SERBEST RADİKALLER, OKSİDATİF STRES VE ANTİOKSİDAN SİSTEMLER

SERBEST RADİKALLER Serbest radikaller dış yörüngelerinde eşlenmemiş elektron bulundurmaları nedeniyle diğer bileşiklerden farklı kimyasal bileşiklerdir. Bu eşlenmemiş elektron nedeniyle kararsız yapıda bulunan serbest radikal molekülü, kararlı hale geçebilmek için elektronunu başka bir elektron ile eşleştirmesi gerekmektedir. Bu nedenle de serbest radikaller oldukça aktif moleküllerdir. 2

Moleküler oksijenin özellikleri Moleküler oksijen (O 2 ), paralel spin durumlu iki ortaklanmamış (eşleşmemiş) elektrona sahiptir. 3

Ortaklanmamış (eşleşmemiş) elektron içeren atom, atom grubu veya moleküller serbest radikal olarak tanımlanırlar. Serbest radikal tanımına göre moleküler oksijen, bir biradikal (diradikal) olarak değerlendirilir. Biradikal oksijen, radikal olmayan maddelerle yavaş reaksiyona girdiği halde diğer serbest radikallerle kolayca reaksiyona girer. 4

Serbest Radikal Kaynakları Aşırı alkol tüketimi Sigara kullanımı Elektromanyetik radyasyon Güneş ışınları(uv) Kronik inflamasyonlar Aşırı demir yüklemesi Aşırı fiziksel egzersiz Yaşlanma Doğum kontrol hapları Antioksidan Moleküller Enzimler (SOD, Katalaz, GSH-Px) Proteinler (Albumin, serüloplazmin) Selenyum Askorbik asit (C vitamini) Tokoferoller (E vitamini) Karotenoidler Flavonoidler Glutatyon ve tiyoller Koenzim Q, ubikinon ve türevleri 5

Oluşan serbest radikaller, aralarında ateroskleroz, kalp hastalıkları, kanser, serebrovasküler hastalıklar, nörodejeneratif hastalıklar, diyabet, akut renal yetmezlik, akciğer hastalıkları, anfizem, bronşit ve alkolik karaciğer hastalıkları gibi yaşlanmaya bağlı dejeneratif bozuklukların da yer aldığı patolojik durumların oluşumuna katkıda bulunurlar. 6

Bu radikallerin başlıcaları; tekli oksijen ( 1 O 2 ), süperoksit anyonu ( O 2- ), hidroksi ( OH), peroksi (ROO ) ve alkoksi (RO ) radikalleridir 7

Biradikal oksijenin elektronlarından birinin enerji alarak kendi spininin ters yönünde olan başka bir orbitale yer değiştirmesiyle singlet oksijen oluşur. Singlet oksijen, eşleşmemiş elektronu olmadığı için radikal olmayan reaktif oksijen molekülüdür, delta ve sigma olmak üzere iki şekli vardır. Delta O 2 Sigma O 2 8

Moleküler oksijen, biradikal doğasının bir sonucu olarak yüksek derecede reaktif oksijen türleri (ROS) oluşturma eğilimindedir. Reaktif oksijen türleri (ROS) Reaktif oksijen türleri (ROS), normal oksijen metabolizması sırasında az miktarda oluşan süperoksit radikali (O 2 ), hidrojen peroksit (H 2 O 2 ) ve hidroksil radikali (OH )'dir. 9

Oksijenin 1 elektron alarak redüklenmesi (O 2 + e - O 2 ) süperoksit anyon radikali (O 2 ) nin, 2 elektron kazanarak redüklenmesi (O 2 + O 2 + 2H + H 2 O 2 + 1 O 2 ) hidrojen peroksit (H 2 O 2 ) in ve 3 elektron alarak redüklenmesi (Fe +2 + H 2 O 2 OH - + Fe +3 + OH ) ise hidroksil radikali (HO - ) nin ortaya çıkmasına neden olur. Tekil oksijenle beraber belirtilen bu ROT lar, potansiyel hasar etkeni ürünler olarak sınıflandırılıp; reaktif oksijen ara ürünleri veya serbest oksijen radikalleri olarak da isimlendirilirler. 11

