BETA TALASEMİDE OKSİDATİF STRES

Transkript

1 T.C. ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BİYOKİMYA ANABİLİM DALI BETA TALASEMİDE OKSİDATİF STRES Ş. EFSUN ANTMEN YÜKSEK LİSANS TEZİ DANIŞMANI Prof. Dr. Levent KAYRIN ADANA-2005

2 TEŞEKKÜR Yüksek lisans öğrenimim boyunca bilgi ve deneyimleriyle bana yol gösteren, hoşgörü ve sabırla her konuda beni destekleyen tez danışmanım sayın Prof.Dr. Levent KAYRIN a teşekkürü borç bilirim. Eğitim ve tez çalışmama bilgi birikimleri ve görüşleriyle katkıda bulunan Biyokimya Anabilim Dalı öğretim üyelerine, asistanlarına, arkadaşlarıma ve bölüm çalışanlarına teşekkür ederim. Deneysel çalışmalarım boyunca bilimsel ve sosyal desteğini esirgemeyen Doç. Dr. Bülent ANTMEN e ve Pediatrik Hematoloji Bilim Dalı çalışanlarına sonsuz teşekkürler. Tez çalışmamı TF2003YL5 nolu proje olarak destekleyen Ç.Ü Rektörlüğüne ve Araştırma Projeleri Birimi ne teşekkür ederim. Yüksek lisans eğitimim boyunca sabır ve desteğini esirgemeyen aileme ve eşime şükranlarımı sunarım. Biyolog Efsun ANTMEN Adana/2005 iii

3 İÇİNDEKİLER KABUL VE ONAY ii TEŞEKKÜR iii İÇİNDEKİLER iv ŞEKİLLER DİZİNİ vi ÇİZELGELER DİZİNİ vii SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ viii ÖZET ix ABSTRACT x 1. GİRİŞ 1 2. GENEL BİLGİLER OKSİDATİF STRES SERBEST RADİKALLER REAKTİF OKSİJEN TÜRLERİ SÜPEROKSİT RADİKALİ(O 2 ) HİDROJEN PEROKSİT (H 2 O 2 ) HİDROKSİL RADİKALİ ( OH) SİNGLET OKSİJEN ( 1 O 2 ) NİTRİK OKSİT (NO ) SERBEST RADİKALLERİN ETKİLERİ DNA VE NÜKLEİK ASİTLERE ETKİLERİ PROTEİNLERE ETKİLERİ KARBOHİDRATLARA ETKİLERİ LİPİTLERE ETKİLERİ ANTİOKSİDAN SİSTEM REDÜKTE GLUTATYON (GSH) GLUTATYON PEROKSİDAZ ENZİMİ (GSH-PX) GLUTATYON REDÜKTAZ ENZİMİ (GSH-RD) GLUTATYON S TRANSFERAZ ENZİMİ (GST) SÜPEROKSİT DİSMUTAZ ENZİMİ (SOD) KATALAZ ENZİMİ (CAT) TİYOREDOKSİN SİSTEM UBİKİNON (KOENZİM Q-Q10) ASKORBİK ASİT (C VİTAMİNİ) KAROTENLER (A VİTAMİNİ) TOKOFEROLLER (E VİTAMİNİ) FLAVONOİDLER SELENYUM TRANSFERRİN VE LAKTOFERRİN ÜRİK ASİT BİLİRUBİN HAPTOGLOBİN (HP) SERULOPLAZMİN (CP) HEMOGLOBİN YAPISI VE SENTEZİ 23 iv

4 HEM YAPISI GLOBİN YAPISI TALASEMİ SENDROMLARI ALFA TALASEMİ BETA TALASEMİ TALASEMİ VE OKSİDATİF STRES TALASEMİ DAĞILIMI TALASEMİDE TEDAVİ GEREÇLER VE YÖNTEMLER GEREÇLER CİHAZLAR KİMYASAL MADDELER ÖRNEK TOPLAMA ANALİZ YÖNTEMLERİ HEMATOLOJİK ANALİZLER HEMOLİZAT HAZIRLANMASI GLUTATYON PEROKSİDAZ (GSH-PX) 34 ÖLÇÜM YÖNTEMİ GLUTATYON REDÜKTAZ (GSH-RD) 36 ÖLÇÜM YÖNTEMİ KATALAZ (CAT) ÖLÇÜM YÖNTEMİ GLUTATYON S TRANSFERAZ ( GST ) 39 ÖLÇÜM YÖNTEMİ SÜPEROKSİT DİSMUTAZ (SOD ) 41 ÖLÇÜM YÖNTEMİ MALONDİALDEHİD (MDA) ÖLÇÜM YÖNTEMİ HEMOGLOBİN TAYİNİ BULGULAR TARTIŞMA SONUÇLAR KAYNAKLAR ÖZGEÇMİŞ 82 v

5 ŞEKİLLER DİZİNİ Şekil 2.1. : Oksijen molekülünün orbital yapısı 4 Şekil 2.2. : Vücuttaki major serbest radikaller ve serbest radikal 6 hasarı sonuçları Şekil 2.3. : Radikallerin yol açtığı hücre hasarı 13 Şekil 2.4. : İnsan dokularındaki major antioksidan enzimler ve bağlı yollar 15 Şekil 2.5. : Redükte Glutatyon (GSH) 16 Şekil 2.6. : Glutatyon redoks döngüsü 18 Şekil 2.7. : Hemoglobin A yapısı 23 Şekil 2.8. : Hem molekülü yapısı 24 Şekil 2.9. : Globin sentezi 25 Şekil : Globin gen kümeleri 26 Şekil : Periferik yaymada talasemik eritrositlerin hipokromileri 28 ve mikrositerliği Şekil : Talasemi,orak hücre anemisi ve diğer yaygın hemoglobin 30 hastalıklarının dünya üzerindeki yayılımı Şekil 4.1. : Kontrol grubu ve hasta grubu SOD değerlerinin karşılaştırılması 62 Şekil 4.2. : Kontrol grubu ve hasta grubu CAT değerlerinin karşılaştırılması 63 Şekil 4.3. : Kontrol grubu ve hasta grubu GST değerlerinin karşılaştırılması 63 Şekil 4.4. : Kontrol grubu ve hasta grubu GSH-Px değerlerinin 64 karşılaştırılması Şekil 4.5. : Kontrol grubu ve hasta grubu GSH-Rd değerlerinin 64 karşılaştırılması Şekil 4.6. : Kontrol grubu ve hasta grubu MDA değerlerinin karşılaştırılması 65 Şekil 4.7. : Kontrol grubu ve hasta grubu Wbc verilerinin karşılaştırılması 65 Şekil 4.8. : Kontrol grubu ve hasta grubu Rbc verilerinin karşılaştırılması 66 Şekil 4.9. : Kontrol grubu ve hasta grubu Hb verilerinin karşılaştırılması 66 Şekil : Kontrol grubu ve hasta grubu Hct verilerinin karşılaştırılması 67 Şekil : Kontrol grubu ve hasta grubu MCV verilerinin karşılaştırılması 67 Şekil : Kontrol grubu ve hasta grubu MCH verilerinin karşılaştırılması 68 Şekil : Kontrol grubu ve hasta grubu MCHC verilerinin karşılaştırılması 68 vi

6 ÇİZELGELER DİZİNİ Çizelge 2.1. : Radikal ve radikal olmayan oksijen türleri 1 Çizelge 2.2. : Oksidatif stres ile ilişkili bazı hastalıklar 5 Çizelge 2.3. : Oksijenin indirgenmesi 7 Çizelge 2.4. : Hidrofilik ve lipofilik fazda bazı antioksidanlar 14 Çizelge 2.5. : İnsan hemoglobinlerindeki globin zincirleri 24 Çizelge 2.6. : Beta talasemide eritrosit indeksi değişimi 28 Çizelge 2.7. : Beta talasemide hemoglobin düzeyleri 28 Çizelge 4.1. : Kontrol grubu hematolojik verileri 51 Çizelge 4.2. : Hasta grubu hematolojik verileri 52 Çizelge 4.3. : Kontrol grubu hematolojik verilerinin istatistiksel sonuçları 53 Çizelge 4.4. : Hasta grubu hematolojik verilerinin istatistiksel sonuçları 53 Çizelge 4.5. : Kontrol grubunda bulunan erkek çocukların 54 hematolojik verileri Çizelge 4.6. : Kontrol grubunda bulunan erkek çocukların 54 hematolojik verilerinin istatistiksel sonuçları Çizelge 4.7. : Kontrol grubunda bulunan kız çocukların hematolojik verileri 55 Çizelge 4.8. : Kontrol grubunda bulunan kız çocukların 55 hematolojik verilerinin istatistiksel sonuçları Çizelge 4.9. : Hasta grubunda bulunan erkek çocukların hematolojik verileri 56 Çizelge : Hasta grubunda bulunan erkek çocukların 56 hematolojik verilerinin istatistiksel sonuçları Çizelge 4.11 : Hasta grubunda bulunan kız çocukların hematolojik verileri 57 Çizelge : Hasta grubunda bulunan kız çocukların 57 hematolojik verilerinin istatistiksel sonuçları Çizelge : Eritrositlerde antioksidan sistemde bulunan 58 enzim düzeylerinin ve MDA ölçümünde kullanılan yöntemlerin tekrarlanabilirliği Çizelge : Kontrol grubunda eritrositlerde ölçülen antioksidan 59 enzimler ve MDA düzeyleri Çizelge : Hasta grubunda eritrositlerde ölçülen antioksidan 60 enzimler ve MDA düzeyleri Çizelge : Kontrol grubunda eritrositlerde ölçülen antioksidan 61 enzimler ve MDA düzeylerinin istatistiksel verileri Çizelge : Hasta grubunda eritrositlerde ölçülen antioksidan 61 enzimler ve MDA düzeylerinin istatistiksel verileri Çizelge : Kontrol ve hasta grubunun hematolojik verilerinin 61 ortalama, standart sapma değerleri ve iki grup arasındaki ilişki Çizelge : Kontrol ve hasta grubunun antioksidan enzimleri ve MDA 62 değerlerinin ortalama, standart sapma değerleri ve iki grup arasındaki ilişki vii

7 SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ α β δ ε ζ γ ATP CAT cgs cgcs Cp DNA EDTA FAD GS GSH GSH-Rd GPx e GSH-Px GSSG G6PD GST Hb Hct Hp IgG MCV MCH MCHC MDA MRP NADPH PUFA RBC RES RNS ROS SOD MnSOD ECSOD CuZnSOD Trx TrxR Alfa Beta Delta Epsilon Zeta Gamma Adenozintrifosfat Katalaz Gama Glutamil Transpeptidaz Gama Glutamil Sisteinil Sentetaz Seruloplazmin Deoksiribonükleik asit Etilen diamin tetraasetik asit Flavin adenin dinükleotid Glutatyon sentaz Redükte glutatyon Glutatyon redüktaz Ekstrasellüler glutatyon peroksidaz Glutatyon peroksidaz Okside glutatyon Glukoz-6-fosfat dehidrogenaz Glutatyon S transferaz Hemoglobin Hematokrit Haptoglobin İmmunglobin G Ortalama eritrosit hacmi Ortalama eritrosit hemoglobini Ortalama eritrosit hemoglobin konsantrasyonu Malondialdehit Multidrug resistans protein Redükte nikotinamid adenin dinukleotid fosfat Çoklu doymamış yağ asitleri Eritrosit Retiküloendotelyal sistem Reaktif nitrojen türleri Reaktif oksijen türleri Süperoksit dismutaz Manganez süperoksit dismutaz Ekstrasellüler süperoksit dismutaz Bakır-çinko süperoksit dismutaz Tiyoredoksin Tiyoredoksin redüktazı viii

8 ÖZET β-talasemide Oksidatif Stres Hücreler metabolik sürecin bir parçası olarak devamlı serbest radikal ve reaktif oksijen türlerini oluştururlar. Bu serbest radikaller ve reaktif oksijen türleri kompleks bir antioksidan sistem tarafından nötralize edilirler. Oksidatif stres, reaktif oksijen türleri veya serbest radikaller ile antioksidan sistem arasında oluşan dengesizliktir ve bu dengesizlik önemli hücre kompartımanlarında geri dönüşümsüz hasara neden olabilir. Talaseminin tüm patofizyolojik özellikleri, globin zincir sentezindeki dengesizlikle ilişkilidir. Globin zincirlerinin yapımındaki şiddetli dengesizlikler farklı talasemi fenotiplerinin ortaya çıkmasına yol açar. Eğer alfa zincir yapımında bozukluk varsa alfa talasemi, beta zincir yapımında bozukluk varsa beta talasemi olarak isimlendirilir. Beta talasemide beta globin zincir yapımındaki dengesizlik nedeniyle artan alfa globin zincirleri, eritrositlerin zar yapılarını bozarak ve eritrosit öncül hücrelerinin erken yıkımını tetikleyerek eritrositlere zarar verirler. Eşleşmemiş, kararsız globin zincirleri oksidatif strese neden olan zincir reaksiyonları başlatan süperoksit ve hidroksil radikallerini oluştururlar. Ülkemizde talasemi yaygınlığı %2 dir. Bu çalışmada beta talasemi hastalarında antioksidan durum ve oksidatif hasarın incelenmesi amaçlanmış olup yaşları 16 nın altında olan beta talasemi hastası çocuklar (n=35) ve sağlıklı kontrol grubu (n=40) örnekleri kullanılmıştır. Tüm örneklerin hematolojik verileri incelendikten sonra eritrosit süperoksit dismutaz (SOD), katalaz (CAT), glutatyon peroksidaz (GSH-Px), glutayon redüktaz (GSH-Rd), glutatyon s transferaz (GST) enzim ölçümleri antioksidan durumun, plazma malondialdehit (MDA) analizi ise lipit peroksidasyonunu gözlemek için yapılmıştır. GSH-Px, GSH-Rd, CAT ölçümü Beutler yöntemiyle, MDA ölçümü tiyobarbitürik asit yöntemiyle ve GST ölçümü ise glutatyonun 1 kloro 2,4 dinitro benzen ile konjugat oluşturma yöntemiyle yapılmıştır. Kontrol grubu ile hasta grubu karşılaştırıldığında hematolojik verilerde anlamlı farklar gözlenmiş ancak antioksidan sistem ve MDA düzeyinde anlamlı fark gözlenmemiştir. Sonuçta oksidatif stres araştırması için talasemi majorlü olgularda yapılan çalışmaların transfüzyon almamış olgularda yapılmasının daha sağlıklı olabileceği düşünülmüştür. Anahtar sözcükler: Antioksidan, lipit peroksidasyonu, oksidatif stres, serbest radikaller, talasemi, ix

9 ABSTRACT Oxidative Stress in β-thalassemia Cells continuously produce free radicals and reactive oxygen species as a part of metabolic process. These free radicals are neutralized by a complex antioxidant system. Oxidative stres is an imbalance between reactive oxygen species or free radicals and antioxidant system and can cause irreversible damage at important cell compartments. All pathophysiological properties of thalassemia are related to imbalance of globin chains. Several imbalance of producing globin chains can cause constitute different thalassemia fenotypes. If the production of alpha chains is impaired, is called alpha thalassemia and if the production of beta chains is impaired is called beta thalassemia. Because of the imbalance with production of beta globin chains excess free alpha globin chains are deleterious to the red cells, damaging the membran structures and triggering premature destruction of the red cell precursors. Unpaired, instabile globin chains generate the superoxide and hydroxyl radicals that start the chain reactions which can cause oxidative stres. Prevalance of Turkey for thalassemia is %2. In this study we aimed to indicate antioxidant status and oxidative damage in beta thalassemia patients. For this purpose the children with beta thalassemia (n=35) and healthy controls (n=40), who ages under sixteen, were used. Erythrocyte superoxide dismutase(sod), catalase(cat), glutathione peroxidase(gsh-px), glutathione redüktase(gsh-rd), glutathione s transferase(gst) were measured to show antioxidant status and plasma malondialdehyde(mda) analyzed to show lipid peroxidation. GSH-Px, GSH-Rd, CAT enzyme activity were assayed according to beutler, MDA were assayed thiobarbituric acid and GST were assayed according to glutathione conjugate with 1 choloro 2,4 dinitrobenzen methods. Control and patient groups when compared, there are significant interaction with hematological results but there are no significant interaction with antioxidant system and MDA level. In this result studying for oxidative stres is reliable in untransfused thalassemia major patients transfused patients. Key words: Antioxidant, free radicals, lipid peroxidation, oxidative stress, thalassemia. x

10 1.GİRİŞ Patolojik bir olayı takiben organizmada meydana gelen fizyopatolojik değişiklikler temelde belirli mekanizmaların harekete geçmesi ile oluşmaktadır. Serbest radikaller, reaktif oksijen türleri veya oksijen metabolitleri olarak da adlandırılabilen bir kısım maddelerin ortaya çıkması ile hücre ölümü, doku hasarı ve nekroz sonucunda, organ veya sistemlerde işlev yetersizliği meydana gelmektedir 1. Serbest radikaller, dış yörüngesinde eşleşmemiş en az bir elektron içeren moleküllerdir. Özellikleri, dengesiz ve tek olan elektronu çiftlemek için diğer moleküller ile tepkimeye girmeye yatkın olmalarıdır. Anyonik, katyonik veya nötral konumda olabilirler 2. Serbest radikaller etkilerini protein, lipit, karbohidrat ve DNA oksidasyonu yaparak; hücre zarında, hücre organellerinde ve DNA larda patolojik değişiklikler oluştururarak gösterirler. Bunların sonucunda işlev bozukluğu veya hücre ölümü olmakta ya da mutant özellikler kazandırarak tümör oluşturabilmektedirler 1. Organizmada essansiyel maddelerin oksidasyonuna neden olabilecek moleküllerin etkilerini önleyen veya geciktirebilen maddelere ise antioksidan denilmektedir. Oksidanlar ve antioksidanlar arasındaki dengesizlik aşırı derecede reaktif oksijen türlerinin yapılmasına ve oksidatif hasara neden olur. Bu durum oksidatif stres olarak belirtilir 3,4. Talasemide genetik bozukluk hemoglobin zincir veya zincirlerinin düşük miktarlarda veya hiç sentezlenememesidir. Bozukluk aynı hastada α, β, γ, δ globin zincirlerini veya bunların bazı kombinasyonlarını da etkileyebilir. Globin zincirlerinin yapımındaki dengesizlik ve çok fazla eşleşmemiş globin zincir içeriği eritrositlerin kemik iliğinde ve dolaşımda yıkımına neden olmaktadır. Beta talasemide, beta globin zincir sentezi yeterli miktarda yapılamaz iken serbest α zincirlerinin yıkım ürünleri ise eritrosit zarlarında hasara neden olur. Aşırı demir, serbest oksijen radikalleri, eritrosit zarındaki lipit ve protein gibi bileşenlere ve hücre içi organellere hasar verir, rijid, dehidrate eritrosit oluşumu, rijit inklüzyonların varlığı, eritrositlerin dalaktan geçiş sırasında da yıkılmasına neden olur 5. 1

