Doktora Tezi Biyoloji Anabilim Dalı Doç. Dr. Fatime GEYİKOĞLU 2007 Her Hakkı Saklıdır.

Transkript

1 POLİKLORLU BİFENİL BİLEŞİKLERİNİN Danio rerio NUN (ZEBRA BALIĞI) GELİŞİMİ ÜZERİNE ETKİLERİ Turgay ŞİŞMAN Doktora Tezi Biyoloji Anabilim Dalı Doç. Dr. Fatime GEYİKOĞLU 2007 Her Hakkı Saklıdır.

2 ATATÜRK ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ DOKTORA TEZİ POLİKLORLU BİFENİL BİLEŞİKLERİNİN Danio rerio NUN (ZEBRA BALIĞI) GELİŞİMİ ÜZERİNE ETKİLERİ Turgay ŞİŞMAN BİYOLOJİ ANABİLİM DALI ERZURUM 2007 Her Hakkı Saklıdır.

3 Doç. Dr. Fatime GEYİKOĞLU danışmanlığında, Turgay ŞİŞMAN tarafından hazırlanan bu çalışma, 25/05/2007 tarihinde aşağıdaki jüri tarafından Biyoloji Anabilim Dalı nda doktora tezi olarak kabul edilmiştir. Başkan : Prof Dr. Ö.Faruk ALGUR İmza : Üye : Prof. Dr. Osman ÖZDEN İmza : Üye : Prof. Dr. M. Cemal OĞUZ İmza : Üye : Doç. Dr. Fatime GEYİKOĞLU İmza : Üye : Doç.Dr. Muhammed ATAMANALP İmza : Yukarıdaki sonucu onaylarım. Prof. Dr. Mehmet ERTUĞRUL Enstitü Müdürü

4 ÖZET Doktora Tezi POLİKLORLU BİFENİL BİLEŞİKLERİNİN Danio rerio NUN (ZEBRA BALIĞI) GELİŞİMİ ÜZERİNE ETKİLERİ Turgay ŞİŞMAN Atatürk Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Biyoloji Anabilim Dalı Danışman: Doç. Dr. Fatime GEYİKOĞLU Bu çalışmada Poliklorlu Bifenil (PCB) bileşiklerinin Zebra balığının embriyolojik gelişimi, karaciğer histolojisi ve sensorimotor duyu hassasiyeti üzerine olan etkileri araştırıldı. Bu amaçla blastula safhasındaki balık embriyoları PCB bileşiklerinden PCB28, PCB52, PCB126, PCB153 ve PCB180 in değişik konsantrasyonlarıyla 5 gün süreyle temas ettirildi. Sınır belirleyici test ile ana testte kullanılacak olan doz aralığı belirlendi. 5-6 farklı dozda yapılan ana testte önce 48 saatlik uygulama sonucunda LD 50 değeri tespit edildi. Probit analizi kullanılarak tespit edilen LD 50 değerleri ise PCB28 için ppm, PCB52 için ppm, PCB126 için ppm, PCB153 için ppm ve PCB180 için de ppm olarak bulundu. İkinci aşamada subletal doz ile yapılan ana test neticesinde her beş PCB konjenerinin embriyolojik gelişimde gerilemeye, ölümlere, kalp ve perikardiyal alanda küçülmeye, kan dolaşımında yavaşlamaya, yumurtadan çıkan larva sayısında azalmaya ve çeşitli teratojenik etkilere (blastodermal lezyon, ekzogastrulasyon oluşumu, vitellus kesesi ödemi, kalp ödemi, pigmentasyonun oluşmaması ya da az oluşması, kranyofasyal malformasyonlar, vertebra sütun defekti, Lordoz, hava kesesinin gelişmemesi, anaxial vücut, boy kısalığı, kuyruk anormalliği) sebep olduğu gözlendi. Anormallik gösteren larvaların normal ortama alındıklarında çok fazla yaşamadıkları belirlendi. PCB bileşiklerine maruz kalmış anormallik gösteren 8 günlük larvalardan hazırlanan karaciğer preparatlarında lipid birikimi, hepatositlerde hipertrofi, hepatosit nukleuslarının sayısında azalma ve glikojen miktarında azalma gibi patolojik anormalliklere rastlandı. Sensorimotor duyu hassasiyeti için yapılan denemede ise PCB uygulanmış larvalarda paralizi (hareketsizlik ve yüzememe durumu) gözlendi. Araştırmamızda hem embriyotoksisite, hem patolojik ve hem de mekanik sensorite testi bulguları neticesinde, uyguladığımız PCB bileşiklerinin etki düzeylerinin aynı olmadığı tespit edildi. Sonuçta en etkili olandan en az etkili olana doğru yapılan sıralama şu şekilde ortaya çıktı: PCB126, PCB28, PCB52, PCB153, PCB180. Sonuç olarak, uygulaması yapılan PCB bileşiklerinin Zebra balığı embriyolarındaki LD 50 değerleri ilk kez bu çalışma ile tespit edildi. Ayrıca, bu bileşiklerin çalıştığımız balığın embriyolarının gelişimi üzerinde toksik etkilere neden olduğu ELS (Erken Hayat Devri), mekanik sensorite ve histopatolojik testlerle yine ilk kez bu araştırma ile ortaya kondu. Toksisitenin muhtemel etki mekanizmaları literatür ışığında tartışıldı. 2007, 107 sayfa Anahtar Kelimeler: PCB, Danio rerio, embriyo-larva, teratojenite, karaciğer histopatolojisi, sensorimotor duyu hassasiyeti i

5 ABSTRACT Ph. D. Thesis THE EFFECTS OF POLYCHLORINATED BIPHENYL COMPOUNDS ON THE DEVELOPMENT OF Danio rerio (ZEBRAFISH) Turgay ŞİŞMAN Atatürk University Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Biology Supervisor: Assoc. Prof. Dr. Fatime GEYİKOĞLU In this study, the effects of Polychlorinated Biphenyl (PCB) compounds on the development of embryos, histology of liver and sensorimotor sense sensitivity of Zebrafish were investigated. For this aim, the fish embryos at blastula stage were contacted with various concentrations of PCB compounds (PCB28, PCB52, PCB126, PCB153 and PCB180) for five days. The dose amounts used in main test and diagnostic limit test were determined. In the main test made in 5-6 different doses, firstly LD 50 value was established after 48 hour exposure. LD 50 values of PCBs calculated from probit analysis were ppm, ppm, ppm, ppm and ppm for PCB28, PCB52, PCB126, PCB153 and PCB180, respectively. In the second stage, as a result of the main test made with sublethal dose it was observed that the PCB congeners caused to regression of embryological development, mortalities, shrinking in the pericardial area and heart, slowness in blood circulation, decrease in hatching and various teratogenic effects (blastodermal lesion, exogastrulation, yolk sac edema, heart edema, nonpigmentation or weak pigmentation, craniofacial malformations, vertebra column defect, Lordosis, inhibition of swim bladder inflation, anaxial body, short length, tail malformation). When abnormal larvae were placed to normal medium, they were observed not to have survived for a long time. Pathological abnormalities such as lipidosis, hepatocyte hypertrophy, decreased number of hepatocyte nuclei and glycogen depletion were found in the liver preparats prepared from 8 days larvae which have showed abnormality and have been exposured to PCBs. In the test applied for sensorimotor sense sensitivity, the larvae subjected to PCBs were found paralysis (the situation that no movement and no swimming). As a result of findings of embryotoxicity, pathologic and mechanosensory test, it was observed that the influence levels of the PCB compounds were not same in the study. In the end, the arrangament made from the most effective PCB to the less effective PCB was that: PCB126, PCB28, PCB52, PCB153, PCB180. In conclusion, LD 50 values of the applications PCB compounds on Zebrafish embryos were determined in this study for the first time. Moreover, it was firstly introduced in this study that the compounds caused the toxic effects on the fish, by means of ELS (Early Life Stage), mechanosensory and histopathological tests. The possible influence mechanisms of the toxicity were discussed in accordance with literature. 2007, 107 pages Keywords: PCB, Danio rerio, embryo-larvae, teratogenicity, liver histopathology, sensorimotor sense sensitivity ii

6 TEŞEKKÜR Doktora Tezi olarak sunduğum bu çalışma, Atatürk Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi Biyoloji Bölümü nde yapılmıştır ve Atatürk Üniversitesi Fon Saymanlığı tarafından desteklenen BAP 2006/41 nolu PCB (Poliklorlu bifenil) Bileşiklerinin Danio rerio nun (Zebra Balığı) Gelişimi Üzerine Olan Etkileri adlı projenin bir kısmını oluşturmaktadır. Çalışmalarımda her türlü desteği sağlayan çok değerli hocam Sayın Doç. Dr. Fatime GEYİKOĞLU na (Atatürk Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi Biyoloji Bölümü) en içten teşekkürlerimi sunarım. Tez çalışmalarım boyunca yoğun işlerine rağmen benimle ilgilenip desteğini esirgemeyen değerli hocam Sayın Doç Dr. Muhammed ATAMANALP a (Atatürk Üniversitesi Ziraat Fakültesi Su Ürünleri Bölümü) çok teşekkür ederim. Başta Bölüm Başkanımız Sayın Prof. Dr. Ö. Faruk ALGUR a (Atatürk Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi Biyoloji Bölümü) ve Biyoloji Bölümünün tüm öğretim elemanlarına sonsuz teşekkürlerimi sunarım. Ayrıca tez çalışmam süresince özellikle karaciğer preparatlarının hazırlanmasında yardım eden Atatürk Üniversitesi Fen Edebiyat Fakültesi Biyoloji Bölümü (İ.Ö.) öğrencilerinden Cemal SOYDAN a teşekkürü bir borç bilirim. Çalışmalarım esnasında destek ve teşviklerini esirgemeyen eşime, varlıklarıyla neşe kaynağım olan oğluma ve kızıma da teşekkür ederim. Turgay ŞİŞMAN Nisan 2007 iii

7 İÇİNDEKİLER ÖZET.. i ABSTRACT... ii TEŞEKKÜR... iii SİMGELER DİZİNİ... vi ŞEKİLLER DİZİNİ... vii ÇİZELGELER DİZİNİ... ix 1. GİRİŞ Poliklorlu Bifeniller (Polychlorinated biphenyls: PCBs) PCB bileşiklerinin kullanım alanları PCB bileşiklerinin üretim miktarları PCB bileşiklerinin Türkiye deki durumu Çevredeki PCB kirliliklerinin durumu ve boyutları PCB bileşiklerine maruziyet PCB bileşiklerinin toksik etkileri PCB bileşiklerinin karsinojenik etkileri PCB bileşiklerinin metabolizması Zebra Balıkları (Danio rerio) Zebra balığının taksonomisi Zebra balığının genel özellikleri Zebra balığında üreme Kemikli balıklarda yumurta morfolojisi Zebra balığında döllenme Zebra balığının gelişimi ve hayat siklusu Zebra balığında çevresel ajanlarla görülebilecek toksikolojik etkiler Zebra balığı ile çalışmanın avantajları KAYNAK ÖZETLERİ MATERYAL ve YÖNTEMLER Materyal Zebra balığı kültürleri Zebra balığı yumurtalarının toplanması 48 iv

8 PCB bileşiklerinin seçimi ve temini Yöntemler Balık yumurtalarının PCB konjenerleri ile temas ettirilmesi Gözlemlerin yapılması ve verilerin toplanması Karaciğer histopatolojisi Mekanik sensorite testi (sensorimotor duyu hassasiyeti) İstatistik analiz ARAŞTIRMA BULGULARI Sınır Belirleyici Test Sonuçları Ana Test Sonuçları (ELS Testi Sonuçları) LD 50 değeri Gelişimsel oran Yumurta ve embriyo mortalitesi Kalp büyüklüğü ve kan dolaşımı Larvaların yumurtadan çıkabilme başarısı Morfolojik anormallikler (malformasyonlar) Karaciğer Histopatolojisi Mekanik Sensorite Testi Sonuçları TARTIŞMA ve SONUÇ KAYNAKLAR EKLER 103 EK EK EK EK EK ÖZGEÇMİŞ 108 v

9 SİMGELER DİZİNİ AhR : Aril Hidrokarbon Reseptör o C CYP1A DDT DMSO ELS EROD gr GST Hem-Eo kg LD 50 MFO mg ml ng OCP PAH PAS PBDE PCB PCDD PCDF ppb ppm ROS TCDD TEF µg : Mikrogram : Santigrad derece : Sitokrom P-450 monooksigenaz : Dikloro Difenil Trikloroetan : Dimetil Sülfooksit : Erken Hayat Devri : Etoksiresorufin-O-detilaz : Gram : Glutayon-S-Transferaz : Hematoksilen Eozin : Kilogram : Canlının % 50 sini Öldüren Doz : Multi Fonksiyonel Oksigenaz : Miligram : Mililitre : nanogram : Organoklorlu pestisit : Polisiklik Aromatik Hidrokarbon : Periodik Asit Schiff : Polibromlu Difenileter : Poliklorlu Bifenil : Poliklorlu Dibenzo-p-Dioksin : Poliklorlu Dibenzofuran : Milyarda bir kısım : Milyonda bir kısım : Reaktif Oksijen Radikalleri : 2,3,7,8-tetrakloro dibenzo-p-dioksin : Toksik Eşit Değer vi

10 ŞEKİLLER DİZİNİ Şekil 1.1. PCB lerin genel kimyasal yapısı ve temel bileşikleri.. 3 Şekil 1.2. PCB bileşiklerinin metabolizması 21 Şekil 1.3. Zebra balığı embriyosunda gelişme. Blastula periyodu-i. 27 Şekil 1.4. Zebra balığı embriyosunda gelişme. Blastula periyodu-ii. 28 Şekil 1.5. Zebra balığı embriyosunda gelişme. Gastrula periyodu Şekil 1.6. Zebra balığı embriyosunda gelişme. Segmentasyon periyodu Şekil 1.7. Zebra balığı embriyosunda gelişme. Faringula periyodu Şekil 1.8. Zebra balığı embriyosunda gelişme. Koryondan çıkma periyodu. 33 Şekil 1.9. Zebra balığı embriyosunda gelişme. Yüzen larva periyodu.. 34 Şekil 3.1. IUPAC numaralandırılma sistemine göre çalışmada kullanılan PCB bileşiklerinin açık formülleri. 49 Şekil 4.1. Kontrol ve PCB uygulanmış 2.0 saatlik Zebra balığı zigotları, a) Kontrol, b) Deney grubunda blastodermin opaklaşması.. 57 Şekil saatlik kontrol ve PCB ye maruz kalmış Zebra balığı larvaları, a) Kontrol b) Deney grubunda kalbin ve perikardiyal alanın gelişmemesi 62 Şekil saatlik kontrol ve PCB ye maruz kalmış Zebra balığı zigotları, a) Kontrol, b) Deney grubunda Blastodermal lesyon.. 64 Şekil 4.4. Kontrol ve PCB ye maruz kalmış 6.0 saatlik Zebra balığı zigotları, a) Kontrol, b) Deney grubunda Ekzogastrulasyon Şekil saatlik Kontrol ve PCB uygulanmış Zebra balığı embriyoları, a) Kontrol, b) Deney grubunda vitellüs kesesi ödemi.. 64 Şekil 4.6. Kontrol ve PCB ye maruz kalmış 24 saatlik Zebra balığı embriyoları, a) Kontrol, b) Deney grubunda akut kalp ödemi.. 65 Şekil 4.7. Kontrol ve PCB ye maruziyetini takiben 30 saatlik Zebra balığı embriyoları, a) Kontrol, b) Deney grubunda zayıf pigmentasyon 65 Şekil 4.8. PCB uygulanmış 30 saatlik Zebra balığı embriyolarında a) Vertebra sütun defekti, b) Çift baş oluşumu Şekil saatlik normal Zebra balığı larvaları.. 66 Şekil PCB uygulanmış 96 saatlik Zebra balığı larvalarında vertebra sütun vii

11 defekti 66 Şekil PCB ye maruz kalmış 96 saatlik Zebra balığı larvalarında Lordoz.. 66 Şekil PCB uygulanmış 96 saatlik Zebra balığı larvalarında vitellüs kesesi ödemi. 67 Şekil PCB ye maruz bırakılmış 96 saatlik Zebra balığı larvalarında kalp ödemi. 67 Şekil PCB maruziyetini takiben 96 saatlik Zebra balığı larvalarında hava kesesinin gelişmemesi Şekil PCB uygulanmış 96 saatlik Zebra balığı larvalarında a) Anaxial vücut, b) Triple retina 67 Şekil PCB ye maruz kalmış 96 saatlik Zebra balığı embriyolarında a) Boy kısalığı, b) Pigmentasyonun oluşmaması ve kuyruk anormalliği. 68 Şekil günlük Zebra balığı larvalarında karaciğer. Normal sitoplazmalı ve normal görünüşlü hepatositler Şekil Farklı PCB bileşiklerine maruz kalmış Zebra balığı karaciğerinde görülen patolojik bulgular: a) Hepatositlerde hipertrofi, b) Lipid birikimi ve nukleus sayısında azalma Şekil Kontrol ve PCB uygulanmış Zebra balığı larvalarında karaciğer hücreleri a) Kontrol grubu hücrelerinde zimojen granülleri, b) Deney grubu hücrelerinde zimojen granülleri.. 71 viii

12 ÇİZELGELER DİZİNİ Çizelge 1.1. PCB lerin kullanım alanları... 6 Çizelge 1.2. Zebra balığı embriyolarında toksik maddelere karşı verilen toksik yanıtlar Çizelge 1.3. Toksikoloji çalışmalarında tatlı su balık embriyolarının kullanımı Çizelge 1.4. TSE ye göre Zebra balığı nın su kalitesi tespitinde kullanıldığını gösteren standart düzenleme.. 38 Çizelge 4.1. PCB uygulanmış döllenmiş Zebra balığı embriyolarındaki gelişim hızları. 59 Çizelge 4.2. Farklı konsantrasyonlarda, farklı PCB konjenerlerine 48 saat süreyle maruz kalmış Zebra balığı embriyolarındaki ölüm oranları Çizelge 4.3. PCB uygulanmış döllenmiş Zebra balığı embriyolarının kalp atışı sayıları. 61 Çizelge 4.4. PCB uygulanmış döllenmiş Zebra balığı embriyolarının koryondan çıkabilme oranları Çizelge 4.5. Subletal dozlarda farklı PCB bileşiklerine maruz kalmış Zebra balığı embriyolarında görülen morfolojik aberasyonlar ve görülme sıklıkları. 68 Çizelge 4.6. Farklı dozda farklı PCB bileşiklerine maruz kalmış 8 günlük Zebra balığı larvalarının karaciğer histopatoloji sonuçları Çizelge 4.7. Farklı PCB bileşiklerine 96 saat maruz kalan Zebra balığı larvalarında uyarıcıya karşı verilen normal yanıtların yüzdesi.. 73 ix

13 1 1. GİRİŞ 1.1. Poliklorlu Bifeniller (Polychlorinated biphenyls: PCBs) Endüstrileşmiş ülkeler bir yandan endüstrileşmenin çevre ve insan sağlığı üzerine oluşturduğu risklerin sonuçlarını değerlendirip bu riskleri azaltmaya çalışırken, diğer taraftan ürettikleri kimyasalların sayılarını ve çeşitliliğini arttırma çabaları içindedirler. Bu çabalar günümüzde çevre ve insan için daha az toksik bileşikler üzerinde yoğunlaşmaktadır. Bu sayede bir tarafta daha önce üretilmiş ve güvenirliği tartışılır durumda olan kimyasalların risklerinden uzak kalınırken, diğer yandan bu kimyasalların oluşturdukları problemlerin çözümü için harcanacak zaman ve nakit, güvenilir kimyasalların ortaya konulması için harcanmaktadır. Yarı sentetik petrol türevi yağlar olan Poliklorlu bifenil bileşikleri (PCB) yukarıda belirtilen kimyasallardan biri olarak hala pek çok sanayileşmiş ülkenin çevre ve insan sağlığı açısından üzerinde çalıştığı kimyasal bileşikler grubudur. Basitçe PCB kısaltmasıyla tanınan bu çeşitten bileşikler, kuramsal olarak 210 çeşit bifenil, terpenil ve naftilen bileşiğinden 50 veya daha fazla çeşidin karışımı ile hazırlanan organik bileşiklerdir. 209 farklı klorlanmış PCB konjeneri mevcuttur (UNEP 1999). Bu bileşikler kullanılma amaçlarına göre %40-60 oranında klorlandırılarak, başlıca Arachlor, Kanechlor, Phenchlor, Pyralene ve Clophen ticari adları altında piyasaya sürülmektedirler (Watts 1998). Ticari PCB ler ağırlıkça değişik oranlarda klor içeren klorine bifenilllerin karışımlarıdır. Örneğin; Arochlor 1242, 1254, 1260 olarak ifade edilen PCB karışımları sırasıyla %42, %54 ve %60 klor içermektedirler. PCB lerin izomerik bileşimleri değişkendir ve tam olarak da bilinmediğinden örnekleme ve analizleri güçlükle yapılmaktadır. Farklı PCB lerin fiziksel ve kimyasal özelliklerindeki farklılıklar bunların çevredeki hareketlerini ve dağılımlarını etkilemektedir. PCB ler karışım çeşitlerine göre oynak nitelikli sıvı kristalli toz veya parlak reçine halinde bulunmaktadırlar. Klor içeriği az olan bileşikler nonpolar olup organik çözücülerde kolayca çözünebildikleri halde yüksek klor içerikli bileşiklerde bu özellik giderek azalmaktadır. Bütün bileşikleri çevresel koşullara ve ısıya karşı aşırı derecede dayanıklıdır. Genellikle yüksek oranda

