ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

Transkript

1 ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ DOKTORA TEZİ Fatmagün SARIHAN TİLAPİA (Oreochromis niloticus) LARDA LEVAMİSOL VE Streptococcus iniae UYGULAMASINDAN SONRA OLUŞAN İMMÜN YANITIN İZLENMESİ SU ÜRÜNLERİ ANABİLİM DALI ADANA, 2005

2 ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ TİLAPİA (OREOCHROMIS NILOTICUS) LARDA LEVAMİSOL VE STREPTOCOCCUS INIAE UYGULANMASINDAN SONRA OLUŞAN İMMÜN YANITIN İZLENMESİ Fatmagün SARIHAN DOKTORA TEZİ SU ÜRÜNLERİ ANABİLİM DALI Bu tez.../.../ 2005 Tarihinde Aşağıdaki Jüri Üyeleri Tarafından Oybirliği/Oyçokluğu ile Kabul Edilmiştir. İmza:... İmza:... İmza:... Prof.Dr. İbrahim CENGİZLER Prof.Dr. İhsan AKYURT Doç.Dr. Mustafa DÖRÜCÜ DANIŞMAN ÜYE ÜYE İmza:... Yrd.Doç. Dr. Aysel ŞAHAN ÜYE İmza:... Yrd.Doç. Dr. Ercüment GENÇ ÜYE Bu tez Enstitümüz Su Ürünleri Anabilim Dalında hazırlanmıştır. Kod No: Prof.Dr. Aziz ERTUNÇ Enstitü Müdürü İmza ve Mühür Bu Çalışma Çukurova Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi Tarafından Desteklenmiştir. Proje No: FBE2002D69 Not: Bu tezde kullanılan özgün ve başka kaynaktan yapılan bildirişlerin, çizelge, şekil ve fotoğrafların kaynak gösterilmeden kullanımı, 5846 sayılı Fikir ve Sanat Eserleri Kanunundaki hükümlere tabidir.

3 İÇİNDEKİLER SAYFA ÖZ.... I ABSTRACT..... II TEŞEKKÜR... III ÇİZELGELER DİZİNİ IV ŞEKİLLER DİZİNİ... VI 1. GİRİŞ ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR MATERYAL VE YÖNTEM Materyal Tilapia (Oreochromis niloticus L. 1758) Denemede kullanılan tanklar, deneme süreleri ve deneme düzeneği Birinci ve üçüncü denemelerde kullanılan bakteri İkinci denemede kullanılan immunostimulant Yöntem Birinci deneme Balıklarda deneysel enfeksiyonun oluşturulması ve Letal Doz 50 nin hesaplanması Enfekte balıkların klinik ve otopsi muayenesi Enfekte balıklardan bakterilerin re-izolasyonu ve bakterilerin polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) yöntemi ile identifikasyonu İkinci deneme Levamisolün balıklara uygulanması Balıklardan kan örneklerinin alınması Balık kanında hematokrit ve lökokrit seviyelerinin tespit edilmesi Balık kanında lökosit düzeyinin belirlenmesi Nitroblue Tetrazolium (NBT) Spektrofotometrik Test 29

4 NBT pozitif hücre aktivasyonu Fagositik aktivite Miyeloperoksidaz aktivitesi (MPO) Periferik yaymanın yapılması Üçüncü deneme Levamisol ve S. iniae nın balıklara uygulanması İstatistik analizler BULGULAR VE TARTIŞMA Bulgular Enfekte balıklarda klinik ve otopsi muayenesi ve LD 50 nin hesaplanması ile ilgili bulgular Enfekte balıklardan bakterilerin re-izolasyonu ve bakterilerin polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) yöntemi ile identifikasyonu Hematokrit değerleri Lökokrit değerleri Lökosit değerleri NBT aktivitesi- Spektrofotometrik test NBT pozitif hücre aktivasyonu Miyeloperoksidaz aktivitesi Fagositik aktivite Periferik yayma Levamisolün streptokokkosis enfeksiyonuna karşı yaşama oranına etkisi Tartışma Streptococcus iniae ile deneysel oluşturulan enfeksiyon Levamisol uygulamasından sonra balıklarda görülen immün yanıt Hematokrit değerleri Lökokrit değerleri Lökosit değerleri... 58

5 NBT aktivitesi- Spektrofotometrik test NBT pozitif hücre aktivasyonu Miyeloperoksidaz aktivitesi Fagositik aktivite Periferik yayma Levamisolün streptokokkosis enfeksiyonuna karşı yaşama oranına etkisi SONUÇLAR VE ÖNERİLER KAYNAKLAR ÖZGEÇMİŞ... 88

6 ÖZ DOKTORA TEZİ TİLAPİA (Oreochromis niloticus) LARDA LEVAMİSOL VE Streptococcus iniae UYGULAMASINDAN SONRA OLUŞAN İMMÜN YANITIN İZLENMESİ Fatmagün SARIHAN ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ SU ÜRÜNLERİ ANABİLİMDALI Danışman Jüri : Prof.Dr. İbrahim CENGİZLER Yıl 2005, Sayfa: 88 : Prof.Dr. İbrahim CENGİZLER Prof.Dr. İhsan AKYURT Doç.Dr. Mustafa DÖRÜCÜ Yrd.Doç. Dr. Aysel ŞAHAN Yrd.Doç. Dr. Ercüment GENÇ Bu çalışmada, levamisolün tilapia (Oreochromis niloticus) da spesifik olmayan savunma mekanizmaları ile Streptococcus iniae enfeksiyonu üzerine etkisi araştırılmıştır. Ayrı ayrı üç deneme kurulmuştur. İlk denemede S. iniae (1x10 1, 1x10 2, 1x10 3, 1x10 4 and 1x10 5 cfu/ml), intraperitonal olarak enjekte edildikten sonra % 50 sini öldüren doz (LD50) belirlenmiştir. İkinci denemede 24 saat banyo yoluyla 5, 7,5 ve 12,5 µg/ml levamisol uygulandıktan sonra denemenin 7, 14, 21 ve 28. günlerinde alınan kan örneklerinde hematokrit, lökokrit, lökosit, nitroblue tetrazolium (NBT) pozitif hücre aktivasyonu, nitroblue tetrazolium aktivitesi (spektrofotometrik olarak belirlenen), miyeleperoksidaz aktivitesi, fagositik aktivite, periferik yayma tespit edilmiştir. Üçüncü denemede, 24 saatlik banyo yoluyla 5, 7,5 ve 12,5 µg/ml levamisol uygulandıktan sonra 14. gün balıklara S. iniae (1x10 4 cfu/ml) intraperitonal olarak olarak enjekte edilerek, nispi yaşama yüzdesi sırasıyla 25, 51 ve 51 olarak hesaplanmıştır. Anahtar kelimeler: Tilapia, Levamisol, Streptococcus iniae, immün yanıt I

7 ABSTRACT PhD THESIS MONITORING OF IMMUNE RESPONSE AFTER APPLICATION OF LEVAMISOLE AND Streptococcus iniae ON TILAPIA (Oreochromis niloticus) Fatmagün SARIHAN DEPARTMENT OF FISHERIES INSTITUTE OF NATURAL AND APPLIED SCIENCES UNIVERSITY OF ÇUKUROVA Supervisor Jurry : Prof.Dr. İbrahim CENGİZLER Year: 2005, Pages: 88 : Prof.Dr. İbrahim CENGİZLER Prof. Dr. İhsan AKYURT Assoc. Prof. Dr.Mustafa DÖRÜCÜ Assist. Prof. Dr. Aysel ŞAHAN Assist. Prof. Dr. Ercüment GENÇ In this research, effects of levamisole on non-specific defence mechanisms and Streptococcus iniae infection in tilapia were investigated. Three experiments were conducted separately. In the first experiment, LD 50 was determined after intraperitonally (i.p) injection of S. iniae (1x10 1, 1x10 2, 1x10 3, 1x10 4 and 1x10 5 cfu/ml). In the second experiment, haematocrit, leucocrit, leucocyte, nitroblue tetrazolium (NBT) positive cell activation, nitroblue tetrazolium activity (spectrophotometrically determined), myeloperoxidase activity, phagocytic activity, differential leucocyte counts were measured from fish blood samples on days 7, 14, 21 and 28 post-bath treatment with 5, 7.5, and 12.5 µg/ml dosages for 24 hours for each dosage. In the third experiment, fish were treated with levamisole (5, 7.5, and 12.5 µg/ml) for 24 hours and kept in tanks for 14 days. After immunization, S. iniae (1x10 4 cfu/ml) was i.p injected and relative percent survivals (25, 51 and 51 respectively) were calculated. Key Words: Tilapia, Levamisole, Streptococcus iniae, immune response II

8 TEŞEKKÜR Tezime başladığımdan itibaren desteğini, ilgisini ve bilgisini esirgemeyen danışman hocam Prof.Dr. İbrahim CENGİZLER e, yakın ilgi ve yardımları için Çukurova Üniversitesi Su Ürünleri Fakültesi Dekanı Prof.Dr. Ercan SARIHAN a, her zaman destek gördüğüm Mustafa Kemal Üniversitesi Su Ürünleri Fakültesi Dekanı Prof.Dr. İhsan AKYURT a teşekkür ederim. Deneme verilerinin değerlendirilmesinde yardımlarını esirgemeyen Ziraat Fakültesi Öğretim Üyesi Prof.Dr. Tamer KAYAALP e, Biyoistatistik Anabilim Dalı Başkanı Prof.Dr. Refik BURGUT a ve Araş.Gör. Levent SANGÜN e teşekkür ederim. Çalışmamızda kullandığımız bakteri suşunu gönderen Dr. Avi Eldar (Hebrew Üniversitesi, Klinik Mikrobiyoloji Bölümü, İsrail) a, yardımlarından dolayı Dr. Mohammed AKLAGHI (Shiraz Üniversitesi, Veteriner Fakültesi, İran) e, Ahmed M. DARWISH (Auburn Üniversitesi, Veteriner Okulu Patobiyoloji Bölümü, USA) e ve Dr. Phillip H. KLESIUS (Auburn Üniversitesi, Balık Hastalıkları ve Parazitler Araştırma Ünitesi, USA) a teşekkür ederim. Her konuda yardımlarını gördüğüm, Prof.Dr. Burhan ARIKAN a, Prof.Dr. Fatih KÖKSAL a, Doç.Dr. Mustafa DÖRÜCÜ ye, Sayın Araş.Gör. Ünal İSPİR e, Dr.Adil ALLAHVERDİYEV e, Yrd.Doç.Dr. Mehmet SERİN e, Yrd.Doç.Dr. Aysel ŞAHAN a, Yrd. Doç.Dr. Mahmut Ali GÖKÇE ye ve Yrd. Doç.Dr. Ercüment GENÇ e ve Araş.Gör. Argun ÖZAK a teşekkür ederim. Çukurova Üniversitesi Su Ürünleri Fakültesi nin akademik ve idari personeli ile laboratuar çalışmalarımda yardımcı olan lisans öğrencilerine teşekkür ederim. Manevi yardımlarından dolayı Yrd. Doç.Dr. Meryem ATİK e, Yrd. Doç.Dr. Şehriban ÇEK e, Dr. Selin SAYIN a ve Araş.Gör. Gül KİRİŞ e teşekkür ederim. Ayrıca her zaman yanımda olan sevgili aileme ve sonsuz ilgisi, sabrı ve hoşgörüsü ile bana destek olan eşim, Denizhan SARIHAN a gönülden teşekkür ederim. III

9 ÇİZELGELER DİZİNİ SAYFA Çizelge 3.1. Denemelerde kullanılan tank, balık sayıları ve denemelerin süreleri Çizelge 4.1. Deneme balıklarının toplam boy ve canlı ağırlıkları Çizelge 4.2. Denemede kullanılan suyun ph, çözünmüş oksijen ve sıcaklık değerleri Çizelge 4.3. Deneme süresince balıklarda görülen ölümler Çizelge 4.4. Reed and Muench yöntemi ile 48 saat sonra balıkların % 50 sini öldüren doz (LD50) Çizelge 4.5. Üç farklı dozda levamisol uygulamasından sonra 7., 14., 21. ve 28. günlerde ölçülen hematokrit ortalamaları (%) Çizelge 4.6. Üç farklı dozda levamisol uygulamasından sonra 7., 14., 21. ve 28. günlerde ölçülen lökokrit ortalamaları (%) Çizelge 4.7. Üç farklı dozda levamisol uygulamasından sonra 7., 14., 21. ve 28. günlerde ölçülen lökosit ortalamaları (x10 3 /mm 3 ) Çizelge 4.8. Üç farklı dozda levamisol uygulamasından sonra 7., 14., 21. ve 28. günlerde ölçülen NBT aktivitesi değerleri (mg/ml) Çizelge 4.9. Üç farklı dozda levamisol uygulamasından sonra 7., 14., 21. ve 28. günlerde ölçülen NBT pozitif hücre aktivasyonu değerleri (adet) Çizelge Üç farklı dozda levamisol uygulamasından sonra 7., 14., 21. ve 28. günlerde ölçülen miyeloperoksidaz aktivitesi (MPO) aktivitesi (kuvvetli boyanan hücreler) (%) Çizelge Üç farklı dozda levamisol uygulamasından sonra 7., 14., 21. ve 28. günlerde ölçülen MPO aktivitesi (zayıf boyanan hücreler) (%) Çizelge Üç farklı dozda levamisol uygulamasından sonra 7., 14., 21. ve 28. günlerde ölçülen MPO aktivitesi (aktif olmayan hücreler) (%) Çizelge Üç farklı dozda levamisol uygulamasından sonra 7., 14., 21. ve IV

10 Çizelge Çizelge Çizelge Çizelge Çizelge günlerde ölçülen aktif fagositik hücreler (%) Üç farklı dozda levamisol uygulamasından sonra 7., 14., 21. ve 28. günlerde ölçülen lenfosit ortalamaları (%) Üç farklı dozda levamisol uygulamasından sonra 7., 14., 21. ve 28. günlerde ölçülen nötrofil ortalamaları (%) Üç farklı dozda levamisol uygulamasından sonra 7., 14., 21. ve 28. günlerde ölçülen monosit ortalamaları (%) Üç farklı dozda levamisol uygulamasından sonra 7., 14., 21. ve 28. günlerde ölçülen eosinofil ortalamaları (%) Levamisol uygulanan gruplarda S. iniae enfeksiyonu sonucu belirlenen ölümler V

11 ŞEKİLLER DİZİNİ SAYFA Şekil 3.1. Denemede kullanılan tilapia (Oreochromis niloticus L. 1758) Şekil 3.2. Denemenin yürütüldüğü tankların genel görünümü Şekil 3.3. Levamisolün kimyasal yapısı Şekil 3.4. Bakterinin intraperitonal olarak balıklara enjekte edilmesi Şekil 4.1. Deneysel enfeksiyon sonucu tilapianın vücut yüzeyinde görülen hiperemik alanlar (orijinal) Şekil 4.2. Deneysel enfeksiyon sonucu tilapianın gözünde görülen korneal opasite (orijinal) Şekil 4.3. Deneysel enfeksiyon sonucu tilapia da görülen bilateral eksoftalmus (orijinal) Şekil 4.4. Deneysel enfeksiyon sonucu tilapia da görülen bağırsaklarda sarı seröz sıvı birikimi (orijinal) Şekil 4.5. Deneysel enfeksiyon sonucu tilapia nın hava kesesinde görülen kanlanma (orijinal) Şekil 4.6. Brain Heart Infusion Agar üzerinde S. iniae kolonilerinin görünümü (orijinal) Şekil 4.7. % 5 koyun kanlı agarı üzerinde β-hemolitik S. iniae kolonilerinin görünümü (orijinal) Şekil 4.8. Gram pozitif S. iniae bakterisinin görünümü x1000 (orijinal) Şekil 4.9. S. iniae DNA larının PCR ile amplifikasyonundan sonra % 2 lik agaroz jel de elektroforeze tabi tutularak elde edilen spesifik bantlarının görünümü M= Marker (300pb) 1= Dan-1 suşu, 2-3= 1.denemede enfekte edilen balıklardan re-izole edilen bakteri 4-5= 3. denemede enfekte edilen balıklardan re-izole edilen bakteri N= Negatif kontrol (orijinal) Şekil Levamisol uygulanan balıklardan alınana kan örneklerinde NBT aktivitesi sonucu pozitif nötrofil hücrelerinin görünümü x400 (orijinal) Şekil Levamisol uygulamasından sonra ölçülen MPO aktivitesi (kuvvetli VI

