ETLİK VETERİNER MİKROBİYOLOJİ DERGİSİ

Transkript

1 I IN ETLİK VETEİNE KONTOL MEKEZ AAŞTIMA ENTİTÜÜ MÜDÜLÜĞÜ ANKAA Test AB-0048-T ETLİK VETEİNE MİKOBİYOLOJİ DEGİİ JOUNAL OF ETLIK VETEINAY MICOBIOLOGY ANKAA TUKEY Cilt/Volume 23 ayı/number

2 II

3 III Etlik Veteriner Mikrobiyoloji Dergisi Cilt/Volume 23 ayı/number Journal of Etlik Veterinary Microbiology Yılda iki kez yayımlanır / Published two times per year IN ahibi Etlik Veteriner Kontrol Merkez Araştırma Enstitüsü Müdürlüğü Adına Uzm.Vet.Hek. Kadir Kaya Enstitü Müdürü V. Editörler Kurulu / Editorial Board Baş Editör / Editor-in Chief Uzm.Vet.Hek. Kadir Kaya Editör Yardımcıları / Co-Editors * Dr. Erhan Akçay Uzm.Vet.Hek. Yıldız Ayaz Dr. Asiye Dakman Dr. Arife Ertürk Dr. Uğur Küçükayan Dr. Yavuz Ulusoy Dr. Armağan Erdem Ütük Uzm.Vet.Hek. M. Kadri Yavuz Adres / Address Etlik Veteriner Kontrol Merkez Araştırma Enstitüsü Etlik Ankara / TÜKİYE Tel : 90 (312) (10 hat) Faks : 90 (312) UL : E-posta : ehh.o@merkezvet.gov.tr

4 IV Hakem Listesi/ eviewers List* Prof.Dr. Yeşim ağ Açıkel Prof.Dr. Mehmet Akan Prof.Dr. Tarık Haluk Çelik Doç.Dr. Alper Çiftçi Doç.Dr. Muammer Göncüoğlu Doç.Dr. Murat Karahan Prof.Dr. Oktay Keskin Doç.Dr. Yahya Kuyucuoğlu Doç.Dr. Gülsüm Öksüztepe Doç.Dr. üheyla Türkyılmaz Prof.Dr. Uçkun ait Uçan Prof.Dr. Hakan Yardımcı Prof.Dr. Murat Yıldırım Hacettepe Üniversitesi, Kimya Mühendisliği Bölümü Ankara Üniversitesi, Veteriner Fakültesi, Mikrobiyoloji Anabilim Dalı Ankara Üniversitesi, Veteriner Fakültesi, Gıda Hijyeni ve Teknolojisi Bölümü Ondokuz Mayıs Üniversitesi, Veteriner Fakültesi, Mikrobiyoloji Anabilim Dalı Ankara Üniversitesi, Veteriner Fakültesi, Gıda Hijyeni ve Teknolojisi Bölümü Cumhuriyet Üniversitesi, Veteriner Fakültesi, Mikrobiyoloji Anabilim Dalı Harran Üniversitesi, Veteriner Fakültesi, Mikrobiyoloji Anabilim Dalı Afyon Kocatepe Üniversitesi, Veteriner Fakültesi, Mikrobiyoloji Anabilim Dalı Fırat Üniversitesi, Veteriner Fakültesi, Gıda Hijyeni ve Teknolojisi Bölümü Adnan Menderes Üniversitesi, Veteriner Fakültesi, Mikrobiyoloji Anabilim Dalı elçuk Üniversitesi, Veteriner Fakültesi, Mikrobiyoloji Anabilim Dalı Ankara Üniversitesi, Veteriner Fakültesi, Mikrobiyoloji Anabilim Dalı Kırıkkale Üniversitesi, Veteriner Fakültesi, Mikrobiyoloji Anabilim Dalı * İsimler soyada göre alfabetik dizilmiştir ve bu sayıda görev alanlar yazılmıştır. ULAKBİM Yaşam Bilimleri ve Türkiye Atıf Dizini veritabanları kapsamında bulunan çift hakemli bir dergidir. Copyright Etlik Veteriner Mikrobiyoloji Dergisi 2012, Her hakkı saklıdır / All rights reserved Basım Tarihi / Publishing Date: Aralık / December 2012, Baskı adedi / Circulation: 500 Tasarım ve Baskı / Printing M MEDİAN Medisan Yayinevi Ltd.Şti. Çankırı Cad. 45 / 347 Ulus - Ankara, Türkiye Tel : medisanyayinevi@gmail.com

5 V İçindekiler / Contents Araştırma Makaleleri / esearch Articles ayfa /Page Erzurum yöresinde koyunlarda Clostridium perfringens toksin varlığının toksin nötralizasyon, ELI- A ve lateks aglütinasyon test yöntemleri ile araştırılması Investigation of Clostridium perfringens toxins in sheeps in the region of Erzurum by toxin neutralization, ELIA and lateks agglütination tests Şenay eyitoğlu, eyda Cengiz, erap Kılıç Altun, Ömer Faruk Küçükkalem, İbrahim özdutmaz...39 Phenotypic characteristics of Listonella anguillarum strains isolated from rainbow trout (Oncorhynchus mykiss, Walbaum) farms in Turkey Türkiye de gökkuşağı alabalığı çiftliklerinden izole edilen Listonella anguillarum suşlarının fenotipik özellikleri eçil Metin...44 Et ürünlerinin histolojik muayenesi Histological analysis of meat products Yıldız Ayaz, Yusuf Ziya Kaplan, Naim Deniz Ayaz, Mihriban H. Aksoy...49 Gökkuşağı alabalık filetolarının marinasyon süresinin ve sıcaklığının merkezi bileşke tasarımı ile optimizasyonu Optimization with central compozite design of rainbow trout fillets time of marination and temperature Özlem Pelin Can, Mehtap Erşan...57 Köpeklerin idrar örneklerinden Klebsiella pnemoniae identifikasyonu ve antibiyotik duyarlılıkları The identification and antibiotic susceptibilities of Klebsiella pneumoniae from dog urine samples Andaç Uzer Gülen, Şükrü Kırkan...64 Derleme / eview taphylococcus aureus larda metisilin direnci ve enfeksiyonlar Methicillin resistance in taphylococcus aureus and infections Volkan Özavcı, Şükrü Kırkan...70 Antibiyotiklere alternatif olarak yumurta sarısı antikorları Egg yolk antibodies as alternative to antibiotics Timur Gülhan Banur Boynukara...77

