Biyoreaktörler ENDÜSTRİYEL MİKROBİYOLOJİ BİYOPROSESLER Biyoreaktörler proteinlerin, organik asitlerin, aminoasitlerin, antibiyotiklerin, enzimatik veya mikrobiyal biyotransformasyon proseslerinde önemli bir role sahiptir. Amaca uygun çok değişik boyutlarda ve şekillerde biyoreaktörler yapılmakta ve kullanılmaktadır. Ancak prensip olarak biyoreaktör işlemin gerektirdiğinden komplike olmamalıdır. 1 2 Tüm biyoreaktörlerin sahip olmaları gereken temel özellikler biyoreaktörlerinün sahip olması gereken temel parçaları: Biyoreaktör steril şartlar altında işletilebilmeli ve uzun süreli reaksiyonlar için güvenilir olmalıdır M.o tarafından gereksinim duyulan havalandırma ve karıştırmayı sağlayabilmelidir Güç sarfiyatı mümkün olduğunca az olmalıdır Sıcaklık ve ph kontrolü sağlanabilmelidir Numune alabilmek için gerekli düzeneğe sahip olmalıdır Buharlaşma kayıpları en az seviyede olmalıdır İşletme, temizleme ve bakım sırasında mümkün olduğunca az işgücü gerektirmelidir. Genel olarak geniş bir proses çeşitliliğinde çalışılabilmelidir. İç yüzeyi mümkün olduğunca pürüzsüz olmalıdır. 1) Gövde : genellikle silindiriktir. Alt ve üst bombeler basınca karşı dayanıklılığın artmasını sağlar. 2) kapak: doldurmaya yarayacağı gibi gövde içinin temizliği için giriş ve çıkışlar da da önemlidir. Kapak substratın sterilizasyonundan önce kapatılır ve işlem sonuna kadar bir daha açılmaz Üretim yapılacak olan reaktör, pilot ölçekli reaktörle benzer yapıya sahip olmalıdır. 3 4 3) aşılama kapağı: inokülasyon amacıyla kullanılır. Bu işlem alev yardımıyla gerçekleştirilir. 4) dalga kıranlar: karıştırıcıların oluşturacağı vorteksi engellemek amacıyla kullanılır. 4 tanedir ve genişlikleri çapının 1/10-1/12 si kadardır 5) hava dağıtıcılar 6) steril hava girişi ve ölçüm cihazları: hava filtrelerden geçirilir. Hava debisi flowmetrelerle ölçülür 5 6 1
7) sıcaklık ve kontrol düzeneği: sterilizasyon ve fermentasyon boyunca sıcaklığın ölçümü ve ayarı için çeşitli düzeneklere ihtiyaç vardır. Isıtma işlemi biyoreaktörün dışında bulunan bir ceket yardımıyla veya içinde veya dışında bulunan serpantinler yardımıyla gerçekleştirilebilir. Sıcaklık kontrolü, fermentör içine daldırılmış özel elektrot yardımıyla, ayarlanmış olan sıcaklığın üzerine çıkıldığında veya soğutma suyu vanası otomatik olarak açılıp kapatılarak yapılır 7 8 8) Basınç kontrol sistemi: fermentör üzerindeki gaz fazı yardımıyla (+) basınç sağlanmalıdır. Böylece dışarıya bağlantı kısımlarından istenmeyen m.o ların içeri girişi önlenebilir. 9) ph kontrol sistemleri: üretim sırasında değişen ph nın ayarı ve kontrolü için sürekli ölçülüp gerektiğinde düzenlenmesi gerekir. ph kontrolü, biyoreaktör içine daldırılan bir ph elektrodu yardımıyla ayarlanmış olan ph nın üzerine çıkıldığında veya düştüğünde sistem otomatik olarak asit veya baz ilave eden bir düzenek yardımıyla gerçekleşir. 9 10) steril besin maddeleri katkı düzeneği: üretim sırasında ilave edilmesi gereken katkı maddeleri aseptik koşullarda ortama verilebilmelidir. Bunun uygun debili dozaj pompaları kullanılır veya biyoreaktör basıncından daha yüksek basınç altında tutulan kaplar yardımıyla gerçekleştirilir. 11) örnek alma vanaları 12) Karıştırıcı sistemi: ısı ve oksijen transferini sağlayacak karıştırıcı uygun karıştırmayı sağlayacak şekilde seçilmeli. Karıştırıcı motorlarının gücü de uygun kapasitede seçilmeli 10 11 12 2
