Staphylococcus aureus ve Staphylococcus intermedius Suşlarının REP-PZR Metodu ile Tiplendirilmesi

Benzer belgeler
ÖZET. Yüksek Lisans Tezi. Ali İhsan ALBAYRAK. Selçuk Üniversitesi. Fen Bilimleri Enstitüsü. Biyoloji Anabilim Dalı. 2007, 29 Sayfa

SALGIN ARAŞTIRMASINDA KULLANILAN TİPLENDİRME YÖNTEMLERİ

Kenan ŞENER*, Mehmet Ali SARAÇLI**, Cengiz Han AÇIKEL***, Levent DOĞANCI****

PULSED-FIELD GEL ELECTROPHORESIS Bengül Durmaz, Rıza Durmaz

Genom analizi için belirteç olarak kullanılan DNA dizileri

Canlı Legionella pneumophila Tespiti ve MLST için Gerçek Zamanlı PCR ve HRM Analizi Tabanlı Yöntemlerin Geliştirilmesi

FUNGAL SALGINLARIN ARAŞTIRILMASI;

TÜBİTAK BİDEB LİSE ÖĞRETMENLERİ FİZİK, KİMYA, BİYOLOJİ, MATEMATİK- PROJE DANIŞMANLIĞI EĞİTİMİ ÇALIŞTAYI LİSE3 (Çalıştay 2013) BİYOLOJİ GRUP TUHAF

Hastane Salgınlarında Moleküler Epidemiyolojik Yaklaşım. Barış Otlu İnönü Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı

MANTARLARIN EPİDEMİYOLOJİK TİPLENDİRİLMESİ. Dr. Ayşe Kalkancı Gazi Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Ankara

Enzimlerinin Saptanmasında

HASTANE KAYNAKLI METİSİLİNE DİRENÇLİ STAPHYLOCOCCUS AUREUS SUŞLARI ARASINDA KLONALİTENİN VE PANTON-VALENTİN LÖKOSİDİN TOKSİNİNİN ARAŞTIRILMASI*

Hacettepe Üniversitesi Fen Fakültesi Biyoloji Lisans 2003

Klinik Örneklerden İzole Edilen Hastane Kaynaklı Metisiline Dirençli Staphylococcus aureus Suşlarının rep-pcr ile Genotiplendirilmesi

Prof.Dr. Meltem Yalınay Çırak Gazi Üniversitesi Tıp Fakültesi Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji A.D. SALGINLARIN İZLENMESİ VE MOLEKÜLER

1. Ekstraksiyon Tamponu: %2 (w/v) CTAB (Cetyltrimethyl-ammonium bromide) 1.4 M NaCl, % 0.2 (v/v) β-merkaptoetanol, 20 mm EDTA. 100 mm Tris-HCl (ph 8)

İnsan ve sığır kökenli Staphylococcus aureus izolatlarının fenotipik ve genotipik özelliklerinin araştırılması *

MOLEKÜLER BİYOLOJİ LABORATUVARI güz dönemi 2. HAFTA GAZİ ÜNİVERSİTESİ FEN FAKÜLTESİ BİYOLOJİ BÖLÜMÜ

Gereç ve yöntem. Şişli Hamidiye Etfal EAH- 700-yataklı. Yenidoğan yoğun bakım ünitesi -29 yataklı Bir izolasyon odası Üç farklı bölüm

Agaroz jel elektroforezi

POLİMERAZ ZİNCİR REAKSİYONU (PZR-PCR) VE RESTRİKSİYON PARÇA UZUNLUĞU POLİMORFİZMİ (RFLP)

POYRAZ TIBBİ CİHAZLAR EDVOTEK

Çoklu İlaç Dirençli A. baumanni İzolatlarının OXA tipi Karbapenemaz Genlerinin Tespiti ve PFGE ile Moleküler Epidemiyolojik Analizi

KLİNİK ÖRNEKLERDEN İZOLE EDİLEN KARBAPENEME DİRENÇLİ ACINETOBACTER BAUMANNII SUŞLARINDA SINIF 1 İNTEGRON TAŞIYICILIĞININ ARAŞTIRILMASI*

ANKARA ÜNİVERSİTESİ BİLİMSEL ARAŞTIRMA PROJELERİ KOORDİNASYON BİRİMİ KOORDİNATÖRLÜĞÜNE. : Lisansüstü Öğrencileri İçin Araştırma Projesi

HIZLI VE YÜKSEK ÇÖZÜNÜRLÜKTE BRUCELLA GENOTİPLENDİRİLMESİ İÇİN MOLEKÜLER BİR YÖNTEM GELİŞTİRİLMESİ

Rekombinant DNA Teknolojisi-I

MOLEKÜLER BİYOLOJİDE KULLANILAN YÖNTEMLER I DNA POLİMORFİZMİNİN MOLEKÜLER MARKER LARLA ANALİZİ

NOZOKOMİYAL KÖKENLİ METİSİLİNE DİRENÇLİ STAPHYLOCOCCUS AUREUS İZOLATLARINDA MUPİROSİN DİRENCİNİN FENOTİPİK VE GENOTİPİK YÖNTEMLERLE ARAŞTIRILMASI*

Enterobacteriaceae Ġzolatlarında Karbapenemazların Saptanmasında Modifiye Hodge Testi ve Carba NP Testlerinin Karşılaştırılması