11 Oksijen taşınımından sorumlu hemoglobin hücrelerin gereksindiği yaklaşık bütün oksijeni akciğerden dokulara taşımanın yanı sıra, hücresel solunumun iki son ürünü olan H + ve CO 2 yi de dokulardan akciğerlere ve böbreklere taşır. Ayrıca bir hemoglobin alt birimine O 2 bağlanması hemoglobin üç boyutlu yapısında değişikliğe neden olur ve bu durumdan en çok alfa ve beta globin zincirleri etkilenir, dolayısıyla globin zincir bozukluğunda hemoglobinin O 2 bağlaması etkilenecektir. Sonuçta eritrositler sürekli olarak oksitleyici ajanlara maruz kaldıklarından oksidatif hasardan korunmak için enzimatik ve nonenzimatik antioksidan sistemler geliştirmişlerdir 6. Bu çalışmamızda eritrositlerde bulunan antioksidan sistem ve oksidatif stres durumunu araştırmak amacıyla beta talasemi majorlü hasta grubu ve kontrol grubu olarak talasemi tanısı konmamış çocukluk yaş grubu bireyler seçilmiş, her iki grupta da aynı parametrelerin çalışılması planlanmıştır. Talasemik eritrositlerde antioksidan sistem ve oksidatif stresi araştırmak amacıyla yapılan bu çalışmada lipit peroksidasyonu ürünü olan MDA, peroksitleri suya metabolize eden katalaz ve glutatyon peroksidaz, okside glutatyonu redükte glutatyona dönüştürerek glutatyonun hücre içi döngüsünü sağlayan glutatyon redüktaz ve elektrofilik bileşiklerin glutatyon ile konjugasyonunu sağlayan glutatyon s transferaz enzim aktivitelerinin ölçülmesini amaçladık. 2

12 2.GENEL BİLGİ 2.1. Oksidatif Stres Vücuttaki fizyolojik aktivitenin doğal ürünü olan serbest radikalleri, organizma doğuştan kazandığı çok hassas bir donanımla oksidan-antioksidan denge olarak tanımlanabilecek bir çizgide tutmaya çalışır. Bu dengenin bozulması oksidatif strese yol açar 7. Reaktif oksijen türleri (ROS), reaktif nitrojen türleri (RNS) ve sülfür merkezli radikaller oksidan sınıfına girer. Ancak tüm reaktif türleri radikal değildirler. Radikal olan ve olmayan reaktif türleri Çizelge 2.1 de özetlenmiştir 8,9. Çizelge 2.1. Radikal ve radikal olmayan reaktif oksijen türleri 3 Reaktif Türleri Radikal Non-Radikal Hidroksil ( OH) Peroksinitrit (ONOO - ) Alkoksil (L(R)O ) Hipoklorit ( - OCl) Hidroperoksil (HOO ) Hidroperoksit (L(R)OOH) Peroksil (L(R)OO ) Singlet oksijen ( 1 O 2 ) Nitrik oksit (NO ) Hidrojen peroksit (H 2 O 2 ) Süperoksit (O 2) Ozon (O 3 ) Canlı organizma için önemli olan yapıları, fiziksel ve kimyasal özellikleri, hücresel kaynakları, rol oynadıkları tepkimeler ve etkileri ile çeşitli klinik durumların patogenezinde rol oynayan serbest radikaller, atomik yörüngelerinde eşleşmemiş elektron bulundurarak, bağımsız olarak varolabilen moleküllerdir. Eşleşmemiş elektronun kazandırdığı en önemli özellik birçok radikal ile bu elektronun paylaşılabilinmesidir 10,11,12. 3

13 Serbest radikallerin en önemli tepkimeleri, moleküler oksijen ve onun reaktif türlerinin olduğu tepkimelerdir. Şekil 2.1 de oksijenin orbital yapısı ve oluşan reaktif türleri belirtilmiştir 13. Şekil.2.1. Oksijen molekülünün orbital yapısı 12 Demir, bakır, mangan, molibten gibi geçiş metalleri de dış yörüngelerinde birer elektron taşımalarına rağmen radikal karakter göstermezler. Serbest radikal kabul edilen atom ve moleküller elektron dağılımlarının yanı sıra termodinamik yapıları ve lokal kinetik reaktiviteleri ile değerlendirilir 14,15. Antioksidan ise; okside olabilen substrata göre ortamda daha az derişimde bulunan ve bu substratın oksidasyonunu belirgin şekilde geciktiren veya engelleyen madde olarak tanımlanabilir. Bu tanıma göre antioksidanların fizyolojik rolü, serbest radikalleri içeren kimyasal tepkimelerin sonucunda hücresel bileşenlere gelebilecek zararı önlemektir 16. Aerobik metabolizmada denge, serbest radikal oluşumu ve bunların benzer hızla antioksidan sistemler tarafından uzaklaştırılmasıyla karakterizedir. Geri dönüşümsüz oksidatif hasarın birikimi ile önce hücre daha sonra doku ve organ sistemlerinde yapısal ve işlevsel bozukluklar ortaya çıkabilir. Oksidatif stres ile ilişkili hastalıkların bazıları çizelge 2.2 de belirtilmiştir 17. 4

14 Çizelge 2.2. Oksidatif stres ile ilişkili bazı hastalıklar 17 Astım Ateroskleroz Serebral vaskuler hastalıklar Kronik obstruktif pulmoner hastalık Konjestif kalp yetmezliği Diabet Hipertansiyon Grip Miyokard enfaktüs Pnömoni Hepatit Kanser İnflamasyon hastalıklar 2.2. Serbest Radikaller Serbest radikaller hücrede metabolik dengenin bir parçası olarak devamlı yapılırlar 18. Serbest radikaller 3 yolla meydana gelirler 19, Kovalent bağlı normal bir molekülün, her bir parçasında ortak elektronlardan birisinin kalarak homolitik bölünmesi. X : Y X + Y 2. Normal bir molekülden tek bir elektronun kaybı veya bir molekülün heterolitik bölünmesi. Heterolitik bölünmede kovalent bağı oluşturan her iki elektron atomların birinde kalır. Böylece serbest radikaller değil, iyonlar meydana gelir. X:Y X: + Y + 3. Normal bir moleküle tek bir elektronun eklenmesi A + e - A - 5

15 Organizmada oksidatif strese neden olan radikal yapımı endojen ve çevresel faktörleri içeren çeşitli mekanizmalarla gerçekleşir (Şekil 2.2) 16. Endojen faktörler mitokondriyal sızıntı, solunumsal patlama, enzim reaksiyonları, otooksidasyon tepkimeleridir. Çevresel faktörlerin başlıcaları ise sigara dumanı, hava kirliliği, ultraviyole ışınları, iyonize radyasyon ve ksenobiotiklerdir 16. Örneğin bir nefes sigara dumanında yaklaşık serbest radikal bulunmaktadır, aşırı egzersiz ile mitokondri oksijeninin yaklaşık %2-5 i serbest radikal yapımında kullanılır 18,21. Çevresel Faktörler Serbest radikal yapımı Endojen Faktörler O 2, H 2 O 2 Geçiş Metalleri Fe +2,Cu + OH Lipit peroksidasyonu DNA Hasarı Protein Hasarı Doku Hasarı Şekil 2.2. Vücuttaki önemli serbest radikaller ve serbest radikal hasarı sonuçları Serbest radikallerin aerobik hücrelerde en önemli tepkimeleri moleküler oksijen ve onun reaktif türleri (süperoksit anyonu ve hidroksil radikali), peroksitler ve geçiş metallerinin olduğu tepkimelerdir 13. 6

16 2.3. Reaktif oksijen türleri Normal şartlarda oksijen kararlı, kokusuz, tatsız, renksiz, sudaki çözünürlüğü sınırlı bir gazdır. İnsan hayatı için hem gerekli hem de toksik olan bir moleküldür. Oksijenin iki eşleşmemiş elektronlarının ayrı orbitallerde aynı yönde dönmesi sonucu oksijen bir radikaldir 22. Moleküler oksijen elektron transferiyle suya kadar indirgenir. Bu yol 4 elektron gerektirir ve bu yolda reaktif ara moleküller oluşur ki bunlar süperoksit, hidrojen peroksit ve hidroksi radikalleridir. Bunlar önemli oksidatif stres ajanları olup reaktif oksijen türleri (ROS) olarak adlandırılır (Çizelge 2.3) 23,24. Çizelge 2.3. Oksijenin indirgenmesi O 2 + e + H + HO 2 Hidroperoksil radikali HO 2 H + + O 2 Süperoksit radikali O 2 + 2H + + e H 2 O 2 Hidrojen peroksit H 2 O 2 + e OH - + OH Hidroksil radikali OH + e + H + H 2 O Süperoksit Radikali (O 2 ) Oksijenli ortamda yaşam, oksidatif fosforilasyon ile ATP üretimi açısından önemli ölçüde yarar sağlarken bazı tehlikeleri de beraberinde getirir. Oksidatif fosforilasyonun ana bileşeni olan oksijene bir elektron eklenmesi ile süperoksit radikali oluşur (Şekil 2.1) 4. Süperoksit radikali serbest radikal olmasına karşın reaktifliği yüksek değildir. Kendiliğinden, özellikle elektronca zengin bir ortam olan iç mitokondri zarında solunum zinciriyle birlikte oluşur. Süperoksit ayrıca iskemi-reperfüsyonda aktive olan ksantin oksidaz gibi flavoenzimlerce endojen olarak da oluşturulur. Lipooksijenaz ve siklooksijenaz ise diğer süperoksit oluşturan enzimlerdir 25,26,27. Süperoksit ayrıca yüksek enerjili elektromanyetik dalgalar gibi fiziksel ve kimyasal ajanlar ile, bazı bileşiklerin otooksidasyonunda ve fagositozda oluşur 28. 7

17 Süperoksit kimyası çözelti ortamına bağlı olarak farklılıklar gösterir. Süperoksit sulu çözeltide askorbik asit, tiyol gibi molekülleri oksitleyebilen zayıf bir oksitleyici ajandır. Bunun yanında süperoksit güçlü bir indirgeyici ajan olup sitokrom c ve ferrik-edta gibi çeşitli demir komplekslerini indirgeyebilir 29. Süperoksit, hidrojen peroksit ve moleküler oksijenin oluştuğu dismutasyon tepkimesinden dolayı sulu ortamda hızlıca kaybolur. Diğer taraftan SOD enzimiyle katalizlenen dismutasyon tepkimesi ise spontan dismutasyondan 10 9 kat daha hızlıdır 30. 2O 2 + 2H + H 2 O 2 + O Hidrojen Peroksit (H 2 O 2 ) Hidrojen peroksit serbest radikal olmamasına karşın biyolojik zarlara nüfuz edebilmesi ve daha reaktif oksijen türlerinin yapım aşamasında aldığı rolden dolayı önemlidir. Diğer bir önemli işlevi ise hücre içi sinyal molekülü olarak görev yapmasıdır 24. Hidrojen peroksit süperoksit radikalinin dismutasyon tepkimesi sonucu oluşur. Ürat oksidaz, glukoz oksidaz, d-aminoasit oksidaz gibi birçok enzim oksijene iki elektron transfer ederek direk hidrojen peroksit oluşturabilirler 19. Hidrojen peroksitin redoks özelliği ve geçiş metalleri varlığında yüksek reaktif serbest radikalleri oluşturmasına karşı vücut, savunma sistemi geliştirmiştir. İstenmeyen hidrojen peroksit katalaz, glutatyon peroksidaz ve diğer oksidazlar ile hücreden uzaklaştırılır Hidroksil radikali ( OH) Hidroksil radikalinin major oluşumu suyun yüksek enerji ile iyonizasyonudur. H 2 O OH + H + e aq - H 2 O 2 8

18 Hidrojen peroksit ise süperoksit ile tepkimeye girerek en reaktif ve zarar verici serbest oksijen radikali olan hidroksil radikali oluşturmak üzere kolaylıkla yıkılabilir. H 2 O 2 + O 2 OH + OH + O 2 Bu tepkimeye Haber-Weiss tepkimesi denir ve tepkime katalizörsüz ortamda oldukça yavaşken, demirin katalizörlüğünde çok hızlıdır. O 2 + Fe +3 O 2 + Fe +2 OH Fe +2 + H 2 O 2 Fe +3 + OH + O 2 + H 2 O 2 OH + OH + O 2 Katalizörlü tepkimede demir önce ferrik formdan (Fe +3 ) süperoksit ile ferröz forma (Fe +2 ) indirgenir. Ferröz form Fenton tepkimesi ile ferrik forma tekrar yükseltgenirken OH ve OH üretilir 22, Singlet Oksijen ( 1 O 2 ) Singlet oksijen eşleşmemiş elektron içermediği için serbest radikal değildir. Bununla birlikte dönme yönlerinin farklılığından dolayı oksijenin yüksek reaktif formudur (Şekil 2.1) 29. Moleküler oksijende paylaşılmamış iki dış elektron aynı yönde, ayrı yörüngelerdedir. Singlet oksijende ise elektron dönme yönleri birbirine zıttır ve oluşturdukları delta veya sigma formuna göre aynı veya ayrı yörüngelerde bulunurlar. Aynı yörüngede ise delta singlet oksijen, ayrı yörüngelerde iseler sigma singlet oksijen formu oluşur. Sigma formu delta formuna göre daha enerjetik olup kolayca delta formuna dönüşebilir 12, Nitrik Oksit (NO ) NO enzimatik olarak nitrik oksit sentaz enzimi tarafından L-arjinin den sentezlenir. 9

19 L-arjinin + NADPH + O 2 L-sitrullin + NO + NADP + NO eşleşmemiş elektron bulundurmasına rağmen birçok biyomolekül ile kolayca tepkimeye giremez, öte yandan peroksil, alkil gibi diğer serbest radikallerle kolayca tepkimeye girerek daha az reaktif moleküller oluşturur 24. Yüksek miktarlarda O 2 yapımı NO ile paraleldir ve birbirlerini etkileyerek OH ve NO 2 oluşumuna neden olurlar. Tepkime sırasında ise peroksinitrit (ONOO - ) ve peroksinitröz asit (ONOOH) ara ürünleri oluşur 24. NO + O 2 ONOO - ONOO - + H + ONOOH ONOOH OH + NO Serbest Radikalerin Etkileri DNA ve Nükleik Asitlere Etkileri İyonize edici radyasyona maruz kalınması ile oluşan serbest radikaller DNA yı etkileyerek hücrede mutasyona neden olurlar. Sitotoksik etki, büyük oranda nükleik asit baz modifikasyonlarından kaynaklanan kromozom değişikliklerine veya DNA daki diğer değişikliklere bağlıdır. Hidroksil radikali deoksiriboz ve bazlarla kolayca reaksiyona girer. Hidrojen peroksit zarlardan kolayca geçip hücre çekirdeğine ulaşarak DNA hasarına, hücrede fonksiyon bozukluğuna ve hatta hücre ölümüne neden olabilir 32, Proteinlere Etkileri Proteinler, radikallerin etkilerine lipitlere oranla daha az hassastır ve amino asit dizilişlerine bağlı olarak etkilenirler. Özellikle doymamış bağ ve sülfür içeren moleküllerin serbest radikallerle etkileşimi yüksektir. Bu nedenle triptofan, tirozin, fenil alanin, histidin, metionin ve sistein gibi amino asitleri içeren proteinler serbest radikallerden daha kolay etkilenirler. İmmungulobin G ve albumin gibi disülfit bağı fazla olan proteinlerin ise üç boyutlu yapıları bozulur 22,29,32. 10

20 Karbohidratlara Etkileri Monosokkaritlerin otooksidasyonu sonucu hidrojen peroksit, peroksit ve okzoaldehitler meydana gelir. Açığa çıkan okzoaldehitler proteinlere bağlanabilme özelliklerinden dolayı antimitotik etki göstererek etki eder ve böylece kanser ve yaşlanmaya neden olabilirler 32. Serbest oksijen radikalleri bağ dokunun önemli bir bileşeni olan hiyalüronik asit gibi karbohidratların parçalanmalarına da yol açabilirler Lipitlere Etkileri Serbest radikallerin biyolojik dokulardaki doymamış yağ asitlerine etkileri lipit peroksidasyonu olarak bilinir. Biyolojik zarların yapısı lipit ve proteinden oluşmaktadır, lipit peroksidasyonu lipitlere olduğu kadar zar proteinlerine de zarar verir 12. Lipit peroksidasyonu, çoklu doymamış yağ asitlerinin(pufa) reaktif oksijen türleri tarafından peroksitler, alkoller, malondialdehit, etan ve pentan gibi ürünlere yıkılma tepkimelerine denilmektedir. Yağ asitlerinin peroksidasyonu sonrasında açığa çıkan ürünler zar geçirgenliğini ve akışkanlığını ciddi şekilde etkileyip hücre ve organel içeriklerinin ayrılmasına neden olan kopma ve kırılmalara yol açar. Lipit peroksidasyonu ile meydana gelen zar hasarı geri dönüşümsüzdür 4,29. Zincir reaksiyonu şeklinde olan lipit peroksidasyonu, organizmada oluşan radikal etkisiyle çoklu doymamış yağ asitleri üzerindeki metilen grubundan bir hidrojen atomu uzaklaştırılması ile başlar. Bu reaksiyon başlangıç reaksiyonu olarak isimlendirilir. Hidrojen atomu uzaklaşması ile karbon atomu üzerinde eşleşmemiş elektron kalır ve bunun sonucu yağ asidi zinciri bir lipit radikali(l ) niteliği kazanır. LH + R L +RH Oluşan lipit radikalinin molekül içi çift bağlarının pozisyonunun değişmesiyle konjuge dienler oluşur. Bir alkenin iki çift bağı arasında bir tane tekli bağ varsa bu yapı konjuge dien olarak isimlendirilir. Bu şekilde moleküler düzenleme sağlanmış olur. Lipit radikalinin moleküler oksijen ile etkileşmesi sonucu lipit peroksil radikali(loo ) oluşur. 11

21 L + O 2 LOO Peroksil radikali diğer komşu yağ asitlerini etkileyerek yeni lipit radikallerinin oluşmasına neden olurken kendisi de açığa çıkan hidrojen atomunu alarak lipit hidroperoksitlerine (LOOH) dönüşür. Böylece peroksidasyon başladıktan sonra kendi kendine yayılabilmekte ve çok sayıda yağ asidi zinciri lipit hidroperoksitlerine dönüşebilmektedir. Bu tepkime ilerleme reaksiyonu olarak isimlendirilir 4,29,33,34,35. LH + LOO L + LOOH Oldukça kararlı olan lipit hidroperoksitleri lipit peroksidasyonunun ilk ürünüdür. Lipit peroksidasyonunun sürekli olarak devam ettiği durumlarda E vitamini gibi zincirleme tepkimeyi sonlandırıcı bir antioksidan ile lipit peroksidasyonu sonlanabilir 36. L + E Vit LH + E Vit E Vit + L LH + Okside E Vitamini Geçiş metalleri varlığında lipit hidroperoksitleri bu metallerin redoks döngüsüyle birlikte lipit peroksidasyonunu başlatabilecek radikallerin oluşumuna neden olabilirler. Lipitlerden araşidonik asit metabolizması sonucu serbest radikal üretimine enzimatik lipit peroksidasyonu, diğer radikallerin sebep olduğu lipit peroksidasyonuna ise non-enzimatik lipit peroksidasyonu denir 22. Lipit proksidasyonunun son bileşeni olan malondialdehit (MDA) peroksidasyona uğramış çoklu doymamış yağ asitlerinin bölünmesiyle oluşan üç karbonlu bir dialdehidtir ve oksidatif durumun göstergesi olarak yaygın kullanılır. Bu dialdehid biyolojik ortamda makromoleküllerin NH 2 ve/veya SH gruplarına bağlı veya serbest olarak bulunur. Oluşan MDA; deformasyon, iyon transportu, enzim aktivitesi ve hücre yüzey bileşenlerinin agregasyonu gibi zar özelliklerinin değişmesine yol açar 4,37. 12