14 2 klorlandırılmış bileşikler çevrede çok uzun süre bozulmaksızın kalabildikleri halde, kısa sürede parçalanabilen düşük klorlu olanlara nazaran daha az toksisite riski oluşturmaktadırlar (Hammond 1972). Bu bileşiklere yönelik çevrede doğal bir kaynak bilinmemektedir. İlk kez 1881 yılında sentezlenmiş ve ilk ticari ürün de 1929 yılında ABD de üretilmiştir (Tanabe 1988). ABD de Swan Corporation tarafından üretilmiş olan PCB lere ait ilk toksik etkiler daha sonra üretimlerinin yoğun olarak yapıldığı General Electric ve Westinghouse firmaları işçilerinde görülmüştür ların ortalarında mesleksel maruziyet nedeniyle işçilerde klorakne gibi deri lezyonlarının yanı sıra ölümler de görülmüştür. Üretiminin başlamasından 7 yıl sonra Harward School of Public bölümü, PCB lerin de içinde bulunduğu klorlanmış hidrokarbonların sistemik etkilerinin incelendiği bir toplantı yaparak, bilimsel bazda ilk kez PCB leri gündeme getirmişlerdir. PCB lere ait ilk çevresel problem, 1966 yılında İsveçli araştırmacı Sören Jensen in balık ve kartal numunelerinde pestisit analizi yaparken tesadüfen son derece fazla sayıda (200 adet) belirlenemeyen bileşikleri saptaması ile ortaya çıkmıştır (Jensen 1966) yılında Japonya da ve 1978 yılında Tayvan da PCB lerin neden olduğu kontaminasyona bağlı olarak gelişen ve geniş insan kitlelerini ilgilendiren zehirlenme kazalarından sonra (Hsu et al. 1985; Carpenter 1998) bu bileşiklerin çevre ve insan dokularında dağılımı, birikimi ve neden olduğu toksik etkiler, araştırmacılar tarafından izlenmeye ve belirlenmeye çalışılmıştır. PCB ler yanıcı, patlayıcı ve elektrik geçirme özelliklerinden tümüyle arındırılmıştır. Mükemmel sayılabilecek derecede kimyasal dayanıklılığa ve kararlılığa sahiptirler. Bu nedenle de su ile hidrolize olmadıkları gibi asitlere, alkalilere ve korrosif etkili diğer maddelere karşı aşırı derecede dayanıklıdırlar. Kaynama dereceleri bileşik çeşidine göre o C ye kadar değişir. Fotokimyasal yolla değişik ürünlere dönüşebilirler. Örneğin; 300 o C de ısıtıldıklarında son derece toksik olan poliklorlu dibenzofuranlara (PCDF) dönüşürler (WHO 1993). Ancak 800 o C de 10 saniyede, 1000 o C de 3 saniyede parçalanmaktadırlar. Nitekim fiziksel ve kimyasal özellikleri yanında geniş kullanım alanları, 1960 ların sonlarında ilk kez artan ölçülerde ilgi uyandırmış ve bu bileşiklerin

15 3 geniş bir çevreye yayıldıkları gözlenmiştir. Çok kısa bir süre içerisinde PCB lerin global ekosistemlerin hemen hemen hepsinde bir parçalanma ürünü olarak bulundukları belirlenmiştir. Bunun neticesinde de PCB lerin geniş ölçütlerde ekosistemlerde bulunması ve bunların da insanlar dahil olmak üzere ekosistem üzerindeki olumsuz etkileri nedeniyle endüstriyel atık olarak kabul edilmelerine neden olmuştur. PCB bileşikleri endüstride bifenilin anhidroklorün uygun bir katalizör varlığında (demirklorit gibi) klorlanması ile elde edilir. Şekil 1.1 de PCB lerin kimyasal yapısı ve temel bileşikleri verilmiştir. Teknik PCB ürünlerinin klorlanma yüzdesi, farklı bifenillerin kompleks karışımlarından oluştukları bilinmektedir. Klorlama derecesi, bifenilin anhidroklor ile reaksiyon süresine bağlı olarak değişmektedir. Reaksiyon şartlarına bağlı olarak klorlamanın derecesi %21-68 arasında değişebilmektedir. Ürün her zaman farklı izomerlerin ve türlerin bir karışımı olmaktadır. Böylece teorik olarak toplam 209 farklı kimyasal bileşik tanımlanmıştır. Fakat bunların sadece 130 kadarı ticari ürünler veya bazı bileşiklerin karışımında bulunmaktadır (WHO 1993). Kimyasal formülleri C 12 H 10-n Cl n şekindedir (Wiegel and Wu 2000). Bileşik Formül Molekül Ağırlığı Klor sayısı Çeşit sayısı Monoklorobifenil C 12 H 9 Cl Diklorobifenil C 12 H 8 Cl Triklorobifenil C 12 H 7 Cl Tetraklorobifenil C 12 H 6 Cl Pentaklorobifenil C 12 H 6 Cl Hekzaklorobifenil C 12 H 4 Cl Heptaklorobifenil C 12 H 3 Cl Oktaklorobifenil C 12 H 2 Cl Nonaklorobifenil C 12 HCl Dekaklorobifenil C 12 Cl Şekil 1.1. PCB lerin genel kimyasal yapısı ve temel bileşikleri (Wiegel and Wu 2000)

16 4 Bu karışımların toksik etkileri ve çevredeki davranışları karışımların klorlanma derecelerine ve bifenil halkasındaki atomların pozisyonlarına bağlıdır. Genelde yapı ve toksisite açısından farklılık gösteren bu karışım iki ayrı grup içinde değerlendirilmiştir (Parsinson 1987; Seegal 1993): a- Coplanar, Planar ya da Dioksin Benzeri PCB Bileşikleri b- Nonplanar Orto İzomerler Planar olanlar, bifenil halkasının her iki para pozisyonunda ve meta pozisyonlarında en az iki klor atomu içeren yapılardır. Planar PCB ler bifenil zincir yapısının orto pozisyonunda klor atomu içermedikleri ve planar yapıya sahip olduklarından dioksin benzeri (2,3,7,8-tetraklorodibenzo-p-dioksin; TCDD) yapıya ve benzeri toksik etki gösterdiklerinden dioksin benzeri PCB Bileşikleri olarak adlandırılmaktadırlar. PCB den kaynaklanan karsinojenite, mutajenite gibi toksik etkilerin ana sorumluları dioksin benzeri PCB lerdir (McKinney and Waller 1994). Toksik konjenerler para- ve meta- pozisyonunda 5 ile 10 tane klor atomu içerenlerdir (Sylvestre 1985). Bununla birlikte in vivo ve in vitro çalışmalar göstermiştir ki PCB molekülündeki klor atomlarının sayısına bağlı olarak konjenerin toksisitesi değişmektedir. Buna göre klor atomu sayısı orto pozisyonunda azaldıkça konjerin toksisitesi artmaktadır (Bonefeld- Jorgensen et al. 2001). Planar olmayan PCB izomerleri ise orto pozisyonunda birden fazla klor atomu içermektedirler ve planar olanlar kadar toksik değildirler. Ama planar olmayan olmayan PCB lerinde toksisitesine işaret eden çok sayıda çalışma bulunmaktadır (Oskam et al. 2004; Castoldi et al. 2006; Danis et al. 2006). Dioksinlerin 75 tane farklı poliklorlanmış dibenzo-p-dioksin (PCDD) ve 135 de poliklorlanmış dibenzofuran (PCDF) konjeneri vardır. Bunlar tehlikeli atıkların, çöp alanlarının yok edilmesi sırasında ve organik klorlu bileşiklerin yapımı sırasında ortaya çıkarlar. Bunlar çevresel kontaminantların neden olduğu toksik etkilerin asıl sorumlularıdırlar (Counston and Kolbye 1994). Dioksin benzeri PCB konjenerlerinin toksisitelerinin değerlendirilmesinde TCDD nin Toksik Eşit Değeri (TEF; Toxic Equivalency Factor) son yıllarda yaygın olarak kullanılmaya başlanmıştır. TCDD nin

17 5 TEF modeli karışımlardaki PCB lerin toksik etkilerinin ve mekanizmasının belirlenmesinde temel oluşturmuştur (Falandysz 1999). Bu değerlendirmede TCDD nin TEF değeri 1.0 kabul edilmekte ve göreceli olarak PCB lerin bu faktöre göre toksisiteleri belirlenmektedir. Örneğin bir PCB konjenerinin TEF i 0.01 ise bu, bu konjenerin 2,3,7,8-TCDD den 1/100 kadar daha az toksik anlamına gelmektedir (EPA 1996). Planar olmayan PCB ler ise ortho pozisyonunda klor atomu içermektedirler. Bu durum planar olmayan PCB leri daha kararlı yapmaktadır. Orto pozisyonunda klor atomlarının sayısının artması koplanariteyi ve toksisiteyi düşürmektedir. Bu planar olmayan PCB konjenerlerinin toksik olmadıkları anlamına gelmemektedir. Kaldı ki kararlı olmaları nedeniyle doğada çok uzun süreler kalabilmekte ve vücuda alındıklarında da yağ dokuda birikebilmektedirler (Safe 1994) PCB bileşiklerinin kullanım alanları Yukarıda belirtilen mükemmel sayılabilecek derecedeki fiziksel ve kimyasal dayanıklılık özelliklerinden yararlanılarak PCB ler soğutucu ve izolatör madde olarak, metaller üzerinde gerçekleştirilen sayısız delme ve tıkama işlemlerinde yağlayıcı, kaçak ve sızıntı önleyici ajan olarak, sıkıştırma işlemlerinde yağlayıcı, fren sistemlerinde hidrolik sıvısı ve yağlayıcı olarak kullanılmaktadırlar. Öte yandan kolaylıkla şekil verilebilme, yapışkan çözücü ve uygulama yerlerinde uzun süre kalabilmeleri sayesinde çok değişik nitelikli yapıştırıcı, kapatıcı maddeler, boya, vernik, asfalt, mum, nişasta, cam macunu, matbaa mürekkebi ve karbon kağıdı üretim sanayinde geniş ölçüde tüketilmektedirler. Polietilen ve benzeri plastik maddelerin üretiminde elastikiyet ve dayanıklılığı arttırıcı plastizer olarak sayısız ambalaj ve kaplama malzemelerinin bileşimine katılmaktadırlar (Falandysz 1999). Çözücü ve buhar basıncını düşürücü özelliklerinden yararlanılarak da organik klorlu insektisitler ve benzeri maddelerin formülasyonuna katılmaktadırlar (Çizelge 1.1).

18 6 Bunlara ilaveten PCB ler, evde floresan lambalarında bulunan ayar rezistanslı kapasitörlerde kullanılmakta, ofislerde ise basınca duyarlı kopya kağıtlarının yapısına katılmaktadırlar. Plastikleştirici özellikleri mobilyalarda, iç dekorasyon ve bina inşaatlarında (örneğin, tekstilde yüzey düzeltici, su geçirmez duvar kaplamalarının bileşiminde yapıştırıcı olarak) kullanılmalarına olanak sağlamaktadır. PCB bileşikleri ayrıca mikroskobik incelemeler için kullanılan immersiyon yağlarında da bulunmaktadırlar (WHO 1993). Çizelge 1.1. PCB lerin kullanım alanları (WHO 1993) Isı transfer ve hidrolik sıvılar içinde (transformatör ve fren sistemleri) Mürekkep yapımında Pestisitlerde etkinliği attırıcı olarak Karbonsuz kopya kağıdı yapımında Yağlamada Yüksek gerilim kablo ve tel yapımında (PCB+Klorlu naftalen karışımı) Kondansatörlerde (sadece PCB) Trafolarda (PCB+Poliklorlubenzen= Askarel) Boya sanayinde Yapıştırıcılar içinde Macun yapımında Plastikleştiriciler içinde PCB bileşiklerinin üretim miktarları Yarı sentetik petrol türevi olan PCB ler, kimyasal kararlılıklarının fazla olması, izolasyon ve dielektrik özelliklerinin yüksek olması nedeniyle yaygın kullanıma sahiptirler ve 1989 yılları arasında toplam dünya üretimleri 7.5 milyar kilodur. Bu rakam her yıl için ortalama 126 milyon kilo olarak gerçekleşmiştir yılları arasında sadece ABD de üretim miktarı 2.42 milyar kilodur. Bu da tüm üretimin yaklaşık 1/3 üdür yılında ABD de üretimi yasaklanmış ancak diğer dünya devletlerinde üretimleri devam ederek yılları arasında yıllık milyon kiloya, yılları arasında 48.5 milyon kiloya düşmüştür (WHO 1993). Bu rakam 1990 ların başında 1.5 milyon kiloya kadar düşmüştür (HELCOM 2001). Şu anki üretimi hakkında kesin bir bilgi bulunmamaktadır.

19 7 Bir OECD raporuna göre 1971 den bu yana pek çok OECD ülkesi PCB lerin kullanımını ve imal edilmesini kendi istekleriyle veya yasal olarak sınırlandırmaya başlamıştır gibi geç bir tarihte neredeyse sadece kapasitör ve transformatörlerde kullanılan PCB lerin kullanımı da alınan bir kararla sınırlandırılmıştır. Japonya da ise üretim ve kullanım 1972 de tamamen yasaklanmıştır. 24 OECD ülkesi 13 şubat 1987 de daha önceki sınırlamalara ilave olarak PCB lerin tüm yeni kullanımlarından aşama aşama vazgeçmek, kontamine ürünleri, aletleri veya ekipmanları kontrol etmek ve PCB içeren atıkları uygun bir şekilde yok etmek noktasında birleşmiş ve karar almışlardır. Buna göre PCB lerin kullanımı neredeyse sadece kapalı sistemlerle (vakum pompaları, hidrolik sistemleri, ısı transfer değişim sistemleri vb.) sınırlandırılmıştır (WHO 1993) PCB bileşiklerinin Türkiye deki durumu Yurdumuzda PCB bileşiklerinin endüstrideki kullanım boyutuna ilişkin yeterli sayıda veri bulunmamaktadır. Ancak 1970 li yıllarda başta ABD ve bazı endüstrileşmiş ülkelerde PCB içeren trafo yağlarının kullanımının yasaklanmasını takiben ülkemizde Lindan (γ-bhc)+transformatör yağının kombine halde Linol, Oleokorlin ve Ormalin adı ile 1970 den 1982 yılına kadar tarımsal amaçlarla kullanıldığı bilinmektedir. Bunun dışında yurdumuzda kağıt endüstrisinin bulunduğu bölgelerdeki atıkların PCB düzeyleri ve kontrol edilmesi hakkında günümüze ulaşan herhangi bir bilgi bulunmamaktadır. Ancak Çevre Bakanlığı nın 7 Ocak 1991 tarih ve sayılı Resmi Gazete de çıkan Atık Su Kontrol Yönetmeliği nde, PCB bileşiklerinin deniz suyunda bulunması gereken miktarları (2-4µg/L) belirlenerek, kontrol edilmesi gereği vurgulanmıştır. 11 Temmuz 1993 tarih ve Sayılı Resmi Gazete de yayımlanarak yürürlüğe giren Zararlı Madde ve Ürünlerin Kontrolü Yönetmeliğinde Polihalojenli bifenil ve terpenillerin ve bunların karışımlarını ihtiva eden malzeme ve ürünler 01/01/1996 tarihinden itibaren kullanılamaz hükmü yer almıştır. Bu yasaklamanın yanı sıra yurdumuzda PCB bileşiklerinin yüksek gerilim kablo ve tel yapımında kullanıldığı, bir transformatörün ortalama ömrünün yıl olduğu (PHS 1993) gerçeğine göre ülkemizde yaklaşık 1960 lardan beri kullanımda olan binlerce

20 8 trafo, kondansatör bulunduğu ve PCB bileşiklerini içeren atıkların bilinmeden ya da kontrolsüz biçimde yurdumuza girdikleri de göz önüne alındığında, çevrede PCB kaynaklı bir kirliliğin global boyutlarının belirlenmesi ve sürekli izlenmesi gereği ortaya çıkmaktadır. Bununla ilgili olarak Türkiye Elektrik Üretim-İletim A.Ş. Genel Müdürlüğü (TEAŞ) Çevre Daire Başkanlığı nın 27/12/1999 tarihli yazısında; Kuruluş bünyesinde 180 adet trafoda farklı ticari adlarda yaklaşık 175 ton PCB bulunmaktadır. Sözü edilen PCB halen kapalı ve sızdırmaz trafolar içinde bulunmakta olup, atık olarak nitelendirilebilecek PCB miktarı yaklaşık 6.5 tondur. Ülkemizde henüz Çevre Başkanlığından lisans almış bir tehlikeli atık bertaraf tesisi bulunmaması nedeniyle açığa çıkan atık PCB ler Tehlikeli Atıkların Kontrolü Yönetmeliğinde belirtilen ara depolama koşullarında saklanmaktadır ifadesi yer almaktadır. Tarım ve Köyişleri Bakanlığı, Koruma ve Kontrol Genel Müdürlüğü nün 23 Eylül 2002 de sayılı Resmi Gazete de yayımlanan Türk Gıda Kodeksi Yönetmeliğindeki tebliğ ise şu şekildedir: Madde 1- Bu Tebliğin amacı, gıda maddelerinde bulunabilen belirli bulaşanların maksimum seviyelerinin belirlenmesidir. Madde 2- Bu Tebliğ, gıda maddelerinde bulunabilen mikotoksinler ve bakteriyel toksinler; metal ve metaloidleri ve yabancı madde ve bileşikleri kapsar. Yabancı madde ve bileşikler: Gıda maddelerinde bitki, hayvan ve/veya toprak kökenli yabancı maddeleri ve her türlü istenmeyen kimyasal madde ve bileşikleri ifade eder. Gıda maddelerindeki kabul edilebilir PCB seviyeleri:

21 9 Madde Poliklorobifeniller 28,52,101,118,138, 153,180 Gıda Maddesi Balık ciğeri Balık yumurtası Etler Kabuklu su ürünleri Derisidikenliler Yumuşakçalar Balıklar Süt ve süt ürünleri Yumurta Diğer bebek ve çocuk gıdaları Sebzeli gıda maddeleri Bebek mamaları ve formülleri Kabul edilebilir en yüksek değer (mg/kg) Açıklama (Analiz) Yağlı madde üzerinden Yağlı madde üzerinden Bütün Çevredeki PCB kirliliklerinin durumu ve boyutları Isı transfer sistemlerinde olduğu gibi gelişmiş endüstriyel araç ve gereçlerin sürekli PCB sızdırmaları, kaza ve eskiyerek devre dışı kalmaları sonucunda çok büyük boyutlarda aynı çeşitten bileşikler çevreye yayılmaktadır. Aynı şekilde temeli PCB lere dayanan veya bileşimlerinde bu maddeleri içeren pek çok endüstri ürünü genellikle eskiyen artıklar halinde çevreye veya su sistemlerine atılmaktadır. Keza plastizer olarak böyle bileşikleri içeren her çeşitten plastik kap ve ambalaj maddesinde tutulan yiyecek malzemeleri migrasyon etkinlikleri sonucunda değişik derecelerde PCB lerle kirlenebilmektedir. Ayrıca günlük yaşamımızda yüzlercesini kullanmak zorunda olduğumuz ve yapısında PCB içeren cam macunu, boyalar, vernik asfalt, matbaa mürekkebi ve karbon kağıdı gibi ürünler tüketim artıkları halinde kaçınılmaz şekilde çevreye saçılmaktadır (EPA 1996). Yukarıdaki açıklamalardan da kolayca anlaşılacağı üzere, çeşitli endüstriyel etkinliklere ve günlük yaşamımıza yaygın bir şekilde girmiş olan PCB ler, kullanma şeklinin kaçınılmaz bir sonucu olarak sayısız kirlenme kaynağı oluşturmaktadırlar. Bu nedenle de, 1930 lu yıllardan günümüze değin giderek katlamalı bir şekilde artan üretim ve tüketim etkinlikleri sonucunda sürekli halde çevreye yayılan PCB atıkları da evrensel boyutlu kirleticiler arasına girmiştir. Değişik kirlenme kaynaklarından çevreye yayılan

