TEMEL METAL ALAŞIMI ve ALAŞIMLARDAN SALINAN ELEMENTLERİN HÜCRE METABOLİZMASI ÜZERİNE ETKİSİ

Transkript

1 TÜRKİYE CUMHURİYETİ ANKARA ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ TEMEL METAL ALAŞIMI ve ALAŞIMLARDAN SALINAN ELEMENTLERİN HÜCRE METABOLİZMASI ÜZERİNE ETKİSİ İrem GÖKTEPE ATEŞ PROTETİK DİŞ TEDAVİSİ ANABİLİM DALI DOKTORA TEZİ DANIŞMAN Prof. Dr. Gülşen CAN Bu tez, Ankara Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Müdürlüğü tarafından proje numarası ile desteklenmiştir ANKARA

2 TÜRKİYE CUMHURİYETİ ANKARA ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ TEMEL METAL ALAŞIMI ve ALAŞIMLARDAN SALINAN ELEMENTLERİN HÜCRE METABOLİZMASI ÜZERİNE ETKİSİ İrem GÖKTEPE ATEŞ PROTETİK DİŞ TEDAVİSİ ANABİLİM DALI DOKTORA TEZİ DANIŞMAN Prof. Dr. Gülşen CAN 2007 ANKARA

3 Ankara Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü Protetik Diş Tedavisi Doktora Programı çerçevesinde yürütülmüş olan bu çalışma aşağıdaki jüri tarafından Doktora Tezi olarak kabul edilmiştir. Tez Savunma Tarihi: 26 / 07 / 2007 Prof. Dr. Ali ZAİMOĞLU Ankara Üniversitesi Jüri Başkanı Prof. Dr.Nurşen SARAÇ Ankara Üniversitesi Prof. Dr. Gülşen CAN Ankara Üniversitesi Prof. Dr. Aykut ÖZKUL Ankara Üniversitesi Prof. Dr. Bülent ULUDAĞ Ankara Üniversitesi ii

4 İÇİNDEKİLER Kabul ve Onay İçindekiler Önsöz Simgeler ve Kısaltmalar Şekiller ve Resimler Çizelgeler ii iii v vi vii viii 1. GİRİŞ Alaşımlar Biyouyumluluk Sistemik Etki Lokal Etki Alerjik Etki Mutajenik ve Karsinojenik Etki Dental Materyallerin Biyouyumluluk Değerlendirme 15 Yöntemleri İn Vitro Test Yöntemleri Biyolojik Sistem Hücre-Materyal Teması Değerlendirme Yöntemleri Spektrofotometri Amaç GEREÇ VE YÖNTEM Metal İyon Çözeltilerinin Hazırlanması Metal Örneklerin Hazırlanması Hücre Kültürünün Hazırlanması Deney BULGULAR 36 iii

5 4. TARTIŞMA SONUÇLAR VE ÖNERİLER 57 ÖZET 59 SUMMARY 61 KAYNAKLAR 63 ÖZGEÇMİŞ 70 iv

6 ÖNSÖZ Fakülte hayatım ve doktora eğitimim süresince tüm yardımları ve manevi desteğini esirgemeyen, bilgi ve deneyimi ile yol gösteren değerli tez danışmanım Sayın Prof. Dr. Gülşen Can a, Tez çalışmalarım süresince yardımları ve desteği için A.Ü. Veteriner Fakültesi Viroloji Anabilim Dalı öğretin üyesi Sayın Prof. Dr. Aykut Özkul a, Hayatım boyunca her zaman yanımda olan ve hep yanımda olacağını bildiğim, beni her konuda destekleyen sevgili ailem ve eşime, teşekkür ederim. v

7 SİMGELER VE KISALTMALAR AAS Atomik Absorpsiyon Spektrometresi Aº Angström Al 2 O 3 Aluminyum oksit BSA Bovine Serum Albumine ºC Santigrat derece CO 2 Karbondioksit DMEM Dulbecco s Modified Eagle s Medium FBS Fetal bovine serum IU/ ml İnternasyonal Ünite / mililitre ISO Internatıonal Organization for Standards LD 50 L929 mg ml mg / kg %50 letal doz Fare fibroblast hücresi miligram mililitre miligram / kilogram µg mikrogram µmol / L mikromol / litre µl mikrolitre µm mikrometre µmol mikromol nm nanometre ppm milyonda partikül sayısı TC 50 %50 toksik konsantrasyon vi

8 ŞEKİLLER ve RESİMLER Şekil 3.1. Kumlanmış, parlatılmış metal örneklerin bulunduğu ortamdaki 36 hücrelerin ve kontrol grubunun 24. ve 72. saatler sonunda ortaya koydukları canlılık sonuçları Şekil Seyreltik ve derişik metal iyonu çözeltilerinin bulunduğu 39 hücrelerin ve kontrol grubunun 24. saat sonunda ortaya koydukları canlılık değerleri Şekil 3.3. Seyreltik ve derişik metal iyonu çözeltilerinin bulunduğu 39 hücrelerin ve kontrol grubunun 72. saat sonunda ortaya koydukları canlılık değerleri Resim 2.1. Ticari metal tuzları 27 Resim 2.2. Metal iyon tuzları 28 Resim 2.3. Ni-Cr (Wiron 99) metal alaşımı 29 Resim 2.4. Pirinç metal örneği 30 Resim 2.5. Metal iyonu çözeltileri yerleştirilmiş 96 göz hücre kültürü 32 tableti Resim 2.6. Metal iyon çözeltileri ile temasta olan kristal viyole ile 32 boyanmış hücreler Resim 2.7. Spektrofotometre 33 Resim 2.8. Metal örnekler yerleştirilmiş 24 göz hücre kültürü tableti 34 Resim 2.9. Metal örnekler ile temasta olan kristal viyole ile boyanmış 34 hücreler vii

9 ÇİZELGELER Çizelge 1.1. Temel Metal Alaşımlarının Yapısına Katılan Elementlerin 3 Fiziksel Etkileri Çizelge 1.2. Temel Metal Alaşımlarının Yapısına Katılan Elementlerin 7 Biyolojik Etkileri Çizelge 1.3. LD 50 değerine göre toksisite dereceleri 11 Çizelge 1.4. Bazı elementlerin diyetle günlük alınım dozları 11 Çizelge 1.5. Dental döküm alaşımlarına katılan metal iyonlarının 13 TC 50 değerleri Çizelge 2.1. Ni-Cr temel metal alaşımı içindeki elementler ve ağırlık 28 yüzdeleri Çizelge 2.2. Metal iyonları, kullanılan çözeltiler ve konsantrasyonlar 29 Çizelge 3.1. Kumlanmış ve parlatılmış metal örneklerin bulunduğu 36 ortamdaki hücrelerin ve kontrol grubunun 24. ve 72. saatler sonunda ortaya koydukları ortalama (minimum- maksimum) canlılık değerleri Çizelge 3.2. Seyreltik ve derişik metal iyonu çözeltilerinin bulunduğu 38 hücrelerin ve kontrol grubunun 24. ve 72. saatler sonunda ortaya koydukları ortalama (minimum- maksimum) canlılık değerleri Çizelge 3.3. Seyreltik metal iyonu çözeltilerinin 24 saat sonunda 40 hücrelerde ortaya koydukları ortalama (minimum- maksimum) canlılık değerlerinin kendi aralarında ikili karşılaştırmaları Çizelge 3.4. Seyreltik metal iyonu çözeltilerinin 72 saat sonunda 41 hücrelerde ortaya koydukları ortalama (minimum- maksimum) canlılık değerlerinin kendi aralarında ikili karşılaştırmaları Çizelge 3.5. Derişik metal iyonu çözeltilerinin 24 saat sonunda 42 hücrelerde ortaya koydukları ortalama (minimum- maksimum) canlılık değerlerinin kendi aralarında ikili karşılaştırmaları viii

10 Çizelge 3.6. Derişik metal iyonu çözeltilerinin 72 saat sonunda 43 hücrelerde ortaya koydukları ortalama (minimum- maksimum) canlılık değerlerinin kendi aralarında ikili karşılaştırmaları ix