12 boyanan hücreler) (%) (orijinal) Şekil Levamisol uygulanan balıklardan alınan kan örneklerinde fagositik aktivite sonucu aktif hücrelerin görünümü. Giemsa, x1000 (orijinal) Şekil Levamisol uygulanan balıklardan alınan kan örneklerinde nötrofillerin görünümü. May-Grünwald Giemsa, x1000 (orijinal) VII

13 1.GİRİŞ Fatmagün SARIHAN 1. GİRİŞ Balık yetiştiriciliği, sağlıklı bir besin kaynağı sağlaması, istihdam olanağı yaratması, önemli bir ihraç ürünü olması nedeniyle, büyük kazanç sağlayan önemli bir sektördür. Yetiştiriciliği yapılan değişik deniz ve tatlısu balık türlerinin üretimi her yıl artmaktadır. Dünya su ürünleri üretiminin % 15 i yetiştiricilik yoluyla elde edilmektedir. Türkiye bulunduğu iklim kuşağı ve coğrafi yapısı nedeniyle denizlerde ve içsularda birçok su ürününün yetiştirilmesine uygun olanaklara sahiptir. Türkiye de yetiştiricilik konusunda teknolojik ilerlemeler son on yılda hızlı bir gelişme göstermiştir yılında yetiştiriciliğin toplam üretimdeki payı 6 düzeyindeyken, son on yıldaki artışla 1998 yılında bu pay % 10 a yükselerek, içsu ve deniz balıkları yetiştiriciliğinden elde edilen üretim tona ulaşmıştır (Anonim, 2001; Atay ve ark, 2000). Son yıllarda resmi olmayan rakamlara göre bu miktar tonu aşmıştır. Bu gelişmelere karşın balık hastalıkları, yetiştiricilikte önemli bir sorun oluşturmaktadır. Çünkü balıklar, havuz ve kafes gibi kapalı alanlarda yetiştirilmekte ve birim alandaki verimliliği yükseltmek için stok yoğunlukları giderek arttırılmaktadır. Bu durum, balıklar için uygun olmayan yetiştiricilik koşullarının oluşmasına ve buna bağlı olarak da enfeksiyonlara karşı hassasiyetin artmasına neden olmaktadır (Schreck, 1996; Sakai, 1999). Balık yetiştiriciliğinde, yüksek nitelikte balık üretmek ve uygun büyüme koşullarını elde edebilmek esastır. Balıkların strese karşı duyarlı olmaları ve su ortamında hastalıkların hızla yayılması, hastalıkları önleme konusunda çaba göstermeyi zorunlu kılmaktadır (Verlhac ve Gabaudan, 1997). Yetiştiricilikte, bakteriyel balık hastalıklarını önlemek ve tedavi etmek için antibiyotikler kullanılmaktadır. Bununla birlikte; antibiyotiklerin kullanımı daha dirençli bakteriyel suşların gelişmesi veya yetiştiriciliği yapılan balıklarda antibiyotik kalıntılarının meydana gelmesi gibi tehlikeleri ortaya çıkarmaktadır. Bu hususlar göz önüne alındığında, bilinen antibiyotiklerin potansiyel kullanımı veya yetiştiricilikte yeni bir antibiyotiğin kabul görmesi sınırlı olmaktadır. Bu anlamda, son yıllarda, enfeksiyöz hastalıklara karşı alternatif stratejiler ön plana çıkmaktadır. Diğer hayvan 1

14 1.GİRİŞ Fatmagün SARIHAN türlerinde olduğu gibi balıklardaki enfeksiyöz hastalıklar için yaygın olarak kullanılan yöntemlerden biride aşılamadır. Ticari olarak bazı bakteriyel ve viral enfeksiyonlar için aşılar geliştirilmiştir (Van Muiswinkel, 1992; Anderson, 1996; Vinitnantharat ve ark, 1999; FAO 2002; Gatlin, 2002). Aşılama, balık hastalıklarını öneleme konusunda en etkili yöntemlerden biri olarak kabul edilmektedir. Ancak bazı patojenlere karşı aşı geliştirilmesi konusunda henüz başarı sağlanamamıştır. Bu nedenle, sadece aşıları kullanarak tüm balık hastalıklarını önleyebilmek henüz olası değildir (Sakai, 1999; Sarder ve ark, 2001). İmmünoterapi, hastalıkları önlemek ve tedavi etmek için immünolojik temel kurallardan faydalanan tüm yöntemleri içerir. İnsan ve hayvan hekimliğinde immünoterapi uygulanmaları gelişmekte olan bir alan olarak kabul edilmektedir. İmmünostimulantlar (bağışıklık uyarıcılar), özel immün yanıtı arttırmamakla birlikte, özel olmayan savunma gücünü arttırmasıyla özellikle bakteriyel hastalıklara karşı direncin oluşmasını sağlamaktadır. Elde edilen bu savunma gücü ise uzun süreli olmamaktadır. Buna rağmen bağışıklık uyarıcılarının kullanılması, balıklarda bağışıklık yeteneğini ve hastalıklara karşı direnci arttırmada etkili bir yöntemdir. Ayrıca immunostimulant kullanımı sayesinde, antibiyotiklerin kullanımı da azaltılmış olmaktadır. Günümüzde su canlıları yetiştiriciliğinde çeşitli immünostimulantlar kullanılmakta ve halen bu konudaki çalışmalar sürdürülmektedir (Raa ve ark, 1992; Hadden, 1993; Douglas ve ark, 1997; Siwicki ve ark, 1998; Sakai, 1999; Raa, 2000). İmmün sistemin temel fonksiyonu, hastalıklara neden olan mikroorganizmalara karşı hayvanı korumaktır. Balıkların immün sistemi, memelilerinkine benzemektedir. Balıklardaki immün sistemin değişik yönleri ile ilgili birçok derleme yapılmıştır (Ellis, 1977; Ellis, 1981; Fletcher, 1986; Chung ve Secombes, 1988; Landolt, 1989; Alexander ve Ingram, 1992; Secombes ve Fletcher, 1992; Siwicki ve ark, 1994a; Dalmo ve ark, 1997; Le Morvan ve ark, 1998; Ellis, 1999; Press ve Evensen, 1999; Robertson, 1999; Olabuenaga, 2000; Ellis, 2001; Neumann ve ark, 2001; Watts ve ark, 2001). İmmün sistem hücresel ve sıvısal faktörleri içeren, hem spesifik hem de spesifik olmayan savunma sistemlerinden oluşur. Spesifik olmayan savunma sistemi normal balıkların bir parçasıdır ve yanıt 2

15 1.GİRİŞ Fatmagün SARIHAN gelişimi için, bir antijen/patojen ile önceden temasa gerek yoktur. Diğer taraftan, spesifik immün yanıtta, antijeni ilk olarak tanıma ve aktivasyon arasındaki süre uzundur (Ellis, 1988; Yano, 1996; Vadstein 1997). Tilapia, günümüzde dünyada yetiştiriciliği yapılan en önemli balık türüdür. Bazı kaynaklara göre dünyada ikinci sırada olduğu bildirilmektedir. Bugün, tilapia, Amerika nın en fazla ithal ettiği, deniz ürünlerinden karides ve Atlantik Salmon dan sonra üçüncü sırada gelmektedir (Bhujel ve Suresh, 2000; Alceste ve Darryl, 2001). Bu çalışmada da yetiştiriciliği ülkemizin bazı bölgelerinde de (Akdeniz, Ege) giderek yaygınlaşan tilapia (Oreochromis niloticus) da, sentetik bir bağışıklık uyarıcı madde olan levamisolün, balık patojeni olarak bilinen Streptococcus iniae enfeksiyonuna karşı koruyucu etkisinin araştırılması amaçlanmıştır. Elde edilecek sonuçların uygulamaya yönelik olması ve bu konuda yapılabilecek çalışmalara temel oluşturması yönüyle önem taşıdığına inanılmaktadır. 3

16 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Fatmagün SARIHAN 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR 2.1. Balıklarda streptokoklar üzerine yapılan çalışmalar Streptococcus iniae ilk olarak Pier ve Madin (1976) tarafından, 1972 yılında Steinhart Akvaryum unda (Amerika) yaşayan tatlısu yunusu (Inia geoffrensis) nun deri altı apsesinden izole edilmiştir. Pier ve ark. (1978), tatlısu yunusu (Inia geoffrensis) dan ikinci defa izole ettikleri Streptococcus iniae suşunun 1976 yılında izole ettikleri suşdan bazı biyokimyasal özelliklerinin farklı olması ile ayrıldığını ve bu türün BU (=ATCC 29177) olarak ifade edildiğini bildirmişlerdir. Rasheed ve Plumb (1984), Fundulus grandis de hemolitik olmayan grup B streptokokları ile, farklı yollarla (balıkları farklı sürelerde bakteriyel süspansiyona daldırma, bakteri verilmeden önce hiperosmatik solüsyonda tutma, balıklarda yara oluşturduktan (skrafiye) sonra bakteriyel süspansiyona daldırma vb.) enfeksiyon oluşturarak etkenin patojenitesini araştırmışlardır. Farklı sürelerde bakteriyel süspansiyonuna daldırılan, bakteriyel süspansiyona daldırmadan önce 50 tuz solüsyonunda bekletilenler ile oral yolla (mide içerisine) bakteri verilen balıklar arasında ölüm görülmediğini, ancak bakteriyel süspansiyona daldırılmadan önce skrafiye edilen balıkların enfekte olduğunu belirlemişlerdir. Ayrıca stok yoğunluğunun ve düşük oksijenin balıklarda enfeksiyon gelişimini hızlandırmadığını saptamışlardır. Sakai ve ark. (1987), alabalıkda streptokokkal enfeksiyonuna karşı Freund un tam adjuvantlı ve adjuvantsız olarak formalinle zayıflatılmış bakterileri immersiyon ve intraperitonal (i.p) enjeksiyon yoluyla aşıladıktan sonra nispi yaşama yüzdesi (Relative percent survival, RPS) ni araştırmışlardır. En yüksek nispi yaşama yüzdesinin adjuvantsız bakteriler ile i.p enjeksiyon yoluyla aşılanan grupta olduğunu belirlemişlerdir. Bragg (1988), gökkuşağı alabalığı (Salmo gairdneri) nda streptokokkosis e neden olan Streptococcus sp. nin serolojik olarak hızlı bir şekilde identifikasyonu için indirekt floresan antikor tekniğini başarılı bir şekilde uyguladıklarını 4

17 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Fatmagün SARIHAN bildirmişlerdir. Bragg ve ark. (1989a), Güney Afrika da gökkuşağı alabalığı (Salmo gairdneri) nda streptokokkosis e neden olan Streptococcus türlerini izole etmek için selektif katı ve sıvı besiyerleri hazırlamışlardır. Streptococcus türleri bulunabilecek su kaynaklarından, tatlısu yengeçlerinden, çamurdan ve alabalıklardan aldıkları örnekleri önce sıvı besiyerine, arkasından tetrazolium agar besiyerine ekerek, kırmızı renkli Streptococcus türlerine ait kolonileri izole etmişlerdir. Bragg ve ark. (1989b), Güney Afrika da Roodeplaat Barajı nda bulunan sülük (Batracobdelloides tricarinata) lerin iç organlarından Streptoccocus sp. izole ettiklerini bildirmişlerdir. Bu sülüklerin Baraj da bulunan gökkuşağı alabalıklarında Streptoccocus sp. enfeksiyonlarının oluşmasında muhtemel rezervuar olduklarını ileri sürmüşlerdir. Al-Harbi (1994), kültürü yapılan hibrid tilapia (Oreochromis niloticus x O. aureus) da yoğun ölümlere neden olan etken olarak α-hemolitik Streptococcus sp. yi izole etmiştir. Hastalanan balıklarda yüzme bozukluğu, renkte koyulaşma, eksoftalmus, vücut yüzeyinde, özellikle çene etrafında, ağızda, operkulum, pektoral, dorsal ve kuyruk yüzgeç tabanlarında hemoraji ile abdominal boşlukta sıvı varlığı gibi klinik bulgular kaydetmiştir. Perera ve ark. (1994), 1992 de ABD nin Teksas eyaletinde bir balık çiftliğinde kültürü yapılan hibrid tilapia (Tilapia nilotica x T. aurea) da görülen ölümlere neden olan etkenin β-hemolitik Streptococcus olduğunu ribozomal gen dizilimi, klasik biyokimyasal ve fizyolojik analizler sonucu belirlemişlerdir. Bu bakterinin, amfisilin ve furozolidon a dirençli, tetrasiklin, oksitetrasiklin ve sülfametoksin-ormetoprim e karşı ise hassas olduğunu tespit etmişlerdir. Amerika da ilk kayıt olarak belirttikleri bu bakteri türünün, balıklarda oryantasyon kaybı, eksoftalmus, korneal opasite, ağız ve anüs etrafında, pektoral yüzgeçlerin proksimalinde peteşi, peritonal boşlukta sıvı birikimi, karaciğer, dalak ve böbreklerde büyüme görüldüğünü bildirmişlerdir. Eldar ve ark. (1995a), İsrail de yetiştiriciliği yapılan hibrid tilapia (Oreochromis aurea x O. nilotica) da ve gökkuşağı alabalığı (Oncorhynchus mykiss) nda hızla yayılarak ölümlere neden olan enfeksiyonun etkenlerini 5

18 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Fatmagün SARIHAN Streptococcus shiloi ve S. difficile olarak belirlemişler. Ancak tilapia ile aynı havuzda bulunan sazan (Cyprinus carpio) ın ise enfeksiyona karşı duyarlı olmadıklarını saptamışlardır. Havuzlardan aldıkları su örneklerinde ise zenginleştirme yöntemleri uyguladıkları besiyerlerinde etkeni izole edebildiklerini bildirmişlerdir. Daha sonra yaptıkları deneysel enfeksiyon çalışmasında, balıklarda görülen hastalık belirtilerinin doğal olarak enfekte olan balıklarla benzer olduğunu (letarji, yem almama, yüzme bozukluğu vb.) belirlemişlerdir. Eldar ve ark. (1995b), İsrail ve Amerika da izole edilen Streptococcus shiloi ile yaptıkları biyokimyasal testler sonucunda, bu bakterinin fenotipik olarak Streptococcus iniae ile benzer olduğunu belirlemişlerdir. Ayrıca inceledikleri türlerde DNA-DNA hibridizasyonunda % homolog seviyelerinde olduğunu tespit etmişlerdir. Sonuç olarak S. iniae nın S. shiloi nin sinonimi olduğunu rapor etmişlerdir. Eldar ve ark. (1995c), hibrid tilapia (Oreochromis aurea x O. nilotica) da meningoensefalitise neden olan S. difficile e karşı koruma sağlamak için, formalin ile etkisiz hale getirilen etkeni veya bakteriyel protein parçalarını içeren aşıları, balıklara uygulamışlardır. Bu aşıların her ikisinin de yüksek etkinliğe sahip olduğunu tespit etmişlerdir. Akhlaghi ve ark. (1996), gökkuşağı alabalığı (O. mykiss, Walbaum) nda streptokokkosis e karşı, profilaksi için pasif immünizasyonun uygulanabilirliğini araştırmışlardır. Bu nedenle, ilk olarak bu hastalığa karşı pasif immünitenin koruyucu değerini saptamışlardır. Ayrıca pasif ve aktif koruyucu immüniteyi karşılaştırmak amacıyla, birinci ay LD 63, ikinci ay LD 75, ve üçüncü ay LD 85 e karşılık gelen bakteri dozlarını intraperitonal (i.p) enjeksiyonla balıklara vermişlerdir. Pasif olarak uygulanan koyun ve tavşan antikorlarının, 60 günden sonra enzim-bağlı immünosorbent testi (enzyme linked immunosorbent assay, ELISA) ile balık serumunda görüldüğünü belirlemişlerdir. Balıklarda bu antikorlara karşı immünolojik olarak yanıt oluştuğunu, koyun ve tavşan anti-streptococcus sp. (ASA) antikorlarına karşı en yüksek hümoral yanıtın, immünizasyon sonrası ikinci ayda şekillendiğini kayıt etmişlerdir. Pasif immünizasyon uygulanmasında, balıklara koyun, tavşan ve balık ASA ı i.p olarak enjekte edildikten sonra, virülent 6