22 2.5. Antioksidan Sistem Organizma içindeki radikaller, geri dönüşümsüz hücre hasarına yol açan birçok tepkimeye neden olurlar (Şekil 2.3). Süperoksit ve hidroksil radikalleri hücresel, mitokondrial, nükleer ve endoplazmik zarlarda lipit peroksidasyonunu başlatırlar. Geçirgenlikteki artış mitokondrial hasara neden olan Ca +2 un hücreye akın etmesine neden olur 9. Şekil 2.3. Radikallerin yol açtığı hücre hasarı. Hücre ve organ sistemlerini reaktif oksijen türlerine karşı koruyabilmek için organizma karmaşık bir sistem geliştirmiştir. Bu sistem endojen ve eksojen orjinli, etkileşimli ve birlikte çalışan çeşitli bileşenler içerir 38. Antioksidan sistem hasar öncesi radikal oluşumunu önler, oksidatif hasarı onarır, hasara uğramış molekülleri temizler ve mutasyonları önler. Nötralize olması gereken çeşitli reaktif ara ürünleri ve indirgenmesi gereken okside biyomolekülleri etkileyen hem lipofilik hem hidrofilik fazda pek çok antioksidan çizelge 2.4 de özetlenmiştir

23 Çizelge 2.4. Hidrofilik ve lipofilik fazda bazı antioksidanlar Antioksidan Faz Etki Süperoksit Dismutaz(SOD) Hidrofilik O 2 nin H 2 O 2 ve O 2 e dismutasyonu Katalaz(CAT) Hidrofilik H 2 O 2 nin H 2 O ve O 2 e dismutasyonu Glutatyon peroksidaz(gsh-px) Hidrofilik veya R-OOH nin R-OH indirgenmesi Lipofilik Glutatyon redüktaz (GSH-Rd) Hidrofilik Okside glutatyonun indirgenmesi Glutatyon S Transferaz (GST) Hidrofilik R-OOH nin GSH ile konjugasyonu Metallotieninler Hidrofilik Geçiş metalleriyle nötralizasyon Tiyoredoksinler Hidrofilik R-S-S-R nin R-SH a indirgenmesi Glutatyon Hidrofilik R-S-S-R nin R-SH a indirgenmesi Serbest radikal temizleyicisi GSH-Px ve GST nin kofaktörü Ubikinon Lipofilik Serbest radikal temizleyicisi Lipid peroksidasyonunda korun Askorbik asit Hidrofilik Serbest radikal temizleyicisi Tokoferol kazanımı Enzimlerin redükte formda korunması Karotenler Lipofilik Serbest radikal temizleyicisi O 2 baskılayıcı Tokoferol Lipofilik Selenyum absorbsiyonunu arttırır Serbest radikal temizleyicisi Lipid peroksidasyonunda korun Selenyum Amfifilik Tiyoredoksin, GSH-Px yapıtaşı Antioksidanları hücre içi, hücre dışı ve zar antioksidanları olarak sınıflandırabiliriz. Bunlara örnek vermek gerekirse; Hücre içi antioksidanlar için süperokit dismutazları, katalazı, glutatyon peroksidazı, glutatyon S transferazı, glutatyon redüktazı, 14

24 Zar antioksidanları için E vitaminini, β karoteni, koenzim Q yu, Hücre dışı antioksidanlar da ise transferini, laktoferrini, haptoglobini, hemopeksini, albumini, seruloplasmini, ekstrasellüler süperoksit dismutazı, ekstrasellüler glutatyon peroksidazı, bilirubini, askorbik asiti sayabiliriz 29. Reaktif oksijen türlerine karşı primer savunma enzimatik ve enzimatik olmayan intrasellüler antioksidanlarca yapılır (Şekil 2.4 ) 40. Şekil 2.4. İnsan dokularındaki major antioksidan enzimler ve bağlı yollar. CuZnSOD (bakır-çinko SOD), MnSOD (manganez SOD), ECSOD (ekstrasellüler SOD), CAT (katalaz), GSH-Px (glutatyon peroksidaz), GSH-Rd (glutatyon redüktaz), GSH (redükte glutatyon), GSSG (okside glutatyon), GST (glutatyon S transferaz), MRP (Multidrug resistans protein), G6PD (glukoz-6- fosfat dehidrogenaz), cgs (gama glutamil transpeptidaz), cgcs (gama glutamil sisteinil sentetaz),(glutamat sistein ligaz), GS (glutatyon sentaz), GPx e (ekstrasellüler glutatyon peroksidaz) 41 15

25 Redükte Glutatyon (GSH) Tripeptid yapıdaki GSH (L-γ- glutamil-l-sisteinil-glisin) oksidatif ve elektrofilik stres ve radyasyona karşı hücrelerin korunmasında önemli rol oynar (Şekil 2.5). GSH sitozolik GSH redoks döngüsünde substrat olarak rol alırken, ROS a karşı direkt olarak da savunma yapabilir 42. Şekil 2.5. Redükte Glutatyon (GSH). Hücrede milimolar derişimde bulunan GSH primer olarak redükte formda(gsh) bulunur ancak okside formda disülfüd dimeri (GSSG) olarakta bulunabilir 43,44. GSH ın hücresel seviyesi γ-glutamil transpeptidaz, aminoasit transporterları, glutatyon sentetaz, glutatyon peroksidaz ve glutatyon redüktazı içeren çoklu bir enzim sistemi tarafından korunur Glutatyon Peroksidaz Enzimi (GSH-Px)(EC ) Glutatyon Peroksidaz organik hidroperoksitlerin (lipit hidroperoksitler, DNA hidroperoksitler) veya hidrojen peroksitin GSH tarafından indirgenmesi tepkimesini katalizler de Mills tarafından keşfedilmiştir 42. H 2 O GSH GSH-Px 2 H 2 O + GSSG GSH-Px ROOH + 2 GSH ROH + GSSG + H 2 O Glutatyon Peroksidaz enzimi iki gruba ayrılabilir: selenyum bağlı ve selenyum bağlı olmayan. Selenyum bağlı grupta hidrojen peroksit ve diğer organik peroksitleri indirgeyen beş üye vardır, selenyum bağımsız Glutatyon Peroksidaz ise 16

26 hidrojenperoksit ile ihmal edilebilir bir aktifliğe sahip olup sadece organik hidroperoksitleri redükler 45. Selenyum bağımlı üyelerden, GSH-Px 1 veya hücresel GSH-Px bütün hücrelerde eksprese edilen, tetramerik yapıda, sitozolik bir enzimdir. Eritrosit, böbrek ve karaciğerde yüksek miktarda bulunur. GSH-Px 2 veya gastrointestinal GSH-Px insanlarda karaciğer ve gastrointestinal kanalda eksprese edilir; böbrek, kalp, akciğer, plasenta ve uterusta bulunmaz. GSH-Px 3 veya plazma GSH-Px plazmanın lipit kısmından izole edilmiş bir glikoproteindir, akciğer, plazma ve diğer ekstrasellüler sıvılarda bulunur. GSH-Px 4 veya fosfolipit GSH-Px sitozolde, mitokondri ve hücre zarında bulunur. GSH-Px 5 veya epididimal GSH-Px selenyum bağlı değildir ve yalnız epididimiste eksprese edilir. GSH-Px 6 hücresel GSH-Px ile homoloji gösterir, burun epiteli ve embriyolarda eksprese edilir 42,46, Glutatyon Redüktaz Enzimi (GSH-Rd)(EC ) Okside glutatyon (GSSG) NADPH bağlı flavo enzim olan Glutatyon Redüktaz tarafından redükte formuna (GSH) indirgenir 16,24,42. GSH-Rd GSSG + NADPH 2GSH + NADP Glutatyon redüktazın kalıtımı otozomal dominanttır, 8. kromozom üzerindedir. Glutatyon peroksidaz ile benzer doku dağılımı gösterir. Glutatyon redüktaz flavin adenin dinükleotid (FAD) içerir, NADPH tan bir elektronun GSSG nin disülfüd bağlarına aktarılmasını katalizler. Bu nedenle NADPH serbest radikal hasarına karşı gereklidir ve major kaynağı pentoz fosfat yoludur (Şekil 2.6)

27 Şekil 2.6. Glutatyon redoks döngüsü Glutatyon-S-Transferaz Enzimi (GST)(EC ) GST memeli türlerinde elektrofilik bileşenlerin GSH ile konjugasyonunu katalizleyen izoenzimlerin oluşturduğu çoklu bir gen ailesinden oluşur; alfa,mu, teta, pi, zeta, sigma, kappa ve omega olarak gösterilen 8 esas gen sınıfı ile düzenlenmiştir. Alfa kromozom 6 da, mu kromozom 1 de, teta kromozom 22 de, pi kromozom 11 de, zeta kromozom 14 de, sigma kromozom 4 de, kappa ve omega kromozom 10 da kodlanır 33,48. GST karsinojenleri, çevresel etmenleri, ilaç ve geniş spektrumlu kasenobiotikleri metabolize eder. Mikrozomal GST belirlendiyse de GST aktivitesi esasen sitozoliktir 42. GST iki subüniteden oluşmuş dimerik bir proteindir. Bu subünitelerden her biri glutatyon bağlanma bölgesi (G bölgesi) ve buna komşu elektrofilik substrata bağlanan nispeten hidrofobik olan bölge içerir. Bunun yanında çeşitli izoenzimlerde transport veya düzenleyici fonksiyonu olduğu düşünülen substrat bağlanmayan bölge de belirlenmiştir. GST, hidroksialkenler, lipit peroksidasyonunun ürünlerinden propenaller ve DNA hidroperoksitleri gibi endojen zararlı bileşiklerin detoksifikasyonunu sağlayabildiği için oksidatif strese karşı savunmaya katılır, bunun yanında epoksidler ve kinonlar gibi maddelerin biotransformasyonunda elektrofilik ksenobiotikler ve/veya reaktif ara ürünler oluşabilir 33,45. GST enziminin teta ve alfa sınıfları selenyum bağlı olmayan Glutatyon peroksidaz aktivitesi gösterirler, GST pi formu lipit hidroperoksitleri ve hidroksialkenler, malondialdehitler ve propenalleri inaktive eder. GST pi ayrıca hassas 18

28 SH- grubuyla ROS ile direkt reaksiyona girerek disülfüd yapımının inaktif olmasına neden olur Süperoksit Dismutaz Enzimi (SOD)(EC ) Reaktif oksijen türlerine karşı primer antioksidan enzim Süperoksit Dismutaz dır. Formları arasında aminoasit dizilimi, aktif metal bölgesi ve hücresel dağılım farkı vardır. Prokaryotlarda Fe ve Mn-SOD bulunurken, ökaryotlarda Mn, CuZn ve ekstrasellüler SOD (EC-SOD) bulunur 49. Mn-SOD homotetramer yapıdadır, her subünitesinde bir Mn iyonu bulunur, ve 88 kda ağırlığındadır. Hücresel Mn-SOD içeriği kalp, beyin, karaciğer, böbrek gibi yüksek metabolik aktivitesi olan dokularda daha fazladır. CuZn-SOD 32 kda ağırlığında olup memelilerde en çok karaciğer, böbrek, eritrosit ve santral sinir sisteminde bulunur. İki protein subünitesi içerir her subünitede Cu ve Zn atomları bulunur. EC-SOD ise en çok vaskülatür, akciğer, uterus ve tiroid bezlerinde bulunur 41,50. SOD, süperoksit molekülünün hidrojen peroksite ve moleküler oksijene tepkimesini katalizler 16,22,24. SOD 2 O 2 + 2H + H 2 O 2 + O 2 Tepkimede süperoksit anyonu Cu +2 ve bir arjinin rezidüsünün guanido grubuna bağlanır. Bu şekilde süperoksitten bir elektron Cu +2 a transfer olurken Cu +1 ve moleküler oksijen oluşur. İkinci süperoksit anyonu Cu +1 dan bir elektron,bağlanma ortağından ise iki elektron alarak hidrojen peroksiti oluşturur 22,41. SOD-Cu +2 SOD-Cu +1 + O 2 SOD-Cu +1 + O 2 + 2H + SOD-Cu +2 + H 2 O Katalaz Enzimi (CAT)(EC ) Katalaz çoğu organizmada bulunan ve hem içeren homotetramerik bir enzimdir. Peroksizomlarda yüksek derişimlerde bulunur 51,52. 19

29 Katalaz yapı ve işlevlerine göre bifonksiyoneldir. Tüm prokaryot ve ökaryotlarda bulunur. Her subünite bir hem grubu ve NADPH molekülü içerir. Birçok katalazda NADPH molekülü yüzeye yakın ve sıkıca bağlıdır. Bu kofaktör peroksitin oksijene dönüşümünde katalazın inaktivasyonunu koruduğu ve etkisini arttırdığı gözlenmiştir 52. Katalaz hidrojen peroksitin su ve moleküler oksijene dismutasyonunu katalizler. 2H 2 O 2 CAT O 2 + 2H 2 O Katalaz ayrıca fenol, alkol gibi farklı substratların, hidrojen peroksitin çift redüksiyonu ile detoksifikasyonunu sağlar. H 2 O 2 + RH 2 CAT R + 2 H 2 O Glukoz-6-fosfat eksikliklerinde NADPH ın olgun eritrostlerdeki düşüklüğünün katalazda inhibisyona neden olduğu ve hemolizin GSH-Rd/GSH-Px den çok katalazdan kaynaklandığı düşünülmektedir Tiyoredoksin sistem Tiyoredoksin sistem oksidoredüktaz enzim aktivitesi gösteren tiyoredoksin (Trx) ile tiyoredoksin redüktazı (TrxR) içeren iki antioksidan enzim sistemi içerir. Memeli ve prokaryotik hücrelerde bulunur. Tiyoredoksin redüktaz NADPH kullanarak tiyoredoksinin disülfit aktif bölgesini ve pek çok substratı redükler. Yapılan çalışmalarda, tiyoredoksinin insanda immun sistem düzenlenmesiyle ilişkili olduğu ve farklı genlerce kodlanan üç farklı varyantı gösterilmiştir.tiyoredoksin redüktaz izoenzimleri, her subünitesinde bir FAD bulunduran NADPH bağlı oksidoredüktazlardır. Tiyoredoksin redüktazın ilk saflaştırılması 1977 de yapılmıştır Ubikinon (Koenzim Q) Ubikinon esas olarak mitokondride elektron transport zincirinin bir parçası olarak kullanılmaktır, bunun yanında ubikinon düşük derişimlerde plazmada ve hücre zarlarında lipit peroksidasyonuna karşı koruyucu antioksidan olarak bulunur. 20

30 Ubikinonun yenilenmesi lipoamid dehidrogenaz ve kısmen tiyoredoksin redüktazı da içeren enzim ailesinin diğer üyeleriyle gerçekleştirilir 53, Askorbik Asit (C Vitamini) Askorbik asit insan plazmasında ve hücre zarında bulunan, zarı geçebilen major antioksidanlardan biridir.suda çözünebilir düşük moleküler ağırlıklı bu antioksidan kollojen sentezi, demir absorpsiyonu ve hücrelerin redoks durumunun korunmasında gereklidir. Tokoferoller, peroksidler ve süperoksit gibi reaktif oksijen türlerini redükler. Askorbik asitin antioksidan olarak esas görevi lipit hidroperoksitlerin oluşumunu engellemektir. Bu da aterosklerotik plak oluşumunu engellemede önemli rol üstlendiğini gösterir Karotenler (A Vitamini) Alkoller(retinoller), aldehitler(retinaller) ve retinoik asitler başta olmak üzere A vitamininin çeşitli türleri bulunur. A vitamininin en etkili ve en yaygın türü β- karoten dir. Suda çözünmeyen bu bileşik havada okside olarak inaktif ürünler oluşturur 56. A vitamininin antioksidan etkisi yanında gerekli olduğu sistemik etkiler hücre ve intrasellüler zar dayanıklılığının sağlanması, epitel dokunun bütünlüğünün sürdürülmesi, ve glikoprotein sentezidir Tokoferoller (E Vitamini) α, β, γ, δ olmak üzere dört farklı tokoferol formu bulunur. Biyolojik olarak en yaygın ve en aktif E vitamini şekli olan d-α-tokoferoldür. Yağda çözünen fakat suda çözünmeyen bu bileşikler oksijen bulunmayan ortamlarda asit ve sıcaklığa dayanıklıdır 57. Eşleşmemiş elektronlarla reaksiyona giren ve indirgeyebilen hidroksil grubu içerir. Radikal reaksiyonları sırasında zincir kırıcı etkiye sahiptir. Glutatyon ve askorbik asit ile antioksidan etkisi artar 13,57, Flavonoidler Flavonoidler çeşitli sebze, meyve ve otlarda bulunan polifenol grubu doğal kimyasallardır. Doğada altı binin üzerinde flavonoid vardır. Antioksidan, 21

31 antiarteriyosklerotik, antiinflamatuvar, antitümör, antitrombojenik, antiviral, antialerjik etkileri vardır. Flavonlar, flavonollar, flavanonlar; kateşinler, isoflavonlar, antosiyanidinler olarak altı sınıfa ayrılırlar. Flavonoidler, önemli metal şelatörleri ve serbest radikal temizleyicisi gibi rol oynarlar. Flavonoidler tarafından temizlenebilen ve formasyonları inhibe edilebilen reaktif oksijen ürünleri; süperoksit anyonları, hidroksil radikali, alkol radikali, peroksil radikali ve perhidroksi radikalidir. Flavonoidler, radikallerin reaktif kısımlarıyla etkileşerek, reaktif oksijen ürünlerini stabilize ederler Selenyum Selenyum yiyeceklerde selenosistein öncü maddesi olan selenitler, selenatlar ve selenometiyonin olarak bulunur. İn vitro hayvan deneylerinde Se bileşiklerinin apoptozisi ve transforme hücrelerde hücre siklusunu indirgediği gösterilmiş ve bundan dolayı da kanser hücre gelişimini durduğu ileri sürülmüştür 58, Transferin ve Laktoferrin Transferin kanda demir taşıyan bir β-globindir. Laktoferrin ise dolaşımdaki serbest demiri düşük ph larda bağlar 22, Ürik Asit İnsanlarda pürin nükleozidleri olan adenozin ve guanozin katabolizmasın temel ürünü ürik asittir. Metal bağlayıcı ve serbest radikal temizleyicisi olarak görev alır Bilirubin Bilirubinin büyük bir kısmı ömrünü dolduran eritrositlerin parçalanmasından kaynaklanır ve dolaşımdan karaciğer tarafından alınır ve biyotransformasyona uğrar, safra ve idrarla atılır. Antioksidan olarak peroksil radikalleri toplar Haptoglobin (Hp) Haptoglobin hemoglobini geri dönüşümsüz olarak bağlayan bir α 2 -glikoproteindir. Ekstrasellüler hemoliz sırasında hemoglobin eritrositlerden salınır ve serbest hemoglobin dimerleri tümüyle haptoglobine bağlanır