11 1.GİRİŞ 1.1. Alaşımlar Günümüz diş hekimliğinde restoratif amaçlı değişik materyallerin kullanımı, materyal ve canlı doku arasındaki ilişkinin uyumlu olmasını gerektirmektedir. Dental amaçlarla kullanılan alaşımlar, genellikle erimiş halde birbirleri içinde çözünen iki veya daha fazla metalin birleşmesiyle meydana gelirler. Alaşımların ekonomik ve mekanik açıdan olumlu özelliklerini üst seviyelere taşıma gerekliliği biyolojik uyum özelliklerini de göz önüne alma zorunluluğu yaratmaktadır (Kawahara ve ark., 1968; Çetin, 1977; Wataha, 2000; O'Brien, 2002). Diş hekimliğinde protetik amaçla kullanılan alaşımların sınıflandırılması Mc Lean (1979) tarafından aşağıdaki şekilde yapılmıştır: Soy Metal Alaşım Sistemleri Yüksek Altın Alaşımları Düşük Altın Alaşımları Altınsız Alaşımlar - Altın-Platin-Paladyum Alaşımları - Altın-Platin-Tantal Alaşımları - Altın- Paladyum-Gümüş Alaşımları - Paladyum-Gümüş Alaşımları Temel Metal Alaşım Sistemleri -Nikel-Krom Alaşımları -Kobalt-Krom Alaşımları 1

12 Soy ve Temel Metal Alaşımları İçerisindeki Elementler Yüksek altın içeren soy metal alaşımlarının biyolojik olarak yüksek uyumlulukları gösterdikleri bilinmektedir. Ancak özellikle temel metal alaşımlarının bileşiminde bulunan nikel, krom, kobalt, bakır ve berilyum, biyolojik yönden olumsuz özelliklere sahip elementler olarak değerlendirilmektedir (Zaimoğlu ve ark.,1993) (Çizelge 1.1). Altın Lekelenme ve korozyona direnç sağlanabilmesi için bir alaşımın altın içeriğinin ağırlıkça en az % 75 olması gerekir (Zaimoğlu ve ark., 1993). Altına bağlı lokal ya da sistemik yan etkiler nadiren görülür. Altın tuzlarının intravenöz uygulamalarında bile toksisite oldukça nadirdir. Genellikle altın alerjisi olduğu bildirilen hastaların tamamında, nikel, kobalt ya da krom alerjisi de görülür (Craig ve Powers, 2002; Özen, 2001). Platin Yüksek erime ısısı ve yüksek korozyon direnci ve buna bağlı olarak yüksek biyouyumluluğu ile diş hekimliğinde, özellikle seramik restorasyonların yapımında; tıpta implant materyali olarak sıklıkla kullanılan bir metaldir (Craig ve Powers, 2002). Paladyum Altın ve gümüş ile birlikte pek çok alaşımın içerisinde kullanılır. Alaşımın erime sıcaklığını yükseltir. Üstün mekanik özellikleri ve biyouyumluğu sayesinde diş hekimliğinde, özellikle seramik restorasyonların alt yapısında; tıpta implant materyali olarak kullanılmaktadır (Craig ve Powers, 2002). 2

13 Çizelge1.1. Temel Metal Alaşımlarının Yapısına Katılan Elementlerin Fiziksel Etkileri (Zaimoğlu ve ark., 1993) Metal Katılma Oranı(%) Özellikler Berilyum 1-2 Dökülebilirlik, çekilebilirlik ve iletkenliği arttırır, birleşme sıcaklığını düşürerek alaşım elementlerini birarada tutar Demir 0,2-2,5 Sertlik verir, porselen bağlantısı için oksit oluşturur İndiyum 0,2-1 Sertlik verir, porselen bağlantısı için oksit oluşturur Kalay 0,2-1 Sertlik verir, porselen bağlantısı için oksit oluşturur Manganez 0,5-6 Korozyon direnci sağlar, sertlik verir,akıcılığı ve dökülebilirliği arttırır Silisyum 0,5-3,5 Dökülebilirliği ve iletkenliği arttırır, sertlik verir, porselen bağlantısı için oksit oluşturur Aluminyum 1,1-6 Sertlik verir Titanyum 0,02-1 Sertlik verir, oksit tabakası oluşturur Boron 0,5 Ergime aralığını genişletir, korozyona direnç sağlar, sertlik verir Molibden 2-12 Termal genleşme katsayısını kontrol eder, korozyon direncini arttırır, oksit oluşturur Tunsten 6-7 Termal genleşme katsayısını kontrol eder, korozyon direncini arttırır İridyum 0-15 Korozyon direnci ve elastikiyet katsayısını arttırır Karbon 0,05-0,4 Dayanıklılık, sertlik ve iletkenlik sağlar Nikel Soy metal alaşımlara ilave edildiğinde, alaşımların mekanik özelliklerinde olumlu etkilere neden olur. Altın alaşımlarına düşük konsantrasyonda nikel ilavesi, alaşımın beyazlığını ve sertliğini arttırır. Ni-Cr-Co alaşımları % 81 oranında nikel içerebilirler. Nikel içeren soy olmayan temel metal alaşımlarının diş hekimliğinde yaygın kullanımı ile alerjik reaksiyonların sıklığı dikkat 3

14 çekmiş, biyouyumlulukları konusunda sorunların ortaya çıkmasına neden olmuştur (Kansu, 1991; Craig ve Powers, 2002). İnsanda akciğer, böbrek, karaciğer ve bağırsak dokularında değişik konsantrasyonlarda nikel elementi bulunur. Yaş ilerledikçe akciğerlerdeki nikel oranı artar. Normal idrar konsantrasyonu yaklaşık 2.3 mg / 100 ml dir. İnsan tükürüğündeki nikel miktarı mg / 100 ml arasında değişirken, yapılan doku kültürü araştırmalarında, insan gingivasındaki fibroblastlar için toksik miktarın 0.25 mg / 100 ml olduğu bildirilmiştir (Kansu, 1991; Özen, 2001). Nikel içerikli alaşımların korozyon oranı yüksektir. Ağız boşluğunda oluşan korozyon ürünleri dokular tarafından tutulup hedef organlara taşınır. Bu, özellikle nikele duyarlı hastalarda, vücudun çeşitli yerlerinde yayılma reaksiyonu şeklinde kendini gösterir (Kansu, 1991). Genel populasyonda nikele aşırı duyarlılık insidansı kayda değer oranda yüksek bulunmuştur (% 28,5). Kadınlarda bu insidans erkeklere oranla on misli fazladır (Kansu, 1991). Nikel dermatitisi ellerde oluşan, parmaklara, bileklere ve ön kola yayılabilen, kaşıntı ve yanma hissi ile beraber seyreden papiller eritemlerle karakterize bir deri hastalığıdır (Suzuki, 1995). Genellikle nikel alerjisi semptomları, metale temas eden vücudun bir bölgesinde egzamatöz reaksiyon ile başlar (Kansu, 1991). Nikele duyarlılık gelişmesine etki edebilen nonspesifik etkenler mekanik irritasyon, deri iltihabı, nikele temas etme şiddeti ve sürekliliği, deri ısısının artması ve nem gibi çevresel faktörlerdir. Nikel içerikli alaşımlara duyarlılık reaksiyonları, vücut salgılarının fazla olduğu sıcak ve nemli bölgelerde ortaya çıkar. Isı artışı ile oluşan ter içindeki klorit, alaşım içindeki nikeli iyonize eder. Korozyona uğrayan nikel tuzları, dokudaki taşıyıcı molekül ile birleşerek 4

15 antijenik özellikler kazanır ve deride duyarlılık reaksiyonlarına neden olurlar (Kansu, 1991). Krom Krom, alaşımlara, lekelenme ve paslanmaya karşı direnç özelliği kazandırır. Alaşım içindeki krom oranı % olmalıdır. % 30 üzerindeki krom, alaşımın kırılganlığını arttırır, dökümü zorlaştırır. Kromun % 20 nin altında olduğu durumlarda alaşımın dayanıklılığı ve lekelenmeye karşı direnci azalır (Kansu, 1991). Endüstriyel alanda krom toksisitesine maruz kalanlarda, solunum sistemi irritasyonları, septum nazi perforasyonları, pulmoner fibrozis ve hatta akciğer kanserine rastlanılmaktadır. Ancak diş hekimliği uygulamalarından kaynaklanmış böyle bir etki bildirilmemiştir. Kan konsantrasyonları ppm i bulduğunda hücrelerde sitotoksik değişikliklere neden olabilmektedir (Kansu, 1991; Messer ve Lucas, 1999; Özen, 2001). Kobalt Alaşımın elastisite modülünü nikelden daha fazla arttırır. Alaşıma % oranında ilave edilir. Alaşıma sertlik ve dayanıklılık verir (Kansu, 1991). Kronik kobalt toksikasyonunda, bireylerde hipertroidi, hematolojik bozukluklar, dispne oluşabilmekteyken dişhekimliğinde kullanılan formlarının bu yönde bir sistematik oluşturduğuna dair yayın mevcut değildir (Kansu, 1991; Özen, 2001). Gümüş İyi bir ısı ve elektrik iletkeni olan gümüş, ağızdaki metal yapılar üzerinde siyah sülfid formasyonu oluşturur. Korozyon direnci düşüktür. Gümüş içeren 5

