ANKARA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ

Transkript

1 ANKARA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ Lactococcus garvieae İLE İNFEKTE EDİLEN TİLAPİA BALIKLARINDA (Oreochromis niloticus L.) PLAZMA LİZOZİM AKTİVİTESİNİN BELİRLENMESİ Faik Sertel SEÇER SU ÜRÜNLERİ ANABİLİM DALI ANKARA 2007 Her hakkı saklıdır.

2 ÖZET Yüksek Lisans Tezi Lactococcus garvieae İLE ENFEKTE EDİLEN TİLAPİA BALIKLARINDA (Oreochromis niloticus L.) PLAZMA LİZOZİM AKTİVİTESİNİN BELİRLENMESİ Faik Sertel SEÇER Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Su Ürünleri Anabilim Dalı Danışman: Doç. Dr. Hijran YAVUZCAN Bu çalışmada Tilapia balıklarında (Oreochromis niloticus L.) Gram pozitif bir bakteri olan Lactococcus garvieae nın sublethal dozda non-spesifik bağışık yanıtın önemli parametrelerinden plazma lizozim aktivitesi ve hematokrit değere etkisi değerlendirilmiştir. Bu parametreler; i) L.garvieae ile intraperitonal enjeksiyonla sublethal dozda deneysel olarak enfekte edilen balıklarda (Grup L); ii) deneysel olarak enfekte edilen balıklarla birlikte kohabitasyona bırakılan balıklarda (Grup LK); iii) PBS verilen kontrol grubu balıklarında (Grup P) ve iv) herhangi bir işleme tabi tutulmayan kontrol grubu balıklarda (Grup PK) ölçülmüştür. Deneysel enfeksiyon L.garvieae nın intraperitonal enjeksiyonu ile gerçekleştirilmiştir. L.garvieae nın tilapia balıklarındaki LC 50 değeri Kärber metoduna göre 1x10 10 kob/ml olarak saptanmıştır. Sublethal doz 1x10 9 kob/ml intraperitonal (i.p) olarak uygulanmıştır. Kontrol grubuna aynı miktarda PBS i.p olarak verilmiştir. Örnekleme, enjeksiyonu takiben 3., 5. ve 7. günlerde yapılmıştır. Plazma lizozim aktivitesi Grup L balıklarında günlere bağlı olarak değişim göstermiştir (P<0,05); 3. günde 11,5 ± 3,03 U/ml; 5. günde 19,3 ± 3,83 U/ml; 7. günde 6,1 ± 0,949 U/ml olarak ölçülmüştür. Plazma lizozim aktivitesi Grup LK balıklarında günlere bağlı olarak değişim göstermiştir (P<0,05); 3. günde 17,4 ± 2,83 U/ml; 5. günde 7,4 ± 1,54 U/ml; 7. günde 8,1 ± 2,67 U/ml olarak ölçülmüştür. Plazma lizozim aktivitesi Grup P balıklarında günlere bağlı olarak değişim göstermiştir (P<0,05); 3. günde 14,6 ± 4,86 U/ml; 5. günde 21,0 ± 9,30 U/ml; 7. günde 9,8 ± 1,53 U/ml olarak ölçülmüştür. Plazma lizozim aktivitesi Grup PK balıklarında günlere bağlı olarak değişim göstermiştir (P<0,05); 3. günde 9,2 ± 1,32 U/ml; 5. günde 5,8 ± 1,86 U/ml; 7. günde 7,6 ± 1,29 U/ml olarak ölçülmüştür. Hematokrit değeri Grup L balıklarında günlere bağlı olarak değişim göstermiştir (P<0,001); 3. günde % 21,20 ± 0,50; 5. günde % 18,24 ± 0,80; 7. günde % 10,59 ± 0,83 olarak ölçülmüştür. Hematokrit değeri Grup LK balıklarında günlere bağlı olarak değişim göstermiştir (P<0,001); 3. günde % 22,64 ± 0,46; 5. günde % 18,88 ± 0,53; 7. günde % 12,14 ± 0,66 olarak ölçülmüştür. Hematokrit değeri Grup P ve Grup PK balıklarında günlere bağlı olarak değişim göstermiştir (P<0,001); Grup P balıklarında 3. günde % 22,42 ± 0,50; 5. günde % 13,84 ±0,45; 7. günde % 11,54 ± 0,49 olarak ölçülmüştür. Hematokrit değeri Grup PK balıklarında 3. günde % 22,13 ± 0,68; 5. günde % 19,92 ± 0,52; 7. günde % 14,37 ± 0,45 olarak ölçülmüştür. Tilapia balıklarında L.garvieae nın horizontal bulaşma potansiyeli bulunmaktadır. Ancak plazma lizozim aktivitesi, L.garvieae ile enfekte tilapia balıklarında sabit bir değişim göstermemiştir. 2007, 47 Sayfa Anahtar Kelimeler: Lactococcus garvieae, tilapia balığı, Oreochromis niloticus, kohabitasyon, plazma lizozim aktivitesi, hematokrit değeri. i

3 ABSTRACT Master Thesıs DETERMINING THE PLASMA LYSOZYME ACTIVITY in THE NILE TILAPIA (Oreochromis niloticus L.) INFECTED BY Lactococcus garvieae Faik Sertel SEÇER Ankara University Gradute School of Natural and Applied Sciences Department of Fisheries and Aquaculture Supervisor: Assoc. Prof. Dr. Hijran YAVUZCAN In this study the plasma lysozyme activity, as an indicator of non-spesific immune response, and hematocrit value were evaluated in tilapia (Oreochromis niloticus L.) experimentally infected with Gram positive bacterium Lactococcus garvieae at a sublethal dose. Plasma lysozyme activity and hematocrit value were measured in fish; i) experimentally infected fish via intraperitonally injection of L.garvieae at a sublethal dose (Group L); ii) cohabitated fish with experimentally infected fish (Group LK); iii) control fish injected with PBS (Group P) and iv) control fish without any application (Group PK). Experimental infection were carried out by intraperitonally injection of L.garvieae. LC 50 value of L.garvieae assessed acccording to Kärber is 1x10 10 cfu/ml. For the experimental infection sublethal dose of 1x10 9 cfu/ml was injected by intraperitonally. PBS was given to the control group at the same volume. Sampling was made at 3 rd, 5 th and 7 th days after challenge. Plasma lysozyme activity in Group L change during the experiment days (P<0.05). Plasma lysozyme activity values in Group L was measured as 11.5 ± 3.03 U/ml in the 3 rd day; 19.3 ± 3.83 U/ml in the 5 th day and 6.1 ± 0.95 U/ml in the 7 th day. Plasma lysozyme activity in Group LK was decreased during the sampling days (P<0.05). Plasma lysozyme activity values in Group LK was measured as 17.4 ± 2.83 U/ml in the 3 rd day; 7.4 ± 1.54 U/ml in the 5 th and 8.1 ± 2.67 U/ml in the 7 th day. Plasma lysozyme activity in Group P was decreased during the experiment days (P<0.05). Plasma lysozyme activity values in Group P was measured as 14.6 ± 4.86 U/ml in the 3 rd day; 21.0 ± 9.30 U/ml in the 5 th and 9.8 ± 1.53 U/ml in the 7 th day. Plasma lysozyme activity in Group PK increased depending on sampling days (P<0.05). Plasma lysozyme activity values in Group PK was measured as 9.2 ± 1.32 U/ml in the 3 rd day; 5.8 ± 1.86 U/ml in the 5 th and 7.6 ± 1.29U/ml in the 7 th day. Hematocrit values in Group L was decreased during the sampling days days (P<0.001). Hematocrit values in Group L was measured as ± 0.50% in the 3 rd ; ± 0.80% in the 5 th and ± 0.83% in the 7 th day. Hematocrit values in Group LK was decreased during the experiment days (P<0.001). Hematocrit values in Group LK was measured as ± 0.46% in the 3 rd ; in the 5 th ± 0.53% and ± 0.66% in the 7 th day. Hematocrit values in Group P and Group PK were decreased depending on sampling days (P<0.001). Hematocrit values in Group P was measured as ± 0.50% in the 3 rd ; ± 0.45% in the 5 th and ± 0.49% in the 7 th day. Hematocrit values in Group PK was measured as ± 0.68% in the 3 rd ; ± 0.52% in the 5 th and ± 0.45% in the 7 th day. There is a potential of horizontal infection risk in tilapia infected with L.garvieae. However a constant change in the plasma lysozyme activity has not been detected in tilapia fish that infected with L.garvieae. 2007, 47 pages Key Words: Lactococcus garvieae, Nile tilapia, Oreochromis niloticus, cohabitation, plasma lysozyme activity, hematocrit. ii

4 TEŞEKKÜR Bu çalışmada öncelikle bana bu konuyu veren, çalışmanın her aşamasında yardımlarını esirgemeyen, önerileriyle beni yönlendiren danışman hocam Sayın Doç. Dr. Hijran YAVUZCAN a, LC 50 dozunun belirlenmesinde, balıkların organlarından bakterinin geri izolasyonu ve identifikasyonunda yardımlarını esirgemeyen Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı Öğretim Elemanlarına, istatistik analizlerinin yapılmasında ve değerli yardımlarını esirgemeyen Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Biyoistatistik Anabilim Dalı ndan Araştırma Görevlisi Aytaç AKÇAY a, Tilapia balıklarının temininde yardımlarını esirgemeyen Çukurova Üniversitesi Su Ürünleri Fakültesi nden Doç. Dr. Mehmet YANAR a, Lactococcus garvieae nin temininde yardımlarını esirgemeyen Süleyman Demirel Üniversitesi Eğirdir Su Ürünleri Fakültesi nden Doç. Dr. Ayşegül KUBİLAY a, deneme sırasında yardımlarını gördüğüm hocalarım ve mesai arkadaşlarıma teşekkürlerimi sunarım. Ayrıca çalışmalarım boyunca maddi ve manevi yanımda olarak beni destekleyen aileme teşekkürlerimi bildiririm. F. Sertel SEÇER Ankara, Temmuz 2007 iii

