T.C. ERCİYES ÜNİVERSİTESİ ECZACILIK FAKÜLTESİ MOLEKÜLER BASKILANMIŞ POLİMERLER VE UYGULAMALARI. Hazırlayan Harun Hadi KUŞ

1 T.C. ERCİYES ÜNİVERSİTESİ ECZACILIK FAKÜLTESİ MOLEKÜLER BASKILANMIŞ POLİMERLER VE UYGULAMALARI Hazırlayan Harun Hadi KUŞ Danışman Yrd. Doç. Dr. Vedat YILMAZ Analitik Kimya Anabilim Dalı Bitirme Tezi Mayıs 2013 KAYSERİ

i BİLİMSEL ETİĞE UYGUNLUK Bu çalışmadaki tüm bilgilerin, akademik ve etik kurallara uygun bir şekilde elde edildiğini beyan ederim. Aynı zamanda bu kurallar ve davranışların gerektirdiği gibi, bu çalışmanın özünde olmayan tüm materyal ve sonuçları tam olarak aktardığımı ve referans gösterdiğimi belirtirim. Harun Hadi KUŞ

ii YÖNERGEYE UYGUNLUK Moleküler Baskılanmış Polimerler ve Uygulamaları adlı bitirme ödevi Erciyes Üniversitesi Lisansüstü Tez Önerisi ve Tez Yazma Yönergesi ne uygun olarak hazırlanmıştır. Hazırlayan Harun Hadi KUŞ Danışman Yrd. Doç. Dr. Vedat YILMAZ Analitik Kimya Anabilim Dalı Başkanı Prof. Dr. İbrahim NARİN

iii Moleküler Baskılanmış Polimerler ve Uygulamaları adlı Bitirme Ödevi Erciyes Üniversitesi Lisansüstü Tez Önerisi ve Tez Yazma Yönergesi ne uygun olarak hazırlanmış ve Analitik Kimya Anabilim Dalında Bitirme Ödevi olarak kabul edilmiştir. Hazırlayan Harun Hadi KUŞ Danışman Yrd. Doç. Dr. Vedat YILMAZ Analitik Kimya Anabilim Dalı Başkanı Prof. Dr. İbrahim NARİN ONAY : Bu bitirme ödevinin kabulü Eczacılık Fakültesi Dekanlığı nın... tarih ve.. sayılı kararı ile onaylanmıştır. / / Prof. Dr. Müberra KOŞAR Dekan

iv TEŞEKKÜR Bu tezin hazırlanmasında, çalışmalarımın her aşamasında bilgi, öneri ve yardımlarını esirgememesinin yanı sıra kişisel ilişkilerde hoca-öğrenci resmiyetini bir tarafa bırakıp bize bir arkadaş içtenliğinde davranan danışman hocam sayın Yrd. Doç. Dr. Vedat YILMAZ a, maddi, manevi desteklerinden dolayı dostlarım; Fikret KARABUDAK, Mustafa YILMAZ, Cemaleddin CANTEPE, Osman ŞAHİN ve Muhammed Yaşar ATA ya ve hayatım boyunca dayanak noktam olan aileme en içten duygularımla teşekkür ediyorum. Harun Hadi KUŞ

v MOLEKÜLER BASKILANMIŞ POLİMERLER VE UYGULAMALARI Harun Hadi KUŞ Erciyes Üniversitesi, Eczacılık Fakültesi Analitik Kimya Anabilim Dalı Bitirme Ödevi, Mayıs 2013 Danışman: Yrd. Doç. Dr. Vedat YILMAZ ÖZET Moleküler baskılama teknolojisi çeşitli uygulama alanlarında ideal materyal olarak kullanılabilen belirli bir analit için önceden belirlenmiş bir seçicilik ve özgüllük ile yapay reseptör tasarımını sağlayan tekniktir. MIP ler (MIP) baskılama teknolijisi kullanılarak elde edilen matris polimerik matrisler biyolojik sıvılar ve çevre örnekleri gibi karmaşk örnekleri ayırmak ve analiz etmek için antibadiler ve biyolojik reseptörler gibi doğal tanımlayıcı varlıkları taklit edebilen güçlü tanımlayıcı unsurlardır.moleküler tanımlamaya dayanan ayırma teknikleri, kalıp moleküllerin yüksek seçiciliklerinden dolayı çesitli alanlarda büyük ilgi görmektedir. Bu çalışmada, baskılama prosesini etkileyen kalıp, fonksiyonel monomer ve çözücü gibi faktörler, MIP lerin hazırlanmasında kullanılan polimerizasyon metotları ve MIP lerin karakterizasyonu ve uygulama alanları incelenmiştir. Anahtar Kelimeler: Moleküler Baskılanmış Polimer, Kalip, Sensör, Monolit ve Küresel Tanecikler.