Keçi Sütü Somatik Hücrelerinden Genomik DNA İzolasyonunda Fenol-Kloroform ve Chelex 100 Ekstraksiyon Yöntemlerinin Karşılaştırılması *

HAYVAN KAYNAKLI BAKTERİLERDE ANTİBİYOTİK DİRENCİ

HASTANE VE TOPLUM KAYNAKLI STAPHYLOCOCCUS AUREUS İZOLATLARINDA ÇEŞİTLİ VİRÜLANS FAKTÖRLERİNİN REAL-TİME PZR YÖNTEMİ İLE ARAŞTIRILMASI

Karbapeneme Dirençli Acinetobacter baumannii Suşlarının PFGE Yöntemiyle Genotiplendirilmesi

Nozokomiyal İnfeksiyonlardan İzole Edilen Pseudomonas aeruginosa Suşlarının Epidemiyolojik Analizi #

MİKROBİYOLOJİDE BİYOTEKNOLOJİ

RESEARCH ARTICLE. Mastitisli sığır sütlerinden izole edilen Enterococcus faecalis izolatlarının plazmid profillerinin incelenmesi

DNA Dizileme (Sekanslama)

TÜBİTAK BİDEB LİSE ÖĞRETMENLERİ-FİZİK, KİMYA, BİYOLOJİ, MATEMATİK- PROJE DANIŞMANLIĞI EĞİTİMİ ÇALIŞTAYI (LİSE-3 [ÇALIŞTAY 2013) BİYOLOJİ PROJE RAPORU

Mikrobiyolojide Moleküler Tanı Yöntemleri. Dr.Tuncer ÖZEKİNCİ Dicle Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji A.D

RTA JEL / PZR Saflaştırma Kiti

Doç.Dr. SERAP SAVAŞAN

BAZI MEYVE TÜRLERİNDE DNA İZOLASYON YÖNTEMLERİNİN ETKİNLİĞİNİN KARŞILAŞTIRILMASI

MOLEKÜLER TANI VE TİPLENDİRME YÖNTEMLERİ

TÜRKİYE DE BULUNAN BAZI YERLİ SIĞIR IRKLARININ GENETİK YAPILARININ KARAKTERİZASYONU

Molecular Characterization of Human Isolate of Fasciola hepatica in Turkey

ZOOTEKNİ BÖLÜMÜ. Araş. Gör. Ertuğrul KUL

TÜBERKÜLOZ DIŞI MİKOBAKTERİLERİN TANIMLANMASINDA PCR-RFLP VE DNA SEKANS ANALİZİ SONUÇLARININ KARŞILAŞTIRILMASI

ÖZGEÇMİŞ DİL ADI SINAV ADI PUAN SEVİYE YIL DÖNEM. Almanca KPDS 81 ÇOK İYİ 1992 Bahar

MİKROBİYOLOJİDE BİYOTEKNOLOJİ. Doç. Dr. Funda BAĞCIGİL

DNA İzolasyonunda Fenol-Kloroform Yerine Potasyum Asetat Kullanımının DNA Miktarı ve Kalitesi Üzerine Etkisi

RTA Bakteriden Genomik DNA İzolasyon Kiti

Hastane infeksiyonlar nda moleküler biyolojik. Hastane nfeksiyonu Salg n nda Moleküler Biyolojik Yöntemler

Elazığ İli Karakoçan İlçesinden Elde Edilen Sütlerde Yağ ve Protein Oranlarının AB ve Türk Standartlarına Uygunluklarının Belirlenmesi

MİKROBİYOLOJİ ANABİLİM DALI BİYOTEKNOLOJİ DERS NOTLARI

Nilgün Çerikçioğlu Marmara Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı

Pozitif kan kültürü şişesinden doğrudan MALDI-TOF MS ile identifikasyon

Rekombinant DNA Teknolojisi-II

önce desteklenmiş olan (AU-BAP HPD, TUBİTAK HD 106T742, TUBİTAK HD 108T280 ve BAP 09H ) projelerimizle oluşturulan bilgilerin

BAKTERİYEL SALGINLARIN ARAŞTIRILMASI;

Diyarbakır Yöresinde Subklinik Mastitisli İneklerde Etken İzolasyonu ve Duyarlı Antibiyotiklerin Belirlenmesi

MOLEKÜLER BİYOLOJİ LABORATUVARI

Laktik Asit Bakterilerinin (LAB) İdentifikasyonunda/Tiplendirmesinde Kullanılan Moleküler Yöntemler

Niçin PCR? Dr. Abdullah Tuli

DNA izolasyonu hangi amaçlarla yapılır?

T.C. SELÇUK ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

Zeynep Ceren Karahan 1*, Alper Tekeli 2, Figen Atalay 3*, Nejat Akar 1

COMPARISON OF DIFFERENT PRIMERS USED FOR THE GENOTYPING OF CANDIDA ALBICANS CLINICAL ISOLATES BY RANDOMLY AMPLIFIED POLYMORPHIC DNA METHOD

Nozokomiyal Metisiline Dirençli Staphylococcus Aureus Đzolatlarının Tiplendirilmesinde Hangi Yöntemi Kullanalım?

