TR117 BUĞDAY x MISIR MELEZLEMESİ İLE DURUM BUĞDAYDA HAPLOİD EMBRİYO ÜRETİMİ SAVAŞKAN Ç.,* ELLERBROOK C.,** FISH L.J.** SNAPE J.W." Nükleer Araştırma ve Eğitim Merkezi, 615, Saray, Ankara. * John Innes Centre, Cereals Research Department, Norwich, U.K. ÖZET Bu çalışma ülkemizde özellikle Orta Anadolu'da tarımı yapılan Kunduru. Berkmen ve Çakmak tetraploid buğday çeşitlerinin mısır (Seneca 6) ile melezlenmesi sonucunda elde edilebilecek haploid embriyo, farklılaşma ve DH bitki kapasitesini saptamak amacı ile yapılmıştır. Bu çeşitlere ait 296 çiçek mısır ile melezlenmiş ve 19-21 gün sonra melezlenen çiçeklerin 13.65'i haploid embriyo üretmiştir. Çeşitlerden alınan haploid embryo sayısı, embriyo kültür ile elde edilen regenerant bitki sayısı (embriyodan ve kallustan) ve DH bitki sayısı ayrı ayrı irdelenmiştir. Embriyo kültürü için standart MS kültür ortamı (2 sükroz) kullanılmıştır. Elde edilen bulgulara göre: Kundura ve Berkmen çeşitlerinin haploid embriyo üretimi arasında önemli bir fark bulunmamış bu çeşitlerin Çakmak çeşidine göre verdikleri haploid embriyo sayısı P<.1 seviyesinde önemli bulunmuştur. Bunun yanısıra meydana gelen haploid embriyo formasyonlarının hepsi farklılaşarak bitki meydana getirmemişlerdir. Üç çeşite ait farklılaşan embriyoların toplam değeri.27 dir. Farklılaşma gösteren ve göstermeyen embriyo sonuçlan arasındaki fark her çeşit için kendi içerisinde önemsiz bulunmuştur. Giriş Hapioid bitki üretmek, bunlardan kısa sürede dihaploidler veya diploidler alabilmek bakımından büyük önem taşımaktadır. Karakterleri kontrol eden genler homozigot olacak ve gelecek generasyonlara da sabit ve değişmez olarak geçeceklerdir. Bunun anlamı: haploid sayıda kromozom iki katma çıkartıldığında karşılıklı aleller aynı genotipik özelliği taşıyan genler olacağından genetik kararlılığa varmak için uzun süre beklemek gerekmeyecektir. Aynca verim ve diğer kantitatif karakterleri erken verecek ve seleksiyon kolay olacaktır (1). Haplodizasyon mutasyon çalışmalarında da kullanılmaktadır. Mutasyon çalışmaları ile daha geniş genetik çeşitliliğe sahip popülasyonlar meydana getirilmektedir. Bu da mutagenierle genlerde oluşturulan resesif aletlerin kromozom sayılarının iki katına çıkarılması ile diploid fazda daha fazla istenen karakterin homozigot olarak alınabileceğini ifade eder (2). Haploidler son yirmi yılda özellikle tahıllarda çeşitli metodlarla üretilmektedir. Çok sayıda haploid üretmek için ilk metod 197 yılında Kasha ve Kao tarafından arpa da geliştirilmiştir (3). DH (doubled haploid) bitkiler, tür içi (Hordeum vulgare ile H. bulbosum) ve tür dışı (buğday ve H. bulbosum veya buğday ile Sorghum gibi) melezlemeler ile ve dişi ve erkek gametofitik hücrelerden (amer. izole edilmiş mikrospor, ovaryum) doku kültürü tekniği ile elde edilebilmektedir (4,5,6). Heksaploid buğday çiçekleri mısır polenleri iie metezlenerek haploid bitki üretimi sağlanmıştır (7,8,9). Mısır kromozomları zigot safhasında elimine olmakta ve meydana gelen haploid embriyolar besi ortamına transfer edilerek haploid bitki regenerasyonu sağlanmaktadır. Amer kültür tekniği ile durum buğdayda yüksek haploid bitki regenerasyon kapasitesi sağlanamamıştır. Kisana ve ark. DH üretimi için buğdayda anter kültürü ve buğday x mısır melezlcmesini kullanmışlar ve sonuçları mukayeseli olarak 9