5 İÇİNDEKİLER ÖZET i ABSTRACT ii TEŞEKKÜR iii SİMGELER DİZİNİ vi KISALTMALAR... vi ŞEKİLLER DİZİNİ... vii ÇİZELGELER DİZİNİ... viii 1. GİRİŞ KAYNAK ÖZETLERİ Tilapia Balıkları Lactococcus garvieae Lethal Konsantrasyon 50 (LC 50 ) Plazma Lizozim Aktivitesi Hematokrit Değeri MATERYAL ve YÖNTEM Materyal Deneme yeri Balık materyali Deney akvaryumları Su materyali Denemede kullanılan Lactococcus garvieae Besi yerleri Denemede kullanılan diğer araç ve gereçler Yöntem Deney balıklarının hazırlanması Deneme ortamı Deneme yöntemi L.garvieae nin LC 50 dozunun belirlenmesi Deneysel düzen Deneme sürecinde L.garvieae izolasyonu ve identifikasyonu Kan örneklerinin alımı Hematokrit değerinin belirlenmesi Kan örneklerinden plazma elde edilmesi Plazma lizozim aktivitesinin ölçülmesi Balıkların davranışlarının incelenmesi İstatistiki değerlendirme BULGULAR. 18 iv

6 4.1 L.garvieae nin LC 50 Değerinin Belirlenmesi Deneme Gruplarınında Ölüm Oranı ve Lactococcus garvieae İzolasyonuna İlişkin Bulgular Standart ve İzole Edilen Suşların Karakterizasyon Bulguları Plazma Lizozim Aktivitesine İlişkin Bulgular Hematokrit Değerine İlişkin Bulgular Makroskobik Bulgular TARTIŞMA ve SONUÇ.. 24 KAYNAKLAR.. 28 EKLER.. 36 EK 1 Lactococcus garvieae EK 2 Çeşitli Besi Yerlerinde L.garvieae EK 3 Hazırlanan Dilüsyonlar ve Enjeksiyon İçin Hazırlanan Enjektörle.. 40 EK 4 Kalpten Kan Alma.. 42 EK 5 Farklı Dokulardan Kanlı Agara Yapılan Ekimler Sonucu Meydana Gelen Üreme. 43 EK 6 Balıklarda Dış Bakıda Gözlenen Semptomlar 44 ÖZGEÇMİŞ.. 47 v

7 SİMGELER DİZİNİ kob i.p L M rpm Koloni oluşturan birim İntraperitonal Litre Molar Dakikada ki dönüş (tur) sayısı KISALTMALAR LC 50 PBS TSA TSB Organizmaların %50 sini öldüren konsantrasyon Fosfat tampon çözeltisi Triptik soy agar Triptik soy buyyon vi

8 ŞEKİLLER DİZİNİ Şekil 3.1 Deneme planı ve örnekleme periyodu. 15 Şekil 4.1 Deneme grupları ve kontrol gruplarındaki ölüm oranı (%) 18 vii

9 ÇİZELGELER DİZİNİ Çizelge 2.1 Bazı balık türlerinde hesaplanan LC 50 değerleri.. 6 Çizelge 2.2 Bazı sağlıklı balık türlerinde hematokrit değerleri (%) 9 Çizelge 4.1 Denemede gruplarından; ölen ve canlı kalan balıklar ile bu gruplardan L.garvieae izolasyonu Çizelge 4.2 L.garvieae ile sublethal dozda enfekte edilmiş tilapia balıklarının plazma lizozim aktivitesi (x10 3 U/ml). 20 Çizelge 4.3 L.garvieae ile sublethal dozda enfekte edilmiş tilapia balıklarının ortalama hemarokrit değerleri (%) viii

10 1. GİRİŞ Bir arada yoğun olarak tutulan balık populasyonların da zaman zaman bazı enfeksiyonlar büyük ekonomik kayıplara neden olmaktadır. Ekonomik kayıplara neden olan bu tür olayları önlemek için hastalıkların erken teşhisinde yardımcı olmak üzere son senelerde hematolojik araştırmalar gittikçe önem kazanmaktadır (Timur ve Timur 2003, Arda vd. 2005). Lactococcosis (streptococcosis), dünyada hem tatlı suda hemde deniz ortamında yaşayan birçok balık türünü etkileyen sistemik bir balık hastalığıdır (Salati et al. 2005). Sarıkuyruk balığı (Seriola quinqueradiata), pisi balığı (Paralichtys olivaceus), kalkan balığı (Scophtalmus maximus), has kefal balığı (Mugil cephalus), çipura balığı (Sparus aurata), gökkuşağı alabalığı (Oncorhynchus mykiss), mersin balığı (Acipenser naccarii), tilapia balığı (Tilapia niloticus), yılan balığı (Anguilla japonica) nda tanımlanmıştır (Kusuda et al. 1978, Kusuda and Kawai 1982, Sakai et al. 1989, Ceschia et al. 1992, Carson et al. 1993, Kim and Lee 1994, Toranzo et al. 1994, Sakai et al. 1995, Salati et al. 1996, Kusuda and Salati 1999, Gonzalez et al. 2000). Balıklardaki bağışıklık sisteminin en önemli unsuru non-spesifik bağışık yanıttır. Bu sistemin özelliği patojene karşı çok hızlı reaksiyon göstermesi ve patojeni önceden tanımlamış olmasına gerek duymamasıdır. Spesifik bağışıklığın aktive olması için de non-spesifik bağışık yanıtın aktive olmasının gerektiği bilinmektedir. Bu sistemin en iyi indikatörlerinden birisi serum/plazma lizozim aktivitesidir. Lizozim, bakterileri eritebilen çok önemli bir enzimdir ve non-spesifik bağışık yanıtın belirlenmesinde kullanılan mutlak parametrelerden birisidir (Watts et al. 2001). Lactococcus garvieae balık patojeni olarak henüz tanımlanmıştır ve entansif balık yetiştiriciliğinde oluşturduğu problemler yeni yeni çalışılmaya başlanmıştır. Bu bağlamda L.garvieae nın balığın fizyolojisine etkileri tam olarak bilinmemektedir. 1

11 Bu çalışmada tilapia balıklarına (Oreochromis niloticus) L.garvieae etkeninin intraperitonel yolla enjektasyonu ve enjekte edilen balıklarla kohabitasyon yoluyla enfekte edilen tilapia balıklarının plazma lizozim aktivitesi hematokrit değerlerinin belirlenmesi, elde edilen bulgular ışığında hastalığın horizontal bulaşma durumu ile balık fizyolojisine etkilerinin aydınlatılması amaçlanmıştır. Çalışma konusu gerek L.garvieae nın yeterince çalışılmamış olması gerekse non-spesifik sisteme etkisinin belirlenmesi kapsamında orijinal bir konudur. Çalışma balık hastalıklarında yeterince irdelenmemiş bir konuyu ele aldığından önemli bir boşluğu dolduracaktır. Ayrıca L.garvieae nın tilapia balıklarında ki horizontal bulaşma yolu da izlenmiş olacaktır. Çalışmada elde edilecek sonuçlar, bu konuda yapılabilecek diğer çalışmalara da katkıda bulunacaktır. 2

12 2. KAYNAK ÖZETLERİ 2.1 Tilapia Balıkları Cichlidae familyası içinde yer alan tilapia balıkları (Oreochromis niloticus), sazan balıklarından (Cyprinidae) sonra dünyada en çok yetiştiriciliği yapılan balık türüdür (Çelikkale 1994, Alpbaz 2005). Dünyada tilapia balıklarının üretimi 1970 yılında ton, 2001 yılında ton ve 2005 yılında tona ulaşmıştır (Alpbaz 2005 ve Anonymous 2006). Tilapia balıkları 21.yüzyılın en önemli su ürünlerinden biri olarak belirtilmiştir. Dünyada 85 ülkede yetiştiriciliği yaygın olarak yapılmaktadır ve üretilen türlerin %90 dan fazlası Oreochromis niloticus tur. Üretimin büyük kısmı Asya kıtasındadır ve birinci sırayı Çin, ikinci sırayı Filipin ler almaktadır (Bekcan 1999). Tilapia balığı, ülkemize 1974 yılında DSI Adana 6. Bölge Müdürlüğü nce Suriye den getirilmiş, 1978 yılından beri Çukurova Üniversitesi Su Ürünleri Fakültesi nde yetiştiricilik çalışmaları yapılmaktadır (Sarıhan ve Toral 1980). Biyolojik özelliklerinin uygunluğu nedeniyle Çukurova Bölgesinde yetiştiriciliği önem kazanmaktadır (Çelikkale 1994, Alpbaz 2005). Türkiye de yetiştiriciliği yapılan tür Tilapia nilotica dır (Çelikkale 1994). Tilapia balıklarının yetiştiricilikte tercih edilmesinin nedenleri, diğer balık türlerinin kullanamadığı çok çeşitli besin maddelerini değerlendirebilmeleri, kısa besin zincirine sahip olmaları, yapay yetiştiricilikte kalabalık ve sıkışık havuz koşullarının kolayca adapte olabilmeleri, genelde hastalıklara ve parazitlere dayanıklı olması ve etlerinin lezzetli olmasıdır (Çelikkale 1994). Yaklaşık 100 kadar türü olduğu bilinen tilapia balıkları, Doğu Afrika kökenlidir ve dünyanın birçok yerine yayılmıştır (Çelikkale 1994). 3

13 Afrika da özellikle Nil vadisi, Nijerya ve Doğu Afrika nın orta kısımlarındaki göllerde, Kongo nehirlerinde, Batı Afrika nehir ve göllerinde yaygın olarak bulunur (Çelikkale 1994, Alpbaz 2005). 2.2 Lactococcus garvieae Lactococcus garvieae Holt et al. (2000) a göre Gram pozitif koklar grubunda yer almaktadır. Bu grupta 23 cins olup, bunlardan birisi de Lactococcus cinsidir. Bu grupta bulunan 5 türden birisi de Lactococcus garvieae dır. Gram pozitif kok grubunda bulunan L. garvieae gram pozitif boyama özelliğinde, yuvarlak biçimli veya oval şekilli, spor oluşturmazlar ve fakültatif anaerobiktir (EK 1). Lactococcus cinsinde bulunan etkenlerin çapı 0,5-1,2 x 0,5-1,5 mikrometre arasında değişmekte olup sıvı besi yerlerinde ikili veya kısa zincirler halinde görülürler. Hareketsiz, katalaz ve oksidaz negatif ve kapsülsüzdürler. Optimum üreme sıcaklıkları 30 C dır ve 10 C nin altında üreyemezler (Holt et al. 2000). Alfonso et al. (2003) Lactococcus cinsinde bulunan etkenlerin balıkların dışında değişik hayvan türlerinde ve insanlarda enfeksiyona neden olduğunu bildirmişlerdir. Örneğin inek ve mandalarda mastitise, insanlarda endokarditise, karaciğerde apseye ve osteomiyelitise neden olduğu, insanlarda deri, idrar ve kandan izole edildiğini belirtilmişlerdir (Alfonso et al. 2003, Wang et al. 2006). İlk defa 1991 yılında Amerika da, Japonya da ve Tayvan da çiğ balık yiyen ve çiğ balıkla temas eden insanlarda görülmüştür (Wang et al. 2006). L. garvieae nın balıklarda oluşturduğu hem deneysel hem de doğal enfeksiyonlarla ilgili değişik balık türlerinde sınırlı sayıda araştırma yapılmıştır (Çağırgan ve Tanrıkul 1995, Muzquiz et al. 1999, Diler vd. 2002, Çağırgan 2004, Salati et al. 2005). 4