19 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Fatmagün SARIHAN Streptococcus sp. ile enfekte edilen balıklarda; en yüksek nispi yaşama yüzdesinin birinci, ikinci ve üçüncü aylarda, koyun ASA ı uygulanması ile olduğunu; aktif olarak immünize edilen balıklarda (i.p ve immersiyon yoluyla) ise en yüksek nispi yaşama yüzdesinin, birinci ikinci ve üçüncü aylarda i.p enjeksiyonla yapılan immünizasyonda olduğunu belirtmişlerdir. Bunch ve Bejerano (1997), hibrid tilapia (O. niloticus x O. aureus) da, stresin gelişmesine ve hassasiyetin artmasına neden olan farklı subletal çevresel faktörleri araştırmışlardır. Bu amaçla, sağlıklı ve hasta olan hibrid tilapia (O. niloticus x O. aureus), sazan (C. carpio), kefal (Mugil cephalus) ve hibrid çizgili levrek (Morone saxatilis x M. chrysops) in bulunduğu balık çiftliklerinden alınan örnekleri incelemeleri sonucunda Streptococcus cinsine ait bakterilere rastlamışlardır. Tüm bakteriyel izolatların, hareketsiz, gram pozitif kok ve katalazın negatif olduğunu belirlemişlerdir. Ayrıca bu izolatlar içerisinde α ve γ olmak üzere iki farklı hemoliz özelliği gösteren Streptococcus cinslerinin olduğunu da bildirmişlerdir. Elde ettikleri bu izolatlarla, deneysel olarak oluşturdukları enfeksiyonda, düşük oksijen, yüksek nitrat konsantrasyonlarının özellikle yüksek su sıcaklıklarında enfeksiyonun gelişiminin hızlandığı ve ölüm oranının arttığını ifade etmişlerdir. Eldar ve ark. (1997), gökkuşağı alabalığında S. iniae enfeksiyonuna karşı farklı dozlarda formalinle etkisiz hale getirilmiş bakterileri aşı olarak kullanmışlardır. Bir defa yapılan intraperitonal enjeksiyon sonucu (3.0x10 11 hücre/ml) birinci ayda başlayan spesifik hümoral yanıtın, altıncı ayın sonuna kadar devam ettiğini bulmuşlardır. Ayrıca hem laboratuvar hem de arazi şartlarında, 50 g ağırlıkta olan balıkların aşılanması sonucu S. iniae enfeksiyonuna karşı en az dört aylık bir koruma sağladıklarını ve arazi şartlarında aşılanmayan balıklarda ölüm oranının %50 olduğunu, aşılanan balıklarda ise bu oranın % 5 e ulaşmadığını bildirmişlerdir. Aşılanan balıkların aşılanmayan balıklara göre, % 20 ağırlık kazandıklarını da tespit etmişlerdir. Hurvitz ve ark. (1997), gökkuşağı alabalığına, aktif ve formalinle zayıflatılmış S. iniae yı i.p olarak enjekte ettikten sonra balıklarda oluşan antikor düzeylerini ve amonyağın subletal konsantrasyonlarının etkisini incelemişlerdir. Düşük (7 µg/l ve yukarısı) ve orta (50-80 µg/l) amonyak seviyelerinde nispi 7

20 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Fatmagün SARIHAN yaşama yüzdesi (Relative percent survival, RPS) inde önemli bir fark görülmediğini yüksek ( µg/l) amonyak seviyesinde ise RPS nin önemli düzeyde düşük olduğunu bildirmişlerdir. Ayrıca antikor titreleri ve koruma arasında korelasyon olmadığını da bildirmişlerdir. Perera ve ark. (1997), hibrit tilapia da S. iniae nın bir biyotipinin neden olduğu bakteriyel septiseminin epizotiyolojik yönlerini araştırmışlardır. Bu amaçla, tatlı ve tuzlu suda bakterilerin canlı kalma süresi, kültür ortamında patojenlerin büyüme dinamikleri, sıcaklık, ph ve tuzluluğa bağlı olarak bakterilerin büyümesi, tilapia (T. aurea) da letal doz (%50) un belirlenmesi, konakçıda hastalığı ortaya koymada su sıcaklığı, ph ve tuzluluğun rolü, enfeksiyon veya patojen saldırısı şeklininin belirlenmesi ve kanal kedi balığı (Ictalurus punctatus), hibrid çizgili levrek (Morone chrysops x M. saxatilis) ve kanal levreği (Sciaenops ocellatus) nde streptokokkal patojenin virülensını belirlemişlerdir. Bowser ve ark. (1998), tilapia (O. niloticus) için oluşturulan farklı resirküle su sistemlerinde S. iniae enfeksiyonunun dağılımını incelemişlerdir. Ayrıca sağlıklı ve enfekte balıkların kohabitasyonu (birlikte yaşaması) ve düşük çözünmüş oksijenin, enfeksiyon riskine olan etkisini araştırmışlardır. Oluşturulan bu şartlar altında bulunan bütün balıklardan, katalazı ve oksidazı negatif, α ve γ olmak üzere iki farklı hemoliz özelliği gösteren gram pozitif olan koklara rastlamışlardır ve yaptıkları diğer biyokimyasal testler sonucu izole ettikleri bakterinin S. iniae (ATCC 29178) olduğunu saptamışlardır. Weinstein ve ark. (1997), insanlarda, balık (tilapia ve levrek) temizlerken bıçak darbesi veya balığın yüzgeç dikenleri ile derinin delinmesi sonucu, elde oluşan perkutan yaraları takiben bakteriyemiyle birlikte S. iniae nın neden olduğu enfeksiyonları belirlemişlerdir. Bu hastalardaki klinik bulguların, ellerde selülit (yaralanmalardan sonra saat içerisinde gelişen), yaralı bölgelerden kaynaklanan ateş ve lenfanjitis (lenfatik damarların iltihaplanması) ve ayrıca menenjite neden olduğunu bulmuşlardır. Austin ve Austin (1999), balıklarda patojenik streptokokların, Streptococcus iniae (= Str. shiloi), S. difficilis (= Str. agalactiae), Streptococcus (Enterococcus) faecalis subsp. liquefaciens, S. milleri, S. parauberis olduğunu belirtmişlerdir. 8

21 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Fatmagün SARIHAN Dodson ve ark. (1999), insanlardan ve hayvanlardan izole edilen S.iniae izolatlarının benzer olup olmadığını araştırmışlardır. Bunun için tesadüfi amplifiye edilmiş polimorfik DNA analizi (random amplified polymorphic DNA analysis, RAPD) ve tekrarlamalı primer polimeraz zincir reaksiyonu (repetitive primer polymerase chain reaction, REP PCR) yöntemlerini kullanarak bu izolatların biyokimyasal profilleri ve genetik ilişkilerini saptamışlardır. İnsan ve balık izolatlarının biyokimyasal profillerinin farklı olduğunu, bu sonuçlarında genetik yapıdaki farklılığı gösterdiğini belirlemişlerdir. İzolatların arasındaki farklılığı göstermek için uyguladıkları RAPD ve REP PCR yöntemlerinde kullandıkları beş farklı RAPD primerleri ve BoxA primerinin ayırma gücüne sahip olmadığını ileri sürmüşlerdir. Klesius ve ark. (1999), formalinle etkisiz hale getirilmiş olan ve konsantre edilmiş ektraselüler ürünlerden oluşan S. iniae aşısını, tilapia (O. niloticus) ya intraperitonal yolla uygulamışlardır. Aşılamadan 30 gün sonra, balıklara i.p yolla virülent S. iniae enjekte etmişlerdir. Aşılanmayan balıklarda 4-5 gün sonra enfeksiyonun belirtileri olan eratik yüzme, hemorajik eksoftalmiya ve oküler opasite görüldüğünü ve bu grupta ortalama ölümün % 80,7 olduğunu, aşılanan balıklarda ise enfeksiyon belirtileri görülmezken ortalama ölümü % 7 olarak saptamışlardır. Nguyen ve Kanai (1999), yetiştiriciliği yapılan japon pisi balığı (Paralichthys olivaceus) nda ve bulunduğu ortamdaki suda streptokokkosise sebep olan S. iniae yı izole etmek için iki tip selektif besiyeri hazırlamışlardır. Bu besiyerlerini, kalp infusyon agarına, talyum asetat ve oksolinik asit (TAOA) ile kolistin sülfat ve oksolinik asit (CSOA) ekleyerek elde etmişlerdir. Ayrıca S. iniae nın, β-hemolitik kolonilerini görebilmek için, her iki selektif besiyerine defibrine at kanı eklemişlerdir. Sonuç olarak, aldıkları örneklerdeki S.iniae ı saf kültür olarak izole ettiklerini bildirmişlerdir. Plumb (1999), tilapiada görülen S.iniae dışındaki diğer bakteriyel hastalıkları, Aeromonas hydrophila, A. sobria, Pseudomonas fluorescens, Plesiomonas shigelloide, Vibrio parahaemolyticus, Flexibacter columnaris, Edwarsiella tarda, mycobacteriosis ve riketsiya olarak bildirmiştir. 9

22 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Fatmagün SARIHAN Evans ve ark. (2000), hibrid çizgili levrek (Morone chrysops x M. saxatilis) nde ve tilapia (O. niloticus) da daha önce uygulanmamış olan gözlere ve burun delikleri içerisine yaptıkları S. iniae inokülasyonundan sonra enfeksiyonun gelişimini takip etmişlerdir. Her iki türde de etkenin göze verilmesi sonucunda ölüm ve hastalık belirtileri görülmediğini, etken burun deliklerinden verildiğinde ise enfeksiyonun tipik belirtileri olan, yüzeyde yüzme veya zeminde sabit durma, eratik yüzme, dengesini kaybetme, ani hareketler yapma, ani sıçrama, yemi yavaş alma veya reddetme, letarji ve vücut renginde koyulaşma olduğunu belirtmişlerdir. Klesius ve ark. (2000), tilapia (O. niloticus) da streptokokkal hastalığını önlemek için, S. iniae nın tilapia izole edilen ARS-10 (homolog) ve hibrit çizgili levrekten izole edilen ARS-60 (hetereolog) suşlarını tek olarak ve bu suşları kombine (ARS-10+ ARS-60) kullanarak, formalinle etkisiz hale getirilmiş ve konsantre edilmiş ekstrasellüler ürünlerinden hazırlanan aşıları intraperitonal ve intramuskular olarak uygulayıp streptococcus enfeksiyonuna karşı etkinliğini araştırmışlardır. ARS-10 (homolog) aşısının i.p olarak uygulanmasının (nispi yaşama yüzdesi; % 93,7), diğer gruplara göre daha koruyucu olduğunu saptamışlardır. Shoemaker ve ark. (2000), tilapia (O. niloticus) da, üç farklı balık yoğunluğu ve bakteri (S. iniae) dozunun immersiyon yoluyla verilmesinin, ayrıca kohabitasyon (tanklara ölü veya ölmek üzere olan balıkların yerleştirilmesi) uygulamalarının yaşama oranı üzerine olan etkilerini araştırmışlardır. Farklı stok yoğunluklarının ölüm oranı üzerine etkisinin fazla olduğunu fakat farklı dozların ölüm üzerine etkisinin yüksek yoğunluk dışında etkili olmadığını bulmuşlardır. Ayrıca kohabitasyon uygulamasının da diğer uygulamalara göre ölüm oranı üzerine etkisinin az olduğunu belirlemişlerdir. Evans ve ark. (2001), hibrid çizgili levreği (Morone chrysops x M. saxatilis) nde S. iniae nın organlarda yayılmasını belirlemek amacıyla etkeni posteriör burun deliklerine inokule etmişlerdir. Levreklerin ilk iki solungaç kemeri ve üçüncü ile dördüncü solungaç kemerinden alınan kanda, burun delikleri, beynin olfaktori, optik ve serebellum (beyincik) bölgeleri, göz, kalp ve ön dokusundan, belirli zaman dilimlerinde aldıkları örneklerde S. iniae nın mevcudiyetini colony forming units (cfu) /µl cinsinden belirtmişlerdir. Etkenin en çabuk ulaştığı dokuların 10

23 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Fatmagün SARIHAN sırasıyla, beyincik, solungaçlarda bulunan kan, kalp böbrek, beyindeki olfaktarik lob ve optik lob bölgeleri ile göz olduğunu bildirmişlerdir. Shoemaker ve ark. (2001), Amerika da tilapia, hibrid çizgili levrek ve kanal kedibalığında S. iniae nın prevalansını (hastalığın sıklığını) belirlemişlerdir. Balık çiftliklerinde bu oran, tilapia da % 3,62, hibrid çizgili levrekde % 4,80, kanal kedibalığında ise rastlanmadığını tespit etmişlerdir. Ayrıca S. iniae nın bulunma sıklığı, kuluçkahanede tilapiada % 0,88 ve hibrid çizgili levrekde % 3,12, büyütme havuzlarında tilapiada % 7,96 ve hibrid çizgili levrekde % 9,56, pazara sunulan balıklarda ise tilapiada % 1,67 ve hibrid çizgili levrek de % 2,12 olduğunu bulmuşlardır. Taylor ve ark. (2001), tilapiadaki spesifik olmayan sitotoksik hücrelerinin apoptosis ve nekrosis üzerine olan etkilerini belirlemek için balıklardan ve insanlardan elde edilen S. iniae nın farklı izolatlarını kullanmışlardır. Sonuç olarak, S. iniae nın farklı izolatlarında, artan nekrosis ile yangı yanıtının programlanmış hücre seviyelerinin azalmasına neden olması ile spesifik olmayan sitotoksik hücrelerin antibakteriyel direncini düzenlediklerini saptamışlardır. Bromage ve ark. (2002), tatlısuda kültürü yapılan baramundi (Lates calcarifer) de S. iniae nın olası giriş yerini ve potansiyelini araştırmışlardır. Çiftliklerdeki balıklarda enfeksiyonun subakut formunun oral olarak başladığını, deneysel olarak patojenin banyo yolu ile verilmesi sonucunda ise akut formunun ortaya çıktığını belirlemişlerdir. Darwish ve ark. (2002), mavi tilapia (Tilapia aurea) da S. iniae enfeksiyonunu kontrol altına alınmasında, yeme ilave edilerek verilen oksitetrasiklin (OTC) in etkinliğini araştırmışlardır. Balıklara S. iniae verildikten 4-5 saat sonra 25, 50, 75 ve 100mg OTC/kg 14 gün boyunca yeme ilave edilerek verilen antibiyotiğin arkasından, 21. günün sonunda yaşama oranını belirlemişlerdir. En yüksek yaşama yüzdesinin (% 98.2), 100mg OTC/kg olarak verilen grupta olduğunu ve ayrıca bu balıklardan hayatta kalanlarda enfeksiyon etkenine rastlamadıklarını bildirmişlerdir. Diler ve ark. (2002), kültürü yapılan gökkuşağı alabalığında yaklaşık % 80 ölümlere neden olan etken olarak identifiye ettikleri Lactococcus garvieae nın Türkiye de streptokokkal enfeksiyon olarak ilk bildirim olduğunu belirtmişlerdir. 11

24 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Fatmagün SARIHAN Nakanishi ve ark. (2002), juvenil gökkuşağı alabalığına β-hemolitik streptocokkosise karşı koruma sağlamak amacıyla aşılamada yeni bir yöntem geliştirmişlerdir. Bu yöntemi çoklu delik açma aleti kullanarak elde etmişlerdir. Bu basit ve kullanışlı uygulamanın etkinliğinin, intraperitonal enjeksiyona eşit olduğunu belirlemişlerdir. Nguyen ve ark. (2002), çiftliklerde yetiştiriciliği yapılan japon pisi balığı (Paralichthys olivaceus) nda önemli bir bakteriyel patojen olan S. iniae nın, balıklarda ve suda görülme sıklığını selektif izolasyon prosedürünü kullanarak iki yıl boyunca takip etmişlerdir. Bu selektif besiyeri ile etkeni, enfeksiyon görülen balıkların beyin ve böbrek dokularından, sağlıklı görülen balıklarda ise; solungaç ve derideki mukus tabakasından, ayrıca su ve sedimentten izole ettiklerini bildirmişlerdir. Huchzermeyer (2003), Güney Afrika Cumhuriyeti nde gökkuşağı alabalığı yetiştiriciliği yapılan bazı çiftliklerde, görülen ölümlerin lansfild (lancefield) D grubu fekal Streptococcus türlerinden kaynaklandığını tespit etmiştir. Bu çiftliklerde balık havuzlarına su sağlama sistemindeki hatadan dolayı, atmosferik gazların suya süpersaturasyon (çözünmenin normalden fazla olması) kazandırmasının, balıkların solungaçlarında gaz kabarcığı hastalığının görülmesine neden olduğunu saptamıştır. Çiftliklerdeki havalandırma probleminin giderilmesinden sonra balıklarda gaz kabarcığı ve Streptococcus enfeksiyonuna rastlanmadığını bildirmiştir. Araştırmacı bu sonuca bağlı olarak gaz kabarcığı ve Streptococcus enfeksiyonu arasında önemli bir ilişki olduğunu belirtmiştir. Lim ve ark. (2003), balıklardan izole edilen S. iniae ve Edwardsiella tarda izolatlarında, sefaleksin ve gentamisin ve bunların birlikte kullanılmalarının in-vitro olarak etkisini araştırmışlardır. Her iki bakteri türünün de gentamisine karşı sefaleksinden daha hassas olduklarını belirlemişlerdir. Sefaleksin ve gentamisin kombinasyonları ise E. tarda ya karşı ise sinerjetik etki gösterirken, bu etkinin S. iniae da olmadığını saptamışlardır. Mcnulty ve ark. (2003), hibrid çizgili levreği (Morone saxatilis x M. chrysops) nde S. iniae nın solungaç kontaminasyonunu girme ve enfeksiyon oluşturma olasılığını araştırmışlardır. Bakterinin dört farklı dozunu solungaçlar 12

