NON-MOLEKÜLER TEKN KLER N TANI AMAÇLI KULLANIMLARI Yrd.Doç.Dr.Alpaslan ALP Hacettepe Üniversitesi T p Fakültesi Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji AB Dal, ANKARA Tüberküloz kontrolünde anahtar faktörler h zl tan, etkili tedavi ve bulafl önlemektir. Hasta kiflilerin tüberküloz basilini bulaflt rmalar n önleyebilmek için, tüberküloz tan s n n k sa sürede konmas ve zaman kaybetmeden tedaviye bafllanmas gerekmektedir. Bu nedenle tüberküloz tan s n n h zl bir flekilde konmas, tüberkülozla savafl program n n önemli bir parças n oluflturmaktad r. Tüberküloz tan s nda kullan lan yöntemler temel olarak, aside dirençli boyama yöntemleri sonras nda mikroskopik inceleme ile basilin görülmesi ve bakterinin çeflitli s v veya kat besiyerlerinde üretilerek tan mlanmas esas na dayanmaktad r. Mikroskopik incelemede aside dirençli basilin görülebilmesi için örne in mililitresinde en az 5000 kadar bakteri bulunmas gerekmektedir. Kültür ile örnekteki birkaç canl bakterinin bile gösterilebilmesi mümkündür, ancak kolonilerin kat besiyerinde gözle görülebilir hale gelmesi 4-6 hafta kadar sürebilmektedir. Bu nedenle tüberküloza yakaland düflünülen hastalar n tan lar n sa layacak, duyarl l ve özgüllü ü yüksek, h zl sonuç veren, uygulamas kolay ve pahal olmayan laboratuvar yöntemlerinin günlük kullan ma girmesi önemli bir gereksinim haline gelmifltir. Tüberküloz tan s nda kullan lan yöntemler direk ve indirek yöntemler olarak ikiye ayr labilir. Direk yöntemler mikobakterilerin veya ürünlerinin saptanmas esas na dayan rken, indirek yöntemler tüberküloza karfl konakta oluflan immün yan t n ölçülmesi esas na dayan r. Mikroskopik nceleme: Klinik örneklerde aside dirençli basil saptanmas amac yla kullan lan en basit, ucuz ve h zl yöntemdir. Boyal yayma preparatlar n mikroskopik incelemesinde aside dirençli basillerin görülebilmesi için örne in mililitresinde en az 5000 basilin olmas gereklidir. Özellikle tüberkülozun endemik 98
oldu u bölgelerde, h zl sonuç al nabilmesi nedeniyle tan da vazgeçilmez bir yöntemdir. Mikroskopik inceleme sonuçlar n etkileyebilecek faktörler örne in türü, yayman n kal nl, boyama s ras nda dekolorizasyon süresi ve incelemeyi yapan kiflinin tecrübesidir. Kültür Yöntemleri: Günümüzde tüberküloz tan s nda alt n standart olarak kabul edilen yöntemler, kültür yöntemleridir. Bu amaçla yumurta bazl veya agar içerikli kat besiyerleri kullan labildi i gibi, s v besiyerleri de kullan labilmektedir. H zl tan sa layabilmek amac yla s v besiyerlerinin yar otomatize cihazlarda kullan ld çeflitli sistemler mevcuttur. Hangi yöntem kullan l rsa kullan ls n, kültür yöntemlerinin verimlili ini etkileyen en önemli faktor, kültür öncesinde gerçeklefltirilen dekontaminasyon-homojenizasyon iflleminin baflar l bir flekilde yap lmas d r. Kültür yöntemlerinin en önemli avantajlar, mikobakteri canl l n do rudan gösterebilmeleri ve bakteri izolat ile duyarl l k tesbiti, idantifikasyon, genotiplendirme gibi ek testler yap labilmesine imkan sa lamalar d r. Kültür amac yla günümüzde en yayg n olarak kullan lan kat besiyeri Lowenstein- Jensen besiyeri, s v besiyeri sistemi ise Bactec 460 radyometrik sistemidir. Lowenstein-Jensen besiyeri, laboratuvar flartlar nda kolayca haz rlanabilmesi ve ucuz olmas nedeniyle birçok merkez taraf ndan tercih edilmektedir. Bactec 460 radyometrik sistemi h zl ve güvenilir tan sa lamas nedeniyle alt n standart olarak kabul görmüfl bir s v besiyeri sistemidir. Ancak inokülasyon öncesi fliflenin ön okutma ifllemi ve haftada üç kez rutin okutma ifllemleri nedeniyle ifl yükünün fazla olmas, kültür flifleleri aras nda çapraz kontaminasyon riski, radyoaktif materyallerin kullan m na ve yok edilmesine iliflkin problemler, cihaz içinde okutmalar s ras nda aerosol oluflma riski, koloni morfolojisinin belirlenememesi, kar fl k kültürlerin tan mlanmas nda zorluk çekilmesi ve enjektörlerin yo un kullan m na ba l olarak laboratuvar çal flanlar n n i ne kazalar bak m ndan sürekli risk alt nda bulunmalar, en önemli dezavantajlar d r. Middlebrook kat ve s v besiyerleri, haz rlanmalar daha zor oldu undan ve haz r sat nal nmalar durumunda da daha pahal olduklar ndan, daha az s kl kla kullan lmaktad rlar. Bununla birlikte, özellikle duyarl l k testlerinde Lowenstein- Jensen besiyerine gore daha güvenilir ilaç konsantrasyonlar sa lad klar ndan, tercih edilmektedirler. Middlebrook kat besiyerleri, mikrokolonilerin erken 99