14 Muzquiz et al. (1999) gökkuşağı alabalıklarında L.garvieae nın klinik olarak ekzoftalmus, karında şişkinlik, gözde kanamalar, kuyruk ve yüzgeç diplerinde hemorajiler, otopside karaciğer, yüzme kesesi ve barsaklarda hemorajiler belirlediklerini açıklamışlardır. Alfonso et al. (2003) de alabalıklarda aynı semptomları belirtmiş, enfeksiyonun populasyon içerisinde dağılımının balık vücudundaki portentrelerden veya rektal-oral yolla meydana geldiğini ve etkenin su ve dip toprağından da izole ve identifiye edildiğini belirtilmiştir. Salati et al. (2005) L. garvieae nın Muzquiz et al. (1999) ile benzer klinik ve otopsi bulgularını saptadıklarını açıklamışlardır. Çağırgan ve Tanrıkul (1995) alabalık çiftliklerinde Enterococcus-benzeri bir hastalık tanımladıkları ve 2004 te Çağırgan tarafından, izolo ettikleri L. garvieae suşu fenotipik ve serolojik özelliklerini çalışmışlardır. Diler vd. (2002), Türkiye de gökkuşağı alabalıklarından L. garvieae yı izole ve identifiye ettiklerini, enfeksiyonda gözlenen klinik-nekropsi bulgularını ve izolasyon sonucu etkenin fenotipik karakterlerini bildirmişlerdir. 5

15 2.3 Lethal Konstantrasyon 50 (LC 50 ) Bazı bakterilerin LC50 değerleri farklı çalışmalarda tanımlanmıştır (Çizelge 2.1). Çizelge 2.1 Bazı balık türlerinde hesaplanan LC 50 değerleri Bakteri Adı Balık Adı LC 50 Referans Aeromonas hydrophila Altın balık kob/ml Qian et al. (Carassius auratus) (1995) Aeromonas hydrophila Aynalı sazan 15 x 10 8 kob/ml Erer (Cyprinus carpio) (1981) Aeromonas hydrophila Tilapia 2,1 x 10 4 kob/ml Khalil et al. (Tilapia nilotica) (1997) Edwardsiella ictaluri Chinook salmon 3,4 x 10 7 kob/ml Baxa et al. (Oncorhynchus tshawytscha) (1990) Edwardsiella tarda Kanal Yayını 3,4 x 10 7 kob/ml Wiedenmayer (Ictalurus punctatus) et al. (2006) Streptococcus iniae Barramundi 2,5 x 10 5 kob/ml Bromage et al. (Lates calcarifer) (48. saatte) (1999) Streptococcus iniae Barramundi 3,2 x 10 4 kob/ml Bromage et al. (Lates calcarifer) (10.günde) (1999) 2.4 Plazma Lizozim Aktivitesi Doğal ve deneysel enfeksiyon sonucu vücutta spesifik olmayan immun yanıtı meydana gelmekte ve bunlara karşı koruma mekanizması ortaya çıkmaktadır (Ingram 1980, Rijkers 1982). Bu sistemin yapılarından biri lizozim olup, bu enzim özellikle Gram pozitif bakterilerin hücre duvarındaki peptidoglukanı parçalayarak bakterinin lize olmasını sağlamaktadır (Chipman and Sharon 1969). Ayrıca Gram negatif bakterileri de etkiledikleri açıklanmıştır (Grinde 1989). Lizozimin direkt antimikrobiyel etkileri yanında, fagositozisi de arttırma özelliği vardır (Engstad et al. 1992). 6

16 Lizozim birçok balığın kan serumunda, kan plazmasında, mukus salgısında, organlarında ve fagositik hücrelerinde bulunduğu araştırıcılar tarafından bildirilmiştir (Ellis and Schlotfeldt 1978, Studnicka et al. 1986, Siwicki and Studnicka 1987, Caruso et al. 2002). Dil balıklarının nötrofil, monosit ve makrofajdan zengin dokuları, yüksek derecede lizozim içerirler. Buna karşın fagositik hücrelerden yoksun diğer dokular örneğin karaciğer, lizozimden fakirdir (Ellis and Schlotfeldt 1985). Caruso and Lazard a göre (1999), plazma lizozim seviyeleri balığın cinsiyetiyle, yaşam alanıyla, vücut uzunluğuyla, ağırlığıyla kondisyon faktörüyle ve stoklama yoğunluğuyla ilişkili değildir. Dil balıklarına lateks partiküllerinin intravenöz enjeksiyonu, beş saat içerisinde lizozimi %50 arttırmaktadır. Balıklardaki lizozim aktivitesi mevsimsel faktörlere (sıcaklığa) bağlıdır (Ellis and Schlotfeldt 1978). Bazı durumlarda stres, lizozim aktivitesini düşürürken (Möck and Peters 1990, Yin et al. 1995, Jeney et al. 1997, Yıldız 2006), bazen de artırmaktadır (Fevolden et al. 1991, Roed et al. 1993). Möck and Peters (1990), gökkuşağı alabalıklarını elle tutarak, taşıma ve akut amonyak zehirlenmesi ile stres oluşturmuşlar ve lizozim aktivitesini saptamışlardır. Araştırıcılar elle tutmanın ve taşımanın yaratmış olduğu stres sonucunda ölçülen plazma lizozim aktivitesinde azalma olduğunu, bu azalmanın stres ortadan kalktıktan 2 hafta sonra normale döndüğünü bildirmişlerdir. Jian et al. (2005) Japon dil balıklarını formolle öldürülmüş Vibrio anguillarum ile hazırladıkları aşıyı intraperitonel yolla vererek aşılamışlardır. Aşılamadan 50 gün sonra ikinci bir aşılama yapmışlardır. Kontrol balıklarına ise aynı yolla PBS vermişler, daha sonra balıklara V.anguillarum ve V.parahemoliticus verilerek epruvasyon yapmışlardır. Aşılama grubunda yüksek derecede non-spesifik immun yanıt saptamışlardır. 7

17 Araştırıcılar balıklarda değerli sayılabilecek lizozim aktivitesi açıklamışlardır. belirlediklerini Wang et al. (2005), ot sazanına, kortisol ve kortisol-kakao yağını intraperitonal enjekte etmişler ve non-spesifik immun sistemin özelliklerine bakmışlar, kakao içeriği enjeksiyonunun olduğu grupta kortisol konsantrasyonu ve lizozim aktivitesinin 30 gün boyunca yüksek seviyede olduğunu bildirmişlerdir. Sadece kortisol enjekte edilmiş grupta ise 2 hafta içerisinde serum kortisol konsantrasyonu ve lizozim aktivitesinde düşme olduğunu, kortisol enjeksiyonu ile ot sazanlarında non-spesifik immunitenin baskılandığını ve hastalıklara karşı daha duyarlı hale geldiklerini saptamışlardır. Caruso and Lazard (1999) stoklama yoğunluğuna bağlı kronik strese maruz bırakılan Nil tilapia balıklarında (O.niloticus) lizozimin strese sokulmayan balıklardan daha düşük olduğunu belirtmişlerdir. Cnaani et al. (2004), 4 değişik tür tilapia balıklarını 5 dakika su dışında tutarak oluşturulan stresin sonunda, kan parametrelerini, lizozim aktivitesini ve hematokrit değerini incelemişlerdir. Ancak bu denemeye alınan gruplar arasında bir farklılığın bulunmamasına rağmen, lizozim aktivitesi için stresi takiben bir zaman dilimi belirleyemediklerini açıklamışlardır. Özen vd.(2003), gökkuşağı alabalıklarına değişik immunostimulantlar vererek spesifik olmayan savunma sisteminin artırılmasını ve lizozim aktivitesini belirlemişlerdir. Yapılan bu çalışma sonucu immunostimulantların lizozim aktivitesinde artış meydana getirdiği ayrıca Yersinia ruckeri ile yapılan epruvasyona karşı balıklarda yeterli bir koruma oluşturduğunu açıklamışlardır. Yıldız (2006), antimikrobiyel madde olarak Leteux-Mayer karışımı uygulanan (60 dakika süreyle) alabalıklarda lizozim aktivitesini incelemiş, bu süre sonunda plazma lizozim aktivitesinde düşüş meydana geldiğini belirtmiştir. 8

18 2.5 Hematokrit Değeri Kolay belirlenebilmesi, uygunluğu, güvenebilirliliği nedeniyle mikrohematokrit yöntemle hesaplanan hematokrit değer, balık hematoloji çalışmalarında önemli bir kriter olarak kabul edilmektedir ve kanın şekilli elemanlarının hacminin, tüm kan hücrelerine olan oranının yüzdesi olarak ifade edilir (Schäperclaus 1979). Hematokrit değer balığın türüne, yaşına, cinsiyetine ve mevsime göre değişmektedir (Hesser 1960). Bazı balık türleri için minimum-maksimum ve ortalama hematokrit değerleri çizelge 2.2 de verilmiştir. Çizelge 2.2 Bazı sağlıklı balık türlerinde hematokrit değerleri (%) Tür Ortalama Değer (%) Referans Alabalık (Oncorhynchus mykiss) 27,2 Klontz 1994 Aynalı Sazan (Cyprinus carpio) 31,3 Klontz 1994 Levrek (Dicentrarchus labrax) 35,3 Klontz ,27 ± 0,21 Yıldız et al. (1997) 36,7 ± 3,9 Chen et al. (2004) Tilapia (Oreochromis niloticus) 25,14 ± 0,59 25,83 ± 0,50 24,55 ± 0,69 Yıldız ve Polatsü(1999) 24,32 ± 0,92 Benli ve Yıldız (2004) Kan parametrelerine ait değerler türler arasında farklılıklar gösterebilir (Hrubec et al. 2000). Balık üzerinde stres yapan faktörler hematokrit değerlerini de etkiler (Wedermeyer et al. 1990). 9