vi MOLECULARLY IMPRINTED POLYMERS AND THEIR APPLICATIONS Harun Hadi KUŞ Erciyes University, Faculty of Pharmacy Department of Analytical Chemistry Graduation Project, May 2013 Advisor: Yrd. Doç. Dr. Vedat YILMAZ ABSTRACT Molecular Imprinting Technology is a technique to design artificial receptors with a predetermined selectivity and specificity for a given analyte, which can be used as ideal materials in various application fields. Molecularly Imprinted Polymers (MIPs), the polymeric matrices obtained using the imprinting technology, are robust molecular recognition elements able to mimic natural recognition entities, such as antibodies and biological receptors, useful to separate and analyze complicated samples such as biological fluids and environmental samples.molecular recognition-based separation techniques have received much attention in various fields because of their high selectivity for target molecules in recent years. In this study, various factors affecting of the imprinting process such as the template, functional monomer(s) and solvent(s); methods of polymerization used in preparation of MIPs and characterization and, applications of MIPs were investigated. Key Words: Molecularly Imprinted Polymer, Template, Sensor, Monolit and Beads

vii İÇİNDEKİLER BİLİMSEL ETİĞE UYGUNLUK... i YÖNERGEYE UYGUNLUK... ii KABUL ONAY... : iii TEŞEKKÜR... iv ÖZET... v ABSTRACT... vi İÇİNDEKİLER... vii TABLOLAR LİSTESİ... x ŞEKİLLER LİSTESİ... xi SİMGELER VE KISALTMALAR... xii 1. GİRİŞ VE AMAÇ... 1 2. GENEL BİLGİLER... 3 2.1. Moleküler Baskılamanın Tarihçesi... 3 2.2. Moleküler Baskılamada Temel Prensipler... 4 2.2.1. Kovalent Baskılama... 5 2.2.1.1. Kovalent Baskılamanın Avantajları... 6 2.2.1.2. Kovalent Baskılamanın Dezavantajları... 6 2.2.2. Non-Kovalent Baskılama... 7 2.2.2.1. Non-Kovalent Baskılamanın Avantajları... 8 2.2.2.2. Non-Kovalent Baskılamanın Dezavantajları... 8 2.2.3. Yarı-Kovalent Baskılama... 8 2.2.4. Metal-İyon Esaslı Baskılama... 10 2.3. Moleküler Baskılamanın Temel Bileşenleri... 11 2.3.1. Kalıp Molekül... 11 2.3.2. Fonksiyonel Monomer... 12 2.3.3. Çapraz Bağlayıcı... 14