25 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Fatmagün SARIHAN yoluyla balıklara verdikten sonra, ölüm oranı ile belli aralıklarda aldıkları doku örneklerinde S. iniae nın dağılımını belirlemişlerdir. Solungaç filament epitelyumuna giren S. iniae nın kan aracılığıyla beyni enfekte ederek, daha sonra bütün vücuda yayıldıklarını belirlemişlerdir. Trotter ve Marshall (2003), besin endüstrisinde çeşitli gram pozitif bakterilere karşı antimikrobiyal aktiviteye sahip olan monolaurinin, ATCC (BU suşu) ve ATCC (PW suşu) S. iniae suşlarına karşı minimum inhibitör konsantrasyonunu belirlemişlerdir. Ayrıca S. iniae nın inaktivasyonunda ph ve tuz (NaCl) un kombine kullanılmasının monolaurin üzerine olan etkisini araştırmışlardır. PW suşunun, BU suşuna göre monolaurine daha hassas olduğunu, ayrıca artan tuz konsantrasyonu ve azalan ph ın, her iki suşda da monolaurin aktivitesini arttırdığını bulmuşlardır Balıklarda kullanılan immünostimulantlar üzerine çalışmalar Siwicki (1987), anaç sazan (C. carpio) da farklı dozlarda (5, 10, 15 ve 20 mg/kg vücut ağırlığı) üç gün aralıklarla üç kez, intraperitonal olarak enjekte edilen levamisolün spesifik olmayan immün yanıt üzerine etkisini 0., 2., 6., 10 ve 12. haftada alınan örneklerde araştırmışlardır. 5 ve 10 mg/kg olarak uygulanan levamisolün immün yanıtı arttırdığını, 15 ve 20 mg/kg olarak uygulanan dozlarda ise immün yanıtın arttığını fakat üçüncü ayın sonunda başlangıç değerlerine geri döndüğünü belirlemişlerdir. Sonuç olarak, levamisolün kullanılan doza bağlı olarak immünomodülasyon aktivitesini değiştirdiğini ileri sürmüşlerdir. Siwicki ve Studnicka (1987), Pseudomonas alcaligenes ve Aeromonas punctata ile deneysel olarak enfekte edilen sazanda meydana gelen nötrofillerin fagositosiz aktivitesi ve serum lizozim aktivitesini araştırmışlardır. İnceledikleri parametrelerin balıklardaki hastalıkların erken teşhisinde uygulanabileceğini bildirmişlerdir. Siwicki (1989), oral olarak 5 mg/kg levamisol uygulanan sazanda, fagositik hücreler, lökosit sayısı ve serumda lizozim seviyesinin arttığını belirlemiştir. Sonuçta 13

26 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Fatmagün SARIHAN balıklarda immün fonksiyonları arttırmak için levamisolün pratikte uygulanabileceğini tespit etmiştir. Siwicki ve ark. (1989), gökkuşağı alabalığı (O. mykiss) da oksolinik asit (0,1, 1, 10 mg/kg), oksitetrasiklin (10 mg/kg), levamisol (5 mg/kg) ve Yersinia ruckeri O- antijen (100 µg) uygulamasının spesifik ve spesifik olmayan immün yanıta etkilerini araştırmışlardır. Levamisol verilen grupta diğerlerine göre uyarılmış spesifik olmayan savunmanın fazla olduğunu, oksolinik asit verilen grupta, spesifik immün yanıtın yüksek olduğunu, oksitetrasiklin uygulanan grupta ise her iki immün yanıtın düşük olduğunu belirlemişlerdir. Kajita ve ark. (1990), gökkuşağı alabalığı (O. mykiss) na uyguladıkları levamisolün fagositik aktivite, kemiluminesens yanıt (chemiluminescence activity, CL) ve doğal öldürücü hücre aktivitesi (natural killer cell activity, NCA) ile Vibrio anguillarum a karşı oluşan serum bakterisidal aktivitesi ve alternatif yoldan kompleman aktivasyonu (alternative complement pathway, ACP) na olan etkisini araştırmışlardır. Levamisol uygulandıktan sonra balıklarda fagositik aktivite kemiluminesens cevap, doğal öldürücü hücre aktivitesi ve alternatif yoldan kompleman aktivasyonunda artış olduğunu, fakat serum bakterisidal aktivitesinde ise değişiklik olmadığını saptamışlardır. Siwicki ve ark. (1990), gökkuşağı alabalığının dalak kesitlerine in-vitro olarak uygulanan üç farklı levamisol dozunun (5 µg/ml, 25 µg/ml, 50 µg/ml ) kombine olarak iki farklı Y.ruckeri O-antijen dozu (10 µg/dalak ve 100 µg/dalak) ve 100 µg DNP-Ficoll (dinitrophenol-ficoll) verilmesi sonucunda, spesifik ve spesifik olmayan savunmayı arttıran en etkili levamisol dozunun 5 µg/ml olduğunu ve bu antijenlerin tek başlarına spesifik olmayan savunmayı uyardıklarını, 50 µg/ml ve 25 µg/ml levamisol seviyelerinin antijenle kombine uygulanmasının ise sinerjistik bir etki oluşturduğunu tespit etmişlerdir. Robertsen ve ark (1990), atlantik salmonunda ekmek mayası (Saccharomyces cerevasiae) nın hücre duvarından elde edilen M-Glukan ın intraperitonel enjeksiyonundan sonra Vibrio salmonicida, V. anguillarum ve Yersinia ruckeri etkenlerinden kaynaklanan üç farklı enfeksiyona karşı oluşan nispi koruma yüzdesini değerlendirmişlerdir. Kontrol grubuyla yaptıkları karşılaştırmada M-Glukan ın bu 14

27 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Fatmagün SARIHAN patojenlere karşı koruma sağladığı ve ölüm oranında düşüşe neden olduğunu belirlemişlerdir. Anderson ve ark. (1992), gökkuşağı alabalığına farklı dozlarda uygulanan Yersinia ruckeri O-antijeninin (0,1ml fosfat tamponlu tuzda süspanse edilen, 1, 10 ve 100 µg), bazı spesifik ve spesifik olmayan immün yanıta ait parametrelere olan etkisini araştırmışlardır. Spesifik immün yanıtın, pasif hemolitik plak testi (passive hemolytic plaque assay) ile plak oluşturan hücrelerin mevcudiyetinin gösterilmesiyle, spesifik olmayan immün yanıtı ise, NBT (nitroblue tetrazolium) redaksiyonu ve nötrofillerin cama yapışması (glass adherence) testleri kullanılarak daha hızlı ve kolay belirlenebileceğini ileri sürmüşlerdir. Anderson ve Jeney (1992), gökkuşağı alabalığına immünostimulant olarak levamisol, kuaternar amonyum bileşiği (quaternary ammonium compound, QAC), kısa zincirli bir polipeptid (ISK) lerin, Aeromonas salmonicida O antijeninin kombin olarak verilmesi sonucunda spesifik olmayan savunma mekanizmaları, spesifik immün yanıt ve A. salmonicida a karşı koruma seviyelerine etkisini araştırmışlardır. A. salmonicida O antijeni ile beraber veya tek olarak immünostimulantlar verildiğinde spesifik olmayan faktörlerin yükseldiği, antijenin immünostimulantsız olarak verilmesi durumunda ise spesifik yanıtın arttığını bildirmişlerdir. İmmünostimulantlar tek olarak verildiğinde A. salmonicida dan kaynaklanan ölümlerin 5-6 gün, antijenle kombine olarak verildiklerinde ise gün geciktiğini de saptamışlardır. Baba ve ark. (1993), sazanda immersiyon yoluyla verilen levamisolün, spesifik olmayan savunma mekanizmalarının aktivasyonu ve Aeromonas hydrophila ya karşı yaşama oranı üzerine etkisini araştırmışlardır. Sazanlarda bu yöntemle, ön böbrekte bulunan kemotaktik yetenek, fagositik aktivite ve aktif oksijen üretiminde rol oynayan fagositlerin aktive olduklarını ve A. hydrophila ya karşı korumanın da oluştuğunu bildirmişlerdir. Jeney ve Anderson (1993a), gökkuşağı alabalığı (O. mykiss) nın dalak kesitlerinde, farklı dozlarda (0,1, 1, 10, ve 100 µg/ml) uygulanan immunostimulant (levamisol, quaternary amonyum bileşiği, bir polipeptid olan ISK) ların lökositler 15

28 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Fatmagün SARIHAN üzerine etkisini araştırmışlardır. 1, 10, ve 100 µg/ml levamisol dozlarının diğer gruplara göre NBT aktivitesini arttırdığını belirlemişlerdir. Jeney ve Anderson (1993b), gökkuşağı alabalığına banyo yoluyla Aeromonas salmonicida O antijeni uygulamadan önce aynı yolla çeşitli immünostimulant (levamisol, kuaternar amonyum bileşiği, QAC ve kısa zincirli bir polipeptid, ISK) lar verilerek spesifik ve spesifik olmayan immün yanıta olan etkisini araştırmışlardır. Spesifik olmayan immün yanıtı belirleyen nötrofil oksidatif ve fagositik aktivitede, spesifik immün yanıtı belirleyen sirküle olan antikor titreleri ve plak oluşturan hücrelerde yükselme olduğunu belirlemişlerdir. Ayrıca virülent A. salmonicida a karşı koruma seviyesinde de artış olduğunu saptamışlardır. Jeney ve ark. (1993c), gökkuşağı alabalığına glukan ve glukan+yersinia ruckeri O-antijeni ve sadece Yersinia ruckeri O-antijenin i.p ve banyo yoluyla uygulamasından sonra spesifik olmayan savunma mekanizmalarında görülen etkiyi araştırmışlardır. Balıklarda nötrofil aktivitesi, oksidatif radikal üretiminde ve fagositosizde artış görülmesi nedeniyle glukanın hastalıkları önlemede önemli bir rol oynadığını ileri sürmüşlerdir. Stoskopf (1993), nematodlar ve yüzme kesesi kurtları için 2 mg/l (24 saat), trematodlar için ise 50 mg/l (2saat) uygulanan levamisolün etkili olduğunu özellikle larval nemotodlar üzerinde daha fazla olumlu etki yaptığını, yüksek dozların ilacın etkinliğini arttırmadığını bildirmişlerdir. Anderson ve Siwicki (1994), dere alabalığı (Salvelinus fontinalis) na intraperitonal ve immersiyon yöntemiyle immünostimulant olarak glukan ve kitosan vermişlerdir. Daha sonra A. salmonicida ya maruz bırakılan balıklarda bu bakteriye karşı kısa süreli koruma meydana geldiğini bulmuşlardır. İmmünostimulantların enjeksiyon yoluyla verildiği balıklarda meydana gelen korumanın immersiyonla verilmesiyle elde edilen korumadan daha yüksek olduğunu tespit etmişlerdir. Siwicki ve ark. (1994b), gökkuşağı alabalığına, Candida utulis, Saccharomyces cerevisiae ve ticari olarak kullanılan Macrogard, Chitosan, Evetsel ve FinnStim i oral yolla uyguladıktan sonra spesifik olmayan selüler immüniteyi incelemişlerdir. İmmünostimulant uygulanan balıklarda hematokrit ve lenfosit sayılarının değişmediğini, fakat oksidatif radikal, miyeloperoksidaz 16

29 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Fatmagün SARIHAN aktivitesi, fagositik indeks ve fagositik hücrelerin potansiyel öldürme aktivitelerinde artış olduğunu belirlemişlerdir. Ayrıca on üçüncü günün sonunda Aeromonas salmonicida enfeksiyonuna karşı, ölüm yüzdesinin kontrol grubunda % 100, immunostimulant verilen gruplarda, Evetsel ve FinnStim de % 80, Candida utulis de % 65, Macrogard, Chitosan ve S. cerevisiae da % 60 olduğunu saptamışlardır. Chen ve ark. (1998), Mycobacterium spp. (TB40, TB267 ve Mycobacterium marinum) nin ekstraselüler ürünlerini ve çeşitli adjuvant (Freund un tam adjuvant, FCA; Freund un tam olmayan adjuvant, FIA ve titremax) ları tilapia (O. niloticus) nın yüzme keselerine enjekte ederek spesifik olmayan immün yanıta olan etkisini araştırmışlardır. Uygulanan Mycobacterium spp. in ekstraselüler ürünlerin ve adjuvantların tilapiada, NBT (nitroblue tetrazolium) redaksiyonu ve lizozim aktivitesinde artış sağlaması nedeniyle spesifik olmayan immün yanıta karşı iyi bir sitümülatör (uyarıcı) olduğunu belirlemişlerdir. Mulero ve ark.(1998), çipura (Sparus aurata) da levamisolün farklı dozlarda (0, 125, 250 ve 500 mg/kg) yeme katılarak verilmesinden sonra 0, 5 ve 10. haftalarda alınan örneklerde, büyümede görülen artış, bazı immün yanıtla ilgili parametlerlerdeki değişiklik ve Vibrio anguillarum a karşı oluşan direnç artışını araştırmışlardır. Balıklarda, fagositler aracılığıyla fagositosiz ve solunum patlaması (Respiratory burst) nı, lenfositler aracılığıyla lenfokin üretimi ni içeren lökosit fonksiyonlarında olduğu kadar boyca ve ağırlıkça da artış olduğunu bildirmişlerdir. Ayrıca levamisol ile beslenen balıkların Vibrio anguillarum a karşı diğerlerine göre daha fazla direnç kazandıklarını ileri sürmüşlerdir. Siwicki ve ark. (1998), gökkuşağı alabalığına i.p olarak enjekte edilen dimerize olmuş lizozim (KLP-602) in spesifik olmayan selüler ve hümoral savunma mekanizmaları üzerine olan etkisini ve furunkulosise karşı koruma sağlayıp sağlamadığını araştırmışlardır. Sonuç olarak KLP-602 in selüler ve hümoral savunma mekanizmalarını uyardığını aynı zamanda da A. hydrophila ya karşı koruma sağladığını saptamışlardır. Findlay ve Munday (2000), denize adapte edilen Atlantik salmonu (Salmo salar) na tatlısu banyosu yoluyla uygulanan 2,5 mg/l dozdaki levamisolün, spesifik 17

30 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Fatmagün SARIHAN olmayan immün sistem üzerine immünomodülatör etkisini araştırmışlardır. Sonuç olarak mukus ve serumda; lizozim aktivitesinin, fagositik kapasitenin, süperoksit anyon üretiminin arttığını ve buna bağlı olarak da levamisol uygulamasının hastalıklara karşı profilaktif olarak kullanılabileceğini ileri sürmüşlerdir. Findlay ve ark. (2000), atlantik salmonuna tatlı su kullanılarak uygulanan üç farklı dozdaki levamisol banyosunun amoebik solungaç hastalığına karşı balıklarda direnci arttırdığını belirlemişlerdir. Kozińska ve Antychowicz (2000), sazan (C. carpio) da i.p ve banyo yoluyla verilen Aeromonas hydrophila aşısının, 12 0 C ve 23 0 C de bazı spesifik olmayan immün parametrelere olan etkisini araştırmışlardır. Sıcaklığa ve uygulama yöntemine bağlı olarak immün parametrelerde farklılıklar belirlemişlerdir. Morrison ve ark. (2001), atlantik salmonuna intraperitonal (i.p) ve banyo yoluyla levamisollü ve levamisolsüz olarak uygulanan Vibrio anguillarum aşısının, bazı organlarda histolojik olarak oluşabilecek potansiyel yan etkilerini incelemişlerdir. Balıklardaki deri, ön böbrek ve dalağın histolojik yapılarının etkilenmediğini, fakat solungaç dokuda patolojik değişiklikler olduğunu saptamışlardır. Cain ve ark. (2003), tilapia (O. niloticus) ya β-1,3 glukan eklenen Wardley Premium Spirulina Plus TM yem ile besleyerek immünomodulator etkiyi araştırmışlardır. Sonuç olarak, β-1,3 glukan eklenen spiriluna yemlerinin balıklarda potansiyel bir bağışıklık yükseltici ve stres azaltıcı etkiye sahip olduklarını ileri sürmüşlerdir. Kwak ve ark. (2003), Schizophyllum commune dan elde edilen β-glukan ın sazan ve pisi balığı (Paralichthys olivcaces) na oral olarak uygulanmasından sonra immünostimülatif etkisini araştırmışlardır. Sikizofillan eklenen (0,1g/100g yeme) diyetlerle beslenen balıklarda periferal makrofajlar ve nötrofillerin, lökositlerin fagositik aktivitelerinin ve serum lizozim aktivitesinin arttığını belirlemişlerdir. Ayrıca β-glukan uygulamasından sonra sazanlarda Aeromonas hydrophila, pisi balıklarında ise Edwardsiella tarda enfeksiyonları sonucu görülen ölüm yüzdesinin sırası ile % 60 ve % 70, kontrol grubunda ise bu oranın % 100 olduğunu belirlemişlerdir. Ayrıca sikizofillanın oral yolla uygulanmasının, bakterilerin 18