22 10 PCB atıklarının toplam miktarını belirlemek oldukça zordur. Ancak bazı önemli kaynaklardan açığa çıkan kirlilik boyutları dikkate alındığında, bu hususta daha gerçekçi tahminler yapılabilmektedir. Şöyle ki, ABD de PCB lerin üretilmesi ve çeşitli endüstriyel artık ve atıkların yok edilmesi için uygulanan yakma işlemleri sonucunda her yıl 2000 ton dolayında PCB lerin atmosfere geçtiği hesaplanmıştır. PCB içeren 4000 ton kadar plastik ve yağlayıcı madde, boşaltma ve sızıntı artıkları ile hidrolik ve ısı transfer sıvısının da su sistemlerine geçtiği tahmin edilmektedir. Öte yandan kullanılma seçenekleri de dikkate alınarak yıllık PCB tüketiminin yarısının doğrudan bulaşma, ıslatma, eskime, aşınma, dökme, boşaltma ve kazalar sonucunda karasal kirlenmeye katıldığı belirlenmiştir. Buraya kadar açıklanan verilerden hareketle, halen bütün dünyada ton arasında PCB artığının etkin bir şekilde çevre kirlenmesine katıldığı kabul edilmektedir (ATSDR 1993). Sayısız kaynaklardan ortaya çıkan PCB kirliliklerinin büyük bir bölümü genellikle doğrudan akarsular, göller ve kıyı suları gibi su sistemlerine bırakılmaktadır. Kaldı ki, atmosfere yayılan ve karasal ortamda beliren aynı kirlilikler de zamanla dünya su kesimlerine yansımış olacaktır. Bu yüzden son yıllarda özellikle iç ve kıyı suları olmak üzere su sistemlerinin ağır bir biçimde PCB artıklarıyla kirlendiği bilinmektedir. Bu nedenle de PCB kaynaklı kirlenmeden dolayı oluşan çevresel sorunları daha çok su ortamındaki biyolojik dengenin bozulması ve su ürünlerinin kirlenmesi biçiminde kendini göstermektedir. Ancak sorun sadece belirtilenlerle sınırlı kalmamakta aşırı derecede kirlenen su ürünleri aracılığıyla PCB ler besin zincirine girerek gelişmiş canlılarda artan yoğunluklarda birikebilmektedir. Böyle kirlenmelerden kuş türleri doğrudan etkilenmektedir. Su ürünlerinin protein kaynağı olarak kullanımı sonucunda da özellikle tavuklar sürekli kirlenme tehdidi ile karşı karşıya kalmışlardır. Dünyanın değişik bölgelerinde yaşayan kara ve su canlılarının anlamlı düzeylerde PCB lerle temas ettikleri anlaşılmaktadır. Bunda göçmen kuşlar, su canlıları ve atmosferin hareketlerinin de önemli bir payı vardır. PCB nin en yüksek yoğunluğuna ileri derecede endüstrileşmiş bölgelerdeki akarsular ve kıyı sularında besin zincirini oluşturan canlılarda rastlanmaktadır. Bu tür bölgelerin su ürünlerinde saptanan PCB yoğunluğu aynı

23 11 numunelerdeki DDT ve diğer organik klorlu kalıntı toplamından 100 kat daha yüksek boyutlarda olduğu anlaşılmıştır (Şanlı 2002). Tüm bunlara bağlı olarak bütün dünyada PCB lerden ileri gelen genel bir kirlenme ortamı şekillenmiş durumdadır. Bu durumun kaçınılmaz bir sonucu olarak balık türlerinde 10 ppm, hayvan vücut yağlarında 300 ppb, bitkisel yağlarda 150 ppb, hayvan etlerinde ppb, tavuk yumurtalarında 30 ppb ve düşük yağ içerikli besinlerde de 5 ppb dolayında PCB kirliliğine rastlanabileceği anlaşılmıştır. Belirtilen durum karşısında da günümüz insanının günlük besinleriyle ortalama 150 ppb düzeyinde PCB kirliliği alabildiği, bu miktarın %80 inin de su ürünleri ile diğer hayvansal besinlerden kaynaklanabileceği belirlenmiştir (WHO 1993) PCB bileşiklerine maruziyet PCB bileşiklerinin üretimine dünyanın bir çok ülkesinde 1970 ile 1980 yıllarında son verilmesine rağmen hala bu bileşiklere maruziyet söz konusudur. İnsanların PCB lere maruziyeti başlıca inhalasyon, ağız yolu ve deri ile olmaktadır. Bu maruziyetin asıl nedenleri arasında hala kullanımda olan ve kullanım dışı kalmış eski transformatörler ve kondansatörlerin PCB içermeleri gösterilmiştir. Kullanım ömürleri 30 yıl olan bu cihazlar PCB sızdırmaktadırlar. Ayrıca eski floresan ampülleri, elektriksel devreler, örneğin televizyon ve buzdolaplarının PCB lerin üretimi durdurulamadan önce PCB bileşiklerini içermiş olabilecekleri tahmin edilmektedir. Cihazlar kullanımları sırasında ısındığı takdirde PCB lerin küçük parçaları havaya sızabilmekte ve ev gibi kapalı alanlar içinde PCB maruziyet için diğer kaynakları oluşturabilmektedirler (PHS 1993). Ancak PCB içeren hava teneffüs edildiğinde, akciğer yoluyla bu bileşikler vücuda girmektedir. Ancak hava ile vücuda giren bu PCB lerin ne kadarının kana karıştığı tam olarak saptanamamıştır. Aynı şekilde deri yoluyla bu bileşiklerin ne miktarda ve ne sürede vücuda alındığı da belirlenememiştir. Diğer taraftan bu bileşikleri içeren suyun içilmesi ve yiyeceğin tüketilmesiyle PCB lerin bir dakika içinde mideden kan dolaşımına geçtiği tespit edilmiştir (PHS 1993).

24 12 Genel nüfus için, kontamine olmuş besinlerin tüketilmesi ile olan oral maruziyet, PCB lere maruz kalınımın en önemli yolu olarak değerlendirilmektedir (Humphrey 1983). Bu besinlerin arasında en önemli rolü balık tüketimi almaktadır (Berglung 1972; Hammond 1972) da yapılan bir çalışmaya göre risk oluşturan elektrikli ekipmanlardan sızan PCB lerin inhalasyon veya oral alınmasının tehlikesi, PCB ile kontamine olmuş balık yiyen populasyonla karşılaştırma yapılarak ölçülmüş ve tehlikenin boyutlarının aynı olduğu görülmüştür (WHO 1993). PCB bileşiklerine maruziyet ayrıca kazalarla ve mesleki de olabilmektedir. Çeşitli kondansatör fabrikalarında, kapasitör ve elektrikli ekipman üretiminde, transformatör kontrolünde, trafoların tamir işinde ve yerleştirilmesinde ve boya fabrikasında çalışan işçiler, solunum ve deri yolu ile PCB lere maruz kalmışlardır. Bu işçilerin avuç içi PCB konsantrasyonlarının çok yüksek olduğu tespit edilmiş ve ellerden yiyeceğe bulaşmak suretiyle sindirim sistemi yolu ile de maruziyet söz konusu olmuştur (Wabeke and Letz 1995). Kazara olan maruziyetlerde şiddetli ve acil durumlar havadaki PCB konsantrasyonunun çok yüksek olmasından kaynaklanmıştır. Örneğin yangın, elektrik devresinin kısa devre yapması, kaynak yaparken çıkan yangınlar sebebiyle PCB nin yakılması veya ısıtılması konsantrasyonunun artmasına sebep olmuştur. Kısa devre nedeniyle olan yangınlar ve elektriksel patlamalarda o C ye kadar değişebilen yüksek sıcaklıklarda PCB ayrışabilmektedir. Yine, yüksek miktarda oluşan kurum içinde mg/kg a kadar çıkan konsantrasyonlarda PCB partikülleri tespit edilmiştir (WHO 1993). Konuyla ilgili PCB maruziyeti yakın geçmişte iki kaza ile bildirilmektedir. İlki Yusho Kazası dır yılı Haziran ayında, Japonya Fukuoka da Kyushu Üniversitesi Hastanesi Dermatoloji Kliniği ne klorakneden şikayet eden hastalar başvurmuştur. Bu hastalar kimyasal ve epidemiyolojik incelemelere tabi tutulmuş ve hastalığın 1968 yılının Şubat ayında üretilen bir seri pirinç yağının tüketiminden kaynaklandığı tespit edilmiştir. Bu hastalık Yusho (pirinç yağı hastalığı) olarak adlandırılmıştır. Pirinç yağının mg/kg oranında %48 klor içeren bifenil yapısının Koneklor 400 ile kontamine olduğu tespit edilmiştir. Koneklor 400 ün yağa, bir ısı değiştiricinin içindeki

25 13 bir çatlaktan sızdığı anlaşılmıştır. Vücuda alınan tahmini değerler; toplam 633 mg PCB, 3.4 mg poliklorlanmış dibenzofuran (PCDF) ve 596 mg poliklorlanmış kuaterfenil (PCQ) şeklinde saptanmıştır. Bu kazadan 1863 kişi etkilenmiş ve 1979 yılına kadar toplam 31 Yusho hastası ölmüştür. Tarihler 1983 ü gösterdiğinde ise bu sayı 120 olmuş ve 1990 yılında toplamda 149 hasta hayatını kaybetmiştir. Hastaların ölüm nedeni muhtemelen PCB maruziyetine bağlı olarak malignant neoplazma, mide kanseri ve akciğer neoplazması şeklinde bildirilmiştir (Masuda et al. 1982; Masuda 1985; Mizukami 1999). İkinci kaza ise Tayvan daki Yu-Cheng Kazası dır. Bu kaza 1979 da Tayvan da meydana gelen Yusho kazasına benzer bir olaydır. Bu olayda 2061 kişi PCB den zehirlenmiştir. Bu kişilerden 7 si ölmüştür. Etkilenen kişiler üretim sırasında ısı transfer ortamı olarak kullanılan PCB lerle kontamine olmuş pirinç-kepeği yağını tüketmişlerdir. Alınan PCB miktarının g olduğu ve klinik belirtilerin çıkışına kadar olan latent periyodun da 3-4 ay olduğu hesaplanmıştır (Masuda et al. 1982; Masuda 1985; Mizukami 1999). Sadece insanlar değil aynı zamanda ekonomik önemi olan evcil hayvanların da PCB bileşiklerine maruziyeti söz konusudur. PCB atıklarıyla bulaşmış yem ve yem hammaddeleriyle beslenen veya böyle ortamlarda otlatılan evcil hayvanlar ve aynı hayvanlardan elde edilen besin çeşitleri değişik boyutlarda kirlenebilmektedirler. Böyle bir durumda hayvanlarda dikkati çekecek derecede akut ve kronik zehirlenme belirtileri gözlenmemiştir. Ancak bu hayvanlarda süt, yumurta ve et miktarının azalması, enfeksiyonlara ve diğer stres faktörlerine karşı vücut direncinin kırılması gibi çok yönlü yetiştirme sorunları ortaya çıkarken, diğer taraftan da aynı hayvancılık birimlerinden elde edilen hayvansal ürünlerde esas kaynağı hemen hemen saptanamayan kirlenme riski kaçınılmaz olmuştur. Kaldı ki, yanlışlıkla PCB lerin hayvan yemlerine karışması veya arıza, eskime, yıpranma, sızdırma ve kaza gibi nedenlerle katı veya sıvı halde çevreye atılan artıkların hayvanlar tarafından alınması sonucunda bireysel ve toplu zehirlenmeler de vuku bulabilmektedir.

26 14 Günümüze kadar yukarıdaki gerçekleri doğrulayan çok sayıda zehirlenme vakalarıyla karşılaşılmıştır. ABD de öğütülmüş yemlerle beslenen tavuk kitle halinde ölmüştür. Keza iç kısımları PCB esasına dayanan boyalarla boyanmış silolarda depolanan yemlerle beslenen çok sayıda inekten elde edilen sütlerin sakıncalı derecede kirlendiği anlaşıldıktan sonra bütün inekler ve bunlardan elde edilen sütler imha edilmiştir. Yine fabrikalarda hazırlanma esnasında ısı transfer sıvısı olarak kullanılan PCB sızıntılarıyla kirlenen et ve balık unları katılarak hazırlanmış yemlerle beslenen tavuk ve bunlardan elde edilen yumurtanın insan besini olarak kullanımı yasaklanmıştır. Öte yandan, herbisid ilaç yerine PCB içeren transformatör sıvılarının yanlışlıkla püskürtüldüğü otlaklarda otlatılan ineklerin kitle halinde zehirlendiği ve sütlerinin de tehlikeli şekilde PCB içerdiği anlaşılmıştır. Başka bir vakada ise sırt yağı yerine sıvı PCB uygulanarak yağlanan sığır sürülerinde çoğu ölümle sonuçlanan kitlesel zehirlenme olgularıyla karşılaşılmıştır (Şanlı 2002). Yemlerle birlikte alınan PCB ler evcil hayvanların sindirim kanalından tümüyle emilmektedir. Deriye uygulandıklarında da daha yavaş bir şekilde emildikleri ve böylece zehirlenmeye yol açabildikleri belirtilmiştir. PCB ler, türevlerinin çoğunun metabolik etkinliklere dayanıklı olması nedeniyle büyük oranda vücut yağ dokusunda birikebilmekte ve sınırlı oranda idrar ve dışkı ile atılmaktadırlar. Böylece belirtilen çevresel ve metabolik ilişkinin doğal bir sonucu olarak hemen hemen bütün hayvansal besinlerde değişik düzeylerde PCB varlığına rastlanabileceği anlaşılmıştır. Bu amaçla ABD de 1400 adet çeşitli yiyecek maddesinde tarama niteliğinde gerçekleştirilen bir araştırma sonucunda örneklerin %90 ında 0.1 ppm veya daha yüksek PCB kalıntısı saptanmıştır. En yüksek kalıntı tutan yiyeceklerin başında özellikle yağ içeriği yüksek olan su ürünleri gelmektedir. İkinci olarak evcil kanatlılar, süt ve yumurta ile bunlarla hazırlanan besinler PCB kalıntılarını tutmaktadırlar. Açıkça kirlenmemiş yemlerle beslenen sığır sütlerinin genellikle 0.1 ppm in biraz üstünde PCB kirliliğine sahip oldukları bildirilmektedir (Counston and Kolbye 1994).

27 PCB bileşiklerinin toksik etkileri PCB bileşiklerinin toksisitesi hakkındaki bilgiler en çok hayvan çalışmaları ve çalışanları içeren mesleki çalışmalardan elde edilmiştir. PCB lerin toksik etkileri hayvanlarda genellikle immunolojik, hepatik, gastrointestinal, hematolojik ve dermal hasarlar, gelişimde gerileme, üreme sistemi bozuklukları, et ve süt veriminde düşme ve kilo kaybı şeklindedir (Cicmanec 1993; Kannan et al. 2000). PCB lerin evcil hayvanlarda akut ve kronik toksisitelerini değerlendirmeye yönelik deneysel veriler sınırlı sayıdadır. Bileşiklerin toksisitesi genellikle klor içeriklerine göre değişebilmektedir. Buna göre klor içeriği daha yüksek olan bileşiklerin akut toksisitesi azalırken kronik toksisitesi artmaktadır. Belirtilen husus özellikle kanatlı hayvanlar için geçerli olmakla beraber, PCB bileşikleri daha çok kronik toksisite yönünden önem taşımaktadırlar. Deney hayvanlarında bileşiğin LD 50 değeri 0.5 g/kg ile 11.3 g/kg vücut ağırlığı arasında değişmektedir. Kanatlılardaki LD 50 değerleri klor içeriğine ve yedirme süresine göre, ppm arasında değişmektedir. Aynı bileşiklerin kemirici laboratuvar hayvanlarına deri yoluyla tekrarlanarak verilen subakut LD 50 değerleri mg/kg arasında saptanmıştır (Sullivan and Krieger 1992). Memeli hayvanlar ve kuş türlerinin klor içeriğince zengin olan bileşikleri daha yüksek oranlarda vücutlarında tutabildikleri belirlenmiştir. Dolayısıyla yüksek klorlu bileşiklerin daha güçlü toksik etkinliğe sahip olma nedeni belirtilen duruma bağlanmaktadır. Etlik piliçler başta olmak üzere, tüm evcil kanatlılar PCB lerin akut toksik etkilerine karşı çok dayanıklı oldukları halde kronik toksik etkilerine karşı en duyarlı türlerin başında gelmektedirler. Yemlerle birlikte 8-32 gün süreyle yedirilen ppm lik Arachlor 1254 ilave edilmiş yem beyaz legornlara toksik etki yapmamıştır. Bunla birlikte Arachlor yoğunluğu 20 ppm e çıkarıldığında yumurta veriminin düşmesi, yumurtadan civciv çıkma oranının azalması ve embriyo üzerinde teratojenik etki oluşturması gibi toksik etkiler görülmüştür. Fertil yumurtalara geçen PCB kalıntıları yoğunluğuyla embriyotoksik ve teratojenik etkileri arasında tam bir ilişki görülememiştir. Ancak yapılan bir sonraki deneyde fertil yumurtalara ml

28 16 dozlarında Arachlor 1242 enjekte edilmiş ve yumurtadan yavru çıkma oranının % arasında azaldığı tespit edilmiştir. Bu durum PCB nin embriyo üzerinde etkili olan eksojen östrojen metabolizmasını ve dolayısıyla biyolojik etkinliği olumsuz yönde etkilemesiyle açıklanabilmiştir (Borja et al. 2005). Yüksek düzeyde klorlandırılmış (%60) PCB lerle 400 ppm yoğunluğunda kirletilmiş yemlerle beslenen tavuklarda hidroperikardium, abdominal ve deri altı ödemler, sentrolobüler karaciğer nekrozu ve porfiri belirtileriyle kendini gösteren kronik zehirlenmeler şekillenmiştir. Yemlerdeki PCB yoğunluğu arttıkça kalp ve karaciğerde şekillenen patolojik bozukluların da ağırlaştığı saptanmıştır. Başka bir çalışmada 100 ppm düzeyinde PCB kirliliği içeren yemlerle 21 gün süreyle beslenen ratlarda hepatosellüler kanser oluştuğu ve daha düşük kirlilik düzeylerinde bile hepatosellüler proliteratif lezyon sıklığının arttığı belirlenmiştir. Günlük 0.05 grama kadar inen farklı dozlarda ayrı ayrı veya kombine bir şekilde PCB çeşitleri yedirilen rat, kobay ve tavşanlarda şiddetli karaciğer hasarı, dalak hipertrofisi ve deri lezyonları görülmüştür. PCB yedirilmesi durdurulduktan sonra da bu lezyonların en az iki ay süreyle kaldığı ve bu durumdaki hayvanların çoğunun öldüğü bildirilmiştir. Memelilerin PCB zehirlenmelerine oldukça dayanıklı oldukları bilinmekle birlikte minkler aşırı derecede duyarlı bulunmuştur. 1-5 ppm yoğunlukları arasında PCB lerle kirletilmiş yemlerle beslenen bu hayvanlarda 4 ay sonra üreme performansının son derece azaldığı belirlenmiştir. Rasyondaki PCB yoğunluğunun 30 ppm e çıkartılmasıyla aynı hayvanlarda anoreksi, kanlı ishal, hemorrajik mide ülseri, yağlı karaciğer ve böbrek dejenerasyonuyla dikkati çeken zehirlenme olgularının geliştiği ve böyle hayvanların 3-6 ay içinde öldüğü gözlenmiştir (Safe 1988; Peterson et al. 1993; WHO 1993; Hoffman et al. 1998; Bernard et al ). Balıklar ve kabuklular başta olmak üzere çeşitli su canlılarının kalıntı düzeyindeki PCB lere çok duyarlı oldukları anlaşılmıştır. Sularda 2 mg/l yoğunluğunda bulunan Aroclor 1254, 24 saatlik sürede Atlantik som balıkları üzerinde öldürücü olmuştur ppb yoğunluğunda PCB içeren sularda tutulan kedi balığı ve 8 ppb lik kirlenme ortamında tutulan alabalıkların birkaç hafta sonra öldükleri görülmüştür. Deneysel