16 alaşımlara paladyum ilavesi bu alaşımların korozyon oranını düşürür (Craig ve Powers, 2002). Çinko Altın ve platinle kullanıldığında alaşımın sertliğini ve parlaklığını arttırır. Ayrıca ısıtma ve döküm işlemleri esnasında deokside edici görev yapar. Alaşım yapısına % 1-2 oranında katılır. Bu oranın yükselmesi alaşımın kırılganlığını arttırır (Craig ve Powers, 2002). Bakır Yüksek ısı ve elektrik iletkenliği ile bilinen yumuşak ve işlenebilir bir metaldir. Altın alaşımlarının direnç ve sertliğini arttırır. Ancak alaşımın lekelenme ve korozyon direncini azalttığından alaşımlara en fazla % 0,5-1 oranında katılır (Craig ve Powers, 2002; Kansu,1991). Berilyum Dental alaşımlara % oranında ilave edilen berilyum, alaşımın sertliğini ve dayanıklılığını arttırırken, dökülebilirliğini kolaylaştırır (Kansu, 1991). Endüstriyel berilyuma maruz kalan bireylerde özellikle akciğer kanseri insidansının yüksek olduğu bildirilmektedir. Çeşitli yayınlarda protetik restorasyonlarda toksik olduğuna dair bilgiler mevcut olmamasına rağmen, diş hekimliği alanında son yıllarda alaşımların bileşiminden çıkarılmıştır (Kansu, 1991). Diş hekimliği materyallerinin yapısına giren bu temel elementlerin yanısıra bileşimde eser miktarda bulunan diğer elementleri de göz ardı etmemek gerekir 6

17 Klinik uygulamalarda alaşımların, fizik ve mekanik özellikleri ile birlikte biyolojik özelliklerinin de göz önünde bulundurulması büyük önem taşır. Diş hekimliğinde kullanılan alaşımların ağız ortamında bulunmaları ve canlı dokularla ilişki halinde olmaları bu alaşımların alerjenite, toksisite ve karsinojenite özellikleri açısından detaylı incelemeleri gereğini ortaya çıkarmıştır (Zaimoğlu ve ark.,1993) (Çizelge 1.2.). Çizelge 1.2. Temel Metal Alaşımlarının Yapısına Katılan Elementlerin Biyolojik Etkileri (Zaimoğlu ve ark., 1993) Element Berilyum Nikel Krom Kalay Boron Molibden Aluminyum Titanyum Demir İndiyum Manganez Tunsten İridyum Silisyum Toksisite verileri Hayvan deneyleri pozitif, karsinojen, küçük partiküller halindeyken yüksek derecede toksik Hayvan deneyleri pozitif, karsinojen Hayvan deneylerine göre kesin olmamakla birlikte karsinojen Tüm organik bileşikleri toksik, elemental kalay düşük derecede toksik. Havadaki elemental kalaya tolerans sınırı 0,1 mg/m³ Halojen bileşikleri yüksek derecede toksik Elemental olarak toksik değil, bileşikleri düşük derecede toksik. Havadaki tolerans sınırı 5 mg/m³ Toksik değil Toksik değil Toksik değil, Havadaki tolerans sınırı 10 mg/m³ Düşük derecede toksik. Havadaki tolerans sınırı 0,1 mg/m³ Element ve bileşik halinde düşük derecede toksik Düşük derecede toksik Muhtemelen düşük derecede toksik Düşük derecede toksik 7

18 Alaşımın biyolojik güvenilirliğini ortaya koyan özelliği, korozyona olan yatkınlık derecesidir (Wataha, 2000). Korozyon genel bir ifade ile, olumsuz çevre koşulları etkisiyle metallerde meydana gelen bozunma olarak tanımlanabilir. Alaşımın aktif ya da soy element içeriği, tek fazlı ya da çok fazlı olabilen mikro yapısı, homojen ya da inhomojen durumu, pasivasyon özelliği gibi yapısal özellikleri, döküm şartları ve bitirme işlemleri, farklı metal alaşımlarla karşılıklı etkileşimleri, bulunduğu ortam korozyon direnci üzerine etkilidir (Akpınar, 2001). Alaşımdan, bu faktörlerden bir veya birkaçı nedeniyle başlangıçta fazla ancak daha sonra pasivasyona bağlı olarak azalan ve sabit bir oranda devam eden element salınımı meydana gelmektedir (Geis-Gerstorfer ve ark., 1991; Wataha ve Lockwood, 1998; Wataha ve ark., 1999a,b,c). Yüzeyde pasif tabakanın oluşması, başlangıçta fazla olan salınımın azalmasına ve yüzeyde korozyona dirençli bölgelerin oluşmasına neden olur. Bu bölgeler herhangi bir etkiyle bozulana dek korozyon oranı düşük bir şekilde seyreder (Geis-Gerstorfer ve ark., 1991). Dental uygulamalarda kullanılacak alaşımların seçiminde korozyon direnci önemli bir faktördür. Korozyon metalik yapıya zarar verir. Yapılan araştırmaların çoğunda korozyon nedeniyle salınan elementlerin, oral kavitede sert ve yumuşak dokulara penetre olduğu rapor edilmiştir. Korozyon ürünleri bazı bireylerde oral mukozada ülser, lökoplazi gibi lezyonlara, alerjiye, ağız içinde tuzlu metalik tat oluşmasına, deride birtakım döküntülere neden olurlar (Şahin ve ark., 1991). Alaşım içindeki elementlerin iyonize olmaları korozyona neden olur. Başlangıçta alaşım içinde yüksüz olan elementler, solüsyon içine bırakıldıklarında pozitif yüklü iyonlar haline gelirler (Wataha, 2000). Bazı elementlerin alaşımlardan yüksek bir salınım eğilimi vardır. Bu eğilim o elementin kararsızlığı olarak tanımlanır. Bakır, nikel, galyum, çinko ve kadmiyum kararsız elementler olup, kolayca salınma eğilimindedirler (Wataha, 2000). Soy metal içeriği, alaşımdan element salınımını nispeten azaltır (Çetin, 8

19 1977; Brune, 1986; Geis-Gerstorfer ve ark., 1991; Zaimoğlu ve ark., 1993). Ancak çok fazlı alaşımlarda soy metal içeriğinin fazla olması, alaşımdan element salınımını azaltmada etkili değildir (Niemi ve Hensten-Pettersen, 1985; Wataha ve ark., 1991a). Element salınımı, elementin ve alaşımın özelliklerine ve hazırlanma şekline ek olarak ağız içi faktörlere de bağlıdır. Olumsuz çevre koşulları, sıcaklık değişimleri, nem varlığı, ph değişimleri, oksijen miktarındaki değişimler, ağza alınan yiyecek ve içeceklerin fiziksel ve kimyasal özellikleri, dental plak, ilaç kullanımı, ısırma kuvvetlerinin miktar ve dağılımındaki değişiklikler, ağızda bulunan diğer metalik restorasyonlarla etkileşim ve diş fırçalama korozyon hızını ve miktarını belirler. Vücut sıvıları ile karşılaşan birçok biomateryal korozyona uğramaktadır (Covington ve ark., 1985; Niemi ve Hensten- Pettersen, 1985; Bergman, 1986; Brune, 1986; Craig ve Hanks, 1988 ; Craig ve Hanks, 1990; Wataha ve ark, 1991a; Wataha ve ark, 1993a; Zaimoğlu ve ark., 1993; Messer ve Lucas, 1999; Messer ve Lucas, 2000; Wataha ve ark, 2000; Wataha ve ark, 2002). Korozyon direncini arttırmak için; alaşıma katılan diğer elementlerin yanı sıra Ni-Cr ve Co-Cr alaşımlarına % oranında katılan krom, krom oksit adı verilen bir pasivasyon tabakası oluşturmakta ve buna bağlı olarak düşük iyon salınımı meydana gelmektedir (Çetin, 1977; Brune, 1986; Geis-Gerstorfer ve ark., 1991; Zaimoğlu ve ark., 1993). Biyolojik sıvılara maruz kaldığında alaşım yüzeyinde meydana gelen değişiklikler ve bunun element salınımı ile ilgisi, alaşımın yüzey bileşiminin, hacim bileşiminden daha önemli olduğunu düşündürmektedir. Alaşımın yüzeyden itibaren 5 Aº alttaki bileşimin yüzeyden farklı bulunması, etkilenme derinliğinin önemini gösterir. Buna göre 5 Aº luk kalınlık, element salınımına engel olan veya izin veren tabakadır. Dental döküm alaşımlarındaki her bir element atomunun metalik çapı yaklaşık 3 Aº olduğuna göre, söz konusu 5 Aº luk yüzey tabakası 1 ya da 2 atom kalınlığındadır (Wataha ve Malcolm, 1996). 9