O 2 in hasar verici etkisi oluşturmuş olduğu serbest oksijen radikallerinden dolayıdır. Yukarıda da belirtildiği gibi, serbest radikal, eşlenmemiş en az bir elektrona sahip molekül ya da atomdur. Serbest radikaller; katyonik, anyonik ya da nötral yapıda olabilir ve aşırı derecede reaktiftirler. 12

ROT lar, serbest radikaller yanında hidrojen peroksit (H 2 O 2 ), hipokloröz asit ve tekil oksijen gibi bir veya daha fazla eslenmemiş elektron içermeyen, fakat ekstra ve intrasellüler ortamda serbest radikal oluşturma kapasitesine sahip molekülleri de içerirler. Oksijenin bir elektron (e - ) alarak indirgenmesi ile süperoksit anyon radikali (O 2 ) oluşur. O 2 + e - O 2 13

Süperoksit hidroksil radikaline oranla reaktivitesi daha zayıftır, membranları geçemez ve az sayıda hücresel hedeflere hasar verir. Spontan olarak sulu ortamda hidrojen peroksit ve tekil oksijene dismute olur ve hücre hasarı oluşturur. Ayrıca süperoksitin ortamdan uzaklaştırılması süperoksit dismutaz (SOD) ile çok daha hızlı bir şekilde H 2 O 2 e dismutasyonuyla gerçekleşmektedir. (O 2 + O 2 + 2H + H 2 O 2 + 1 O 2 ) 14

Oluşan tekil oksijen ( 1 O 2 ), serbest radikal olmamasına karşın kuvvetli bir okside edici ajandır ve birçok molekülle etkileşir. Membran lipitlerine etki ederek peroksitleri (lipit peroksidasyonu) oluşturur. Hidrojen peroksit, serbest radikal değildir ve nispeten anreaktiftir. H 2 O 2, biyolojik membranları geçerek, intrasellüler olarak fosfolipitler, karbonhidratlar, metalloproteinler ve DNA ile reaksiyona girerek hasara sebep olmaktadır. 15

Süperoksitin dismutasyonuyla oluşan hidrojen peroksit, birçok fizyolojik fonksiyona sahiptir. Bazı enzimler (ksantin oksidaz, glikolat gibi) direkt olarak hidrojen peroksit oluşturlar. SOD tarafından oluşturulan hidrojen peroksit daha çok intrasellüler (hücre içi) ortamda bulunan katalaz enzimi ile suya ve oksijene dönüştürülür. 2H 2 O 2 2H 2 O + O 2 16

Ekstraselüler (hücre dışı) ortamda katalazın görevini daha çok selenyum bağımlı enzim olan glutatyon (GSH) üstlenir. 2GSH + H 2 O 2 GSSG + 2H 2 O 17

O 2, biyolojik materyallerde önemli indirgeyici reaksiyonları indükler; örneğin, ferritin gibi metalloproteinlerde ferrik formdaki demir (Fe +3 ) i ferrus form (Fe +2 ) a indirgeyebilir. Fe +3 + O 2 Fe +2 + O 2 Demir bağlı proteinin indirgenmesi, biyolojik materyallerde önemli bir reaksiyondur. Çünkü o, çok yüksek oranda reaktif olan hidroksil radikali (OH.- ) ne dönüşümü sağlayacaktır. 18

Hidroksil radikali en reaktif okside edici radikaldir ve in vivo koşullarda yüksek bir reaksiyon hızıyla hemen hemen her moleküle saldırır. Hidroksil radikali lipit peroksidasyon olarak bilinen klasik serbest radikal zincir reaksiyonunu başlatabilir. Membran fosfolipitlerin yakınında hidroksil radikali oluştuğu zaman, peroksil radikali, lipit hidroperoksitler gibi radikaller oluşturur. Hidroperoksitlerin akümülasyonu membran fonksiyonunu bozabilir ve sitotoksik aldehitler oluşturabilir. 19