değerlendirmişlerdir. Amer kültürü ile elde edilen yeşil regenerant bitki oranının daha düşük olduğu ve kromozom sayılarında DH yerine polihaploidlere rastlandığım belirtmişlerdir (1). Dunun (tetraploid) buğdayda ise mısır ile melezlenmesi sonucunda haploid bitki üretimi üzerine çalışma çok azdır (11). Bu çalışmada özellikle Orta Anadolu'da üretimi yapılan üç durum buğday çeşidinin haploid embriyo üretim kapasitesi buğday x mısır melezlemesi ile araştırılmıştır. Materyal ve Metod Materyal: Denememizin materyali Triticum durum ev. Kunduru 1149, Berkmen ve Çakmak çeşitleri, Orta Anadolu da tarımı yapılan, makarnalık buğday çeşitlerimizdir. Kunduru 1149 ve Berkmen; Orta Anadolu da Ankara-Eskişehir yöresinden alınarak seleksiyon yolu ile ıslah edilmiştir. Çakmak ise kışlık makarnalık Üveylik 162 ile ABD orijinli yazlık kısa boylu, makarnalık 61-13 hatlının melezlenmesi ile ıslahı yapılmış bir çeşittir. Her üç çeşitte alternatif özelliktedir. Metod: Çeşitlere ait buğday ve mısır bitkileri normal oda sıcaklığında seralarda yetiştirildi. Başakçıklar amerlerden arındırılarak (kasturasyon) başaklar şeffaf bir zarfla kapatıldı ve etiketlendi. Mısır polenleri toplandı ve bir forsep yardımı ile kasturasyon yapılan başakçıklardaki sügmalann üzerine konularak melezleme işlemi yapıldı (7) Buğday x mısır döllenmesi ve sağlıklı embriyo oluşumu için başaklara melezleme işleminden 24 saat sonra iki ayn Dicamba çözeltisi uygulandı. 1-) Döllenen başakların her birine birer damla.5 ml'lik şırınga ile 2 mg/1 Dicamba çözeltisi uygulandı. 2-) Üst intemoda imernodun alt kısmından başağa doğru 1 mg/l'lik Dicamba solüsyonu enjekte edildi. Onsekiz-21 gün sonra başakların içerisinde embriyo bulunanlar tespit edildi. Embriyo kültürü için standart MS kültür ortamı, 2 g/l sükroz ve 9 g/l Difco bakto ağar ilave edilerek hazırlandı. Embriyoların inkübasyonu 2±l C'de, klasik ışık ortamında yapıldı. Bu safhada embriyolardan haploid regenerant bitkilerin çıkışı gözlemlendi, sayımı yapıldı. Haploid sayıda (14 adet) kromozom sayısı kök ucu hücrelerinin sitolojik analizi ile kontrol edildi (Şekil 1). Bunun için; kök uçları feulgen boya ile boyandı ve ezme preparasyön yöntemi ile mikroskop gözlemi için hazırlandı. Regenerantlar yeterli büyüklüğe ulaştıkları zaman içerisinde 3 kısım peat + ı kısım kum karışımının bulunduğu saksılara transfer edildiler. Üç yapraklı bir gövde büyüklüğüne ulaşan haploid bitkiler.5 lik 5 saat kolşisin çözeltisine tabi tutuldular (4). Böylece kromozomları iki katına çıkartılan DH bitkiler toprağa transfer edildiler ve yeniden seralarda tohum alımına kadar yetiştirildiler. Çeşitlerden elde edilen tüm sonuçların frekans dağılımı ve z-testi ile sonuçların karşılaştırması yapıldı. 91
Bulgular Oç çeşitte toplam olarak 296 çiçek melezlendikten 19-21 gun sonra incelenmeye alındı ve bunların 13.65 i haploid embriyo üretmiştir (Tablo 1). Çakmak çeşidi 5.2 ile en düşük embriyo veren çeşit olmuştur ve diğer çeşitlerle P<.1 seviyesinde fark vardır. Diğer çeşitlerden Kunduru da haploid embriyo oranı 19.96 Berkmen de ise 16.7 dir ve bu değerler arasındaki fark önemli değildir. Endosperm oluşumu ise Oç çeşitte toplam olarak sadece.1 unda gözlemlenebilmiştir (Tablo l).topraga transfer edilen haploid bitki sayısı her Uç çeşitte ayrı ayn değerlendirildi. Yine Çakmak ile diğer çeşitler arasında P<.1 seviyesinde farklılık vardır. Halbuki Kunduru ve Berkmen çeşitlerinin haploid bitki frekansları arasında farklılık olmamıştır (Tablo 1). Üç çeşitte toplam olarak haploid bitkiden 36 adedi kolşisin uygulamasına kadar yaşamlarını sürdürebilmişlerdir (Tablo 1). Bu adımda Çakmak çeşidinin Kunduru ile arasındaki fark P<.1 seviyesinde, Berkmen ile arasındaki