6 VI

7 Yazarlara Bilgi / Instructions for Authors VII Etlik Veteriner Mikrobiyoloji Dergisi Yayım Koşulları 1. Dergi, T.C. Gıda, Tarım ve Hayvancılık Bakanlığı, Etlik Veteriner Kontrol Merkez Araştırma Enstitüsü Müdürlüğü nün hakemli, bilimsel yayın organı olup, yılda iki defa yayımlanır. Derginin kısaltılmış adı Etlik Vet Mikrobiyol Derg dir. 2. Etlik Veteriner Mikrobiyoloji Dergisi nde veteriner hekimlik alanında yapılan, başka bir yerde yayımlanmamış olan orijinal bilimsel araştırmalar, güncel derleme, gözlem, kısa bilimsel çalışmalar ve enstitüden haberler yayımlanır. Derleme şeklindeki yazılar; orijinal olması, en son yenilikleri içermesi, klasik bilgilerin tekrarı olmaması durumunda kabul edilir. Derlemeyi hazırlayan yazarın, o konuda ulusal ya da uluslararası düzeyde orijinal yayın ve araştırmalar yapmış olması koşulu aranır. 3. Türkçe ve İngilizce olarak hazırlanacak metinler 12 punto Times New oman yazı karakterinde, düz metin olarak, çift aralıklı ve kenarlarda 30 mm boşluk bırakılarak, A4 formundaki beyaz kağıda yazılmalıdır. Yazıların tamamı, şekil ve tablolar dahil olmak üzere orijinal bilimsel araştırmalarda 16, derlemelerde 10, gözlemlerde 6 ve kısa bilimsel çalışmalarda 4 sayfayı geçmemelidir. 4. Microsoft Word formatındaki metin ile en az 300 dpi çözünürlükteki JPEG formatındaki resim/lerin tamamı etlikvetmikrobiyolderg@ gmail.com e-posta adresine gönderilmelidir. 5. Türkçe orijinal çalışmalar konu başlığı, yazar/yazarların adları, adresleri, Türkçe özet ve anahtar sözcükler, İngilizce başlık, İngilizce özet ve anahtar sözcükler, giriş, materyal ve metot, bulgular, tartışma ve sonuç, teşekkür ve kaynaklar sırası ile hazırlanmalıdır. İngilizce orijinal çalışmalar konu başlığı, yazar/yazarların adları, adresleri, İngilizce özet ve anahtar sözcükler, Türkçe başlık, Türkçe özet ve anahtar sözcükler, giriş, materyal ve metot, bulgular, tartışma ve sonuç, teşekkür ve kaynaklar şeklinde hazırlanmalıdır. Kısa bilimsel çalışmaların ve derlemelerin başlık ve özet bölümleri orijinal çalışma formatında, bundan sonraki bölümleri ise, derlemelerde; giriş, metin ve kaynaklar şeklinde, kısa bilimsel çalışmalarda ise bölümlendirme yapılmadan hazırlanmalıdır. 6. Orijinal çalışmalar ve gözlemler aşağıdaki sıraya göre düzenlenerek yazılmalıdır. Başlık, kısa, konu hakkında bilgi verici olmalı ve küçük harflerle yazılmalıdır. Yazar(lar)ın, ad(lar)ı küçük, soyad(lar)ı büyük harflerle yazılmalı ve unvan belirtilmemelidir. Özet, Türkçe ve İngilizce olarak, tek paragraf halinde ve en fazla 500 sözcük olmalıdır. Anahtar kelimeler, alfabetik sıraya göre yazılmalı ve 5 sözcüğü geçmemelidir. Giriş, konu ile ilgili kısa literatür bilgisi içermeli, son paragrafında çalışmanın amacı vurgulanmalı ve iki sayfayı geçmemelidir. Materyal ve Metot, ayrıntıya girmeden, anlaşılır biçimde yazılmalıdır. Başlıklar kalın, alt başlıklar italik yazı tipiyle belirtilmelidir. Bulgular bölümünde veriler, tekrarlama yapmadan açık bir şekilde belirtilmelidir. Tablo başlıkları tablonun üstünde, şekil başlıkları ise şeklin altında belirtilmelidir. Tartışma ve onuç bölümünde, araştırmanın sonucunda elde edilen bulgular, diğer araştırıcıların bulguları ile karşılaştırılmalı ve literatüre olan katkısı kısaca belirtilmelidir. Teşekkür bölümü, gerekli görülüyorsa kaynaklardan hemen önce belirtilmelidir. Kaynaklar bölümünde, kaynaklar listesi alfabetik ve kronolojik olarak sıralanmalı ve numaralanmalıdır. Metin içerisindeki kaynak, yazar soyadı yazılıp sıra numarası ile; cümle sonunda ise sadece sıra numarası ile parantez içerisinde yazılmalıdır. Cümle sonunda birden çok kaynak belirtilecek ise kaynak numaraları küçükten büyüğe doğru sıralanmalıdır. Metin içerisinde ikiden çok yazarlı kaynak kullanımlarında ilk yazarın soyadı yazılmalı diğer yazarlar ise ve ark. (İngilizce metinlerde et al. ) kısaltması ile belirtilmelidir. Dergi adlarının kısaltılmasında Periodical Title Abbreviations: By Abbreviation son baskısı esas alınmalıdır. Kaynaklar listesinde yazar(lar)ın aynı yıla ait birden fazla yayını varsa, yayın tarihinin yanına a ve b şeklinde belirtilmelidir. Kaynak yazımı ve sıralaması aşağıdaki gibi yapılmalıdır; üreli Yayın: Dubey JP, Lindsay D, Anderson ML, Davis W, hen K, (1992). Induced transplacental transmission of N. caninum in cattle. J Am Vet Med Ass. 201, Yazarlı Kitap: Fleiss Jl, (1981). tatistical methods for rates and proportions. econd edition. New York: John Willey and ons, p.103. Editörlü Kitap: Balows A, Hausler WJ, Herramann Kl, eds., (1990). Manual of Clinical Microbiology. Fifth edition. Washington DC: IL Press, p.37. Editörlü Kitapta Bölüm: Bahk J, Marth EH, (1990). Listeriosis and Listeria monocytogenes. Cliver DD. eds. Foodborne Disease. Academic press Inc, an Diego. p Kongre Bildirileri: Çetindağ M, (1994). Pronoprymna ventricosa, a new digenic trematoda from the Alosa fallax in Turkey. Eighth International Congress of Parasitology (ICOPA VIII), October, 10-14, İzmir- Turkey. Tezler: Aksoy E, (1997). ığır Vebası hastalığının histolojik ve immunoperoksidaz yöntemle tanısı üzerine çalışmalar. Doktora Tezi, AÜ ağlık Bilimleri Enstitüsü, Ankara. Anonim: Anonim, (2009). Contagious equine metritis. Erişim adresi: Erişim tarihi: Peter AT (2009). Abortions in dairy cows. Erişim adresi: Erişim tarihi: Yazışma adresi, çok yazarlı çalışmalarda yazışma adresi olarak yazarlardan sadece birinin adı/soyadı, adresi ve e-posta adresi çalışmanın sonunda belirtilmelidir. 7. Latince cins ve tür isimleri italik yazı tipi ile yazılmalıdır. Tüm ölçüler I (ysteme Internationale) ye göre verilmelidir. 8. Dergide yayımlanmak üzere gönderilen makaleler tüm yazarlar tarafından imzalanan Yayın Hakkı Devri özleşmesi ve başvuruya ilişkin bir dilekçe ile birlikte gönderilmelidir. Yayımlanması uygun görülen çalışmalar, istendiğinde Yayım Komitesi nin basıma ilişkin kararı, yazar(lar)ına bildirilir. 9. Etlik Veteriner Mikrobiyoloji Dergisi nde yayımlanacak olan, hayvan deneylerine dayalı bilimsel çalışmalarda Etik Kurul Onayı Alınmıştır ifadesi aranır. 10. Gönderilen yazıların basım düzeltmeleri orijinal metne göre yapıldığından, yazıların her türlü sorumluluğu yazarlara aittir. 11. Ürünlerin ticari adları ile karşılaştırılmalarına yönelik araştırmalar derginin ilgi kapsamı dışındadır. 12. Araştırmaya konu olan maddelerin ve ürünlerin ticari adları kullanılmamalıdır. 13. Şayet varsa araştırmanın desteklendiği kurum adı ve proje numarası belirtilmelidir. 14. Dergiye gönderilen yazılar geliş tarihine göre yayımlanır. 15. Yayımlanmayan yazılar, yazarına iade edilmez.