(4-Hydroxynonenal) 20

OKSİDATİF STRES Hücresel antioksidan düzeyinin, reaktif oksijen düzeylerine karşı yetersiz kalması sonucu, toksik bir etkinin başlaması olarak tarif edilir. Bu durum ya antioksidan savunmaların yetersizliği, ya reaktif oksijen türlerinin aşırı üretimi, ya da her ikisinden dolayı olmaktadır. ROT üretiminin aşırı artması veya antioksidan savunmanın azalmasından dolayı her iki sistemin dengesizliği oksidatif strese yol açmaktadır. 21

Süperoksit, hücrelerde özellikle solunum zincirlerindeki elektron kaçaklarından dolayı sitosolde ve mitokondride önemli miktarlarda üretilmektedir. Süperoksit kendiliğinden ya da süperoksit dismutaz aracılığıyla hidrojen peroksit ve oksijene dönüşmektedir. Hidrojen peroksit ise ya çeşitli enzimler aracılığıyla (GSH-Px, GSH, CAT) su ve oksijene dönüştürülerek etkisiz hale getirilir ya da geçiş metalleri (Fe 2+, Ca + ) aracılığıyla aşırı reaktif hidroksil radikaline dönüşerek lipit peroksidasyonuna, DNA veya proteinlerde hasarlara neden olabilirler. 23

Süperoksit radikali kendisi direkt olarak zarar vermez. Bu radikal anyonun asıl önemi, hidrojen peroksit kaynağı olması ve geçiş metalleri iyonlarının indirgeyicisi olmasıdır. Süperoksit radikali düşük ph değerlerinde daha reaktiftir, oksidan perhidroksi radikali (HO 2 ) oluşturmak üzere protonlanır. +H + 25

Süperoksit radikali ile perhidroksi radikali birbirleriyle reaksiyona girince biri okside olur diğeri indirgenir. Bu dismutasyon reaksiyonunda moleküler oksijen ve hidrojen peroksit meydana gelir. 26

Süperoksit radikali hem oksitleyici hem indirgeyici özelliğe sahiptir. Örneğin ferrisitokrom c ile reaksiyonunda indirgeyici olarak davranarak bir elektron kaybeder ve moleküler oksijene okside olur. 27

Hidrojen peroksit (H 2 O 2 ) Hidrojen peroksit (H 2 O 2 ), Süperoksitin çevresindeki moleküllerden bir elektron alması veya moleküler oksijenin çevresindeki moleküllerden iki elektron alması sonucu oluşan peroksitin iki proton (H + ) ile birleşmesi sonucu meydana gelir. 28

Biyolojik sistemlerde hidrojen peroksidin asıl üretimi, süperoksidin (O 2 ) dismutasyonu ile olur. İki süperoksit molekülü, süperoksidin dismutasyonu reaksiyonunda iki proton alarak hidrojen peroksit ve moleküler oksijeni oluştururlar. 29

Hidrojen peroksit bir serbest radikal olmadığı halde reaktif oksijen türleri (ROS) kapsamına girer ve serbest radikal biyokimyasında önemli bir rol oynar. Çünkü Fe 2+ veya diğer geçiş metallerinin varlığında Fenton reaksiyonu sonucu, süperoksit radikalinin (O 2 ) varlığında Haber-Weiss reaksiyonu sonucu en reaktif ve zarar verici serbest oksijen radikali olan hidroksil radikali (OH ) oluşturur. 30

Hidroksil radikali (OH ) Hidroksil radikali (OH ), Fenton reaksiyonu ve Haber-Weiss reaksiyonu sonucu hidrojen peroksitten oluşmaktadır. Hidroksil radikali son derece reaktif bir oksidan radikaldir, yarılanma ömrü çok kısadır. 32

Hidroksil radikali olasılıkla reaktif oksijen türlerinin (ROS) en güçlüsüdür. Oluştuğu yerde tiyoller ve yağ asitleri gibi çeşitli moleküllerden bir proton kopararak tiyil radikalleri (RS ), karbon merkezli organik radikaller (R ), organik peroksitler (RCOO ) gibi yeni radikallerin oluşmasına ve sonuçta büyük hasara neden olur. 33

