MOLEKÜLER TANI VE TİPLENDİRME YÖNTEMLERİ

Ebat: px

Şu sayfadan göstermeyi başlat:

Download "MOLEKÜLER TANI VE TİPLENDİRME YÖNTEMLERİ"

Bilge Hanım
8 yıl önce
İzleme sayısı:

1 MOLEKÜLER TANI VE TİPLENDİRME YÖNTEMLERİ Doç.Dr. Aynur KARADENİZLİ Kocaeli Üniversitesi Tıp Fakültesi, Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji AD, Kocaeli

2 Francisella tularensis Küçük, aerobik, pleomorfik, gram negatif, hücreiçi ve hücredışında yaşayabilen bir kokobasildir. Toplum sağlığını tehdit edebilmesi, Laboratuvar infeksiyonu oluşturma riski, Bir biyoteror etkeni olma potansiyeli nedeniyle ayrı bir öneme sahiptir.

Toplum sağlığını tehdit edebilmesi, Laboratuvar infeksiyonu

3 Bioterorizm Ajanları: Laboratuvar Bulaşı Etken BSL Lab.Riski B. anthracis 2 Düşük Y. pestis 2 Orta F. tularensis 2/3 Yüksek Botulinum toksini 2 Orta Çiçek 4 Yüksek Kanamalı Virusler 4 Yüksek

4 Tanı Klinik tanı Laboratuvar tanı Kültür Seroloji ELISA ve immun blott yöntemleri Direkt Floresan antikor testi Moleküler tanı Bakteri DNA sını saptamaya yönelik testler Tul4 yada fopa geninin PCR ile amplifikasyonu (klasik PCR) Real Time PCR yöntemlerinin kullanımı

Bakteri DNA sını saptamaya yönelik testler Tul4 yada fopa geninin

5 Tularemi tanısında PCR: İlk çalışmalar Fare dokusunda F. tularensis DNA sının gösterilmesi (Deneysel model) Ülseroglandüler tularemide yara örneklerinden F. tularensis DNA sının gösterilmesi (Sjöstedt A et al, 1997) Kültüre göre daha duyarlı (1998,İsveç) Çevresel örneklerden yapılan kültür sonuçlarına göre daha duyarlı (Versage et al, 2003)

6 PCR temelli metodlarda F. tularensis e ait hedeflenen başlıca genler tul4 (17kD, Dış membran proteinini kodlar) fopa (43kD, Dış membran proteinini kodlar) ISFtu2 (Multiple sayıda bulunan insersiyon element benzeri bir sekans) 23kDa gen (Makrofaj infeksiyonunda eksprese edilen bir proteini kodlar)

proteinini kodlar) fopa (43kD, Dış membran proteinini kodlar) ISFtu2

7 Real-Time PCR teknikler 5 nükleaz assay (TaqMan PCR) Hairpin probları Hibridizasyon temelli rezonans enerji transfer probları Çift ipliğe spesifik DNA boyalarının kullanılmasına dayalı tekniklerdir.

8 Tanıda Real Time TaqMan PCR (5 nükleaz assay) İlk kez F.tularensis e ait fopa genini hedefleyen bir yöntem olarak tanımlanmıştır. Bu testle 1pg genomik DNA (<100 CFU) yakalanabilir. (Higgins et al. Am J Trop Med Hyg 2000;62(2):310-8) Multi Target RT TaqMan PCR Hedef genler: ISFtu2, 23kD, tul4, fopa Çevre ve insan örneklerinde çalışılabilir. Saptama sınırı: 1-45 CFU Versage et al. J Clin Mİcrobiol 2003;41(12):5492-9

Bu testle 1pg genomik DNA (<100 CFU) yakalanabilir. (Higgins et al.

9 Tularemi tanısı: Real Time PCR Avantajları: Hızlı (Klasik PCR a göre) Patojene spesifik nükleik asitin amplifikasyonunun aynı anda saptanabilmesi Birkaç DNA hedefi kullanımı ile yüksek hızda tanımlama Duyarlılık standart PCR a göre 10 kat daha yüksek Saptama sınırı: hücre/ml

saptanabilmesi Birkaç DNA hedefi kullanımı ile yüksek hızda tanımlama

10 Tularemi tanısı: Real Time PCR Örnek olarak: Hastaya ait örnekler (Ülser, lenf nodu aspiratı, kan, boğaz sürüntüsü..) Çevresel örnekler (Su, çamur, ölü hayvan dokuları..) Kültürde üreyen bakteri (identifikasyon için) kullanılabilir.

.) Çevresel örnekler (Su, çamur, ölü hayvan dokuları.

11 Tularemi tanısı: Real Time PCR Örnekler taşınırken DNaz inhibitörü (4M GuCN) içerisinde taşınır. DNA izolasyonu yapılır (Ticari Kit yada glass milk yöntemi kullanılabilir). DNA kısa süre içerisinde kullanılacak ise +4ºC de saklanabilir.