20 1.2. Biyouyumluluk Klasik tanımı ile biyouyumluluk, herhangi bir materyalin canlı dokularla temas halinde iken lokal ya da sistemik toksisiteye, alerjik, mutajenik ve karsinojenik etkiye neden olmayan inert özellikleri ile vücudun sert ya da yumuşak dokularında doku reaksiyonu oluşturmamasıdır (Smith, 1982; Bergman, 1986). Biyouyumluluk bir başka deyişle, materyalin uygulamalar sonrası uygun konakçı doku cevabı oluşturabilme yeteneğidir (Schmalz, 1994). Vücuda yerleştirilen herhangi bir restorasyon, çevredeki sert ve yumuşak dokuda birtakım değişikliklere yol açar (Smith, 1982). Oral epitel, bağ dokusu, diş sert dokusu ve kemik ile temas eden restorasyonlarda kullanılan metalik materyallere karşı oluşan bu değişiklikler doku reaksiyonu olarak adlandırılır ve materyalin kimyasal yapısına, restorasyonun tasarımı ve elde edilme yöntemlerine, mekanik özellikleri, dokularla olan temasının şekli ve süresine bağlı olarak çeşitli şekillerde ortaya çıkar (Smith, 1982; Wataha, 2000) Sistemik Etki Sistemik etki veya toksisite, materyalin vücuda girdikten sonra, kan dolaşımına katılarak hedef bölgeye ulaşmasıyla meydana gelir. Sistemik toksisitede reaksiyon, toksik materyalin uygulandığı bölgeden uzakta meydana gelir (Schmalz, 1998). Sistemik toksisite ölçüsü LD50 (Letal Doz) değeri ile belirlenir (Çizelge 1.3). Bu değer, deney hayvanlarının % 50 sini öldüren doz olup, birimi mg / kg dir (Schmalz, 1998; Wataha, 2000). 10

21 Çizelge 1.3. LD 50 değerine göre toksisite dereceleri (Akpınar,2001) Toksisite Derecesi LD50 (mg / kg) etkisiz > az orta çok şiddetli 5 10 süper <5 Diş hekimliğinde kullanılan alaşımlardan salınan elementlerin, vücutta sistemik etki yaptığına dair çok az kanıt vardır. Birçok durumda, dental alaşımı oluşturan elementlerin günlük diyetle alımları (Çizelge 1.4) ile karşılaştırıldığında, dental alaşımdan salınan elementlerin miktarının diyetle alına miktardan çok daha az olması nedeni ile sistemik toksisite oluşmaması sürpriz değildir ( Akpınar, 2001 ). Çizelge 1.4. Bazı elementlerin diyetle günlük alınım dozları (Wataha, 2000) Element Doz (µg) Altın < 7 Civa 20 Gümüş 25 Krom 240 Kobalt 250 Molibden 400 Nikel Titanyum 750 Bakır 3110 Çinko Demir Alüminyum

22 Lokal Etki Lokal etki veya toksisite, toksik materyalin vücuda giriş bölgesinde oluşturduğu reaksiyondur (Hanks ve ark.,1996; Wataha, 2001). Dental döküm alaşımlarından salınan metal iyonları lokal toksisiteye neden olabilir. Lokal toksisite için gereken konsantrasyon, sistemik toksisite için gereken konsantrasyondan daha düşük olabilir (Wataha, 2000). Dental döküm alaşımları, lokal dokularla uzun süre sıkı temas halinde olduklarından, alaşımla doku arasında mikro çevre oluşur. Restoratif kronlar genellikle gingival seviyenin altına uzanarak, gingiva ile alaşım arasında bir sulkus oluşturur. Eğer alaşımdaki elementler bu sulkusa salınırlarsa, tükürük ve diğer sindirim sıvılarıyla dilüe olmadıklarından, yüksek konsantrasyona ulaşabilirler (Wataha, 2000). Metal iyonlarının lokal toksisitesi TC 50 (toksik konsantrasyon) değeri ile ölçülür (Çizelge 1.5). Bu değer, hücresel olayların gerçekleşmesinde gereken enerjinin sağlanmasından sorumlu olan mitokondriyal aktiviteyi % 50 oranında azaltan iyon konsantrasyonudur. Metal iyonlarına 24 saat maruz bırakılarak belirlenmiş olan TC 50 değerleri, hücre tipine ve toksisite parametresine göre 6 µmol / L den 3000 µmol / L e kadar değişkenlik gösterir (Wataha, 2000). 12

23 Çizelge1.5. Dental döküm alaşımlarına katılan metal iyonlarının TC 50 değerleri (Schmalz, 2002) Metal İyonları TC 50 Ag +1 AgNO Au +3 HAuCl 4.3H 2 O 21 Cd +2 CdCl 2 10 Co +2 CoCl 2.6H 2 O 100 Cr +3 CrCl 2.6 H 2 O 1790 Cu +2 CuCl 2.2 H2O 139 Ga +3 GaCl Hg +2 HgCl 2 11 In +3 InCl Mn +2 MnCl 2.4H2O 556 Mo +5 MoCl Ni +2 NiCl 2.6H 2 O 188 Pd +2 PdCl Pt +6 H 2 PtCl 6 33 Sn +2 SnCl 2.2H 2 O 3110 Zn +2 ZnCl 2 7 Düşük TC 50 değerlerine ve yüksek salınma oranına sahip elementler biyolojik açıdan daha zararlıdır. Artan salınım süresi, toksisiteyi arttırırken TC 50 değeri azalır. Metal, hücreyle ne kadar uzun süre temas ederse hücrede zararın oluşması için o kadar düşük miktarda metal iyonu gerekir. Bu nedenle, uzun süre boyunca element açığa çıkaran alaşımlar daha fazla lokal toksik etki oluşturmaya eğilimlidirler (Wataha, 2000). Bir metalin element ya da alaşım formunda olmasının toksik reaksiyonları üzerinde bir etkisinin bulunmadığı sonucuna varılmıştır. Ancak yüzey alanının artması, mekanik preparasyonun şekli, rezidüel streslerin varlığı ve yüzey temizliği gibi bazı lokal faktörlerin kimyasal etkileşimi arttırarak sitotoksik cevabı etkilediği düşünülmektedir. Materyalin partikül boyutu ne kadar küçülürse toksik cevap ihtimali de o derece artar. Bu nedenle dental alaşımın biyolojik uyumluluğuna karar verirken içerdiği elementlerin bilinen toksik 13

24 özelliklerine göre değil, alaşımın özelliklerine, hazırlanma şekline ve kompozisyonuna göre karar verilmelidir (Smith, 1982) Alerjik Etki Alerji ve aşırı duyarlılık terimleri immün sistemle ilgilidir. İmmün sistemin unsurlarından olan antijen, alerjik reaksiyonu oluşturan proteindir. Antijene ilk maruz kalındığında, antijene karşı organizmayı savunmak amacıyla oluşturulan protein ise antikordur. Bazı durumlarda immün reaksiyonlar, koruyucu ve iyileştirici olmaktan çıkarak doku ve organlar için zarar verici nitelik kazanabilirler. Optimum immün cevabın aksine, antijene karşı organizmanın oluşturduğu bu zarar verici immün cevaba alerji ve aşırı duyarlılık (hipersensitivite) denmektedir (Güven, 1995; Kılıçturgay, 1994). İmmünolojide bir diğer unsur haptenlerdir. Kimyasal madde yapısındaki haptenler tek başlarına immün cevap meydana getirmeyip, proteinle birleşerek antijenik yapı oluştururlar (Güven, 1995). Metal iyonları organizmada hapten olarak rol oynarlar; protein, nükleik asit ya da karbonhidrat moleküllerine bağlanarak alerjiye yol açarlar (Wataha, 2000). Alerjik reaksiyonlar sıklıkla toksik reaksiyonlarla karıştırılırlar. Alerjik reaksiyonlar dozdan bağımsız oluşur. Düşük dozlar immün hücreleri aktive ederek alerjik reaksiyon oluştururken toksisiteye yol açmaz (Wataha, 2000). Toksisiteden farklı olarak alerjik reaksiyonlar ilk karşılaşmada görülmez. Toksik reaksiyonlar bireyler arası farklılık göstermezken, alerjik reaksiyonlar ayrı bireylerde farklı, ayrıca aynı bireyde değişik zamanlarda değişik etki gösterebilir (Güven, 1995) Mutajenik ve Karsinojenik Etki Mutajenite DNA nın çift sarmal yapısındaki değişikliktir. Karsinojenite ise DNA daki değişiklik sebebiyle hücrenin bölünme ve büyüme işlevini yerine 14