Serbest radikallerin lipidlere etkileri Lipidler serbest radikallerin etkilerine karşı en hassas olan biyomoleküllerdir. Hücre membranlarındaki kolesterol ve yağ asitlerinin doymamış bağları, serbest radikallerle kolayca reaksiyona girerek peroksidasyon ürünleri oluştururlar. Poliansatüre yağ asitlerinin oksidatif yıkımı lipid peroksidasyonu olarak bilinir. Lipid peroksidasyonu kendi kendini devam ettiren zincir reaksiyonu şeklinde ilerler ve oldukça zararlıdır. 36

Hücre membranlarında lipid serbest radikalleri (L ) ve lipid peroksit radikallerinin (LOO ) oluşması, reaktif oksijen türlerinin (ROS) neden olduğu hücre hasarının önemli bir özelliği olarak kabul edilir. Serbest radikallerin sebep olduğu lipid peroksidasyonuna "nonenzimatik lipid peroksidasyonu" denir. 37

Hücre membranlarında lipid peroksidasyonuna uğrayan başlıca yağ asitleri poliansatüre yağ asitleridir. Lipid peroksidasyonu genellikle yağ asitlerindeki konjuge çift bağlardan bir elektron içeren hidrojen atomlarının çıkarılması ve bunun sonucunda yağ asidi zincirinin bir lipid radikali niteliği kazanmasıyla başlar. 38

Lipid radikali (L ) dayanıksız bir bileşiktir ve bir dizi değişikliğe uğrar. Lipid radikallerinin (L ) moleküler oksijenle (O 2 ) etkileşmesi sonucu lipid peroksit radikalleri (LOO ) oluşur. Lipid peroksit radikalleri (LOO ), membran yapısındaki diğer poliansatüre yağ asitlerini etkileyerek yeni lipid radikallerinin oluşumuna yol açarken kendileri de açığa çıkan hidrojen atomlarını alarak lipid peroksitlerine (LOOH) dönüşürler ve böylece olay kendi kendini katalizleyerek devam eder. 39

Serbest radikallerin proteinlere etkileri Proteinler serbest radikallere karşı poliansatüre yağ asitlerinden daha az hassastırlar. Proteinlerin serbest radikal harabiyetinden etkilenme derecesi amino asit kompozisyonlarına bağlıdır. Doymamış bağ ve kükürt içeren triptofan, tirozin, fenilalanin, histidin, metiyonin, sistein gibi amino asitlere sahip proteinler serbest radikallerden kolaylıkla etkilenirler. Bu etki sonucunda özellikle sülfür radikalleri ve karbon merkezli organik radikaller oluşur. 41

Serbest radikallerin etkileri sonunda, yapılarında fazla sayıda disülfit bağı bulunan immünoglobülin G (IgG) ve albümin gibi proteinlerin tersiyer yapıları bozulur, normal fonksiyonlarını yerine getiremezler. Prolin ve lizin reaktif oksijen türleri (ROS) üreten reaksiyonlara maruz kaldıklarında nonenzimatik hidroksilasyona uğrayabilirler. Hemoglobin gibi hem proteinleri de serbest radikallerden önemli oranda zarar görürler. Özellikle oksihemoglobinin süperoksit radikali (O 2 ) veya hidrojen peroksitle (H 2 O 2 ) reaksiyonu methemoglobin oluşumuna neden olur. 42

Serbest radikallerin nükleik asitler ve DNA'ya etkileri İyonize edici radyasyonla oluşan serbest radikaller DNA'yı etkileyerek hücrede mutasyona ve ölüme yol açarlar. Hidroksil radikali (OH ) deoksiriboz ve bazlarla kolayca reaksiyona girer ve değişikliklere yol açar. Aktive olmuş nötrofillerden kaynaklanan hidrojen peroksit (H 2 O 2 ) membranlardan kolayca geçerek ve hücre çekirdeğine ulaşarak DNA hasarına, hücre disfonksiyonuna ve hatta hücre ölümüne yol açabilir. 43