32 Seruloplazmin:(Cp) Seruloplazmin total serum bakırının yaklaşık %95 ini içeren α 2 -globulindir. Cp nin primer fizyolojik rolü plazma redoks reaksiyonlarıyla ilişkilidir. Serbest ferrik iyonları ve ferritin bağlayan bölgelerin varlığı gibi faktörlere bağlı olarak oksidan veya antioksidan olarak işlev görür. Cp nin demirin iyonik durumunu düzenlemede ve toksik demir ürünleri oluşmaksızın demirin transferine girmesinde. yaşamsal önemi vardır Hemoglobin Yapısı ve Sentezi Hemoglobin eritrositlerin kırmızı rengini sağlayan ve oksijen taşıma yeteneği kazandıran bileşenidir. Protein yapısındaki hemoglobin oksijeni akciğerlerden dokulara, karbondioksiti ise dokulardan akciğerlere taşımaktadır 62. Molekül ağırlığı yaklaşık dalton olup molekülün %96 sını globin proteini, %4 ünü de hem yapısı oluşturmaktadır (Şekil 2.7) 63. Şekil 2.7. Hemoglobin A yapısı Hem Yapısı Hem grubu dört pirol halkasından meydana gelen protoporfirin halka sistemi ile bir demir atomundan oluşmaktadır. Meten köprüleri ile birbirine bağlanan dört pirol halkasından meydana gelen tetrapirol halkasına yan zincir olarak dört metil, iki vinil ve iki propiyonat eklenmiştir.(şekil 2.8) Protoporfirin halkasına zincirler onbeş farklı 23

33 şekilde bağlanabilmektedir. Biyolojik sistemde protoporfirin IX olarak isimlendirilen izomerinin bulunduğu belirlenmiştir 60. Şekil 2.8. Hem molekülü yapısı Molekülde Protoporfirin IX halkasının merkezine prostetik grup olarak demir yerleşir. Hem dönüşümlü olarak oksijenle bağlanması ancak demir ferröz (Fe 2+ ) formunda iken olur. Demir ferrik (Fe 3+ ) duruma okside olduğunda hem oksijene bağlanamaz ve methemoglobin olarak isimlendirilir. Hemoglobinin globin proteininden ayrı olarak demir serbest halde oksijene bağlanamaz Globin Yapısı İki farklı globin zinciri kombine olarak hemoglobini oluşturur. Bu zincirlerden biri alfa iken diğeri non-alfa zinciridir. Embriyogenezin ilk haftaları dışında globin zincirlerinden biri daima alfadır (Çizelge 2.5) 64. Çizelge 2.5. İnsan hemoglobinlerindeki globin zincirleri 65 Embriyonik hemoglobinler gower 1- ζ 2, ε 2 gower 2- α 2, ε 2 Portland- ζ 2, γ 2 Fetal Yetişkin hemoglobin hemoglobinleri hemoglobin F- α 2, γ 2 hemoglobin A- α 2, β 2 hemoglobin A 2 - α 2, δ 2 24

34 Embriyoda ilk sentezlenen globin zinciri zeta (ζ ) ve alfa (α) zincirine benzeyen epsilondur (ε). Beş altı haftalık gestasyon öncesinde Hb Gower 1 (ζ 2, ε 2 ) major hemoglobin olarak gözlenir. Hb Gower 2 (α 2, ε 2 ) 4-13 haftalar arası embriyoda gözlenir, diğer bir erken dönem hemoglobini ise Portland ( ζ 2, γ 2 ) dır.hb F (α 2, γ 2 ) fetal hayatın major hemoglobinidir.(şekil 2.9) Normal erişkin hemoglobininde Hb A %97 oranındadır ve 9 haftalık fetusta gösterilebilir. Hb A 2 erişkin hemoglobininin %2.5 ini oluşturur 66. Şekil 2.9. Globin sentezi Globin komponentlerini şifreleyen α benzeri genler16. kromozomda, β benzeri genler 11. kromozomda yer alır 62. α globin gen kümesi üç fonksiyonel gen içeir; ζ geni, α 1 geni ve α 2 geni. Gen delesyonları veya zincir sentez eksikliği veya yokluğu sonucu α-talasemi oluşur. β globin gen kümesi ise ε geni, γ geni, δ geni ve β geni olmak üzere beş gen içerir (Şekil 2.10) 63. β globin geni, β globin zincirindeki 146 aminoasidi kodlamak için gerekli bilgiyi, 3 ekson, 2 intron ve 5, 3 düzenleyici bölgelerden oluşan yaklaşık 1.8 kb üzerinde taşımaktadır

35 Şekil Globin gen kümeleri 2.7. Talasemi Sendromları Normal bir erişkinde yapısal olarak birbirinden farklı üç hemoglobin vardır; bunlar Hb A, Hb F, ve Hb A 2 dir. Talasemi bu üç farklı hemoglobinin yapısındaki dört (α,β,δ,γ) farklı globin zincirlerinden bir veya birden fazlasının yapım azlığı veya hiç yapılamama durumudur 68. Talasemi ilk kez Detroitli bir çocuk hekimi olan Thomas Cooley tarafından 1925 yılında derin anemisi, dalak büyümesi, büyüme geriliği, ve kemik deformiteleri gibi benzer bulguları olan çocuklarda ayrı bir hastalık olarak tanımlanmıştır 69. Talasemi otozomal resesif geçiş gösteren heterozigot formda taşıyıcılığa, homozigot formda hastalığa yol açan kronik hemolitik bir anemidir 70. Talasemi sınıflandırması yetersiz globin zincir yada zincirlerine göre yapıldığında, α zincir sentezinin yokluğu yada eksikliği α-talasemi, β zincir sentezinin yokluğu yada eksikliği β talasemi olarak adlandırılır Αlfa Talasemi α-talasemide en sık rastlanılan patoloji gen delesyonudur. Dört α geninden bir tanesi delesyona uğradığında α + -talasemi, (sessiz talasemi veya α- talasemi-2), iki α geni delesyona uğradığında α o -talasemi (α-talasemi taşıyıcılığı veya α-talasemi-1) adı verilen taşıyıcılık, üç α-geni delesyona uğradığında ise Hb H (β 4) hastalığı adı verilen hastalık ortaya çıkar. Hb Bart s (γ 4 ) (hidrops fetalis) ise dört α-geni de delesyona uğramıştır, bu durumda intra uterin tedavi yapılmazsa fetal ölüm veya doğumu takiben 1-2 dakika içinde bebek ölümü gerçekleşir 68,71,72. 26

36 Beta Talasemi 11. kromozomdaki β geninde çesitli ve çok sayıda genetik mutasyonlar sonucu, β globin zincir yapısının azalması veya hiç yapılmaması ile β-talasemi hastalıgı ortaya çıkmaktadır 73. β-talaseminin en önemli nedenini, α-talasemide görülen büyük delesyonlar değil gen içindeki nokta mutasyonları oluşturmaktadır. Bugüne kadar β-talasemi ye neden olan 200 den fazla nokta mutasyon belirlenmiştir. lvs-l-110 Türkiye de en sıklıkla rastlanan β talasemi mutasyonudur (%40) 74. β talasemi klinik durum göz önüne alınarak sınıflandırıldığında major klinik bulguları ve derin anemisi olan hastalar talasemi major, anemisi düzenli transfüzyon gerektirmeyen hastalar talasemi intermedia, anormal eritrosit morfolojisi olmasına rağmen anemisi olmayan veya çok az olan hastalar talasemi minör, talasemi geni taşımasına rağmen anormal eritrosit morfolojisi göstermeyen hastalar da talasemi minima olarak sınıflandırılır 63. β globin zincirinin eksikligi veya yokluğuyla gama ve delta zinciri artışı HbA 2 ve HbF artmasına neden olmaktadır. β-talasemi li hastalarda inutero γ globin sentezi yeterli olduğu için β globin sentezindeki defekt HbA nın HbF ile yer değiştirmesi gereken dönemde başlar. Klinik bulguların yaşamın ilk birkaç ayında görülmemesinin nedeni budur 70. β-talasemide anemi, periferal sirkülasyondaki eritrositlerin inefektif eritropoesisi ve prematür hemolizinin kombinasyonundan kaynaklanmaktadır 73. Hastalığı ağırlaştıran ikinci ve daha önemli olay ise β globin zinciri eksikliği nedeniyle eşlenmemiş fazla α globin subünitelerinin birikip, çökmesi eritrosit membran ve organellerinde geri dönüşümsüz harabiyete neden olup, eritrositlerin dalakta yıkımını arttırmaktadır 73. β-talasemi tanısında öncelikle mikrositik hipokromik anemiyi ortaya koymak için eritrosit indeksine bakılır,(çizelge 2.6) daha sonra periferik yaymada eritrosit morfolojileri incelenir,(şekil 2.11) hemoglobin analiziyle HbA düşüklüğü ve HbA 2,HbF artışı araştırılır.(çizelge 2.7) İleriki basamakta ise genetik testlerle mutasyon taraması yapılır

37 Çizelge 2.6. Beta talasemide eritrosit indeksi değişimi 65 Eritrosit İndeksi Normal Hasta Taşıyıcı Erkek Kadın ß-Thal Major ß-Thal Minor MCV fl fl fl <79 fl MCH pg pg pg <27 pg Hb g/dl g/dl <7 g/dl g/dl Çizelge 2.7. Beta talasemide hemoglobin düzeyleri 65 Tipi Hasta Hemoglobin Normal Taşıyıcı ߺ-Thal ß + -Thal ß-Thal Homozigot Homozigot veya Minor ß + /ߺ Heterozigot HbA 96-98% % 92-95% HbF <1% 95-98% 70-90% 0.5-4% HbA 2 2-3% 2-5% 2-5% >3.5% Şekil Periferik yaymada talasemik eritrositlerin hipokromileri(sağ) ve mikrositerliği (sol). Eritrositlerin merkezindeki solukluk çapının %30 undan fazlasını kaplamakta ve eritrositlerin çapları 7 µm den küçük gözleniyor Talasemi ve Oksidatif Stres β-talasemi hastalarında artmış α globin zinciri nedeniyle şiddetli oksidatif hasar gözlenir.eşleşmemiş α zincirlerinin hem direkt ilişkişi, hem yarattığı oksidatif hasar 28

38 nedeniyle eritrosit membranının antijenik yapısında değişiklik olmaktadır. Bu antijenik yapı değişikliği otoreaktif IgG antikorları olusumuna neden olmaktadır. IgG antikorları antigalaktosit ile reaksiyona girer ve eritrositlerin retiküloendotelyal sistem'de(res) yıkımı artar 13,23. Globin zincirlerinin yapımındaki şiddetli dengesizlikler farklı talasemi fenotiplerinin ortaya çıkmasına yol açar. Talasemik eritrositlerin oksidatif streslere artmıs duyarlılığı, serbest radikallerle olusan oksidatif hasar, lipid peroksidasyonu ve demir toksisitesi ile belirlenmiştir 37,76. Talasemide oksidatif hasarı ayrıca kolaylaştıran mekanizmalar multifaktöryeldir. Bunlar; 1- Eşleşmemiş fazla alfa globin zincirleri 2- Non hemoglobin demiri 3- Hücre içinde Hb'nin düşük oluşudur. Serbest, eşleşmemiş, instabil globin subünitleri süperoksit ve hidroksil radikali olustururlar. Bunlar oksidatif olaylar zincirini baslatırlar. Önce methemoglobin olusur, sonra reversible ve irreversible hemikromlar çökerler ve membranın çesitli komponentleri ile iliskiye girerler. Hem ve globulini parçalarlar. Hemin degredasyonu ile açığa çıkan serbest demir Fenton reaksiyonu yolu ile çok güçlü sekilde okside radikal olusumuna yol açmaktadır 77. Oluşan ve çok toksik olan hidroksil radikali membran iskeletinde bozulma ile, deformabilitede azalma, rijiditede artma, membran lipidlerinde peroksidasyon, antijenik degişme ile eritrositlerde erken yaşlanma, katyon degişiminde bozulma ile hücre içi K + kaybı gibi olaylara neden olmaktadır Talasemi Dağılımı Talasemi dünyadaki en yaygın kalıtsal hastalıktır. Akdeniz, Afrika nın bir kısmı, Orta doğu, Arap yarımadaları, güney-doğu Asya olmak üzere geniş bölgelerde görülür 71,78. β-talasemi Akdenizi de içine alan bir kuşak içinde sıklıkla gözlenirken alfa talasemi uzak doğuda önemli bir sorundur 79. Her yıl doğan bebeklerin %6,5 i taşıyıcı olarak dünyaya gelirken, bunun yanında yaklaşık 300,000 hasta çocuk doğmaktadır (Şekil 2.12)

39 Şekil Talasemi,orak hücre anemisi ve diğer yaygın hemoglobin hastalıklarının dünya üzerindeki yayılımı. Talasemi çeşitli ülkelerde ve aynı ülkenin farklı bölgelerinde dağılım bakımından heterojenite gösterir. Talaseminin yaygın olduğu kuşakta bulunan ülkemizde de hastalığa her bölgede rastlanmakta ve Türkiye ortalaması %2 olarak belirtilmektedir 80,81. β-talasemi ve diğer hemoglobinopatiler Türkiye de son yıllarda sağlık bakanlığınca yaygın sağlık sorunu olarak kabul edildi. Ulusal Hemoglobinopati Konseyi 2000 yılında sağlık otoriteleriyle tüm Türkiye de hastalığın tanı, tedavi ve kontrol standardizasyonunu sağlamak için yasa önerisi hazırlamış ve bu yasalaşmıştır Talasemide Tedavi Modern dünyanın büyük kısmında yaygın olduğu anlaşıldıktan sonra bu grup hastalıklarda yeni tedavi gelişimleri ilgi çekmeye başlamıştır. Ayrıca birçok ülkede DNA temelli prenatal tanı önemli ölçüde hasta, taşıyıcı doğumunu engellemiştir 78. Talasemi major ve diğer transfüzyon gerektiren talasemik sendromlarda tedavide şu yöntemler kullanılır 82. Süper ve hipertransfüzyon tedavisi Splenektomi Şelasyon tedavisi Kemik iliği transplantasyonu 30

40 Bu tedavilerden düzenli kan transfüzyonu; yaşamı uzatır, anemi komplikasyonlarını azaltır, kemik iliği hiperaktivitesini önler, normal büyüme ve gelişmeyi sağlar.sadece kan transfüzyonu alan hastalar demir birikimine bağlı olarak kaybedilebilirler. Splenektomi;hipersplenizmi bulunan olgularda uygulanır, şelasyon tedavisi; demir birikimini azaltarak yaşam süresini arttırır de Thomas tarafından talasemi için yapılan transplantasyondan beri binin üstünde allogenik transplantasyon rapor edilmiştir. Halen bilinen tek kür oluşturan tedavi yöntemi hematopoetik kök hücre transplantasyonudur 78,83. Gen terapisi ise umut vadeden bir tedavi yöntemidir. Tek gen fonksiyonunun azalması veya tamamen kaybolması gen terapisi tedavisi için ilk düşünülen sebeplerdendir. Bu beklenti yaklaşık 15 yıl önce β globin geni transfer edilen transgenik farelerde talaseminin düzeltilmesiyle desteklenmiştir. Günümüzde de değişik metodlar uygulanarak çalışmalar sürdürülmektedir

41 3.GEREÇLER VE YÖNTEMLER 3.1. Gereçler Cihazlar 1. Spektrofotometre Bausch and Lamb Spectronic 20D 2. UV spektrofotometre Schimadzu-UV Su Banyosu Thermomix BU 4. Kan sayım cihazı Coulter T Buz makinesi Scotsman AF Soğutmalı Santrifüj Ependorf Centrifuge Santrifüj Hettich D Manyetik karıştırıcı Heidolph MR Vorteks Elektro-mag M Dijital ph metre WTW ph S Elektrikli Terazi Mettler P Otomatik pipet Gilson P-20, P-100, P-200, P-1000 µl 13. Aspiratör Vacumat Kimyasal Maddeler 1. Redükte nikotinamid adenin dinukleotid fosfat (NADPH) (Sigma) 2. Sodyum dodesil sülfat (SDS) (Sigma) 3. 1,1,3,3-tetrametoksipropan (Aldrich) 4. Redükte Glutatyon (GSH) (Sigma) 5. Glutatyon Redüktaz (Sigma) 6. t-butil hidroperoksit (Sigma) 7. Okside Glutatyon (GSSG) (Sigma) 8. SOD Ransod Kıt (Randox) 32

42 9. Flavin adenin dinukleotid (FAD) (Calbiıochem) kloro-2-4-dinitrobenzen (CDNB) (Aldrich) 11. n-butanol (Merck) 12. Piridin (Sigma) 13. Asetik asit (Sigma) 14. Tiyobarbitürikasit (Sigma) 15. %30 luk Hidrojen peroksit (Merck) 3.2.Örnek Toplama β talasemili hastaların kan örnekleri Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi Hastanesi Pediatrik Hematoloji Anabilim Dalı nda tanısı konmuş ve tedavi edilmekte olan çocukluk yaş grubunda transfüzyondan hemen önce; kontrol grubunun kan örnekleri ise β talasemi tanısı konmamış 16 yaş altı çocuklardan alınmıştır. Olgulardan venöz staza yol açmadan EDTA içeren antikoagulanlı tüplere alınan kan örneklerinin, hematolojik testleri yapıldıktan sonra santrifüj edilerek MDA analizi için plazmaları ayrılmış elde edilen eritrosit pelletleri eritrosit SOD, GSH-Px, GSH-Rd, GST, CAT, enzimlerinin aktivite ölçümü için serum fizyolojik ile yıkanmış ve bütün kan örnekleri bekletilmeksizin aynı gün analiz edilmiştir Analiz Yöntemleri Hematolojik Analizler Hematolojik analizler coulter counter cihazıyla yapılmış; Hemoglobin(Hb), Hematokrit(Hct), Eritrosit (RBC), ortalama eritrosit hacmi(mcv), ortalama eritrosit hemoglobini(mch) ve ortalama eritrosit hemoglobin konsantrasyonu(mchc) ölçüm sonuçları alınmıştır Hemolizat Hazırlanması: Plazmaları ayrılan kan örnekleri 2 ml soğuk (+4 o C) serum fizyolojik ile alt üst edilerek karıştırıldıktan sonra 3000xg de 5 dakika santrifüj edildi ve süpernatan atıldıktan sonra aynı işlem atılan süpernatan berrak oluncaya kadar 3-4 kez tekrarlandı. 33

43 Elde edilen eritrosit pelletinden 50 µl alınıp üzerine 2 ml saf su ilave edilerek hemolizatlar hazırlandı ve hemolizatlar deney süresince buz içerisinde muhafaza edildi Glutatyon Peroksidaz (GSH-PX) Ölçüm Yöntemi Prensip: GSH-Px ile t-bütil hidroperoksit varlığında GSH nin GSSG ye oksidasyonu gerçekleşir.yöntem, bu oksidasyon sonucu oluşan GSSG nin glutatyon redüktaz (GSH- Rd) enzimi ile tekrar GSH ye indirgenmesi tepkimesinde NADP ye oksitlenen NADPH nin 340 nm dalga boyundaki absorbans değeri farkının zamana karşı okunması prensibine dayanır 84. GSH-Px 2 GSH + R-O-O-H GSSG + H 2 O + ROH GSSG + NADPH + H + GR 2 GSH + NADP + Ayıraçlar: 1. 1 M Tris Tamponu (ph: 8,0) Tris asit 8,8 g Tris baz 5,4 g EDTA 0,14 g Saf su ile 100 ml ye tamamlanır. 2. 0,1 M GSH GSH 31 mg Saf su ile 1 ml ye tamamlanır. Gerekli miktarda günlük olarak hazırlanır Ü/ml Glutatyon Redüktaz Kullanılan glutatyon redüktazın U/ml si üzerinden hesaplanır mm t-butil hidroperoksit %70 lik t-butil hidroperoksit 1:1000 saf su ile sulandırılır mm NADPH NADPH 17 mg 34