viii 2.3.4. Çözücü(Porojen)... 15 2.3.5. Başlatıcı(İnsiyatör)... 16 2.3.6. Sıcaklık... 17 2.4. Serbest Radikal Polimerizasyonu... 18 2.5. Başarılı Bir Baskılanmış Polimerin Oluşturulması... 19 2.6. Moleküler Baskılanmış Polimerlerin Akılcı Tasarımı... 21 2.6.1. Kombinasyonel Yaklaşım... 21 2.6.2. Hesaplamalı Yaklaşım... 22 2.6.3. Ön Polimerizasyon Etkileşimlerinin İncelenmesi... 22 2.7. Polimerizasyon Yöntemleri... 23 2.7.1. Monolit Sentezi... 26 2.7.2. Küresel Tanecik Oluşumu... 27 2.7.2.1. Sulu Ortamda Süspansiyon Polimerizasyonu... 27 2.7.2.2. Perflorokarbon Sıvılı Ortamında Süspansiyon Polimerizasyonu... 28 2.7.2.3. Mineral Yağlı Ortamda Süspansiyon Polimerizasyonu... 30 2.7.2.4. Spiral Mikrokanal Akış Reaktöründe Süspansiyon Polimerizasyonu... 31 2.7.2.5. Süspansiyon Epitop Polimerizasyonu... 33 2.7.2.6. Çöktürme Polimerizasyonu... 33 2.7.2.7. Dispersiyon Polimerizasyonu... 34 2.7.2.8. Çok Basamaklı Şişme Polimerizasyonu... 35 2.7.2.9. Çekirdek Kabuğu Emülsiyon Yöntemi... 37 2.8. Polimerlerin Değerlendirilmesi ve Karakterizasyonu... 38 2.9. MIP lerin Uygulama Alanları... 39 2.9.1. Biyomoleküllerin Ayrılmasında MIP Lerin Kullanımı... 40 2.9.2. Moleküler Olarak Baskılanmış Hidrojellerin Kontrollü İlaç Salımında Kullanımı... 42 2.9.3. Katı Faz Ekstraksiyonu (SPE)... 44 2.9.3.1 Kesikli(off-line) MISPE Çalışmaları... 47

ix 2.9.3.2. Kesiksiz(on-line) MISPE... 49 2.9.4. Kromatografik Çalışmalar... 49 2.9.4.1. Kiral Kromatografi... 49 2.9.4.2. Kapiler Elektrokromatografi... 52 2.9.4.3. İnce Tabaka Kromatografisi... 54 2.9.5. Sensörler... 54 2.9.6. Enzim Mimikleri ve Kataliz... 56 2.9.7. Medikal Uygulamalar... 57 3. SONUÇ... 60 4. KAYNAKLAR... 61 ÖZ GEÇMİŞ... 72

x TABLOLAR LİSTESİ Tablo 1. Başlıca kalıp moleküller ve uygulama alanları... 12 Tablo 2. Moleküler baskılamada kullanılan başlıca fonksiyonel monomerler... 13 Tablo 3. Moleküler baskılamada kullanılan başlıca çapraz bağlayıcılar... 15 Tablo 4. İdeal MIP in taşıması gereken özellikler... 20 Tablo 5. Kesikli MISPE ile çevre örneklerinde yapılan çalışmalar... 47 Tablo 6. Kesikli ve kesiksiz MISPE ile vücut sıvılarında yapılan çalışmalar... 48 Tablo 7. MIP-CSP kullanılarak çalışılan bazı rasemik bileşikler... 51 Tablo 8. Farklı CEC formatları ile hazırlanan CEC-MIP lere örnekler... 51 Tablo 9. MIP-sensör uygulamaları... 55 Tablo 10. Baskılanmış polimerlerin immünolojik çalışmalara göre avantaj ve dezavantajları... 58