Biyoreaktör çeşitleri Derin kültür reaktörleri uygulanan karıştırma ve havalandırma şekline göre çeşitli tipleri vardır Mekanik karıştırmalı biyoreaktörler karıştırma mekanik olarak gerçekleşir 13 14 En basiti silindirik bir tank ve karıştırıcıdan oluşur. Birçok reaktörde vorteks oluşumunu engellemek amacıyla kenarlarda dalgakıranlar bulunur. Genellikle tankın uzunluk/çap oranı 3-5 arasındadır. Karıştırıcı şaft üzerindeki pervane sayısı buna bağlı olarak değişir. Karıştırıcı hızı bu tip reaktörlerde önemli bir parametredir. Karıştırıcı hızı reaksiyonun homojen olarak devam etmesini sağlayacak ancak m.o lara zarar vermeyecek düzeyde olmalıdır. Reaktöre gaz (hava) karıştırıcının en alt pervanesinin altından verilir. Böylece havanın reaktörün içerine homojen olarak dağılımı sağlanır. 15 16 Hava kaldırmalı reaktörler Bu tip reaktörlerde reaktörün sıvı hacmi bir seperatör yardımıyla ikiye ayrılmıştır. Bu bölümlerden sadece birinden reaktörün içine hava verilir. Hava verilen kısımdan yükselen sıvı diğer kısımdan aşağıya iner ve reaktör içerinde karışım sağlanır. Hava kaldırmalı reaktörlerde enerji karıştırmalı tank reaktörlere göre daha etkin kullanılır. Bu tip reaktörler hassas m.o lardan elde edilen farmasötik ürünlerin üretiminde kullanılır. Akışkan yataklı reaktörler Bunlar, sıvı-immobilize enzim gibi askıda katı madde reaksiyonları için uygun reaktörlerdir. Bir akışkan yataklı reaktör sisteminin çalışabilmesi için alttan bir gaz veya hava yardımıyla hareketlendirilmesi gerekir. Yukarı doğru sağlanan akış reaktördeki katıların süspanse edilmesi için kullanılır. Geometrik olarak reaktörün tepe kısmı süspansiyonun hızının yavaşlatılması için genişletilmiştir. Sonuç olarak bu geniş kısma gelen katılar reaktörün içine tekrar dönerler. 17 18 3
Sabit yataklı kolon reaktörler Bir yatak oluşturacak şekilde sıkıştırılmış ve üzerinde veya içinde biyokatalizör immobilize edilmiş katı partiküller sabit yataklı biyoreaktörü oluşturur. Yatak görevi gören malzeme gözenekli katılardan veya homojen jellerden oluşur. İmmobilize biyokatalizör için uygun sıvı besiyeri yatağın içinden sürekli olarak akar Metabolitler ve ürünler bu sıvıya salınır ve dışarı alınır. Akış yukarı veya aşağı olabilir ancak aşağı akışlarda yerçekiminden yararlanılacağı için daha yaygındır. Eğer akış yukarı olursa, debi en fazla yatağı harekete geçirmeyecek kadar olabilir. Bu tip reaktörler genel olarak immobilize enzim prosesleri için kullanılırlar ve ph kontrolü mümkün değildir. 19 20 Endüstriyel mikrobiyolojide temel işlemler Biyoproseslerde üretim hücreler tarafından gerçekleştiriliyorsa oluşan ürün ya hücre dışına salgılanır ya da hücre içinde tutulur. Her iki durumda da biyoürünlerin saflaştırılması gerekir. Biyoürünler genelde işlem koşullarından çok etkilenebilen duyarlı maddeler olduklarından işlem seçiminde dikkatli olunmalıdır. Örn., biyoürün bir enzim ise ayırma ve saflaştırma sürecinde organik çözgen kullanılması pek mümkün değildir. 22 Biyoürünlerin saflaştırılması oldukça masraflı bir süreçtir. Üretim prosesinden sonra ortamdan biyoürünlerin ayrılma, saflaştırma işlemlerinin toplam maliyet içindeki payı büyüktür. Amaç, en az maliyetle en yüksek kalitedeki ürünün mümkün olan en kısa sürede elde edilmesidir. Doğal olarak seçilen proses ve bunun ürün maliyetine etkisi istenilen son ürüne bağlıdır. Enzimler ve özellikle hücreler ile gerçekleştirilen bir biyoproses sonunda reaktördeki sıvı ortamın karakteri klasik kimyasal proseslerdekinden çok farklıdır. Proses bittikten sonra bile reaktördeki biyodönüşüm devam edeceğinden sıvının karakteri sürekli değişir ve bu sebeple uzun süre depolanabilmesi mümkün değildir. Biyoreaktör sıvılarının tipik özelliklerinden bazıları şöyledir: Yoğunluğu içinde bulunduğu sıvınınkine çok yakın olan sıkıştırılabilen katı parçacıkların dağıldığı bir süspansiyon Yüksek vizkozite Jelatinimsi materyal 23 24 4