19 Yıldız (1998), Pseudomonas florescens ile enfekte edilen sazan balıklarının hematokrit değerinde azalma olduğunu belirtmiştir. Caruso et al. (2002), Edwardsiella tarda ile deneysel olarak oluşturulan stres ve enfeksiyon sonucu yayın balıklarında (Silurus glanis) hematokrit değerinde önemli sayılabilecek bir düşme olduğu saptamışlardır. Cnaani et al. (2004) a göre dört değişik tür tilapia balıklarının (O. mossambicus. Oreochromis aureus ve iki farklı türden olan O. niloticus L.) hematokrit değerinde, uygulamadan 4,5 saat sonra önemli bir artış olmaktadır. Yıldız (2006), Leutex-Mayer karışımındaki sularda 60 dakika tutulan alabalıkların hematokrit değerinde bir farklılığın olmadığını açıklamıştır. 10

20 3. MATERYAL ve YÖNTEM 3.1 Materyal Deneme yeri Bu çalışma, Ankara Üniversitesi Ziraat Fakültesi Su Ürünleri Bölümü Deneme Ünitesi nde gerçekleştirilmiştir Balık materyali Araştırmada kullanılan tilapia balıkları (Oreochromis niloticus) Adana Çukurova Üniversitesi Su Ürünleri Fakültesi nden temin edilmiştir. Daha önce enfeksiyon geçirmediği bildirilen ortalama 16,95 ± 0,70cm boyunda ve ortalama 80,59 ± 11,61g ağırlığında olan 30 adet tilapia balığı (LC 50 değerinin hesaplanması için gerekli balıklar hariç) kullanılmıştır Deney akvaryumları Denemede 65 x 40 x 50 cm boyutlarındaki üç adet akvaryum deneme öncesi dezenfekte edilmiş ve 100 litre su alacak şekilde düzenlenmiştir Su materyali Denemede en az 48 saat dinlendirilmiş ve havalandırılarak kloru giderilmiş şehir suyu kullanılmıştır. Deneme süresince su sıcaklığı 27 ± 1 o C de sabit tutulmuştur. Çözünmüş oksijen 8 mg/l civarında, ph ise 7,38 civarında ölçülmüştür. 11

21 3.1.5 Denemede kullanılan Lactococcus garvieae Denemede kullanılan patojen Lactococcus garvieae suşu (saha izolatı) Süleyman Demirel Üniversitesi Eğirdir Su Ürünleri Fakültesi Yetiştiricilik Bölümü Hastalıklar Anabilim Dalı ndan temin edilmiştir Besi yerleri Çalışmada standart suşun karakterlerinin belirlenmesi, etkenin üretilmesi, organlardan etken izolasyonu ve izole edilen etkenlerin identifikasyonu için Triptik Soy agar (TSA), Triptik Soy buyyon (TSB) ve kanlı agar (EK 2) kullanılmıştır Denemede kullanılan diğer araç ve gereçler Deneme süresince deney suyunun sıcaklığı 200 wattlık ataman marka termostatlı ısıtıcılar ile sabit tutulmuştur. Deneme süresince suyun sıcaklığını ölçmede 1 o C hassasiyetli termometre kullanılmıştır. Deneme süresince ortam suyunun çözünmüş oksijen değerleri ± 0,2 ppm hassasiyetli taşınabilir oksijenmetre (YSI Model 51 B) ile ölçülmüştür. Deneme süresince ortam suyunun ph değerlerini ölçmede 0,001 ph ya duyarlı laboratuar tipi dijital ph metre (Metrohm Herrisan ph meter E 532) kullanılmıştır. Balıkların tartılmasında 0,01 g a duyarlı terazi kullanılmıştır. Denemede plazma analizlerinin kolorimetrik ölçümlerinde Shimadzu UV-1201 V spektrofotometre kullanılmıştır. 12

22 Hematokrit değerlerini ölçmede rpm hız yapabilen hematokrit santrifüjü (Hettich hematokrit 27,D-78532) kullanılmıştır. 3.2 Yöntem Deney balıklarının hazırlanması Deney balıkları, deneme başlamadan 15 gün önce ortama uyum için akvaryumlara yerleştirilmiştir. Balıklar deneme süresince günde vücut ağırlıklarının %2 si oranında yemlenmişlerdir. Deneyin başlama tarihinden önceki 7 gün içinde balıklarda ölüm oranının %5 den az olmasına dikkat edilmiştir (Anonymous 1975, Reish and Oshida 1987) Deneme ortamı Denemede 27 ± 1 o C su sıcaklığı kullanılmıştır. Deneme akvaryumunda su sıcaklığı termostatlı ısıtıcılar ile deneme süresince sabit tutulmuştur. Bu su sıcaklığının seçiminde tilapianın yetiştiricilik koşullarında yaşadığı optimal su sıcaklığı tercih edilmiştir (Bardach et al. 1976, Çelikkale 1994, Ross 2000, Alpbaz 2005) Deneme yöntemi Denemede Statik test metodu kullanılmıştır (Anonymous 1975) L.garvieae nin LC 50 dozunun belirlenmesi Deneysel enfeksiyon balıklara intraperitonal (i.p.) yolla bakteri enjektasyonun yanında kohabitasyon yoluyla gerçekleştirilmiştir. Deneme başlamadan önce L.garvieae nin 13

23 LC 50 dozu Kärber metoduna göre belirlenmiştir (Arda 1971). Metodda kullanılan formül; burada; m: %100 ölüm meydana getiren son dilüsyonun logaritması; d: dilüsyonlar arası kat sayının logaritması; p: pozitif reaksiyonlar; p: pozitif reaksiyonlar toplamı; n: kullanılan hayvan sayısı; 0,5: sabit değer. L.garvieae nin LC 50 dozunun belirlenmesi amacıyla 24 saatlik Triptik Soy Bunyon (TSB) daki kültürü kullanılmıştır (10 12 kob/ml). Bu kültürden seri dilusyonlar hazırlanmış her bir dilusyondan 0,1 ml 3 balığa intraperitonal yolla verilmiştir (Arda 1971, Bilgehan 2004) (EK 3) Deneysel düzen Denemede 5 adet L.garvieae enjekte edilmiş balık ile 5 adet klinik olarak sağlıklı balık 100L kapasiteli akvaryumlara yan yana konmuştur. Burada amaç hastalık etkeninin aynı sucul ortamdaki balıklar arasında horizontal bulaşım yoluyla, klinik olarak sağlıklı balıklarda meydana getirdiği etkilerin gözlenmesi içindir. Deney iki tekerrürlü yapılmıştır. Kontrol grubunda 5 adet PBS injekte edilmiş balık ile 5 adet klinik olarak sağlıklı ve hiçbir işleme tutulmamış balıklar yan yana konulmuştur (Şekil 3.1). Kohabitasyonda kullanılacak balıklara 0,1ml intraperitonal (i.p.) yolla LC 50 değerinin altında yani sublethal dozda (1x10 9 kob/ml) L.garvieae süspansiyonu verilmiştir (Brunt and Austin 2005). İnfekte edilen balıkların baş kısımları gümüş nitrat kalemi ile markalanmıştır. Kontrol grubundaki balıklara 0.1ml i.p. yolla PBS verilmiştir. 14

24 L(n=5) P(n=5) LK(n=5) n total =10 PK(n=5) n total =10 Kohabitasyon Deneyi Kontrol Akvaryumu L: 0,1 ml i.p olarak 1x10 9 kob/ml L. garvieae verilen grup (Grup L) LK: hiçbir enjeksiyon işlemine tutulmaksızın L. garvieae verilen grup ile kohabite edilmiş grup (Grup LK) P: 0,1 ml i.p olarak 0,04M luk PBS verilen grup (Grup P) PK: PBS verilen grup ile kohabite edilmiş grup (Grup PK) Şekil 3.1 Deneme planı ve örnekleme periyodu Deneme sürecinde L.garvieae izolasyonu ve identifikasyonu Deneme ve kontrol grupları 7 gün izlenmiş ve bu süre içinde ölen balıkların iç organlarından ekimler yapılmıştır. Yedi günlük süreç sonunda tüm balıklar öldürülerek organlarından besi yerlerine ekim yapılarak etken izolasyonuna çalışılmıştır. Standart suş ve enfeksiyon sonu balıkların organlarından izole edilen suşların özelliklerinin belirlenmesi amacıyla oksidaz, katalaz, hemoliz, hareket, nitrat, indol, sitrat, üreaz, MR, VP, eskulin, hidroliz, O/F, arabinoz, glukoz, inosital, maltoz, mannoz, salisin, sorbitol, sakkaroz, ksiloz, trehaloz, H 2 S, hippurat testleri Holt et al. (2000) ve 15

25 Buller (2004) e göre Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı nda yapılmıştır Kan örneklerinin alımı Kan örnekleri kohabitasyona başladıktan 3., 5. ve 7. günlerde tüm gruplardan anestezi uygulanmadan kalpten punksiyonla alınmıştır. Bu amaçla sol tarafa yatırılan balığın solungaç kapağı kaldırıldıktan sonra kleitrum kemiğinin oluşturduğu pektoral kemerin hemen önünden alt üçtebir mesafeden 5 ml lik steril ve tek kullanımlık yeşil uçlu enjektörler ile derecelik bir açı yapacak şekilde kalbe girilerek kan çekilmiştir (Yıldız 1997) (EK 4). Kanın pıhtılaşmasını önlemek için antikuagülant olarak ticari adı Nevparin olan heparin kullanılmıştır. Kan çekilecek enjektörün iç duvarları ticari heparin solusyonuyla sıvanarak heparinize edilmiştir (Yıldız 1997). Kan alımının balıkta yaratacağı stresi azaltmak için, yapılan işlemin saniyeyi geçmemesine dikkat edilmiştir Hematokrit değerinin belirlenmesi Hematokrit değeri mikrohematokrit yöntemle saptanmıştır (Siwicki and Anderson 1993). Kalpten çekilen kan, hematokrit tüplerine, tüplerin kendi kapillaritesiyle en az 1/1 oranında doldurulmuş ve uçları macun ile kapatılmıştır. Hettich marka hematokrit santrifüjünde rpm de 5 dakika süreyle santrifüje edildikten sonra özel skalada hematokrit değer okunmuştur Kan örneklerinden plazma elde edilmesi Plazma, rpm de 5 dakika boyunca santrifüj edilen hematokrit tüplerinin, üstte kalan kısmının ayrılması ile elde edilmiştir. Elde edilen plazma; plazma lizozim aktivitesi ölçülene kadar -20 o C de muhafaza edilmiştir (Kubilay 2002). 16