DNA izolasyonu yapılır (Ticari Kit yada glass milk yöntemi

12 PCR için Ana Karışım Buffer Nükleotidler (datp, dctp, dgtp, dttp) Primerler Prob Su Taq DNA polymerase Template (DNA)

17 Arithmetic Relative Fluorescence Cycle Number

18 Arithmetic Relative Fluorescence Cycle Number

19 Arithmetic Relative Fluorescence Cycle Number

20 F. tularensis suşlarının tiplendirilmesi Tip A tularemi de etken bilinen en infeksiyöz patojenlerden biri olan F. tularensis alttür tularensis dir. Mortalite oranı yüksektir. Tip B tularemi etkeni F. tularensis alttür holarctica dır. Tip A ya göre daha az şiddetlidir ve fatal olgular nadirdir.

Mortalite oranı yüksektir. Tip B tularemi etkeni F.

21 F. tularensis suşlarının tiplendirilmesi Klinik özellikleri ve mortalite oranları farklı olması, biyoteror etkeni olma potansiyeli nedeniyle alttür ayırımı önmelidir. Alttür ayırımında kullanılan yöntemler RNA helikazı kodlayan gen (Ft-M19) Insersiyon sekans (ISFtu2) ve/veya pdpd gen varlığı

22 F.tularensis alttür tularensis in alttür holarctica dan ayırımı 1. Hücre genomunda RNA helikazı kodlayan gen alttür holarctica da devamlı 30bp lik delesyon gösterir. Bu geni hedefleyen Real Time PCR ile melting curve analizi sonucunda her iki türü ayırmak olasıdır.

23 F.tularensis alttür tularensis in alttür holarctica dan ayırımı 2. Alttür holarctica da 865bp lik ISFtu2 (Insertion sekans element) bulunur, alttür tularensis te bulunmaz.

24 F. tularensis izolat tiplendirilmesi Tüm dünyadan suşların tiplendirildiği bir çalışmada: bilinen 4 genotip yanısıra, Japonya suşlarında farklı bir grup saptanmıştır. Kullanılan tiplendirme metodları: REP-PCR (Repetitive extragenic palindromic sequence) ERIC-PCR (enterobacterial repetitive intragenic consensus sequences) AP-PCR (arbitrary primed)

25 F.tularensis alttürlerinin ayırımı Özellikle Kuzey Amerika da tipa ve tipb doğal olarak görülür. Alttür tularensis bioterör ajanı olduğu için ayırımı ayrı bir önem taşır.

26 F.tularensis Tiplendirilmesi F.tularensis alttür ayırımında: PFGE AFLP 16SrRNA gen sekanslama RFLP Aynı alttür izolatlarının ayırımında: Short sequence tandem repeats Multi locus variable number tandem repeats Tüm genomu içeren DNA microarray Farlow et al 2001, Johansson et al 2001, 2004

28 Multi locus variable number tandem repeats F.tularensis genomundaki sayıda farklı lokusu hedefleyen bir yöntemdir. Bu lokusların PCR ile amplifikasyonu yapılır. Herbir VNTR lokusunda tüm izolatlardan elde edilen amplikon büyüklüğü ile ilgili skorlamalar yapılır. VNTR lerdeki allelik farklılıklara göre izolatlar genetik olarak gruplandırılır (dendogram).

29 Tularemi tanısında TaqMan PCR Örnekler: Hastaya ait: Tonsil sürüntüsü, lenf nodu aspiratı Çevre örnekleri: Su, ölü hayvan dokuları Örneğin taşınması: DNA izolasyonu için alınan örnekler, DNA degradasyonunun önlenmesi amacıyla guanidium izotiyosiyanat içeren tüplere konuldu ve oda ısısı şartlarında transport edildi. Su; şüpheli kaynaklardan alınan su örnekleri filtre edilip, filtre yüzeyinden DNA izolasyonu yapıldı. Karadenizli et al. Scand J Infect Dis. 2005;37(10):712-6.

30 TaqMan PCR yöntemi Tularemi salgınlarında, Biyoteror olgularında, Organizmanın doğa döngüsü sırasında, Ekolojisinin araştırılmasında; hayvan dokuları, idrar, dışkı, keneler, hasta örnekleri gibi birçok farklı örnekler üzerinde çalışılmış ve hassas şekilde F.tularensis i saptadığı gösterilmiştir.

31 Boncuk Karadenizli

Benzer belgeler

Tularemi: Tanı yöntemleri. Doç.Dr. Aynur Karadenizli Kocaeli Üniversitesi Tıbbi Mikrobiyoloji AD

Tularemi: Tanı yöntemleri. Doç.Dr. Aynur Karadenizli Kocaeli Üniversitesi Tıbbi Mikrobiyoloji AD Tularemi: Tanı yöntemleri Doç.Dr. Aynur Karadenizli Kocaeli Üniversitesi Tıbbi Mikrobiyoloji AD Dünyada Tularemi Francisella tularensis: Taksonomi Bacterium tularensis Tulare kasabası, Kaliforniya, Dr.