29 17 çalışmalar sonucunda su ortamındaki PCB kirliliklerinin hızla balık vücuduna girerek biriktiği ve böyle balıkların temiz bir ortama alındığında 3 ay süreyle aynı kirliliklerin azalan düzeylerde balık organizmasında kaldığı saptanmıştır (Boon et al. 1992). PCB lerin doğal balık populasyonlarını etkileyebilediği ve özelikle de bu balıkların kontamine sulara bıraktıkları döllenmiş yumurtalarının erken dönemlerde olumsuz yönde etkilenebildiği çeşitli araştırmacılar tarafından bildirilmiştir (Birge et al. 1979; Passino and Kramer 1980; Walker and Peterson 1992). Ayrıca PCB bileşiklerinin ergin balıkların üreme sistemini etkileyerek döl verimini düşürdüğü de rapor edilmiştir (Nebeker and Puglisi 1974; Bengtsson 1980; Matta et al. 1998; Orn et al. 1998). Deneysel çalışmalar sonucunda su ortamındaki PCB kirliliklerinin hızla balık vücuduna girerek biriktiği (özellikle yağ dokusunda) ve bazı türleri (Som balıkları gibi) öldürdüğü tespit edilmiştir (Cecil et al. 1974). Ayrıca diğer balık türlerinde de ölümleri arttırdığı çeşitli araştırmacılar tarafından saptanmıştır (Duke et al. 1970; Mauck et al. 1978; Boese et al. 1995; Clarck et al. 2001). Balık vücudunda birikebilen ve akuatik sistemlerde uzun yıllar kalabilen PCB lerin endokrin sistemleri de bozabildiği yapılan çalışmalar arasındadır (Gerpe et al. 2000; Carlson and Williams 2001). PCB bileşiklerinin akut ve kronik toksisitelerinin insanlarda nasıl olduğu ile ilgili veriler daha çok mesleki çalışmalardan elde edilmiştir. Klorakne, oluşan akut toksisitenin en önemli göstergesi olmuştur. PCB lerin neden olduğu akut toksisiteye ait bulguların en iyi açıklamasını Yusho ve Yu-Cheng kazası sırasında elde edilen bulgular vermiştir. Her iki kaza sonucu PCB ye maruz kalan hastalarda görülen ilk belirtiler, gözlerin meibom bezlerinin hipersekresyonu ve büyümesi, göz kapaklarının şişmesi, tırnak ve mukoz membranın renklenmesi, fiziksel ve zihinsel bitkinlik, bulantı ve kusmadır. Bunu derideki aknelerin oluşumu izlemiştir. Ayrıca bazı hastalarda kol ve bacaklarda ödem görülmüştür. Buna ilaveten hastaların çoğunluğunda solunumla ilgili semptomların bulunduğu ve senelerce süren kronik bronşit benzeri rahatsızlık çektikleri de ortaya çıkmıştır. En kötü sonuç ise her iki hadisenin ikisinden de alınan örneklerde yüksek oranda toksik etkiye sahip 2,3,7,8-tetrakloro-, 2,3,4,7,8-pentakloro- ve 1,2,3,4,7,8- hekzaklorodibenzofuran izomerlerinin mevcut olmasıdır. Her iki kazada gözlenen

30 18 semptomlar bir anlamda PCB karışımları ile meydana gelen zehirlenmelerde referans profil oluşturmaktadır (WHO 1993; PHS 1993). PCB bileşiklerine karşı gelişen kronik toksisite daha çok PCB içeren işyerlerinde çalışan işçilerin, deriden emilim, ağız yolu ve soluma ile uzun süre PCB bileşiklerine maruz kalmaları sonucunda ortaya çıkmıştır. Belirtiler, akut zehirlenmeyle hemen hemen aynı bulunmuştur. Farklı olarak bu tür yerlerde çalışan kadınlarda gebelik süresinde azalma ve düşük doğum ağırlığı gözlenmiştir. Gastrointestinal bozukluklar, anormal hepatik fonksiyonlar, baş ağrısı ve göğüste sıkışma diğer kronik belirtiler olarak tespit edilmiştir (WHO 1993) PCB bileşiklerinin karsinojenik etkileri PCB bileşiklerinin kansere yol açıp açmadıklarına dair özellikle deney hayvanları üzerinde yapılmış pek çok araştırma vardır yılında yayımlanan ilk çalışma bu bileşiklerin hayvanlarda kansere neden olduğunu ileri sürmektedir. Fare ve sıçanlarda yapılan diğer çalışmalarda PCB bileşiklerinin karsinojenik etkiye sahip olduğu vurgulanmıştır. Aslında tüm kronik çalışmalar PCB maruziyetinin kanser ya da kanser öncesi başkalaşıma neden olduğunu göstermiştir. Daha çok bu bulgulara dayanarak Dünya Sağlık Teşkilatı nın Uluslararası Kanser Araştırma Ajansı (IARC) PCB lerin insanlarda karsinojenik olduğunu varsaymış ve bu bileşikleri 2A İnsanda Karsinojenik Etki Olasılığı Bulunanlar grubunda değerlendirmiştir. Ayrıca Birleşmiş Milletler Uluslararası Toksikoloji Programı da PCB lerin karsinojenik olduğunu bildirmektedir (ATSDR 1998). Çalışanlar üzerinde yapılan karsinojenik araştırmalar vaka sayısı az da olsa böbrek kanserinde bir artış olduğunu göstermektedir (Longnecker et al. 1997). Bir çalışmada, %41-%54 Chlorine içeren ticari karışım serisine maruz kalan kapasitör işçilerinde karaciğer, safra mesanesi ve safra yolu kanseri (Brown 1987), mide kanseri (Bertazzi et al. 1987) veya kötü huylu melanomadan ölüm oranı artışı görülmüştür (Sinks et al. 1992). Arochlor 1254 e maruz kalmış işçilerle yapılan başka bir çalışmada malignant malinomanın istatistiksel artışı bulunmuştur (Bahn et al. 1976). Son zamanlarda elektrik

31 19 işçileri ile ilgili olarak yapılan bir çalışmada malignant melanoma ve beyin kanserinden ölüm oranının arttığı bulunmuştur (Loomis et al. 1997). EPA (Environmental Protection Agency), 1990 lı yılların başlarında PCB lere ilişkin verileri yeniden değerlendirmeye almış ve bazı PCB karışımlarının diğerlerinden daha fazla kansere yol açtığını kabul etmiştir. Bu veri aslında bütün PCB karışımlarının kansere neden olduğu yönündeki konuyu daha da genişletmiştir (Cogliano 1987). Son zamanlarda yapılan çalışmalarla PCB lerin reaktif oksijen radikallerinin (ROS) oluşumuna neden olarak oksidatif strese yol açtıkları da tespit edilmiştir. Bu nedenden dolayı PCB bileşiklerinin immunotoksik, genotoksik, mutajenik ve karsinojenik olduklarına karar verilmiştir (Groten et al. 1999) PCB bileşiklerinin metabolizması Bu bileşiklerin canlı organizmadaki biyokimyasal mekanizması tam olarak bilinmemekle birlikte karaciğer dokusunda kalıcı hasarlar yaptığı, kültür hücrelerinin üremesini ve büyümesini inhibe ettiği, eşey hormonlarının etkinliğini değiştirdiği, mikrozomal enzim sistemi başta olmak üzere diğer enzim sistemlerini olumsuz etkilediği, oksidatif strese yol açtığı ve antiöstrojenik aktiviteye sebep olduğu bildirilmiştir (Harris and Rose 1972; Cecil et al. 1974; Safe 1995). Genel olarak vücuda çeşitli yollardan giren PCB lerin metabolizması diğer ksenobiyotiklerle karşılaştırıldığında oldukça yavaştır. Pek çok türde mono-, di-, tri-, tetra-, penta- ve heksaklorobifenillerin in vitro metabolizmaları çalışılmıştır (Sundstrom et al. 1976, Sipes et al. 1982). Bu çalışmalar PCB metabolizmasının üç parametreye bağlı olarak değiştiğini göstermiştir. Bu parametreler; fenil halkasındaki klor atomları sayısı, fenil halkasındaki klorların pozisyonu ve hayvanın türüne bağlı olmuştur.

32 20 Matthews and Anderson (1975), yapılarında 1,2,5 ve 6 klor içeren 4 PCB nin klor sayısı arttıkça yarılanma ömrünün de arttığını saptamışlardır. İn vivo şartlarda yapılan çalışmalar da bu durumu desteklemiştir (Mehendale 1976). Diğer yandan, köpeklerde yapılan bir çalışmada farklı pozisyonda klor atomu taşıyan 4 simetrik heksaklorobifenil bileşiklerinin eliminasyonunun farklı oranlarda olduğu (2,3,5-HBC<2,4,5-HCB<2,4,6- HCB<2,3,6-HCB) anlaşılmıştır (Sipes et al. 1979). Deney hayvanları ile yapılan çalışmalarda sıçanların 2,3,6-heksaklorobifenil in %50 dozunun bir gün içinde elimine edildiği belirlenirken aynı miktar eliminasyonun maymunlar için 6 gün olduğu ve yine 2,4,5-HCB nin %50 dozunun sıçanlarda 8 günde elimine olduğu saptanırken maymunlar için bu durum ömürlerinin yarısına kadar uzadığı tespit edilmiştir (Lutz et al. 1977; Kato et al. 1980). Çeşitli hayvan türlerinin PCB bileşiklerini metabolize etme yetenekleri sırasıyla balıklar<kuşlar<memeliler şeklinde olmuştur. Bununla beraber, kapsam dahilindeki biyotransformasyon mekanizmalarının üzerinde çalışılan tüm türler için aynı olduğu görülmüştür. Nitekim karaciğer, PCB metabolizmasında hidroksilasyon, glukronik asit ve sülfatlarla konjugasyon yoluyla rol oynayan ana organ olmuştur. Metabolizmanın oranı klor atomunun sayısı ve pozisyonuna bağlı olarak değişmektedir (Matthews and Dedrick 1984). Düşük oranlarda klor içeren PCB ler (tri, penta-) çok hızlı bir şekilde metabolize olurken yüksek oranda klor içerenler (hekza, deka-) metabolik olarak dayanıklı olup dokularda en fazla bulunmuşlardır. Burada bütün türler tarafından oluşturulan metabolitlerin öncelikle karışık fonksiyonlu oksidazlar (MFO) tarafından oluşturulan hidroksillenmiş bifeniller olduğu görülmüştür. Diğer bir deyişle hidroksilasyon, PCB biyotransformasyonunda ana yol olmuştur (Schnellmann et al. 1984). Klor sayısı arttıkça klorların bulundukları pozisyon, biyotransformasyon için önemli bulunmuştur. Ayrıca faz 1 reaksiyonları boyunca klor atomları bir karbondan diğer karbona göç edebilmiş ve kaybolabilmişlerdir (Block and Cornish 1959; Kato et al. 1980). Tavşan, sıçan ve maymun gibi türlerde hidroksillenmiş PCB lerin glukronit konjugantları tespit edilmiştir (Mio et al. 1976, Norback et al. 1981). Glukronidasyon,

33 21 PCB eliminasyonunda ana rolü oynayan faz 2 reaksiyonlarının da başında gelmektedir. Bunun yanı sıra merkapturik asit yolunun da PCB metabolizmasonda önemli rol oynadığı gösterilmiştir (Bickel and Muhlebach 1980). Ayrıca oluşan aren oksit gibi ara ürünlerin glutatyon ile konjugasyonu söz konusu olmuştur (Şekil 1. 2). Oral yolla alınan PCB nin en önemli atılım yolları sırasıyla anne sütü, safra, dışkı, idrar ve saç olarak tespit edilmiştir. PCB ler yağ, deri, adrenal bez, kan ve diğer dokularda da birikebilmiştir. Konsantre olmuş metabolize olmamış PCB ler özellikle adipoz dokudan açlık ve laktasyon dönemlerinde metabolize edilmektedirler (Vodicnik and Lech 1980; Matthews et al. 1984). PCB lerin eliminasyonunda rol oynayan ana faktör molekül ağırlıkları olmaktadır. Fenil halkasındaki klor atomu sayısı arttıkça dışkı ile atılan miktarıda artmaktadır (Schnellmann et al. 1985). Bunun yanı sıra böbrek ve dışkı yoluyla atılımda tür faklılıkları da rol oynamaktadır (Sipes et al. 1980). İnsanlarda ise gerçek farmakokinetik bilgilere henüz ulaşılamamıştır. Şekil 1.2. PCB bileşiklerinin metabolizması (Norback et al. 1981)

34 Zebra Balıkları (Danio rerio) Zebra balığının taksonomisi Phylum Subphylum Classis Superordo Ordo Subordo Familya Genus Species : Chordata : Craniata : Osteichthyes (Kemikli balıklar) : Teleostei : Ostariophysoidei : Cyprincidae : Cyprinidae : Danio (= Branchydanio) : Danio rerio (Zebra balığı), (Kuru 1996 ya göre) Zebra balığının genel özellikleri Bu tür 1930 lardan beri yaygın olarak üzerinde çalışılan bir balıktır. Üzerinde zebranın çizgilerine benzer hatlar olduğu için Zebra balığı denir. Akvaryumlarda yaygın bir şekilde süs olarak kullanılır ve Cyprinidae familyasının bir üyesi olup doğal olarak Bengal deki akarsulardan Hindistan ın Coromendel sahillerine kadar bulunur (Hisaoka and Battle 1958). Hareketli bir balıktır. Diğer balıklarla beraber çok iyi ve uyumlu bir şekilde yaşarlar. Sürü halinde yaşamaktan hoşlanırlar. Boyları dişilerde 5 cm ye kadar ulaşabilir. Erkekler ise dişilerden daha ufaktır. Erkeklerde karın düz olduğundan dişiye oranla daha ince görünürler. Vücut temel olarak gümüş rengindedir. Vücutta boydan boya 7-9 tane mavi çizgi bulunur. Bu çizgiler kuyrukta da devam eder. Erginleşmemiş erkek ve dişilerin ayırt edilmesi belirsiz eşey karakterlerinden dolayı çok zordur. Ama erginleşmemiş erkeklerin dişiye nazaran daha büyük anal yüzgece sahip olmaları ve dişilerin genital papillasının daha belirgin oluşu bu ayrımın yapılmasına olanak

35 23 sağlamaktadır. Ayrıca dişilerde karın oldukça şişkin ve tombuldur (Karp and Berllil 1976) Zebra balığında üreme Bu ovipar tür orijinal ortamından uzakta tanklar içinde kolaylıkla yetiştirilebilir. Yaşam koşulları bakımından o C arasındaki sıcaklıklarda yaşayabilirler. Bu balıklar için en ideal su ısısı o C dir. Nötr sulardan hoşlanırlar ve ph arasındaki sular bu balıklar için uygundur. Normal çeşme suyu konmuş akvaryumlarda bol havalandırma koşullarında rahatça yaşarlar. Besin ve ısı, yumurtlamaya hazırlanacak balıklar için önemli faktörlerdir. Bu balıklar omnivor olup kuru veya dondurulmuş normal balık yemi, plankton, Paramecium, beyaz solucan, sivrisinek larvası, Tubifex, Daphnia gibi çeşitli besinleri alırlar (Laale 1977). İlk yumurtlama dişiler standart uzunluk olan 24.1 mm ye ulaştıklarında gerçekleşir. Bu uzunluğa o C de günlük bir kültürden sonra ulaşırlar. Yumurtlama zamanı fotoperiyot ile yakından ilişkilidir. 14 saat aydınlığı takiben 10 saatlik bir karanlık kafidir (Hallare et al. 2005). Bir dişiye 3-4 erkek olacak şekilde yapılan çiftleştirmelerden 26 o C de yumurta elde edilebilir. Yapışkan olmayan, transparant ve dibe çöken bu yumurtalar embriyolojik çalışmalar için çok uygundur. Çünkü gelişme periyodu fertilizasyondan (döllenmeden) koryondan çıkışa kadar yaklaşık 96 saattir (Laale 1977). Yavru alınacak olgun erkek ve dişiler birbirlerinden bir hafta kadar önce ayrılmalıdır. Ayrı bakılan dişi ve erkeklerin hazır olduğu anlaşılınca kuluçka akvaryumuna alınırlar. Bu işlem genelde akşam saatlerinde yapılmalıdır. Diğer günün sabahında balıkların yumurtlamış oldukları görülecektir. Yumurtlama periyotlar halinde devam eder ve 3 hafta sürebilir.

36 Kemikli balıklarda yumurta morfolojisi Yumurtalar dişi balığın ovaryumunda gelişir. Büyüklüğü türlere göre değişiklik gösterir. Yumurtalar arasındaki bu değişiklik vitellus miktarı, vitellusun dağılışı ve sitoplazmayla ilişkisine göre meydana gelmektedir (Gong and Korzh 2004). Kemikli balık (Teleostei) yumurtalarında vitellus çok fazladır. Bölünme tipik diskoidaldir, bölünme yarıkları blastodiski aşmaz (meroblastik diskoidal bölünme). Yavrular yumurtadan ergine benzer şekilde çıkar. Yumurta hücresinin olgunlaşması sırasında sitoplazma ve nukleus bileşiminde ve yapısında bazı değişiklikler meydana gelir. Embriyonun beslenmesi için vitellus (deutoplazma) ve yağ damlalarından oluşan depo edilmiş besin materyali sitoplazma tarafından salgılanır. Yağ, karbonhidrat ve proteinlerin birikmesi olgun yumurtanın büyüklüğünü tayin eder. Tüm omurgalı yumurtalarında olduğu gibi balık yumurtalarının da etrafı primer (oosit tarafından salgılanan), sekonder (folikül hücrelerinden salgılanan) ve tersiyer (ovidukttan salgılanan) membranlarla çevrilidir. Sitoplazmanın hemen üzerinde bulunan ince plazmik membrana Zona Radiata (Primer Kılıf) denir. Bu tabakanın sayısı ve kalınlığı balığın cinsine göre değişebilir. Teleostlarda basit şekildedir. Zona Radiata nın üzerinde foliküller hücreler tarafından salgılanan jel tabakası (sekonder örtü) vardır. Jel tabakası su alarak şişer ve yapışkan hale gelir. Yumurtanın otlara vb. materyale tutunmasını sağlar. Balık yumurtalarının çoğunun diğer bir özelliği de kabuğun kalın olması nedeniyle animal kutbun yan tarafında spermin girmesine yarayan ve mikropil denen açıklığın bulunuşudur. Olgun yumurta ile dolu balık ovaryumuna olgunlaşmış ovaryum (ripel) adı verilir. Bazı balık türlerinde yumurtalar, yumurta bırakmaya hazır bir dişinin karnını sıkmak

37 25 suretiyle kolayca çıkartılabilir. Döllenmeyle hazır olmayan yumurtalar, olgunlaşmış olanlara nazaran daha serttir. Tatlı su balıklarının yeni yumurtlanmış yumurtaları oldukça yapışkan ve yumuşaktır. Bunlar süratle su alarak sertleşirler. Yumurtanın bu durumuna su sertleşmesi denir. Balıkların çoğunda yumurta ve spermler doğrudan suya bırakılır, dış döllenme meydana gelir (Gong and Korzh 2004) Zebra balığında döllenme Üremeye hazır balıklarda erkek ve dişiler arasında yakın bir ilgi meydana gelir. Bu da erkeğin dişinin yakınlarında ya da üst taraflarında yüzmesiyle sağlanır. Erkek dişiye zaman zaman çarpar ona bir yüzük şekline gelerek sarılır. Bu arada spermlerini suya bırakır. Spermler kamçı hareketiyle yumurtaya yaklaşır. Döllenmeden önce sperm yumurta kapsülünü geçerek sitoplazmaya yaklaştığı zaman yumurta sitoplazması bir miktar sıvı salarak hafif büzülür. Aynı anda jel tabakasının şişmesiyle birlikte kapsülle yumurta yüzeyi arasında sıvı dolu perivitellin bölge meydana gelir. Perivitellin sıvı yumurtanın serbestçe hareket etmesini sağladığı gibi dış etkenlere karşı (vurma, çarpma gibi) gelişen embriyoyu korur. Yumurta spermanın girişi sırasında tam olgunlaşmamıştır. Sperm girdikten sonra II. Mayoz bölünme başlar. İkinci polar cisim yüzeye atıldıktan sonra dişi pronukleusu ile erkek pronukleusu kaynaşır ve döllenme tamamlanmış olur. Spermin girişi yumurtanın sitoplazmasında bazı değişikliklere neden olur. Sitoplazmanın büyük bir kısmı animal kutba doğru akarak germinal diski (protoplazmik disk) oluşturur. Yumurtanın çevresini saran sitoplazma iyice azalarak ince bir tabaka halini alır. Bu değişikliklerden sonra döllenme sırasında sentrolesital olan yumurta artık ileri telolesital yumurtaya dönüşür. Meroblastik (kısmi) diskoidal bölünme meydana gelir (Gong and Korzh 2004).

38 Zebra balığının gelişimi ve hayat siklusu Zebra balığı embriyosunun 27 o C deki gelişim dönemleri 6 periyotta incelenebilir: a) Blastula periyodu (0-5.3 saat), b) Gastrula periyodu ( saat), c) Segmentasyon periyodu (10-24 saat), d) Faringula periyodu (24-48 saat), e) Koryondan çıkma (Hatching) periyodu (48-72 saat) ve f) Yüzen larva periyodu ( saat) (Kimmel et al. 1995, Haffter et al. 1996). a) Blastula periyodu (0-5.3 saat): Döllenmeden hemen sonra koryon tam bir küre şeklini alır. Döllenme ile oluşan perivitellin aralık koryon ile zona radiata yı (primer kılıf; döllenmemiş yumurtada vitellin zarın altındaki sitoplazmik zar) birbirinden ayırır. Koryonun kalınlığı yaklaşık 10µm olup 1.5 µm çapında sirküler porlara sahiptir. Bu koryonik yüzey su ve elektrolitlerin perivitellin aralığa girmesini sağlar (Lale 1977). Yumurta hücresinin kendisi biraz elipsoidal yapıdadır (Şekil 1.3a) ve çapı mm kadardır. Koryonun şeffaflığı nedeniyle sitoplazmada blastodisk oluşumunu gözlemek mümkündür. Döllenmeden yaklaşık 5 dakika sonra animal kutup yumurta kitlesinin yassılaşmasıyla ayırt edilir. Blastodisk sonradan yaklaşık 25 dakika içinde yassılaşır. Bu şekliyle yumurta artık tipik bir telolesitaldir (Şekil 1.3b). 45 dakika sonra blastodisk ortasından (median) dikey bir şekilde ilk yarıklanmaya (cleavage) uğrar ve biraz globüler yapıda iki eşit blastomer oluşur (Şekil 1.3c). İkinci yarıklanma 60 dakika sonra birinci bölünme düzlemine dik bir şekilde gerçekleşir (Şekil 1.3d). Döllenmeden 75 dakika sonra üçüncü yarıklanma ilk bölünme düzlemine paralel, ikincisine dik bir şekilde meydana gelir. Meydana gelen 8 blastomer genellikle dört hücrenin iki sıra oluşturacak şekilde dizilmesiyle düzenlenir (Şekil 1.3e).