26 Plazma lizozim aktivitesinin ölçülmesi Plazma lizozim aktivitesi türbitimetrik metod ile belirlenmiştir (Ellis 1989, Özen vd. 2003, Yıldız 2006). Spektrofotometrede 570 nanometre dalga boyunda 0,3 yoğunluğa sahip (Li et al. 2005), 0.04M lik PBS ve Micrococcus luteus u içeren süspansiyonlara, 1900 mikrolitre süspansiyon üzerine 100 mikrolitre balıklardan elde edilen serumlar katılarak oluşturulan karışımlar 30 saniyede ve bunu takiben 270. saniyedeki absorbans değerleri ölçülmüştür (Ellis 1989). Negatif kontrol olarak süspansiyon içerisine PBS ilave edilmiş ve aynı zaman aralıklarında aynı dalga boyunda okunmuştur. Bir ünit lizozim aktivitesi 0,001 dakika/l absorbans değerindeki azalma olarak saptanmıştır Balıkların davranışlarının incelenmesi Deneme balıklarının kontrol grubuna göre sergilediği farklı dış görünüşleri ve beslemek amacıyla verilen yemin tüketip tüketmediği gözlenmiştir İstatistiki değerlendirme Denemede elde edilen gözlemler Gün x Grup ve Grup x Gün olarak tek yönlü varyans analizi tekniği (one-way anova) ile test edilmiştir. Denemede grup faktörünün L.garvieae enjekte edilen, L.garvieae enjekte edilen ile kohabite edilen, PBS enjekte edilen, PBS enjekte edilen ile kohabite edilen olmak üzere 4 seviyesi; gün faktörünün 3., 5. ve 7. gün olmak üzere 3 seviyesi mevcuttur. Grup ortalamaları arasındaki farklılıkların belirlenmesinde Kruskal Walis testi, gün ortalamaları arasındaki farklılıkların belirlenmesinde Friedman testi kullanılmıştır. Yapılan istatistik analizler SPSS 14.0 programı kullanılarak yapılmıştır. 17

27 4. BULGULAR 4.1 L.garvieae nin LC 50 Değerinin Belirlenmesi Kärber metoduna göre LC 50 değeri 1x10 10 kob/ml olarak belirlenmiştir (Arda 1971). 4.2 Deneme Gruplarında Ölüm Oranı ve Lactococcus garvieae İzolasyonuna İlişkin Bulgular Grup L balıklarında yürütülen deneme boyunca 10 adet balıktan 7 adedi ölmüş(şekil 4.1), ölen balıkların iç organlarından (kalp, karaciğer, dalak, yumurtalık) (EK 5) yapılan ekim sonucu 6 sından saf kültür halinde L.garvieae izole ve identifiye edilmiştir (Çizelge 4.1). Canlı kalan 3 balık 7.günün sonunda öldürülerek aynı organlardan besi yerlerine yapılan ekim sonucu hepsinden L.garvieae etkeni izole edilmiştir. Şekil 4.1 Deneme grupları ve kontrol gruplarındaki ölüm oranı (%) 18

28 Çizelge 4.1 Deneme gruplarından; ölen ve canlı kalan balıklar ile bu gruplardan L.garvieae izolasyonu Gruplar* Balık Adeti Ölen balık adeti L.garvieae izolasyonu ve identifikasyonu Canlı kalan L.garvieae izolasyonu ve identifikasyonu Grup 1 Grup L Grup 2 Grup LK Grup 3 Grup P 5 5 Grup PK 5 5 * Grup L : 0,1 ml i.p olarak 1x10 9 kob/ml L. garvieae verilen grup Grup LK: Hiçbir enjeksiyon işlemi uygulamaksızın L. garvieae enjekte edilenbalıklar ile kohabite edilen grup Grup P : 0,1 ml i.p olarak 0,04M luk PBS verilen grup Grup PK: PBS verilen grup ile kohabite edilmiş grup Grup LK de ki 10 adet balıktan 3 adedi deneme süresince ölmüş ve bunlardan etken izolasyonu gerçekleştirilmiştir. Geriye kalan 7 adet canlı balık deneme süresi sonunda öldürülmüş ve bunların 3 ünün organlarında L.garvieae izolasyonu yapılmıştır. Kontrol grubunda bulunan (Grup P ve Grup PK) balıklarda deneme sırasında ölüm gözlenmemiş ve 7.gün sonunda bu balıkların organlarından yapılan ekim sonucu etken izolasyonu gerçekleşmemiştir. 4.3 Standart ve İzole Edilen Suşların Karakterizasyon Bulguları Çalışmada balıklarda enfeksiyon oluşturmak üzere kullanılan standart L.garvieae suşu ile enfeksiyonu takiben ölen balıkların ve deneme süresi sonunda öldürülen balıklardan izole edilen suşların hepsinin aynı karakterde olduğu Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı tarafından saptanmıştır. 19

29 4.4 Plazma Lizozim Aktivitesine İlişkin Bulgular L.garvieae ile sublethal dozda enfekte tilapia (Oreochromis niloticus) balıklarından Grup L, Grup LK, Grup P ve Grup PK dan daha önce belirtilen günlerde yapılan plazma lizozim aktivitesi sonuçları Çizelge 4.2 de verilmiştir. Çizelge 4.2 L.garvieae ile sublethal dozda enfekte edilmiş tilapia balıklarının plazma lizozim aktivitesi (x10 3 U/ml) DENEME GÜNLERİ DENEME GRUPLARI Grup L* Grup LK Grup P Grup PK 3.Gün 11,5 ± 3,03 Aa** 17,4 ± 2,83 Aa 14,6 ± 4,86 Aa 9,2 ± 1,32 Aa 5.Gün 19,3 ± 3,83 ABa 7,4 ± 1,54 ACb 21,0 ± 9,30 Ba 5,8 ± 1,86 Ca 7.Gün 6,1 ± 0,95 Ab 8,1 ± 2,67 Ab 9,8 ± 1,53 Aa 7,6 ± 1,29 Aa * Grup L : 0,1 ml i.p olarak 1x10 9 kob/ml L. garvieae verilen grup Grup LK: Hiçbir enjeksiyon işlemi uygulamaksızın L. garvieae enjekte edilenbalıklar ile kohabite edilen grup Grup P : 0,1 ml i.p olarak 0,04M luk PBS verilen grup Grup PK: PBS verilen grup ile kohabite edilmiş grup **Büyük harfler gruplara göre gün ortalamaları arasındaki farklıkları ve küçük harfler günlere göre grup ortalamaları arasındaki farklıkları göstermektedir. Aynı satırda farklı büyük harf taşıyan ortalamalar arası fark istatistik olarak önemlidir (P<0,01). Aynı sütünda farklı küçük harf taşıyan ortalamalar arası fark istatistik olarak önemlidir (P<0,01). Grup L de ki plazma lizozim aktivitesi 5. günde 3. güne göre artarken; 7. günde 5. güne göre azalma olmuştur. 7. gündeki plazma lizozim aktivitesi 3. güne göre düşme göstermiştir (P<0,05). Grup LK de ki lizozim aktivitesi 5. günde 3. güne göre azalırken; 7. günde 5. güne göre artış olmuştur. 7. gündeki plazma lizozim aktivitesi 3. güne göre düşme göstermiştir (P<0,05). Kontrol gruplarından Grup P de ki lizozim aktivitesi 5. günde 3. güne göre artış göstermiş ve 7. günde azalma meydana gelmiştir (P<0,05). 20

30 Kontrol gruplarından Grup PK de ki plazma lizozim aktivitesi 5. günde 3. gündekine göre düşme meydana gelmiş olup; 7. günde artış meydana gelmiştir (P<0,05). 3. günde deneme gruplarından Grup L ve Grup LK ile kontrol gruplarından Grup P ve Grup PK arasında istatistik olarak bir fark bulunmamıştır (P>0,05). 5. günde deneme gruplarından Grup L ile Grup LK arasında, Grup L ile kontrol gruplarından Grup P arasında, Grup LK ile kontrol gruplarından Grup PK arasında istatistik olarak bir fark bulunmamasına karşın (P>0,05); Grup L ile kontrol gruplarından Grup PK arasında, Grup LK ile kontrol gruplarından Grup P arasında istatistik olarak önemli bir fark bulunmaktadır (P<0,05). 7. günde deneme gruplarından Grup L ve Grup LK ile kontrol gruplarından Grup P ve Grup PK arasında istatistik olarak bir fark bulunmamıştır (P>0,05). 3. ve 7. günlerde deneme gruplarından Grup L ve Grup LK ile kontrol gruplarından Grup P ve Grup PK arasında fark bulunmamıştır (P>0,05). Ancak 5. günde deneme grupları ile kontrol grupları arasında fark istatistik olarak önemlidir (P<0,05). 4.5 Hematokrit Değerine İlişkin Bulgular L.garvieae ile sublethal dozda enfekte tilapia (Oreochromis niloticus) balıklarından Grup L, Grup LK, Grup P ve Grup PK dan daha önce belirtilen günlerde yapılan günlerde kan alınarak hesaplanan ortalama hematokrit değerleri çizelge 4.3 de gösterilmiştir. 21