8 VIII Yazarlara Bilgi / Instructions for Authors Journal of Etlik Veterinary Microbiology Publication Conditions 1. The Journal is a refereed, scientific publication of epublic of Turkey Ministry of Food, Agriculture and Livestock, Directorate of Etlik Veterinary Control Central esearch Institute and is published two issues in a year. The abbreviation of the journal is J Etlik Vet Microbiol. 2. In the Journal of Etlik Veterinary Microbiology, original research articles, actual reviews, case reports, short communications on the issue of veterinary medicine whose one part or whole have not been published in any other place before, and news from the institute are published. The review articles will be accepted only if they are original, actual and not repeating the classical knowledge. The author of the review is asked to possess original publications or researches on the subject at national or international levels. 3. Manuscripts that will be prepared in Turkish and English should be typed as a full text, on A4 paper with 12 pt, in Times New oman typing character, double-spaced and with 30 mm space in both sides of the paper. Manuscripts including figures and tables should not exceed 16 pages for original research articles, 10 pages for reviews, 6 pages for case reports and 4 pages for short communications. 4. Manuscript written in Microsoft Word format and figures in JPEG format at minimum 300 dpi resolution should be submitted to etlikvetmikrobiyolderg@gmail.com 5. Original research articles and case reports should include in following rank: title, name(s) of the author(s), their addresses, abstract and key words in English, title, abstract and key words in Turkish, introduction, material and method, findings, discussion and conclusion, acknowledgements and references. In short communications and reviews, divisions except summaries should be omitted. 6. Original research articles and case reports should be arranged and composed as in the following. Title should be brief, explanatory and written in small caps. Explanation(s) about the study should be written as footnotes. Author(s) should be mentioned by their names and surnames; their surnames should be written in capital letters and author(s) title should not be mentioned. ummary should be in Turkish and English, single paragraph and composed of at most about 500 words. Key Words should be written in alphabetical order and should not exceed 5 words. Introduction not exceeding two pages should include a short review of the literature related with the subject and in the end paragraph; the aim of the study should be mentioned. Material and Method should be written in an essential and comprehensible manner without getting into details. ubtopics should be mentioned first in bold and after in italic type. Findings should be shortly explained and data should not be repeated within the text. Legends should be indicated at the top of each table, whereas should be indicated at the bottom of each figure and print. Vertical lines are not allowed in tables. Discussion and Conclusion must include the evaluation and comparison of results with other researchers findings. The study s contributions to the existing literature should also be explained briefly. Acknowledgements must be indicated before references if necessary. eferences should be listed alphabetically and chronologically by numbers. In the body of text, reference must be shown by author s surname and list number or only by list number within parenthesis. If there is more than one reference that refers to the same issue, these should be arranged by smallest to biggest reference list numbers at the end of sentence. If the reference is more than two authors, the surname of the first author should be written and other authors should be mentioned with the abbreviation of et al.. For the abbreviation of journals, the latest edition of the Periodical Title Abbreviations: By Abbreviation should be taken as basis. If the author(s) have more than one publication within the same year, besides the publication date, it should be mentioned as a and b in the list of references. The writing of the references and their alignment should be as in the following examples. For articles: Dubey JP, Lindsay D, Anderson ML, Davis W, hen K, (1992). Induced transplacental transmission of N. caninum in cattle. J Am Vet Med Ass. 201, For books: Fleiss Jl, (1981). tatistical methods for rates and proportions. econd edition. New York: John Willey and ons, p.103. For edited books: Balows A, Hausler WJ, Herramann Kl, eds., (1990). Manual of Clinical Microbiology. Fifth edition. Washington DC: IL Press, p.37. For chapter in edited books: Bahk J, Marth EH, (1990). Listeriosis and Listeria monocytogenes. Cliver DD. eds. Foodborne Disease. Academic press Inc, an Diego. p For congress papers: Çetindağ M, (1994). Pronoprymna ventricosa, a new digenic trematoda from the Alosa fallax in Turkey. Eighth International Congress of Parasitology (ICOPA VIII), October, 10-14, İzmir- Turkey. For dissertations: Aksoy E, (1997). ığır Vebası hastalığının histolojik ve İmmunoperoksidaz yöntemle tanısı üzerine çalışmalar. PhD Thesis, Ankara University Institute of Health ciences, Ankara. Corresponding address, in multiple-author studies, as a correspondence address, only one of the authors name/surname, address and should be mentioned at the end. 7. Genus and species names in Latin should be written in italic. All measures should be given according to the I (ysteme Internationale) units. 8. The articles that are sent to be published in the journal should be sent with a covering letter and Publication ights Transfer Agreement signed by all of the authors. The selected articles for the publication, and if asked for, the decision of the editorial committee concerning the publication, are declared to the article s author/ authors. 9. The wording of Ethical Commission Permission is obtained should appear in scientific studies based on animal experiments, which will be published in the Journal of Etlik Veterinary Microbiology. 10. As the edition of the sent articles are done in accordance with the original text, all responsibility of the articles bear on the authors. 11. esearches that aim at comparisons of the products with their commercial names are out of the journal s theme scope. 12. The trademarks of materials and products that are subject of the research should not be mentioned. 13. If the research is supported by a foundation, name of the foundation and project number must be mentioned. 14. The articles that are sent to the journal are published in line with their coming date. 15. Unpublished papers are not returned to their author.

9 Yazarlara Bilgi / Instructions for Authors IX Yayın Hakkı Devri özleşmesi Etlik Veteriner Mikrobiyoloji Dergisi - Ankara Aşağıda başlığı bulunan ve yazarları belirtilen makalenin tüm sorumluluğu Etlik Veteriner Mikrobiyoloji Dergisi Yayın Komisyonu Başkanlığı na ulaşıncaya kadar yazar/larına aittir. Yayının adı: Yazar/ların ad/ları: Aşağıda isim ve imzaları bulunan yazarlar; yayınlamak üzere gönderdikleri makalenin orijinal olduğunu, daha önce başka bir dergiye yayınlanmak üzere gönderilmediğini ve kısmen ya da tamamen yayınlanmadığını, gerekli düzeltmelerle birlikte her türlü yayın hakkının, yazının yayımlanmasından sonra Etlik Veteriner Mikrobiyoloji Dergisi ne devrettiklerini kabul ederler. Yayımlanmak üzere gönderilen bu makalenin tüm sorumluluğunu da yazar/lar üstlenmektedir. Yukarıdaki makalenin tüm hakları Etlik Veteriner Mikrobiyoloji Dergisi ne devredilmiştir. Yazar ad/ları İmza Tarih Yazışma Adresi: Copyright elease Journal of Etlik Veterinary Microbiology Ankara - TUKEY The undersigned authors release Journal of Etlik Veterinary Microbiology from all responsibility concerning the manuscript entitled; Title of paper: Authors names: Upon its submission to the publishing commission of the Journal of Etlik Veterinary Microbiology. The undersigned author/s warrant that the article is original, is not under consideration by another journal, has not been previously published or that if has been published in whole or in part, any permission necessary to publish it in the above mentioned journal has been obtained and provided to the Journal of Etlik Veterinary Microbiology. We sign for and accept responsibility for releasing this material. Copyright to the above article is hereby transferred to the Journal of Etlik Veterinary Microbiology, effective upon acceptance for publication. To be signed by all author/s Authors names ignature Date Correspondence Address:......

10 X

11 Etlik Vet Mikrobiyol Derg, 23, eyitoğlu 39-43, ve 2012 ark.. Etlik Vet Mikrobiyol Derg, 23, 39-43, Araştırma 2012Makalesi / esearch Article 39 Erzurum yöresinde koyunlarda Clostridium perfringens toksin varlığının toksin nötralizasyon, ELIA ve lateks aglütinasyon test yöntemleri ile araştırılması Şenay EYİTOĞLU 1, eyda CENGİZ 2, erap KILIÇ ALTUN 1, Ömer Faruk KÜÇÜKKALEM 1, İbrahim ÖZDUTMAZ 1 1 Erzurum Veteriner Kontrol Enstitüsü, 2 Atatürk Üniversitesi Veteriner Fakültesi Mikrobiyoloji AD, Erzurum Geliş Tarihi / eceived: , Kabul Tarihi / Accepted: Özet: Bu çalışmada, Erzurum yöresinde bulunan enterotoksemi şüpheli 70 adet koyuna ait bağırsak içeriğinin ELIA, toksin nötralizasyon ve lateks aglütinasyon testi (LAT) ile incelenerek; klostridial toksinlerin araştırılması ve tiplendirilmesi amaçlandı. Toksin testinde 25 (%35,7) örnekte C.perfringens yönünden pozitif sonuç alınırken, 45 (%64,3) adet örnek negatif olarak değerlendirildi. Bu test sonuçlarına göre, 14 örnek C.perfringens tip C, 2 örnek C.perfringens tip A, 9 örnek C.perfringens tip D olarak identifiye edildi. İncelenen örneklerin ELIA sonuçları değerlendirildiğinde 70 adet bağırsak içeriğinin 37 (%52,8) adeti C.perfringens yönünden pozitif bulunurken, 33 (%42,7) adet örnek negatif bulundu. Yapılan ELIA tiplendirilmesinde 12 adet numunede alfa toksin (tip A), 7 adet örnekte alfa, beta, epsilon toksin (tip B), 9 tanesinde alfa ve beta toksin (tip C) ve 9 adet örnek de alfa ve epsilon toksini (tip D) belirlendi. Lateks aglütinasyon sonuçlarında ise 2 örnek alfa toksin yönünden pozitif sonuç verirken, 16 örnekte epsilon toksini belirlendi. onuç olarak Erzurum ilinde enterotoksemi kontrolünde aşılamaların kontrollü, yaygın bir şekilde yapılmasının ve uygulanacak aşılarda başta tip A olmak üzere, tip C, tip D ile tip B nin de bulundurulmasının gerekli olduğu belirlendi. Anahtar sözcükler: Enterotoksemi, ELIA, lateks aglütinasyon, toksin nötralizasyon. Investigation of Clostridium perfringens toxins in sheeps in the region of Erzurum by toxin neutralization, ELIA and lateks agglütination tests ummary: Investigation and typing of clostridial toxins after ELIA, serum neutralization and latex agglutination tests (LAT) of intestinal contents from 70 enterotoxemia suspected sheeps in Erzurum region was aimed in this study. According to toxin neutralization results; 25 (35,7 %) and 45 (64,3 %) of the samples were determined as positive and negative, respectively. According to typing by toxin neutralization test; 14, 2 and 9 of the samples were typed as C, A and D, respectively. Thirty-seven (52,8 %) of the samples were positive for C.perfringens in the ELIA results. According to ELIA typing, 12 of the samples had alpha toxin (Type A), 7 of the samples had alpha, beta and gamma toxins (Type B), 9 of the samples had alpha and beta toxins (Type C), and 9 of the samples had alpha and epsilon toxins (Type D). According to latex agglutination test results, 2 of the samples had alpha and 16 of the samples had gamma toxins. As a result, the control of the province of Erzurum enterotoxemia, vaccination should be controlled and widely. Vaccines to be applied, especially in type A, type B, C and D must be present. Key words: Enterotoxemia, ELIA, latex agglutination, toxin neutralization. Giriş Clostridium perfringens hareketsiz ve kapsüllü, gram pozitif, çomak şekilli, spor oluşturan, evcil hayvanlarda önemli enterik infeksiyonlara neden olan bir bakteridir. C.perfringens e bağlı enterotoksemiler C.perfringens in değişik tipleri tarafından oluşturulan, koyun, kuzu, buzağı ve diğer hayvanlarda toksemi ile karakterize infeksiyonlardır (1). C.perfringens in oluşturduğu toksinler fazla sayıdadır ve etkenin tiplendirilmesinde bu toksinler kullanılır. Toksin tiplendirmesine göre C.perfingens tipleri A, B, C, D ve E olarak ayrılmıştır (1, 5, 11, 13, 15). C.perfringens tipleri değerlendirildiğinde; Tip A en yaygın C.perfringens tipidir (11). Toksijenik özellikleri ve patojenitesi oldukça değişkendir. Yapısındaki alfa toksin, kimyasal olarak fosfolipaz C yapısındadır. Lesitini fosforilkolin ve digliseride hidrolize eder. Çoğu hücre membranı lesitin içerdiğinden dolayı alfa toksin yapısı ile yıkımlanır (10, 15). Yazışma adresi / Correspondance: eyda Cengiz, Atatürk Üniversitesi, Veteriner Fakültesi, Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, 25240, Erzurum, Türkiye Eposta: seydacengiz@atauni.edu.tr