ANTİOKSİDAN SİSTEMLER Serbest radikallerin neden olduğu oksidasyonları önleyen, serbest radikalleri yakalama ve stabilize etme yeteneğine sahip maddelere antioksidan adı verilir Oksijen radikalleri (süperoksit anyon radikali, hidroksil radikali ve peroksi radikaller), hidrojen peroksit ve tekil oksijen gibi reaktif non-radikal oksijen türler, karbon, nitrojen ve sülfür radikalleri gibi çeşitli reaktif moleküllerin hücresel ve çevresel oluşumu oksidatif strese yol açmaktadır. 44

Serbest oksijen radikallerinin meydana getirdigi etkilerin giderilmesi için vücut savunma sistemi gelistirmistir. Antioksidan savunma sistemi adı verilen savunma sistemi, fizyolojik veya çevresel olarak meydana getirilen serbest oksijen radikallerini ortadan kaldırmaktadır. 45

Antioksidan savunma sistemi, süperoksit dismütaz (SOD), katalaz (CAT), glutatyon peroksidaz (GPx) ve glutatyon redüktaz (GR) gibi antioksidan enzimleri ve glutatyon, vitaminler (A,C,E), melatonin ve bazı eser elementleri kapsayan enzim olmayan antioksidanları içermektedir. 46

Enzimatik Savunma Sistemleri ve Özellikleri Süperoksit Dismütaz (SOD) SOD, süperoksit anyon radikali (O 2 ) nin, daha az reaktif olan H 2 O 2 e indirgenmesini katalize eder. 48

Bir radikal üzerine direkt olarak hareket eden tek enzimdir. Hidrojen iyonu kullanır ve oksijen üretir. Toksik ve reaktif olan O 2 ni süpürerek hücreleri korur. Kesin özgüllüğe sahip olan bu enzim kofaktör olarak Cu, Zn, Mn ve Fe i kullanır. İntrasellüler olarak Cu-Zn SOD olarak sitozol ve nükleusta yer alır. Mitokondriyal matriks ve nükleusta ise Mn-SOD olarak yer alır. 49

Katalaz (CAT) H 2 O 2 i suya ve oksijene dönüştürerek süpüren bir diğer enzim katalazdır. Tetramerik yapıda olan katalaz, yapısında dört tane hem grubu bulunan bir hemoproteindir. En yüksek oranda karaciğer ve eritrositlerin peroksizomlarında lokalize olmuştur. 50

Glutatyon Redüktaz (GSH-R) Glutatyon redüktaz, GSH-Px vasıtasıyla hidroperoksitlerin indirgenmesi sonucu oluşan okside glutatyonun (GSSG) tekrar indirgenmiş glutatyona (GSH) dönüşümünü katalize eder. 51

Glutatyon Peroksidaz (GSH-Px) Glutatyon peroksidaz (GSH-Px) sitozolde bulunur, 4 selenyum atomu içerir, tetramerik yapıdadır. Glutatyon peroksidaz, hidroperoksitlerin indirgenmesinden sorumlu enzimdir. 52

Enzimatik Olmayan Savunma Sistemleri ve Özellikleri α-tokofrol (E vitamini), β-karoten (A vitamini), askorbat (C vitamini) gibi vitaminler antioksidan savunma sisteminde yaygın bir sekilde yer alan vitamin grubudur. Vitaminlerin yanı sıra glutatyon ve Cu, Zn, Fe, Mn, Se gibi mineraller de nonenzimatik antioksidan savunma sisteminin bir parçasıdır. 53

Vitamin E (α-tokoferol): E vitamini yağda çözünebilir özellikte olup hücre membranlarını serbest radikal aracılı peroksidatif hasardan koruyan önemli bir antioksidandır. E vitamininin en etkin şekli α- tokoferoldür ve membrana bağlıdır. α- tokoferolün fenolik çekirdeği membran yüzeyinde antioksidan olarak etki ederken, yan zincirindeki metil grupları, membran yağ asitlerinin çifte bağlarınca oluşturulmuş ceplere girerek membranı stabilize etmektedir 54