31 Çizelge 4.3 L.garvieae ile sublethal dozda enfekte edilmiş tilapia balıklarının ortalama hemarokrit değerleri (%) DENEME GÜNLERİ DENEME GRUPLARI Grup L* Grup LK Grup P Grup PK 3.Gün 21,20 ± 0,50 Aa** 22,64 ± 0,46 Aa 22,42 ± 0,50 Aa 22,13 ± 0,68 Aa 5.Gün 18,24 ± 0,80 Ba 18,88 ± 0,53 Ba 13,84 ± 0,45 Bb 19,92 ± 0,52 Bc 7.Gün 10,59 ± 0,83 Ca 12,14 ± 0,66 Ca 11,54 ± 0,49 Ca 14,37 ± 0,45 Cb * Grup L : 0,1 ml i.p olarak 1x10 9 kob/ml L. garvieae verilen grup Grup LK: Hiçbir enjeksiyon işlemi uygulamaksızın L. garvieae enjekte edilenbalıklar ile kohabite edilen grup Grup P : 0,1 ml i.p olarak 0,04M luk PBS verilen grup Grup PK: PBS verilen grup ile kohabite edilmiş grup ** Büyük harfler günlere göre grup ortalamaları arasındaki farklıkları ve küçük harfler gruplara göre gün ortalamaları arasındaki farklıkları göstermektedir. Aynı sütunda farklı büyük harf taşıyan ortalamalar arası fark istatistik olarak önemlidir (P<0,01). Aynı satırda farklı küçük harf taşıyan ortalamalar arası fark istatistik olarak önemlidir (P<0,01). Grup L de ki hematokrit değer 5. günde 3. güne göre azalırken; 7 günde 5. güne göre azalma olmuştur. 7. gündeki hematokrit değer 3. güne göre düşme göstermiştir (P<0,001). Grup LK de ki hematokrit değer 5. günde 3. güne göre azalırken; 7. günde 5. güne göre azalma olmuştur. 7. gündeki hematokrit değer 3. güne göre düşme göstermiştir (P<0,001). Kontrol gruplarından Grup P de ki hematokrit değer 5. günde 3. güne göre azalırken; hematokrit değer 7. günde 5. güne göre azalma meydana gelmiştir. 7. gündeki hematokrit değer 3. güne göre düşme göstermiştir (P<0,001). Kontrol gruplarından Grup PK de ki hematokrit değer 5. günde 3. gündekine göre düşme meydana gelmiş olup; 7. günde hematokrit değerde artış meydana gelmiştir. 7. gündeki hematokrit değer 3. güne göre düşme göstermiştir (P<0,001). 3. günde deneme gruplarından Grup L ve Grup LK ile kontrol gruplarından Grup P ve Grup PK arasında istatistik olarak bir fark bulunmamıştır (P>0,05). 22

32 5. günde deneme gruplarından Grup L ve Grup LK arasında istatistik olarak bir fark bulunamazken; deneme gruplarının Grup P ile arasındaki fark ve deneme gruplarının Grup Pk ile arasındaki fark istatistik olarak önemlidir. Kontrol gruplarından Grup P ile Grup PK arasındaki fark istatistik olarak önemli bulunmuşuır (P<0,01). 7. günde deneme gruplarından Grup L, Grup LK ve kontrol gruplarından Grup P ile Grup PK arasındaki fark, istatistik olarak önemli bulunmuştur (P<0,001). 5. ve 7. günde yapılan varyans analizi sonucunda ise L.garvieae verilen grup, L.garvieae verilen grubu ile kohabite edilen balıklar, PBS verilen gruptaki balıklar ve PBS verilen grup ile kohabite edilen gruptaki balıkların hematokrit değerlerinin ortalamaları arasındaki farklılıklar istatistiki olarak önemlidir (P<0,01 ve P<0,001 ). 4.6 Makroskobik Bulgular L.garvieae ile enfekte edilmiş balıklar ile kohabite edilen balıklarda, kontrol grubuna göre renkte koyulaşma, hareketlerinde yavaşlama, ekzoftalmus, vücut yüzeyinde hemorajiler ve yüzgeçlerde erime saptanmışır (EK 6). Enfektasyon grubu ile kohabite grubu arasında makroskobik bulgular açısından farklılık gözlenmemiştir. L.garvieae enjekte edilmiş tilapia balıkları ile kohabite edilen balıklarda, kontrol grubuna göre yem alımında ve iştahında azalma olduğu dikkati çekmiştir. 23

33 5. TARTIŞMA ve SONUÇ Bu çalışmada Lactococcus garvieae ile kohabitasyon yoluyla enfekte edilen tilapia balıklarında (Oreochromis niloticus) plazma lizozim aktivitesi ile hematokrit değişimleri incelenmiştir. Yapılan taramalar sonucunda değişik balık türlerinde bu parametrelerle ilgili Türkiye de ve yurt dışında kısıtlı sayıda çalışmalara rastlanmıştır (Siwicki and Studnicka 1987, Lie et al. 1989, Demers and Bayne 1997, Caruso et al. 2002, Yıldız 2006). Balıklarda deneysel enfeksiyonla ilgili çalışmalar genellikle i.p enjeksiyon ya da banyo üzerinde yoğunlaşmıştır (Wiklund and Dalsgaard 1998, Iguchi et al. 2003). Kohabitasyon yolu ile bulaşma son yıllarda dikkat çeken bir konu haline gelmiştir. Ancak kohabitasyon- hastalığa özgü ölüm- ile ilgili çok fazla araştırma mevcut değildir. Bununla birlikte Chinook salmonlarında (Oncorhynchus tshawytscha) frunkulozis prevelansı ile ilgili yapılan bir çalışmada doğal bir yol olarak horizontal bulaşmaya dikkat çekilmektedir (Ogut and Reno 2004). Bu çalışmada hesaplanan LC 50 değeri, deneysel enfeksiyon çalışmalarında hesaplanan değerlerle karşılaştırıldığında; LC 50 değerinin balık türleri arasında ve bakteri türleri arasında farklılık gösterdiği gözlemlenmiştir. Daha önce tilapia balıklarında L.garviea için LC 50 değeri hesaplanmadığından diğer çalışmalar ile karşılaştırılma yapılamamıştır. Bu bakımdan çalışmamız tilapialarda L.garviea nın LC 50 değerlerinin ortaya konması bakımından bir ilk özelliği taşımaktadır. Plazma lizozim aktivitesi balıklarda yaygın olarak ölçülen bir parametredir. Siwicki ve Studnicka (1987), deneysel olarak Pseudomonas agalactica ve Aeromonas punctata ile enfekte ettikleri sazan balıklarında ilk 14 günde kandaki lizozim seviyesinde artmalar olduğunu daha sonra bu düzeyin kontrol balıklarında belirlenen seviyeye düştüğünü bildirmişlerdir. Buna karşın Lie et al. (1989), deneysel olarak infekte edilmiş alabalıklarda lizozim seviyesinin düşük olduğunu ve bunun nedeninin balığın genetik dispozisyonundan kaynaklandığını belirtmişlerdir. Caruso et al. (2002), Edwardsiella 24

34 tarda ile enfekte edilmiş yayın balıklarında plazma lizozim aktivitesini incelemişler, ışık ile strese sokulan balıklarda lizozim ve hematokrit değerde bir değişme olmamasına karşın E.tarda ile enfekte olan yayın balıklarında hem strese sokulanla hem de strese sokulmayan grupta lizozim aktivitesinde önemli sayılabilecek bir artış meydana geldiğini, hematokrit değerlerinde ise her iki grupta bir düşüş olduğunu bildirmişlerdir. Yapılan bu çalışmada L. garvieae ile enfekte edilen tilapia (Oreochromis niloticus) balıklarında 3., 5. ve 7. günlerde belirlenen lizozim aktiviteleri arasında istatistik olarak fark saptanmıştır (P<0,05). Alınan sonuçlara göre sadece L. garvieae ile enfekte edilen balıkların lizozim değerinde Grup L balıklarında 5. günde 3. güne göre artış, 7. günde 5. güne göre azalış; Grup LK balıklarında 5. günde 3. güne göre azalış, 7. günde 5. güne göre azalış; Grup P balıklarında 5. günde 3. güne göre artış, 7.günde 5. güne göre azalış; Grup PK balıklarında 5. günde 3. güne göre azalış, 7.günde 5. Güne göre artış gözlenmiş olup, bu sonuçlar (Siwicki and Studnicka 1987, Demers and Boyne 1997, Caruso et al. 2002) değişik tür balık ve bakteri türü ile yapılan çalışma sonuçları ile paralellik gösterdiği görülmüştür. Ancak tilapia balıklarında L.garvieae ile direkt olarak yapılan bir çalışma olmadığından karşılaştırma yapılamamıştır. Tilapia balıkları ve diğer balık türleri üzerinde hem enfeksiyon hem de stres oluşturularak yapılan çalışmalarda hematokrit değerleri belirlenmiştir. Yıldız (1998), Pseudomanas florescens etkeni ile enfekte edilen sazan balıklarında, hematokrit değerinde azalma meydana geldiğini bildirmiştir. Cnaani et al. 2004, dört değişik tür tilapia balıklarının kan parametrelerinde hematokrit değerini incelemişler ve uygulamadan 4,5 saat sonra hematokrit seviyelerinde önemli bir artış olduğunu belirtmişlerdir. Benli ve Yıldız (2004), tilapia balıklarında yaptıkları denemede, Edwardsiella tarda izole ettikleri balıkların klinik bulgularını ve bazı kan parametrelerini değerlendirmişler, sağlıklı ve enfekte balıklarda hematokrit % değerlerini sırası ile 24,23 ± 0,88 ve 16,76 ± 0,98 olarak belirtmişler ve sonuç olarak hematokrit değerinde düşme olduğunu, aynı şekilde Caruso et al. (2002), yayın balıklarında E.tarda etkeni kullanarak hematokrit değeri deneysel olarak oluşturulan stres ve enfeksiyon sonucunu araştırmışlar ve hematokrit değerde önemli sayılabilecek bir düşme olduğunu açıklamışlardır. Bu çalışmada hematokrit değer L. garvieae ile 25

35 enfekte edilen ve enfekte grupla kohabilite edilen gruplardaki balıklardan 3., 5. ve 7. günlerde alınan kanla yapılmıştır. Deneysel enfeksiyonun başlangıçını takiben 3. günde yapılan değerlendirmede gruplar arasında (kontrol grubu dahil) istatistiki olarak bir farklılık bulunmamıştr (P>0,05). Deneysel enfeksiyonun devamında 5. ve 7. gün sonunda yapılan hematokrit değerlerinin ölçümlerinde elde edilen veriler istatistiki açıdan önemli olarak belirlenmiştir (P<0,01 ve P<0,001 ). Bu sonuçlar enfeksiyon periyodu sonunda elde edilen diğer verilerle karşılaştırıldığında düşme sonucuna göre paralellik göstermektedir. Hematokrit değerindeki bu düşüşün sebebi, bakteriyel hastalıklarda hemopoiezis etkilenmesidir (Barham et al. 1980, Yıldız 1998). Tilapia balıklarında L.garvieae verilerek oluşturulan deneysel enfeksiyonla ilgili bir kaynak bulunamamıştır. Benli ve Yıldız (2004), Edwardsiella tarda izole ettikleri çalışmada, deride yaygın hemorajiler ve ağızda ülserlere rastladıklarını bildirmişlerdir. Etken farklılığına bağlı olarak her iki çalışmanın benzer yönleri, meydana gelen patolojik değişmelerdir. Chen et al. (2002), L.garvieae izole ettikleri ve L.garvieae verdikleri has kefal (Mugil cephalus) balıklarında yaptıkları çalışmada balıklarda; eksoftalmus, karında şişkinlik, gözlerde, operkulumda ve yüzgeç tabanlarında hemorajiler, kaudal yüzgeçte nekrotik ülserler belirlemişlerdir. Diler vd. (2002), %80 e varan ölüm görülen üç değişik alabalık çiftliğindeki balıkların değişik organlarından besi yerlerine ekim sonucu L. garvieae yı izole etmişler ve alabalıklarda bilateral ekzoftalmus, deri renginin koyulaşması, anüste hemorajiler, kuyruk ve pektoral yüzgeçlerde kanamalar, karında kanlı ascites, karaciğer, dalak, böbrek ve barsaklarda hemoraji görmüşlerdir. Çalışmamızda deneysel enfeksiyon ve kohabitasyon grupları balıklarında renkte koyulaşma, hareketlerinde yavaşlama, eksoftalmus, vücut yüzeyinde hemorajilere rastlanmıştır. Makroskobik bulgular açısından çalışmamızdaki gözlemlerimiz daha önce yapılan çalışmalardaki klinik bulgularla uyumludur. 26