Gıdalarda Patojen Mikroorganizma Aranmasında Kullanılan Moleküler Genetik Yöntemler 1

GİRİŞ. Kan dolaşımı enfeksiyonları (KDE) önemli morbidite ve mortalite sebebi. ABD de yılda KDE, mortalite % 35-60

DOKUZ EYLÜL ÜNİVERSİTESİ HASTANESİ NDEKİ DOMİNANT METİSİLİNE DİRENÇLİ STAPHYLOCOCCUS AUREUS SUŞUNUN MOLEKÜLER YÖNTEMLERLE TİPLENDİRİLMESİ*

Proteus mirabilis in moleküler tiplemesi için pulsed-field jel elektroforezinin optimizasyonu

Sütçü İneklerde Günlük Sağım Sayısının Klinik Mastitis ve Süt Verimi Üzerine Etkisi

KAPİLLER ELEKTROFOREZ DNA SEKANSLAMA

t030, Türkiye deki Hastanelerden İzole Edilen Metisiline Dirençli Staphylococcus aureus İzolatları Arasında En Yaygın spa Tipidir*

HLA Tiplendirmesi PCR-SSP. Türker Duman PhD

Providencia stuartii moleküler tiplemesi için pulsed-field jel elektroforezinin optimizasyonu

Komplike deri ve yumuşak doku enfeksiyonu etkeni çoklu dirençli patojenlerin bakteriyofaj duyarlılıklarının araştırılması

ANTİMİKROBİYAL AKTİVİTEYE SAHİP TERMOFİLİK BAKTERİLERİN 16S rrna ANALİZİ İLE TANILANMASI

İstanbul daki El Ayak Ağız Hastalığı Vakalarında Coxsackievirus A6 ve Coxsackievirus A16 nın Saptanması

KAN KÜLTÜRLERİNDEN İZOLE EDİLEN KLEBSIELLA PNEUMONIAE SUŞLARINDA GENİŞLEMİŞ SPEKTRUMLU BETA-LAKTAMAZ VARLIĞININ ARAŞTIRILMASI VE TİPLENDİRİLMESİ*

ÖZGEÇMİŞ VE ESERLER LİSTESİ

YYU Veteriner Fakultesi Dergisi, 2011, 22 (2), ISSN: ; e-issn:

Gıda Örneklerinde Genetiği Değiştirilmiş Organizma Analizleri. Bölüm 9. MON810 Mısır, Bt-176 Mısır ve Roundup Ready Soya nın PCR ile Nitel Saptanması

Tuğba Kula Atık, Bayhan Bektöre, Mehmet Burak Selek, Ümit Karakaş, Orhan Baylan, Mustafa Özyurt 1

GIDA KAYNAKLI HASTALIKLAR. Gıda orijinli hastalıklar gıda zehirlenmesi gıda enfeksiyonu olarak 2 ana gruba ayrılır.

Erzincan İli Tulum Peynirlerinden Listeria spp. İzolasyonu ve İdentifikasyonu*

REKOMBİNANT DNA TEKNOLOJİSİ. Araş. Gör. Dr. Öğünç MERAL

Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR: Polymerase Chain Reaction) Ayten AŞKIN KILINÇ Veteriner Hekim

HİPERVİRÜLAN ESCHERİCHİA COLİ ST131 KLONU ÜLKEMİZDE YENİ Mİ?

STREPTOMİSİNE DİRENÇLİ MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS KOMPLEKS İZOLATLARINDA rpsl VE rrs GEN BÖLGESİ MUTASYONLARININ ARAŞTIRILMASI*

Laboratuvar Tekniği. Adnan Menderes Üniversitesi Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü TBY 118 Muavviz Ayvaz (Yrd. Doç. Dr.) 5. Hafta (14.03.

REAKSİYON PRENSİPLERİ

SUBKLİNİK MASTİTİSLİ İNEKLERİN SÜTLERİNDEN AEROBİK BAKTERİLERİN İZOLASYONU

Polimeraz Zincir Reaksiyonu. Mikrobiyoloji Anabilim Dalı

TÜBERKÜLOZUN MOLEKÜLER TANISINDA GÜNCEL DURUM

ARAŞTIRMA. Rastgele Çoğaltılmış Polimorfik DNA Yöntemiyle Kanatlı Etlerinde Tür Tayini. 2007: 21 (4):

KLİNİK ÖRNEKLERDEN İZOLE EDİLEN STAPHYLOCOCCUS AUREUS SUŞLARINDA PANTON-VALENTİN LÖKOSİDİN (PVL) VARLIĞININ ARAŞTIRILMASI

Transkript:

S Ü Fen Fak Fen Derg Sayı 34 (2009) 85-92, KONYA Staphylococcus aureus ve Staphylococcus intermedius Suşlarının REP-PZR Metodu ile Tiplendirilmesi Emine ARSLAN *, Kuddisi ERTUĞRUL, Ali İhsan ALBAYRAK Selçuk Üniversitesi, Fen Fakültesi, Biyoloji Bölümü, 42031, Konya. Özet: Mastitis sütçülük işletmelerinde giderlerin artması ve süt veriminin azalması gibi sonuçlara yol açarak önemli ekonomik kayıplara sebep olan yangısal bir bozukluktur. Staphylococcus aureus, mastitise sebep olan etken organizmalar arasında ilk sırada yer almaktadır. Bu çalışmada Konya Bölgesi ndeki mastitisli ineklerden izole edilen 43 S. aureus 6 S. intermedius suşunun akrabalık derecelerinin REP-PZR yöntemi ile belirlenmesi amaçlanmıştır. REP-PZR sonucunda 500-~3000 bp büyüklüklerinde ve 2-6 arasında değişen sayılarda bantlar gözlemlenmiştir. Bu REP profillerinden elde edilen dendrograma göre S. aureus ve S. intermedius suşları arasındaki en yüksek akrabalık derecesi %82 oranında olduğu belirlenmiştir. Anahtar Kelimeler: Mastitis, S. aureus, S. intermedius, REP, PZR Typing of Staphylococcus aureus and Staphylococcus intermedius Strains with Repetitive Sequence-Based PCR (REP-PCR) Method Abstract: Mastitis is an inflammatory anomaly which results in important economic losses causing consequences like increase in prices at small dairies and decrease in milk production. Staphylococcus aureus is the first of the most effective factors which cause mastitis disease. The aim of this study was to determine of the relationship degree by REP-PCR between 43 S. aureus and six S. intermedius strains isolated from bovines mastitis in Konya region. As a result, 2-6 bands sized 500-~3000 bp were observed. According to obtaining a dendrogram from these REP profiles, it was determined that the most high relationship degree between S. aureus and S. intermedius strains was 82% rate. Key words: Mastitis, S. aureus, S. intermedius, REP, PCR Giriş Mastitis, sütçülük işletmelerinde giderleri arttırarak ve süt veriminde belirgin bir azalmaya sebep olarak önemli ekonomik kayıplara neden olan bir problemdir [1, 2, 3]. Mastitisten izole edilen etkenlerin içerisinde S. aureus tüm dünyada sütçülük işletmelerindeki en sık görülen ve kontrolü en zor olan enfeksiyon etkeni olarak bildirilmektedir [4]. Yapılan çalışmalarda da klinik mastitis olguların % 47.45 inin S. aureus tan kaynaklandığı ve bu olguların % 10,8 inin tedaviye rağmen klinik olarak iyileşmediği gözlemlenmiştir [5]. S. aureus un sebep olduğu mastitisin kontrolü için çok çeşitli metotlara ihtiyaç duyulmaktadır [6]. Fenotipik teknikler (faj tiplendirme, serotiplendirme, biyotiplendirme, antibiyogramlar) inek orijinli Staphylococcus lar için genellikle düşük tiplendirme yeteneğine * aarslan@selcuk.edu.tr

Staphylococcus aureus ve Staphylococcus intermedius suşlarının REP-PZR metodu ile Tiplendirilmesi sahiptirler [6, 7]. Son günlerde moleküler epidemiyolojinin DNA`ya dayalı metotları iyi sonuçlar vermiştir [8, 9]. Bu tip çalışmalar insan ve hayvan kaynaklı S. aureus suşları arasında genotipik farklılıklar olduğunu göstermiştir [10, 11, 12, 13, 14, 15]. Hızlı epidemiyolojik tipleme, kaynağın identifikasyonu için çok önemlidir ve enfeksiyonun yayılmasında bakterinin gelişimi için detaylı bilginin edinilmesini sağlamıştır [16]. S. aureus suşlarının tiplendirilmesinde kullanılan metodun; hızlı, kolay, güvenilir ve yüksek ayırım gücüne sahip olması