39 27 Dördüncü yarıklanma döllenmeyi takip eden 1.5 saat sonra tamamlanır ve toplam 16 adet blastomer oluşur. Dördüncü yarıklanma ikinci bölünme düzlemine paralel, birinci ve üçüncü bölünme düzlemine dikey olan bir bölünmedir (Şekil 1.3f). a) b) c) d) e) f) Şekil 1.3. Zebra balığı embriyosunda gelişme. Blastula periyodu-i (0-1.5 saat). a) Zigot, b) 1 hücreli blastodisk, c) 2 hücreli blastodisk, d) 4 hücreli blastodisk, e) 8 hücreli blastodisk, f) 16 hücreli blastodisk.* Beşinci yarıklanmayla birlikte blastomer sayısı 32 ye çıkmaktadır (1.75 saat). Buraya kadar balstomerler birbirine eşit ve tek sıralıdır (Şekil 1.4a). Altıncı yarıklanma hızla beşinciyi takip eder ve tek tabakalı olan blastomerleri iki tabaka halinde ayıracak şekilde meydana gelir. Bu aynı zamanda ilk horizontal (yatay) bölünmedir. Altıncı yarıklanmayı daha düzensiz olan iki yarıklanma izler. Blastomer sayısı katlanarak artar (Şekil 1.4b). Teleost yumurtalarının çoğunda olduğu gibi burada da vitellüs kesesi bölünmelere katılmaz. Horizontal bölünmeler sonucunda blastula iki

40 28 tabakaya ayrılmıştır. Alttakine primer periblast, üsttekine ise blastoderm tabakası ve aradaki boşluğa da primer blastosöl denir (Gong and Korzh 2004). Döllenmeden sonraki üçüncü saatin başlarında çok hücreli yüksek blastoderm görülür. Yüksek blastula denmesinin nedeni animal kutupta gevşek olarak organize olmuş hücrelerin tepesinde yükselen kısımdan dolayıdır (Şekil 1.4c). Blastoderm hücreleri daha kompakt bir şekilde düzenlenirler (Şekil 1.4d). Düz blastula evresi ise döllenmeden 3.5 saat sonra tamamlanır. Blastoderm önemli derecede düzleşir ve yüzeyi pürüzsüz hale gelir (Şekil 1.4e). Gastrulasyon öncesi evrede blastodermin dorsal kenarı vitellüs yüzeyine komşu olan kısmın içine (periplast) karışır. Bu aşamanın sonunda (5.25 saat) yumurta küresel formdadır ve blastomerler artık çok küçüktür (Şekil 1.4f). a) b) c) d) e) f) Şekil 1.4. Zebra balığı embriyosunda gelişme. Blastula periyodu-ii ( saat). a) 32 hücreli blastodisk, b) 256 hücreli blastodisk, c) Erken yüksek blastula, d) Geç yüksek blastula e) Düz blastula, f) Gastrulasyon öncesi dönem.*

41 29 b) Gastrula periyodu ( saat): Erken gastrula blastodermin vitellüs küresinin üçte birini kapadığı dönemdir. Döllenmeden yaklaşık 5.5 saat sonra başlar. Blastoderm daha düz bir hale gelir. Vitellüs kütlesinin üzerini örtecek şekilde çok hızlı bölünmeler meydana gelir. Germ halkasının kenarı blastoporun dorsal dudağının lokalizasyonunu belirleyen hücresel bir involüsyon başlar (Şekil 1.5a ve 1.5b). Gastrulasyonun orta dönemi blastodermin vitellüs kütlesinin 1/2 lik kısmını kapadığı dönemdir. Döllenmeden sonraki altıncı saatten sonra blastoderm vitellüs kütlesinin yarısına kadar gelişir ve dorsal dudaktan gelişen embriyonik örtü iyice uzar (Şekil 1.5c). Geç gastrula dönemi döllenmeden sonraki yedinci saat ve sonrasında meydana gelir. Bu dönemde blastoderm vitellüs kütlesinin 3/4 ünü örter. Bu dönemde yavaş gelişen hücre kümelerinin yanı sıra hızla gelişen hücreler de vardır. Vitellüs kütlesini saran hücrelerin çoğuda bu hücrelerden ibarettir. Bu hızlı gelişen hücre kümelerinin bulunmasına epiboli denmektedir (Hisaoka and Battle 1958). Yani 3/4'lük kapama işi epiboli ile olmaktadır. Bu dönemde ayrıca geniş bir vitellüs tıkacı mevcuttur. Embriyonik örtü belirgin bir omurgaya kondanse olur (Şekil 1.5d ve Şekil 1.5e). a) b) c) Şekil 1.5. Zebra balığı embriyosunda gelişme. Gastrula periyodu ( saat). a) Erken gastrula-i, b) Erken gastrula-ii, c) Gastrulasyonun orta dönemi-i,

42 30 d) e) Şekil 1.5. (devam) Zebra balığı embriyosunda gelişme. Gastrula periyodu ( saat). d) Geç gastrula-i, e) Geç gastrula-ii.* c) Segmentasyon periyodu (10-24 saat): Segmentasyon periyoduna blastoporun kapanması dönemi de denmektedir. İlk aşamada döllenmeden on saat sonra vitellüs kütlesinin tamamı hızla gelişen germ halkası tarafından (dorsal dudak hariç) kapatılır. Embriyonun ekseni hemen hemen vitellüs kütlesinin etrafını saran yarı şeffaf bir kabartma çizgisi (sırt) olarak fark edilebilir. İki tane mezodermal somit oluşur (Şekil 1.6a). İkinci aşamada blastopor dudaklarının birleşmesinden kısa bir süre sonra önce başın arka kısmında arka-yan duvarlarının ters yüz olmasıyla optik veziküller gelişmeye başlar. Döllenmeden yaklaşık saat sonra optik veziküller net bir şekilde ortaya çıkar (Şekil 1.6b ve Şekil 1.6c). 18 saatlik embriyo artık tipik balık şekliyle tanınabilir ve işitme plakları gelişmiştir. Vitellüs kütlesinin posterior kısmında kısmi bir darlık başlar. Somitler 15 tanedir. Bu aşamaya işitme plağı dönemi de denir (Şekil 1.6d ve Şekil 1.6e). Döllenmeden yaklaşık 23 saat sonra optik vesikül invaginasyona uğrayarak optik çukur formuna dönüşür (optik çukur dönemi). Lens gelişir. Notokord işitme vezikülünden kuyruk sonuna kadar uzanır. Somitler 20 tane olmuştur. Embriyonik gövdenin özellikle posterior kısmında bir uzunluk artışı olur ve kuyruk vitellüs kütlesinden ayrılır. Kasılma hareketi bu aşamada başlar (Şekil 1.6f).

43 31 a) b) c) d) e) f) Şekil 1.6. Zebra balığı embriyosunda gelişme. Segmentasyon periyodu ( saat). a) Blastoporun kapanması 1.dönem, b)-c) Blastoporun kapanması 2. dönem (Optik vesiküler dönem [ok]). d)-e) Blastoporun kapanması 2. dönem (İşitme plağı dönemi [ok]), f) Blastoporun kapanması 2. dönem (Optik çukur dönemi [ok]).* d) Faringula periyodu (24-48 saat): Yemek borusu başta olmak üzere sindirim sisteminin gelişiminden dolayı bu periyoda faringula periyodu denmektedir. Otolit oluşumu döllenmeden sonraki 27. saatte başlar (otolit formasyonu dönemi) ve kuyruk epeyce uzar. Kalp atışı başlar ve 1-2 saat içinde sirkülasyon görülebilir (Şekil 1.7a). Somitler 30 tanedir. 37. saatte retinal pigmentasyon dönemi başlar. Gözün retina tabakasındaki melanin gözün görünür hale geçmesine neden olur. Beyin ventrikülleri net bir şekilde görülür. Baş vitellüs kütlesine bağlandığı yerden ayrılmaya başlar. Median dorsal yüzgeç ve kaudal yüzgeç belirir. Kan dolaşımı özellikle vitellüs kütlesi etrafında görülebilir (Şekil 1.7b). Retinada melanin oluşumundan sonra oldukça geniş yıldız şeklinde melanoforlar baş bölgesinin üzerinde, vitellüs kütlesinin yüzeyinde ve karın çevresinde görülmeye başlar

44 32 (vücut pigmentasyonu dönemi). Sonradan 48. saatte melanoforlar tüm kuyruk ve yüzgeçler boyunca yayılır. Barsak, hava kesesi ve karaciğer gelişir (Şekil 1.7c). a) b) c) Şekil 1.7. Zebra balığı embriyosunda gelişme. Faringula periyodu (24-48 saat). a) Otolit formasyonu dönem (ok), b) Retinal pigmentasyon dönemi (ok), c) Vücut pigmentasyonu dönemi. * e) Koryondan çıkma (Hatching) periyodu (48-72 saat): Embriyo koryondan çıkmaya hazır hale gelirken bir yandan da baş bölgesinde başlayan yaygın bir sarı renklenmenin sonucu olarak ksantoforlar belirmekte ve tüm embriyonun kaudal kısmına doğru yayılmaktadır. Anterior kısımda 15 porteriörde 19 somit bulunur ki bu erişkindeki karakteristik sayıdır. Çenelerde kıkırdak oluşumu başlamaktadır. Kalp atışı düzenli olup dakikada 191 kez atmaktadır. Kuyruğun şiddetli kontraksiyonuyla koryon herhangi bir yerden yırtılmakta ve larva dışarı çıkmaktadır (Şekil 1.8a). Aynı şartlar altındaki yumurtaların çoğunun koryondan çıkma zamanları oldukça değişiktir. Ama bu süre normal olarak 26 o C de yaklaşık 72. saatte tamamlanır. Pigmentasyon yoğundur ve melanofor yıldızları Zebra balığının karakteristik çizgileri şeklinde düzenlenir. Optik çukur pigmentlenir ve gözlerin irisinde sarımtırak hafif bir renk gözlenir. Karaciğer gibi iç organlar, barsaklar ve hava kesesi yarı saydam olan vücut duvarından ayırt edilebilir. Yüzgeçler belirgindir ve larvalar kısa aralıklarla yüzerler (Şekil 1.8b ve 1.8c).

45 33 a) b) c) Şekil 1.8. Zebra balığı embriyosunda gelişme. Koryondan çıkma (hatching) periyodu (48-72 saat). a) Koryondan yeni çıkmış erken larva, b) Pigmentasyon ve büyüyen larva, c) 72 saatlik larva. * f) Yüzen larva periyodu ( saat): Larvalar artık daha seri ve devamlı yüzmektedirler. Periyodun sonuna doğru hava keseleri şişmeye başlar. Vitellüs keseleri tamamen bittiği için beslenmeye ihtiyaç duyarlar. Yumurta sarısını çok severler (Alpbaz 1993). Tüm vücut kısımları gelişmiş hatta Zebra balıklarına özgü olan çizgilenmeler de netleşmeye başlamıştır. Cinsiyet tayini yapmak eşey karakterleri belirmediğinden mümkün olamamaktadır (Şekil 1.9a, Şekil 1.9b, Şekil 1.9c ve Şekil 1.9d).

46 34 a) b) c) d) Şekil 1.9. Zebra balığı embriyosunda gelişme. Yüzen larva periyodu ( saat). a) 96 saatlik larva (dorsal), b) 96 saatlik larva (Lateral), c) 120 saatlik larva (dorsal), d) 120 saatlik larva (Lateral). * *Materyal ve Yöntem bölümünde belirtilen prosedüre uygun olarak elde edilen balık yumurtaları Holtfreter Solüsyonu bulunan petri kaplarına alınmış ve ilk andan itibaren yaklaşık 5. günün sonuna kadar gözlem yapılarak dijital kamera destekli stereo mikroskopla yumurtaların gelişim fotoğrafları çekilmiştir. Fotoğraflarda periyod tespiti Kimmel et al. (1995) e uygun olarak yapılmıştır.

47 Zebra balığında çevresel ajanlarla görülebilecek toksikolojik etkiler Gelişimin erken evrelerinde çevresel ajanlarla muamele edilen Zebra balığının embriyoları genellikle anormallik gösterirler. Kullanılan toksik ajanın konsantrasyonundaki oran, muamele süresi ve birikim bu anormalliklerin ortaya çıkışında kritik parametrelerdir (Laale 1977). Zebra balığında gözlemlenen anormallikler genellikle ödem ve dolaşım bozuklukları, merkezi sinir sisteminin ve duyu organlarının organizasyonundaki bozukluklar, notokord ve adale malformasyonları ve epidermal aberasyonlar şeklindedir (Todd and Leeuwen 2002; Argenton et al. 2004; Hallare et al. 2005; Fraysse et al. 2006). Gövde ve kuyruk anormallikleri en sık rastlanılan teratojenik anormalliklerdir. Kuyrukta kısalma ve sıklıkla sağa veya sola kırık görülebilir. Buna ilaveten pigmentasyonda da değişiklik meydana gelebilir. Beyin, periton ve perikardiyal boşluklardaki ödem, dokuların aşırı şişmesi ve büyümesiyle ortaya çıkar. Ödeme genellikle vasküler sirkülasyondaki düzensizlikler ve durgunluk eşlik eder. Kalp tüpü genişleyebilir, kontraktil özellikleri zayıflayabilir, kalp atımı zayıflar ve tamamen kaybolur. Merkezi sinir sistemi düzensizlik gösterebilir. Omurilik ve beyinde sıklıkla düzensiz boşluklar gelişir ve bu boşluklar gevşek hücre topluluklarıyla doludur. Gri ve beyaz madde arasındaki bariz sınır çizgisi genellikle kaybolur. Duyu organları etkilenir, özellikle gözlerde teratojenik faktörlere hassasiyet görülür. İşitme ve koku yapılarında hassasiyet kaybı da diğer bozukluklardır. Zebra balığında görülen toksik etkilerin çoğu ölümle sonuçlanan anormalliklerdir. Ancak süreleri farklıdır. Örneğin koagule olan embriyo da ölüm döllenmeden sonraki 1.5 saat içinde gerçekleşirken kuyruk anormalliği gösteren bir larvanın ölümü fertilizasyondan sonraki saat civarlarında gerçekleşir. Zebra balığının erken gelişim evrelerine göre tespit edilen karakteristik özellikleri ve toksik maddelere karşı gelişen gelişimsel anormallikleri Çizelge 1.2 de verilmiştir.

48 36 Çizelge 1.2. Zebra balığı embriyolarında toksik maddelere karşı verilen toksik yanıtlar (Kimmel et al. 1995). Gelişim periyodu a Yarıklanma %75 epiboli Faringula Koryondan çıkış Erken larva Saat Karakterizasyon Diskoidal Embriyo hala Kuyruk ve bölünme küresel, somitler gerçekleşir epiboli ilerler gelişir Kalp atımı, pigment oluşumu, kan dolaşımı gerçekleşir Serbest larva düz kuyruk, kalp düzenli atar Toksikoljik parametreler Letal Koagule/ölü embriyo Kuyruk ayrılması Kalp atışı Subletal Gelişimde gerileme Somit gelişiminde gerileme Spontan hareket + + Göz gelişiminde gerileme Otolit gelişiminde gerileme Yavaş kan dolaşımı + + Düşük kalp oranı + b + Ödem b Koryondan geç çıkış + b + b Teratojenik belirtiler Kuyruk malformasyonu Kuyruk kısalığı + + b a Gelişim periyotlarını Kimmel et al. (1995) tanımlamıştır. b En kolay tanımlanabilen toksikoljik belirtiler. + b Zebra balığı ile çalışmanın avantajları Balık gibi sucul omurgalılar çevreden yayılan çeşitli stres faktörlerine diğer canlılardan daha fazla maruz kalırlar. Bu nedenle balıklarla ilgili yapılan ekotoksikolojik araştırmalar oldukça önemlidir. Son yıllarda ekotoksikoloji çalışmalarında Danio rerio (Zebra balığı) yumurtaları ve embriyoları sıklıkla kullanılmaya başlamıştır. Zebra balıkları, dayanıklı bir tür olmalarının yanı sıra kolay bulunabilmesi, laboratuvar ortamında kolay beslenebilmesi ve çoğalmaları, yüksek fekondite göstermesi (ergin dişiler haftalık aralıklarla yüzlerce yumurta bırakır), dış döllenmeyle üremesi, yumurta ve embriyolarının saydam oluşu,

49 37 yumurta ve larva gelişiminin kolay izlenebilmesi, jenerasyon zamanının kısa olması ve toksik ajanlara embriyolarının duyarlı oluşu bakımından toksikoloji çalışmalarında oldukça sık başvurulan bir test organizması olmuştur (Hisaoka and Battle 1958; Kimmel et al. 1995; Lele and Krone 1996). Öyle ki toksik etkisinden şüphelenilen bir ajanın toksik olup olmadığı bu balık türünün embriyolarına 48 saatlik uygulama sonucunda elde edilen verilere göre karar verilebilmektedir (DIN 2002). Öte yandan son zamanlarda Zebra balığı insan ve diğer omurgalıların hastalıklarının araştırılmasında mükemmel bir model organizma olarak kullanılmaktadır. Bunun nedenleri, Zebra balığı ile insan ve diğer omurgalıların genom yapılarının benzer oluşu, metabolizmalarının ve embriyonik gelişimlerinin hemen hemen aynı olması, en önemlisi insanlarda bulunan tümör baskılayıcı genin (sitokrom P450 grubu) Zebra balığında da keşfedilmiş olmasıdır. Bunlara ilaveten ksenobiyotik metabolizmanın faz I ve faz II enzim sistemi bu balık türünde de bulunmaktadır (Stern and Zon 2003). Ayrıca laboratuvar farelerine göre hayat döngüsünün daha kısa sürede tamamlanması, farelerle yapılan deneylerin aynılarının bu balık türüyle de yapılabilmesi ve hatta daha fazla neslin takip edilebilmesi (özellikle teratojenik testlerde) diğer bir tercih nedeni olmuştur. Keza farelerde embriyo gelişimi anne vücudu içinde olmakta ve bu da araştırıcıya embriyoyu en başından takip etme şansını vermemektedir. Oysa Zebra balığı embriyoları anne vücudu dışında gelişmekte ve döllenmeden itibaren zigotun gelişimi takip edilebilmektedir. Toksikoloji araştırmalarında Zebra balığının tercih edilmesinin diğer bir nedeni uygulanan testin kısa oluşu ve sonuçların tartışmasız net oluşudur (Çizelge 1.3). Çizelge 1.3. Toksikoloji çalışmalarında balık embriyolarının kullanımı (Fraysse et al. 2006). Evre Toksikoljik etkiler Toksikolojik sonuç Test süresi Balık türü Kaynaklar Embriyo Toplam ölüm Letal gün Danio rerio OECD 1992 Pro-larva Koryondan çıkış Subletal Larva Anormal larva Subletal Embriyo Toplam ölüm Letal 8-10 gün Danio rerio OECD 1998 Pro-larva Koryondan çıkış Subletal Larva Anormal larva Subletal Embriyo Yumurta koagulasyonu Letal 48 saat Danio rerio DIN 2002 Somitlerin gelişimi Letal Kuyruk ayrılması Letal Kalp atışı Letal