dönemde saptanabilmesi amac yla kullan labilmektedirler. Bu amaçla özellikle antibiyotik içeren selektif 7H11 besiyeri tercih edilmektedir. Bu yöntemle besiyerinde koloni oluflumu bir hafta içinde mikroskopik olarak saptanabilmektedir. Ancak rutin tan laboratuvarlar nda çok tercih edilen bir yöntem de ildir. H zl bir tüberküloz tan sistemi olan TK kültür sistemi, yeni gelifltirilmifl olan bir tan yöntemidir. Bu sistemde izolasyon için kullan lan TK besiyeri, çoklu renk indikatörleri kimyas ndan yararlan larak haz rlanm fl, mikobakterilerin üremesini erken saptayan bir besiyeridir. Ekilen örnekte mikobakteri bulunmas durumunda, inkübasyon süresince mikobakterilerin üretti i metabolitlere ve enzimlere ba l olarak TK besiyerinin orijinal k rm z rengi sar ya, di er bakteri veya fungal türlerin varl nda ise yeflile dönmektedir. Bu renk de iflimi, kolonilerin görünür hale gelmesinden çok daha önce gerçekleflmektedir. Renk de iflimi hem gözle, hem de otomatik kültür sistemi MYCOLOR TK ile izlenebilmektedir. TK kültür sistemi tüberküloz tan s nda rutin olarak kullan labilecek pratik, h zl ve güvenilir bir yöntemdir. Otomatize bir mikobakteri tan sistemi olan MGIT 960 sistemi, floresans veren bir indikatörün bulundu u tüplerde bakterilerin üretilmesi esas na dayanmaktad r. Mikobakteriler üredikçe tüpteki oksijenin tüketilmesine ba l olarak indikatör serbest kalmakta ve floresans aç a ç kmaktad r. Aç a ç kan floresans cihaz taraf ndan otomatik olarak ölçülmekte ve sonuçlar verilmektedir. MGIT 960 sisteminin k sa sürede sonuç vermesinin yan nda en önemli avantajlar, i ne veya benzeri riskli gereçlere ihtiyaç duyulmamas ve radyoaktif madde kullan lmamas d r. Bu nedenle bu sistem baz merkezlerde Bactec 460 radyometrik sistemine bir alternatif olarak kullan lmaktad r. MB/BacT Alert sistemi, besiyerindeki karbondioksit miktar n n kolorimetrik olarak saptanmas esas na dayanan bilgisayarl bir sistemdir. Her fliflenin taban nda bulunan silikona gömülü kolorimetrik sensör, besiyerinde bulunan mikobakterilerin oluflturdu u çözünmüfl karbondioksit de iflimine ve bunun sonucunda de iflen ph ya duyarl d r. Böylece üremenin gerçekleflmesi durumunda ph de iflikli i sonucunda kolorimetrik sensor renk de ifltirir. Sensörün koyu yeflilden sar ya dönmesi, sonucun pozitif oldu unu gösterir ve bakteriler canl l n yitirse bile bu renk de iflimi geriye dönmez. Bu sistemde radyoaktif madde kullan lmamas 100
bir avantaj olmakla birlikte, kontaminasyon riskinin biraz daha fazla olmas ve Bactec sistemine göre saptama zaman n n biraz daha uzun olmas dezavantajlar mevcuttur. Tam otomatize bir tüberküloz tan sistemi olan Myco-ESP II (Extra Sensing Power) kültür sistemi, mikobakterilerin üremeleri sonucu oksijen tüketimine ba l olarak kapal flifledeki bas nç de iflikliklerinin devaml takip edilmesi ve bilgisayarda grafiksel olarak görüntülenmesi esas na dayanmaktad r. Radyoaktif madde kullan lmamas ve az iflgücü gerksinimi nedeniyle tercih edilebilecek bir yöntem olmas na ra men, Myco-ESP II kültür sistemi henüz rutin uygulamaya girmemifltir. Fast Plague TB Test: Klinik örneklerden M. tuberculosis saptanmas nda kullan labilen fenotipik bir testtir. Örne in ekildi i kat besiyerine mikobakteriyofajlar n eklenmesi ve örnekte bulunabilecek mikobakterilerin bu mikobakteriyofajlarla enfekte edilmesi esas na dayan