gerekir. Yapılan çalışmalarda REP-PZR yönteminin güvenilir bir yöntem olduğu kanaatine varılmıştır [16]. REP-PZR metodu, bakteri kökenlerinin, kodlanmış tekrar dizileri ile hızlı olarak tanımlanmasında kullanılmıştır. Bu dizilerin boyutları her bakteri suşu için spesifiktir [17]. Bu tekrarlanan elementler birçok bakteri genlerinin bulunduğu ortamda farklı genlerin korunduğu bölgeler oluşturmaktadır [18, 19, 20]. Bakteriyel izolatlar içinde klonal akrabalıkların DNA`ya dayalı epidemiyolojik değerlendirmesinde REP-PZR ile yapılan parmak izi kullanışlı bir yöntemdir. Birkaç saat içinde örneklerden izolatların karakterize edilmesini sağlar [21, 22, 23]. Bu çalışmada, diğer birçok moleküler yöntemlere göre daha spesifik olan REP-PZR metodu ile mastitis etkeni S. aureus ve S. intermedius suşlarının tiplendirilmesi amaçlanmıştır. Materyal ve Metot Bakteri Örnekleri -80 C`de saklanan bakteri suşları TSA besiyerinde aktif hale getirilmiştir. Daha sonra DNA izolasyonları için Nutrienth Broth sıvı besiyerine ekim yapılarak 37 C`de 18 saat inkübasyona bırakılmıştır. Bakterinden Genomik DNA izolasyonu Bakteriden DNA izolasyonu Ausubel [24] in önerdiği metoda göre yapılmıştır. 2 ml`lik sıvı besiyerinde bakteri örnekleri üretilmiştir. 14.000 rpm`de 10 dakika santrifüj edilmiştir ve 200µl TE tamponunda (ph:8.0) süspanse edilmiştir. 9µl lizostafin (2mg/ml) solüsyonu süspansiyona ilave edilerek 37 C`de 1 saat inkübe edilmiştir. 30µl %10`luk SDS ve 3µl proteinaz K (20mg/ml) ilave edilmiştir. Daha sonra 37 C`de 1 saat bakteri hücrelerinin parçalanması için inkübe edilmiştir. 1M NaCl içerisinde %1`lik CTAB çözeltisinden 80µl ve 100µl 5M NaCl çözeltisi ilave edilmiştir. 10 dakika 65 C`de inkübe ettikten sonra lizat kloroform ile ekstrakte edilmiş ve daha sonra fenol/kloroform ile ekstrakte edilmiştir. DNA 0,6 hacim izopropanol ile süpernatant`tan presipite edilmiştir ve 50µl steril distile su ile süspanse edilmiştir. REP-PZR uygulaması REP-PZR uygulaması için 25 µl çözelti hazırlanmıştır. Her reaksiyon karışımı için, 75 pikomol RW3A primeri (5 -TCGCTCAAAACAACGACACC-3 ) [16], 10X PZR tamponu (50mM KCl, 10mM Tris-HCl, ph=9, %0.1 TritonX-100), 3mM MgCl, 2.5mM dntp ve 2.5U Taq polimeraz kullanılmıştır. Daha önceden bakteriden izole ettiğimiz genomik DNA`dan 50ng karışıma eklenmiştir. Karışım hazırlandıktan sonra thermo-cycler cihazı 94ºC`ta 3 dakika, 94ºC`ta 1 dakika, 54ºC`ta 1 dakika ve 72ºC`ta 2 dakika`ya 30 döngü yapılması için programlanmıştır. Son olarak program bittiğinde 72ºC`ta 5 dakikalık uzantı basamağı eklenerek ve hazırlanan tüpler thermo-cycler cihazına yerleştirilip çoğaltım yapılmıştır. REP-PZR ürünlerinin agaroz jel elektroforezi REP-PZR ürünleri değerlendirilmek için %2 lik agaroz jel elektroforezinde 90 voltta yürütülmüştür [25]. U.V. transilluminatörde görüntülenen fotograf bilgisayara aktarılmıştır. Bio 1 D ++ bilgisayar programı ile dendrogramları çıkarılmıştır. Sonuç ve Tartışma REP-PZR sonucu ile elde edilen fotografta (Şekil 1), bantların varlığı ve yokluğuna göre Bio 1D++ bilgisayar programı ile genetik akrabalıkları hesaplanarak dendrogramı çıkarılmıştır. Elde edilen dendrograma göre (Şekil 2) iki ana grup oluşmuştur. Birinci ana grup S. intermedius ve S. aureus suşları içeren iki alt grup içerir. Birinci alt grupta S. aureus ve S. intermedius suşları %30-50 oranında genetik olarak uzak bulunurken, bu suşlara Standart S. aureus suşunun 86