Bir proses sonunda ortam sıvısı içinde ürün düşük konsantrasyonlardadır ve ürünle birlikte ortamda m.o lar, hücre parçaları, çözünmüş ve çözünmemiş ortam bileşenleri ile birlikte diğer metabolik ürünler bulunur Öte yandan ürün hücre içi bir metabolitte olabilir. Bütün bu faktörler saflaştırma prosesini zorlaştıran etkenlerdir Saflaştırma prosesi seçilirken dikkate alınması gereken kriterler Ürünün hücre içi veya hücre dışı oluşu Ürünün fermentasyon sonundaki konsantrasyonu Ürünün fiziksel ve kimyasal özellikleri Ürünün kullanım alanı Kabul edilebilir en düşük saflık oranı Ürünün toksisitesi Fermentasyon sırasında ortamda bulunan safsızlıklar Ürünün fiyatı 25 26 Ürün saflaştırmada; ilk adım büyük katı parçaların, çöktürme, santrifüj veya filtrasyon yolu ile ortamdan uzaklaştırılmasıdır İkinci adım, elde edilen sıvının ultrafiltrasyon, ters osmoz, kromatografi yöntemleri, sıvı-sıvı ekstraksiyonu, çöktürme yolu ile bölümlenmesidir. Son adımda ise daha hassas kromatografik yöntemler veya kristalizasyon teknikleri kullanılarak yüksek saflıkta ürün elde edilir. 1. Ayırma Biyoprosesler ile edilen ürünler hücreler ile birlikte bulunurlar. Öncelikle ortamdan hücre veya hücre parçalarının uzaklaştırılması gerekir. Bu ayırma işleminde hücrelerin boyutları önemli bir parametredir. Süspansiyondan m.o hücrelerinin ayrılması için bazı ön işlemlere gerek vardır. Isıl, fiziksel veya kimyasal karakterli olabilen bu işlemler hücreleri bir araya toplayarak ayırmayı kolaylaştırmaya yöneliktir. 27 28 Ayırma işleminde göz önünde bulundurulması gereken önemli parametreler: Ayırmada kullanılan proses ve aletlerin güvenilir ve dayanıklı olması Proses süresinin kısa olması Ürünün yüksek oranda kazanılması Ayırma prosesi enerji giderinin düşük olması Prosesin atık suyun sisteme geri dönüşüne ve arıtma tesisine doğrudan gönderilmesine uygun olması a) Flokülasyon ve flotasyon Bir partikülün çökelme hızı onun çapı ile orantılıdır. Dolayısıyla hücrelerin agregasyonu çökelerek ortamdan ayrılmalarını (flokülasyon) kolaylaştırır. Hücre membranındaki yüklerin çok değerlikli iyonlar ile nötralleştirilmesi, Coulomb itme kuvvetlerini ortadan kaldıracağından hücrelerin bir araya toplanmalarını sağlar. Hücrelerin flokülasyonu ph, sıcaklık, iyon şiddeti, yüzey gerilim kuvvetleri, hücrelerin yaşı ve m.o nın türüne bağlıdır. 29 30 5
Flokülasyon ile sonuç alınamayan durumlarda flotasyon yoluyla m.o hücrelerinin ayrılması sağlanır. Flotasyonda partiküller gaz habbeciklerinde adsorplanır ve bir sıvı ortamın üst yüzeyinde bir köpük tabakasında toplanırlar. Köpük tabakasının stabilitesini arttırmak için uzun zincirli yağ asitleri veya aminlerden yararlanılabilir. 