fark ise P<.5 seviyesindedir. Kunduru ile Berkmen arasında ise önemli bir farklılık yoktur. Kolşisin uygulamasından sonra DH bitki sayısı genotiplerde değişmemiştir ve istatistiksel değerlendirmeler kolşisin uygulaması yapılan bitki değerlendirmeleri ile aynı bulunmuştur (Tablo 1). Toplam olarak 38 haploid embriyodan 63 embriyo ve 1 kallus farklılaşma göstermiş, 64 farklılaşan embriyodan adedi toprağa transfer edilebilecek seviyede bitki geliştirmiştir (Şekil 2 ve Tablo 2). Farklılaşma gösteren ve göstermeyen embriyo değerleri üç çeşit arasında önemli bulunmamıştır (Tablo 2). Farklılaşma direkt olarak embriyodan veya kallus formasyonundan sonra meydana gelmiştir. Her iki durum için de farklılaşma; zayıf (zayıf yaprak veya kök) veya kuvvetli (güçlü yaprak ve kök) olarak iki guruba ayrılmıştır. Toplam değerlendirmeye göre hem embriyodan hem de kallus formasyonundan farlılaşma her üç çeşit arasında P<.1 seviyesinde farklıdır (Tablo 2). Toprağa transfer edilen bitki frekansı çeşitlerin haploid embriyo frekansı üzerinden de değerlendirilmiştir (Tablo 2). Çakmak ile diğer çeşitler arasında P<.1 seviyesinde farklılık vardır. Burada; Tablo 1 de gösterilen her 1 melezlenen çiçek ile yapılan hesaplamadan farklı olarak Kunduru ve Berkmen çeşitlerinin bu değerleri arasında P<.5 seviyesinde farklılık bulunmuştur. Tartışma Tahıllarda aynı tür içindeki çeşitlerin veya farklı türlerin birbirleri ile melezlerimden mümkündür. Böylece birinden diğerine istenen genler transfer edilebildiği gibi yine bu yolla ıslah programlan için çok sayıda haploid bitki üretmek mümkündür (12). Bu çalışmada tetraploid buğday ile mısırın melezlenmesi sonucunda üç çeşitten toplam olarak 13.7 haploid regenerant elde edilmiştir (Tablo 1). Heksaploid buğdayda ise bu metodla 26.5-3. haploid bitki alınmaktadır (7,8). Haploid formasyonunun oluşumu genetik faktörlere, bitkinin genom oranına ve çevresel koşullara bağlıdır (6). Heksaploid çeşitlerde Kr genlerinin varlığımn, dominant veya resesif oluşunun haploid bitki üretimi üzerinde etkili olduğu bilinmektedir (9). 92
Kundura ve Berkmen çeşitleri sırasıyla 2. ve 16.7 haploid regenerant bitki üretmişlerdir. Ancak Çakmak çeşidi 5. haploid bitki üretebilmiştir. O'Donoughue ve Bennett'in tetraploid buğday çeşitlerinden aldıkları sonuçlar Kundura ve Berkmen çeşitlerine benzerlik göstermektedir (Waksona 14.5 ve Rampton Rivet 15.6) (1). Tetraploid buğday çeşitlerinde endosperm oranı da heksaploid çeşitlere göre düşük olmuştur. Çalışmamızda toplam endosperm oranı.1 dir. Endospermdeki çok az gelişme potansiyel olarak yaşayabilecek haploid embriyolann ölümüne neden olur. Embriyoyu yapay kültür ortamları ile yani embriyo kültürü ile destekleyerek bundan bitki elde etmek mümkündür (12). Türler arası melezleme işlemlerinde fertil bitki oluşumunu engelleyen nıelezleme sonrası engelleri Batım ve ark. üç ana başlık altında toplamışlardır (12). 1- hibrit bireyin sterilitesi, 2- endosperm gelişiminin noksanlığından dolayı yaşayabilir embriyolann ölümü, 3- embriyo gelişimi sırasında ebeveyn kromozom setlerinden bir kromozomun eliminasyonudur. Embriyo kültürü sırasında her üç çeşitte farklılaşma gösteren ve farklılaşmayan embriyo değerleri arasındaki fark önemsiz bulunmuştur (Tablo 2). Diğer bir ifade ile her 1 embriyo formasyonuna göre ttç çeşitte de bitki verebilen embriyo frekanslan birbirine çok yakındır. Bu sonuçlar çeşitlerin seçilen çevre faktörlerine aynı uyumu göstermesi ile açıklanabilir (besin ihtiyaçları, ısı ve ışık gibi) (6) Tablo 