Emine ARSLAN, Kuddisi ERTUĞRUL, Ali İhsan ALBAYRAK yaklaşık %70 oranında uzak olduğu gözlenmiştir. Birinci alt gruba %86 oranında uzak olan ikinci alt grupta ise birbiri ile tamamen aynı olan S. aureus suşlarının (48-53, 86-87 no`lu suşlar) yanısıra en yakın benzerlik oranıyla (%80-83) 97-118 ve 109 nolu S. aureus suşları bu grubun üyelerini oluşturmuştur. 15 ve 77 nolu suşları birbirine %75 oranında benzerken 33 nolu diğer S. intermedius suşunun %74 oranında 48 ve 53 nolu S. aurues suşlarına yakın olduğu görülmüştür. Bununla birlikte diğer S. aureus suşları %50 ve %65 arasında değişen genetik uzaklıklarda yer almıştır. İkinci ana grup kendi içinde 2 alt gruba ayrılmış ve bu grup üyelerini S. aureus suşları oluşturmuştur. Birinci alt grupta %86 oranında uzak iki küçük küme meydana gelirken, iki küçük kümenin S. aureus suşları %82`den %40`a kadar değişen genetik benzerlikler göstermiştir. İkinci alt grubu oluşturan S. aureus suşlarından bazıları genetik açıdan birbirinin aynısı bulunurken (21-45, 68-72 ve 56-58 no`lu suşlar) diğer S. aureus suşları yaklaşık %80 ile %38 oranında değişen genetik açıdan birbirlerine oldukça benzer olduğu tespit edilmiştir. Genel olarak bakıldığında S. aureus ve S. intermedius suşları %9-82 oranında birbirlerine yakındır. REP primerleri ile yapılan PZR sonucunda her bir suşun 2-6 arasında değişen bantlara sahip oldukları bulunurken bu bantların büyüklüklerinin de 500- ~3000 bp arasında değişen DNA fragmentlerinden oluştuğu gözlemlenmiştir. 500 bp lık bant 46 nolu örnek dışında bütün S. aureus ve S. intermedius suşlarında ortakken, 3000 bp lık bant hem S. aureus suşlarında hemde S. intermedius suşlarında çoğunlukla bulunmaktadır. Son günlerde moleküler epidemiyolojinin DNA ya dayalı metodları iyi sonuçlar vermiştir [8, 9]. Bu sonuçlar, insan ve hayvan kaynaklı S. aureus suşları arasında farklılık olduğunu göstermiştir [10, 11, 12, 13]. İnsan kaynaklı S. aureus ve S. intermedius suşları REP-PZR ile tiplendirilerek 5-15 arasında değişen sayıda bantlar elde edilmiş ve bu bantların büyüklükleri yaklaşık 300-5000 bp arasında değiştiği gözlenmiştir [26]. Del Vecchio ve ark. [16] yine insan kaynaklı S. aureus suşlarının REP-PZR sonuçlarına göre, 3-12 arasında bant oluşturduklarını ve aynı tip izolatların özel coğrafik bölgelerde yayıldığını belirlemişlerdir. Yaptığımız çalışmada iki bakteri türüne ait suşlardan elde edilen bant sayıları insan kaynaklılardan daha az olduğu görülmektedir. Reinoso ve ark. [27] mastitisli ineklerden izole ettikleri S. aureus suşlarının 200-1700bp büyüklükleri arasında REP-PZR ürünlerini elde etmişlerdir. Yapılan tüm çalışmalarda bant büyüklükleri 200 ve 5000 bp arasında sınırlanırsa bizim bulduğumuz 500-3000bp bant büyüklükleri bu değerler arasında olduğu için diğer sonuçlarla uyum göstermektedir. Arslan ve ark. [28] ineklerden izole ettikleri mastitis etkeni S. aureus ve S. intermedius suşlarını RAPD-PZR metodu kullanarak en yüksek akrabalık derecesini %91.30 olarak bildirirlerken, Reinoso ve ark. [27] elde ettikleri REP-PZR sonuçlarına göre insanda enfeksiyona neden olan S. aureus suşlarında %87, ineklerden elde edilen S. aureus suşlarında ise %93 genetik akrabalık olduğunu ve Peles ve ark. [29] PFGE (Pulsed Field Jel Elektroforez) sonuçlarına göre ise 59 S. aureus izolatının %86 benzerlikte olduğunu tespit etmişlerdir. Bu çalışmada da tüm Staphylococcus suşlarının %9-82 benzerlik derecesinde bulunması yukardaki sonuçlara yakın olduğunu göstermektedir. Yapılan çalışmalarda mastitisli ineklerden izole edilen S. aureus suşlarının çok az sayıda genotipleri olduğu belirlenmiştir. Bu genotipik çeşitliliğin az olmasının sebeplerinden biri S. aureus un bulaşıcılığından dolayı çiftlikteki hayvanlar arasında yayılmasıdır [6]. Metisiline dirençli S. aureus suşları için REP-PZR diğer metodlara nisbeten daha hızlı, güvenilir ve etkili moleküler tiplendirme sistemi olarak geliştirilmiştir. Bu da RW3A primerinin kullanımı ile başarılmıştır. RW3A primer dizisinin S. aureus ların kromozomunda sayı ve pozisyonu çeşitli olduğu için suşlar arasında farklı REP-PZR profilleri gözlenmektedir. Bu primerin kullanımıyla agaroz jel elektroforezinde son derece ayırt edici PZR ürünleri meydana gelmektedir. Zahmetsiz ve ucuz donanımla yürütülebilen bu teknik kolayca salgın kaynağını belirleyebilir, rutin faaliyetleri izlemede kullanılabilir ve enfeksiyon kontrol potansiyelini artırabilir. REP-PZR ile çıkarılan DNA parmakizi, bulaşıcı ve virulant bakteri suşlarının hızlı bir şekilde tanımlanması için bir araç olarak teklif edilebilir [16]. 87