36 Sonuç olarak, L. garvieae ile enfekte edilen tilapialarla aynı ortamda tutulan sağlıklı balıkların da enfekte oldukları saptanmış ve enfeksiyonun horizontal bir yayılma gösterdiği belirlenmiştir. Plazma lizozim ve hematokrit değerleri balıkların sağlık durumlarının belirlenmesinde kullanılan kriterlerden bazıları olarak bildirilmesine karşın, çalışmamızda tilapialardaki (Oreochromis niloticus) L. garvieae enfeksiyonu açısından bu iki parametrenin çok iyi işlemediği sonucuna varılmıştır. Ancak bu çalışma kapsamında önemli bir bulgu L. garvieae nın tilapialarda horizontal bulaşmasıdır. 27

37 KAYNAKLAR Alfonso, A., Joana, C.R., Silva, J. and Gomes, S Lactococcus garvieae trout infections in Portugal: A new challenge on fish vaccinology, IBMC News, 7, 4-5. Alpbaz, A Su Ürünleri Yetiştiriciliği. Alp Yayınları 567s. İzmir. Anonymous Standart methods fort he examination of water and wastewater 14 th edition Washington. APHA, 1134p; USA. Anonymous Web sitesi: Erişim tarihi: Arda, M Hastalık etkenlerinin titrasyon ve nötralizasyon testlerinde uygulanan laboratuar metodları. Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi, Yayın 273, Tatbikat Klavuzu 175, 105s. Arda, M., Seçer, S. ve Sarıeyyüpoğlu, M Balık Hastalıkları 2. Baskı. Medisan Yayın Serisi: s. Ankara. Bardach, J. E., Ryther, J. H. and Mclarney, W.O Aquaculture. The farming and husbrandry of freshwater and marine organisms 842p. USA. Barham, W.T., Smith, G.L. and Schoonbee, H.J The haematological assessment of bacterial infection in rainbow trout, Salmo gairdneri Richardson. J. Fish Biol., 17: Baxa, D.V., Groff, J.M., Wishkovsky, A. and Hedrick, R.P Susceptibility of nonictalurid fishes to experimental infection with Edwardsiella ictaluri Dis. aquat. Org. Vol. 8: Bekcan, S Tilapya Yetiştiriciliği. Türk-Koop Ekin Dergisi Yıl:3 Sayı: s. Benli A. Ç. K. and Yıldız, H. Y Blood parametres in Nile tilapia (Oreochromis niloticus L.) sponteneously infected with Edwarsiella tarda, Aquaculture Research, 35, Bilgehan, H Klinik Mikrobiyolojik Tanı 4. Baskı. Fakülteler Kitapevi Barış Yayınları 777s. İzmir. 28

38 Bromage, E.S., Thomas A., and Owens L Streptococcus iniae, a bacterial infection in barramundi Lates calcarifer, Diseases-of-Aquatic-Organisms vol. 36, no. 3, pp Brunt, J. and Austin, B Use of a probiotic to control lactococcosis and streptococcosis in rainbow trout, Onchorynchus mykiss (Walbaum) Journal of Fish Diseases. 28, Buller, N. B Bacteria from fish and other aquatic animals: A Practical Identification Manual. CABI. p361. Carson, J., Gudkovs, N. and Austin, B Characteristics of an Enterococcus-like bacterium from Australia and South Africa, pathogenic for rainbow trout, Onchorynchus mykiss (Walbaum). Journal of Fish Disease, 16, Caruso, D. and Lazard, J Subordination stress in Nile tilapia and its effect on plazma lysozyme activity. Journal of Fish Biology, 55, Caruso, D., Schlumberger, O., Dahm, C. and Proteau J. P Plasma lysozyme levels in sheatfish Silurus glanis (L.) subjected to stres and experimental infection with Edwardsiella tarda. Aquaculture Research 2002, 33, Ceschia, G., Giorgetti, G., Giavenni, R. and Sarti, M A new problem for Italian trout farms: streptococcosis in rainbow trout (Onchorynchus mykiss). Bulletin of The European Association of Fish Pathologists, 12, Chen, S. C., Liaw, L. L., Su, H. Y., Ko, S. C., Wu, C. Y., Chaung, H. C., Tsai, Y. H., Yang, K. L., Chen, Y. C., Chen, T. H., Lin, G. R., Cheng, S. Y., Lin, Y. D., Lee, J. L., Lai, C. C., Weng, Y. J. and Chu, S. Y Lactococcus garvieae, a cause of disease in grey mullet, Mugil cephalus L., in Taiwan. Journal of Fish Diseases, 25, Chen C. Y., Woosres, G. A. and Bowser, P. R Comparative blood chemistery and histopathology of tilapia infected with Vibrio vulnificus or Streptococcus iniae or copper tetrachlorid, gentamisin or copper sulphate. Aquaculture, 239 (1-4), Chipman, D.M. and Sharon, N Mechanism of lysozyme action. Science 165,

39 Cnaani, A., Tinman, S., Avidar, Y., Ron, M. and Hulata, G Comparative study of biochemical parametres in response to stres in Oreochromis aureus, O. mosambicus and two strains of O. niloticus. Aquaculture Research. 35, Çağırgan, H., Tanrıkul, T.T A new problem Enterecoccus-like infection in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) Farm in Turkey (Turkish). Vet. Kont. ve Araşt. Ens. Md. Derg. C.19, S.33: Çağırgan, H Biotyping of Lactococcus garvieae isolated from Turkey. E.Ü Su Ürünleri Dergisi, 21, 3-4, Çelikkale, M. S İçsu Balıkları ve Yetiştiriciliği Cilt2 2. Baskı. Karadeniz Teknik Üniversitesi Sürmene Deniz Bilimleri Fakültesi Genel Yayın N0:128 Fakülte Yayın No:3 460s. Trabzon. Demers, N. E. and Bayne, C. J The immediate effects of stress on hormones and plasma lysozyme in rainbow trout. Dev. Comp. Immunol., 21, Diler, Ö., Altun, S., Adiloglu, A. K, Kubilay, A. and Isıklı, B First occurrence of streptococcosis affecting farmed rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) in Turkey. Bull. Eur. Ass. Pathol. 22, 1, Ellis, A. E. and Schlotfeldt, H. J Immunologie der knochenfische, In Grundlagen der Fischpathologie. Ronalds R.J (ed.) Verlag Paul Parey, page Ellis, A. E The Immunology of teleost. In: Roberts, R., J.(Ed). Fish Pathology , Baillie Tindal, London Engstad, R. E., Robertsen, B. and Frivold, E Yeast glucan induces increase in activity of lysozyme and complementmediated haemolytic activity in Atlantic salmon blood. Fish Shellfish Immunol. 2: Erer, H Aynalı sazanlarda (Cyprinus carpio) deneysel Aeromonas hydrophila enfeksiyonundaki patolojik bulgular. Doktora tezi. Ankara Üniversitesi Fevolden S. E., Refstie, T. and Roed, K. H Selection for high and low cortisol stress response in Atlantik salmon (Salmo salar) and rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Aquaculture 95,

40 Gonzalez, C.J., Encinas, J.P., Garcia-Lopez, M.L., and Otero, A Characterization and identification of lactic acid bacteria from freshwater fishes. Food Microbiology, 17, Grinde, B Lysozyme from rainbow trout Salmo gairdneri Richardson as an antibacterial agent against fish pathogens. Journal of Fish Diseases 12, Holt, J. G., Krieg, N. R., Sneath, P. H. A., Staley, J. T. and Williams, S. T Bergey s Manual of Determanitive Bacteriology, Ninth Edition, Lippincott Williams, Wilkins Philadelphia, USA 787p Hesser, E. F Methods for routine fish hematology. The Progressive Fish-Culturist 22: Hrubec, T.C., Cardinale, J.L and Smith, S.A Hematology and plasma chemistry reference intervals for cultured tilapia (Oreochromis hybrid). Veterinary Clinical Pathology, 29(1), Iguchi, K., Ogawa, K., Nagaec, M. and Ito, F. 2003, The influence of rearing density on stress response and disease susceptibility of ayu (Plecoglossus altivelis), Aquaculture 220: Ingram, G. A Substances involved in the natural resistance of fish to infection. A review. Journal of Fish Biology 16, Jeney, G., Galeotti, M., Volpatti, D., Jeney, Z. and Anderson, D.P Prevention of stress in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) fed diets contains different doses of glucan. Aquaculture, 154, Jordansen, J., Sharp, G. J. E., Secombes, C.J. and Robertsen, B Effects of a yeast cell wall glukan on the bacterisidal activity of rainbow trout macrophages. Fish and Shellfish Immunology 3, Jian, L., Donmei, G., Qun, W. and Quingyin, W Efficacy of Vibrio anguillarum antigen administered byintraperinal injection route in Japanese flounder, Paralichthys olivaceus (temminck et Schlegel) Aquaculture Research, 36, Khalil, A.H. and Mansour, E.H Toxicity of crude extracellular products of Aeromonas hydrophila in tilapia, Tilapia nilotica, Lett Appl Microbiol, Oct, 25(4),