25 getirememesidir. Karsinojenite mutasyonlar sonucu oluşur; ancak, tüm mutasyonlar karsinojeniteye neden olmaz. Rutin olarak DNA da birçok mutasyonlar oluşmaktadır. Ancak vücudumuz bu mutasyonları tamir edecek çok çeşitli mekanizmalara sahiptir. Metaller, direkt olarak DNA da mutasyonlara neden olacak şekilde etki etmezler; ancak, DNA yı değiştirecek serbest radikallerin oluşmasına neden olabilirler (Wataha, 2000). Karsinojenite veya mutajenitenin oluşması için alaşımdan element salınımı gereklidir.bu nedenle, bir metalin karsinojenite veya mutajenite oluşturabilmesi direkt olarak korozyonla ilgilidir. Ayrıca metalin formu da mutajenik aktivitede rol oynar. Örneğin, kromun oksidasyon durumu mutajenik potansiyelini etkiler. Cr +3 mutajen değilken, Cr +6 mutajen özellik gösterir. Metal iyonun moleküler formu da mutajenitede önemlidir. Nikel iyonları tek başına zayıf mutajenken, nikel subsülfit yüksek seviyede mutajendir (Wataha, 2000). Restorasyon nedeniyle ağızda kullanılan materyallere karşı gelişen immünnonimmün, allerjik ve kronik inflamatuar yanıtların değerlendirilebilmesi için araştırmaların, hücresel düzeyde ve moleküler biyolojik yaklaşımlarını da içermesi önem taşımaktadır Dental Materyallerin Biyouyumluluk Değerlendirme Yöntemleri Dental materyallerin biyolojik uyumluluklarını değerlendirmek için çok sayıda yöntem geliştirilmektedir. Standart değerlendirme metodlarına göre çeşitli metodları kullanarak sonuçlar değerlendirilmeye çalışılmaktadır. Biyolojik uyumluluk testleri, 1- İn vitro testler (Öncül testler ) 2- İn vivo hayvan deneyleri (İkincil testler) 3- Kullanım testleri olarak sınıflandırılabilir. 15

26 İn vitro testler; materyalin toksik profilini veren testlerdir. Sonuçlarının in vivo koşulların sonuçlarıyla bağıntısının kurulması güç olsa bile, kontrollü olması ve tekrarlanabilirliği ile in vitro hücre kültürü deneyleri, potansiyel biyolojik zararların analizine dayanmaktadır. İn vivo hayvan deneyleri; değerlendirilecek materyalin subkutan, kas ya da kemik içerisine yerleştirildikten sonra doku cevabının incelenmesine dayanır. Kullanım testleri; in vitro ve in vivo testlerde güvenilirliği kanıtlanmış bir materyalin insanlarda klinik kullanılımı takiben, materyale karşı gelişen cevapların gözlenmesi esasına dayanır (Browne, 1988; Craig ve Hanks, 1988; Schmalz, 1988; Phillips, 1991; Hanks ve ark., 1996; Schmalz ve ark, 1996; Wataha, 1996; Nelson ve ark., 1999a) İn Vitro Test Yöntemleri Dental materyallerin olası toksik etkilerinin in vivo değerlendirilmesindeki kısıtlamalar, in vitro test yöntemlerinin geliştirilmesini zorunlu kılmıştır (Browne, 1988). İn vivo değerlendirme yöntemlerinin doğasından kaynaklanan sorunları içermeyen, kontrollü deney şartlarında yürütülen, tekrarlanabilir ve hızlı sonuç alınabilen in vitro test yöntemleri; aynı zamanda dental materyallerin ağız içerisine uygulanmalarından hemen sonraki kısa periodda meydana getirdikleri toksik etkilerinin gösterilmesinde de önemli rol oynarlar (Browne, 1988; Schmalz, 1994). Bununla beraber, in vivo testler ve kullanım testleri karşılaştırılan çalışmalara bakıldığında, in vitro testlerin uygunluğu ile ilgili tartışmalar da vardır. Bu tartışmalar, özellikle in vitro deneylerin nispeten kısa süreli olması üzerinde yoğunlaşmaktadır (Craig ve Hanks, 1988; Craig ve Hanks, 1990; Wataha ve Lockwood, 1998). Ancak alaşımları biyolojik ortamda ve vücut sıcaklığında bir 16

27 aydan uzun süre tutmak mikroorganizmalarla kontaminasyon ve ortam bileşenlerinin azalması gibi nedenlerle uygun değildir (Wataha ve Lockwood, 1998). Kültüre edilmiş hücrelerle ilgili sınırlamalar yüzünden pek çok deney 168 saatten kısadır (Niemi ve Hensten-Pettersen, 1985; Craig ve Hanks, 1988; Craig ve Hanks, 1990; Wataha ve Lockwood, 1998; Wataha ve ark., 1999a). İn vitro biyouyumluluk değerlendirmelerinde sitotoksisite testleri, en yaygın kullanılan test yöntemidir (Hanks ve ark., 1996). Sitotoksisite testleri, test edilecek materyalin, uygun hücre kültüründe, negatif ve pozitif kontrol materyali kullanılarak, hücre büyüme oranı ve hücre ölümü esas alınarak değerlendirme yapılan bir in vitro test yöntemidir (Hensten-Pettersen, 1988; Kansu, 1991). Sitotoksisitenin belirlenmesinde kullanılan in vitro test yöntemleri ISO standartlarına göre aşağıdaki gibi sınıflandırılmıştır: 1. Agar diffüzyon testi 2. Filtre diffüzyon testi 3. Direkt temas ya da ekstrakt testi 4. Dentin Bariyer Testi Aynı standartlara göre özel kullanım alanına sahip testler ise: 1. Akut sistemik toksisite - oral uygulama (ISO ) 2. Akut sistemik toksisite - inhalasyon yoluyla (ISO ) 3. Subkronik sistemik toksisite- oral uygulama (ISO ) 4. Deri irritasyonu ve intrakutanöz reaktivite(iso ) 5. Sensitizasyon (ISO ) 6. Subkronik sistemik toksisite- inhalasyon yoluyla (ISO ) 7. Genotoksisite (ISO ) 8. İmplantasyon sonucu lokal etkiler (ISO ), olarak belirtilmiştir. 17

28 Farklı yöntemlere sahip bu sitotoksisite testlerinin her biri üç temel faktöre göre yürütülür: - Biyolojik sistem - Hücre-materyal teması - Değerlendirme yöntemi (Schmalz, 1994) Biyolojik Sistem İn vitro sitotoksisite testlerinde biyolojik sistem olarak hücre kültürleri, organ kültürleri ve hücre organelleri kullanılmaktadır (Schmalz, 1994). Hücre, içinde çekirdeğin ve diğer organellerin bulunduğu bir sitoplazma kitlesinden oluşmaktadır. Hücrenin % ini su, % 15 ini protein (yapısal proteinler, enzim ve aminoasitler), % 3 ünü yağ, % 1 ni elektrolitler oluşturur. Çeşitli dokularda yer alan hücreler yassı, oval, armut, ipliksi ya da çok sayıda uzantılı olarak görülebilirler. Hücrelerin büyüklükleri çaplarıyla ölçülür ve μ arasında değişir (Erkoçak, 1983; Tekelioğlu, 1989; Soydan, 1992). Bu yapı içinde, canlılığın devamını sağlayacak tüm fizyolojik ve kimyasal olaylar gerçekleşir. Hücre organelleri; çekirdek, çekirdekçik, hücre membranı, endoplazma retikulumu, golgi cisimciği, mitokondri, lizozom, ribozom, sitosol, vakuol ve veziküller, granüller ve değişik hücre tiplerine göre bulunan diğer bazı yapıları içerirler. Çekirdek biyosentez olaylarını kontrol eden informasyonel makromolekülleri (haberci RNA, ribozomal RNA, taşıyıcı RNA) kapsar, hücre metabolizmasında ve fonksiyonunda dolaylı rol oynar. Çekirdekçik RNA, DNA ve bunlara bağlı proteinlerden oluşmuş membransız bir yapıdır. Profaz sırasında oluşan kromozomların yapısına katılırlar. 18