12 40 eyitoğlu ve ark.. Etlik Vet Mikrobiyol Derg, 23, 39-43, 2012 C.perfringens tip B, alfa, beta ve epsilon toksinleri üretir fakat beta toksin çoğunlukla temel toksindir (12, 15). Hayvanlarda ani ölüm ile karakterize infeksiyonlara neden olan C.perfringens tip C de alfa toksin yanında beta toksin üretir. Beta toksin tripsin ve diğer proteolitik enzimler ile kolayca inaktif hale getirilebilir (15, 16). C.perfringens tip D en iyi bilinen C.perfringens tipidir ve epsilon toksin üretir. Epsilon toksin sindirim enzimlerine karşı dirençlidir. Bağırsakta fazla miktarda üretilen epsilon toksin, sistemik dolaşım ile absorbe olarak organ ve dokularda kapiller geçirgenlik artışı meydana getirir (21, 23) Tip E nin temel toksini Iota toksindir. Toksin proteolitik enzimler ile aktive olur. Bu toksin nekrotizan etkilidir ve kapillar permeabiliteyi arttırır (5,13,15,18). Daha önce yapılan çalışmalarda C.perfringens infeksiyonlarının teşhisi ve tiplendirilmesinde toksin nötralizasyon testi, ELIA, lateks aglütinasyon metotları (LAT), PC gibi çeşitli teknikler kullanılmış, hastalığın çıktığı bölge ve bireysel predizpozisyon gibi faktörlere bağlı olarak farklı sonuçlar elde edilmiştir. Bu çalışmada enterotoksemi şüpheli 70 adet koyuna ait bağırsak içeriğinde C.perfringens ve klostridial toksin varlığının ELIA, toksin nötralizasyon ve lateks aglütinasyon testi ile araştırılması ve karakterizasyonu amaçlandı. Materyal ve Metot Çalışmada, enterotoksemi şüphesiyle Erzurum Veteriner Kontrol Enstitüsüne (EVKEM) getirilen 70 adet koyuna ait bağırsak örneği kullanıldı. Bağırsak örnekleri aseptik koşullar altında alındıktan sonra ELIA için Bio-X Enterotoksemi Elisa Kit, (Bio K 270), Lateks Aglütinasyon testleri için Bio-X Diagnostics C.perfringens epsilon toksin (Bio K176), C.perfringens alfa toksin (Bio K170) test kitleri kullanıldı. Kit prosedürleri üretici firmanın direktifleri doğrultusunda uygulandı. Toksin nötralizasyon testi için Koruma ve Kontrol Genel Müdürlüğü Laboratuvar Metot Birliği tarafından hazırlanan protokol uygulandı (9). Bulgular İncelenen örneklerin ELIA sonuçları değerlendirildiğinde, 70 adet bağırsak içeriğinin 37 (%52,8) adeti C.perfringens yönünden pozitif bulunurken, 33 (%42,7) adet örnek negatif bulundu. ELIA tiplendirmesinde 12 adet numunede alfa toksin (tip A), 7 adet örnekte alfa, beta, epsilon toksin (tip B), 9 örnekte alfa ve beta toksin (tip C) ve 9 örnek de ise alfa ve epsilon toksini (tip D) belirlendi (Tablo 1). Toksin nötralizasyon testi sonuçlarına göre; 25 (%35,7) örnekte C.perfringens pozitif bulunurken, 45 (%64,3) adet örnek negatif bulundu. Toksin nötralizasyon testi tiplendirmesine göre, 14 örnek C.perfringens tip C, 2 örnek C.perfringens tip A ve 9 örnek de C.perfringens tip D olarak tiplendirildi. (Tablo 1). İncelenen örneklerin Lateks aglütinasyon sonuçlarında ise 2 örnek alfa toksin yönünden pozitif sonuç verirken, 16 örnekte epsilon toksini belirlendi. Tablo 1. ELIA ve Nötralizasyon test sonuçlarına göre C.perfringens tipleri C.perfringens tipleri ELIA test sonuçları (%) Nötralizasyon test sonuçları (%) A 12 (%32,4) 2 (%8) B 7 (%18,9) - C 9 (%24,3) 14 (56) D 9(%24,3) 9 (36) Toplam 37 (%100) 25 (%100) Tartışma ve onuç Enterotoksemiler C.perfringens in farklı tipleri tarafından oluşturulan, toksemi ile seyreden infeksiyonlardır. C.perfringens in oluşturduğu toksinlerin tiplendirilmesi ile C.perfringens tipleri A, B, C, D ve E olarak ayrılmıştır (1, 5 15). Tip A en yaygın tip olup, sahip olduğu alfa toksin fosfolipaz C yapısındadır ve hücre membranını yıkımlama özelliği bulunmaktadır (10, 15). C.perfringens tip B nin temel toksini beta toksindir (12, 15). C.perfringens tip C nin de temel letal toksini beta toksin yapısındadır (15, 16). C.perfringens tip D sindirim enzimlerine dirençli olan epsilon toksini üretir. Tip E nin temel toksini Iota toksindir. Nekrotizan etkili olan bu toksin kapillar permeabiliteyi arttırır (5,15,18). C.perfringens pozitifliğinin ve toksin tiplerinin belirlenmesi amacıyla kullanılan metotlar ile ilgili çeşitli çalışmalar bulunmaktadır. Nötralizasyon testi ile yapılan çalışmalarda, Uzal ve ark. (22) nötralizasyon testinin %62,7 oranında pozitiflik verdiğini belirlemişlerdir. Idrissi ve Ward (4) nötralizasyon