Staphylococcus aureus ve Staphylococcus intermedius suşlarının REP-PZR metodu ile Tiplendirilmesi Şekil 1. REP-PZR Profilleri. 88

Emine ARSLAN, Kuddisi ERTUĞRUL, Ali İhsan ALBAYRAK Şekil 2. Bio 1D++ Programı sonucu elde edilen dendrogram. Staphylococcus suşlarının analizinde REP-PZR tiplendirme metodunun, AP-PZR (Arbitrarily primed-polimeraz zincir reaksiyonu) ve PFGE kadar ayırt edici olduğu bildirilmiştir. 89

Staphylococcus aureus ve Staphylococcus intermedius suşlarının REP-PZR metodu ile Tiplendirilmesi AP-PZR ile kıyaslandığında REP-PZR, ilaveten bir kromozomal DNA saflaştırma basamağı gerektirdiği için AP-PZR ın performansı REP-PZR ın performansından biraz hızlıdır. Ancak, epidemiyolojik amaçlar için kullanıldığı zaman son derece önemli olan REP-PZR ın tekrarlanabilirliği AP-PZR a göre mükemmel bulunmuştur. PFGE ile karşılaştırılacak olursa, REP-PZR ın en önemli avantajı kolay ve hızlı performansa sahip olmasıdır. Ancak PFGE ile aynı tekrarlanabilirliği vardır [7, 9]. Diğer bir PZR a dayalı tiplendirme metodu, tekraralanabilirlik ve performansın kolay olması bakımından en iyi REP-PZR ile kıyaslanan Deplano ve ark. [30] tarafından tanımlanan Inter-IS256 PZR metodudur. Inter-IS256 PZR ile analiz edilmiş 36 Staphylococcus suşu arasında 3 farklı tip teşhis edilirken, aynı suşların REP-PZR tiplendirmesi ile 5 farklı tip tanımlanmıştır. REP-PZR tiplendirme aynı zamanda, her ikisininde orta derecede ayırt edebilme yeteneği olan Tn916-16S rrna gen bölgesi ve inter-16s-23s rrna gen bölgesinin çoğaltımları gibi diğer tekrarlanan dizilere dayalı PZR metotları ile benzemektedir [31, 32, 33]. Sonuç olarak; Konya Bölgesindeki ineklerde mastitise sebep olan S. aureus suşlarının, genetik açıdan değerlendirilmeleri ile birbirine yakın suşlar olduğu ve gelecekteki aşı çalışmaları için kullanılabilecekleri düşünülmektedir. Doğru suş ya da suşların seçiminin yapılabilmesi için bu verilerin başarılı bir şekilde kullanılması gerekir. REP-PZR metoduna ilaveten ERIC-PZR ve BOX-PZR metotlarının da uygulanması, Staphylococcus izolatlarının sınıflandırılmasında, tanımlanmasında ve tiplendirilmesinde daha güvenilir sonuçlar sağlayacağı kanısındayız. Kaynaklar [1] Waterman, D.F., Harmon, R.J., Hemken, R.W., Langlois, B.E. Milking Frequency as Related to Udder Health and Milk Production. J Dairy Sci. 66(2):253 258 (1983). [2] Rajala-Schultz, P.J., Gröhn, Y.T., McCulloch, C.E., Guard, C.L. Effect of Clinical Mastitis on Milk Yield in Dairy Cows. J. Dairy Sci. 82: 1213 1220 (1999). [3] Shim, E.H., Shanks, R.D., Morin, D.E. Milk Loss and Treatment Costs Associated with Two Treatment Protocols for Clinical Mastitis in Dairy Cows. J Dairy Sci. 87(8):2702 2708 (2004). [4] Alaçam, E., Tekeli, T., Sezen, Y., Erganiş, O. Sütçü İneklerin Subklinik Mastitislerinde Cefoperazone un Etkisi Üzerinde Çalışma. S.Ü. Vet. Fak. Derg. 1(2):65 74 (1986). [5] Bademkıran, S., Yeşilmen, S., Gürbulak, K. Sütçü İneklerde Günlük Sağım Sayısının Klinik Mastitis ve Süt Verimi Üzerine Etkisi. Y.Y.Ü. Vet Fak. Derg. 16 (2):17-21 (2005) [6] Matthews, K.R., Jayarao, B.M., Oliver, S.P. Plasmid pattern analysis of Staphylococcus species isolated from bovine mammary secretions. J. Dairy Sci. 75(12):3318-23 (1992) [7] Tenover, F.C., Arbeit, R., Archer, G., Biddle, J., Byrne, S., Goering, R., Hancock, G., Herbert, G.A., Hill, B., Hollis, R., Jarvis, W.R., Kreiswirth B., Eisner, W., Maslow, J., McDougal, L.K., Miller, J.M., Mulligan, M., Pfaller, M.A. Comparison of traditional and molecular methods of typing isolates of Staphylococcus aureus. J. Clin. Microbiol. 32:407-415 (1994). [8] Maslow, J.N., Mulligan, M.E., Arbeit, R.D. Molecular epidemiology: application of contemporary techniques to the typing of microorganisms. Clin. Infect Dis. 17: 153-164 (1993). [9] van Belkum, A., Kluytamans, van Leeuwen, W., Bax, R., Quint, W., Peters, E., Fluit, A., Vandenbroucke- Grauls, C., van den Brule, A., Koelman, H. Multicenter evaluation of arbitrarily primed PCR for typing of Staplycoccus aureus strains. J. Clin. Microbiol. 33:1537-1547 (1995). [10] Hajek, V., Marsalek, E. The differentiation of pathogenic staphylococci and a suggestion for their taxonomic classification. Zenralbl. Bakteriol. Abt. l. Orig.A217-176-182 (1971). [11] Devriese, L.A. A simplified system for biotyping Staphylococcus aureus strains isolated from different animal species. J. Appl. Bacteriol. 56,215-220 (1984). [12] Musser, J., Kapur, V., Clonal analysis of methicillin resistant Staphylococcus aureus strains from intercontinental sources: association of the mec gene with divergent phylogenetic lineages implies dissemination by horizontal transfer and recombination. J. Clin. Microbiol. 30,2058-2063 (1992). 90