29 Membranlar lipoprotein yapıda olup, hücrenin farklı fonksiyonel bölümlerini birbirinden ayırır. Hücre enzimlerinin çoğu, bu membranlar üzerindedir. Hücre membranı, hücre içi ve dışı ortam arasında farklı yapı ve iyon konsantrasyonunun korunmasını sağlar, seçici geçirgen bir yapıdır. Çekirdek membranı ise sitoplazmayla nükleoplazmayı birbirinden ayırır. Endoplazma retikulumu, granüllü ve granülsüz olmak üzere iki tiptir.granüllü endoplazma retikulum protein sentezinde görevlidir. Golgi cisimciği, endoplazma retikulumunda yapılan salgının toplanıp yoğunlaşarak vezikül ve granüller halinde hücreden boşaltılmak üzere sitosol içine verilmesinde rol oynar. Mitokondrilerin büyük kısmı protein, geri kalanı lipittir. Hücrenin solunum merkezi ve her çeşit hücre olayı için gerekli enerjinin üretilmesinde görevlidir. Hücre enzimlerinin % si mitokondride yer alır. Lizozom, proteolitik enzimleri içeren organellerdir. Normal koşullarda lizozom yüzey membranı, lizozom enzimlerinin sitosol içine geçmesine engel olur. Ölü hücrelerde bu enzimler membranı geçerek sitoplazmaya dağılır. Ribozom, sitoplazma proteinlerinin sentezinde rol oynarlar. Su, RNA ve proteinden oluşurlar. Sitosol, hücre iskeletini yapar. Mikrotübülüsler, mikrofilamanlar ve ara filamanlardan oluşan üç tip lif grubunu içerir. Bu yapılar, hücrenin şeklinin korunması, hücresel hareketlerin düzenlenmesi, hücre içi organel ve vezikül taşınması gibi fonksiyonlara sahiptir (Darnell ve ark., 1990). Vakuol ve veziküller membran ile sınırlanmiş sitoplazma boşluklarıdır. Granüller, içerisinde bazı maddelerin toplandığı, yoğunluğu değişken olan veziküllerdir (Erkoçak, 1983; Tekelioğlu, 1989; Darnell ve ark., 1990). 19

30 Doku; belli bir faaliyeti yapmak üzere, aynı yapısal özelliklere sahip hücrelerin bir araya gelmesi ile oluşan yapıdır. Görünüş, yapı ve fonksiyon bakımından 4 tip doku mevcuttur. Bunlar; epitel dokusu, bağ doku, kas dokusu ve kemik dokusudur. Bağ dokusunun sabit ve en çok bulunan hücreleri fibroblastlardır. İnaktif fibroblastlara fibrosit denir. Fibroblastlar protein ve mukopolisakkarit sentezi yaparak, bağ dokusu liflerini ve hücreler arası maddeyi meydana getirirler. İltihap bölgeleri, yara yerleri ve çeşitli patolojik etkenlere bağlı doku harabiyeti bölgelerinde yeni bağ dokusu yapımı fibroblastlar tarafından sağlanır (Erkoçak, 1983). Hücrelerin ya da dokuların hipertrofi, atrofi gibi geri dönüşümü olan ve nekroz (denetimsiz hücre ölümü) ve apopitoz (programlı hücre ölümü) gibi geri dönüşümü olmayan değişik fizyolojik durumları vardır. Nekroz; hipoksi, aşırı ısı değişiklikleri, toksinler gibi daha çok hücre dışından gelen çeşitli fiziksel ve kimyasal etkenler sonucunda gelişen travmatik hücre ölümüdür. Apopitoz ise yaşlanmış, fonksiyonunu yitirmiş, düzensiz gelişmiş veya genetik olarak hasarlı hücrelerin, organizma için güvenli bir şekilde yok edilmelerini sağlayan ve genetik olarak kontrol edilen programlı hücre ölümüdür. Nekroz patolojik bir olaydır. Apopitoz ise fizyolojik veya patolojik uyaranlarla oluşabilir (Öztürk, 2002). Fizyolojik olayların meydana gelmesinden önce ortaya çıkabilecek hücre içi metabolik aktivitelerin şiddeti oldukça önemlidir. Kültür hücreleri, dental materyallerin sitotoksisite değerlendirmelerinde en yaygın olarak kullanılan biyolojik sistemdir. Kültür hücreleri ya ticari olarak kültürlerden elde edilen hücre dizileri ya da doku parçalarından izole edilen hücrelerden elde edilmektedir (Schmalz, 1994). Bu hücre dizilerine insan pulpa, gingiva, deri hücreleri, periodontal membran, embriyo akciğer hücresi, epitel (NCTC 2544) ve ağız epiteli kültüre fibroblastları, insan epitel hücresi 20

31 (HeLa), mürin hücre dizileri (C3H-L, Balb/c 3T3, L929), T-Lenfosit hücresi, maymun, tavşan, öküz pulpa hücreleri, hamster ve maymun yanak epitel hücresi ve Afrika yeşil maymun böbrek epitel hücresi (VERO) örnek gösterilebilir. Bu hücreler biyouyumluluğu değerlendirilen materyale karşı ölçülebilir ve kolay gözlemlenebilir reaksiyonlar meydana getirirler (Wataha ve ark., 1994a; Cenni ve ark., 1999). Dental materyallerin in vitro hücre kültürü testlerinde kullanılmak üzere ISO :1999 ( E ) de önerilen hücreler ise; American Type Culture Collection CCL 1 (NCTC clone 929 fare fibroblast hücresi (Woody ve ark., 1977; Wennberg, 1988; Wataha ve ark, 1994a; Schedle ve ark., 1995; Schmalz ve ark., 1998; Wang ve Li, 1998; Sjögren ve ark., 2000), CCL 163 (Balb/c 3T3 clone A31 fare embriyo fibroblast hücresi) (Craig ve Hanks, 1990; Wataha ve ark, 1992a; Wataha ve ark, 1993a; Wataha ve ark, 1994a,b; Wataha ve ark, 1995a,b; Nelson ve ark, 1999a,b; Wataha ve ark, 1999a,b,c; Nelson ve ark., 2001; Wataha ve ark, 2002a; Al-Hiyasat ve ark, 2002; Al-Hiyasat ve ark, 2003a,b; Al-Hiyasat ve ark, 2005), CCL 171 (MRC-5, insan embriyo akciğer fibroblast hücresi), CCL 75 (WI-38, insan embriyo akciğer fibroblast hücresi) (Wataha ve ark, 1994a), THP-1 insan monosit makrofajları (Wataha ve ark, 1995c; Wataha ve ark, 1996; Edwards ve ark., 1998; Wataha ve ark, 1999a; Wataha ve ark, 2000; Wataha ve ark, 2002b; Heil ve ark., 2002), insan epitelyal hücreleri (Niemi ve Hensten-Pettersen, 1985; Exbrayat ve ark., 1987; Wennberg, 1988), insan mast hücreleri (Schedle ve ark., 1995), CCL 81 (VERO [Afrika yeşil maymun böbrek epitel hücresi]), CCL 10 [(BHK-21) C-13 hamster böbrek fibroblast hücresi] ve V A (Çin fare karaciğer fibroblast hücresi), ROS 17/2.8 (Wataha ve ark, 1994a), P338D1 fare makrofajları (Wataha, 1995c), NIH 3T3 fibroblastları (Hornez ve ark., 2002 ), L132 (Hornez ve ark., 2002), KB hücre dizisi (Huang ve ark, 2001) dir. Hücre kültürlerinin kullanıldığı test sistemlerinde hücre tipleri; mortal (sonlu, primer, diploid) hücre kültürleri ve immortal (ölümsüz, devamlı) hücre kültürleri olarak kullanılmaktadır (Hensten-Pettersen, 1988; Schmalz, 1994). 21

32 Primer hücreler, laboratuarlarda doku eksplantlarından elde edilirler, yavaş büyürler ve yaşam süreleri sınırlıdır (Schmalz, 1994). Spesifik metabolik potansiyele sahip olduklarından in vivo şartlara daha yakın deney koşulları sağlarlar (Arenholt-Bindslev ve Blegg, 1990). Devamlı hücre kültürleri, standart kültür örnekleri olan embriyonik veya malignant hücrelerden üretilerek standardize edilmiş ve kodlanarak kullanıma hazırlanmışlardır (Browne, 1988; Schmalz, 1994). Primer hücrelere göre daha basit şekilde çoğalırlar ve uygun şekilde pasajlandıkları sürece sınırsız yaşam süresine sahiptirler (Schmalz, 1994) Hücre-Materyal Teması İn vitro sitotoksisite testlerinde hücre-materyal teması; direkt veya indirekt şekilde materyalin kendisinin veya materyal yapısından salınan bileşenlerin kullanılması ile sağlanmaktadır. Direkt hücre-materyal teması uygulanan testlerde hücreler materyalin yanında veya üzerinde bulunurlar (Wennberg ve ark., 1979; Schmalz, 1988). Bu testler dişeti, pulpa, periapikal dokular gibi canlı dokularla temas halinde bulunan dental materyallerin etkilerini taklit etmek amacıyla düzenlenirler (Schmalz, 1994). İndirekt temas testlerinde materyal ve hücreler bir bariyer yardımıyla ayrılmışlardır. Bu testler, dolgu maddelerinin canlı dokulardan dentin veya smear tabakası gibi bir bariyer ile ayrıldığı durumları taklit edebilmek için kullanılır. Bu sistemde agar, agaroz veya selüloz asetat filtre gibi maddeler bariyer olarak kullanılır (Schmalz, 1994). 22