44 Saf su ile 10 ml ye tamamlanır. Gerekli miktar günlük olarak hazırlanır Yöntem: Ayıraçlar 1 ml lik küvetlere tabloda belirtilen oranlarda ilave edilir. Kör (µl) Örnek (µl) 1 M Tris Tamponu ,1 M GSH Ü/ml Glutatyon Redüktaz mm NADPH Hemolizat Saf Su ºC de 10 dakika inkubasyon t-bütil hidroperoksit 10 Hesaplama: 1 cm ışık yollu kuvartz küvetlerde, 37 ºC de, 340 nm dalga boyunda oluşan tepkimenin absorbans değişikliği farklı zaman aralıklarında izlenir. OD/ dak GSH-Px Aktivitesi (Ü/ml) = x V Toplam 6,22 V Örnek OD = Optik Dansite Değişimi 6,22 = 1 mm NADPH nin 1 cm lik ışık yolunda verdiği OD değeri V Toplam = Toplam hacim V Örnek = Hemolizat hacmi GSH-Px Spesifik Aktivitesi = GSH-Px Aktivitesi Hb Değeri 35

45 3.3.4.Glutatyon Redüktaz (GSH-Rd) Ölçüm Yöntemi Prensip: Glutatyon Redüktaz, GSSG nin NADPH tarafından GSH a indirgenmesini katalize eder. Enzim aktivitesi, tepkime sırasında yükseltgenen NAD(P)H nin 37 ºC de, 340 nm dalga boyunda absorbans farkı ölçülerek belirlenir 84. NADPH + H + + GSSG GSH-Rd NADP GSH Ayıraçlar: 1. 1 M Tris Tamponu ( ph: 8,0) Tris asit 8,8 g Tris baz 5,4 g EDTA 0,14g Saf su ile 100 ml ye tamamlanır µm FAD Stok 100 mm FAD 0,0008 g Saf su ile 10 ml ye tamalanır. 1:10 seyreltilerek 10 mm FAD hazırlanır M GSSG GSSG 210 mg Saf su ile 10 ml ye tamamlanır. Kullanılacak olan miktar günlük olarak hazırlanır mm NADPH NADPH 17 mg Saf su ile 10 ml ye tamamlanır. Kullanılacak olan miktar günlük olarak hazırlanır. 36

46 Yöntem: Ayıraçlar 1 ml lik küvetlere tabloda belirtilen oranlarda ilave edilir. FAD siz çalışma FAD li çalışma Kör (µl) Örnek (µl) Kör (µl) Örnek (µl) 1M Tris Tamponu Hemolizat Saf Su µm FAD ºC de 10 dakika inkubasyon 0,033 M GSSG ºC de 10 dakika inkubasyon 2 mm NADPH GSH-Rd bir flavin enzimdir. Normal hemolizatlarda FAD tarafından tam olarak aktive edilmediği bulunmakla birlikte apoenzimin tam aktivasyonu için enzimin FAD ile preinkübasyonu gereklidir. Bu nedenle yöntemde FAD li ve FAD siz tüpler hazırlanmış,aktivite farkı gözlenmiş ve FAD li tüp kullanılmıştır. Hesaplama: GR Aktivitesi (Ü/ml) = OD/ dak V Toplam x 6,22 V Örnek OD = Optik Dansite Değişimi 6,22 = 1 mm NADPH nin 1 cm lik ışık yolunda verdiği OD değeri V Toplam = Toplam hacim V Örnek = Hemolizat hacmi GR Spesifik Aktivitesi = GR Aktivitesi Hb Değeri 37

47 Katalaz (CAT) Ölçüm Yöntemi Prensip: Katalaz H 2 O 2 nin su ve moleküler oksijene yıkımını katalizler. H 2 O 2 nin ışığı absorbe etmesinden yararlanılarak 230 nm de enzimin yıkım hızı spektrofotometrik olarak ölçülür 84. CAT 2 H 2 O 2 2 H 2 O + O 2 Ayıraçlar: 1. 1 M Tris Tamponu ( ph: 8,0) Tris asit 8,8 g Tris baz 5,4 g EDTA 0,14g Saf su ile 100 ml ye tamamlanır mm H 2 O 2 ( % 30 luk H 2 O 2 den hazırlanır.) 1 M fosfat tamponu 1/10 oranında sulandırılır, bunun 0.9 ml sinin saf su olan köre karşı optik dansitesi 230 nm de okunur. (OD 1 ) 0.9 ml 1/10 oranında sulandırılmış 1 M fosfat tamponu üzerine 1/100 oranında sulandırılmış %30 luk H 2 O 2 den 0.1 ml eklenerek bu çözeltinin de optik dansitesi okunur.(od 2 ) 1/100 sulandırılmış H 2 O 2 nin derişimi c = 141x (OD 2 -OD 1 ) mm dır.10 mm H 2 O 2 hazırlamak için 1/100 seyreltilmiş H 2 O 2 nin 1 ml si derişimin 1/10 u ölçüsünde saf su ile tamamlanır M Fosfat tamponu (ph: 7.0) Disodyum Fosfat 5,4 g Sodyum Fosfat 9,5 g Bir miktar su koyulduktan sonra NaOH ile ph ayarlanır ve 100 ml ye tamamlanır. 38

48 Yöntem: Ayıraçlar 1 ml lik tabloda belirtilen oranlarda ilave edilir. Kör (µl) Örnek (µl) 1 MTris Tamponu mm H 2 O H 2 O ºC de 10 dakika inkubasyon Hemolizat Hesaplama: CAT Aktivitesi(Ü/ml): OD/ dak x 0,071 V Örnek V Toplam OD = Optik Dansite Değişimi 0,071 = 1 µmol H 2 O 2 nin 1 cm lik ışık yolunda verdiği optik dansite değeri. V Toplam = Toplam hacim V Örnek = Hemolizat hacmi CAT Spesifik Aktivitesi = CAT Aktivitesi Hb Değeri Glutatyon S Transferaz ( GST ) Ölçüm Yöntemi Prensip: GST, 1-kloro-2,4-dinitrobenzen (CDNB) ile glutatyonun SH grubu arasındaki tepkimeyi katalizler. Enzim aktivitesi 340 nm de 37 ºC de GSH ve CDNB kullanılarak dakikada oluşan S-2,4 dinitrofenilglutatyonun 1 µmolünü katalizleyen enzim miktarının ölçülmesiyle belirlenir 85. CDNB + GSH GST S-2,4 dinitrofenilglutatyon + HCl 39

49 Ayıraçlar: mm GSH GSH 6,1 mg Saf su ile 1 ml ye tamamlanır. Gerekli miktarda günlük olarak hazırlanır mm CDNB CDNB 4,05 mg % 95 lik etanolle 1 ml ye tamamlanır. Gerekli miktarda günlük olarak hazırlanır M NaK Fosfat Tamponu (ph 6.5) Disodyum fosfat 1,19 g Potasyum fosfat 2,25 g EDTA 29,2 mg Saf su ile 100 ml ye tamamlanır. ph doymuş sodyumhidroksit ile ayarlanır Yöntem:. Ayıraçlar 1 ml lik küvetlere tabloda belirtilen oranlarda ilave edilir. Kör (µl) Örnek (µl) 0,2M NaK Tamponu GSH Hemolizat 20 Saf Su CDNB Hesaplama: GST Aktivitesi (Ü/ml) = OD/ dak V Toplam x 10 V Örnek OD = Optik Dansite Değişimi 10 = 1 µmol CDNB nin 1 cm lik ışık yolunda verdiği optik dansite değeri V Toplam = Toplam hacim 40

50 V Örnek = Hemolizat hacmi GST Spesifik Aktivite = GST Aktivitesi Hb Değeri Süperoksit Dismutaz (SOD ) Ölçüm Yöntemi Prensip: Süperoksit Dismutaz enzimi, oksidatif enerji üretimi sırasında oluşan toksik süperoksit radikallerinin hidrojen peroksit (H 2 O 2 ) ve moleküler oksijene (O 2 ) dismutasyonunu hızlandırır. Yöntemde, ksantin ve ksantin oksidaz (XOD) kullanılarak 2-[4-iyodofenil]-3-[4-nitrofenol]-5-feniltetrazoliyum klorid (INT) ile tepkimeye giren ve kırmızı renkli formazon boyası oluşturan süperoksit radikalleri üretilmektedir. Enzim aktivitesi ölçümü ise reaksiyonun 505 nm de ortamda bulunan SOD enzimi ile inhibisyonuna dayanır 86. XOD Ksantin -. Ürik asit + O 2 INT O 2 Formazon boyası veya SOD SOD O 2 O 2 + H 2 O 2 Ayıraçlar: 1. CAPS (3-(sikloheksilamino)-1-propan sülfonik asit) Tamponu 2. Stok substrat karışımı 3. Ksantin Oksidaz (80 Ü/L) 4. 0,01 M Fosfat Tamponu (ph: 7.0) 5. Standart (S 6 ) :5.4 Ü/ml SOD içeren ransod kitinin standartıdır. 41

51 Standart Eğri Çizimi: Liyofilize olarak hazırlanmış ayıraç 10 ml bidistile su ile sulandırılır. Standart eğri çiziminde kullanılacak olan diğer SOD derişimleri ise 0,01 M lık fosfat tamponu ile tabloda verildiği şekilde hazırlanır. Kullanılacak 0,01 M Fosfat SOD Derişimi Standart Tamponu (Ü/ml) S 5 5 ml S 6 5 ml 2,8 S 4 5 ml S 5 5 ml 1,4 S 3 5 ml S 4 5 ml 0,7 S 2 5 ml S 3 5 ml 0,23 Standart eğri çizimi için ayıraçlar 1 ml lik küvetlere tabloda belirtilen oranlarda ilave edilir. Kör (ml) Standart (ml) Standart - 0,05 Fosfat Tamponu 0,05 - Substrat Karışımı 1,7 1,7 Tüpler iyice karıştırılır Ksantin oksidaz 0,25 0,25 Tüpler iyice karıştırıldıktan 30 saniye sonra 37 o C, 505 nm dalga boyunda havaya karşı başlangıç absorbansı (A 1 ), 3 dakika sonra son absorbans (A 2 ) okunur. Hesaplama: Çalışma körü içinde SOD olmadığı için inhibisyona uğramamış reaksiyon olarak kabul edilir ve değeri %100 olarak alınır. Tüm standart ve örnekler için % inhibisyon değeri bunlara ait değerin çalışma körüyle oranlanarak 100 den çıkarılması sonucu hesaplanır. A/dak = A 2 A 1 3 dakika 42

52 % inhibisyon standart = A/dak standart x 100 A /dak çalışma körü Hesaplama yapıldıktan sonra eğride x yatay eksenine SOD derişimlerinin (Ü/ml) logaritmik dönüşüm değerleri, y dikey eksenine standartlara ait % inhibisyon değeri yazılarak standart eğri oluşturulur. SOD STANDART EĞRİSİ %inhibisyon ,8-0,6-0,4-0,2 0 0,2 0,4 0,6 0,8 log Ü/ml 43

53 Yöntem: Ayıraçlar 1 ml lik küvetlere tabloda verildiği oranlarda ilave edilir. Kör(ml) Örnek (ml) Hemolizat 0,05 Fosfat Tamponu 0,05 Substrat Karışımı 1,7 1,7 Tüpler İyice karıştırılır Ksantin Oksidaz 0,25 0,25 Tüpler iyice karıştırıldıktan 30 saniye sonra 37 o C, 505 nm dalga boyunda havaya karşı başlangıç absorbansı (A 1 ), 3 dakika sonra son absorbans olan (A 2 ) okunur. Hesaplama: Örneğe ait inhibisyon hesaplandıktan sonra standart eğriden inhibisyona karşılık gelen SOD değeri kullanılarak SOD aktivitesi hesaplanır. A/dak = A 2 A 1 3 dak % inhibisyon örnek = A örnek/dak x 100 A çalışma körü/dak SOD Spesifik Aktivitesi (Ü/gHb) = SOD Değeri (Ü/ml) Hemoglobin Değeri (g/dl) 44

54 3.3.8.Malondialdehid (MDA) Ölçüm Yöntemi Prensip: Lipid peroksidasyonu sonucu malondialdehit sekonder ürünü oluşur. Ölçümü aerobik şartlarda ph 3.4 te MDA nın 95 o C de tiyobarbitürik asit (TBA) ile inkubasyonu sonucu oluşan pembe renkli kompleksin 532 nm de absorbans ölçümü esasına dayanır 87. Ayıraçlar: 1. %8,1 lik SDS Sodyum Dodesil Sülfat (SDS) 8,1 g Saf suyla 100 ml ye tamamlanır. 2. %20 lik Asetik Asit (ph:3.5) Asetik asit 20 ml Saf su ile 100 ml ye tamamlanır. ph: 3,5 e doymuş NaOH ile ayarlanır. 3. %0,8 lik Tiyobarbitürik asit (ph:3,5) Tiyobarbitürik asit 0,8 g Saf su ile 100 ml ye tamamlanır. ph: 3,5 e doymuş NaOH ile ayarlanır 4. n-butanol/piridin (nbu/pi) çözeltisi n-butanol 15 ml Piridin 1 ml 5. Stok standart 1,1,3,3 tetramethoksipropan (yoğunluk = 0,99 g/ml) 45

55 Standart Eğri Çizimi: Günlük standart MDA stok standartından (1,1,3,3 tetramethoksipropan) 10 μl alınıp 100 ml ye saf su ile tamamlanarak hazırlanır. Eğri çizimi için günlük standarttan saf su ile 40,20,10,8,5,4 seyreltme yapılarak 15,30,60,75,121,151 n/mol derişiminde çalışma standartları hazırlanır. Ayıraçlar tüplere aşağıdaki gibi eklenir. Tüp No Kör Std (ml) - 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 SDS (ml) 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 HAc (ml) 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 TBA (ml) 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 Saf su(ml) 0,8 0,7 0,7 0,7 0,7 0,7 0,7 95 o C de 30 dakika inkube edilip, soğutulur. Saf su (ml) 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 nbu/pri (ml) 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 n-butanol/piridin eklendikten sonra çözeltiler vorteks kullanılarak karıştırılır, daha sonra 4000 rpm de 10 dakika santrifüj edilir.santrifüj sonrası üstteki organik kısım alınıp 532 nm de absorbans değeri okunur. Standart eğri grafiği derişimler nmol/ml biriminden hesaplanarak çizilir. 46

56 MDA STANDART EĞRİSİ 0,4 0,35 0,3 Optik Dansite (532 nm) 0,25 0,2 0,15 0,1 0, nmol/ml Yöntem: Ayıraçlar 3 santrifüj tüpüne tabloda belirtildiği gibi konur. Kör (ml) Örnek(ml) Plazma - - SDS 0,2 0,2 HAc 1,5 1,5 TBA 1,5 1,5 Saf su 0,8 0,7 95 o C de 30 dakika inkübe edilir, soğutulur. Saf su 1,0 1,0 nbu/pi 5,0 5,0 n-butanol/piridin eklendikten sonra çözeltiler vorteks kullanılarak karıştırılır, daha sonra 4000 rpm de 10 dakika santrifüj edilir. Santrifüj sonrası üstteki organik kısım alınıp 532 nm de absorbans okunur. 47

57 Hesaplama: 532 nm de okunan optik dansite standart eğriden karşılaştırılarak bulunup sonuç nmol/ml olarak hesaplanır Hemoglobin Tayini Prensip: Hemoglobin molekülündeki +2 değerlikli demir drabkin çözeltisindeki ferrosiyanür ile +3 değerliğe yükseltgenerek methemoglobine daha sonra potasyum siyanür ile kararlı bir bileşik olan siyanmethemoglobine dönüşür..siyanmethemoglobinin 540 nm dalga boyunda verdiği transmitans değeri ölçülerek hemoglobin (Hb) miktarı belirlenir 88. Ayıraçlar: 1. Drabkin Çözeltisi K 3 Fe(CN) 6 0,198 gr KCN 0,052 gr NaHCO 3 1,0 gr Saf su ile 1000 ml ye tamamlanır. Eğri çizimi için 2, 4, 8, 12, 18, 20 g/dl lik derişimlerde standartlar hazırlanarak 15 dakika oda ısında bekletilir. Spektrofotometrede 540 nm dalga boyunda tansmitans okunarak standart eğri çizilir. Yöntem: Çözeltiler tüplere aşağıdaki gibi konulur. Kör(ml) Örnek(µl) Drabkin Çözeltisi 5 5 Hemolizat

58 Tüpler 15 dakika oda ısısında bekletildikten sonra 540 nm de transmitans değeri okunarak standart eğriden hemoglobin (Hb) miktarı saptanır. 49

59 4. BULGULAR Beta Talasemi de oksidatif stres varlığının belirlenmesini amaçlayan bu çalışmada, hasta grubu örnekleri Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi Pediatrik Hematoloji Anabilim Dalı nda tanısı konulmuş, tedavi görmekte olan β-talasemi hastalarından, kontrol grubu örnekleri ise β-talasemi tanısı konulmamış çocukluk yaş grubu bireylerden toplanmıştır. Kanlar EDTA lı tüplere alınmış, her iki grubunda Coulter T-890 kan sayım cihazı ile hematolojik verileri belirlenmiştir(çizelge 4.1, 4.2) Yaşları 8-14 arası değişen 18 erkek 22 kız çocuktan toplanan kontrol grubu örneklerinin selüloz asetat elektroforezi ile hemoglobin tipleri belirlenmiş ve kontrol grubunda bulunan tüm örneklerin Hb AA olduğu saptanmıştır. Kontrol grubuna ait cinsiyet, yaş ve hematolojik veriler çizelge 4.1 de verilmiştir. Hasta grubunda bulunan 35 kan örneğinin 21 i erkek 14 ü kız çocuk olup yaşları 4-16 arasında değişmektedir. Kan örnekleri, düzenli olarak ayda bir transfüzyon alan hastalardan transfüzyondan hemen önce alınmıştır. Hasta grubuna ait cinsiyet, yaş ve hematolojik veriler çizelge 4.2 de verilmiştir. Kontrol ve hasta grubunun hematolojik verilerinin ortalaması, standart sapması, medianı, en büyük ve en küçük değerleri ise çizelge 4.3, 4.4 de verilmiştir. 50