41 Kim, Y. G. and Lee, K. K Isolation, characterisation and pathogenicity of a Streptococcus strain in the flounder (Paralichthys olivaceus) cultured in Korea. Bulletin of The European Association of Fish Pathologists, 14, Klontz, G. W Fish hematology. In Techniques in fish immunology, FITC 3, J. S. Stolen, T. C. Fletcher, A. F. Rowley, D. P. Anderson, S.L. Kaattari, J. T. Zelikoff, and S. A. Smith (eds.). SOS Publications, Fair Haven, New Jersey, pp Kubilay, A. Ve Uluköy, G The effecs of acute stres in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Turk. J. Zool Kusuda, R., Komatsu, I. and Kawai, K Streptococcus sp. Isolated from an epizootic of cultured eels. Bulletin of The Japanese Society of Scientific Fisheries, 44, 295. Kusuda, R. and Kawai, K Characteristics of Streptococcus sp. Pathogenic to yellowtail. Fish Pathology, 17, Kusuda, R. and Salati, F Enterococcus seriolicida and Streptococcus iniae. In Fish Diseases and Disorders, Viral, Bacterial and Fungal Infections, Vol. 3 (P.T.K. Woo and D.W. Bruno, Eds.), p , CABI Publishing. Li, J., Gao, D., Wang, Q., Wang, J. And Wang, Q Efficacy of Vibrio anguillarum antigen administered by intraperitoneal injection route in Japanese flounder, Paralichthys olivaceus (Temminck et Schlegel). Aquaculture Research 36, Lie, O., Sorensen, A. and Froysadal, E Study on lysozyme activity in some fish species. Diseases of Aquatic organismus 6, 1-5. Möck, A. and Peters, G., Lysozyme activity in rainbow trout, Oncorhyncus mykiss (Walbaum), stressed by handling, transport and water pollution. Journal of Fish Biology. 37, Muzquiz, J. L., Royo F. M., Ortega, C., De Blas, I., Ruiz, I. and Alonso J. L Pathogenicity on Streptococcosis in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss): Dependence on age of diseased fish. Bulletin of The European Association of Fish Pathologists. 19, 3,

42 Ogut, H. and Reno, P.W. 2004, Prevalence of Furunculosis Depends on Density of the Host (Oncorhynchus tshawytscha) Exposed by Cohabitation, North American Journal of Aquaculture, 66: Özen M. R., Kubilay, A. ve Aybal, N. Ö Gökkuşağı alabalıklarında (Oncorhynchus mykiss) immunostimulant kullanılması ile spesifik olmayan savunma mekanizmasının artırılması ve lizozim aktivitesinin belirlenmesi. Türk Sucul Yaşam Dergisi Yıl 3 Sayı 4. Qian, D., Chen, Y., Shen, J. and Shen, Z Serogroups, virulence and hemolytic activity of Aeromonas hydrophila which caused fish bacterial septicaemia Wei Sheng Wu Xue Bao, Dec, 35(6), Reish, D.L. and Oshida, P.S., Manual of methoda in aquatic environment. Research. Part 10. Short Term Static Bioassays. FAO Fish Tech. Paper. 247, Rijkers, G.T Non-lymphoid defense mechanisms in fish. Developmental and Comparative Immunology, 6, Roed, K.H., Larsen, H.J.S., Linder R.D. and Refstie, T Genetic variation in lysozyme activity in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Aquaculture 109, Ross, L. G Environmental physiology and energetics. In Tilapias: Biology and Exploitation Beveridge, M.C.M and Mc Andrew B. J. (Eds) Kluver Publishing. Dordrecht, 505p., The Netherlands. Sakai, M., Atsuta, S. and Kobayashi, M Protective immune response in rainbow trout, Onchorynchus mykiss, vaccinated with b-haemolytic streptococcal bacterin. Fish Pathology 24, Sakai, M., Atsuta, S. and Kobayashi, M Efficencies of combined vaccine for V.anguillarum and Streptococcus sp. Fisheries Science, 61, Salati, F., Tassi, P. and Bronzi, P Isolation of an Entrococcus-like bacterium from diseased Adriatic sturgeon, Acipencer naccarii, farmed in Italy. Bulletin of The European Association of Fish Pathologists, 16, Salati, F., Angelucci, G., Viale, I. and Kusuda, R Immune response of gilthead sea bream, Sparus aurata L., to Lactococcus garvieae antigens. Bulletin of The European Association of Fish Pathologists, 25(1),

43 Sarıhan, E. ve Toral, Ö Bir tropikal balık türü Tilapia nilotica L. nin Çukurova bölgesinde yetiştirilme sorunları üzerine bir tartışma. TÜBİTAK, VII. Bilim Kongresi 29 Eylül-3Ekim İstanbul No:173, VHAG Seri 14, Schäperclaus, W Fischkrankheiten 4.Auf. Teil 1, Akademie Verlang Berlin Siwicki, A. and Studnicka, M The phagocytic ağabeylity of neurophils and serum Lysozyme activity in experimentally infected carp, Cyprinus carpio L. Journal of Fish Biology 31, Siwicki, A.K. and Anderson, D.P Immunostimulation in Fish: Measuring the effects of stimulants by serological and immunological methods. The Nordic Symposium on Fish Immunology, May, Sweden. Smith, S. L Introduction of fish physiology. Argent Lab. Redmond, 352p. Wa, USA. Studnicka, M., Siwicki, A. and Ryka, B. (1986). Lysozyme level in carp (Cyprinus carpio L.) Israeli Journal of Aquaculture 38:(1) Timur, G. Ve Timur, M Balık Hastalıkları. İstanbul Su Ürünleri Fakültesi. 588s. İstanbul Toranzo, A.E., Devesa, S., Heinen, P., Riaza, A., Nuoes, S. and Barja, J.L Streptococcosis in cultered turbot caused by an Entrococcus-like bacterium. Bulletin of The European Association of Fish Pathologists, 14, Wang, W.B., Li, A.H., Cai, T.Z. and Wang, J.G Effects of intraperitonel infection of cortizol on non-spesific immune functions of Ctenopharyngodon idella. Journal of Fish Biology, 67, Wang, C.Y.C., Shie H.S., Chen, S.C., Huang, J.P., Hsieh, I.C., Wen, M.S., Lin, F.C. and Wu, D Lactococcus garvieae infections in humans: possible association with Aquaculture outbreaks. J. Clin. Pract. 10, 1-5. Watts, M., Munday, B.L. and Burke, C.L Immune response of teleost fish. Austrian Veterinary Journal, 79, Wedemeyer, G. A., Barton, B.A. and Mcleay, D.J Stress and aclimation in methods for fish biology. Schreck, C. B. And Moyle P. B. (Eds) p. Bethesta, Mayland, USA. 34

44 Wiedenmayer, A. A., Evans, J. J. and Klesius, P. H Experimental Edwardsiella tarda infection in nonabraded channel catfish Ictalurus punctatus by immersion. Fisheries Science; 72: Wiklund, T. and Dalsgaard, I Occurrence and significance of typical Aeromonas salmonicida in non-salmonid and sad fish species: a review. Disease of Aquatic Organisms 32: Yıldız H. Y., Pulatsu, S. and Kurtoglu, F Baseline haematoligical and serological parameters of healthy Nile tilapia (Oreochromis niloticus). Animal Science Papers and Reports, 15(4) Yıldız, H. Y Sazanlarda nötrofillerin fagositik yeteneğinin belirlenmesi. Doktora tezi (basılmamış). Ankara Üniversitesi Yıldız, H. Y Effects of infection with Pseudononas flouracens on different blood parameters in carp, Bamidgeh, 50, Yıldız, H.Y. and Pulatsu, S Evaluation of the secondary stres response in healty Nile tilapia (Oreochromis niloticus L.) after treatment with a mixture of formalin, malachite green and methylene blue. Aquaculture Research Yıldız, H. Y., Plasma lysozyme levels and secondery stress response in rainbow trout, Oncorhynchus mykiss (Walboum) after exposure to Leutex-Mayer Mixture. Türk J. Vet. Anim. Sci. 30, Yin, Z., Lam, T. J. and Syn, Y. M The effects of crowding stress on the nonspesific immune response (Cyprinus carpio L.). Fish and Shellfish Immunology. 5,

45 EKLER EK 1 Lactococcus garvieae EK 2 Çeşitli besi yerlerinde L.garvieae EK 3 Hazırlanan Dilüsyonlar ve Enjeksiyon İçin Hazırlanan Enjektörle.. 40 EK 4 Kalpten Kan Alma.. 42 EK 5 Farklı Dokulardan Kanlı Agara Yapılan Ekimler Sonucu Meydana Gelen Üreme. 43 EK 6 Balıklarda Dış Bakıda Gözlenen Semptomlar 44 36

46 EK 1 Lactococcus garvieae 37

47 EK 2 Çeşitli Besi Yerlerinde L.garvieae Şekil 1.a: TSA da L.garvieae Şekil 1.b: TSB de L.garvieae 38

48 EK 2 Çeşitli Besi Yerlerinde L.garvieae (devam) Şekil 1.c: Kanlı agarda L.garvieae 39

49 EK 3 Hazırlanan Dilüsyonlar ve Enjeksiyon İçin Hazırlanan Enjektörler. Şekil 1.a Hazırlanan dilüsyonlar Şekil 1.b Enjeksiyon için hazırlanan enjektörler. 40

50 EK 3: Hazırlanan Dilüsyonlar ve Enjeksiyon İçin Hazırlanan Enjektörler (devam) Şekil 1.c Enjeksiyon için hazırlanan enjektörler. Şekil 1.d Enjeksiyon için hazırlanan enjektörler. 41

51 EK 4: Kalpten Kan Alma 42

52 EK 5: Farklı dokulardan Kanlı Agara yapılan ekimler sonucu meydana gelen üreme 43

53 EK 6: Balıklarda dış bakıda gözlenen semptomlar Şekil 1.a Kohabitasyon grubu balıklarında yüzgeç tabanında hemorajiler Şekil 1.b Deneysel enfeksiyon grubu balıklarında renkte koyulaşma 44

54 EK 6: Balıklarda dış bakıda gözlenen semptomlar (devam) Şekil 1.c Deneysel enfeksiyon grubu balıklarında yüzgeçlerde erime Şekil 1.d Deneysel enfeksiyon grubu balıklarında yüzgeçlerde erime 45

55 EK 6: Balıklarda dış bakıda gözlenen semptomlar (devam) Şekil 1.e Deneysel enfeksiyon grubu balıklarında yüzgeçlerde erime Şekil 1.f Deneysel enfeksiyon grubu balıklarında ekzoftalmus 46