31 32 b) Filtrasyon Oluşturulan basınç farkı yardımıyla katı sıvı karışımının bir filtre materyalinden geçirilerek katı fazın ortamdan ayrılması işlemidir. Filtrasyonda etkin olan iki parametre basınç ve filtrasyon hızıdır. Filtrasyon hızını sabit tutabilmek için basıncın kek kalınlığı ile orantılı olarak arttırılması gerekmektedir. Basınç sabit tutulursa filtrasyon hızının kek kalınlığı ile orantılı biçimde azalır. Partiküllerin ayrılma mekanizmasına göre filtrasyon üç şekilde gerçekleşir: 1. Yüzey filtrasyonu 2. Derin filtrasyon 3. Elek filtrasyonu 33 34 Yüzey filtrasyonu: bir filtrasyon materyalinden sıvı kısım geçerken katı atıkların alıkonması esasına dayanır. Filtrasyon materyali yüzeyinde zamanla kalınlaşan bir kek tabakası oluşur. Filtrasyon hızı basınç farkına, filtrasyon yüzeyine, filtre materyali ve kekin filtrasyon direncine bağlıdır. Yüzey filtrasyonu filtre plakaları, filtre hücreleri, bant filtreleri, basınç veya vakum tambur filtreleri ile gerçekleştirilir. 35 36 6
Derin filtrasyon: derin filtrasyonda partiküllerin ayrılması gözenekli filtre materyali içinde adsorpsiyonları esasına dayanır. Bu filtrasyon az bulanık çözeltilere uygulanır. Filtre materyali yüzeyi ve partiküller arasındaki elektrostatik etkileşmelerin de önemli rolü vardır. 37 38 Elek filtrasyonu: esası filtre materyalinin belirli gözenek boyutuna sahip olması ve bu boyutun üzerindeki partiküllerin geçişinin engellenmesine dayanır. Filtre yüzeyinde biriken maddelerin hemen uzaklaştırılması gerekir. Bu yöntem büyük partiküllerin ayrılmasına uygundur. Ultrafiltrasyon ve membran filtrasyonu elek filtrasyonunun özel uygulamalarıdır. 39 40 c) Santrifüjleme Çözeltideki partiküllerin uygulanan merkezkaç kuvvetin etkisiyle çeperlere veya tabanlara oturtulması esasına dayanır. Santrifüjleme verimini arttıran faktörler: Vizkozitenin düşüklüğü Partikül boyutu Katı partikül ile içerisinde bulunduğu sıvı arasındaki yoğunluk farkı Açısal hızın yüksekliği Santrifüj çapının büyüklüğü Sıvı hacminin fazlalığı M.o lar ve benzer büyüklükte diğer partiküller, filtrasyonla iyi sonuç alınamadığında santrifüj yardımı ile ortamdan ayrılabilirler. Santrifüj filtrasyon ile birleştirildiğinde pahalı bir seçenek olsa da, filtrasyonun zor gerçekleştiği, filtrasyonu kolaylaştıracak kimyasalların kullanılamadığı ve yüksek saflıkta ayırmanın gerektiği durumlarda zorunlu bir seçenektir. Kesikli ve sürekli olmak üzere iki tipte uygulanabilen santrifüj işleminde kesikli uygulamanın kapasitesi oldukça düşüktür ve endüstriyel uygulamalar için uygun değildir. Endüstriyel uygulamalarda sürekli sistemler kullanılır (seperatorler) Hem farklı yoğunluktaki maddeleri hem de katı ve sıvıları birbirinden ayırmak için kullanılabilirler. 41 42 7
Santrifüjleme süresinin kısa olması çok önemlidir. Böylece halen canlı olan hücrelerin ürünü parçalama olasılığı azalır. Ayrıca hem kontaminasyonun hem de çevreden gelebilecek kirliliklerin önlenmesi için steril seperatörlü kapalı sistemler gereklidir. 2. Hücrelerin parçalanması Biyoproseslerde üretimi hedeflenen ürün çoğu kez hücre veya belirli organellerin içerisinde bulunmaktadır. İstenen ürünün serbest hale getirilmesi için hücrelerin parçalanması gerekir. Bu amaçla kullanılacak yöntemler izole edilecek biyoürünün denatürasyonuna neden olmamalıdır. Bitkisel materyal veya hayvansal organların parçalanmasında kesme veya öğütme gibi mekanik işlemler olumlu sonuç vermektedir. Materyalin derin dondurulması işlemlerde kolaylık sağladığı gibi biyoürünün denatürasyonunu da önemli ölçüde engellenir. 43 44 Mikroorganizma hücrelerinin parçalanması çok zordur. Çünkü hücre içinde yüksek bir ozmotik basınç vardır ve hücre membranı çok dayanıklıdır. Hücre parçalanması amacıyla: Soğutmalı yüksek basınç homojenizatörleri Cam küreli değirmenler Soğutmalı presler Ultrases ile çalışan cihazlar kullanılabilir. Ayrıca, ozmotik şok ve tekrarlanan dondurma çözme işlemleri ile de hücre parçalanması gerçekleştirilebilir. Toluen gibi organik çözgenlerin deterjanların, asit ve bazların etkisiyle de hücre parçalanabilir. 