13 eyitoğlu ve ark.. Etlik Vet Mikrobiyol Derg, 23, 39-43, testi ile 151 adet ani ölen koyunun 21 adedinde C.perfringens tip C (beta toksin) saptarken, 39 adet C.perfringens tip D (epsilon toksin) bulmuşlardır. Özcan ve Gürçay (19) 132 örnekte yaptıkları bakteriyolojik muayenede 51 adet pozitifliğe (%38) rastlamışlar, toksin nötralizasyon testi sonucunda 7 (%13) örnekte tip A, 16 (%31) örnekte tip C, 28 örnekte ise (%54) tip D saptamışlardır. Bu çalışmadaki toksin nötralizasyon testi sonuçları, araştırıcıların bulguları ile karşılaştırıldığında C.perfringens oranı, Uzal ve ark. (22) dan düşük bulunurken, Özcan ve Gürçay (19) ile Idrissi ve Ward (4) ın çalışmalarının sonuçlarına yakın bulunmuştur. Örneklerin tiplendirilmesi yönünden, Özcan ve Gürçay (19) ile Idrissi ve Ward (4) ın tiplendirme bulgularına göre tip C yüksek oranda bulunurken, tip D düşük oranda saptanmıştır. Tip A yönünden elde edilen sonuç Özcan ve Gürçay (19) dan düşük bulunurken hem tip C hem de tip D nin yaygın olarak bulunması araştırıcıların bulgularını desteklemektedir. ELIA, C.perfringens toksin varlığının ve tipinin belirlenmesi için kullanılan hızlı, basit, duyarlı ve spesifik bir testtir. Özellikle bağırsak içeriğinde bulunan çok az miktardaki toksin yapısını saptayarak ve tiplendirerek sonuç verdiğinden dolayı enterotoksemi vakalarının ayrımını da sağlamaktadır (5,14,21). Gökçe ve ark. (3) nın ELIA ile yaptıkları çalışmada, 56 ishalli dışkı örneğinde C.perfringens yönünden pozitif sonuç veren 32 adet (%57) örnek belirlenirken, toksin tiplendirmesinde, örneklerin 6 sı (%10,7) tip A, 7 si (%12,5) tip B, 9 tanesi (%16) tip C, 10 adedi (%17,8) de tip D olarak bulunmuştur. Koç ve Gökçe (8) ELIA metodu ile 150 adet dışkıda 122 (%81,3) adet pozitiflik belirlemişlerdir. Araştırıcılar toksin tiplendirmesinde 61 (%40,6) adet tip A, 19 (%12,6) adet tip B, 28 adet (%18,6) tip C ve 14 (%9,3) adet tip D bulmuşlardır. Islam ve ark. (5) ELIA metodunu kullanarak %68,75 oranında tip D, %25 oranında tip B, %6,25 oranında tip C belirlemişler ancak tip A ya rastlamamışlardır. Naylor ve ark. (14) ise yaptıkları çalışmada 158 örneğin 56 (%35,4) sında C.perfringens yönünden pozitiflik belirlemişlerdir. Tür düzeyinde yaptıkları tiplendirmede 9 (%16) örnekte tip A, 4 (%7,1) örnekte tip B, bir (%1,7) adet örnekte tip C ve 42 (%75) örnekte tip D pozitifliği elde etmişlerdir. Watson ve choles (23) yaptıkları çalışmada bir buzağıda ELIA ile alfa ve epsilon toksin yönünden pozitifliğe rastlarken beta toksin yönünden negatiflik tespit etmişlerdir. Bu çalışmada elde edilen ELIA bulguları C.perfringens pozitifliği yönünden Gökçe ve ark (3) nın bulgularına benzerlik gösterirken, Koç ve Gökçe (8) nin bulgularından düşük, Naylor ve ark. (14) dan yüksek bulunmuştur. C.perfringens toksin tiplerine bakıldığında ise tip A bulgusu Gökçe ve ark (3) nın bulguları ile uyumluluk gösterirken, Koç ve Gökçe (8) den düşük, Naylor ve ark. (14) dan yüksek bulunmuştur. Islam ve ark. (5) nın ise tip A tiplendirmesi yapmamış olması ile bu araştırıcılar ile karşılaştırılamamıştır. Tip B yönünden bakıldığında ise Gökçe ve ark. (8) ile Koç ve Gökçe (8) nin çalışma bulguları ile uyumlu bulunurken, Islam ve ark. (5) nın çalışmasından düşük, Naylor ve ark. (14) dan yüksek bulunmuştur. Tip C bakımından Gökçe ve ark. (3) ile Koç ve Gökçe (8) den düşük bulunurken, Naylor ve ark. (14) ile Islam ve ark. (5) nın tip C bulgularından fazla bulunmuştur. Tip D değerlendirmesine göre ise Koç ve Gökçe (8) den yüksek bulunurken, Gökçe ve ark (3), Naylor ve ark. (14), Islam ve ark. (5) dan düşük bulunmuştur. ELIA ve toksin nötralizasyon test sonuçları karşılaştırıldığında, Uzal ve ark. (21) C.perfringens tip D nin epsilon toksini için ELIA ve toksin nötralizasyon test sonuçları arasında yüksek oranda benzerlik bulmuş, her iki tekniğinde benzer nitelikte ölçüm yaptığını belirtmişlerdir. Ancak ELIA metodunun daha kolay, duyarlı ve spesifik olarak sonuç verdiğini bildirmişlerdir. Aynı araştırıcılar başka bir çalışmada her iki metodu tekrar karşılaştırdıklarında ELIA testinin duyarlılığını toksin nötralizasyon testine göre daha fazla bulmuşlar, ELIA ile 43 adet örnek de pozitifliğe rastlarken toksin nötralizasyon testi sonucunda örneklerin 30 tanesinde pozitifliğe rastlamışlardır (22). Idrissi ve Ward (4) toksin nötralizasyon testi ile ELIA testi için yaptıkları karşılaştırmada ELIA testinin sensivite ve spesifitesini toksin nötralizasyon testlerine göre daha fazla bulmuşlardır. Araştırıcılar ELIA testinin uygulama kolaylığı bakımından alternatif bir test olduğunu belirterek, toksin nötralizasyon testinin özellikle toksinin aktif-inaktif olma durumu, yıkımlanma gibi pek çok durumdan etkilenebileceğini bildirmişlerdir. osskopf-treicher ve ark. (20) da toksin nötralizasyon testlerine alternatif olarak ELIA testlerinin kısa sürede hızlı sonuç vermesi ve manipülasyon kolaylığı bakımından tercih edilebileceğini bildirmişlerdir. Moller ve ark. (13) C.perfringens ve toksinlerinin teşhisinde kullanılan toksin nötrali-