60 Çizelge 4.1. Kontrol grubu hematolojik verileri No Olgu Cins Yaş Wbc (10 3 /µl) Rbc (10 6 /µl) Hb (g/dl) Hct (%) MCV (fl) MCH (pg) MCHC (g/dl) 1 K.T E 10 8,7 4, ,4 27,9 32,7 2 S.Ö E 13 5,8 4, ,9 25,5 32,3 3 A.T E 14 7,9 4, ,2 25,8 33,1 4 N.T E 12 7,6 4, ,8 27,7 33,4 5 A.B E 13 8,2 4, ,9 26,8 32,7 6 H.G K 13 8,9 4, ,1 32,7 7 B.G K 12 7,9 4, ,2 28,6 33,6 8 Y.Y K 11 8,7 4, ,8 27,4 33,1 9 H.B K 11 8,9 4, ,1 28,8 33,5 10 E.K K 11 9,6 4, ,2 28,3 33,2 11 A.S E , ,3 27,8 33,4 12 N.Ö K 13 9,2 4, ,8 30,4 33,9 13 Ü.Ç E 11 8,9 4, ,7 26,6 32,9 14 İ.Y E 11 5,2 4, ,2 27,3 33,6 15 R.A E 11 9,6 4, ,4 27,5 34,2 16 Ö.G E , ,6 28,2 33,7 17 Ö.K E , ,5 25,2 32,1 18 M.G K 13 7,1 4, ,4 27,4 32,8 19 M.B E 11 9,6 4, ,7 27,5 32,8 20 G.Y K 8 9,2 4, ,1 27,2 33,1 21 O.G E 11 6,6 4, ,9 28,5 33,5 22 H.Ö K 13 8, ,1 33,1 23 H.G K , ,7 28,5 33,6 24 M.T K , ,1 30,2 33,2 25 B.G K 14 6,8 4, ,5 27, E.C E 11 7, ,2 25,8 32,2 27 İ.T K 13 5,5 4, ,3 28,1 33,7 28 S.C K , , ,7 29 E.E K 10 7,6 4, ,6 27,3 33,1 30 A.N E 13 4,9 4, ,3 29,2 33,1 31 E.K E 13 6,1 4, ,6 33,7 32 D.B K , ,9 28,2 33,6 33 G.O E 11 7,6 4, ,8 34,3 34 T.T K 14 6,2 4, ,9 27,7 34,7 35 Ç.D K 11 7,1 4, ,3 28,6 34,3 36 A.N K 12 8,1 4, ,2 27,2 34,8 37 T.Y E 11 8,3 4, ,9 28,7 34,6 38 S.D K 10 5,2 3,3 9, ,6 29,2 34,5 39 E.S K 10 9,5 4, ,9 29,3 35,2 40 D.A K 11 4,9 4, ,5 28,8 33,7 51

61 Çizelge 4.2. Hasta grubu hematolojik verileri No Olgu Cins Yaş Wbc (10 3 /µl) Rbc (10 6 /µl) Hb (g/dl) Hct (%) MCV (fl) MCH (pg) MCHC (g/dl) 1 F.M K 5 6,4 3,1 7, ,1 23,9 31,4 2 B.O K 8 37,8 2,2 6, ,5 28,3 32,7 3 Ç.E E 9 22,5 3 8, ,3 27,9 33,1 4 G.Ö K 11 5,8 3, ,7 27,7 33,9 5 F.İ K 15 3,8 2,6 7, ,4 28,3 34,8 6 S.Y K 8 6 1,7 5, ,3 31,7 35,9 7 O.K E 6 4,2 1,8 4, ,8 26,8 35,4 8 H.U E 16 54,9 2,3 6, ,1 28,9 32,4 9 M.Y E 16 21,8 2,5 6, ,7 25,6 30,5 10 B.Y E 11 7,5 2,4 6, ,7 26,5 35,5 11 H.İ E 16 18,5 2,3 6, ,1 28,8 32,3 12 M.K K 16 11,7 2,4 6, ,6 28,5 33,2 13 E.A E 15 3,9 1,9 5, ,2 34,5 14 E.K K 13 80,7 2,5 6, ,2 25,7 30,5 15 F.Ç K 15 42,3 2,3 6, ,5 27,4 32,8 16 A.K E 10 10,3 3 7, ,7 24,6 34,3 17 Y.K E 8 5 3,1 6, ,8 20,9 32,3 18 O.K E 11 7,5 1,7 4, ,8 28,5 30,8 19 A.T E 9 6,8 2,9 7, ,2 26,3 32,8 20 T.D K 8 5,7 3, ,2 27,7 34,5 21 T.B K 7 3,7 2,2 6, ,4 28,3 33,5 22 B.Ö E 7 4,3 1, ,2 25,5 34,9 23 S.A E , ,3 34,1 24 Ü.Ç E ,7 7, ,2 29, M.T E 6 4, ,2 27,5 33,1 26 D.Ö K 16 5,9 1,7 4, ,8 26,2 32,9 27 E.N K 4 7,3 2,7 7, ,5 27, E.Y K 15 8,1 2,7 7, ,2 27,3 34,1 29 E.B K , ,8 28,2 30,1 30 C.B E 6 5,6 2,5 6, ,5 27,8 30,4 31 H.S E ,4 6, ,2 28,9 34,7 32 S.K E 8 6 3,1 6, ,8 21,2 38,3 33 İ.D E 8 15,9 1,9 6, ,3 31,9 34 M.E E 10 63,8 2,2 6, ,4 30,7 35,9 35 H.S E 6 25,2 3,4 9, ,4 27,5 33,1 52

62 Çizelge 4.3. Kontrol grubu hematolojik verilerinin istatistiksel sonuçları Yaş Wbc (10 3 /µl) Rbc (10 6 /µl) Hb (g/dl) Hct (%) MCV (fl) MCH (pg) MCHC (g/dl) Ortalama 11,7 7,6 4,5 12,5 37,2 83,3 27,8 33,4 Medyan 11 7,9 4,5 12,5 37,8 83,3 27,8 33,4 Maksimum 14 9,6 5, , ,4 35,2 Minimum 8 4,9 3,3 9,6 27, ,2 32,1 SD 1,5 1,4 0,3 0,9 2,7 3,3 1,2 0,7 Çizelge 4.4. Hasta grubu hematolojik verilerinin istatistiksel sonuçları Yaş Wbc (10 3 /µl) Rbc (10 6 /µl) Hb (g/dl) Hct (%) MCV (fl) MCH (pg) MCHC (g/dl) Ortalama 10,5 15,3 2,5 6,8 20,8 82,9 27,4 33,3 Medyan 10 6,8 2,4 6,7 20,4 83,5 27,7 33,1 Maksimum 16 80, ,5 104,4 33,3 38,3 Minimum 4 2 1,6 4 11,4 64,8 20,9 30,1 SD 3,9 18,7 0,7 1,8 5,2 7,3 2,4 1,8 Kontrol ve hasta grubu hematolojik verileri ve yaşları istatistiksel açıdan karşılaştırıldığında yaşları, MCV, MCH, MCHC değerleri arasında anlamlı bir fark gözlenmezken Wbc, Rbc, Hb, Hct değerleri arasında anlamlı farklar gözlenmiştir. Bu farklar ileride daha detaylı olarak belirtilecektir (Çizelge 4.18). Kontrol ve hasta grubunda bulunan erkek ve kız çocukların hematolojik verileri ve bunların istatistiksel çalışmaları ise çizelge 4.5, 4.10 arasında verilmiştir. 53

63 Çizelge 4.5. Kontrol grubunda bulunan erkek çocukların hematolojik verileri Olgu Cins Yaş Wbc (10 3 /µl) Rbc (10 6 /µl) Hb (g/dl) Hct (%) MCV (fl) MCH (pg) MCHC (g/dl) 1 K.T E 10 8,7 4,57 12,8 39,1 85,4 27,9 32,7 2 S.Ö E 13 5,8 4,85 12,4 38,3 78,9 25,5 32,3 3 A.T E 14 7,9 4,34 11,2 33,9 78,2 25,8 33,1 4 N.T E 12 7,6 4,6 12,8 38,1 82,8 27,7 33,4 5 A.B E 13 8,2 4,76 12, ,9 26,8 32,7 6 G.O E 11 7,6 4,34 11,6 33, ,8 34,3 7 A.S.Y E ,8 13, ,3 27,8 33,4 8 Ü.Ç E 11 8,9 4,92 13,1 39,7 80,7 26,6 32,9 9 İ.Y E 11 5,2 4,52 12,3 36,7 81,2 27,3 33,6 10 R.A E 11 9,6 4,6 12, ,4 27,5 34,2 11 Ö.G E ,43 12, ,6 28,2 33,7 12 Ö.K E ,07 12,8 39,8 78,5 25,2 32,1 13 M.B E 11 9,6 4,65 12,8 38,9 83,7 27,5 32,8 14 O.G E 11 6,6 4,28 12,2 36,4 84,9 28,5 33,5 15 E.C E 11 7,2 4,97 12,8 39,9 80,2 25,8 32,2 16 T.Y E 11 8,3 4,83 13, ,9 28,7 34,6 17 A.N.E E 13 4,9 4,33 12,7 38,2 88,3 29,2 33,1 18 E.K E 13 6,1 4,8 13,2 39, ,6 33,7 Çizelge 4.6. Kontrol grubunda bulunan erkek çocukların hematolojik verilerinin istatistiksel sonuçları Wbc (10 3 /µl) Rbc (10 6 /µl) Hb (g/dl) Hct (%) MCV (fl) MCH (pg) MCHC (g/dl) Ortalama 7,6 4,7 12,7 38, ,2 33,2 Medyan 7,8 4,6 12,7 38, ,5 33,3 Maksimum 9,6 5,1 13, ,3 29,8 34,6 Minimum 4,9 4,3 11,2 33, ,2 32,1 SD 1,4 0,2 0,6 1,9 2,7 1,1 0,7 54

64 Çizelge 4.7. Kontrol grubunda bulunan kız çocukların hematolojik verileri Olgu Cins Yaş Wbc (10 3 /µl) Rbc (10 6 /µl) Hb (g/dl) Hct (%) MCV (fl) MCH (pg) MCHC (g/dl) 1 H.G K 13 8,9 4, , ,1 32,7 2 B.G K 12 7,9 4,17 11,9 35,5 85,2 28,6 33,6 3 Y.Y K 11 8,7 4,82 13,2 39,9 82,8 27,4 33,1 4 H.B K 11 8,9 4,27 12,3 36,8 86,1 28,8 33,5 5 E.K K 11 9,6 4,47 12,6 38,1 85,2 28,3 33,2 6 N.Ö K 13 9,2 4,1 12,5 36,8 89,8 30,4 33,9 7 T.T K 14 6,2 4, ,5 79,9 27,7 34,7 8 M.G K 13 7,1 4,5 12,3 37,5 83,4 27,4 32,8 9 G.Y K 8 9,2 4,19 11,4 34,4 82,1 27,2 33,1 10 H.Ö K 13 8,2 3,97 11,2 33, ,1 33,1 11 Ç.D K 11 7,1 4,14 11,8 34,5 83,3 28,6 34,3 12 H.G K , ,7 84,7 28,5 33,6 13 M.T K ,27 12,9 38,9 91,1 30,2 33,2 14 B.G K 14 6,8 4,84 13,2 39,9 82,5 27, A.N K 12 8,1 4, ,4 78,2 27,2 34,8 16 İ.T K 13 5,5 4,1 11,5 34,1 83,3 28,1 33,7 17 S.C K ,18 11,7 35,7 85, ,7 18 E.E K 10 7,6 4,36 11, ,6 27,3 33,1 19 S.D K 10 5,2 3,28 9,6 27,8 84,6 29,2 35,5 20 H.S K 10 9,5 4, ,2 81,9 29,3 35,2 21 D.B K ,86 13,7 40,7 83,9 28,2 33,6 22 D.A K 11 4,9 4,28 12,4 36,6 85,5 28,8 33,7 Çizelge 4.8. Kontrol grubunda bulunan kız çocukların hematolojik verilerinin istatistiksel sonuçları Wbc (10 3 /µl) Rbc (10 6 /µl) Hb (g/dl) Hct (%) MCV (fl) MCH (pg) MCHC (g/dl) Ortalama 7,7 4,3 12,3 36,7 84,5 28,4 33,5 Medyan 8 4,3 12,3 36,7 84,2 28,3 33,5 Maksimum 9,6 4,9 42,9 42, ,4 35,2 Minimum 4,9 3,3 9,6 27,8 78,2 27,2 32,7 SD 1,4 0,4 1,0 3,2 3,3 0,9 0,7 Kontrol grubunda bulunan erkek ve kız çocukların hematolojik verileri istatistiksel çalışmalarla karşılaştırıldığında Rbc, MCV, MCH değerleri arasında anlamlı farklar gözlenirken Wbc, Hb, Hct, MCHC değerleri arasında ise anlamlı farklar gözlenmemiştir. 55

65 Çizelge 4.9. Hasta grubunda bulunan erkek çocukların hematolojik verileri Olgu Cins Yaş Wbc (10 3 /µl) Rbc (10 6 /µl) Hb (g/dl) Hct (%) MCV (fl) MCH (pg) MCHC (g/dl) 1 Ç.E E 9 22,5 2,96 8,2 24,9 84,3 27,9 33,1 2 O.K E 6 4,2 1,84 4, ,8 26,8 35,4 3 H.U E 16 54,9 2,25 6, ,1 28,9 32,4 4 M.Y E 16 21,8 2,51 6, ,7 25,6 30,5 5 B.Y E 11 7,5 2,37 6,3 17,7 74,7 26,5 35,5 6 H.İ.Y E 16 18,5 2,33 6,7 20,8 89,1 28,8 32,3 7 E.A E 15 3,9 1,93 5,1 14, ,2 34,5 8 A.K E 10 10,3 3 7,4 21,5 71,7 24,6 34,3 9 Y.K E 8 5 3,09 6, ,8 20,9 32,3 10 O.K E 11 7,5 1,6 4,7 15,4 92,8 28,5 30,8 11 A.T E 9 6,8 2,92 7,7 23,4 80,2 26,3 32,8 12 B.Ö E 7 4,3 1, ,4 73,2 25,5 34,9 13 S.A E , , ,3 34,1 14 Ü.Ç E ,7 7,9 23,8 88,2 29, M.T E 6 4,4 4, ,5 83,2 27,5 33,1 16 C.B E 6 5,6 2,45 6,8 22,4 91,5 27,8 30,4 17 H.S E ,37 6,8 19,7 83,2 28,9 34,7 18 S.K E 8 6 3,11 6,6 23,3 74,8 21,2 28,3 19 İ.D E 8 15,9 1,91 6,3 19,9 104,4 33,3 31,9 20 M.E E 10 63,8 2,24 6,9 19,1 85,4 30,7 35,9 21 H.S E 6 25,2 3,4 9,6 28,9 84,4 27,5 33,1 Çizelge Hasta grubunda bulunan erkek çocukların hematolojik verilerinin istatistiksel sonuçları Wbc (10 3 /µl) Rbc (10 6 /µl) Hb (g/dl) Hct (%) MCV (fl) MCH (pg) MCHC (g/dl) Ortalama 14,3 2,6 6,9 21,1 82,7 27,2 33,5 Medyan 6,8 2,4 6,7 20,4 83,7 27,5 33,1 Maksimum 63, ,5 104,4 33,3 38,3 Minimum 2 1,6 4 11,4 64,8 20,9 30,4 SD 16,5 0,8 2,0 6,1 8,8 2,8 1,9 56

66 Çizelge Hasta grubunda bulunan kız çocukların hematolojik verileri Olgu Cins Yaş Wbc (10 3 /µl) Rbc (10 6 /µl) Hb (g/dl) Hct (%) MCV (fl) MCH (pg) MCHC (g/dl) 1 F.M K 5 6,4 3,09 7,4 23,5 76,1 23,9 31,4 2 B.O K 8 37,8 2,21 6,3 19,2 86,5 28,3 32,7 3 G.Ö K 11 5,8 3, ,4 81,7 27,7 33,9 4 F.İ K 15 3,8 2,62 7,4 21,3 81,4 28,3 34,8 5 S.Y K 8 6 1,68 5,3 14,8 88,3 31,7 35,9 6 M.K K 16 11,7 2,35 6,7 20,1 85,6 28,5 33,2 7 E.K K 13 80,7 2,48 6,4 20,9 84,2 25,7 30,5 8 F.Ç K 15 42,3 2,33 6,4 19,5 83,5 27,4 32,8 9 T.D K 8 5,7 3, ,1 80,2 27,7 34,5 10 T.B K 7 3,7 2,21 6,3 18,7 84,4 28,3 33,5 11 D.Ö K 17 5,9 1,65 4,3 13,2 79,8 26,2 32,9 12 E.N.S K 4 7,3 2,66 7,2 21,9 82,5 27, E.Y K 15 8,1 2,67 7,3 21,4 80,2 27,3 34,1 14 E.B K ,98 5,6 18,6 93,8 28,2 30,1 Çizelge Hasta grubunda bulunan kız çocukların hematolojik verilerinin istatistiksel sonuçları Wbc Rbc Hb Hct MCV MCH MCHC (10 3 /µl) (10 6 /µl) (g/dl) (%) (fl) (pg) (g/dl) Ortalama 16,8 2,5 6,7 20,4 83,4 27,6 33,1 Medyan 6,9 2,4 6,6 20, ,7 33,1 Maksimum 80,7 3,3 9 26,4 93,8 31,7 35,9 Minimum 3,7 1,7 4,3 13,2 76,1 23,9 30,1 SD 22,1 0,5 1,3 3,7 4,3 1,7 1,6 Hasta grubunda bulunan kız ve erkek çocukların hematolojik verileri istatistiksel açıdan karşılaştırıldığında parametreler arasında anlamlı bir fark gözlenmemiştir. İleride yapılacak antioksidan sistem çalışmalarının tekrarlanabilirlik ve güvenilirlik sınırlarının belirlenmesi için rastgele seçilen sağlıklı örnekler üzerinde çalışmalar yapılmış, sonuçları çizelge 4.13 de gösterilmiştir. Yöntemin güvenilirliği için CV nin %5 in altında olması beklenir, ancak laboratuar ölçümlerinde CV nin üst sınırı %10 dur

67 Çizelge Eritrositlerde antioksidan sistemde bulunan enzim düzeylerinin ve MDA ölçümünde kullanılan yöntemlerin tekrarlanabilirliği MDA (nmol/ml) SOD (Ü/gHb) CAT (x10 3 Ü/gHb) GSH-Rd (Ü/gHb) GSH-Px (Ü/gHb) GST (Ü/gHb) 1 2, ,22 28,6 4,1 2 2, ,15 29, , ,44 28,8 3,8 4 2, ,18 30,5 3,3 5 2, ,59 29,7 3,4 6 2, ,27 32,2 3,5 7 2, ,56 29,3 3,1 8 2, ,3 29,5 3,5 9 2, ,32 28,9 3,5 10 2, ,36 30,1 3,1 % CV 3,2 1,68 2,8 2,05 3,5 8,6 x ± SD 2,1±0, ±24 443±12,5 7,34±0,15 29,7±1,06 3,5 ± 0,3 Hasta ve kontrol grubunda çalışılan antioksidan sisteme ait enzimlerden SOD, CAT, GSH-Px, GSH-Rd, GST enzim aktiviteleri ve MDA düzeyleri ve bunların istatistiksel sonuçları çizelge arasında verilmiştir. 58