31 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Fatmagün SARIHAN konsantrasyonu ve balıkların büyüklüğüne bağlı olarak bakteriyel enfeksiyonlar sonucu görülen ölümlerde azalma sağlayacağını da belirtmişlerdir. Leaño ve ark. (2003), farklı ağırlıklara sahip iki gruptaki (12±0,4 g ve 25,5±1,2 g) kobia (Rachycentron canadum) fingerliklerinde, ilk gruba (12±0,4 g) 500 mg/kg, ikinci gruba ise 500 mg/kg ve 1000 mg/kg olacak şekilde yeme karıştırılarak verilen levamisolün spesifik olmayan immün yanıta ve Photobacterium damselae subsp. piscicida enfeksiyonuna karşı olan etkisini araştırmışlardır. Her iki grupta da levamisolün kan lökositlerinin potansiyel öldürme ve fagositik aktiviteleri ile bakterisidal aktiviteyi arttırdığını, lizozim aktivitesine ise bir etkisi olmadığını belirlemişlerdir. Ayrıca levamisolün Photobacterium damselae subsp. piscicida enfeksiyonuna karşı birinci grupta koruma sağlamadığını, ikinci grupta ise hem 500 mg/kg hem de 1000 mg/kg levamisol verilen balıklarda kontrol grubuna göre önemli derecede koruma sağladığını saptamışlardır. Abutbul ve ark. (2004), tilapia da S. iniae enfeksiyonu tedavisinde, oral olarak verilen biberiye (Rosmarinus officinalis) ve oksitetrasiklin etkisini araştırmışlardır. Her iki uygulama sonucunda da ölüm oranındaki düşüşün, kontrol grubu ile arasında önemli bir fark olduğunu bildirmişlerdir. Antibiyotik tedavisinin olumsuz etkilerinden dolayı (bakterilerde direnç gelişmesi, insan sağlığına zararlı oluşu) biberiyenin S.iniae enfeksiyonuna karşı alternatif bir tedavi olabileceğini ileri sürmüşlerdir. Kozińska ve Guz (2004), sazan (C. carpio) da i.p olarak verilen Aeromonas bestiarum aşısının, spesifik olmayan selüler ve sıvısal yanıt üzerine etkisini araştırmışlardır. İmmünizasyondan sonra, yedinci gün nötrofil ve monositlerin sayısının arttığını, NBT aktivitesinde (spektrofotometrik test) ise gruplar arasında fark olmadığını belirlemişlerdir. Li ve Gatlin (2003), hibrid çizgili levrek (Morone chrysops M. saxatilis) e, % 1,2 ve 4 oranında oral yolla verilen bira mayası (Saccharomyces cerevisiae) nın büyümeye, bazı immün parametrelere ve S. iniae ya enfeksiyonuna karşı olan etkisini incelemişlerdir. % 1 ve 2 oranında bira mayası verilen gruplarda ağırlık artışının kontrol grubuna göre yüksek olduğunu, S. iniae ya enfeksiyonuna karşı % 2 ve 4 oranında bira mayası verilen gruplarda ölüm görülmediğini, kontrol grubunda % 19

32 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Fatmagün SARIHAN 20, % 1 uygulanan grupta ise ölümlerin % 10 olduğunu fakat bu oranın istatistiksel olarak önemli olmadığını bildirmişlerdir. Ayrıca kontrol dahil tüm gruplarda, intraselüler süperoksit anyon üretimini ve serum lizozim seviyelerinde önemli bir fark olmadığını, % 2 bira mayası uygulanan grupta NBT aktivitesinin, % 4 uygulanan grupta ise ektraselüler süperoksit anyon üretiminin yüksek olduğunu bulmuşlardır. Li ve Gatlin (2004), hibrid çizgili levrek (M. chrysops M. saxatilis) e bir prebiyotik olan Grobiotic AE ve bira mayası (Saccharomyces cerevisiae) nın % 1 ve 2 yeme ilave edilmesi sonucu büyüme oranı, immün yanıta ve S.iniae ya enfeksiyonuna karşı olan etkisini karşılaştırmışlardır. Büyüme oranı, NBT aktivitesi ve intraselüler süperoksit anyon üretiminin incelenmesi sonucu, belirlenen değerlerde bu iki grup arasında fark olmadığını, fakat % 1 ve 2 bira mayası ve % 1 Grobiotic AE verilen grupta ekstraselüler süperoksit anyon üretiminin benzer, aynı zamanda bu gruplardan elde edilen değerlerin kontrol grubundan yüksek olduğunu belirlemişlerdir. Ayrıca Grobiotic AE ve bira mayası verilen gruplarda S.iniae ya enfeksiyonuna karşı yaşama oranının kontrol grubundan yüksek olduğunu tespit etmişlerdir. Li ve ark. (2004a), çizgili hibrid levrek (M. chrysops x M. saxatilis) e oral yolla verilen maya RNA sından elde edilen nükleotidlerin, spesifik ve spesifik olmayan immün yanıt ile S. iniae ya enfeksiyonuna karşı pozitif yönde etki yaptığını belirlemişlerdir. Li ve ark. (2004b), çizgili hibrid levrek (M. chrysops x M. saxatilis) e levamisolün oral yolla farklı seviyelerde (500 ve 1000 mg/ml) verilmesinin büyümeye ve yemden yararlanmaya, ayrıca in vitro olarak farklı dozlarda (1, 10, 100 ve 1000 µg/ml) uygulanmasının intraselüler süperoksit anyon üretimine olan etkisini araştırmışlardır. Levamisol uygulanan gruplarda, oral yolla 1000 mg /kg nın üç hafta sonra büyüme ve yemden yararlanmayı, in vitro uygulamada ise, 24 saat sonra 1000 µg/ml in, 72 saat sonra 100 ve 1000 µg/ml ın intraselüler süperoksit anyon üretimini baskıladığını saptamışlardır. Yoshimura ve Endoh (2005), veterinerlikte kullanılan çeşitli antiparazitik ilaçların tatlısu organizmalarına olan akut toksisitesini araştırmışlardır. Medaka 20

33 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Fatmagün SARIHAN balığı (Oryzias latipes) nda, levamisolün 24, 48, 72 ve 96 saat sonra LC 50 (% 50 letal konsantrasyon) nun, sırasıyla 45,3, 39,2, 38,3 ve 37,3 mg/l olduğunu bildirmişlerdir. 21

34 3. MATERYAL VE YÖNTEM Fatmagün SARIHAN 3. MATERYAL VE YÖNTEM Bu tez çalışması Ağustos 2003 ile Şubat 2004 tarihleri arasında, Çukurova Üniversitesi Su Ürünleri Fakültesi Yetiştiricilik Ünitesinde yürütülmüştür. Çalışma, üç bölümden oluşmuştur. İlk bölümde tilapiada deneysel olarak streptokokkosis enfeksiyonu oluşturularak balıkların % 50 sini öldüren doz (LD 50) tespit edilmiştir. Çalışmanın ikinci bölümünde, farklı dozlarda banyo yöntemi ile uygulanan levamisolün immunostimulant etkisi araştırılmıştır. Üçüncü bölümde ise levamisolün, streptokokkosis enfeksiyonuna karşı balıkların yaşama oranına etkisi incelenmiştir Materyal Tilapia (Oreochromis niloticus L. 1758) Tropik ve subtropik iklim kuşaklarında yetiştiriciliği yapılan Chiclidae familyasının üyesi olan Nil tilapiası (Oreochromis niloticus L. 1758), ülkemiz sularında bulunmamakla beraber, 22 yıl önce bölgemizde yetiştiricilik çalışmalarına başlanmıştır. Araştırmada, 1., 2. ve 3. denemelerde toplam 204 adet tilapia kullanılmıştır. Tilapia, Çukurova Üniversitesi Su Ürünleri Fakültesi Araştırma ve Üretim istasyonundan temin edilmiş ve yetiştiricilik ünitesine getirilerek bir ay süreyle uyumları sağlanmıştır. 22

35 3. MATERYAL VE YÖNTEM Fatmagün SARIHAN Şekil 3.1. Denemede kullanılan tilapia (Oreochromis niloticus L. 1758) Denemede kullanılan tanklar, deneme süreleri ve deneme düzeneği Araştırmada, tüm denemelerde 1,5x0,35x0,40 m ebatlarında, 210 L hacminde fiberglas tanklardan, birinci ve ikinci denemede; 12, üçüncü denemede ise 10 adet olarak kullanılmıştır. Denemelerde kullanılan tank ve balık sayıları ile deneme süreleri Çizelge 3.1. de verilmiştir. Çizelge 3.1. Denemelerde kullanılan tank, balık sayıları ve denemelerin süreleri 1.deneme 2.deneme 3.deneme Tank sayısı (adet) Her tankta bulunan balık sayısı (adet) Toplam balık sayısı (adet) Deneme süresi (gün) Araştırma süresince en az 24 saat dinlendirilmiş ve havalandırılmış şehir suyu kullanılmıştır. İkinci ve üçüncü denemelerde, hava sıcaklığının düşmesi nedeniyle su sıcaklığındaki azalmayı gidermek için, her tanka takılan iki ısıtıcı, istenilen su 23

36 3. MATERYAL VE YÖNTEM Fatmagün SARIHAN sıcaklığa ulaşmada yeterli olmuştur. Aynı zamanda su deposundan alınan suyun sıcaklığını ayarlamak için, depo içine yerleştirilen 2000W lık resistanslı ısıtıcı konularak, homojen su sıcaklığı sağlamak amacıyla havalandırma yapılmıştır. Denemede kullanılan suyun ph, çözünmüş oksijen ve sıcaklık değerleri her hafta alınmıştır. Su değişimi, tank hacminin % 70 i oranında günde bir kez sifonla, organik maddelerin uzaklaştırılması için yapılmıştır. Havalandırma kuru hava motoru ile bir merkezden tanklara dağıtılmıştır. Balıklara uygulanan karanlık aydınlık periyodu 12 saat aydınlık 12 saat karanlık olacak şekilde düzenlenmiştir. Balıkların stres vb. etkiler nedeniyle dışarı atlamalarını önlemek amacıyla tankların üstü 1 cm göz açıklığındaki ağla kapatılmıştır. Denemede kullanılan tankların genel görünümü Şekil 3.2 de verilmiştir. Şekil 3.2. Denemenin yürütüldüğü tankların genel görünümü Birinci ve üçüncü denemelerde kullanılan bakteri Denemelerde kullanılan Streptococcus iniae suşu (Dan-1), İsrail de bulunan Hebrew Üniversitesi, Klinik Mikrobiyoloji Bölümü nden Dr.Avi Eldar tarafından sağlanmıştır. Bu suşun çoğaltılması amacıyla, Todd Hewitt Broth ve arkasından Brain Heart Infusion Agar (BHIA) a ekimleri yapılıp 30 C de 24 saat inkübasyona bırakılmıştır. Kültürün korunması amacıyla bu işlemler ayda bir kez tekrarlanmıştır. 24

37 3. MATERYAL VE YÖNTEM Fatmagün SARIHAN İkinci denemede kullanılan immünostimulant İkinci denemede kullanılan, kimyasal ismi 2,3,5,6-Tetrahydro-6- phenylimidazo (2,1-b) thiazole hydrochloride olan levamisol, Sigma (L-9756) dan temin edilmiştir. Kimyasal formülü, C 11 H 12 N 2 S HCl olan bir bileşiktir (Şekil 3.3.) (Anonymous, 2004). Şekil 3.3. Levamisolün kimyasal yapısı 3.2. Yöntem Birinci deneme Balıklarda deneysel enfeksiyonun oluşturulması ve Letal Doz 50 nin hesaplanması Buzdolabında + 4 o C de muhafaza edilen S. iniae stok kültüründen alınan bakteri izolatları Brain Heart Infusion agara ve hazır olarak temin edilmiş olan % 5 koyun kanlı besiyerine aseptik koşullarda ekilerek 30 o C de 24 saat inkübasyonu ile gençleştirilmiştir. Gençleştirilmiş S. iniae suşu, 10 ml Todd-Hewitt Broth içeren tüpe ekilerek 24 saat sonra üreyen bakterilerden alt kültür elde edilmiştir. İnkübasyondan sonra, yüzeye yayma yöntemi ile bir mililitredeki canlı bakteri sayısı tespit edilmiştir (Atlas ve ark., 1995; Temiz, 1994). Ayrıca bakteri yoğunluğu 540 nm (A 540 ) dalga boyundaki absorbansı 1OD olarak bulunmuştur. Bir mililitredeki canlı bakteri sayısı 1x10 9 cfu/ml olarak belirlenmiştir. 6 balık, 2 tekrarlı olacak şekilde bir grup için 12 balığa, 1x10 1, 1x10 2, 1x10 3, 1x10 4 ve 1x10 5 cfu/ml olacak şekilde 200 µl bakteri ve kontrol grubunu da aynı miktarda Todd-Hewitt Broth karın bölgesi alkol ile silinerek 25

38 3. MATERYAL VE YÖNTEM Fatmagün SARIHAN 1ml lik enjektör ile intraperitonal olarak, toplam 72 balığa enjekte edilmiştir (Şekil 3.4.). Balıklar vücut ağırlıklarının % 1 i oranında, günde bir kez pelet yem ile beslenmişlerdir. Bakteri enjeksiyonundan 24 saat önce yemleme kesilmiştir. Enjeksiyonu takiben 28 gün boyunca balıklar takip edilmiştir. Ölen balıklar hemen incelemeye alınmıştır. Şekil 3.4. Bakterinin intraperitonal olarak balıklara enjekte edilmesi Balıklara bakteri uygulamasının ardından, 48 saat sonra % 50 sini öldüren doz (LD50) hesaplanmıştır. (Reed and Muench, 1938) Enfekte balıkların klinik ve otopsi muayenesi Enfekte edilen balıklardaki değişiklikler gözlenerek yeni ölen balıkların otopsileri yapılmıştır. İç organlardan (beyin, ön böbrek, karaciğer, dalak, solungaçlar ve yüzme kesesi) alınan örneklerden ayrı ayrı aseptik koşullarda ekim yapılmıştır Enfekte balıklardan bakterilerin re-izolasyonu ve bakterilerin polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) yöntemi ile identifikasyonu PCR yöntemi ile bakterilerin identifikasyonu Çukurova Üniversitesi Tropikal Hastalıklar Araştırma ve Uygulama Merkezi laboratuarında yapılmıştır. PCR için 26