r. K sa bir inkübasyon süresi sonras nda h zla ço alan mikobakteriyofajlar, ikinci bir besiyerinde h zl üreyen nonpatojenik mikobakteri türü ile inkübasyona b rak l r. Bir gecelik inkübasyon sonras nda örnekteki mikobakteri varl besiyerinde litik zonlar n görülmesiyle anlafl l r. Adenozin Deaminaz Ölçümü: Adenozin deaminaz (ADA) pürin metabolizmas nda ifllevi olan bir enzimdir ve monosit, makrofaj ve özellikle T- lenfosit gibi birçok hücrenin olgunlaflmas nda önemli rol oynar. Plevra, periton, perikard ve beyin omurilik s v lar nda, bu boflluklarda tüberküloz bulundu u zaman ADA düzeyinin yükselmifl oldu u belirlenmifltir. Bu durum kötü huylu tümörlerin varl gibi durumlarda da görülmekle beraber ADA düzeyindeki yükseklik genellikle tüberkülozda oldu u kadar belirgin de ildir. Ancak rutin tan da ADA seviyesinin ölçümü, yeterince özgül bir test olmamas nedeniyle tamamlay c bir test niteli indedir. Serolojik Testler: M. tuberculosis antijenik yap lar n n saptanmas esas na dayanan serolojik testler, rutin tan laboratuvarlar nda yayg n kullan m alan bulamam fllard r. Bunun en önemli nedeni, serolojik testlerin duyarl l klar n n düflük olmas ve M. tuberculosis ile nontüberküloz mikobakteri ayr m n n bu 101
testlerle yap lamamas d r. Bu testlerde s kl kla balgam veya idrardaki mikobakteriyel lipoarabinomannan komponentinin saptanmas na yönelik çal flmalar yap lm flt r. Tüberküloz Tan s nda ndirekt Yöntemler; Antikorlar n Saptanmas : Bu testler de, antijen saptanan testler gibi, rutin tüberküloz tan laboratuvarlar nda yayg n olarak kullan lmamaktad rlar. Özellikle tüberküloz insidans n n yüksek oldu u ülkelerde, yüksek seropozitiflik oran nedeniyle bu tür testlerin tan sal de eri düflmektedir. Antikor aranmas amac yla çeflitli testlerde kullan lan antijenler aras nda lipoarabinomannan, 38 kda antijen, MBP 64 antijeni ve ESAT 6 antijeni bulunmaktad r. KAYNAKLAR: 1. Albay A, Kisa O, Baylan O, Doganci L. Evaluation of FASTPlaqueTB for the rapid diagnosis of Mycobacterium tuberculosis infections. Diagn Microbiol Infect Dis 2003; 46:211-215. 2. Baylan O. Tüberkülozun kültüre dayal tan yöntemleri. Mikrobiyol Bul 2005 39:107-24. 3. Del Prete R, Picca V, Mosca A, et al. Detection of anti-lipoarabinomannan antibodies for the diagnosis of active tuberculosis. Int J Tuberc Lung Dis 1998; 2:160-164. 4. Fujiki A: Direct smear examination, p.26-33. In, TB Microscopy. 1998, The Research Institute of Tuberculosis, Japan. 5. Gil-Setas A, Torroba L, Fernandez JL, et al. Evaluation of the MB/BacT system compared with Middlebrook 7H11 and Lowenstein-Jensen media for detection and recovery of mycobacteria from clinical specimens. Clin Microbiol Infect 2004;10:224-228. 6. Hale YM, Pfyffer GE, Salfinger M: Laboratory diagnosis of mycobacterial infections: new tools and lessons learned. Clin Infect Dis 2001, 33:834-846. 7. Mejia GI, Castrillon L, Trujilo H, Robledo JA. Microcolony detection on 7H11 thin layer culture as an alternative for rapid diagnosis of Mycobacterium tuberculosis infection. Int J Tuberc Lung Dis 1999; 3:138-142. 8. Piersimoni C, Scarparo C, Callegaro A, et al. Comparison of MB/BacT ALERT 3D system with radiometric BACTEC system and Löwenstein-Jensen Medium for 102
recovery and identification of mycobacteria from clinical specimens: a multicenter study. J Clin Microbiol 2001; 39: 651-657. 9. Salfinger M, Pfyffer GE: The new diagnostic mycobacteriology laboratory. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 1994, 13:961-979. 10. Siddiqi SH: Procedure for primary isolation of mycobacteria from clinical specimens. p. II.1-II.13. In BACTEC TB System Product and Procedure Mannual 1989, Becton Dickinson, Maryland. 11. Yan JJ, Huang AH, Tsai SH, et al. Comparison of the MB/BacT and BACTEC MGIT 960 system for recovery of mycobacteria from clinical specimens. Diagn Microbiol Infect Dis 2000; 37:25-30. 103