50 38 Tablodan da anlaşılacağı üzere bu balık türünün sadece yumurta ve larvalarını kullanmak suretiyle bir maddenin toksisitesi hakkında kolayca sonuca varılabilmektedir. Zebra balığının en büyük avantajı da budur. Ayrıca yurdumuzda da Zebra balığı yumurtaları kullanılarak su kalitesi hakkında önemli bilgiler elde edilmektedir. Türk Standartları Enstitüsü Kurumu, Çevre İhtisas Grubuna hazırlattığı ve tarihinde kabul ettiği TS 6021 EN ISO ve TS 6022 EN ISO nolu dökümana göre iki farklı metotla Zebra balığı yumurtaları kullanılarak su kalitesi ölçümü yapılmaktadır (Çizelge 1.4) (TSE 2007). Bu açıdan yaklaşıldığında çalışmamız için Zebra balığının neden seçildiği daha iyi anlaşılmaktadır. Çizelge 1.4. TSE ye göre Zebra balığının su kalitesi tespitinde kullanıldığını gösteren standart düzenleme. Ts No Türkçe başlık Yararlanılan kaynak TS 6021 EN ISO TS 6022 EN ISO Su Kalitesi- Maddelerin Bir Tatlı Su Balığı [Brachydanio rerio Hamilton- Buchanan (Teleostei, Cyprinidae)] Üzerindeki Akut Öldürücü Zehirliliğinin (Toksisitesinin) Tayini- Bölüm 2: Yarı Statik Metot Su Kalitesi-Maddelerin Bir Tatlı Su Balığı [Brachydanio rerio Hamilton- Buchanan (Teleostei, Cyprinidae)] Üzerindeki Akut Öldürücü Zehirliliğinin (Toksisitesinin) Tayini- Bölüm 3: Sürekli Akış Metodu EN ISO :1976 EQV EN ISO :1997 EQV Kapsam Bu standard, belirli kalitedeki bir suda, bir tatlı su balığına [Brachydanio rerio Hamilton- Buchanan (Teleostei, Cyprinidae) - Yaygın adı zebra balıkları] kararlı, uçucu olmayan, belirli koşullarda suda çözünen ve tayini yapılacak maddeden başka herhangi bir maddenin bulunmadığı durumlarda bir maddenin anlık öldürücü zehirliliğinin (akut lethal toksisitesinin)- yarı- statik metotla tayini Bu standard, belirli kalitedeki bir suda, bir tatlı su balığına [Brachydanio rerio Hamilton- Buchanan (Teleostei, Cyprinidae) - Yaygın adı zebra balıkları] kararlı, uçucu olmayan, belirli koşullarda suda çözünen ve tayini yapılacak maddeden başka herhangi bir maddenin bulunmadığı durumlarda bir maddenin anlık öldürücü zehirliliğinin (akut lethal toksisitesinin) sürekli-akış metoduyla tayinini

51 39 Günden güne artan insan nüfusu ve gelişmekte olan ülkelerle gelişmiş ülkelerde endüstrinin hızlı gelişimi nedeniyle endüstriyel kaynaklı çevre kirleticileri doğaya daha çok karışmakta ve bu durum tüm dünyada teknik ve bilimsel topluluklarda acil araştırma konuları haline gelmektedir. PCB ler bu kirleticilerden biri olmakla birlikte insanoğlunun yaşamını tehdit eder hale gelmiştir. Endüstrileşmiş bölge insanının yağ dokusundaki PCB birikimi gün geçtikçe artmakta ve uzun vadede kanser riski için potansiyel tehlike oluşturmaktadır. Ayrıca ekosisteme yayılmış olan PCB bileşikleri özellikle su ve sedimentlerde yaygın bir şekilde bulunmakta ve akuatik canlıları tehdit etmektedir. Bu stres faktörünün biyolojik etki mekanizmasının tam anlamıyla aydınlatılamamış olması, her ne kadar üretimi sınırlandırılmış ve kontrol altına alınmış olsa da tehlikenin devam etmesi de ayrı bir sorun olarak karşımıza çıkmaktadır. Buradan hareketle yapacağımız çalışmanın ana hedeflerini şöyle özetlemek mümkündür: 1- Endüstriyel olarak çevreye girdiği bilinen PCB bileşiklerinden Zebra balığı üzerinde daha önce denenmemiş olanlarının bu balığın yumurta, embriyo ve larvaları üzerinde teratojenik etkilere yol açıp açmadığını araştırmak ve LD 50 dozlarını bulmak, 2- PCB bileşiklerinin Zebra balığı larvalarının (8 günlük) karaciğerinde herhangi bir histopatolojik etkiye sebep olup olmadığını, oluyorsa etkinin düzeyini belirlemek, 3- PCB bileşiklerinin Zebra balığı larvalarının duyusal hassasiyetini etkileyip etkilemediğini tespit etmek, 4- Yukarıda belirtilen araştırmalar neticesinde PCB nin biyolojik etki mekanizmasının işleyişiyle ilgili verilere katkıda bulunabilmek ve bu sayede PCB lerin aynı yolla insanları etkileyip etkileyemeyeceği hakkında fikir ileri sürebilmek.

52 40 2. KAYNAK ÖZETLERİ Baştürk vd. (1980) PCB kalıntı düzeylerini belirlemek amacıyla yaptıkları çalışmalarında Akdeniz in doğu kıyılarından dört farklı balık tür ve dip çamuru (sediment) örnekleri toplamışlar ve analiz sonucunda PCB düzeyinin yaşayan organizma ve sedimentlerde çok düşük seviyelerde olduğunu bulmuşlardır. Gould et al. (1997) yaptıkları bir araştırmada, 10 günlük tavuk embriyolarına 10µl Aroclor 1242 ve Aroclor 1254 enjekte etmişler ve 17 gün sonraki incelemelerinde Aroclor 1242 ve Aroclor 1254 ün vücut ağırlığını düşürdüğünü, kemik uzamasını olumsuz etkilediğini gözlemlemişlerdir. Bu durumu da karışım içinde bulunan PCB lerin genel toksisitesine bağlamışlardır. Billsson et al. (1998) Zebra balığı döllenmiş yumurtalarına 50 µl PCB60, PCB104, PCB173 ve PCB190 enjekte etmişler ve sonuçta yüksek oranda ölüm, ödem oluşumu, yavaş embriyonik gelişim ve anteriör malformasyonların meydana geldiğini tespit etmişlerdir. Koponen et al. (1998) üç farklı dozda (1, 10 ve 100 µgl -1 ) PCB77 yi gökkuşağı alabalığı embriyolarına uygulamışlar ve bu konjenerin balık embriyolarında biriktiğini gözlemlemişlerdir. Tuncer vd. (1998) 1993 yılında Karadeniz kıyıları ve Karadeniz e dökülen dere ve ırmaklarda kirlilik düzeyi ile ilgili yaptıkları çalışmada 42 noktanın hemen hemen hepsinde PCB kalıntılarına rastlamışlardır. Arınç ve Şen (1999) İzmir Körfezi ndeki organik kirleticilerin toksisitelerini araştırmak amacıyla bu bölgede yaşayan çulara balığı (Liza saliens) ve dil balığı (Solea vulgaris) türlerinin özellikle karaciğer enzimlerinin seviyesine bakmışlar ve EROD

53 41 (ethoxyresorufin -O-deethylase) aktivitesinde kontrole oranla 62 kat bir artışın olduğunu ve CYP1A monooksigenaz seviyesinde de anlamlı bir artmanın varlığını belirlemişlerdir. Gutleb et al. (1999) PCB lerin etkilerini iki yaşamlılarda (amfibiler) araştırmışlardır. Yaptıkları çalışmada Xenopus laevis ve Rana temporaria iribaşlarına gelişim süreleri boyunca Clophen A50, Aroclor 1254 ve PCB126 uygulamışlar ve sonuçta larvalarda vücut ağırlığının düştüğünü, gelişim periyodunun uzadığını, ölümlerin arttığını ve çeşitli vücut kısımlarında anormalliklerin olduğunu gözlemlemişlerdir. Olsson et al. (1999) PCB60, PCB190 ve PCB104 ü Zebra balığı ergin dişilerine enjeksiyonla vermişler ve dişilerin yumurta veriminde bir azalmanın olduğunu tespit etmişlerdir. Ayrıca karaciğerden hazırlanan histolojik preparatlarda hipertrofi, hepatositlerde dejenerasyon ve böbrekte de nekrozların ortaya çıktığını bulmuşlardır. Westerlund et al. (2000) 8 farklı PCB konjenerini (PCB60, PCB104, PCB112, PCB126, PCB143, PCB184, PCB173, PCB190) mikroenjeksiyonla Zebra balığına uygulamışlar ve en yüksek toksisiteye PCB104 ün neden olduğunu rapor etmişlerdir. Andersson et al. (2001) PCB lerin biyoakümülasyonu ile ilgili yaptıkları araştırmada Danio rerio, Gasterosteus aculeatus ve Salvelinus alpinus balıklarına üç farklı yolla (diyetle, fındık yağıyla birlikte enjeksiyonla ve silikon kapsül yedirilerek) PCB vermişler ve türlerin hemen hemen hepsinde her üç yolla da PCB lerin birikebileceğini göstermişlerdir. Sonuçta Danio rerio da 91. günde g, Gasterosteus aculeatus da 83. günde 0.3 g ve Salvelinus alpinus da da 70. günde 13.5 g PCB tespit edilmiştir. Görücü (2001) Türkiye de PCB maruziyetinin varlığı ile ilgili yapmış olduğu çalışmasında Ankara da yaşayan annelerin adipoz doku ve süt numunelerinde kayda değer oranlarda PCB bileşiklerine rastlamıştır.

54 42 Henry et al. (2001) çeşitli poliklorlu bileşiklerin kombine etkilerini belirlemek amacıyla Danio rerio karaciğer hücrelerini kullanmışlardır. Deney sonucunda poliklorlu dibenzop-dioksin (PCDD), dibenzofuran (PCDF) ve bifenil (PCB) uygulanan karaciğer hücrelerinde CYP1A mrna sayısında artışın olduğu bulunmuştur. Twaroski et al. (2001) Sprague-Dawley ratlara 3 hafta boyunca haftada iki sefer enjeksiyonla 100 µmol/kg/enjeksiyon PCB77 ve PCB153 vermişler ve anormallikleri gözlemlemişlerdir. Deneyde tespit edilen defektler ise şunlardır: Her iki konjenerde çeşitli karaciğer enzim aktivitelerinde çok az artma, ancak transkripsiyon faktör AP-1 in DNA bağlama aktivitesinde normalden daha fazla bir artma ortaya çıkmıştır. Keza α- tokofreol kuinonda da ciddi artışların olduğu ve PCB maruziyet analizlerinde bu parametrenin kullanılabileceği vurgulanmıştır. Brown et al. (2002) genç gökkuşağı alabalıklarını 30 gün boyunca 12.4 ve 126 ng -1 PCB126 içeren besinler vermişler, sonra 160 gün süreyle de normal diyetle beslemişlerdir. Sonuçta 14 C ile işaretlenmiş PCB126 nın biyomagnifikasyon faktörü 2.4 ten 4.1 e çıkmasıyla bu bileşiğin balık vücudunda birikebileceği anlaşılmıştır. Ayrıca karaciğer EROD aktivitesi kontrolden 44 kat daha fazla tespit edilmiş, tüm bu olumsuzluklara rağmen karaciğer ve tiroid histolojilerinde herhangi bir yapı anormalliğinin olmadığı belirlenmiştir. Lobel and Davis (2002) PCB bileşiklerini immunohistolojik olarak belirleyebilmek için yine yüksek oranda PCB lerce kirletilmiş Pasifik Okyanusu kıyılarından mercanlar arasında yaşayan rahip balığının (Abudefduf sordidus) embriyo ve larvalarını toplayarak PCB analizi yapmışlardır. PCB kontaminasyonundan etkilenmiş larva embriyolarda anormallik tespit etmişler ve bunun nedeni olarak embriyo zarlarında immunohistokimyasal olarak saptanan PCB leri göstermişlerdir. Roode and Brink (2002) yaptıkları bir çalışmada tavuk embriyolarına iki farklı dozda (%2 ve %18) Aroclor 1254 enjekte etmişler ve ilk dozun 13. günde ikinci dozun da 19.

55 43 günde embriyoların vitellüs kütlesi tarafından absorbe edildiğini bulmuşlardır. Bu süre içinde vitellüs kütlesi içindeki lipid miktarının aynı kaldığını tespit eden araştırmacılar embriyo vücuduna PCB lerin öncelikli olarak girdiğini göstermişlerdir. Schmalz et al. (2002) yaptıkları bir çalışmada poliaromatik hidrokarbon (PAH), PCB ve diğer ağır metallerce kirlenmiş New Jersey Linden kıyılarında yaşayan Fundulus heteroclitus un (galyon balığı) karaciğerinden aldıkları doku örneklerinde fokal nekrosis ve basofilik lezyonlar tespit etmişlerdir. Smeets et al. (2002) çeşitli balık türlerinin karaciğer hücre kültürünü kullanarak PCB lere bağlı olarak sitokrom P450 1A (CYP1A) aktivitesini ölçmüşlerdir. Bu amaçla Microstomus kitt, Limanda limanda, Platychthyis flesus ve Oncorhynchus mykiss in karaciğer kültüründe primer hepatositlerine PCB126 yı iki gün buyunca uygulamışlar ve doza bağlı olarak CYP1A aktivitesinde belirgin bir artış gözlemlemişlerdir. Tugiyono (2002) pembe çıt çıt balığı (Pagrus auratus) ile yaptığı çalışmasında PCB126 nın balık metabolizmasını nasıl etkilediğini araştırmak için yer fıstığı yağı ile birlikte 10 µg PCB126 vermiş ve EROD, sitokrom-c-oksidaz (CCO), sitrat sentaz (CS) ve laktat dehidrogenaz (LDH) aktivitelerinde artışların olduğunu göstermiştir. Çok ve Şatıroğlu (2004) Ankara da yaşayan emziren annelerin adipoz dokularından aldıkları numunelerde PCB analizi yapmışlar ve sonuçta PCB28, PCB52, PCB101 ve PCB153 ün diğerlerine nazaran daha yüksek düzeyde ortaya çıktığını bulmuşlardır. Erdoğrul vd. (2004) Kahramanmaraş ta yaşayan annelerin sütlerinde organohalojen kararlı kirleticilerin seviyelerini belirlemek amacıyla yaptıkları araştırma neticesinde alınan 37 örnekte PCB düzeyinin çok düşük, 1,1,1-trikloro-bis-2,2 -(4-klorofenil)-etan (P,P -DDT) ve bunların metabolitlerinin ise yüksek çıktığını rapor etmişlerdir.

56 44 Kurt ve Özkoç (2004) Orta Akdeniz kıyılarındaki deniz suyu ve midyelerinde (Mytilus galloprovincialis) klorlu pestisit ve PCB kalıntılarının analizini yapmışlardır yılında yapılan bu çalışmada deniz suyunda herhangi bir kalıntı izine rastlanmazken özellikle nehirlerin denize döküldüğü yerlerden toplanan midyelerde PCB düzeyinin fazla olduğu tespit edilmiştir. Oskam et al. (2004) PCB99 ve PCB153 ün 8 haftalık genç C57BL6 farelerinde spermatogenesis üzerine olan etkilerini araştırmışlardır. Oral yolla 10 ve 100mg/kg PCB99 ve PCB153 altı hafta süreyle farelere yedirilmiş ve 6. haftanın sonunda farelerin üreme hücrelerinde ve vücut ağırlığında önemli derecede azalmayla birlikte ayrıca Leydig hücrelerinin apoptosisinde de artış kaydedilmiştir. Erdoğrul vd. (2005) Kahramanmaraş ta yaptıkları ikinci çalışmada Kahramanmaraş Baraj gölünde yaşayan dört balık türünde (Acanthobrama marmid, Cyprinus carpio, Chondrastoma regium, Silurus glanis) organoklorlu pestisit (OCPs), poliklorlu bifenil (PCBs) ve polibromludifenil eter (PBDEs) düzeylerini araştırmışlar ve PCB ile PBDE seviyelerinin Avrupa ve Amerika da tespit edilen düzeyden düşük olduğunu belirlemişlerdir. Hussam et al. (2005), yoğun bir şekilde PCB lerce kirlenmiş Florida Everglades Körfezi nde yaşadıkları bilinen altı farklı akuatik gruba (yıllık balıklar, canlı doğuranlar, güneş balıkları, kerevit, Florida Gar-Lepisosteus platyrhincus, kedibalığı) 0.1 µg l -1 PCB uygulamışlar ve bu bileşiklerin bu balık gruplarında üreme ve yaşam süresi üzerine negatif etkilerinin olduğun tespit etmişlerdir. Kuzyk et al. (2005) PCB kalıntısının çok olduğu Kanada Saglek Körfezi nden 7 farklı noktadan topladıkları 35 adet Myoxocephalus scorpius balığının karaciğerini incelemişler ve neticede balık karaciğerlerinde EROD aktivitesinin arttığını gözlemlemişlerdir.

57 45 Mi and Zhang (2005), 18 günlük tavuk embriyolarına 10µg/ml bir PCB karışımı olan Aroclor 1254 uygulamış ve sonuçta bu karışımın embriyonik üreme hücreleri üzerine hormonal ve sitotoksik etkilerinin olduğunu tespit etmişlerdir. Ayrıca karışımdan etkilenen ergin tavuklarda ise infertilite görülmüştür. Schmidt et al. (2005) sazan (Cyprinus carpio) balıklarının besinlerine 21 gün süreyle 10µg/ml Aroclor 1254 katmışlar ve bu yemle beslenen balıklarda GST (glutatyon-s transferaz) aktivitesinin arttığını, yüzme davranışlarında değişmeler olduğunu ve vücut uzunluğunda bir azalmanın meydana geldiğini tespit etmişlerdir. Vaccaro et al. (2005) deniz levreği (Dicentrarchus labrax) erkeklerinde östrojenik aktivite, faz1 ve faz2 biyotransfromasyon enzimleri üzerine PCB126 nın etkilerini incelemişlerdir. 100 µg/kg PCB konjenerinin ergin erkek balıklarda hepatik CYP1A ya bağlı EROD aktivitesinde (faz1) ve Glutatyon-S-transferaz (GST) (faz2) aktivitesinde bir artışa yol açtığı ve buna bağlı olarak PCB126 nın erkek balıklar üzerinde antiöstrojenik potansiyele sahip olduğu vurgulanmıştır. Arzuaga et al. (2006) Fundulus heteroclitus un embriyonik gelişimi boyunca PCB126 nın reaktif oksijen türlerinin (ROS) oluşup oluşmadığına bakmışlardır. 0.3 µm PCB126 nın embriyonik karaciğerde ROS üretimini arttırdığını ve CYP1A enzim aktivitesinde de anlamlı artışların gözlendiğini rapor etmişlerdir. Castoldi et al. (2006) 20 mg/kg vücut ağırlığı/gün PCB153 ü ergin dişi ratlara oral yolla 21 gün boyunca yedirmişler ve öncelikle hippocampus serebellum ve serebral kortekste enzim aktivitesini incelemişlerdir. Araştırmacılar bu bölgelerdeki enzimlerin (dopamin, serotinin, 5-hidroksi-indol-3-asetik asit ve homovanillik asit) aktivitelerinde bir azalma ve dopaminerjik sistemde anormalliklerin olduğunu bulmuşlardır. Coelhan vd. (2006) Marmara Denizi nden yakalanan yenilebilir balıklarda yaptıkları kalıntı analizi sonucunda en fazla DDT ye rastlamışlardır. Buna ilaveten PCB

58 46 konjenerlerinden PCB28, PCB52, PCB101, PCB118, PCB138, PCB153 ve PCB180 in varlığı tespit edilmiş ancak bu seviyenin Ege Denizi ve Akdeniz den daha düşük olduğu bildirilmiştir. Çok vd. (2006) ilk kez Ankara da yaşayan yaş arası 23 erkeğin adipoz dokusunda PCB, PCDF ve PCDD seviyelerini araştırmışlar ve her üç kontaminantın da varlığını tespit etmişlerdir. Danis et al. (2006) yaptıkları bir denemede koplanar ve koplanar olmayan PCB lerin biyoakümülasyonunu ve immunotoksisitelerini araştırmışlardır. Fransa Nord-Pas-de- Calais (Audresselles) den toplanan ve laboratuar ortamına adapte edilen deniz yıldızlarına (Asterias rubens) farklı dozlarda Koplanar (PCB77, PCB126, PCB169) ve koplanar olmayan (PCB28, PCB52, PCB101, PCB118, PCB138, PCB153, PCB180) PCB ler uygulanmış ve sonuçta koplanar PCB konjenerlerin biyoakümülasyonu ve immunotoksisiteleri arasında önemli bir korelasyon bulunmuş, koplanar olmayanlarda ise sadece biyoakümülasyonun olduğu tespit edilmiştir. Erdoğrul (2006) Kahramanmaraş ta piyasada satılan ballarda pestisit analizi yapmış, 32 farklı pestisit, 8 farklı polibormlu difenil eter (PBDE) konjeneri ve PCB lerden de sadece PCB28 i tespit etmiştir. McGraw and Waller (2006) yaptıkları bir çalışmada, insandaki rekombinant sitokrom P450 2A6 (CYP 2A6) enziminin PCB101 konjenerinin metabolizmasından sorumlu olduğunu göstermişlerdir. Kunz et al. (2006) rat karaciğerinde PCB28 ve PCB101 in etkilerini belirlemek amacıyla 50 ve 150µmol/kg vücut ağırlığı miktarında PCB leri haftada bir kez olmak üzere 8-16 hafta ratlara vermişler, PCB28 in hafif hepatik EROD aktivitesine yol açtığını ve PCB101 in neredeyse hiç etkilemediğini gözlemlemişlerdir.

