TAA) nın belirlenmesi: Lobaria pulmonaria (L.) Hoffm ın metanol ekstraktı (LPME) nın antioksidant aktivitesi

72 72 tiyosiyanat yöntemi kullanılarak Mitsuda ve arkadaşları (1996) tarafından belirtilen prosedüre göre belirlendi mg liyofilizat 1 ml saf suda çözüldükten sonra kapaklı deney tüpü içerisinde üzerine 4 ml fosfat tamponu (0,2 M, ph 7) ve 5 ml linoleik asit çözeltisi ilave edildi ve daha sonra 37 o C ta inkübasyona bırakıldı. İnkubasyonun başlatılmasını müteakip her 6 saatte bir %75 etanol ve %30 amonyum tiyosiyanat çözeltilerine 0,1 ml inkübasyon karışımı ilave edilerek vortekslendi. Karışıma %35 HCl içerisinde 0.02 M FeCl 2 çözeltisinden 0.1 ml ilave edilerek absorbanslar 500 nm de köre karşı ölçüldü. Kontrol için aynı işlemler yalnızca linoleik asitli karışımda, kör için ise 0.1 ml saf su ilave edilerek tekrarlandı. İnkübasyona kontrolün maksimum absorbansa ulaşması (66. saat) neticesinde son verildi. inkübasyon karışımından her seferinde 3 tekerrür ile sonuçlar verildi Bitki ekstraktındaki total fenolik bileşiklerin miktarlarının belirlenmesi: Lobaria pulmonaria (L.) Hoffm nın metanol ekstraktı (LPME) nın toplam fenolik bileşiklerinin miktarı Slinkard ve Singleton (1977) tarafından belirtilen prosedüre uygun olarak Folin-Coicalteu çözeltisi kullanılarak ölçüldü mg liyofilizat 0.5 ml saf suda çözüldükten sonra kapaklı deney tüpü içerisinde üzerine 2.5 ml Folin-Coicalteu çözeltisi ilave edildi ve 30 o C ta 5 dakika inkubasyona bırakıldı. Sonra bu karışımın üzerine 2ml Na 2 CO 3 ilave edilerek 30 o C ta 90 dakika süreyle yeniden inkubasyona bırakıldı. 90. dakikanın sonunda 765 nm de absorbanslar ölçüldü. Gallik asit kullanılarak hazırlanan standart grafikten de yararlanılarak sonuçlar, mg Gallik Asit ekuvalenti (GAE) / g liyofilizat şeklinde verildi (Şekil 8).

73 73 Absorbans (765 nm) 3, , , , , , , y = 0,3977x - 0,4686-0, , , , , , , , , Gallik asit konsantrasyonları (mg / ml) Şekil 8. Toplam fenolik bileşiklerin miktarının belirlenmeinde kullanılan gallik asit standart grafiği Bitki ekstraktındaki indirgeme kuvvetinin belirlenmesi: Lobaria pulmonaria (L.) Hoffm ın metanol ekstraktı (LPME) nın indirgeme gücü Yen ve Chen (1977) tarafından belirtilen prosedüre uygun olarak belirlendi mg liyofilizat 0.5 ml saf suda çözüldükten sonra kapaklı deney tüpü içerisinde üzerine 2.5 ml fosfat tamponu (0.2 M, ph 6.6) ve 2.5 ml % 1 lik potasyum ferrisiyanür çözeltisi eklendikten sonra 50 o C ta 30 dakika inkubasyona bırakıldı. % 10 luk TCA çözeltisinden 2.5 ml ilave edilip 3000 rpm de 10 dakika santrifüj edildi. Bu karışımın üzerine 2.5 ml süpernatan alınarak üzerine 2.5 ml %0.1 lik FeCl 3 ve 2.5 ml saf su ilave edildikten sonra 700 nm de absorbans ölçüldü. Yüksek absorbans, yüksek indirgeyici gücü temsil etmektedir.

74 İstatistiksel analizler İstatistiksel analizler SPSS 12.0 software programı kullanılarak yapıldı. Bütün ölçümlerde istatistiksel farklılıklar ve önem seviyeleri one-way variance analyzes (ANOVA) testi ile belirlendi ve p<0.05 seviyesindeki sonuçlar önemli kabul edildi. Çoklu karşılaştırmalarda Scheffe s multiple comparison testi uygulandı.

75 75 3. BULGULAR Yaptığımız çalışmalardan elde ettiğimiz veriler, bu bölümde tablo ve şekiller ile gösterilmiş, kontrole göre mukayeseler % inhibisyon olarak ifade edilmiştir. Her deneye ait verilere ait tablonun hemen altında değişik muamele grupları arasındaki farkın daha iyi görülmesi amacıyla, verilerin ortalamalarına göre hazırlanan diyagramlar şekil olarak numaralandırılarak sunulmuştur. Bulgular kısmında sunulan veriler, 3 tekerrür olarak yapılan deney sonuçlarının ortalaması ± standart hata (SE) olarak sunulmuştur. Bütün verilere SPSS 12.0 software kullanılarak one-way variance analyzes (ANOVA) testi uygulandı. Ortalam değerler arasındaki istatiksel farklılılar LSD testi ile belirlenerek, p<0.05 seviyesindeki sonuçlar istatiksel olarak farklı kabul edildi. Çoklu karşılaştırmalarda ise Scheffe s multiple comparison testi uygulandı Makroskopik Bulgular Makroskopik inceleme sonuçları Tablo 1, Şekil 9 ve 10 da sunulmuştur. A B Şekil 9. IND (25 mg/kg) tarafından oluşturulan gastrik hasarlı dokudan (A) ve LPME ile muamele edilmiş grupdan alınan (B) rat mideleri.