14 42 eyitoğlu ve ark.. Etlik Vet Mikrobiyol Derg, 23, 39-43, 2012 zasyon metodu ile ELIA yöntemini karşılaştırmışlardır. Araştırıcılar alfa toksin saptanmasında toksin nötralizasyon testinin sınırlı derecede yeterli olduğunu belirtmiş, beta toksin saptanmasında ELIA testinin iyi sonuç verdiğini bildirmişlerdir. Bu çalışmada kullanılan ELIA testi ve toksin nötralizasyon bulguları karşılaştırıldığında ELIA ile 37 örnekte pozitiflik saptanırken, toksin nötralizasyon testinde 25 adet örnekte pozitif sonuç alınmıştır. Bu çalışmada C.perfringens in belirlenmesinde ELIA testinin toksin nötralizasyon metoduna göre daha fazla sayıda pozitiflik verdiği görülmüştür. Lateks aglütinasyon testi de C.perfringens toksin tiplerinin belirlenmesi için kullanılan bir metottur. Kadra ve ark. (6) C.perfringens için toksin nötralizasyon ve lateks aglütinasyon testlerinin sonuçlarını karşılaştırmışlar, toksin nötralizasyon testi ile tip A olarak belirledikleri 47 örneğin lateks aglütinasyon testinde 4 adet tip A pozitifliği verdiğini belirlemişlerdir. Araştırıcılar 5 adet tip B örneği için yaptıkları toksin nötralizasyon testinde örneklerin tamamını pozitif bulurken lateks aglütinasyon sonucunu negatif bulmuşlar, 11 adet tip C için toksin nötralizasyon testini pozitif belirlemişler, lateks aglütinasyon sonucunu ise negatif olarak bildirmişlerdir. Yirmi bir adet tip D örneği için toksin nötralizasyon testini pozitif bulurken, lateks aglütinasyonunda 1 adet pozitiflik, 1 adet tip E örneğinin ise hem toksin nötralizasyon hem de lateks aglütinasyonu için pozitiflik bulmuşlardır (6). Gökçe ve ark. (2) ELIA ve lateks aglütinasyon testlerini kullanarak yaptıkları çalışmada ELIA ile 260 bağırsak içeriğinin 220 tanesinde (%84,61), lateks aglütinasyonu ile 152 sinde (%58,46) C.perfringens toksinlerine rastlamışlardır. Bu örneklerin 40 ı (%15,8) ELIA, 108 i ise (%41,3) lateks aglütinasyonu ile negatif bulunmuştur. ELIA tiplendirmesinde 104 ü (%47,27) A, 20 si (%9) B tipinde, 10 u (%4,54) C tipinde ve 86 sı (%39,7) D tipinde bulunmuş, lateks aglütinasyonu tiplendirmesinde ise 79 u (%51,97) A tipinde, 15 i (%9,86) B tipinde, 7 si (%4,60) C tipinde, 51 i (%33,55) D tipinde tespit edilmiştir. İki test içinde en yüksek pozitiflik tip A ve tip D olarak belirlenmiştir. Enterotoksemi vakalarında, özellikle ani ölüm meydana gelen koyunlarda teşhis amaçlı sık kullanılan bir test olarak bildirilen lateks aglütinasyon testi ELIA ile karşılaştırıldığında hızlı ve kolay olmasına karşın duyarlılığı ve spesifitesi az olan bir test olarak belirlenmiştir (2). Lateks aglütinasyon testinde sonuçların yorumlanmasının bir laboratuvar çalışanı tarafından yapılması, ELIA testi sonucunun ise spektrofotometrik olarak verilmesi ELIA testinin duyarlılığını arttırmaktadır. Bu çalışmada incelenen örneklerin lateks aglütinasyon sonuçlarına bakıldığında; 2 örnekte alfa toksin, 16 örnekte epsilon toksin belirlendi. Elde edilen lateks aglütinasyon bulgularının toksin nötralizasyon ve ELIA sonuçları ile karşılaştırıldığında daha az sayıdaki örnekte pozitifliği belirlemesi bakımından bu testin C.perfringens toksinlerinin tiplendirilmesinde sınırlı sonuç verdiğini ve ek tiplendirme metotlarına gereksinim olduğu sonuçları ile uyumlu bulunmuştur. Bölgede yapılan enterotoksemi çalışmaları değerlendirildiğinde Kars ilinde %3,5 ile %84 arasında değişen oranlarda C.perfringens infeksiyonlarına rastlanırken (2,3,8), Elazığ ilinde %31 ile %50 arasında infeksiyona rastlanılmıştır (7,19). Toksin tiplendirilmesi değerlendirildiğinde Kars ilinde tip A %18-47 arasında, tip B %9-30, tip C %4-69, tip D %9-39 arasında bildirilirken, tip E ise belirlenememiştir. Elazığ ilinde C.perfringens toksin tipleri değerlendirildiğinde tip A %13-95, tip C %15-31, tip D %5-54 oranlarında bildirilirken tip B ve tip E bildirimi yapılmamıştır. Bu çalışma sonuçları örneklerdeki C. perfringens pozitifliği üzerinden değerlendirildiğinde Kars ilindeki pozitif sonuçlar ile uyumlu, Elazığ ilinde yapılan çalışmalardan yüksek bulunmuştur. Tiplendirilen toksinler yönünden tip A bulguları Kars ilindeki çalışmalar ile benzer iken, Elazığ ilinden düşüktür. Tip B için Kars ili ile uyumlu bulunmuş ancak Elazığ ilinde tip B bulunamadığı için karşılaştırılamamıştır. Tip C bulguları Elazığ ili ile uyumlu bulunurken Kars ilindeki bulgulardan düşük bulunmuş, tip D bulguları her iki il ile de benzer bulunmuştur. Tip E ise bu çalışmada da belirlenememiştir. Bu bulgu diğer araştırıcıların sonuçları ile paralel bulunmuştur. Erzurum iline yakın illerde yapılan çalışmalar ile bu çalışma bölgede enterotokseminin yaygınlığını ve toksinlerinin tip dağılımı da ortaya koymaktadır. Bu çalışma ile Erzurum ilinde %52,8 oranı ile enterotokseminin yaygın bir infeksiyon olduğu belirlendi. Tiplendirme yöntemleri bakımından ELIA metodunun, toksin nötralizasyon ve lateks aglütinasyon metotlarına göre daha fazla örnekte pozitiflik verdiği görüldü. ELIA sonuçlarına göre tip A nın en yüksek düzeyde olduğu, bunu tip C ve

15 eyitoğlu ve ark.. Etlik Vet Mikrobiyol Derg, 23, 39-43, tip D nin takip ettiği, daha az oranda da tip B nin bulunduğu tespit edildi. Bu sonuçlar diğer enterotoksemi çalışmaları ile karşılaştırıldığında, enterotoksemi vakalarının hayvan popülasyonu, merada beslenme, aşılamalar, coğrafik durum ve iklim gibi pek çok parametreden etkilendiğini göstermektedir. Elde edilen bu sonuçlar ile Erzurum ilinde enterotoksemi kontrolünde aşılamaların kontrollü, yaygın bir şekilde yapılmasının ve uygulanacak aşılarda başta tip A olmak üzere, tip C, tip D ile tip B nin de bulundurulmasının gerekli olduğu düşünülmektedir. Teşekkür Bu çalışma TC. Gıda, Tarım ve Hayvancılık Bakanlığı Tarımsal Araştırmalar Genel Müdürlüğü tarafından TAGEM/H/09/01/02/148 nolu proje olarak desteklenmiştir. Kaynaklar 1. Akan M, (2006). Clostridium Hastalıkları. Aydın N, Paracıkoğlu J. Eds. Veteriner Mikrobiyoloji (Bakteriyel Hastalıklar). İlke Emek Yayınları, Ankara. p Gökçe Hİ, Genç O, özmen M, Gökçe G, (2007). Determination of Clostridium perfringens toxins types in sheeps with suspected enterotoxemia in Kars province. Turk. J. Vet. Anim. ci. 31, Gökçe E, Ünver A, Erdoğan HM, (2010). İshalli neonatal kuzularda enterik patojenlerin belirlenmesi. Kafkas Univ Vet Fak Derg. 16, Idrissi AH, Ward GE, (1992). Evaluation of enzyme-linked immunosorbent assay for diagnosis of Clostridium perfringens enterotoxemias. Vet Microbiol. 31, Islam KBM, ahman M, Ershauzzaman M, Taimur MJFA, Jang H, ong H, (2010). Detection of C.perfringens and its toxinotypes by ELIA from enterotoxaemic goats in Bangladesh. Korean J Vet erv. 33, Kadra B, Guillou JP, Popoff M, Bourlioux P, (1999). Typing of sheep clinical isolates and identification of enterotoxigenic C.perfringens strains by classical methods and polymerase chain reaction (PC). FEM Immunol Med Microbiol. 24, Kalender H, Ertas HB, Cetınkaya B, Muz A, Arslan N, Kılıc A, (2005). Typing of isolates of Clostridium perfringens from healthy and diseased sheep by multiplex PC. Vet Med Czech. 50, Koç, Gökçe Hİ, (2007). Determination of the toxins and biotypes of C.perfringens in diarrhoeic calves in the Kars district of Turkey. Turk J Vet Anim ci. 31, Laboratuvar Metot Birliği. Koruma-Kontrol Genel Müdürlüğü, Ankara. Erişim adresi: tr/genel/birimfaal.html 10. McClane B, trouse J, (1983). apid detection of C.perfringens type A enterotoxin by Enzyme-Linked Immunosorbent Assay. J Clin Microbiol. 19, Miyakawa MEF, Uzal FA, (2005). Morphologic and physiologic changes induced by Clostridium perfringens type A alfa toxin in the intestine of sheep. AJV. 66, Miyakawa MEF, Fisher DJ, Poon, ayeed, Adams V, ood J, McClane BA, Uzal FA, (2007). Both Epsilon toxin and Beta toxin are important for the lethal properties of C.perfringens type B isolates in the Mouse intravenous injection model. Infect Immun. 75, Moller K, Ahrens P, (1996). Comparison of toxicity neutralization-elia and PC tests for typing of Clostridium perfringens and detection of the enterotoxin gene by PC. Anaerobe. 2, Naylor D, Martin PK, Barker LT, (1997). Detection of Clostridium perfringens alfa toksin by enzyme-linked immunosorbent assay. es Vet ci. 63, Niilo L, (1980). C.perfringens in animal disease: a review of current knowledge. Can Vet J. 21, Niilo L, (1986). Experimental production of hemorragic enterotoxemia by C.perfringens tip C in maturing lamb. Can J Vet es. 50, Niilo L, (1987). Toxigenic characteristics of C.perfringens tip C in enterotoxemia in domestic animals. Can J Vet es. 51, OIE (2004). Epsilon toxin of Clostridium perfringens. Institute for International Cooperation in animal biologics. Iowa tate University. 19. Özcan C, Gürçay M, (2000). Elazığ ve çevresinde yılları arasında küçük ruminantlarda enterotoksemi ınsidensi. Turk J Vet Anim ci. 24, osskopf-treicher U, Volkers P, Werner E, (2003). Control of Clostridium perfringens vaccines using an indirect competitive ELIA for the epsilon toxin component. Pharmeuropa Bio. 2, Uzal FA, Niealsen K, Kelly W, (1997). Detection of Clostridium perfringens type D epsilon antitoxin in serum of goats by competitive and indirect ELIA. Vet Microbiol. 51, Uzal FA, Kellay W, Thomas, Hornitzy M, Galea F, (2003). Comparison of four techniques for the detection of Clostridium perfringens type D epsilon toxin in intestinal contents and other body fluids of sheep and goats. J Vet Diagn Invest. 15, Watson PJ, choles FE, (2009). Clostridium perfringens type D epsilon intoxication in one day old calves. Vet ec. 164,