1. Bazı Turk tetraploid genoüplerin buğday x mısır melezlenmesi ile DH bitki üretim kapasiteleri Kundura n * Berkmen n Çakmak n Toplam n Meiezlenen başak 28 32 35 95 Meiezlenen çiçek 937 988 135 296 Embriyo 187 19.96a* 165 16.7a 5.2b 44 13.65 Endosperm Toprağa transfer edilen bitki Kolşisin uygulanan bitki 1 29 2.11 3.9a 2.13a 2 18 12.2 1.82a 1.2a 5 4..48b.38b 3 36.1 1.76 1.22 DH bitki 2 2.13a 12 1.2a 4.38b 36 1.22 ' Sıra içinde aynı rakam ile gösterilen değerler arasındaki farklılık önemli değildir. "Her 1 adet meiezlenen çiçekten alınan embriyo, endosperm, toprağa transfer edilen bitki, kolşisin uygulanan bitki ve DH bitki sayısı 93
Tablo 2 Genotiplcrdc embriyo ve kallustan farklılaşma ve haploid regenerant bitkiler Meydana gelen embriyo Farklılaşmayan cnıb Faklılaşan embriyo I Embriyodan: I u) zayıf I b) iyi I Toplam II Kallustan: II a)zavıf II b) iyi 11 Toplam Toprağa transfer edilen bitki n 187 92 97 45 3 75 19 1 2 Kundura»9.2a* 5.8a 24.6 16.4 4.1a 1.16.53 1.7b 29 15.51a 18 12.8b 5 ' Sıra içerisinde ayrı rakam ile gösterilen değerler arasındaki fark önemlidir n 149 71 78 2 25 45 33 33 Berkinen 47.65a.35a 13.42 16.77 3.2b 22.15. 22.15c Çakmak n_ 44 21 23 15 8 23 47.73a.27a 34.9 18.18.27c.. O.OOd 11.36c n 38 184 196 8 63 143 1 53 Total 48.42 51.58 21.5 16.58 37.63 13.68.26 13.94 12.98
Şekil 1. Bir haploid buğday regenerant bitkisinde 14 kromozom sayısını gösteren kök ucu kromozomlan. Bar 1 um uzunluğu göstermektedir. Şekil 2. Buğday x mısır melezlenmesi ile çeşitlerden elde edilen haploid embriyolar ve haploid bitki regenerasyonu. 95
Kaynaklar 1. Snape J.W. (1989) Doubled haploid breeding: In: Mujeeb-Kazi A, Sitch L.A (eds) Rcviewof advantages in plant biotechnology 1985-88. 2nd International Symposium on genetics manipulation in crops. C1MMYT and IRRI, Mexico and Manila, ppl9-31. 2. Szarejko.I-, Maluszynski, M., Polok, K., and Kilian, A. (1991) Doubled Haploids in the Mutation Breeding of Selected Crops. Plant Mutation Breeding for Crop Improvement, IAEA/FAO, Vol 2, 355-378. 3. Kasha K.J. and Kao (197) High frequency haploid production in barley (Hordeum vulgare L.). Nature 225,874-876. 4. Sitch L.A. and Snape J.W. (1986) The influence of the Hordeum bulbosum on haploid production in wheat (Triticum aestivum). Z. Pflanzenzuchtg 96, 34-319. 5. Laurie D.A. and Bennett M.D. (1988) Cytological evidence for fertilization in hexaploid wheat x sorghum crosses. Plant Breeding 1:73-82. 6. Pickering R.A. and Devaux P., (1992) Haploid production: Approachs and use in plant breeding In: P.R. Shewry (ed) Barley: Genetics, Biochemistry, Molecular Biology and Biotechnology, pp: 519-547. 7. Laurie D.A. and Bennett M.D. (1986) Wheat x maize hybridization Can. J.Genet. Cytol. Vol 28: 313-315. 8. Laurie D.A. and Bennett M.D. (1988) The production of haploid wheat plants from wheat x maize crosses. Theor Appl. Genet 76: 393-397. 9. Laurie D.A. and Bennett M.D. (1987) The effect of crossabiliry loci Krl and Kr2 on fertilization in hexaploid wheat x maize crosses. Theor Appl Genet 73: 43-49. 1. Kisana N.S., Nkolongolo, K.K., Quick J.S. and Johnson D.L. (1993). Production of doubled haploids by anther culture and wheat x maize method in a wheat breeding programme. Plant Breeding 11,96-12. 11. O'Donoughe L.S. and Bennett M.D. (1994) Durum wheat haploid production using maize widecrossing. Theor. Appl. Genet 89:559-566. 12. Baum M., Lagudah, E.S. and Appels, R. (1992) Wide cross in cereals. Annu. Rev. Plant. Physiol. Plant. Mol. Biol. 43: 117-143. 96