68 Çizelge Kontrol grubunda eritrositlerde ölçülen antioksidan enzimler ve MDA düzeyleri No Olgu Cins Yaş MDA (nmol/m l) SOD (Ü/gHb) CAT (10 3 Ü/gHb) GSH-Px (Ü/gHb) GSH-Rd (Ü/gHb) 1 K.T E 10 4, ,3 5,7 1,7 2 S.Ö E 13 3, ,7 11,2 3,8 3 A.T E 14 3, ,9 14,4 1,1 4 N.T E 12 2, ,2 6 2,6 5 A.B E 13 2, ,1 15,1 1,9 6 H.G K 13 2, ,4 8 0,4 7 B.G K ,2 14 4,1 8 Y.Y K 11 3, ,4 10,6 2,3 9 H.B K 11 2, ,7 0,2 10 E.K K 11 3, ,2 0,1 11 A.S E 14 3, ,7 12,9 2,9 12 N.Ö K 13 2, ,1 13,1 1,2 13 Ü.Ç E 11 2, ,1 12,6 4,1 14 İ.Y E ,4 12 2,4 15 R.A E 11 1, ,4 11,7 2,7 16 Ö.G E 10 2, ,8 19,1 1,8 17 Ö.K E 12 2, ,5 21,2 2,7 18 M.G K 13 3, ,1 5,7 1,6 19 M.B E 11 2, ,2 9,2 3,2 20 G.Y K ,1 13,2 3,3 21 O.G E 11 3, ,1 12,9 3,2 22 H.Ö K 13 5, ,3 12 1,6 23 H.G K 10 2, ,4 4,3 3,2 24 M.T K 14 2, ,4 9, B.G K 14 4, ,1 14, E.C E 11 2, ,3 11 3,4 27 İ.T K 13 2, ,9 11,6 2,2 28 S.C K 13 3, ,1 7,3 4,5 29 E.E K 10 3, ,6 6,3 0,6 30 A.N E 13 2, ,9 12,1 2,1 31 E.K E 13 2, ,4 8 4,4 32 D.B K 11 3, ,7 13,3 4,5 33 G.O E 11 2, ,9 6,6 4,6 34 T.T K ,4 7,9 5,1 35 Ç.D K ,6 9,2 3,3 36 A.N K ,8 1,8 37 T.Y E ,8 9 3,4 38 S.D K 10 0, ,9 8,5 5,1 39 E.S K ,4 9,2 4,9 40 D.A K 11 1, ,7 GST (Ü/gHb) 59

69 Çizelge Hasta grubunda eritrositlerde ölçülen antioksidan enzimler ve MDA düzeyleri No Olgu Cins Yaş MDA (nmol/ml) SOD (Ü/gHb) CAT (x10 3 Ü/gHb) GSH-Px (Ü/gHb) GSH-Rd (Ü/gHb) GST (Ü/gHb) 1 F.M K 5 1, ,5 11,7 1,5 2 B.O K 8 1, ,3 10 6,3 3 Ç.E E 9 1, ,7 11 2,4 4 G.Ö K ,3 14 2,9 5 F.İ K 15 3, ,8 7,5 6,2 6 S.Y K 8 3, ,2 13,1 6,3 7 O.K E 6 2, ,4 11,1 4,2 8 H.U E 16 3, ,7 12,6 4,8 9 M.Y E 16 4, ,9 12,6 9,4 10 B.Y E 11 2, ,8 9,4 1,1 11 H.İ E 16 2, ,4 4,6 1,2 12 M.K K 16 1, ,1 11,7 1,9 13 E.A E 15 2, ,9 9,3 5,3 14 E.K K 13 2, ,6 10 7,8 15 F.Ç K 15 3, ,4 10,3 1,3 16 A.K E 10 2, ,7 2,5 17 Y.K E 8 2, ,5 9,7 0,8 18 O.K E ,1 8,2 1,2 19 A.T E 9 4, ,7 9,2 2,5 20 T.D K 8 2, ,9 9, T.B K 7 2, ,3 8,5 1,5 22 B.Ö E 7 1, ,9 9, S.A E 10 3, ,1 9,5 1,5 24 Ü.Ç E ,7 18 1,7 25 M.T E ,2 10,6 1,6 26 D.Ö K 16 4, ,3 10,3 2,5 27 E.N K ,4 8,9 2,7 28 E.Y K 15 3, ,2 10, E.B K 16 3, ,7 10,9 1,7 30 C.B E 6 3, ,6 9, H.S E 11 2, ,5 6,2 4,5 32 S.K E 8 3, ,1 9 3,1 33 İ.D E 8 2, ,9 5,7 3,5 34 M.E E ,8 6,6 1,5 35 H.S E 6 1, ,3 7,1 1,4 60

70 Çizelge Kontrol grubunda eritrositlerde ölçülen antioksidan enzimler ve MDA düzeylerinin istatistiksel verileri MDA (nmol/ml) SOD (Ü/gHb) CAT (x10 3 Ü/gHb) GSH-Px (Ü/gHb) GSH-Rd (Ü/gHb) GST (Ü/gHb) Ortalama 2,5 873,6 522,5 42,8 10,6 2,8 Medyan 2, ,3 44,2 10,8 2,9 Maksimum 5, ,1 82,5 21,2 5,7 Minimum ,7 8,4 4,3 0,1 SD 1,4 185,8 188,1 17,5 3,5 1,4 Çizelge Hasta grubunda eritrositlerde ölçülen antioksidan enzimler ve MDA düzeylerinin istatistiksel verileri MDA (nmol/ml) SOD (Ü/gHb) CAT (x10 3 Ü/gHb) GSH-Px (Ü/gHb) GSH-Rd (Ü/gHb) GST (Ü/gHb) Ortalama 3 921,1 591,6 44,5 10 3,1 Medyan 2, ,1 46,7 9,9 2,5 Maksimum 4, ,5 72,7 18 9,4 Minimum 1, ,1 17,9 4,6 0,8 SD 0,9 211,2 123,9 13,2 2,6 2,1 Çizelge 4.18 de hematolojik verilerin istatistiksel olarak karşılaştırılmasında MCV,MCH, MCHC hariç diğer hematolojik parametreler arasında anlamlı farklar gözlenmiştir. Wbc hasta grubunda yüksek iken Hb, Hct, Rbc de kontrol grubunda yüksek olarak belirlenmiştir. Çizelge 4.19 da verilen antioksidan enzim sistemi ve MDA düzeyinde hasta grubu ile kontrol grubu arasında anlamlı fark gözlenmemiştir. Çizelge Kontrol ve hasta grubunun hematolojik verilerinin ortalama, standart sapma değerleri ve iki grup arasındaki ilişki Kontrol Hasta p X ± SD X ± SD Wbc (10 3 /µl) 7,6 ± 1,4 15,3 ± 18,7 0,020 Rbc (10 6 /µl) 4,5 ± 0,3 2,5 ± 0,7 0,000 Hb (g/dl) 12,5 ± 0,8 6,9 ± 1,8 0,000 Hct (%) 37,3 ± 2,7 20,8 ± 5,2 0,000 MCV (fl) 83,3 ± 3,2 83 ± 7,3 0,797 MCH (pg) 27,8 ± 1,2 27,4 ± 2,4 0,274 MCHC (g/dl) 33,4 ± 0,7 33,3 ± 1,8 0,752 p<0,05 istatistiksel anlamlı farklılık gösterir. 61

71 Çizelge Kontrol ve hasta grubunun antioksidan enzimleri ve MDA değerlerinin ortalama, standart sapma değerleri ve iki grup arasındaki ilişki Kontrol Hasta p X ± SD X ± SD MDA(nmol/ml) 2,5 ± 1,4 3 ± 0,9 0,115 SOD (Ü/gHb) 873,7 ±185,9 921 ± 211,2 0,303 CAT (x10 3 Ü/gHb) 522,5 ± 188,1 591,6 ± 123,8 0,068 GSH-Px (Ü/gHb) 42,8 ±17,5 44,5 ± 13,2 0,635 GSH-Rd (Ü/gHb) 10,7 ± 3,5 10 ± 2,6 0,373 GST (Ü/gHb) 2,9 ± 1,4 3,1 ± 2 0,569 p<0,05 istatistiksel anlamlı farklılık gösterir. Şekil 4.1.Kontrol grubu ve hasta grubu SOD değerlerinin karşılaştırılması 62

72 Şekil 4.2.Kontrol grubu ve hasta grubu CAT değerlerinin karşılaştırılması Şekil 4.3.Kontrol grubu ve hasta grubu GST değerlerinin karşılaştırılması 63

73 Şekil 4.4.Kontrol grubu ve hasta grubu GSH-Px değerlerinin karşılaştırılması Şekil 4.5.Kontrol grubu ve hasta grubu GSH-Rd değerlerinin karşılaştırılması 64

74 Şekil 4.6.Kontrol grubu ve hasta grubu MDA değerlerinin karşılaştırılması Şekil 4.7.Kontrol grubu ve hasta grubu Wbc verilerinin karşılaştırılması 65

75 Şekil.4.8.Kontrol grubu ve hasta grubu Rbc verilerinin karşılaştırılması Şekil.4.9.Kontrol grubu ve hasta grubu Hb verilerinin karşılaştırılması 66

76 Şekil.4.10.Kontrol grubu ve hasta grubu Hct verilerinin karşılaştırılması Şekil.4.11.Kontrol grubu ve hasta grubu MCV verilerinin karşılaştırılması 67

77 Şekil.4.12.Kontrol grubu ve hasta grubu MCH verilerinin karşılaştırılması Şekil.4.13.Kontrol grubu ve hasta grubu MCHC verilerinin karşılaştırılması 68

78 5. TARTIŞMA Reaktif oksijen türleri, oksidatif fosforilasyon, mitokondrial elektron transportu, ksenobiotik metabolizması ve inflamasyon gibi hücre süreçlerinin bir parçası halinde devamlı olarak oluşturulurlar. Hücresel antioksidan savunma sisteminin serbest radikalleri toksik eşiğin altında tutmakta ki yetersizliği veya oksidatif stres durumu hücre içi reaktif oksijen türleri seviyesinin artmasına neden olur 7. Reaktif oksijen türleri DNA, protein, karbohidrat, lipit gibi önemli makromoleküller ile gelişigüzel reaksiyona girerek fizyolojik sürecin bozulmasına neden olan yüksek reaktif moleküllerdir 8. Oksidatif stres ve oksidatif hasar, özgün kanserler, kardiovasküler hastalıklar, nörodejeneratif hastalıklar gibi birçok patofizyolojik sürecin erken evrelerinde önemli rol oynar. Oksidatif stres enzimatik, nonenzimatik pek çok antioksidan savunma sistemleriyle önlenebilmektedir 9. Talasemi otozomal resesif geçiş gösteren heterozigot formda taşıyıcılığa, homozigot formda hastalığa yol açan kronik hemolitik bir anemidir. 57 Globin zincirlerinin yapımındaki şiddetli dengesizlikler farklı talasemi fenotiplerinin ortaya çıkmasına yol açar. Talasemik eritrositlerin serbest radikallerle olusan oksidatif hasarı, lipid peroksidasyonu ve demir toksisitesi ile belirlenmiştir 37, 76. Çalışmamızda hasta grubunda 21 erkek, 14 kız çocuk olup yaşları 4-16 arasında, kontrol grubunda ise 18 erkek 22 kız çocuğunun yaşları 8-14 arasında değişmektedir. Çalışmamızda MCV, MCH, MCHC parametrelerinde anlamlı fark gözlenmemiş bunun sebebinin düzenli transfüzyon, ilaç tedavisine bağlı olduğu düşünülmektedir. Antioksidan sistem incelenmesi amacıyla her iki grupta da önemli antioksidan enzimler olan SOD, CAT, GSH-Px, GSH-Rd, GST enzimleri çalışılmış ve iki grup sonuçları istatistiksel olarak karşılaştırılmıştır. Meral ve arkadaşları beta talasemi major ve demir eksikliği olan çocuklarda yaptığı çalışmada beta talasemi grubunun MDA değerini demir eksikliği kontrol grubu 69

79 olguları ile karşılaştırdığında anlamlı büyük bulmuş, demir eksikliği olgularında ise MDA değerini kontrol grubu ile karşılaştırdığında anlamlı düşük bulmuştur 81. Yine Meral ve arkadaşlarının beta talasemili ve demir eksikliği olan çocuklarda yaptığı çalışmada eritrosit antioksidan enzimlerinden SOD aktivitesini beta talasemi grubunda diğer her iki gruba göre anlamlı yüksek bulmuştur. GSH-Px aktivitesi ise demir eksikliği olgularıyla karşılaştırıldığında anlamlı yüksek bulunurken, kontrol grubuyla anlamlı bir fark gözlenmemiştir 81. Asma Kassab-Chekir ve arkadaşlarının beta talasemili çocuklarda yaptığı çalışmada MDA düzeyi kontrol grubuna göre yüksek bulunurken eritrosit SOD ve GSH-Px enzim aktiviteleri de kontrol grubuna göre yüksek bulunmuştur. Bunun yanında MDA yapımının yüksekliği enzimlerin serbest radikallere yeterince karşı gelemediğini düşündürmektedir 76. GSH-Px aktivitesi için benzer bir sonuçta Suthutvoravut ve arkadaşlarının yaptığı çalışmada belirtilmiştir. Talasemili çocuk olgularda yapılan çalışmada GSH-Px aktivitesinde yükseklik gözlenmiştir 90 Chakraborty ve arkadaşlarının beta talasemi olgularında yaptığı çalışmada eritrosit GSH-Px, SOD, GSH-Rd ve G6PD enzim aktivitelerinin talasemi taşıyıcılarına ve kontrol grubuna göre anlamlı artış gösterdiğini bulmuştur. Bunun yanında CAT,GST aktivitesinde ve MDA düzeylerinde gruplar arasında anlamlı fark gözlenmemiştir. Bu çalışmada GSH-Rd ve G6PD enzim aktivitelerinin artışı normal enzim içeriğinin GSH rejenerasyonu için yeterli gelmediği yorumu yapılmıştır. SOD enzim aktivitesi artışı ile süperoksit radikali temizlenirken hidrojen peroksit oluşmaktadır. Buna bağlı olarak GSH-Px enzim aktivitesi artmakta ancak CAT aktivitesi artışı gözlenmemektedir. Oksidatif stres düşünülmesine rağmen MDA da anlamlı fark gözlenmemesi ise oksidatif hasar gören hücrelerin sirkülasyondan uzaklaştırılmasından kaynaklandığını düşündürmüştür 75. Cighetti ve arkadaşlarının yaptığı çalışmada MDA düzeyi talasemi majorlü olgularda talasemi intermedia olgularına göre yüksek bulunmuştur. MDA düzeyi, talasemi majorlerde serum demiri ile pozitif korelasyon gösterirken talasemi intermedia da anlamlı fark gözlenmemiştir 37. Gerli ve arkadaşları talasemi majör ve minörlü hastalarda SOD, CAT ve GSH- Px enzim aktivitelerini incelemişlerdir. Yaptıkları çalışmada talasemi minörlü olgularda 70

80 enzim aktivitelerini yüksek bulurken, talasemi majörlü olgularda enzim aktivitelerini normal eritrosit değerlerinde bulmuşlardır. Bu bulgularla, minörlü hastalarda devamlı oksidatif strese maruz kalmanın antioksidan enzim düzeylerini arttırdığını, talasemi majörlü hastalarda ise düzenli transfüzyondan dolayı sirkülasyonda normal eritrositlerin bulunduğu bu nedenle enzim aktiviteleride artış gözlenmediği düşüncesini ortaya atmışlardır 91. Vives, Miguel-Garcia ve arkadaşlarının beta talasemi, demir eksikliği anemisi ve delta beta talasemi taşıyıcılarında yapmış olduğu çalışmada MDA yapımında ve SOD, GSH-Px enzim aktivitelerinde beta talasemi grubunda diğer iki gruba göre artış olduğunu belirlemişlerdir 92. Ponnazhagan ve Sarkar yaptığı çalışmada homozigot ve heterozigot talasemi gruplarında GSH miktarı GSH-Rd, GSH-Px ve G6PD enzim aktivitelerine bakmışlar, homozigot beta talasemi grubunda GSH ve enzim aktivitelerinde anlamlı artış gözlemişler, bununla birlikte heterozigot beta talasemilerde GSH miktarı artarken enzimler için aynı artış gözlenmemiştir 93. Livrea ve arkadaşları beta talasemi majorlü hastalarda MDA düzeyinde iki kata varan artış olduğunu ve MDA düzeyinin serum ferritin seviyesiyle pozitif korelasyon gösterdiğini belirtmiştir 94. Ünal çalışmasında beta talasemi, G6PD ve demir eksikliği anemisi gruplarını karşılaştırmıştır. Sonuçta beta talasemi grubunun SOD enzim düzeyi kontrol grubuna göre farklı bulunmazken MDA düzeyi kontrol grubuna göre anlamlı yüksek bulmuştur 31. Yüzbaşıoğlu çalışmasında beta talasemi ve demir eksikliği anemisi olan olguları kullanmış, kullandığı olguların MDA düzeyinde kontrol grubuna göre anlamlı bir fark gözlememiştir 95. Corrons ve arkadaşları SOD aktivitesini talasemi grubunda demir eksikliği anemisi grubuna göre yüksek olduğunu GSH-Px aktivitesinde fark gözlenmediğini belirtmişlerdir 96. Cappellini ve arkadaşlarının talasemi intermedia olgularıyla yaptığı çalışmada MDA düzeyinin kontrol grubuna göre yüksek bulunduğunu, splenektomi olan talasemi intermedialar ile splenektomi olmayan olgular arasında ise MDA düzeyinde anlamlı fark bulunmadığını belirtmiştir

81 Beta talasemi majör olgularında yapılan literatür çalışmalarının bazıları SOD enzim düzeyini yüksek bazıları da normal sınırlarda bulmuşlardır. Yine bazı çalışmalar GSH-Px ve GSH-Rd enzim düzeylerinin artışını gösterirken bazı çalışmalar kontrol grubuyla fark göstermediğini belirtmiştir. Çalışmalarda bu antioksidan enzimlerin oksidatif durum beklenen beta talasemi majör olgularında artmayışının düzenli transfüzyonla kazanılan normal eritrositlerden kaynaklandığını belirtmişlerdir. Oksidatif stres olmasına ve SOD enzim düzeyinin artmasına karşın bazı çalışmalarda CAT ve GST enzim düzeylerinde değişiklik gözlenmemiştir. Oysa ki beklenen, SOD artışı ile oluşan H 2 O 2 ve oksidatif stresle oluşan toksik bileşiklerdeki artışa karşın bu enzim aktivitelerinin yükselmesidir. Lipit peroksidasyonu ürünü olan MDA düzeyinin yapılan birçok çalışmada kontrol grubuna göre artış gösterdiği belirtilmiştir. Chakraborty ve arkadaşlarının yaptığı çalışmada MDA düzeyinde anlamlı fark gözlenmemesi, MDA nın yüksek reaktif olan karbonil gruplarının protein ve fosfolipitlerin amino gruplarıyla çapraz bağ oluşturabileceği ve oluşan bu çapraz bağlardan sonra eritrosit membranının sertleşip ve dalakta yıkılacağı şeklinde açıklanmıştır. Talasemili olgularda yapılan çalışmalarda Meral, Asma Kassab-Chekir, Suthutvoravutı, Chakraborty, Vives, Miguel-Garcia ve arkadaşları GSH-Px enzim aktivitesinde kontrol grubuna göre anlamlı fark gözlerlerken, Gerli, Corrons ve arkadaşları yaptığımız çalışmaya benzer sonuçlar elde etmiş kontrol grubu ile talasemi grubu arasında anlamlı fark gözlememişlerdir. Yapılan literatür taramasında talasemi majorlü olgularda CAT ve GST enzim aktiviteleri normal eritrosit değerlerinde bulunmuştur. Yaptığımız çalışmada ise CAT, GST enzim aktivitelerinde hasta ve kontrol grubu arasında anlamlı bir fark gözlenmemiştir. Eritrosit MDA değeri talasemi majörlü olgularda Meral, Asma Kassab-Chekir, Vives, Miguel-Garcia, Livrea, Cighetti ve arkadaşlarının yapmış olduğu çalışmalarda belirgin artış göstermiştir. Bununla birlikte Chakraborty ve arkadaşları, Ünal ve Yüzbaşıoğlu çalışmalarında yaptığımız çalışmaya benzer sonuçlar elde etmişler, talasemi majorlü olgularla kontrol grubu arasında anlamlı fark gözlememişlerdir. Yaptığımız çalışmada kullanılan talasemi majörlü olgularda oksidatif strese karşı artmış enzim düzeyleri beklenirken enzim değerleri arasında anlamlı fark 72