45 46 Çeşitli kaynaklardan elde edilen bazı enzimler hücre zarını parçalayabilirler. Fakat enzimler immobilize edilip defalarca kullanılmazsa pahalıdır ve ticari enzim preperatlarının içerdiği safsızlıklar daha sonraki saflaştırma işlemlerinde problem yaratabilirler. Genellikle proteaz ve lipaz enzimleri kullanılır. Zenginleştirme a) Ekstraksiyon Esası, ayrılacak maddenin iki sıvı fazdaki dağılımının farklı olmasına dayanır. Ayrılacak maddeyi (genellikle lipofil karakterli) içeren faza çözgen ilave edilir. Ayrılacak maddenin her iki fazdaki dağılımı Nerst dağılma kanununa uyar Cü kd = ----------------- Ca kd: maddenin fazlar arasındaki dağılma katsayısı Cü: üst fazdaki konsantrasyon Ca: alt fazdaki konsantrasyon 47 48 8
Özellikle antibiyotik üretiminde ekstraksiyon yöntemi kullanılır. Ekstraksiyonun önemli avantajları işlemin kısa sürmesi ve büyük işletmelerde kesiksiz proseslere uygunluğudur. b) Membran filtrasyonu Esası, çözünmüş partiküllerin membran yüzeyine taşınmasıdır. Hidrostatik basıncın etkisiyle bazı moleküller membrandan geçerken bazıları geçemez. Membran filtrasyonu teknikleri deriştirme yanında küçük ve büyük moleküllerin ayrılması ve tuzun giderilmesine de yarar. Uygulamada 3 önemli yöntem vardır: ultrafiltrasyon, ters ozmoz ve elektrodiyaliz. 49 50 Ultrafiltrasyon Membran filtrasyonundan farkı basınç veya santrifüj uygulamasıyla yarı geçirgen bir membran yardımıyla işlem gerçekleştirilir. 51 52 Çöktürme Çöktürme ürün saflaştırmanın çeşitli evrelerinde kullanılan bir yöntemdir. Tek bir adımda hem zenginleştirme hem de konsantre etmesi bakımından oldukça kullanışlı bir yöntemdir. Çöktürme için kullanılan kimyasallar arasında asitler ve bazlar, tuzlar, organik çözücüler vb yer almaktadır. a) Kristallendirme 4. Saflaştırma Endüstriyel boyutta kristallendirme sitrik asit üretiminde kullanılır. Kristalledirme çözeltiyi soğutma, çözünürlüğü azaltacak maddelerin ilavesi (Ca(OH)2 gibi) veya ortam koşullarının (ph, sıcaklık, iyon şiddeti vb) değiştirilmesiyle gerçekleştirilir. Çeşitli antibiyotik ve bazı enzimlerin saflaştırılmasında kristallendirmeden yararlanılır. 53 54 9
b) Kromatografi 5. kurutma Düşük konsantrasyonlarda ürün elde edilen proseslerde fiziksel ayırmanın ardından ürün saflaştırmanın en önemli basamağı kromatografidir. Kromatografi karışımdaki maddeleri birbirinden ayırmada kullanılan en etkin yöntemdir. Endüstride kullanılan kromatografi türleri Adsorbsiyon kromatografisi İyon değiştirme kr. Jel filtrasyon kr. Affinite kr. Biyoürünlerin termal kararlılıkları düşüktür ve bu sebeple kurutma işlemlerinin bu durum göz önünde bulundurularak yapılması gerekir. a) Dondurarak kurutma b) Kontak ile kurutma Mekanik olarak hareketli bir tabaka üzerinde ısı alışverişi sonucu gerçekleşir. 55 56 c) Konveksiyon ile kurutma Bu kurutucuda kurutulacak maddenin hareketi genellikle gaz akımı ile sağlanır. Kısa sürede büyük miktarda madde kurutulmasına olanak sağlar. Kurutulacak madde derişik çözelti, süspansiyon veya ıslak katı formunda kurutucuya verilebilir. Küçük partiküller halinde sıcak hava akımına püskürtülen madde çok çabuk kurur ve granüler formda kurutucunun altında toplanır. Hava akımında sıcaklık 150-200 C arasında olmasına rağmen işlem süresi çok kısa olduğundan biyoürünlerde termal bozunma görülmez. 57 58 10