33 Hücre-materyal temasını sağlamanın bir başka yolu, dental materyallerin belirli bir zaman periodu boyunca, besi ortamı gibi sıvı bir ortamda bekletilmesi ve testlerde materyalin kendisi yerine bu sıvının kullanılmasıdır (Akpınar, 2001). İn vitro hücre kültürü deneylerinde, hücrelerin yaşatılması için açık ya da kapalı sistem inkübatörü kullanılmaktadır. Açık sistemde kültür ortamı ile inkübatör içindeki hava ilişkidedir. Ortama, sisteme bağlı bir tüpten CO 2 gelir. Hücrelerin yaşatılması için gerekli 37 ºC lik, % 5 CO 2 li, % 95 nemli ortam sağlanmış olur. Uzun süreli kültürlerde mutlaka açık sistem inkübatörü kullanılmalı ve metabolizma artıklarının uzaklaştırılması için kültür vasatı birkaç gün arayla yenilenmelidir. Kapalı sistemde, kültür kaplarının ağzı hava almayacak şekilde sıkıca kapatılır. Bu yüzden ortama CO 2 verilmesine ihtiyaç yoktur. Kısa süreli kültürlerde kullanılır.hücreler kültür kaplarına aseptik şekilde ekildikten sonra, kültür vasatı ilave edilir. Kültür vasatının besleyici madde karışımını proteinler, vitaminler, tuzlar, büyüme faktörleri, glikoz, metabolitler, mineraller, polipeptitler, organik maddeler ve inhibitörler oluşturur. Mikrobiyal gelişimi engellemek için antibiyotikler ve antifungal ilaçlar katılır. Bu amaçla pek çok hücre kültürü çalışmasında hücre çoğalma periodu sırasında fetal ya da yeni doğan calf serumu kullanılmaktadır (Erkoçak, 1983; Hensten-Pettersen, 1988; Akpınar, 2001) Değerlendirme Yöntemleri Sitotoksisite değerlendirme testlerinde, hücre morfolojisinde, hücre membranında, hücre aktivitesindeki ya da değişikliklere hücre proliferasyon oranlarındaki değişiklere göre değerlendirme yapılabilmektedir (Schmalz, 1994). 23

34 Hücre aktivitesini değerlendiren test sistemlerinde bir enzim ya da enzim grubunun veya bir maddenin ölçülmesi ile değerlendirme yapılmaktadır (Schmalz,1994). Sitoplazmik bir enzim olan LDH (Laktat Dehidrojenaz), membran bütünlüğüne zarar verebileceğinden membran bütünlüğünün değerlendirildiği testlerde kullanılmaktadır (Messer ve Lucas, 1999). Mitokondriyal aktivitenin incelenmesiyle hücre canlılığının değerlendirilmesinde, SDH (Süksinik Dehidrojenaz) enziminin ölçülmesine yönelik MTT (3-{4,5-dimethylthiazol-2-yl}-2,5-diphenyltetrazolium bromide) testi (Wataha ve ark., 1992a; Wataha ve ark., 1993a; Wataha ve ark., 1994a,b; Wataha ve ark., 1995a,b,c; Schmalz ve ark., 1998; Wataha ve ark., 1999a,b,c; Nelson ve ark., 1999a,b; Sjögren ve ark, 2000; Huang ve ark., 2001; Heil ve ark., 2002; Wataha ve ark., 2002a,b; Al-Hiyasat ve ark, 2002; Al-Hiyasat ve ark, 2003a,b; Al-Hiyasat ve ark, 2005); protein sentezi (Wataha ve ark, 1995; Messer ve Lucas, 1999), RNA ve DNA sentezi (Messer ve Lucas, 1999); nötral kırmızının lizozom içine alınmasıyla lizozomal aktivitenin değerlendirilmesi (Messer ve Lucas, 1999); lusiferin- lusiferaz reaksiyonu esnasında salınan fotonların ölçülmesi ile intrasellüler ATP seviyesinin değerlendirilmesi (Messer ve Lucas,1999) hücre aktivitesini belirleyen testlere örnek olarak verilebilir. Materyallere karşı gelişen inflamatuar ve immün reaksiyonlar da, sitotoksisite değerlendirmelerinde kullanılmaktadır (Wataha ve ark., 1996; Edwards ve ark., 1998; Wataha ve ark., 2000) Tüm sitotoksisite testlerinde takip aralığı, bitiş noktası ve kayıt metodu seçimlerinde, hedeflenen veriye bağlı olarak modifikasyonlar yapılmaktadır (Schmalz, 1994). 24

35 1.4. Spektrofotometri Spektrofotometri; ışığın dalga boyu fonksiyonu olarak, bir cisim tarafından geçirilen ya da yansıtılan radyant enerjinin ölçümüdür. Spektrofotometre moleküller tarafından absorbe edilen radyant ışık enerjisinin miktarını ölçen cihazdır. Spektrofotometrelerin görünür ışık ( nm), ultraviole ( nm) ve infrared dalga boylarında ölçüm yapabilme özelliklerine sahip çeşitleri bulunmaktadır. Spektrofotometrenin 5 temel komponenti; ışık kaynağı, prizma ya da dağıtma ızgarası, açıklık, dedektör (fotoelektrik tüpü) ve sonuçları okuyup kaydeden dijital sayıcıdır. Işık ışınları, prizma ya da dağıtma ızgarasından yansıtıldıktan sonra dalga boylarına ayrılarak birbirlerinden uzaklaşırlar. Işınlar, açıklıktan geçtikten sonra fotoelektrik tüpüne ulaşır ve tüpe çarpan fotonların sayısıyla orantılı olarak bir elektrik akımı oluşur. Fotoelektrik tüpüne eğer bir dijital sayıcı bağlı ise elektrik akım değerleri ışık geçirgenliği yüzdesi ya da optik dansite birimleri olarak ölçülüp kaydedilebilir (Louisiana State University, 2007). Optik dansite, geçen ışığın miktarının ölçümüyle bir materyaldeki maddenin rölatif miktarının ölçülmesini ifade eder (Wikipedia, 2007). 25

36 1.5. Amaç Dental alaşımlarda ekonomik şartları düşürme, daha gelişmiş mekanik özellik ve üstün biyolojik güvenilirlik gerekliliği günümüzde hala materyaller üzerindeki çalışmaların sürdürülmesine neden olmaktadır. Dental materyallerin kimyasal yapılarının komplike oluşu ve özellikle biyolojik problemleri materyal teknolojisini üzerinde ileri çalışmaları gerektirmektedir. Teknolojik gelişmeler diş dokularının sağlığının ve bütünlüğünün korunması için yeni yöntemlerin bulunmasını zorunlu kılmaktadır. Diş hekimliğinde materyallerin sıklıkla kullanım gerekliliği materyal-canlı doku arası ilişkinin uyumlu olmasını gerektirmektedir. Protetik restorasyonlarda kullanılan materyallerin bileşimlerinde bulunan elementlerinin metalurjik yapılarında diğer elementlerle etkileşimleri veya bulundukları ortam değişiklikleri nedeniyle korozyona uğrayıp stabil özellik gösterememesi, canlı doku-materyal ilişkisinin incelenmesini zorunlu kılar. Dental alaşımların biyolojik etkileri, çoğunlukla materyalin, canlı hücre dizileri ile direkt temasta olduğu hücre kültürü ortamlarında sitotoksisite incelemeleri ile araştırılmaktadır. Bu bilgilerin ışığı altında çalışmamızda, yüzey pürüzlülüğü, metal iyon konsantrasyonu ve sürenin canlı doku-materyal arasında önemli olduğu hipotezi ile bir metal alaşımı ve alaşımları oluşturan elementlerin iyon hallerinin canlı doku-materyal arası ilişkisinin belli sürelerde ortaya konması amaçlanmıştır. Hücre kültürü ortamında kumlanmış ve parlatılmış bir temel metal (Ni-Cr) alaşımı ile alaşımların yapısına katılan Ni, Cr, Co, Ag, Cu, Zn, Mo, Be elementlerinin değişik konsantrasyonlarda çözeltileri kullanılarak L929 fare fibroblast hücrelerinin 24. ve 72. saatlerde metabolik aktivitesi spektrofotometrik analizler ile ortaya konmuştur. Hücrelerin canlılığını biyolojik açıdan değerlendiren bulgularımızın, materyal teknolojisi üzerine katkıda bulunacağı düşünülmektedir. 26