Vitamin C (Askorbik asit): Askorbik asit, güçlü indirgeyici aktivitesinden dolayı güçlü bir antioksidandır. Suda çözünür. Süperoksit radikali (O 2 ) ve hidroksil radikali (OH ) ile reaksiyona girerek onları ortamdan temizler ve böylece lipidleri oksidasyona karşı korur. 56

Vitamin A Karotenoidler, renkli meyve ve sebzelerle, bitkilerde bulunan moleküllerin bir sınıfıdır. Insan hayatı için temel degildir. 600 den fazla karotenoid bilinir ve yaklasık 50 si yağda çözünen A vitamininin öncülü (retinol olarak isimlendirilir) olarak çalışır. 57

Besinsel bir antikarsinojen olan β-karoten, peroksi radikallerin süpürülmesinde α- tokoferollerin etkisini arttırır ve kalp hastalığına karsı da koruyucu etki gösterir. Bitkilerde bulunan bu antioksidan bileşikler, klorofil ile ışığın interaksiyonu sonucu oluşan tekil oksijeni süpürür ve ayrıca hidroksil radikalini süpürerek lipit peroksidasyonunu inhibe eder. 58

Glutatyon (GSH) Mitokondri, nukleus ve sitoplazmada bol bulunan ve bu hücre kompartmanlarında çözülebilen büyük bir antioksidandır. GSH, Se- GSH-Px ın H 2 O 2 i ortadan kaldırması ile disülfite (GSSG) okside olur. Diğer enzimler oksidan olan H 2 O 2 den daha çok lipit peroksitleri kullanarak glutatyonu okside edebilirler. Böylece GSH, hem çözülebilir hem de lipit peroksitleri detoksifiye edebilir. 59

GSSG, daha sonra indirgen olarak NADPH ı kullanarak glutatyon redüktaz tarafından indirgenir. Bir çok peroksitin detoksifiye edilmesinde indirgeyici güç kaynagı saglayan NADPH, pentoz fosfat yolu ve diğer sitoplazmik kaynaklarla indirgenir. 60

Ürat Normal plazma konsantrasyonunda ürat, hidroksil, süperoksit, peroksit radikalleri ve singlet oksijeni temizler. Fakat lipid radikalleri üzerine etkisi yoktur. Ayrıca vitamin C oksidasyonunu engelleyici etkisi vardır. Bilirubin Bilirubin süperoksit ve hidroksil radikali toplayıcısıdır. Albümin Albümin LOOH toplayıcısıdır. 61

Seruloplazmin Seruloplazmin olasılıkla SOD'a benzer mekanizmayla etki gösterir. Ferro demiri (Fe 2+ ) ferri demire (Fe 3+ ) yükseltgeyerek Fenton reaksiyonunu ve böylece hidroksil radikali oluşumunu inhibe eder. Transferrin ve Laktoferrin Transferrin ve laktoferrin dolaşımdaki serbest demiri bağlarlar. Ferritin Ferritin dokudaki demiri bağlar. 62

Sistein Sistein süperoksit ve hidroksil radikali toplayıcısıdır. Ebselen Ebselen selenyumlu bir bileşiktir. Glutatyon peroksidaz (GSH-Px) aktivitesini güçlendirir ve lipoksijenaz yolunu inhibe eder. Sitokinler Sitokinler başta katalaz olmak üzere antioksidan enzimleri aktive ederler. Ancak proteolitik enzimleri aktive ettiklerinden dolayı zararlı da olabilirler. 63

Demir şelatörleri Demir şelatörleri hücre içine girerek serbest demiri bağlamak suretiyle onu etkisizleştirirler, böylece Fenton reaksiyonunu ve sonuçta hidroksil radikali oluşumunu inhibe ederler. Bu özelliklerinden dolayı reperfüzyonda kullanılmalarının faydalı olduğu kaydedilmiştir. Desferroksamin Desferroksamin serbest Fe 3+ 'ü bağlar. 64

Mannitol Mannitol hidroksil radikalini toplayıcı etki gösterir. Probukol Probukol kan kolesterolünü düşürmede kullanılır. Lipid peroksidasyonu zincir reaksiyonunu kırıcı etkisi vardır. 65