39 3. MATERYAL VE YÖNTEM Fatmagün SARIHAN kullanılan yöntem, Zlotkin ve ark. (1998) nın çalışmalarından modifiye edilerek uygulanmıştır. Enfekte edilen balıklardan yapılan ekimler sonucu elde edilen her örnekten birkaç bakteri kolonisi alınarak 0,5 ml distile su içerisinde süspanse edilmiştir. Bu süspansiyondan 100 µl alınarak üzerine 300 µl lizis tamponu (13,3 mmol/l Tris-HCl [ph 8,0], 6,7 mmol/l ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), % 0,67 sodium dodecyl sulfate, 133 µg/ml proteinase-k) ilave edilerek 56 C de en az 4 saat inkübe edilmiştir. Bu karışım üzerine 800 µl fenol/kloroform ilave edilerek alt üst edilip ve 4 C de 20 dk inkübe edilmiştir. Karışım xg de 15 dk santrifüj edilerek süpernatant yeni bir tüpe aktarılmıştır. Bu işlem iki defa tekrarlanmıştır. Son santrifügasyondan sonra süpernatant üzerine hacmin iki katı kadar kloroform ilave edilerek aynı işlem tekrarlanmıştır. Süpernatant yeni bir tüpe aktarıldıktan sonra üzerine 1 ml soğuk etanol ilave edilerek 20 C de bir gece bekletilip ve xg de 15 dakika santrifüj edilerek DNA presipite edilmiştir. Etanol tamamen döküldükten sonra havada 3 dk kurutulan DNA, 20 µl Dnase-free steril distile suda çözülerek PCR da örnek olarak kullanılmıştır. Ekstrakte edilen DNA nın 5 µl si 1,25 ünite tag polimeraz (Promega, USA), 200 µmol/l dntp, her primerden 100 pmol (Sin-1:5 -CTAGAGTA CACATGTACTAGCTAAG-3 ve Sin-2:5 -GGATTTTCCACTCCCATTA-3 ), ve reaksiyon karışımından oluşan 50 µl lik PCR karışımında amplifiye edilmiştir. Reaksiyonda bu primerler kullanılmıştır. Amplifikasyonda 95 C de iki dakika ön ısıtma, 30 döngü; 94 C de bir dakika denatürasyon, 55 C de bir dakika birleşme (annealing), 72 C de bir dakika uzatma (elongasyon) aşamaları uygulanmıştır. PCR amplifikasyonundan sonra ürünler, etidyum bromid ile boyalı % 2 lik agaroz jel de elektroforeze tabi tutularak analiz edilerek, sonuçlar ultraviyole transilluminatörde değerlendirilmiştir. 27

40 3. MATERYAL VE YÖNTEM Fatmagün SARIHAN İkinci deneme Levamisolün balıklara uygulanması İkinci denemede üç farklı levamisol dozu [steril fosfat tamponlu tuz (PBS) da eritilen 5, 7,5 ve 12,5 µg/ml] balıklara banyo yolu ile verilmiştir. Balıklar vücut ağırlıklarının % 1 i oranında pelet yem ile günde bir kez beslenmişlerdir. Levamisol uygulamasından 24 saat önce yemleme yapılmamıştır. Bu dozlar, balıklara 24 saat süre uygulanmıştır. Araştırmada her grup için 24 balık 3 paralelli olacak şekilde, kontrol grubu da dahil olmak üzere toplam 96 balık kullanılmıştır Balıklardan kan örneklerinin alınması Levamisol uygulamasından sonra 7., 14., 21., ve 28. günler sonunda anestezik madde olarak 0,4 ml/l fenoksietanol (2-Phenoxyethanol) uygulanarak balıklardan kan örnekleri alınmıştır. Balıklar bayıltıldıktan sonra sağ tarafları üzerine yatırılmıştır. Heparinli enjektör ile lateral çizginin altından omurga hissedilinceye kadar girilmiş ve negatif basınç hissedildiğinde kaudal venadan kan örnekleri alınmıştır. Periferik yayma dışında diğer analizleri yapmak üzere alınan kan örneği EDTA lı tüplere veya heparinli mikrohematokrit pipetlere çekilmiştir. Periferik yayma için kan örneği doğrudan lama alınmıştır. 7., 14., 21 ve 28. günlerde farklı balıklardan kan örnekleri alınmıştır. Daha önce kan alınan balıklarla alınmayan balıkları karıştırmamak amacıyla balıklarda markalama yapılmıştır. Markalama, her alınan örnekte kuyruk yüzgecinin farklı bir bölümünün bir miktar kesilmesi ile yapılmıştır. Elde edilen kan örnekleri hematokrit, lökokrit seviyeleri, lökosit düzeyi, NBT (Nitroblue tetrazolium) pozitif hücre aktivasyonu, NBT aktivitesi (spektrofotometrik test), fagositik aktivite, miyeloperoksidaz aktivitesi (MPO) ve periferik yayma analizleri için kullanılmıştır. 28

41 3. MATERYAL VE YÖNTEM Fatmagün SARIHAN Balık kanında hematokrit ve lökokrit seviyelerinin tespit edilmesi Hematokrit ve lökokrit tayini için mikrohematokrit metod kullanılmıştır. Bu metoda göre; mikrohematokrit pipetlere kan örnekleri alındıktan sonra pipetin ucu macunlanıp, mikrohematokrit santrifüjüne yerleştirilmiştir xg de 5 dk santrifüj edilerek hematokrit ve lökokrit yüzdesi özel skala (tüp okuyucu) da okunmuştur. Her balık örneği için iki adet pipet hazırlanmıştır (Tanyer, 1985) Balık kanında lökosit düzeyinin belirlenmesi Lökosit hücre düzeyinin belirlenmesinde, EDTA lı tüp içindeki kandan eritrosit pipetinin 1 çizgisine kadar çekilmiş üzerine PBS (ph=7,2) den 101 çizgisine kadar çekilmiştir. Pipet çalkalandıktan sonra thoma lamında incelenmiştir. Thoma lamında 16 büyük kare üzerine düşen (toplam 256 küçük kare) lökositlerin tamamı sayılmıştır. Daha sonra 1mm 3 kandaki lökosit miktarı saptanmıştır (Siwicki ve Anderson, 1993) Nitroblue Tetrazolium (NBT) aktivitesi- Spektrofotometrik Test EDTA lı tüpten alınan 100 µl kan örneği mikrotitir plaklara konularak üzerine 100 µl NBT solusyonu (% 0,2) ilave edilmiştir. Her balıktan 3 kan örneği alınmıştır. Oda sıcaklığında 30 dk inkübe edildikten sonra örnekten alınan 50 µl, 1 ml N, N- dimetil formamid bulunan tüpe ilave edilmiştir xg de 5 dk santrifüj edildikten sonra üstteki tabaka alınarak 1 ml lik spektrofotometre küvetinde 540 nm de okunmuştur. NBT aktivitesi, aşağıdaki formülle hesaplanmıştır (Siwicki, ve Anderson, 1993). Absorbans x 4 = mg NBT/1ml kan NBT pozitif hücre aktivasyonu EDTA lı tüpden alınan 50 µl kan lamel üzerine yayılarak, önceden hazırlanan nemli bir kağıt havlu yerleştirilen petri kutusunun içerisinde 30 dk bekletilmiştir. Daha sonra bir pastör pipeti yardımıyla lamel üzerindeki kan hücrelerinin yıkanması için PBS (ph=7,4) kullanılmıştır. Lamelin kenarı kağıt bir havluya değdirilerek suyun fazlası alınmıştır. 50 µl NBT damlatılan lamın üzerine lamel kapatılarak 30 dk 29

42 3. MATERYAL VE YÖNTEM Fatmagün SARIHAN inkübasyonu sağlanmıştır. Her balık için iki örnek hazırlanmıştır. x40 büyütmeli ışık mikroskobunda maviye boyanan en yoğun üç bölge olmak üzere toplam altı bölgede sayılan hücrelerin ortalaması alınmıştır (Anderson, 1992a) Fagositik aktivite EDTA lı tüpten alınan 100 µl kan örneği mikrotitir plaklara konularak, üzerine 100 µl PBS de bulunan Streptococcus iniae (1x10 9 cfu/ml) hücre süspansiyonu eklenmiştir. Bir pipet yardımıyla karıştırıldıktan sonra oda sıcaklığında 20 dk inkübasyona bırakılmıştır. Daha sonra mikrotitir plaklardan alınan 5 µl örnek lam üzerine yayılmıştır. Oda sıcaklığında kurutulan örnekler 5 dk etil alkolde (% 95) fikse edilerek, giemsa (% 7) ile 10 dk boyanmıştır. 100 hücre sayılarak aktif olan ve olmayan hücrelerin yüzdesi belirlenmiştir (Siwicki ve Anderson, 1993) Miyeloperoksidaz aktivitesi Miyeloperoksidaz aktivitesinin belirlenmesinde Sigma Kit 390-A kullanılmıştır. İlk olarak, EDTA lı tüpten alınan 5 µl kan örneği lam üzerine damlatılarak yayılmıştır. Oda sıcaklığında 5 dk kurutulmaya bırakılmıştır. Lam fiksatif solüsyonunda (etanol/formaldehit) 30 saniye bekletilerek tespit edilmiştir. Musluk suyunda 2 dk yıkandıktan sonra kurutulmuştur. 1:10 Trizmal 6.3 tampon 50 ml olacak şekilde sulandırılarak 37 o C deki su banyosunda önceden ısıtılmış ve işleme başlanacağı zaman, içerisine bir şişe peroksidaz indikatör ayıracı ve % 3 hidrojen peroksitten 200 µl ilave edilerek karışması sağlanmıştır. Lamlar karanlıkta 37 o C de su banyosundaki solüsyonunda bekletilmiştir. İnkübasyonu takiben dk musluk suyunda yıkanan preparatlar kurumaya bırakılmıştır. 100 hücre sayılarak kuvvetli boyanan, az boyanan ve boyanmayan hücrelerin yüzdesi belirlenmiştir (Anderson, 1992a) Periferik yaymanın yapılması Lamın üzerine alınan bir damla kan ikinci bir lam aracılığıyla yayılmıştır. Daha sonra lamlar oda sıcaklığında kurutulmaya bırakılmıştır. Kuruyan lamlar, önce May-Grünwald boyası ile 5 dk boyandıktan sonra distile su ile yıkanıp, arkasından 30

43 3. MATERYAL VE YÖNTEM Fatmagün SARIHAN Giemsa boyası 20 dk süre uygulanmış ve distile su ile yıkanmıştır. Preparatlar kuruduktan sonra x100 büyütmeli ışık mikroskobunda immersiyon yağı kullanılarak incelenmiştir. Her balıktan iki preparat hazırlanmıştır. 100 lökosit hücresi sayılarak, lökosit hücrelerinin (lenfosit, nötrofil, monosit ve eozinofil) yüzde oranları belirlenmiştir (Şahan ve Cengizler, 2002) Üçüncü deneme Levamisol ve S. iniae nın balıklara uygulanması Üçüncü denemede üç farklı levamisol dozu (5, 7,5 ve 12,5 µg/ml) balıklara banyo yolu ile verilmiştir. Bu dozlar balıklara 24 saat süre ile uygulanmıştır. Balıklar günde bir kez, vücut ağırlıklarının % 1 i oranında pelet yem ile beslenmişlerdir. Levamisol uygulamasından 24 saat önce yemleme yapılmamıştır. Ayrıca pozitif (bakteri uygulanan) ve negatif (Todd-Hewitt Broth enjekte edilen) olmak üzere iki kontrol grubu oluşturulmuştur. Bu denemede her doz için 6 adet balık 2 paralelli olmak üzere toplam 60 balık kullanılmıştır. Levamisol uygulamasından sonra, daha önceden belirlenmiş olan LD50 değeri dikkate alınarak, denemenin 14. gününde S.iniae (1x10 4 cfu/ml) her balığa 200 µl olacak şekilde intraperitonal olarak enjekte edilmiştir. 28 gün boyunca, levamisolün, streptokokkosis enfeksiyonunu önleme ve yaşama oranına etkisi incelenerek nispi yaşama yüzdesi (relative percent survival, RPS) aşağıdaki formüle göre hesaplanmıştır (Logambal ve ark. 2000). RPS = [1- (immunostimulant uygulanan grupta görülen ölüm yüzdesi/ kontrol balıklarında ölüm yüzdesi] x 100 Yeni ölen balıklar otopsi yapılarak mikrobiyolojik incelemeye alınmıştır. Daha sonra ekim sonucu elde edilen koloniler alınarak PCR yöntemi ile bakterilerin identifikasyonu yapılmıştır İstatistik analizler Araştırma verilerinin değerlendirilmesinde, SPSS 10.0 paket programı kullanılarak, tek yönlü varyans analizi ve levamisol dozlarına ve zamana bağlı olarak, ortalamaların karşılaştırılmasında ise Duncan, çoklu karşılaştırma testi ile 0,05 önem düzeyinde değerlendirilmiştir (Anonymous, 1993). 31

44 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Fatmagün SARIHAN 4. BULGULAR VE TARTIŞMA 4.1. Bulgular Çalışmada kullanılan balıkların, deneme başlangıcında ortalama toplam boy ve canlı ağırlıkları çizelge 4.1. de verilmiştir. Çizelge 4.1. Deneme balıklarının toplam boy ve canlı ağırlıkları Balık 1.Deneme 2.Deneme 3.Deneme Canlı ağırlık (g) 89,69±0,48 92,88±0, ±0,27 Toplam boy (cm) 18,13±0,05 17,56±0,042 16,91±0,039 Çalışmada kullanılan suyun ph, çözünmüş oksijen ve sıcaklık değerleri Çizelge 4.2. de verilmiştir. Çizelge 4.2. Denemede kullanılan suyun ph, çözünmüş oksijen ve sıcaklık değerleri Parametre Deneme 1* Deneme 2** Deneme3*** ph 7,63±0,16 7,50±0,12 7,55±0,22 Çözünmüş oksijen (mg/l) 5,34±9,54E-02 5,50±0,10 5,45±0,18 Sıcaklık ( o C) 26,14±0,11 25,57±0,19 25,83±0,39 *:LD50 Hesaplanması **:Levamisol dozunun belirlenmesi ***:Levamisol+ bakteri uygulaması Tilapia larda deneysel olarak streptokokkosis enfeksiyonu oluşturulması, balıklara üç farklı dozda levamisol uygulanması ve levamisolün streptokokkosis enfeksiyonuna karşı balıkların yaşama oranına etkisi ile ilgili elde edilen bulgular aşağıda verildiği gibidir Enfekte balıklarda klinik ve otopsi muayenesi ve LD 50 nin hesaplanması ile ilgili bulgular Streptococcus iniae balıklara enjekte edildikten sonra, 24 saat içerisinde bazı balıkların renginde koyulaşma, durgunluk, hareketlerinde yavaşlama, tankın köşelerinde hareketsiz durma ve ölmeden hemen önce ise ani hareketler yaparak yüzme bozukluğu gösterdikleri, daha sonraki günlerde de ölmek üzere olan balıklarda aynı belirtilerin oluştuğu gözlenmiştir. 24 saat sonra bu belirtileri gösteren 32

45 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Fatmagün SARIHAN balıkların bir kısmında görülen ölümler, bakteri miktarına göre değerlendirildiğinde; 1x10 5 cfu/ml bakteri verilen grupta iki birey, 1x10 4 cfu/ml, 1x10 3 cfu/ml ve 1x10 2 cfu/ml bakteri verilen grupta ise bir bireyin öldüğü görülmüştür. Bakteri verildikten sonra 1. günden itibaren, 7. güne kadar balıklarda artan oranda ölümlerin görüldüğü, fakat 7. günden sonra bakteri verilen grupların tümünde ölüm olmadığı belirlenmiştir. 28 gün boyunca, kontrol grubundaki balıklarda ise ölüme rastlanmamıştır. Deneme süresince uygulanan bakteri miktarına göre balıklarda görülen ölümler Çizelge 4.3. de, Reed ve Muench yöntemi ile 48 saat sonra balıkların % 50 sini öldüren doz (LD50) ise Çizelge 4.4. de verilmiştir. Çizelge 4.3. Deneme süresince balıklarda görülen ölümler Gün 1.gün 2.gün 3.gün 4.gün 7.gün 14.gün 21.gün 28.gün ölü ölüm Doz sayısı (%) Kontrol 0 * /12 0/12 0/12 0/12 0/12 0/12 0/12 0/12 0/12 0 1x10 1 0/12 2/12 2/12 4/12 6/12 6/12 6/12 6/12 6/ x10 2 1/12 3/12 4/12 5/12 7/12 7/12 7/12 7/12 7/ x10 3 1/12 3/12 5/12 7/12 10/12 10/12 10/12 10/12 10/ x10 4 1/12 5/12 7/12 8/12 11/12 11/12 11/12 11/12 11/ x10 5 2/12 8/12 9/12 10/12 11/12 11/12 11/12 11/12 11/12 92 toplam 6/72 22/72 27/72 34/72 45/72 45/72 45/72 45/72 45/72 63 * Ölen balıkların sayısı Çizelge 4.4. Reed ve Muench yöntemi ile 48 saat sonra balıkların % 50 sini öldüren doz (LD50) Kümülatif değerler Balıkların sayısı Balıkların sayısı Dilüsyon cfu/ml log 10 ölü canlı ölü canlı ölüm (%) (kontrol) THB * x x x x x THB * = Todd-Hewitt Broth 33