82 gözlenmemiştir. Bu sonuç talasemi majör olgularında düzenli transfüzyondan dolayı oksidatif stresi belirleyemediğimizi veya serbest radikallere karşı başka savunmalarında olabileceğini düşündürmüştür. 73

83 6.SONUÇLAR ve ÖNERİLER 1. β talasemi majör olgularında majör antioksidan enzimlerden SOD, GSH-Px, GSH-Rd, CAT, GST düzeyleri kontrol grubu ile farklı bulunmamıştır. 2. β talasemi majör olguları lipit peroksidasyonu ürünü olan MDA değeri bakımından kontrol grubu ile karşılaştırıldığında anlamlı fark bulunmamıştır. 3. Talasemi majör olgularında oksidatif stres göstergesi olarak çalışılan antioksidan enzim aktivitelerinin ve MDA değerinin kontrol grubu ile farklı bulunamayışının düzenli transfüzyondan kaynaklandığı düşünülmekte bu nedenle oksidatif stres çalışmalarının transfüzyon almamış talasemi majör olgularında çalışılmasının daha sağlıklı olacağı sonucuna varılmıştır. 4. Oksidatif stres ile oluşan serbest radikal hasarına karşı daha başka savunma mekanizmalarını belirlemek için çalışmalara ihtiyaç vardır. 74

84 KAYNAKLAR 1. Dilek O.N. Serbest Radikaller ve Cerrahi. Serbest Radiakaller ve Antioksidanlar Araştırma Derneği III.Ulusal Kongresi. Afyon, Mart 2003:6. 2. Halliwell B. Antioxidants and Human Disease: curiosity, cause or consequence? Lancet, 1994; 344: Yeum K-J, Russell M.R, Krinsky I.N, Adlini G. Biomarkers of antioxidan capacity in hydrophilic and lipophilic compartments of human plasma. Archives of Biochemistry and Biophysics, 2004;430: Kurutaş Belge E, İnanç Güler F, Kılınç M. Serbest Radikaller. Arşiv, 2004; 13: Uthman E,O. The Red Cell and Anemia.Ed 2 th. 1995; Aksoy Y, Öğüş İ.H, Özer N.İnsan Eritrositlerinde Oksidatif Stres Sonucu Oluşan GSSG nin Eksportunun GSH/GSSG Oranını Korumadaki Etkinliği.. Serbest Radiakaller ve Antioksidanlar Araştırma Derneği III.Ulusal Kongresi. Afyon, Mart 2003: Dündar Y, Aslan R. Oksidan-Antioksidan Denge ve Korunmasında Vitaminlerin Rolü,Hayvancılık Araştırma Dergisi. 1999; 9(1-2): Abuja P.M, Albertini R. Methods for monitoring oxidative stress, lipid peroxidation and oxidation resistance of lipoproteins. Clinica Chimica Act,. 2001; 306: Word RJ, Peters TJ. Free radicals. Kaplan LA, Pesce AJ editors. Clinical chemistry. 3 th Ed. Mosby Year Book, Inc. 1996; Dormandy T L. An approach to free radicals. Lancet, 1983;322: Kaynak K. Akciğer kanserinde oksidatif hasarın rolü. Solunum, 2002;4(4); Halliwell B, Gutteridge JM. Free radicals in biology and medicine. 2 th Ed. Oxford: Clarendon Pres, Zwart De LL, Meerman JHN, Commandeur JNM, Vermeulen NPE. Bıomarkers of free radical damage applications in experimental animals and in humans. Free Radical Biology and Medicin,. 1999; 26:

85 14. Aslan R, Şkeroğlu MR, Bayiroğlu F. Serbest Radikal Türlerin Membran Lipid Peroksidasyonuna Etkileri ve Antioksidan Savunma, Y.Y.Ü Sağlık Bil. Derg.1995;2(1); Byung PY. Cellular Defenses Against Damage from Reactive Species. Physiological Review,. 1994; 74(1): Young I.S, Woodside J.V. Antioxidants in health and disease, J Clin Pathol, 2001; 54: Clarkson P.M,Thompson H.S. Antioxidants: What role do they play in physical activity and health?. Am J Clin Nutr, 2000;72: Urso ML, Clarkson MP. Oxidative stres, exercise, and antiooxidant supplemetation. Toxicology, 2003; 189: Halliwell B, Gutteridge JMC. Oxygen toxicity, oxygen radicals, transition metals and disease.biochem J, 1984:219; Halliwell B, Gutteridge JMC. Role of Free Radicals and Catalytic Metal İons in Human Disease:An overview. Methods Enzymol, 1990; 49(3): Church DF, Pryor WA. Free Radical chemistry of cigerette smoke and its toxicological implications. Environ. Health Perspect, 1985; 64: Akkuş İ. Serbest Oksijen Radikalleri ve Fizyopatolojik Etkileri. Mimoza Basım Yayın ve Dağıtım, Konya:1995; Fridovich I. Oxidative Stres. Encyclopedia of Life Sciences. Nature Publishing Group, Nordberg J, Arner ESJ. Reactive Oxygen Species, Antioxidants and The Mammalian Thioredoxin System. Free Radical Biology and Medicine, 2001; 31(11): Zimmerman, B. J.; Granger, D. N. Mechanisms of reperfusion injury. Am. J. Med. Sc,. 1994; 307: Kontos, H. A.; Wei, E. P.; Ellis, E. F.; Jenkins, L. W.; Povlishock, J. T.; Rowe, G. T.; Hess, M. L. Appearance of superoxideanion radical in cerebral extracellular space during increased prostaglandin synthesis in cats. Circ. Res. 1985; 57: McIntyre, M.; Bohr, D. F.; Dominiczak, A. F. Endothelial function in hypertension. Hypertension 1999;34: Oruç Özcan E. 2,4-Diamin ve Azinfosmetilin Tilapia Nilotica da Karaciğerde Antioksidan Enzim Aktivitelerine ve Lipid Peroksidasyonuna Etkileri. Doktora Tezi, Çukurova Üniversitesi, Adana,

86 29. Gutteridge J M C. Lipid peroxidation and antioxidants as biomarkers of tissue damage. Clin Chemistry 1995;41: Hinder R.A, Stein H.J. Oxygen-derived free radicals. Arch Surg.1991;126: Ünal B. Β Talasemi ve G6PD Enzim Eksikliğinde MDA Düzeyi. Uzmanlık Tezi, Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi Biyokimya Anabilim Dalı,Adana, Meram İ, Aktaran Ş. Serbest Radikallerin Biomoleküller Üzerine Etkileri. Arşiv. 2002;11: Özkan A, Fışkın K. Serbest Oksijen Radikalleri, Karsinogenez ve Antioksidant Enzimler. Türk Hematoloji Onkoloji Dergisi. 2004; 14: Sodergen E. Lipid Peroxidation İnvivo Evolution and Application of Methods for Measurements, Sweeden, Tryck&Medier, Abuja P.M, Albertini R. Methods for monitoring oxidative stress, lipid peroxidation and oxidation resistance of lipoproteins. Clinica Chimica Acta. 2001; 306: Thomas MJ.The role of free radicals and antioxidants: how do we know that they are working?. Critical Reviews in Food Sci. Nutrition, 2000;32: Cighetti G,Duca L, Bortone L, Sala S, Nava I, Fiorelli G, Cappellini M.D. Oxidative Status and Malondialdehyde in β-thalassaemia Patients. Eıropean Journal of Clinical İnvestigation. 2002; 32: Percival M. Antioxidants. Clinical Nutrıtıon Insıghts. 1998; 98(10): Sorg O. Oxidative stres: a theoretical model or biological reality?. C.R.Biologies, 2004;327: Bowler R.P, Crapo J.D. Oxidative Stres in Allergic Respiratory Diseases. J. Allergy Clin İmmunol. 2002;110(3): Kinnula V.L,Paakko P, Soini Y. Antioxidant enzymes and redox regulating thiol proteins in malignancies of human lung. FEEBS, 2004; M.F.C.M Knapen, Zusterzeel P.L.M, Peters W.H.M,Steegers E.A.P. Glutathione and Glutathione-Related Enzymes in Reproduction. European Journal of Obstetrics & Gynecology and Reproductive Biology. 1999;82: Lucente G, Luisi G, Pinnen F. Design and Synthesis of Glutathione Analogues. Il Framaco. 1998; 53:

87 44. Sies H. Glutathione and Its Role in Cellular Functions. Free Radical Biology and Medicine. 1999; 27: Cnubben N.H.P, Rietjens I.M.C.M, Wortelboer H, Zanden J., Bladeren P.J. The interplay of glutathione-related processes in antioxidant defense. Envorimental Toxicology and Pharmacology. 2001; 10: Hall L,Williams K, Perry A.C.F, Frayne J,Jury J.A. The majority of human glutathione peroxidase type 5 (GPX5) transcripts are incorrectly spliced : implications for the role of GPX5 in the male reproductive tract. Biochem J. 1998;333: Haan j.b, Bladier C, Griffith P, Keiner M, O shea R.D, Kola İ. Mice with a homozygous null mutation for the most abundant glutathione peroxidase, Gpx1, show increased susceptibility to the oxidative stres-inducing agents paraquat andd hydrogen peroxide. Issue of August. 1998;273(35): Strange R.C, Spiteri M.A, Ramchandran S, Fryer A.A. Glutathione-S-transferase family of enzymes. Mutation Research. 2001; 482: Oberley L.W. Representetive of Polypeptid Structure of Bovine CuZnSOD. Superoxide Dismutase, 1982;1: Kınnula V.L, Crapo J.D. Superoxide Dismutases in Malignant Cells and Human Tumors. Free Radical Biology and Medicine. 2004; 36(6): Erişim ([email protected]) Erişim tarihi: Zamocky M, Koller F. Understanding the structure and function of catalases:clues from molecular evolution and in vitro mutagenesis. Progress in Biophysics & Molecular Biology.1999;72: Ernster, L.; Dallner, G. Biochemical, physiological and medical aspects of ubiquinone function. Biochim. Biophys. Acta,1995; 1271: ; 54. Xia, L.; Bjo rnstedt, M.; Nordman, T.; Eriksson, L. C.; Olsson, J. M. Reduction of ubiquinone by lipoamide dehydrogenase. An antioxidant regenerating pathway. Eur. J. Biochem. 2001; 268: Frei B,Stocker R,England L,Ames BN.Ascorbate: the most effective antioxidant in human blood plasma. Av Exp Med Biol. 1990; 264: Sies H,Stahl W, Sundqust AR. Antioxidant function of vitamins. Vitamin E and C, betacarotene and other carotenoidsa. Ann N Y Acad Sci, 1992;669:

88 57. Tadmouri G.O, Başak A.N. Β thalassemia. in Turkey; A review of the clinical epidemiological molecular and evoluinory aspects. Hemoglobin. 2001;25(2): Burtis C.A,Ashwood E.R. Vitaminler.Aslan D. Eds. Klinik Kimyada Temel İlkeler. Ankara: Palme Yayınları, 2005: , , Nijveldt R.J, Noad E, Hoarn D.E.C, Boelens P.G, Norren K, Leeuwen P.A.M. Flavonoids: a review of probable mechanism of action and potential applications. Am J Clin Nutr. 2001;74: Onat T,Eerk K,Sözmen Y.E.İnsan Biyokimyası. Ankara: Palme Yayıncılık. 2002: 135, Becker M.A,Roessler B.J. Hyperuricemia and Gout. In Scriver CR,Beaudet AL, Sly WS.The Metabolic and Moleculer Bases of Inherited Disease, New York: 7 th Ed. McGraw- Hill,1995: Erişim: ( kacr.or.kr/library/item.view) erişim tarihi: Lukens JN:The thalassemias and related disorders:quantitative disorders of hemoglobin synthesis. Lee GR, Bithell TC, Foerster J, Athens JV and Lukens JN. Wintrobe s Clinical Hematology., 9 th Ed. Lea&Febiger, Philadelphia, 1993: Erişim: (chem.purdue.edu/chm 333) erişim tarihi: Erişim: (globin.cse.psu.edu) erişim Segel GB, Oski FA:Hematology of the newborn. General Hematology. Williams SW, Beutler E, Erslev AJ, Lichttman AM. 4 th ed. 1991: Swee L. T. B-thalassemia. Bailliere s Clinical Haematology,1993;6(1): Altay Ç. Talasemi: tanı ve tedavide yenilikler. XXIX. Ulusal Hematoloji Kongresi.Antalya- Türkiye Şaşmaz İ. Talassemi majorlü çocuklarda karaciğer ve demir metabolizması. Uzmanlık tezi, Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi Çocuk Sağlığı ve Hastalıkları Anabilim Dalı,Adana, Ulusal Hemoglobinopati Konseyi Kitapçığı. 2 th Ed. Tunç B, Timur H.İ, Tarama Programları ve Yöntemleri. Nisan 2003, Antalya Weatherall D.J, Clegg JB; The Thalassaemia Syndromes. 4 th ed. Blackwell Scientific Publication, Oxford,2001:

89 72. Küçük M. Hemoglobinopatiler. Uysal A,V. Klinik Hematoloji, Ankara, Anadol Yayıncılık, 1984: Anonim 74. Çürük M,A. Hemoglobinopatilerde Tarama ve Tanı Yöntemleri Neler Olmalı? 3. Uluslar arası Talasemi Yaz Okulu ve Avrupa Transfüzyon Tıbbı Okulu.Antalya, : Chakraborty d, Bhattacharyya M. Antioxidant defense status of red blood cells of patients with β-thalassemia and Eβ-thalassemia. Clinica Chimica Acta, 2001; 305:( ) 76. Kassab-Chekir A, Laradi S, Ferchichi S, Khelil A.H, Feki M, Amri F, Semli H, Bejaoui M, Miled A. Oxidant, antioxidant status and metabolic data in patients with beta-thalassemia. Clinica Chimica Acta, 2003; 338:(79-86) 77. Comporti M,Signorini C, Buonocore G, Ciccoli L, İron Release, Oxidative Stres and Erythrocyte Ageing. Fre Rad Bio Med, 2002;32(7): Rund D, Rachmilewitz E. New treatment of β-thalassemia. Critical Reviews in Oncology/Hematology, 2000;33: Arcasoy A, Canatan D. Dünyada ve Türkiye de Talasemi ve Hemoglobinopatiler. Arcasoy A,Canatan D,Köse M.R, Üstündağ M. Hemoglobinopati ve Talasemi önlem, tanı ve tedavi. Antalya,2 th Ed.Siyah Grafik Matbaacılık Ltd. Şti; 2003: Hoffbrand V.A, Pettit J.E. Color Atlas of Clinical Hematology.3 th Ed., Spain: Harcourt Publishers Limited, 2000: Meral A, Tuncel P, Sürmen-Gür E, Özbek R, Öztürk E, Günay Ü. Lipid Peroxidation and Antioxidant Status in β-thalassemia. Pediatric Hematology and Oncology. 2000;17: Erişim: (thalassemia.org) Erişim tarihi: 31,10, Arcasoy A. Türkiye de Thalassemia taşıyıcı sıklığı ve anormal hemoglobinler. Ankara Thalassemia Derneği Beutler E:Red Cell Metabolism. A manual of biochemical methods. 3 th Ed. Grune & Stratton. Orlando.1984:72-73,74-75, Mannervik B, Guthenberg C. Glutathione transferase (human plasenta). Meth. Enzymol. 1981: 77; Randox manual procedures. 3 th Ed. Superoxide Dismutase 80

90 87. Ohkawa H,Ohishi N,Tagi K.Assay for Lipid Peroxides in Animal Tissues by Thiobarbituric Acid Reaction. Analytic Biochem,. 1979: 95; White WL, Erickson MM, Stevens SC. Chemistry for the clinical laboratory. CV Mosby Comp. St Louis. 1976: Klinik Laboratuarlarda Standardizasyon ve Kalite Güvencesi. Eğitim Uygulama Toplantısı-II. 1998,İstanbul. 90. Suthutvoravut U,Hathirat P,Sirichakwal P,Sasanakul W,Tassaneeyakul A,Feungpean B. Vitamin E status, glutathione peroxidase activity and the effect of vitamin E supplementation in children with thalassemia. J Med Assoc Thai. 1993; 76(2): Gerli GC, Beretta L, Bianchi M, Pellegatta A, Agostoni A. Erythrocyte superoxide dismutase, catalase and glutathione peroxidase activities in beta-thalassaemia (major and minor). Scand J Haematol. 1980; 25(1): Vives Corrons JL, Miguel-Garcia A, Pujades MA, Miguel-Sosa A, Cambiazzo S, Linares M, Dibarrart MT, Calvo MA. Increased susceptibility of microcytic red blood cells to in vitro oxidative stres. Eur J Haematol. 1995; 55(5): Ponnazhagan S, Sarkar R. Enzymes of the pentose phosphate pathway in glutathione-regulated membrane protection in beta-thalassaemia. Eur J Clin Chem Clin Biochem. 1992; 30(8): Livrea M.A,Tesoriere L,Pintaudi A.M,Calabrese A,Maggio A,Bongiorno A,Freisleben H.J. Oxidative stres and antioxidant status in beta-thalassemia mjor: ıron overload and depletion of lipid-soluble antioxidants. Blood. 1996;88(9): Yüzbaşıoğlu S. Talasemi ve demir eksikliği anemisi olgularında oksidatif hasarın membran proteinlerine etkisi. Yüksek Lisans Tezi. Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi Biyokimya Anabilim Dalı,Adana, Corrons V.J.L,Garcia M.A,Pujades M.A. Increased susceptibility of microcytic red blood cells to in vitro oxidative stres. Eur J Haemotol. 1995;55: Cappellini M.D,Tavazzi D,Duca L,Marelli S,Fiorelli G. Non-traansferrin-bound ıron, ıronrelated oxidative stres and lipid peroxidation in beta-thalassemia intermedia. Transfusion Science. 2000;23:

91 ÖZGEÇMİŞ yılında Adana da doğdum. İlk,orta,lise eğitimimi Ankara da tamamladıktan sonra yılları arasında Ankara Üniversitesi Fen Fakültesi Biyoloji Bölümün de lisans eğitimimi tamamladım yılında Çukurova Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü Biyokimya Anabilim Dalı nda yüksek lisans eğitimime başladım. Evliyim. 82