59 47 Pereira and Rao (2006) 21 günlük Wistar ratlarında PCB ve dietilfitalatın (DEP) toksisitesini araştırmak üzere sağlıklı dişi ve erkek ratlara diyetle Clophen A60 ve DEP yedirmişler ve test sonucunda her iki eşeyde de karaciğerin büyüdüğünü, laktat dehidrogenaz ve asit fosfataz seviyelerinde bir artışın olduğunu tespit etmişlerdir. Karaciğer histolojisinde ise hepatositlerde kuvvetli vakuolasyon (hücre içi aşırı yağ birikimi) ve steatosis (hepatosit dejenerasyonu) ortaya çıkmıştır. Her iki maddenin sinerjistik etki yaptıklarına hükmedilmiştir. Schlezinger et al. (2006), Stenomotur chrysops balığında yaptıkları denemede 0.14, 0.08 µm PCB126 ve PCB169 un balık karaciğeri mikrozomlarında sitokrom P450 1A enzimini bağladığını, EROD aktivitesini arttırdığını ve reaktif oksijen radikallerinin oluşumunu tetiklediğini bulmuşlardır. Şişman vd. (2006), yaptıkları bir araştırmada PCB ile aynı grupta bulunan diğer bir poliklorlu kirletici Poliklorlu naftalenin (PCN) iki farklı konjenerini (PCN27 ve PCN46) iki farklı dozda (20 ve 30 µg/l) Zebra balığı embriyolarına uygulamışlar ve sonuçta balık embriyolarında fertilizasyondan saat sonra konjenerin çeşidine ve konsantrasyonuna bağlı olarak çeşitli teratojenik etkiler ve ölümlerin olduğunu gözlemlemişlerdir. Vega-Lopez et al. (2006a) Girardinichthys viviparus balıklarının ergin bireylerine PCB yedirmişler ve konjener çeşidi ve konsantrasyonuna bağlı olarak 1, 2, 4, 8 ve 16. günlerde ölümlerin meydana geldiğini bulmuşlardır. Vega-Lopez et al. (2006b) Girardinichthys viviparus balıklarıyla yaptıkları ikinci denemede PCB bileşiklerinin toksisitelerinin eşeye bağlı gelişip gelişmediğini araştırmışlar ve sonuçta 8 günlük maruziyeti takiben erkek balıkların karaciğerinde lipid peroksidasyon (LPOX) seviyesinin dişilere oranla arttığını, Süperoksit dismutaz (SOD) aktivitesinin her iki eşeyde de düştüğünü ve 16 günlük maruziyette ise erkek balıklarda katalaz (CAT) aktivitesinin arttığını rapor etmişlerdir.

60 48 3. MATERYAL ve YÖNTEMLER 3.1. Materyal Zebra balığı kültürleri Damızlık Zebra balıkları Atatürk Üniversitesi Ziraat Fakültesi Su Ürünleri Bölümü Akvaryum Balığı Üretim ve Araştırma Merkezi ve akvaryumculardan temin edildi. Balıklar 40x60x100 cm (yükseklik, en, boy) ebadında stok akvaryumlarında dişi ve erkekler birbirlerinden ayrı olarak stoklandı. Akvaryumlar sürekli olarak filtreli bir hava pompasıyla havalandırıldı ve temizlendi. Akvaryum ısısı termostatlı ısıtıcılarla 26 o C civarında tutuldu. Yemleme (pul tetramin) günde 2-3 kez yapıldı. Haftada en az bir kez canlı yem (Daphina) verildi. Akvaryumun bulunduğu ortam fotoperiyodu sağlamak için 14 saat aydınlık, 10 saat karanlık olacak şekilde ışıklandırıldı. Akvaryumların suyunun ph sı 8, su sertliği de 25 mg/l Ca olacak şekilde ayarlandı (Hallare et al. 2005). Çiftleştirme akvaryumu olarak 24x28x40 cm (yükseklik, en, boy) ebadında 4 adet akvaryum kullanıldı. Bu akvaryumlara 2 gün dinlendirilmiş çeşme suyu kondu. Filtre kullanılmazken suyun ısısı yine termostatlı ısıtıcılarla 26 o C ye ayarlandı. Her çiftleştirme akvaryumunun tabanına balıkların yumurtalarını yemelerini önlemek için amacıyla iki sıra cam bilye yerleştirildi. Bu şekilde hazırlanan akvaryumların bulunduğu ortam yine 14 saat aydınlık, 10 saat karanlık olacak şekilde ışıklandırıldı. Işıklandırma süresinin kontrolü amacıyla zaman ayarlı elektrik prizleri kullanıldı Zebra balığı yumurtalarının toplanması Yumurta toplamak için yumurta toplanması amaçlanan günden 1 hafta önce balıklar canlı yemle (Daphnia) beslendi. Daha önceden fotoperiyoda alışkın olan balıklar 2 dişiye 3 erkek karşılık gelecek şekilde yumurta toplanacak günden bir gün önce çiftleştirme akvaryumlarına bırakıldı ve ertesi sabah döllenmiş yumurtalar cam bilyeler

61 49 arasında birikmiş olarak gözlendi. Çiftleştirme akvaryumundan önce balıklar uzaklaştırıldı. Daha sonra cam bilyeler dikkatlice alınarak akvaryumun altında toplanmış olan yumurtalar sifonlanarak çıkarıldı. Döllenmiş ve döllenmemiş yumurtalar stereo mikroskop altında ucu alevden geçirilmiş öze yardımıyla seçildi. Temiz ve dinlendirilmiş çeşme suyu ile birkaç kez yıkanan yumurtalar içinde Holtfreter solüsyonu bulunan petrilere aktarıldı (EK 1). Bütün testlerde asgari örnek büyüklüğü 60 canlı yumurta olarak alındı. Kontrol grubu için de yine aynı dişinin döllenmiş yumurtaları kullanıldı (Küçükoğlu 1996) PCB bileşiklerinin seçimi ve temini 209 konjeneri bulunan PCB bileşiklerinin tamamının araştırmamızda kullanılması mümkün olmadığından bazı kritik nitelikler göz önünde bulundurularak bu konjenerlerden 5 tanesi çalışmamızda toksik madde olarak kullanılmıştır. Bunlar: PCB28 (2,4,4 ' -triklorobifenil), PCB52 (2,2',5,5'-tetraklorobifenil), PCB126 (3,3',4,4',5- pentaklorobifenil), PCB153 (2,2',4,4',5,5'-hekzaklorobifenil) ve PCB180 (2,2',3,4,4',5,5'-heptaklorobifenil) (Şekil 3.1). Şekil 3.1. IUPAC numaralandırılma sistemine göre çalışmada kullanılan PCB bileşiklerinin açık formülleri (Skorfuing et al. 1994).

62 50 Bu beş bileşik şu dört nedenden dolayı seçilmişlerdir: 1- ICES (International Council for the Exploration of the Sea) tarafından izlenmesi ve araştırılması şiddetle tavsiye edilen 6 PCB konjeneri vardır. Bunlar; PCB28, PCB52, PCB101, PCB138, PCB153 ve PCB180 dir. Bu seçim Dünya Sağlık Örgütü (WHO) tarafından da benimsenmiştir (WHO 1999). 2- Akarsu, göl ve deniz kıyısı sedimentlerinde en çok rastlanılan, en yüksek toksisiteye sahip olan, en çok maruz kalınan, maruziyet indikatörü olan ve akuatik organizmaların vücudunda en çok biriken PCB konjenerleri PCB28, PCB52, PCB101, PCB118, PCB138, PCB153 ve PCB180 dir (IARC 1978; Rayne and Ikonomu, 2003; Covaci et al. 2006; Samara et al. 2006). PCB126 ise balıklar üzerine en yüksek toksisiteye sahip PCB bileşiğidir (Van den Berg et al. 1998). 3- PCB bileşiklerinin Zebra balığı üzerine olan etkilerinin araştırılmasında PCB28, PCB52, PCB126, PCB153 ve PCB180 konjenerlerinin hiç denenmediği literatür araştırmalarımız neticesinde anlaşılmıştır. Ayrıca ülkemizde özellikle PCB28 ve PCB52 nin anne sütü ve yağ dokusunda tespit edilmiş olması (Görücü 2001) bizi bu bileşikleri araştırmaya sevk etmiştir. 4- Bunlara ilaveten 209 konjeneri örnekleme bakımından PCB28 mono-ortho, PCB52, PCB153 ve PCB180 di-ortho ve PCB126 da non-ortho PCB bileşiği olarak ve ayrıca PCB28 triklorlubifenil, PCB52 tetraklorlubifenil, PCB126 pentaklorlubifenil, PCB153 heksaklorlubifenil ve PCB180 heptaklorlubifenillere örnek olarak seçilmişlerdir. Tüm bunlara ilaveten PCB126 planar, diğerleri planar olmayan PCB bileşikleridir. Bu sayede etki düzeyleri ve hangisinin daha toksik olduğu bir kez daha vurgulanmış olacaktır. PCB konjenerlerinden PCB28, PCB52, PCB153 ve PCB180 ticari ambalajlarında Riedel-de Haën, Almanya dan, PCB126 ise Dr. Ehrenstorfer GmbH, Almanya dan temin edilmiştir.

63 Yöntemler Balık yumurtalarının PCB konjenerleri ile temas ettirilmesi Günümüzde su ortamlarındaki zararlı kimyasalların araştırılmasında çeşitli toksisite testleri kullanılmaktadır. Bu testler mortalite, ölüm oranı, çeşitli malformasyonlar (fenotipik ve gelişimsel anormallikler) ve bu malformasyonların sonraki nesilde ortaya çıkıp çıkmadığına dayanmaktadır. Bu testlerden en yaygın kullanılanı ve en güvenilir olanı Zebra balığı embriyoları ile yapılan ELS (Early Life Stage) Testi dir (Oberemm 2000; Nagel 2002; Roex et al. 2002; Hutchinson et al. 2003; Hallare et al. 2005). Araştırmamızda toksikoloji testlerimiz ELS test tekniği kullanılarak yürütülmüştür. Bu testte önce sınır belirleyici test ve sonra da ana test yapılmaktadır. Sınır belirleyici test ile elde edilen doza bağlı olarak Zebra balığı embriyolarında LD 50 değeri, gelişimsel oran, yumurta ve embriyo mortalitesi, kalp atımı ve kan dolaşımı, larvaların yumurtadan çıkabilme başarısı ve morfolojik (teratojenik) anormallikler belirlenmektedir. Çalışmamızda bu parametrelere ilave olarak larvaların karaciğer histopatolojilerine ve mekanik sensörite hassasiyetine de bakılmıştır. Her PCB konjenerinden 100 ppm stok solüsyon hazırlandı (EK 2). Bütün testler statik koşullarda ve havalandırması olmayan çözeltilerde yapıldı. Kontrol grubu olarak 50 ml Holtfreter solüsyonu ve 50 ml %10 luk DMSO solüsyonu kullanılmıştır. PCB konjenerleri ile yumurtaların temasına blastula safhasında (döllenmeden sonraki 2 saat) başlandı ve toplam 5 gün devam edildi. Blastula safhasındaki embriyolar içinde farklı dozlarda PCB bulunan 50 ml Holtfreter Solüsyonu+PCB bulunan steril cam petri kaplarına alındı. PCB konjenerlerinin etkin doz düzeylerini ve ana testte kullanılacak konsantrasyonlarını belirlemek amacıyla önce bir sınır belirleyici test yapıldı ve ana testte sınır belirleyici testle tespit edilmiş aralıklar içinde kalan 6 farklı konsantrasyon (0.5, 1.0, 2.0, 4.0, 7.0 ve 10.0 ppm) kullanıldı. Bütün testler 26+1 o C de 14 saat aydınlık, 10 saat karanlık olacak şekilde aydınlanması sağlanmış inkübatörde yapıldı. Her konsantrasyon için 5 farklı test grubu kullanıldı. 24 saat aralıklarla test ve kontrol

64 52 gruplarının solüsyonları yenilendi. Solüsyon yenileme işlemi petrideki solüsyonun embriyoları kurumaktan koruyacak kadarı bırakılıp geri kalanı uzaklaştırılarak yapıldı Gözlemlerin yapılması ve verilerin toplanması Kontrol ve deney gruplarındaki tüm embriyolar 2, 4, 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84, 96 ve 120 saat aralıklarında (Hallare et al. 2004) stereo mikroskop altında makroskobik olarak incelendi. İlk aşamada yumurtalar 48 saatlik değerlendirmeye tabi tutuldu ve sonrasında gözlemlere 5. günün sonuna kadar devam edildi. PCB konjenerlerinin toksisitelerinin araştırılması amacıyla yumurta ve larvalarda meydana gelen ölümler, gastrulasyon, somitlerin oluşumu, optik çukur oluşumu, hareket, kuyruk uzaması ve ayrılması, retinal ve vücut pigmentasyonu, kalp atışı, kan dolaşımı ve koryondan çıkış oranına bakılmıştır. Test maddeleriyle temas edip anormal gelişme gösteren ve ölen embriyoların en tipik örneklerinin dijital kamera destekli stereo mikroskop (Nikon- Olympus) kullanılarak 2.5x4 büyütmede fotoğrafları çekildi Karaciğer histopatolojisi Histolojik araştırmalar için 8 günlük balık larvaları kullanılmıştır (Hallare et al. 2005). Bu amaçla PCB ile temas etmiş ve çeşitli malformasyonlar göstermiş larvalar seçildi. Larvalar bütün olarak formalin tesbit sıvısından (EK 3) geçirildi. Sonra alkolle dehidrate edilen ve ksilol ile temizlenen larvalar parafinle bloklandı. Bu bloklardan 5 6µm kalınlığında kesitler alındı, sırasıyla Hematoksilen-Eosin (Hem-Eo) (EK 4), Peritodik Asit Şif (PAS) (EK 5) boyalarıyla boyandı (Hallare et al. 2005). Kesitler kanada balzamı ile kapatıldıktan sonra boyanmış preparatlar ışık mikroskobu ile incelendi ve karaciğerde meydana gelen anormalliklerin fotoğrafları yine dijital kamera destekli ışık mikroskobu ile çekildi. Formalin fiksatifinde 48 saat bekletilen larvalar aşağıdaki işlemlerden geçirildi: 1- Çeşme suyunda 3-4 saat süreyle yıkandı. 2- %70 lik alkolde 2 saat bekletildi.

65 53 3- %80 lik alkolde 2,5-3 saat bekletildi. 4- %96 lik alkolde 1 gece, %96, %100, %100 lük alkol serilerinde 1 er saat bekletildi. 5- Ksilol І, Ksilol П ve Ksilol Ш de 10 ar dakika bekletildi. 6- Ksilol:Parafin(1:1) karışımında 10 dakika (56 o C deki etüvde) bekletildi. 7- Üç ayrı parafin bünyesinde 1 er saat (56 o C deki etüvde) bekletildi. Parafin Ш banyosundan sonra larvalar parafin kalıplara konuldu ve bu kalıplardan mikrotom için bloklar hazırlandı. Parafin bloklardan mikrotomla 5-6 mikron kalınlığında larvanın baş kısmından itibaren enine kesitler alındı. Kesitler jelatinli sıcak su banyosuna konularak açılmaları sağlandı ve lamlara alınan kesitler iyice kuruduktan sonra Hem-Eo ve PAS boya solüsyonlarından geçirildi. Kesitlerin genel histolojik yapısını incelemek amacıyla Hematoksilen-Eozin boyaması yapıldı. Kesitlerin Harris in hematoksilen-eozin ile boyanması şu şekildedir: 1- Ksilol І de (20 dak.) bekletildi. 2- Ksilol П ve Ksilol Ш de (10 dak.) bekletildi. 3- %80 lik alkolde (10 dak.) bekletildi. 4- İki ayrı %96 lık alkol serisinde (5 dak.) bekletildi. 5- Kesitler çeşme suyunda yıkandı. 6- Hematoksilen boyasında 1 dak. bekletildi. 7- Asit-alkol karışımına batırılıp çıkarıldı. 8- Eozin solüsyonunda (1 dak.) bekletildi. 9- Suda (1 dak.) yıkandı. 10- %80 lik alkolde (10 dak.) bekletildi. 11- İki ayrı %96 lık alkol serisinde (10 dak.) bekletildi. 12- Ksilol І, Ksilol П ve Ksilol Ш serilerinde (20 dak.) bekletildi. 13- Kanada balzamı ile kapatıldı. Sonuçta hücrelerin çekirdekleri menekşe, sitoplazmaları pembe renge boyandı.

66 54 Karaciğerin glikojen içeriğini gösterebilmek için PAS boyaması yapıldı. Kesitlerin PAS ile boyanması; 1- Ksilol І de (10 dak.) bekletildi. 2- Ksilol П de (10 dak.) bekletildi. 3- %96 lık alkolde (10 dak.) bekletildi. 4- %96 lık alkolde (10 dak.) bekletildi. 5- Kesitler çeşme suyunda 10 dak. yıkandı 6- Periodik Asit te 5 dak. tutuldu. 7- Saf suda birkaç defa yıkandı. 8- Schiff reaktifinde (15 dak.) bekletildi. 9- Çeşme suyunda 5-10 dak. yıkandı. 10- Hematoksilen boyaması (en az 1 dak.) yapıldı. 11- Çeşme suyunda yıkandı. 12- Asit alkolde 3-4 saniye diferansiye edildi. 13- Suda yıkandı. 14- İki ayrı %96 lık alkol serisinde (10 dak.) bekletildi. 15- Ksilol І ve Ksilol П de (10 dak.) bekletildi. 16- Kanada balzamı ile kapatıldı. Sonuçta zimogen granülleri pembe-kırmızıya boyandı Mekanik sensorite testi (sensorimotor duyu hassasiyeti) Zebra balığı larvalarında toksik madde maruziyetinden kaynaklanan sensorimotor duyu hassasiyeti bozuklukların tespiti amacıyla bu test uygulanmaktadır. Mekanosensor sistem ya da diğer adıyla lateral çizgi, balığın suyun akışını algılamasını sağlayan ve tehlikeden uzaklaşma, sürü halinde yüzme ve beden duruşunu yönetme gibi önemli davranışları kontrol eden bir sistemdir (Granato et al. 1996). Bu sistemdeki bir arıza balıkta çeşitli davranış bozukluklarına yol açmaktadır. Test ilk olarak Granato et al. (1996) tarafından yapılmış ve Lefebvre et al. (2004) de testi geliştirmiştir.

67 55 Çalışmamızda fertilizasyondan sonra geçen ilk 48. saatin başlarında koryondan kurtulan larva bundan sonraki geçirdiği her 24 saatin başlangıcında gözleme tabi tutuldu. Hafif bir uyarıcı ile (öze veya toplu iğne) her 24 saatte bir larvaların kuyruğuna veya başına dokunuldu. Sağlıklı bir larva uyarıcı merkezinden süratle yüzerek uzaklaştı. Dokunmaya karşı verilen olumlu ve olumsuz tepkilerin saati, sayısı ve larvanın aldığı mesafe kaydedildi. Dokunmaya karşı verilen olumsuz tepkiler kontrol ve DMSO gruplarında hiç gözlenmezken hemen hemen bütün deney gruplarında gözlendi İstatistik Analiz LD 50 değerlerinin probit analizi ile hesaplanması ve farklı PCB bileşiklerinin toksisitelerinin kontrol grubları ve birbirleriyle karşılaştırılması için SPSS 12.0 istatistik paket programı kullanıldı. Sonuçlar ortalama ± standart sapma olarak verildi. İstatistiksel anlamlılık için P<0.05 ve P<0.01 düzeyi anlamlı olarak kabul edildi.