46 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Fatmagün SARIHAN Reed ve Muench yöntemi ile 48 saat sonra balıkların % 50 sini öldüren doz aşağıda açıklandığı gibi 6,9 x10 3 cfu/ml veya ~ 7 x10 3 cfu/ml olarak belirlenmiştir. Orantılı mesafe = % 50 - % 50 nin altındaki dilusyondaki ölüm/ %50 nin üstündeki dilusyondaki ölüm - % 50 nin altındaki dilusyondaki ölüm Orantılı mesafe = / = 0,84 log 1x ,84 (Orantılı mesafe) = 3,84 antilog 3,84 = 6918 cfu/ml = ~ 7 x10 3 cfu/ml Enfekte olan balıklarda renk koyulaşması, tek veya iki gözde eksoftalmus, yüzgeçlerde ve vücut yüzeyinde hiperemik alanlar, gözlerde korneal opasite, abdominal şişkinlik, hareketlerde yavaşlama, durgunluk, tankın köşelerinde hareketsiz durma, dönerek hareket etme, yüzme bozukluğu, ani sıçrama hareketleri gibi klinik bulgular tespit edilmiştir (Şekil 4.1., 4.2., 4.3.). Şekil 4.1. Deneysel enfeksiyon sonucu tilapianın vücut yüzeyinde görülen hiperemik alanlar (orijinal) 34

47 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Fatmagün SARIHAN Şekil 4.2. Deneysel enfeksiyon sonucu tilapianın gözünde görülen korneal opasite (orijinal) Şekil 4.3. Deneysel enfeksiyon sonucu tilapiada görülen bilateral eksoftalmus (orijinal) 35

48 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Fatmagün SARIHAN Deneysel olarak enfekte edilen tilapia da yapılan otopside, vücut boşluğunda kanlı sıvı birikimi, iç organlarda özellikle beyinde hemoraji, karaciğer ve dalakta büyüme, hava kesesinde kanlanma, bağırsaklarda sarı seröz sıvı birikimi gibi internal bulgulara rastlanmıştır (Şekil 4.4., Şekil 4.5.). Şekil 4.4. Deneysel enfeksiyon sonucu tilapiada görülen bağırsaklarda sarı seröz sıvı birikimi (orijinal) Şekil 4.5. Deneysel enfeksiyon sonucu tilapianın hava kesesinde görülen kanlanma (orijinal) 36

49 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Fatmagün SARIHAN Enfekte balıklardan bakterilerin re-izolasyonu ve bakterilerin polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) yöntemi ile identifikasyonu Yeni ölmüş balıkların iç organlarından (beyin, ön böbrek, karaciğer, dalak, solungaçlar ve yüzme kesesi) BHIA a ekim yapılarak, 30 0 C de 24 saat inkübasyondan sonra düz, hafif kabarık, krem renginde yuvarlak 1-2 mm çapında küçük koloniler oluştuğu gözlenmiştir (Şekil 4.6.). Aynı şekilde % 5 koyun kanlı besiyerine yapılan ekimler sonucunda oluşan kolonilerin, beta hemolitik özellikte oldukları belirlenmiştir (Şekil 4.7.). Ayrıca katalaz testinin negatif olduğu tespit edilmiştir. Şekil 4.6. BHIA üzerinde Streptococcus iniae kolonilerinin görünümü (orijinal) 37

50 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Fatmagün SARIHAN Şekil 4.7. % 5 koyun kanlı agarı üzerinde β-hemolitik Streptococcus iniae kolonilerinin görünümü (orijinal) BHIA a yapılan ekim sonucu oluşan kolonilerden alınan örnekler, Gram boyama ile boyandığında gram pozitif, zincir oluşturan koklar tespit edilmiştir (Şekil 4.8.). Şekil 4.8. Gram pozitif Streptococcus iniae bakterisinin görünümü, x1000 (orijinal) 38

51 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Fatmagün SARIHAN Birinci ve üçüncü denemede, enfekte olan balıklardan re-izole edilen bakteri DNA larının, PCR ile amplifikasyonundan sonra % 2 lik agaroz jel de elektroforez uygulanması sonucunda S. iniae a özgü spesifik bantlar elde edilmiştir (Şekil 4.9.). 300pb Şekil 4.9. S. iniae DNA larının PCR ile amplifikasyonundan sonra % 2 lik agaroz jel de elektroforeze tabi tutularak elde edilen spesifik bantlarının görünümü M= Marker (300pb) 1= Dan-1 suşu, 2-3= 1.denemede enfekte edilen balıklardan re-izole edilen bakteri 4-5= 3. denemede enfekte edilen balıklardan re-izole edilen bakteri N= Negatif kontrol (orijinal) Balıklara farklı dozlarda levamisol uygulamasından sonra 7., 14., 21. ve 28. günlerde ölçülen hematokrit, lökokrit, lökosit, NBT (spektrofotometrik ve pozitif hücre aktivasyonu), miyeloperoksidaz, fagositik aktivite ve periferik yayma değerleri, ortalamalarının aralarındaki gün ve doza göre oluşan farklılıklar istatistiksel olarak değerlendirilmiş olup, sonuçlar aşağıda verilmiştir Hematokrit değerleri Balıklara farklı dozlarda levamisol uygulamasından sonra, dozlara ve günlere ait olarak belirlenen hematokrit ortalamaları, standart hatalar ile Duncan çoklu karşılaştırmalı test sonuçları Çizelge 4.5. de görüldüğü gibidir. Çizelge 4.5. deki Duncan test sonuçlarına göre, levamisol dozlarına bağlı olarak 7., 14 ve 21. günlerde belirlenen hematokrit ortalamalarının kontrol grubu ile arasında önemli bir farklılık olmadığı belirlenmiştir (p>0.05). 28. gün ise, 5 µg/ml ve 39

52 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Fatmagün SARIHAN 7,5 µg/ml levamisol uygulanan gruplardan elde edilen hematokrit değerlerinin, kontrol ve 12,5µg/ml uygulanan gruplardan önemli derecede düşük olduğu tespit edilmiştir (p<0.05). Günlere bağlı olarak, 1 ve 2. dozlarda ve kontrol grubunda hematokrit ortalamaları arasında önemli bir fark görülmemiştir (p>0.05). Fakat 3. dozda en yüksek hematokrit değeri 14. günde gözlenmiş olup, bu değerin 7. gün ve 28. gün ile benzer 21. günde elde edilen değerden önemli derecede farklı olduğu tespit edilmiştir (p<0.05). Çizelge 4.5. Üç farklı dozda levamisol uygulamasından sonra 7., 14., 21. ve 28. günlerde ölçülen hematokrit ortalamaları (%) Duncan test sonuçlarına göre; sütunlarda gösterilen küçük harfler dozlar ve satırlarda gösterilen büyük harfler günler arasındaki farklılığı ifade etmektedir Lökokrit değerleri Levamisol uygulamasından sonra 7., 14., 21 ve 28. günlerde ölçülen lökokrit ortalamaları ve standart hatalara ait günlere ve dozlara bağlı oluşan farklılıkların Duncan çoklu karşılaştırmalı test sonuçları Çizelge 4.6. de verilmiştir. Çizelge 4.6. daki Duncan test sonuçlarına göre, dozlara bağlı olarak, 7., 14., 21 ve 28. günlerde belirlenen lökokrit ortalamalarının (%), kontrol grubuna göre önemli derecede farklı olmadığı belirlenmiştir (p>0.05). Ayrıca kontrol grubu dahil levamisol uygulanan gruplardan elde edilen lökokrit ortalamalarının (%), günlere bağlı olarak önemli bir farklılık göstermediği tespit edilmiştir (p>0.05). Diğer taraftan, levamisol uygulanan balıklarda lökokrit değerlerinin % 0,78-1,05, kontrol grubunda ise % 0,72-1,02 arasında olduğu belirlenmiştir. 40

53 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Fatmagün SARIHAN Çizelge 4.6. Üç farklı dozda levamisol uygulamasından sonra 7., 14., 21 ve 28. günlerde ölçülen lökokrit ortalamaları (%) Duncan test sonuçlarına göre; sütunlarda gösterilen küçük harfler dozlar ve satırlarda gösterilen büyük harfler günler arasındaki farklılığı ifade etmektedir Lökosit değerleri 5µg/ml, 7.5µg/ml ve 12.5µg/ml levamisol uygulamasından sonra 7., 14., 21. ve 28. günlerde ölçülen lökosit ortalamaları ve standart hatalarda, günlere ve dozlara bağlı oluşan farklılıkların Duncan çoklu karşılaştırmalı test sonuçları Çizelge 4.7. de verildiği gibi bulunmuştur. Levamisol uygulanan balıklarda lökosit ortalamaları 31,00-53,00 x10 3 /mm 3 arasında, kontrol grubunda ise 28,33-34,67 x10 3 /mm 3 arasında değişmiştir. En yüksek lökosit ortalamasının denemenin 28. günü 2. dozda (53,00 x10 3 /mm 3 ), en düşük ortalamanın ise 7. günü 2. dozda (31,00 x10 3 /mm 3 ) olduğu anlaşılmıştır. Lökosit ortalamaları, uygulamanın 7. gününde 1 ve 2. dozlarda artış göstermiştir. Bu iki gruptaki artış benzer olup (p>0.05), 5 µg/ml levamisol verilen grubun, kontrol grubundan önemli derecede farklı olduğu belirlenmiştir (p<0.05). 14. gün 5 µg/ml levamisol verilen gruptan elde edilen lökosit değerinin, 7,5 µg/ml ve 12,5 µg/ml uygulanan gruplarla benzer (p>0.05), kontrol grubundan önemli derecede farklı olduğu belirlenmiştir (p<0.05). 28. günde levamisol uygulanan tüm gruplardan elde edilen lökosit ortalamalarının, kontrol grubundan yüksek olmasına rağmen, 21 ve 28. günlerde belirlenen değerlerin, kontrol grubuyla aralarında istatistiksel olarak önemli bir farklılık olmadığı tespit edilmiştir (p>0.05). Kontrol grubu ile 5µg/ml levamisol verilen grupta, günlere bağlı olarak lökosit değerleri arasındaki farkın önemli olmadığı belirlenmiştir (p>0.05). 7,5µg/ml verilen gruptaki lökosit değerinin en yüksek 28. gün belirlendiği, bu değerin 14. gündeki değerle benzer (p>0.05), 7 ve 21. günlerde belirlenen değerlerden ise 41

54 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Fatmagün SARIHAN önemli derecede yüksek olduğu tespit edilmiştir (p<0.05). 12,5µg/ml levamisol uygulanan grupta, en yüksek olan lökosit ortalamasının 28. günde belirlendiği ve bu değerin diğer günlerden önemli derecede farklı olduğu saptanmıştır (p<0.05). Çizelge 4.7. Üç farklı dozda levamisol uygulamasından sonra 7., 14., 21 ve 28. günlerde ölçülen lökosit ortalamaları (x10 3 /mm 3 ) Duncan test sonuçlarına göre; sütunlarda gösterilen küçük harfler dozlar ve satırlarda gösterilen büyük harfler günler arasındaki farklılığı ifade etmektedir NBT aktivitesi- Spektrofotometrik Test Balıklara farklı dozlarda levamisol uygulamasından sonra 7., 14., 21. ve 28. günlerde ölçülen NBT aktivitesi değerleri ile günlere ve dozlara bağlı oluşan farklılıkların Duncan çoklu karşılaştırmalı test sonuçları Çizelge 4.8. de verilmiştir. Levamisol uygulanan balıklarda NBT aktivitesi 1,43-2,40 mg/ml arasında, kontrol grubunda ise bu değer, 0,71-1,89 mg/ml arasında değişmiştir. En yüksek NBT aktivitesi, denemenin 21. günü 3. dozda (2,40 mg/ml), en düşük ortalamanın ise 7. günde kontrol grubunda (0,71 mg/ml) olduğu bulunmuştur. Çizelge 4.8. deki Duncan test sonuçlarına göre, farklı dozlarda levamisol uygulanan bütün gruplarda, 7., 14. ve 28. günlerde elde edilen NBT aktivitesi değerlerinin, kontrol grubuna göre önemli derecede bir farklılık göstermediği belirlenmiştir (p>0.05). Fakat 21. gün 12,5µg/ml verilen gruptaki NBT aktivitesinin, kontrol grubuna göre önemli düzeyde yüksek olduğu saptanmıştır (p<0.05). Bu değerin, 7,5 µg/ml levamisol uygulanan grupla benzer olduğu tespit edilmiştir (p>0.05). Kontrol grubu ve 1. doz, 2. doz levamisol uygulanan gruplardaki NBT aktivitesinde günlere bağlı olarak önemli düzeyde bir değişim olmadığı görülmüştür (p>0.05). 3. doz daki grupta ise 14., 21 ve 28. günlerde belirlenen NBT 42

55 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Fatmagün SARIHAN aktivitesindeki artışın 7. güne göre önemli düzeyde farklı olduğu belirlenmiştir (p<0.05). Çizelge 4.8. Üç farklı dozda levamisol uygulamasından sonra 7., 14., 21 ve 28. günlerde ölçülen NBT aktivitesi değerleri (mg/ml) Duncan test sonuçlarına göre; sütunlarda gösterilen küçük harfler dozlar ve satırlarda gösterilen büyük harfler günler arasındaki farklılığı ifade etmektedir NBT pozitif hücre aktivasyonu Balıklara farklı dozlarda levamisol uygulamasından sonra 7., 14., 21. ve 28. günlerde ölçülen NBT pozitif hücre aktivasyonu değerleri ile günlere ve dozlara göre oluşan farklılıklar istatistiksel olarak değerlendirilmiş ve sonuçlar Çizelge 4.9. da verilmiştir. Levamisol uygulanan balıklarda NBT pozitif hücre aktivasyonu 26,17-55,67 adet arasında, kontrol grubunda ise 29,83-34,00 adet arasında değişmiştir. En yüksek NBT-slide ortalaması denemenin 7. günü 2. dozda (55,67 adet), en düşük ortalamanın ise 7. günde 3. dozda (26,17 adet) olduğu bulunmuştur. Çizelge 4.9. deki Duncan test sonuçlarına göre, uygulanan dozlar arasında 7. gün, 1. ve 2. doz, 14. gün 1. doz, levamisol verilen gruplarda, elde edilen NBT pozitif hücre aktivasyonunun kontrol grubundan önemli derecede farklı olduğu belirlenmiştir (p<0.05). 21 ve 28. günlerde ise NBT pozitif hücre aktivasyonun, dozlara bağlı olarak kontrol grubundan önemli derecede farklı olmadığı tespit edilmiştir (p>0.05). Günlere bağlı olarak, NBT hücre aktivasyonundaki değişim; 5µg/ml uygulanan grupta 14. günde görülen artışın, 7., 21. ve 28 günlerden, 7,5µg/ml ve 12,5µg/ml uygulanan gruplarda, 7. gün elde edilen değerin 14., 21. ve 28. günlerden, önemli derecede farklı olduğu belirlenmiştir (p<0.05). Kontrol grubunda ise NBT hücre aktivasyonunda, günlere bağlı olarak önemli derecede bir değişim olmadığı saptanmıştır (p>0.05). 43

56 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Fatmagün SARIHAN Çizelge 4.9. Üç farklı dozda levamisol uygulamasından sonra 7., 14., 21 ve 28. günlerde ölçülen NBT pozitif hücre aktivasyonu değerleri (adet) Duncan test sonuçlarına göre; sütunlarda gösterilen küçük harfler dozlar ve satırlarda gösterilen büyük harfler günler arasındaki farklılığı ifade etmektedir. Levamisol uygulanan balıklardan alınana kan örneklerinde NBT aktivitesi sonucu pozitif nötrofil hücrelerinin görünümü Şekil de verilmiştir. Şekil Levamisol uygulanan balıklardan alınanan kan örneklerinde NBT aktivitesi sonucu pozitif nötrofil hücrelerinin görünümü, x400 (orijinal) Miyeloperoksidaz aktivitesi Balıklara farklı dozlarda levamisol uygulamasından sonra 7., 14., 21 ve 28. günlerde ölçülen miyeloperoksidaz (MPO) aktivitesi ortalamaları ve aralarında günlere ve dozlara göre oluşan farklılıklar istatistiksel olarak değerlendirilmiş ve Duncan çoklu karşılaştırmalı test sonuçları, MPO aktivitesi (kuvvetli boyanan 44