xi ŞEKİLLER LİSTESİ Şekil 1. MIP ile ilgili yapılan çalışmaların yıllara göre dağılımı... 4 Şekil 2. Moleküler baskılama işleminin şematik gösterimi... 5 Şekil 3. Kovalent baskılamanın şematik gösterimi... 5 Şekil 4. Non-kovalent baskılamanın şematik gösterimi... 7 Şekil 5. Yarı-kovalent baskılamanın şematik gösterimi... 9 Şekil 6. Moleküler baskılamada kullanılan başlıca başlatıcılar... 17 Şekil 7. AIBN ve BPO(benzoil peroksit) serbest radikal oluşum reaksiyonları... 19 Şekil 8. Aminopiridin ile metakrilik asit arasındaki etkileşim mekanizması... 23 Şekil 9. Farklı polimerizasyon yöntemiyle hazırlanmış polimerlerin SEM ve TEM mikroskoplarındaki görüntüleri... 25 Şekil 10. Yığın polimerizasyonu yönteminin şematik gösterimi.... 26 Şekil 11. (a) Reaktörde florokarbonda süspansiyon polimerizasyonu kullanılarak hazırlanan parçacıkların SEM görüntüleri (b) SPE kartujlarında florukarbonda süspansiyon polimerizasyonu yöntemiyle hazırlanan parçacıkların SEM görüntüleri.... 30 Şekil 12. Spiral mikro-kanal reaktörünün şematik gösterimi... 32 Şekil 13. (a) SEM in mikro-reaktör (b) perflorokarbon (c) mikro-reaktör (d) konventiyonel... süspansiyon polimerizasyon yöntemi ile elde edilen küresel taneciklerin SEM görüntüleri... 32 Şekil 14. Monodispers MIP in şişme polimerizasyon yöntemiyle hazırlanması... 36 Şekil 15. Molekül baskılanmış polimerlerin uygulama alanları... 40 Şekil 16. Moleküler baskılanmış polimer katı faz ekstraksiyonu... 45 Şekil 17. HPLC-MIP kolonu... 50 Şekil 18. In-situ MIP-CEC sisteminin hazırlanması... 53 Şekil 19. MIP-sensör sistemi... 55 Şekil 20. Enzim yetenekli MIP uygulaması... 57

xii SİMGELER VE KISALTMALAR µm : Mikrometre 4-VPy ACM AIBN BPO CE CEC ConA EDMA EGDMA FTIR GC Gly HPLC HPLC-F MAA MAA MAC MBA MeOH : 4-vinilpiridin : Akrilamid : 2,2'-azobisizobütironitril : Benzoil peroksit : Kapiler elektroforez : Kapiler elektrokromatografi : Conconavalin A : Etilenglikoldimetakrilat : Etilenglikol dimetakrilat : FourierDönüşümü Infrared Spektroskopi : Gaz kromatgrafisi : Glisin : Yüksek basınçlı sıvı kromatografisi : Yüksek basınçlı sıvı kromatografisi-floresans : Metakrilik asit : Metakrilik asitetakrilat : Metakrilamidosistein : N,N -metilen bisakrilamid : Metanol

xiii MetACM MIP MMA N,N -MBAA Nm NMR SEM SPE SPR TFMAA TIP TMDMA Trp TrpOMe UV : Metakrilamid : Moleküler baskılanmış polimerler : Metil metakrilat : N,N -metilbisakrilamid : Nanometre : Nükleer Manyetik Rezonans : Taramalı elektron mikroskobu : Katı faz ekstraksiyonu : Yüzey plazmon rezonans : Triflorometakrilik asit : Teofilin baskılanmış polimer : Tetra metilen dimetakrilat : Triptofan : Triptofan metil esteri : Ultraviyole