68 56 4. ARAŞTIRMA BULGULARI 4.1. Sınır Belirleyici Test Sonuçları Sınır belirleyici testler düşükten yükseğe değişik konsantrasyonlarda yapılmış olup bu beş PCB konjeneri için tespit edilen konsantrasyonlar; 0.10, 0.15,0.20, 0.50, 1.0, 2.0, 4.0, 7.0, 10.0, 25.0 ve 50.0 ppm şeklindeydi. Yüksek konsantrasyonda (50.0 ppm) embriyoların ilk saatler içinde perivitellin sıvısında bir miktar opak partikül oluşturdukları ve genel olarak normal embriyonik gelişimlerini devam ettiremedikleri görülmüştür. Bu durum zamanın ilerlemesine ve konjenerin çeşidine bağlı olarak değişiklik göstermiştir ppm PCB180 ile temas ettirilen balık embriyolarının 72. saatten sonra koryon içinde hızla öldükleri gözlenmiştir. Bu durum PCB153 te 68., PCB52 de 56., PCB28 de 49. saatte ve PCB126 da ise 28. saatte gerçekleşmiştir ppm ile yapılan denemelerde ise ilk saatlerde blastoderm üzerindeki örtü tabakasının bütünlüğünü kaybettiği ve blastomerlerin bazılarının serbest hale geçerek bir süre sonra blastomerlerin opaklaşıp öldüğü ve vitellüs kesesinin bütünlüğünü kaybettiği gözlenmiştir (Şekil 4.1). Düşük konsantrasyonlarda ise PCB lerin yol açtığı opak partikül kümeleri blastula ve gastrula safhalarından koryondan çıkışa (hatching) kadar ki safhalarda da gözlenmiştir. Opak partiküller genellikle blastoderm çevresinde ve animal yarı kürede yoğunlaşmıştır. Ayrıca opak partikül kümelerinin düşük dozlarda miktarının azalıp kaybolduğu ve embriyoların canlı kalma süresinin de arttığı tespit edilmiştir. Yine 72. saatten sonra canlı kalan embriyolarda doza ve PCB konjenerinin çeşidine bağlı olarak koryondan çıkışın geciktiği, yüksek dozlarda çıkışın tamamen baskılandığı ve embriyoların koryon içinde öldüğü gözlenmiştir. Çıkıştan sonra veya koryon içinde ölen embriyolarda görülen morfolojik anormallikler ise vertebra defekti (Lordoz, kuyruk anormalliği, vertebra sütun deformasyonu), ödem (kalp ve vitellüs kesesi ödemi), kraniofasyal malformasyonlar (çift baş ve triple retina oluşumu) ve hava kesesi oluşumunun engellenmesi (SBI; Inhibition of Swim Bladder Inflation) şeklinde olmuştur. Sonuçlar aynı zamanda şekil ve çizelgeler halinde sunulmuştur. Ödemin çıkıştan önce başladığı ve çıkışın geciktiği bazı embriyolarda aşırı ödemden dolayı embriyonun öldüğü tespit edilmiştir. Anormallik gösteren canlı embriyo ve larvalarda

69 57 kontrol grubundan farklı olarak yüzme davranışlarında da bozuklukların olduğu fark edilmiştir. Bu tip embriyolar gerekli kuyruk kasılmalarını gösteremezken, larvaların da genel olarak petrinin dibinde hareketsiz yattıkları ve ara sıra anormal şekilde yüzdükleri (kendi ekseni etrafında dönme, kesik kesik ve yan yüzme gibi) gözlenmiştir. a) b) Şekil 4.1. Kontrol ve PCB uygulanmış 2.0 saatlik Zebra balığı zigotları, a) Kontrol, b) Deney grubunda blastodermin opaklaşması (ok). Uygulanan test neticesinde konjenerlerle yapılacak olan asıl embriyo ve larval toksisite testleri için deney dozları üst ve alt sınırlar belirlenmiştir. Bu konsantrasyonlar her konjener için blastula safhasındaki (döllenmeden sonraki 2 saat) yumurtalara 0.5, 1.0, 2.0, 4.0, 7.0 ve 10.0 ppm olacak şekilde uygulanmıştır. Test sonuçları LD 50, gelişimsel oran, yumurta ve embriyo mortalitesi, kalp büyüklüğü ve kan dolaşımı, koryondan çıkma başarısı, morfolojik anormallikler, karaciğerdeki hasarlar ve sensorimotor hassasiyet bakımından değerlendirilmiştir Ana Test Sonuçları (ELS Testi Sonuçları) LD 50 değeri Her PCB konjeneri için LD 50 değerinin tespit edilmesi amacıyla döllenmiş balık yumurtalarına fertilizasyondan itibaren PCB maruziyeti gerçekleştirilmiş ve 48 saat sonra canlı kalan ve ölen embriyolar tespit edilerek probit analizi ile ortalama değerler

70 58 elde edilmiştir. Her PCB konjeneri için bulunan ve %95 güven sınırları içinde kalan ortalama LD 50 değerleri PCB28 için ppm, PCB52 için ppm, PCB126 için ppm, PCB153 için ppm ve PCB180 için de ppm olarak bulunmuştur. Bu sonuçlardan yola çıkarak konjenerin etki düzeyi şu şekilde sıralanabilir: PCB126>PCB28>PCB52>PCB153>PCB180. Bu konjenerlerin Zebra balığı embriyolarındaki LD 50 değerlerinin ilk olarak bu araştırmada verilmiş olması da ayrıca önemlidir Gelişimsel oran Uygulanan PCB bileşiğinin çeşidine ve konsantrasyonuna bağlı olarak döllenmiş yumurtaların gastrulasyonu, somitlerinin oluşumu, optik çukur oluşumu, spontan kontraksiyon, kuyruğun ayrılması, kalp atışı, retinal ve vücut pigmentasyonu, koryondan çıkış, kuyruk uzunluğu, baş bölgesinin gelişimi ve serbest yüzen larva gibi bazı kritik gelişim aşamaları dikkate alınarak embriyo ve larvaların gelişim aşamaları takip edilmiştir. Kontrol ile deney grupları ve deney gruplarının kendi aralarındaki gelişim durumları belirlenmiştir. Gelişim hızının yavaş olduğu dönemler kaydedilmiştir. Sonuçta kontrolle karşılaştırıldığında gelişim hızının PCB uygulanmış balık embriyolarında yavaşladığı tespit edilmiştir. Örneğin koryondan çıkış kontrol grubunda 48. saatten itibaren meydana gelirken, DMSO grubunda 51. saatte, 3.0 ppm PCB28 de saatte, 3.5 ppm PCB52 de 60. saatte, 1.0 ppm PCB126 da 78.saatte, 5.0 ppm PCB153 te 58. saatte ve 5.5 ppm PCB180 de ise 55. saatte meydana gelmiştir. Uygulanan konjener dozu LD 50 değerinden biraz düşük olan subletal doz olarak seçilmiştir. DMSO uygulanan grupta ise gelişim hızının kontrol grubuyla hemen hemen aynı olduğu gözlenmiştir (Çizelge 4.1). Çizelgeden de anlaşıldığı gibi konjenerlerin etki düzeyi sıralaması şu şekilde ortaya çıkmıştır: PCB126>PCB28>PCB52>PCB153>PCB180.

71 59 Çizelge 4.1. PCB uygulanmış döllenmiş Zebra balığı embriyolarındaki gelişim hızları Gelişim periyodu ve Karakterizasyon a Yarıklanma Diskoidal bölünme gerçekleşir. %75 epiboli Embriyo hala küresel, epiboli ilerler. Faringula Kuyruk ve somitler gelişir. Koryondan çıkış. Kalp atışı, pigment oluşumu ve kan dolaşımı gerçekleşir. Erken larva Serbest larva düz kuyruk, kalp düzenli atar. Kontrol 1.50± ± ± ± ±1.09 DMSO 1.50± ± ± ± ±1.41 PCB ppm 1.50± ±0.569* 38.8±1.16* 65.3±1.03* 110.3±2.58* PCB ppm 1.51± ±0.579* 35.8±1.70* 59.8±2.31* 103.5±1.04* PCB ppm 1.51± ±0.281* 44.6±1.36* 77.5±2.34* 124.1±3.48* PCB ppm 1.50± ±0.212* 32.6±0.50* 57.5±2.88* 95.5±3.39* PCB ppm 1.50± ± ±0.75* 55.0±0.89* 89.5±4.18* a Gelişim periyotları ve karakterizasyon Kimmel et al e göre verilmiştir. * P<0.05 anlam seviyesine göre istatistiki açıdan kontrollerden farklılığı göstermektedir. Değerler gelişimin saatini göstermekle birlikte ortalama ± Standart sapma olarak verilmiştir Yumurta ve embriyo mortalitesi PCB bileşiklerinin yumurta ve embriyoda ölümlere sebep olup olmadığı sınır belirleyici test sonuçlarından aşağı yukarı anlaşılmış ve belirlenen dozlar neticesinde uygulamalar beş kez tekrarlanarak ölüm oranları bulunmuştur. Yüksek dozlarda 48 saat süreyle PCB maruziyeti gerçekleştirilen yumurta ve embriyolarda ölümler %50 den fazla gerçekleşmiştir. Yarıdan fazla mortaliteye sebep olan PCB bileşikleri, dozları ve ölüm yüzdeleri Çizelge 4.2 de sunulmuştur. Ölüm oranları tespit edilirken 48 saatlik uygulama sonuçlarına bakılmış ve ölümlerin konjener çeşidi ve dozuna bağlı olarak farklı zaman dilimlerinde gerçekleştiği anlaşılmıştır. Örneğin 2.0 ppm PCB126 da ölümler 8-16 saat aralığında başlarken 8.0 ppm PCB180 de saat aralığında başlamıştır. LD 50 değerlerinden sonraki en yüksek ölüm 2.0 ppm PCB126 da, en düşük ölüm 7.0 ppm PCB180 de gözlenmiştir. Kontrol ve DMSO grubunda ise çok az ölümün olduğu tespit edilmiştir. Yüksek dozlarda yumurta ve embriyoların yaklaşık 3/4 ü ölmüş, düşük konsantrasyonlarda daha fazla birey yaşamakta ancak bunların çoğunda da letal ve subletal malformasyonlar gözlenmiştir. Anormal görünümlü larvalar ise PCB içeren ortamdan uzaklaştırılıp normal bir çözelti içinde alındığında ise en fazla 15 gün yaşamışlardır.

72 60 Çizelge 4.2. Farklı konsantrasyonlarda, farklı PCB konjenerlerine 48 saat süreyle maruz kalmış Zebra balığı embriyolarındaki ölüm oranları * P<0.05 anlam seviyesine göre istatistiki açıdan kontrollerden farklılığı göstermektedir. ** P<0.01 anlam seviyesine göre istatistiki açıdan kontrollerden farklılığı göstermektedir Kalp büyüklüğü ve kan dolaşımı Yarı saydam olan Zebra balığı embriyolarında kalp atımını ve kan dolaşımını gözlemek oldukça kolaydır. Kalp ilk kez 24. saatin sonunda atmaya başlar ve genellikle embriyoların gelişimlerinin 5. gününde dakikada 240 defa atarak hızlı gelişimini tamamlamış olur. 5. günden sonra kalp atışında yavaş yavaş bir azalma olur. Bu azalma 15. günde 140 atışa kadar geriler (Schwerte et al. 2006). Normal gelişen bir embriyoda bu durum, kalbin ve perikardial alanın normal büyüklüğüne ulaştığını ve kan dolaşımının düzenli olduğunun bir göstergesidir. Uygulanan PCB bileşiğinin çeşidine ve konsantrasyonuna bağlı olarak 24, 48 ve 72 saatlik embriyo ve larvaların kalp atışları dijital kamera destekli stereomikroskop altında kaydedilmiş, kalp ve perikardiyal alan ölçümü ise 48, 72 ve 96 saatlik larvalarda mm ölçekli mikroskop altında yapılmış ve

73 61 kontrol ile deney grupları arasındaki farklılıklar kaydedilmiştir (Çizelge 4.3). Uygulama dozu olarak olarak yine subletal dozlar seçilmiştir. Çizelge 4.3. PCB uygulanmış döllenmiş Zebra balığı embriyolarının kalp atışı sayıları 24 saat 48 saat 72 saat Kontrol 60.0± ± ±3.54 DMSO 60.2± ± ±8.04 PCB ppm 45.6±4.27* 110.0±2.54* 138±9.46* PCB ppm 49.8±3.27* 123.4±2.07* 151.6±15.1* PCB ppm 30.2±1.30* 97.4±6.06* 131.2±9.75* PCB ppm 51.8±0.83* 132.2±10.7* 160.2±12.6* PCB ppm 54.4± ±3.83* 164.8±12.8* * P<0.05 anlam seviyesine göre istatistiki açıdan kontrollerden farklılığı göstermektedir. Değerler 1 dakikada atan kalp atım sayısını göstermekle birlikte ortalama ± Standart sapma olarak verilmiştir. Çizelgeden de anlaşılacağı gibi PCB bileşikleri balık embriyolarında Braşikardi ye (kalbin yavaş atması) ve Aritmi ye (düzensiz kalp atışı) yol açmıştır. Kan dolaşımı da buna bağlı olarak azalmıştır. Yüksek konsantrasyonlarda ise özellikle PCB126 ve PCB28 uygulanmış embriyoların bazılarında kalp atışı 48. saatin sonunda tamamen durmuş ve embriyolar koryondan çıkamadan ölmüşlerdir. Kalbin yavaş attığı larvalarda kalp büyüklüğünün ve perikardial alanın normal larvalardan daha küçük olduğu görülmüştür (Şekil 4.2). Sonuçta PCB bileşiklerinin kalbin büyümesini yavaşlattığı ve kan dolaşımını azalttığı sonucuna varılmıştır.

74 62 a) b) Şekil saatlik kontrol ve PCB ye maruz kalmış Zebra balığı larvaları, a) Kontrol, b) Deney grubunda kalbin ve perikardiyal alanın gelişmemesi (kesik çizgi perikardiyal alanı, düz çizgi kalbi göstermektedir) Larvaların yumurtadan çıkabilme başarısı Hatching (yumurtadan larvanın çıkması) normal şartlarda (26 o C ph 7.00, Holtfreter solüsyonu içinde) 48. saatte başlamaktadır. Koryondan çıkış asla senkronize gerçekleşmemekle beraber fertilizasyondan sonraki 72. saate kadar devam etmektedir. Kontrol ve DMSO grubundaki canlı kalan embriyoların nerdeyse tamamı koryondan çıkarken deney grubu embriyolarında koryondan çıkış gecikmiş, embriyoların birazı koryondan çıkamamış ve ölmüşlerdir. Özellikle PCB126 ve PCB28 verilen

75 63 embriyoların yarısından çoğu koryondan çıkamamıştır. Larvaların koryondan çıkabilme yüzdeleri ve saatleri Çizelge 4.4 de gösterilmiştir. Çizelge 4.4. PCB uygulanmış döllenmiş Zebra balığı embriyolarının koryondan çıkabilme oranları Kontrol ve DMSO grubu arasında koryondan çıkma başarısı bakımından önemli bir fark yoktur. Diğer gruplarda bu başarı oranı düşmekte ve bu durum konjener çeşidine bağlı olarak ortaya çıkmaktadır Morfolojik anormallikler (malformasyonlar) Gelişimin erken safhalarından larvalar 8 günlük oluncaya kadar arada geçen süre içinde yapılan makroskobik gözlemler ile PCB konjenerlerine maruz kalmış fertil yumurta, embriyo ve larvaların maruziyete bağlı olarak ortaya çıkan morfolojik anormallikleri takip edilmiş ve fotoğrafları çekilmiştir. Uygulama dozu olarak yine subletal doz kullanılmıştır. Buna göre gelişimin erken safhalarında (zigot ve embriyoda) gözlenen anormallikleri şöyle sıralamak mümkündür: Blastodermal lezyon (Şekil 4.3), ekzogastrulasyon oluşumu (Şekil 4.4), vitellus kesesi ödemi (Şekil 4.5), kalp ödemi

76 64 (Şekil 4.6), pigmentasyonun oluşmaması ya da az oluşması (Şekil 4.7), vertebra defekti (Şekil 4.8a) ve çift baş oluşumu (Kranyofasyal malformasyon) (Şekil 4.8b). a) b) Şekil saatlik kontrol ve PCB ye maruz kalmış Zebra balığı zigotları, a) Kontrol, b) Deney grubunda blastodermal lezyon (ok) a) b) Şekil 4.4. Kontrol ve PCB ye maruz kalmış 6.0 saatlik Zebra balığı zigotları, a) Kontrol, b) Deney grubunda ekzogastrulasyon (ok) a) b) Şekil saatlik Kontrol ve PCB uygulanmış Zebra balığı embriyoları, a) Kontrol, b) Deney grubunda vitellüs kesesi ödemi (ok)

77 65 a) b) Şekil 4.6. Kontrol ve PCB ye maruz kalmış 24 saatlik Zebra balığı embriyoları, a) Kontrol, b) Deney grubunda kalp ödemi (ok) a) b) Şekil 4.7. Kontrol ve PCB ye maruziyetini takiben 30 saatlik Zebra balığı embriyoları, a) Kontrol, b) Deney grubunda zayıf pigmentasyon a) b) Şekil 4.8. PCB uygulanmış 30 saatlik Zebra balığı embriyolarında a) Vertebra sütun defekti (ok), b) Çift baş oluşumu (oklar)

78 66 Koryondan çıktıktan sonra (larva safhasında) gözlenen morfolojik anormallikler ise vertebra sütun defekti (Şekil 4.10), Lordoz (Şekil 4.11), vitellüs kesesi ödemi (Şekil 4.12), kalp ödemi (Şekil 4.13), hava kesesinin gelişmemesi (Şekil 4.14), anaxial vücut (vücut simetrisinin kaybolması) (Şekil 4.15a), triple retina (Kraniofasyal malformasyon) (Şekil 4.15b), boy kısalığı (Şekil 4.16a), kuyruk anormalliği ve pigmentasyonun oluşmaması ya da az oluşması (Şekil 4.16b) şeklindedir. Şekil saatlik normal Zebra balığı larvaları Şekil PCB uygulanmış 96 saatlik Zebra balığı larvalarında vertebra sütun defekti (ok) Şekil PCB ye maruz kalmış 96 saatlik Zebra balığı larvalarında Lordoz (ok)

79 67 Şekil PCB uygulanmış 96 saatlik Zebra balığı larvalarında vitellüs kesesi ödemi (ok) Şekil PCB ye maruz bırakılmış 96 saatlik Zebra balığı larvalarında kalp ödemi (ok) Şekil PCB maruziyetini takiben 96 saatlik Zebra balığı larvalarında hava kesesinin gelişmemesi (ok) a) b) Şekil PCB uygulanmış 96 saatlik Zebra balığı larvalarında a) Anaxial vücut (ok), b) Triple retina (oklar)

80 68 a) b) Şekil PCB ye maruz kalmış 96 saatlik Zebra balığı embriyolarında a) Boy kısalığı, b) Pigmentasyonun oluşmaması ve kuyruk anormalliği (ok) Tüm bu anormalliklerin hiçbiri kontrol ve DMSO grubunda gözlenmemiştir. Malformasyon görülme sıklığı PCB konjenerinin çeşidi ve dozu ile doğrudan ilgilidir. Uygulanan subletal dozlarda en fazla anormallik görülme oranı PCB126 da, en az ise PCB180 de gerçekleşmiştir. En sık görülen anormallikler ise Lordoz, vertebra defekti ve hava kesesinin şişmemesidir (Çizelge 4.5). Özellikle ödem ve vertebra anormalliği gösteren larvalarda da önce yüzme aktivitesinde azalma meydana gelmiş, daha sonra kalp ödemine bağlı olarak çoğunda ölüm gerçekleşmiştir. Çizelge 4.5. Subletal dozlarda farklı PCB bileşiklerine maruz kalmış Zebra balığı embriyolarında görülen morfolojik aberasyonlar ve görülme sıklıkları Embriyo (1.5-48) Larva ( saat) Anormallikler* Kontrol DMSO PCB28 PCB52 PCB126 PCB153 PCB180 Eksogastrulasyon Balstodermal lesyonlar Vitellüs kesesi ödemi Akut kalp ödemi Pigmentasyonun az olması Vertebra defekti Çift baş Vertebra defekti Lordoz Vitellüs kesesi ödemi Kalp ödemi Boy kısalığı Hava kesesinin şişmemesi Pigmentasyonun az olması Anaxial vücut şekli Kuyruk anormalliği Triple retina *Tespit edilen malformasyonlar 120 saatlik uygulama sonucunda elde edilmiştir. (-) herhangi bir anormalliğin gözlenmediğini, (+) anormalliğin %10-25 oranında, (++) anormalliğin %25-50 oranında, (+++) anormalliğin %50-90 oranında gözlendiğini ifade etmektedir.

81 Karaciğer Histopatolojisi 8 günlük normal larvalardan hazırlanan karaciğer preparatlarında hepatositlerin hekzagonal şekilli, nukleuslarının da hücre merkezine yerleşmiş olduğu ve zimogen granüllerinin de hepatosit sitoplazmasında biriktiği bilinmektedir (Zodrow et al. 2004). Hazırladığımız preparatlarda hepatositlerin düzgün olduğu, normal boyandığı, çekirdeklerin merkezde olduğu ve zimogen granüllerinin de sitoplazmada biriktiği tespit edilmiştir (Şekil 4.17, Şekil 4.19a). Şekil günlük Zebra balığı larvalarında karaciğer. Normal sitoplazmalı ve normal görünüşlü hepatositler ( ). Boya. Hem-EoX 400. Her nukleusta küçük miktarlarda heterokromatin ve nukleolus belirlenmiştir. PCB maruziyetine bağlı olarak larvaların karaciğerinde gözlemlenen anormallikler lipid birikimi, hepatositlerde hipertrofi, hepatosit nukleusunun sayısının azalması (Şekil 4.18a ve Şekil 4.18b) ve zimogen granüllerinin sayısının azalışına bağlı olarak glikojen miktarındaki azalmadır (Şekil 4.19b).

82 70 a) b) Şekil Farklı PCB bileşiklerine maruz kalmış Zebra balığı karaciğerinde görülen patolojik bulgular: a) Hepatositlerde hipertrofi ( ), b) Lipid birikimi ( ) ve nukleus sayısında azalma ( ).Boya. Hem-EoX 600.

83 71 a) b) Şekil Kontrol ve PCB uygulanmış Zebra balığı larvalarında karaciğer hücreleri a) Kontrol grubu hücrelerinde zimojen granülleri, b) Deney grubu hücrelerinde zimojen granüllerinin sayısı azalmış ve hücreler daha açık renkte boyanmışlardır. Boya. PASX 1000.