57 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Fatmagün SARIHAN hücreler) Çizelge 4.10 da, MPO aktivitesi (zayıf boyanan hücreler) Çizelge 4.11 de, MPO aktivitesi (aktif olmayan hücreler) Çizelge 4.12 de verilmiştir. Levamisol uygulanan balıklarda MPO aktivitesi (kuvvetli boyanan hücreler) ortalamaları % 24,67-62,67 arasında, kontrol grubunda ise % 36,33-42,00 arasında değişmiştir. En yüksek % miyeloperoksidaz aktivitesi ortalamasının, denemenin 14. günü 1. dozda (% 62,67), en düşük ortalamanın ise 21. günde 2. dozda (% 24,67) olduğu bulunmuştur. Çizelge daki Duncan test sonuçlarına göre, dozlara bağlı olarak, 7., 14., 21 ve 28. günlerde belirlenen MPO (kuvvetli boyanan hücreler) aktivitesinin, kontrol grubuna göre önemli derecede farklı olmadığı belirlenmiştir (p>0.05). MPO (kuvvetli boyanan hücreler) aktivitesinin, kontrol grubu ve 5 µg/ml ile 12,5 µg/ml levamisol verilen gruplarda, günlere bağlı olarak önemli derecede farklılık göstermediği saptanmıştır (p>0.05). 7,5µg/ml levamisol uygulanan grupta ise en yüksek MPO (kuvvetli boyanan hücreler) aktivitesi 28. gün tespit edilmiş olup, bu değerin 7. ve 14. gündeki değerlerle benzer (p>0.05), 21. gündeki değerden ise önemli derecede yüksek olduğu belirlenmiştir (p<0.05). Çizelge Üç farklı dozda levamisol uygulamasından sonra 7., 14., 21 ve 28. günlerde ölçülen MPO aktivitesi (kuvvetli boyanan hücreler) (%) Duncan test sonuçlarına göre; sütunlarda gösterilen küçük harfler dozlar ve satırlarda gösterilen büyük harfler günler arasındaki farklılığı ifade etmektedir. Levamisol uygulanan balıklardan alınan kan örneklerinde MPO aktivitesi sonucu kuvvetli boyanan nötrofil hücrelerinin görünümü Şekil de verilmiştir. 45

58 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Fatmagün SARIHAN Şekil Levamisol uygulanan balıklardan alınan kan örneklerinde MPO aktivitesi sonucu kuvvetli boyanan nötrofil hücrelerinin görünümü, x1000 (orijinal) Levamisol uygulanan balıklarda miyeloperoksidaz aktivitesi (zayıf boyanan hücreler) ortalamaları % 12,67-37,00 arasında, kontrol grubunda ise % 30,00-41,33 arasında değişmiştir. En yüksek % miyeloperoksidaz aktivitesi ortalaması denemenin 7. günü kontrol grubunda (%41,33), en düşük ortalamanın ise 21. günde 2. dozda (%12,67) olduğu bulunmuştur. Çizelge deki Duncan test sonuçlarına göre; 7. günde, 5 µg/ml ve 7,5 µg/ml levamisol verilen gruplardan elde edilen MPO (zayıf boyanan hücreler) aktivitesinin, kontrol grubundan önemli derecede düşük olduğu belirlenmiştir (p<0.05). Diğer günlerde, levamisol uygulanan gruplardan elde edilen değerlerle kontrol grubu arasında farklılığın olmadığı görülmüştür (p>0.05). Ayrıca kontrol grubu dahil tüm gruplarda belirlenen MPO (zayıf boyanan hücreler) aktivitesinin günlere bağlı olarak önemli bir farklılık göstermediği tespit edilmiştir (p>0.05). 46

59 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Fatmagün SARIHAN Çizelge Üç farklı dozda levamisol uygulamasından sonra 7., 14., 21 ve 28. günlerde ölçülen MPO aktivitesi (zayıf boyanan hücreler) (%) Duncan test sonuçlarına göre; sütunlarda gösterilen küçük harfler dozlar ve satırlarda gösterilen büyük harfler günler arasındaki farklılığı ifade etmektedir. Levamisol uygulanan balıklarda miyeloperoksidaz aktivitesi (aktif olmayan) ortalamaları % 15,34-51,66 arasında kontrol grubunda ise % 22,34-32,00 arasında değişmiştir. En yüksek % miyeloperoksidaz aktivitesi ortalamasının, denemenin 21. günü 2. dozda (%51,66), en düşük ortalamanın ise 14. günde 3. dozda (% 15,34) olduğu belirlenmiştir. Çizelge deki Duncan test sonuçlarına göre, levamisol uygulanan gruplardan elde edilen MPO aktivitesinin (aktif olmayan), 7 ve 28. günlerde kontrol grubundan önemli derecede farklı olmadığı belirlenmiştir (p<0.05). 14. gün, 5µg/ml ve 12,5µg/ml uygulanan gruplardaki aktivitenin kontrol grubundan önemli düzeyde düşük olduğu tespit edilmiştir (p<0.05). 21 günde ise 7,5µg/ml verilen grupta elde edilen aktivitenin kontrol grubundan önemli derecede yüksek çıktığı saptanmıştır (p<0.05). Günlere bağlı olarak, MPO (aktif olmayan) aktivitesinin, 5µg/ml levamisol verilen grupta 28. günde en yüksek değerin elde edildiği, bu değerin 21. günle benzer (p>0.05), 7. ve 14. günlerden farklı olduğu belirlenmiştir (p<0.05). 7,5µg/ml levamisol uygulanan grupta, 21. gün saptanan MPO aktivitesinin, 7., 14. ve 28. günlerden önemli derecede yüksek olduğu (p<0.05), 12,5 µg/ml levamisol verilen grupta ise 21. gündeki değerin 7. ve 28 günlerde elde edilen değerlerle benzer (p>0.05), 14. günden farklı (p<0.05) olduğu anlaşılmıştır. 47

60 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Fatmagün SARIHAN Çizelge Üç farklı dozda levamisol uygulamasından sonra 7., 14., 21 ve 28. günlerde ölçülen MPO aktivitesi (aktif olmayan hücreler) (%) Duncan test sonuçlarına göre; sütunlarda gösterilen küçük harfler dozlar ve satırlarda gösterilen büyük harfler günler arasındaki farklılığı ifade etmektedir Fagositik aktivite Balıklara farklı dozlarda levamisol uygulamasından sonra 7., 14., 21 ve 28. günlerde ölçülen aktif fagositik hücrelerin yüzde değerlerinin günlere ve dozlara bağlı olarak oluşan farklılıkları istatistiksel olarak değerlendirilmiş ve gruplarda belirlenen fagositik aktivite ortalamaları (%), Duncan çoklu karşılaştırmalı test sonuçları Çizelge de verilmiştir. Levamisol uygulanan balıklarda fagositik aktivitite ortalamaları % 22,67-65,33 arasında kontrol grubunda ise % 20,67-49,33 arasında değişmiştir. En yüksek fagositik aktivite ortalamasının, denemenin 14. günü 2. dozda (% 65,33), en düşük ortalamanın ise 28. günde kontrol grubunda (% 20,67) olduğu bulunmuştur. Çizelge deki Duncan test sonuçlarına göre, fagositik aktivitenin, 14. gün levamisol uygulanan bütün gruplarda artış gösterdiği, bu artışın kontrol grubundan önemli düzeyde yüksek olduğu belirlenmiştir (p<0.05). Diğer günlerde ise tüm gruplarda, kontrol grubuna göre önemli bir farklılık olmadığı tespit edilmiştir (p>0.05). Günlere bağlı olarak, kontrol grubu dahil tüm gruplarda, 7 ve 14. gün fagositik aktivitede belirlenen artışın, 21 ve 28. günlerden önemli düzeyde yüksek olduğu belirlenmiştir (p<0.05). 48

61 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Fatmagün SARIHAN Çizelge Üç farklı dozda levamisol uygulamasından sonra 7., 14., 21 ve 28. günlerde ölçülen aktif fagositik hücreler (%) Duncan test sonuçlarına göre; sütunlarda gösterilen küçük harfler dozlar ve satırlarda gösterilen büyük harfler günler arasındaki farklılığı ifade etmektedir. Levamisol uygulanan balıklardan alınan kan örneklerinde fagositik aktivite sonucu aktif hücrelerin görünümü Şekil de verilmiştir. Şekil Levamisol uygulanan balıklardan alınan kan örneklerinde fagositik aktivite sonucu aktif hücrelerin görünümü. Giemsa, x1000 (orijinal) Periferik Yayma Balıklara farklı dozlarda levamisol uygulamasından sonra 7., 14., 21 ve 28. günlerde ölçülen periferik yayma değerlerinin günlere ve dozlara göre oluşan farklılıkları istatistiksel olarak değerlendirilmiş ve periferik yaymada elde edilen sonuçların Duncan çoklu karşılaştırmalı test sonuçları, lenfosit ortalamaları Çizelge 49

62 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Fatmagün SARIHAN 4.14 de, nötrofil ortalamaları Çizelge 4.15 de, monosit ortalamaları Çizelge 4.16 de eosinofil ortalamaları 4.17 de verilmiştir. Levamisol uygulanan balıklarda lenfosit ortalamaları % 66,84-81,67 arasında, kontrol grubunda ise % 74,83-80,83 arasında değişmiştir. En yüksek % lenfosit ortalaması denemenin 7. günü 2. dozda (% 81,67), en düşük ortalamanın ise 28. günde 3. dozda (% 66,84) olduğu bulunmuştur. Çizelge deki Duncan test sonuçlarına göre, 7. gün, levamisol uygulanan bütün dozlardan elde edilen lenfosit ortalamalarının kontrol grubu ile benzer (p>0.05), 14. gün, tüm gruplardan elde edilen lenfosit ortalamalarının kontrol grubundan önemli derecede düşük olduğu (p<0.05), 21. gün ve 28 günlerde ise, levamisol uygulanan gruplardan elde edilen lenfosit ortalamalarının, kontrol grubuyla aralarında önemli bir farklılık olmadığı tespit edilmiştir (p>0.05). Günlere bağlı olarak, 5 µg/ml levamisol uygulanan grupta 14. günde elde edilen lenfosit ortalamasının, 7. gündeki değerle benzer olduğu (p>0.05), fakat 21 ve 28. günlerdeki değerden önemli derecede düşük olduğu anlaşılmıştır (p<0.05). 7,5 µg/ml verilen grupta, 14. gün düşük çıkan lenfosit ortalamasının 28. günle arasında farklılık olmadığı (p>0.05), 12,5 µg/ml uygulanan grupta ise 7. gün düşük olan lenfosit ortalamasının, 14 ve 28. günlerle benzer olduğu saptanmıştır (p>0.05). Çizelge Üç farklı dozda levamisol uygulamasından sonra 7., 14., 21 ve 28. günlerde ölçülen lenfosit ortalamaları (%) Duncan test sonuçlarına göre; sütunlarda gösterilen küçük harfler dozlar ve satırlarda gösterilen büyük harfler günler arasındaki farklılığı ifade etmektedir. Levamisol uygulanan balıklarda nötrofil ortalamaları % 9,83-24,33 arasında, kontrol grubunda ise % 10,00-16,67 arasında değişmiştir. En yüksek % nötrofil ortalaması denemenin 28. günü 3. dozda (% 24,33), en düşük ortalamanın ise 21. günde 3. dozda (% 9,83) olduğu bulunmuştur. 50

63 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Fatmagün SARIHAN Çizelge deki Duncan test sonuçlarına göre, nötrofil ortalamalarının (%), 7. gün levamisol uygulanan gruplarda kontrol grubundan önemli derecede farklı olmadığı (p>0.05), 14. gün levamisol uygulaması yapılan tüm grupların nötrofil ortalamalarının yükseldiği ve kontrol grubundan önemli derecede farklılık gösterdiği saptanmıştır (p<0.05). 21. gün 1. ve 2. dozda belirlenen nötrofil ortalamalarının, kontrol grubuyla benzer olduğu (p>0.05), 3. dozdaki nötrofil ortalamasının bu iki gruptan ve kontrol grubundan önemli derecede düşük olduğu tespit edilmiştir (p<0.05). 28. gün 12,5 µg/ml uygulanan grupta elde edilen nötrofil ortalamalarının 7,5 µg/ml verilen grupla benzer olduğu (p>0.05), fakat kontrol grubundan önemli derecede yüksek çıktığı anlaşılmıştır (p<0.05). Günlere bağlı olarak, 5 µg/ml levamisol uygulanan grupta nötrofil ortalaması (%), 14. gün yükselmiş olup, bu değerin 7., 21 ve 28. günlerden önemli derecede farklı olduğu belirlenmiştir (p<0.05). 7,5 µg/ml uygulanan grupta, 14. gün yükselen nötrofil ortalamasının, 21 ve 28. günlerle benzer olduğu (p>0.05), 12,5 µg/ml levamisol uygulanan grupta ise, 21. gün elde edilen değerin diğer günlerdeki değerlerden önemli derecede düşük olduğu tespit edilmiştir (p<0.05). Kontrol grubunda belirlenen nötrofil ortalamalarının günlere göre farklılık göstermediği görülmüştür (p>0.05). Çizelge Üç farklı dozda levamisol uygulamasından sonra 7., 14., 21 ve 28. günlerde ölçülen nötrofil ortalamaları (%) Duncan test sonuçlarına göre; sütunlarda gösterilen küçük harfler dozlar ve satırlarda gösterilen büyük harfler günler arasındaki farklılığı ifade etmektedir. Levamisol uygulanan balıklardan alınan kan örneklerinde nötrofillerin görünümü Şekil de verilmiştir. 51

64 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Fatmagün SARIHAN Şekil Levamisol uygulanan balıklardan alınan kan örneklerinde nötrofillerin görünümü. May-Grünwald Giemsa, x1000 (orijinal) Levamisol uygulanan balıklarda monosit ortalamaları % 7,33-13,33 arasında, kontrol grubunda ise % 8,00-10,20 arasında değişmektedir. En yüksek % monosit ortalaması denemenin 7. günü 1. dozda (% 13,33), en düşük ortalamanın ise 7. günde 2. dozda (% 7,33) ve 21. günde 1. dozda (% 7,33) olduğu bulunmuştur. Çizelge deki Duncan test sonuçlarına göre, uygulamanın 7., 21 ve 28. günleri, tüm levamisol verilen gruplarda belirlenen monosit ortalamalarının (%), kontrol grubundan önemli derecede farklı olmadığı belirlenmiştir (p>0.05). 14. gün ise 7,5 µg/ml ve 12,5 µg/ml levamisol verilen gruplarda monosit ortalamalarının birbirinden önemli derecede farklı olduğu (p<0.05), fakat levamisol uygulanan gruplardan elde edilen monosit ortalamalarının kontrol grubundan önemli derecede farklı olmadığı tespit edilmiştir (p>0.05). Günlere bağlı olarak 5 µg/ml, 12,5 µg/ml levamisol verilen gruplarla, kontrol grubunda, monosit ortalamalarında önemli bir değişim saptanmamıştır (p>0.05). 7,5 µg/ml uygulanan grupta ise 7 ve 28. günlerin 14. günden önemli derecede yüksek olduğu belirlenmiştir (p<0.05). 52

65 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Fatmagün SARIHAN Çizelge Üç farklı dozda levamisol uygulamasından sonra 7., 14., 21 ve 28. günlerde ölçülen monosit ortalamaları (%) Duncan test sonuçlarına göre; sütunlarda gösterilen küçük harfler dozlar ve satırlarda gösterilen büyük harfler günler arasındaki farklılığı ifade etmektedir. Çizelge deki Duncan test sonuçlarına göre, dozlara bağlı olarak, 7., 14., 21 ve 28. günlerde belirlenen eosinofil ortalamalarının (%), kontrol grubuna göre önemli derecede farklı olmadığı belirlenmiştir (p>0.05). Ayrıca kontrol grubu dahil levamisol uygulanan gruplardan elde edilen eosinofil ortalamalarının (%), günlere bağlı olarak önemli bir farklılık göstermediği tespit edilmiştir (p>0.05). Diğer taraftan, levamisol uygulanan balıklarda eosinofil ortalamaları % 0,00-0,67 arasında değişirken kontrol grubunda ise bu değer, % 0,00-0,33 arasında değişmiştir. Çizelge Üç farklı dozda levamisol uygulamasından sonra 7., 14., 21 ve 28. günlerde ölçülen eosinofil ortalamaları (%) Duncan test sonuçlarına göre; sütunlarda gösterilen küçük harfler dozlar ve satırlarda gösterilen büyük harfler günler arasındaki farklılığı ifade etmektedir Levamisolün streptokokkosis enfeksiyonuna karşı yaşama oranına etkisi Üçüncü denemede, levamisol uygulamasından sonra, denemenin 14. günü balıklara S.iniae (1x10 4 cfu/ml) her balığa 200 µl olacak şekilde intraperitonal olarak enjekte edilmiştir. Bakteri uygulandıktan sonra, ilk ölüm ikinci gün kontrol (pozitif) grubunda bir bireyde görülmüştür. Daha sonra aynı grupta; toplam ölen balık sayısı, üçüncü 53