37 2. GEREÇ ve YÖNTEM Dental alaşım ve alaşımların yapısına giren elementlerin hücresel metabolizma üzerine etkisini in vitro hücre kültürü ortamında hücre canlılığını inceleyerek değerlendirmeyi amaçlayan çalışmamız, Ankara Üniversitesi Diş Hekimliği Fakültesi Protetik Diş Tedavisi Anabilim Dalı, Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Viroloji Anabilim Dalı ve Gazi Üniversitesi Fen Fakültesi Kimya Bölümü laboratuarlarında yürütüldü Metal İyon Çözeltilerinin Hazırlanması Derişik ve seyreltik konsantrasyonlarda metal iyon çözeltilerinin hazırlanabilmesi için ticari olarak satın alınan (Resim 2. 1 ve Resim 2.2) Ni, Cr, Co, Ag, Cu, Zn, Mo, Be metal iyon tuzları (Riedel-de Haën, Sigma-Aldrich GmbH Seelze, Germany) kullanıldı. Resim 2.1. Ticari metal tuzları 27

38 Resim 2.2. Metal iyon tuzları Bu metal tozları, derişik ve seyreltik konsantrasyonlar için 1000 ml su içine ölçülerek konuldu. Ni, Cr, Co, Cu, Zn, Mo metal iyonları klorid çözeltisinden elde edilirken, Ag ve Be iyonları sülfat çözeltisinden hazırlandı. Çalışmamızda kullanılan metal iyonları, hazırlanan çözeltiler, derişik ve seyreltik konsantrasyonları Çizelge 2.1. de gösterilmektedir. Çizelge 2.1. Metal iyonları, hazırlanan çözeltiler ve konsantrasyonlar Metal İyonları Çözeltiler Konsantrasyonlar (µmol/ L) Ni +2 NiCl 2.6H 2 O Cr +3 CrCl 3.6H 2 O Co +2 CoCl 2.6H 2 O Ag +1 Ag 2 SO Cu +2 CuCl 2.2H 2 O Zn +2 ZnCl 2.6H 2 O 1-50 Mo +5 MoCl Be +2 BeSO 4.4H 2 O

39 2.2. Metal Örneklerin Hazırlanması Çalışmamızda, Çizelge 2.2. de içerdiği elementlerin ağırlık yüzdeleri belirtilen Ni-Cr temel metal alaşımının (Wiron 99 [Bego, Bremen, Germany]) (Resim 2.3) sitotoksik değerlendirmeleri yapıldı. Çizelge 2.2. Ni-Cr temel metal alaşımı içindeki elementler ve ağırlık yüzdeleri Cr Ni Mo Fe Si C Ce Nb Resim 2.3. Ni-Cr (Wiron 99) metal alaşımı Temel metal alaşımı örnekleri, ISO standardına göre sitotoksisite deneyleri için uygun olan 5 mm çapında ve 2 mm yüksekliğinde, ortasında 1 mm çap ve 7 mm yüksekliğinde tutucu kısım bulunan pirinç metal örneklerden (Resim 2.4) hazırlandı. 29

40 Resim 2.4. Pirinç metal örneği Bu pirinç modelden silikon esaslı elastomerik ölçü maddesi (Panasil Contact Plus-PC-Kettenbach, Eschenburg, Germany) kullanarak 32 adet mum örnek hazırlandı. Mum eritme tekniği ile, Unicast (VOP Co., Botevgrad, Bulgaristan) indüksiyonlu döküm makinesinde, üretici firma tarafından önerilen eritme ve döküm ısıları kullanılarak, metal örnekler hazırlandı. Hazırlanan 32 metal örnekten 16 tanesine bilinen tesviye ve parlatma işlemleri yapıldı. Geri kalan 16 örneğe ise, tesviye işlemini takiben 250 µm lik Al 2 O 3 ile kumlama uygulandı. Örnek yüzeylerindeki kalıntıları uzaklaştırmak için % 70 lik etanol içerisinde 15 dakika ultrasonik temizleme yapıldı. Örnekler distile suyla durulandıktan sonra, otoklavda (Heraeus Ins) 125 ºC de 30 dakika steril edilip, 72 saat 40 ºC de etüvde (Heraeus Ins) kurumaya bırakıldı Hücre Kültürünün Hazırlanması İn vitro sitotoksisite incelemelerinde hücre kültürü, canlı hücre ve bu hücrelerin gelişiminin devam ettirileceği ortamın konulduğu 96 göz hücre kültürü tabletlerinde ( Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO, USA) yürütüldü. 30

41 Deneylerde L929 fare fibroblast hücreleri (NCTC clone 929, ATCC CCL1, American Type Culture Collection, Rockville Md.) kullanıldı ve kullanılacak düzeye çoğaltılmaları amacıyla subkültürleri yapıldı. Hücre kültürünün hazırlanması için öncelikle hücre kültürü tabletlerinin herbir gözüne / ml olacak şekilde hücreler konuldu. Tabletlere hücrelerin canlılıklarını devam ettirilebilmesi için DMEM (Dulbecco s Modified Eagle s Medium, ph 7.4, Sigma, USA), % 10 FBS (Fetal Bovine Serum) ve kristalize streptomisin sülfat 100 ml / 2 gr, kristalize penisilin G potasyum 100 ml / 2 milyon IU ilave edilerek 37 ºC de % 5 CO 2 li ve % 97 nemli ortamda 24 saat inkübe edildi Deney İnkübasyonu takiben derişik ve seyreltik konsantrasyonlarda hazırlanan metal iyon çözeltileri, 2 nm lik enjektör filtreden süzüldükten sonra her bir göze 100 µl hacimde olacak şekilde hücre kültürü tableti gözlerine ayrı ayrı konuldu (Resim 2.5). Seyreltik ve derişik metal iyon çözeltisi için hücre kültürü tabletinde 64 göz kullanıldı. Metal iyon çözeltilerinin derişik ve seyreltik konsantrasyonları 24. ve 72. saatler için 4 ayrı hücre kültürü tabletinde yürütüldü. Kontrol grubu için hazırlanan 8 göze metal iyon çözeltisi konulmadı. 31

42 Resim 2.5. Metal iyonu çözeltileri yerleştirilmiş 96 göz hücre kültürü tableti Canlı hücre-metal iyon temasının 24. ve 72. saatleri sonunda sıvı ortam uzaklaştırılarak hücreler % 10 luk formaldehit ile fikse edildi. Daha sonra yıkanan hücreler kristal viyole (Merck, Germany) ile 20 dakika süresince boyandı. Boyama sonunda tekrar yıkanan hücre kültürü tabletlerinin gözlerine, her bir göze 100 µl olacak şekilde % 70 lik etil alkol ilave edilip oda ısısında 5 dakika bekletilerek incelemeler yapıldı (Resim 2.6). Resim 2.6. Metal iyon çözeltileri ile temasta olan kristal viyole ile boyanmış hücreler 32

43 Hücre kültürü tabletlerinde kristal viyole ile boyanan canlı hücrelerin optik dansitesi spektrofotometrede (ELISA; Multiscan Plus, Helsinki, Finland) 492 nm dalga boyu kullanılarak değerlendirildi (Resim 2.7). Resim 2.7. Spektrofotometre Parlatılmış ve kumlanmış metal örnekler ile yürütülen deneylerde metal örnekler, 24 göz hücre kültürü tabletinin her gözüne 0.5 ml olacak şekilde hücre içermeyen DMEM içerisine yerleştirilip (Resim 2.8) 72 saat boyunca, 37 ºC de % 5 CO 2 içeren etüvde bekletildi. Kumlanmış ve parlatılmış metal örnekler için hücre kültürü tabletinde ayrı ayrı 8 göz kullanıldı. Metal örneklerin incelenmesi 24. ve 72. saatler için 2 ayrı hücre kültürü tabletinde yürütüldü. Kontrol grubu için hazırlanan gözlere metal örnek konulmadı. 33

44 Resim 2.8. Metal örnekler yerleştirilmiş 24 göz hücre kültürü tableti Metal örnekler, 72 saat sonunda hücre kültürü tabletlerinden uzaklaştırıldıktan sonra tabletlerde kalan DMEM solusyonu, içinde 24 saat boyunca inkübe edilmiş L929 hücreleri bulunan 96 göz hücre kültürü tabletlerindeki DMEM alındıktan sonra her göze 100 µl olacak şekilde konuldu. Kumlanmış ve parlatılmış metal örnekler için de, 24. ve 72. saat sonunda metal iyon çözeltileri için izlenen protokol (Resim 2.9) uygulanarak, spektrofotometrik ölçümle optik dansite değerlendirildi. Resim 2.9. Metal örnekler ile temasta olan kristal viyole ile boyanmış hücreler 34