1 1. GİRİŞ VE AMAÇ Moleküler etkileşim kavramı oldukça eski bir kavram olup ilk kez 1894 de Fischer in enzim substrat etkileşimini ortaya koyan ünlü anahtar-kilit modelini ortaya atmasıyla birlikte konuyla ilgili modern fikirler ortaya çıkmaya başlamıştır. Bu tanıma göre enzim molekülünün yüzeyinde substrat molekülünün şeklini tamamlayan ve bu şekle uygun yapılar bulunmaktadır. Böylece substrat bir anahtar gibi enzimin aktif bölgeleriyle etkileşir. Moleküler etkileşim kavramının en yeni ve büyük çapta ilgi gören uygulaması moleküler baskılama yöntemidir. Moleküler baskılama yöntemi farklı matrikslerden iyonlar, organik moleküller ve biyomoleküllerin seçiciliği yüksek olarak ayrılması için akıllı polimer elde edilmesi ve bunun farklı uygulamalarda kullanılmasını yaygınlaştıran yeni bir malzeme geliştirme yöntemidir. Moleküler baskılamada, kalıp molekül çevresi ile etkileşen bir kalıp olarak davranır, çapraz bağlı monomerler kalıp molekül çevresinde düzenlenir ve kalıp benzeri bir tabaka oluşturmak üzere birlikte polimerleşirler. Temel olarak monomerler kovalent veya non-kovalent etkileşimler yoluyla kalıp molekül ile bir kompleks oluşturur. Polimerizasyondan sonra kalıp molekül uzaklaştırılır ve bağlanma bölgeleri kalıp moleküle büyüklük, şekil ve fonksiyonel grupların yerleşimi olarak tamamlayıcıdır. Böylece esas olarak kalıp molekülü seçici olarak tekrar bağlayabilen polimer üzerine bir moleküler bellek baskılanmıştır. Moleküler baskılanmış polimerlerler (MIP) biyolojik reseptörlerin en önemli iki özelliğine olan tanıma yeteneği ve spesifik kalıp molekülleri bağlama yeteneğine sahiptirler. MIP ler yüksek mekanik dayanıklılıkları, ısıya ve basınca olan dirençleri, fiziksel sağlamlıkları, asitler, bazlar metal iyonları ve organik çözücüler gibi zorlayıcı şartların varlığında yüksek kararlılıkları sebebiyle oldukça dayanıklıdırlar. Birkaç yıl boyunca performansında değişim olmaksızın saklanabilir. Bu çalışmada, MIP lerin hazırlanmasında kullanılan kalıp molekül, fonksiyonel monomer(ler), çözücü(ler) ve sıcaklık gibi parametrelerin baskılama prosesindeki

2 etkileri; başarılı bir baskılanmış polimer hazırlamada kullanılan deneysel ve hesaplamalı yöntemler, hazırlanan polimerlerin değerlendirilmesi ve karakterizasyonunda kullanılan yöntemler ve son olarak MIP lerin uygulama alanları incelenmiştir.

3 2. GENEL BİLGİLER 2.1. Moleküler Baskılamanın Tarihçesi Moleküler baskılama kavramı oldukça eski bir kavram olup ilk defa 1894 de Fischer in enzim-substrat etkileşimini ortaya koyan ünlü Anahtar-Kilit modelini ortaya atmasıyla birlikte konuyla ilgili modern fikirler ortaya çıkmaya başlamıştır. Daha sonra 1931 yılında Polyakov sodyum silikat çözeltisinin asitlendirilmesi ile jelimsi silika polimerin kuruması sonucunda sert bir matriks elde etmiş, kuruma süresince benzen, toluen, ksilen varlığında gözenek yapısına etkisini incelemiştir. (1) Polyakov bundan sonraki çalışmalarında seçici moleküler tanıma konusunda araştırmalar yapmış ve seçiciliğin katkı maddesinin kimyasal yapısının sonucu olarak yapısal değişikler oluşturduğunu belirtmiştir. Moleküler baskılamanın ilk örnekleri olan, sentetik organik polimerler, birbirinden bağımsız olarak Takagashi, Klotz, Wulff, ve Sarhan tarafından 1972 yılında sunulmuştur. (2;3) Wulff, ilk defa kovalent baskılama yöntemini öne sürmüştür. (4) Daha sonraki çalışmalarda Mosbach tarafından kovalent baskılamaya göre daha kolay olan ikincil etkileşimlere dayanan kovalent olmayan baskılama yöntemi geliştirilmiştir (5) S. Hjerten, J.L. Liao ve arkadaşları tarafından yapılan çalışmada miyoglobin molekülü baskılanarak elde edilen polimerler kolon dolgu maddesi olarak protein adsorpsiyonunda denenmiş ve olumlu sonuçlar elde edilmiştir. (6) Nagahori ve S. Nishimura tarafından sentezlenen glikoproteinlerin monomer olarak kullanıldığı MIP ler model lektin olarak Conconavalin A (Con A) adsorpsiyonunda kullanılmıştır. (7) K. Mosbach ve grubu tarafından 1990 yılında yapılan çalışmada amino asit türevleri kullanılarak metakrilat bazlı MIP ler sentezlenmiş ve bunların HPLC de kullanımına yönelik olumlu sonuçlar elde edilmiştir. (8)Moleküler baskılamada yıllara göre yapılan çalışmalar Şekil 1. de gösterilmektedir.