Emine ARSLAN, Kuddisi ERTUĞRUL, Ali İhsan ALBAYRAK [13] Kapur, V, Sischo, W., Greer, R., Whittam, T, Musser, J. Molecular population genetic analysis of Staphylococcus aureus recovered from cows. J. Clin. Microbiol. 33, 376-380 (1995). [14] Zadoks, R., van Leeuwen, W., Barkema, H., Sampimon, O., Verbrugh, H., Schukken, Y., van Belkum, A. Application of pulsed-field gel electrophoresis and binary typing as tools in veterinary clinical microbiology and molecular epidemiologic analysis of bovine and human Staphylococcus aureus isolates. J. Clin. Microbiol. 38, 1931-1939 (2000). [15] Reinoso, E., Bettera, S., Frigerio, C., Di Renzo, M., Calzolari, A., Bogni, C. RAPD-PCR analysis of Staphylococcus aureus strains isolated from bovine and human hosts. Microbiol. Res. 159, 245-255 (2004). [16] Del Vecchio, V.G., Petroziello, J.M., Gress, M.J., McClesky, F.K., Melcher, G.P., Crouch, H.K. and Lupski, J.R. Molecular genotyping of methicillin-resistant Staphylococcus aureus via fluorophore enhanced repetitive sequence VCR. J. Clin. Microbiol. 33, 2141-2144 (1995). [17] Versalovic, J., Koeuth, T. and Lupski, J.R. Distribution of repetitive DNA sequences in eubacteria and application to fingerprinting of bacterial genomes. Nucleic Acids Res. 19, 6823-6831 (1991). [18] Stern, M.J., Ames, G.F.L., Smith, N. H., Robinson, E. C. and Higgins, C. F. Repetitive extragenic palindromic sequences: a major component of the bacterial genome. Cell 37:1015-1026 (1984). [19] Hulton, C.S.J., Pliggins, C.F., Sharp, P.M. ERIC sequences: a novel family of repetitive elements in the genomes of Escherichia coli, Salmonella typhimurium, and other enterobacteria. Mol. Microbiol. 5, 825-34 (1991). [20] Martin, B., Humbert, O., Camara, M., Guenzi, E., Walker, J., Mitchell, T., Andrew, P., Prudhomme, M., Alloing, G., Hackenbeck, R., Morrison, D.A., Boulnois, G.J., Claverys, J.P. A highly conserved repeated DNA element located in the chromosome of Streptococcus pneumoniae. Nucleic Acids Res. 20, 3479-83 (1992). [21] Georghiou, P., Wright, C., Versalovic, J., Koeuth, T., Watson, D., Hamill, R. and Lupski, J. Program Abstr. 32nd lntersci. Conf. Antimicrob. Agents Chemother., abstr. 1415 (1992). [22] Woods, C.R, Versalovic, J., Koeuth, T. and Lupski, J.R. Analysis of relationships among isolates of Citrobacter diversus by using DNA fingerprints generated by repetitive sequence-based primers in the polymerase chain reaction. J. Clin. Microbiol. 30:2921-2929 (1992). [23] Versalovic, J., Kapur, V., Mason, E.O., Shah, U., Koeuth, T., Lupski, J.R. and Musser, J.M. Penicillin resistant Streptococcus pneumoniae strains recovered in Houston, Texas: identification and molecular characterization of multiple clones. J. Infect. Dis. 167:850-856 (1993). [24] Ausubel, F.M., Kingston, R.E., Brent, R., Moore, D.D., Seidman, J.G., Smith, J.A. and Struhl, K. Current protocols in molecular biology. Greene Publishing Associates & Wiley Interscience, New York (1991). [25] Maniatis, R., Fritsh, E.F., Sambrook, J. In Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbos, New York (1982). [26] van der Zee, A., Verbakel, H., van Zon, J.C., Frenay, I., van Belkum, A., Peeters, M., Butting, A., Bergmans, A. Molecular genotyping of Staphylococcus aureus strains: comparison of repetitive element sequence-based PCR with various typing methods and isolation of a novel epidemicity marker. J. Clin. Microbiol. 37:342-349 (1999). [27] Reinoso, E.B., El-Sayed, A., Lämmler, C., Bogni, C., Zschöck, M. Genotyping of Staphylococcus aureus isolated from humans, bovine subclinical mastitis and food samples in Argentina. Microbiol. Res. Vol 163:3, 314-322 (2008). [28] Arslan, E., Açık, L., Uçan, U.S. Mastitisli ineklerden izole edilen S. aureus ve S. intermedius suşlarının RAPD-PCR ile akrabalık derecelerinin belirlenmesi. Vet. Bil. Derg. (2005), 21, 1-2:65-69 (2005). 91

Staphylococcus aureus ve Staphylococcus intermedius suşlarının REP-PZR metodu ile Tiplendirilmesi [29] Peles, F., Wagner, M., Varga, L., Hein, I., Rieck, P., Gutser, K., Keresztúri, P., Kardos, G., Turcsányi, I., Béri, B., Szabó, A. Characterization of Staphylococcus aureus strains isolated from bovine milk in Hungary. Int. J. Food Microbiol. Vol 118:2, 186-193 (2007). [30] Deplano, A., Vaneechoutte, M., Verschraegen, G. and Struclens, M.J. Typing of Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis Strains by PCR Analysis of inter-is256 spacer length polymorphism. J. Clin. Microbiol. 35:2580-2587 (1997). [31] Cuny, C, and Witte, W. Typing of Staphylococcus aureus by PCR for DNA sequences flanked by transposon TnP/6 target region and ribosomal binding site. J. Clin. Microbiol. 34:1502-1505 (1996). [32] Gürtler, V. and Barrie, H.D. Typing of Staphylococcus aureus strains by PCR-amplification of variable-length 16S-23S rdna spacer regions: characterization of spacer sequences. Microbiol. 141:1255-1265 (1995). [33] Kumari, D.N.P., Peer, V., Hawkey, P.M., Parnell, P., Joseph, N., Richardson, J.F. and Cookson, B. Comparison and application of ribosome spacer DNA amplicon polymorphisms and pulsed-field gel electrophoresis for differentiation of methicillin-resistant Staphylococcus aureus strains. J. Clin. Microbiol. 35:881-885 (1997). 92