16 44 Etlik Vet Mikrobiyol Derg, 23, 44-48, Metin Etlik Vet Mikrobiyol Derg, 23, 44-48, Araştırma 2012 Makalesi / esearch Article Phenotypic characteristics of Listonella anguillarum strains isolated from rainbow trout (Oncorhynchus mykiss, Walbaum) farms in Turkey eçil METİN üleyman Demirel University, Eğirdir Fisheries Faculty, İsparta, Turkey Geliş Tarihi / eceived: , Kabul Tarihi / Accepted: ummary: In the present study, nine isolates of Listonella anguillarum were characterized isolated from epizootics at five rainbow trout fresh water farms in Middle and Mediterranean region of Turkey. Infected rainbow trout exhibited lethargy, dark skin, bilateral exophthalmos, spilling of scales, furuncles on the sides of the body, haemorrhage in the skin, mouth, eyes, fins and anus. Necropsy findings included haemorrhage in the liver, adipose tissue and muscles, pale kidney and liver, enlarged spleen, ascites in the body cavity, yellowish-bloody fluid in the stomach and intestine. amples for bacteriological examinations were collected from the kidney and liver by using sterile swabs; these samples were streaked onto trypticase soy agar supplemented with 1% NaCl plates, and incubated at 25 C for 48 h. Nine bacterial isolates were obtained from sick fish. L.anguillarum isolates was identified by conventional methods and API 20 E. Phenotypic characteristics of the isolates were found as homogenous. All of L.anguillarum isolates were sensitive to trimethoprim, tetracycline, oxytetracycline, enoxacin and resistance to flucloxacillin, sulfamethoxazole, amoxicillin and ampicillin. Key words: Listonella anguillarum, Oncorhynchus mykiss, phenotypic characteristics, rainbow trout, vibriosis. Türkiye de gökkuşağı alabalığı çiftliklerinden izole edilen Listonella anguillarum suşlarının fenotipik özellikleri Özet: Bu çalışmada Türkiye de İç Anadolu ve Akdeniz bölgesinde bulunan 5 gökkuşağı alabalığı çiftliklerinde meydana gelen salgınlardan izole edilen 9 Listonella anguillarum izolatının fenotipik özellikleri belirlenmiştir. Enfekte gökkuşağı alabalıklarında letarji, deri renginde koyulaşma, bilateral ekzoftalmus, pullarda dökülme, vücut yüzeyinde furunkuller, deri, ağız, göz, yüzgeç ve anüste hemorajiler görülmüştür. İç bakıda asites, karaciğer, yağ doku ve kaslarda hemoraji, karaciğer ve böbrekte solgunluk, dalakta genişleme, mide ve bağırsakta sarı renkli kanlı sıvı birikimi tespit edilmiştir. Bakteriyolojik incelemeler için karaciğer ve böbrekten alınan örnekler, %1 NaCl ilave edilmiş Triptik oy Agara ekilmiş ve 25 C de 48 saat süre ile inkübe edilmiştir. L.anguillarum izolatları (n=9) geleneksel bakteriyolojik yöntemler ve API 20 E kullanılarak identifiye edilmiştir. İzolatların fenotipik özelliklerinin homojen olduğutespit edilmiştir. Yapılan antibiyogram testinde tüm izolatların trimethoprim, tetrasiklin, oksitetrasiklin, enoksasin e duyarlı ve flukloksasillin, sülfamethakzol, amoksisillin ve ampisilline karşı dirençli oldukları belirlenmiştir. Anahtar kelimeler: Fenotipik özellikler, gökkuşağı alabalığı, Listonella anguillarum, Oncorhynchus mykiss, vibriosis. Introduction Vibriosis is one of the most prevalent fish diseases caused by several bacterial species belonging to the genus Vibrio. Bacteria species belong to Vibrio genus exist normally in the microflora of intestine and skin of healthy marine and freshwater fishes. However, epizootics of vibriosis appear to the stressing conditions such as grading, transporting, malnutrition, negative environmental status and unsuitable water quality. Listonella anguillarum is the causative agent of vibriosis isolated from marine fishes, mainly sea bream, sea bass (1, 3, 8, 12, 20). However, vibriosis infections have been reported in salmonid fish especially, rainbow trout in the past years (9, 11, 13, 14, 19). ecently, has reported that it also caused important losses in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) cultured in freshwater in Turkey (16, 17, 18). The aim of present study was to determine the phenotypic characteristics and antimicrobial sensi- Yazışma adresi / Correspondance: eçil Metin, üleyman Demirel Üniversitesi Eğirdir u Ürünleri Fakültesi, İsparta, Türkiye Eposta: secil_ekici@yahoo.com, secilekici@sdu.edu.tr

17 Metin. Etlik Vet Mikrobiyol Derg, 23, 44-48, tivity caused by L.anguillarum isolated from rainbow trout in different farms located in the Middle and Mediterranean regions of Turkey. Materials and Methods ampling: The outbreaks were occurred rainbow trout (body weight g) in five different fresh water farms in the Middle and Mediterranean regions of Turkey. amples came from 5 fish farms during The postmortem examinations of external and internal disease signs were performed. Isolation and identification of bacteria: For bacterial isolation, samples were obtained from the kidney and liver of 10 fish, streaked on trypticasesoy agar (TA, Merck) supplemented with 1% NaCl plates, and incubated at 25 C for 48 h. ingle colonies were restreaked on the same media to obtain pure isolates. Isolated colonies were identified by physiological and biochemical characterization. outine tests were carried out for determination of biochemical characteristics of the bacteria, as described previously (6, 7, 10). A presumptive identification of the strain was performed using the following tests: Gram staining, motility, fermentative degradation of glucose with O/F basal medium (Merck) supplemented with 1% glucose, oxidase, catalase, production of indole, citrate utilization, hydrolysis of starch and gelatine, Methyl red-voges proskouer tests, production of H 2, growth at peptone water with 0, 2, 7, 8 and 10% NaCl, growth in thiosulphate citrate bile salts sucrose agar (TCB), growth at Tryptic oy Broth at 4 C, 25 C, 37 C, inhibition by the vibriostatic agent O/129 (2,4-diamino-6,7-di isopropylpteridine; Oxoid) and fermentation of carbohydrates (glucose, arabinose, inositol, saccharose, maltose, fructose, lactose, galactose, rhamnose, mannitol, sorbitol, amygdalin, mellibiose). Additional test were performed using API 20 E (biomérieux) (2). In all the tests, L.anguillarum ATCC was used as a reference. Antimicrobial sensitivity: Antimicrobial tests were performed on the isolate at 25 C by using a disc diffusion assay on Mueller-Hinton agar (Oxoid). CLI standards were used for the evaluation of the results (5). esults Necropsy findings of moribund rainbow trout included haemorrhage in the liver, adipose tissue and muscles, pale kidney and liver, ascites in the body cavity, yellowish-bloody fluid in the stomach and the intestine, enlarged spleen. The external signs were lethargy, dark skin, exophthalmos, spilling of scales, haemorrhage and furuncle in skin, haemorrhage in the eyes, the fins, the mouth and the anus (Figure 1). The mortality changed from 25 to 30% in the farms. For isolation, samples taken from kidneys and livers of sick fishes streaked onto tryptic soy agar (TA, Merck) supplemented with 1% NaCl. Colonies on the TA appear white, entire, smooth, convex and 2-3 mm in diameter after 48 h growth at 25 C. Isolates were found to be Gram negative, straight or slightly curved rods, fermentative, motile, producing yellow colonies on TCB Agar, positive for oxidase, catalase and hydrolysis of gelatine and sensitive to 0/129 Vibriostat test (10 and 150 μg), positive for indol production, gas production from saccharose and mannitol and negative for decarboxylation of lysine and ornithine (Table 1). All L.anguillarum isolates were sensitive to oxytetracycline, tetracycline, enoxacin and trimethoprim and resistant to sulfamethoxazole, amoxicillin, ampicillin and flucloxacillin. However, the isolates showed different antimicrobial sensitivities for trimethoprim+ sulfamethoxazole, doxycycline and furazolidone (Table 2).

18 46 Metin. Etlik Vet Mikrobiyol Derg, 23, 44-48, 2012 Table 1. The phenotypic characteristics of L.anguillarum strains L.anguillarum strains Charecteristics A1 B1 K1 C1 C2 C3 A4 A6 M1 ATCC Growth in TCB +, Y +,Y +,Y +, Y +, Y +, Y +, Y +, Y +, Y +, Y Gr staining Motility O Catalase O/F F F F F F F F F F F O/129 (10µg) O/129 (150µg) Arginine dihydrolase β galactosidase Lysine decarboxylase Ornithine decarboxylase H 2 Urea Hydroliyis of gelatine Hydrolysis of starch Production of indole M VP NO 3 reduction Growth: in 0% NaCl in 2% NaCl in 7% NaCl _ in 8% NaCl in 10% NaCl at 4 C at 25 C at 37 C at 42 C Utilization of citrate Fermentation of carbohydrates Glucose Arabinose _ Inositol accharose Maltose Fructose Lactose Galactose hamnose Mannitol orbitol Amygdalin Mellibiose (+): positive, (-): negative, (Y): Yellow; (F): fermantative; A, B, C, K, M codes refer to different farms: A, B, C, M in Mediterranean region, K in Middle region

19 Metin. Etlik Vet Mikrobiyol Derg, 23, 44-48, Figure 1. ainbow trout naturally infected with L.angullarum. a) Furuncle, spilling of scales and hemorrhage on the side of the body. b) Exophthalmos and hemorrhage in eye. c) Hyperemia and hemorrhage in adipose tissue. d) Hemorrhage in the liver Table 2. Antibiotics sensitivities of L.anguillarum strains L.anguillarum strains Antibiotics (µg/disc) A1 B1 K1 C1 C2 C3 A4 A6 M1 Oxolinic Acid ( 2) Amoxicillin (25) Trımethoprim+ulfamethoxazole (25) Doxycycline (30) Tetracycline (30) Oxytetracycline (30) Enoxacin (10) Furazolidone (100) I I Flucloxacillin (5) ulfamethoxazole (100) Trimethoprim (5) Ampicillin (10)

20 48 Metin. Etlik Vet Mikrobiyol Derg, 23, 44-48, 2012 Discussion and Conclusion Clinical findings during epizootics at five rainbow trout fresh water farms in Middle and Mediterranean region of Turkey were similar to those previously described by Bullock (4), Timur and Korun (18), Balebona et al. (3) and Tanrıkul (17). The biochemical and culture characteristics of L.anguillarum strains were found substantially similar in the present study. Tanrıkul (17) also was reported same biochemical characteristics L.anguillarum strains from different localities and different times in rainbow trouts in Turkish farms. However, different results were found among strains in terms of M-VP and fermentation of arabinose. Myhr et al.(15) noted variable results for VP test in L.anguillarum strains from salmonid fish (15). All L.anguillarum isolates were sensitive to oxytetracycline in the present study, while Tanrıkul (17) was found variable results for oxytetracycline sensitivitiy (17). All L.anguillarum isolates were sensitive to oxytetracycline, tetracycline, enoxacin and trimethoprim. However, Tanrıkul (17) reported that all L.anguillarum isolates (n=12) were sensitive to amoxicillin, ampicillin, furazolidone, oxolinic acid (17). In conclusion, the biochemical and culture characteristics of L.anguillarum strains isolated from rainbow trout in different farms located in the Middle and Mediterranean regions of Turkey were found substantially similar. In addition all L.anguillarum isolates were sensitive to oxytetracycline, tetracycline, enoxacin and trimethoprim in this study. Thus, this antibiotics have been used in controlling vibriosis in rainbow trout. eferences 1. Akaylı T, (2001). Diagnosis of Vibriosis by ELIA and methods in cultured sea bream (parus auratus, L 1758). Ph.D Thesis, İstanbul Univ Fisheries Faculty, İstanbul. 2. Austin B, Austin DA, (2007). Bacterial Fish Pathogens: Disease in Farmed and Wild Fish. 4 th ed. Praxis Publishing, Chichester, p Balebona CM, Zorilla I, Morinigo MA, Borrege JJ, (1998). urvey of bacterial pathologies affecting farmed gilt head sea bream (parus aurata, L) in south western pain from 1990 to Aquacult. 166, Bullock GL, niesko F, (1971). Bacterial Diseases of Fish. Diseases of Fishes, book 2A, T.F.H., p CLI (Clinical Laboratory tandards Institute), (2006). Performance standards for antimicrobial susceptibility testing.16th Informational upplement. 6. Collins CH, Lyne PM, (1976). Microbiological Methods. 4 th ed. Butterworths, p Cowan T, teel KJ, (1970). Manual for the Identification of Medical Bacteria. Cambrige at University Press, p Çağırgan H, (1993). An investigation on the diagnosis and the treatment of cultured sea bass and sea bream. Ph. D Thesis, Ege University Fisheries Faculty, İzmir. 9. Giorgetti G, Ceschia G, (1982). Vibriosis in rainbow trout, almo gairdneri ichardson, in fresh water in north-eastern Italy. J Fish Dis. 5, Holt J, Krieg N, neath PHA, taley JI, Willians T,(1994). Bergey s Manual of Determinative Bacteriology. 9 th ed. Williams & Wilkins, p Holt G, (1970). Vibriosis (Vibrio anguillarum) as an epizootic disease in rainbow trout (almo gairdneri). Acta Vet cand. 11, Korun J, (2006). A study on Listonella anguillarum infection occurred in cultured gilt-head sea bream (parus aurata L.). EU J Fish Aquat ci. 23, Malnar L, Čož-akovac, Hacmanjek M, Teskeredžić Z, Teskeredžić E, trunjak-perović I, McLean E, Naglić T, (1996). Vibriosis in rainbow trout cultured in the Krka estuary, Croatia: occurrence and comments. Vet Med. 41, McCarthy DH, tevenson, JP, oberts M, (1974). Vibriosis in rainbow trout. J Wildlife Dis. 10, Myhr E, Larsen JL, Lillehaug A. Gudding, Heum M, Hastein T, (1991). Characterization of Vibrio anguillarum and closely related species isolated from farmed fish in Norway. Appl Environ Microbiol. 57, Tanrıkul T, Gültepe N, (2011). Mix Infections in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss Walbaum): Lactococcus garvieae and Vibrio anguillarum O1. J Anim Vet Adv. 10, Tanrıkul T, (2007). Vibriosis as an epizootic disease of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) in Turkey. Pakistan J Biolog ci. 10, Timur G, Korun J, (2004). First outbreak of vibriosis in farmed rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) in Turkey. Istanbul Univ J Aquat ci. 18, oss AJ, Martin JE, Bressler V, (1968). Vibrio anguillarum from an epizootic in rainbow trout (almo gairdneri) in the U..A. Bull Off Int Epizoot Zorrilla I, Arijo, Chabrillon M, Diaz P, Martinez- Manzanares E, Balebona M, Moriňigo MA, (2003). Vibrio species isolated from diseased farmed sole, olea senegalensis (Kaup) and evaluation of the potential virulence role of their extracellular products. J Fish Dis. 26,