4 Şekil 1. MIP ile ilgili yapılan çalışmaların yıllara göre dağılımı 2.2. Moleküler Baskılamada Temel Prensipler Moleküler baskılama kısaca, üzerinde kalıp molekülü tanıma özelliği taşıyan merkezler içeren polimerlerin sentezlenmesi işlemidir. Sentez için iki temel gereksinim vardır: 1) kalıp molekül veya diğer bir deyişle baskılanacak molekül, 2) kalıp molekül ile etkileşebilecek (kovalent ya da non-kovalent bağlanma ile) işlevsel bir monomer. Bu temel gereksinimlerin yanı sıra çözücü, çapraz-bağlayıcı gibi yan gereksinimler de mevcuttur. Moleküler baskılama işlemi, Şekil 2. de özetlendiği gibi üç basamaktan oluşur. İlk basamakta baskılanacak molekül (c) ile fonksiyonel monomer(ler) (a) etkileşerek bir kompleks oluştururlar. İkinci basamakta bu kompleks yapı, işlevsel monomer üzerinden (b) polimerleştirilir. Polimerizasyon gerçekleştikten sonra baskılanan molekül, yıkama işlemiyle polimerik yapıdan uzaklaştırılır. Böylelikle geride baskılanmış bağlanma bölgelerine sahip bir polimer kalır. Artık bu polimer kalıp molekül için yüksek seçicilik ve ilgiye sahiptir. Örneğin, kalıp molekülü içeren bir karışım, baskılanan polimer ile etkileşecek olursa, sahip olduğu bağlanma bölgeleri nedeniyle yalnızca kalıp molekülü tanıyarak ona bağlanacak ve böylelikle kalıp molekülün karışım ortamından uzaklaştırılması, yani saflaştırılması sağlanacaktır

5 Şekil 2. Moleküler baskılama işleminin şematik gösterimi İlk basamakta, fonksiyonel monomer ve kalıp molekül kovalent olarak yada nonkovalent etkileşimlerle bağlanabilir. Bu bakımdan moleküler baskılama işlemi kovalent, non-kovalent moleküler baskılama ve ikisinin avantajlarının birleştirildiği yarı-kovalent moleküler baskılama olarak üç gruba ayrılabilir. 2.2.1. Kovalent Baskılama Kovalent baskılamada, polimerizasyon işleminden önce fonksiyonel monomer ile kalıp molekül birbirlerine kovalent bağlarla bağlanır. Polimerizasyon işleminden sonra kovalent bağlar kırılır ve kalıp oluşturmak amacıyla polimerden uzaklaştırılır. Kalıp molekül, baskılanmış polimerlerle etkileştirildiğinde aynı kovalent bağ yeniden oluşur.(9;10) Şekil 3. Kovalent baskılamanın şematik gösterimi Wulff ve arkadaşları tarafından yapılan çalışmada p-vinilbenzenboronik asit ile 4- nitrofenil-α D-mannopiranositin 2:1 kovalent birleşimi ile oluşan kompleks etilen dimetakrilat (çapraz bağlayıcı olarak) varlığında polimerleştirilmesiyle ilk kovalent baskılama yapılmıştır. (4) Hwang ve Lee çalışmalarında kolesterol baskılanmış

6 polimerleri kovalent ve non-kovalent baskılama yöntemi kullanarak yığın polimerizasyon yöntemiyle hazırlamışlardır. Kovalent baskılanmış polimerin hazırlanması için EGDMA, AIBN ve kolesteril(4-vinil)fenil karbonat, hekzanda çözülmüştür. Non-kovalent baskılama yöntemiyle MIP hazırlanması için metrakrilik asit ve 4-vinil piridin fonksiyonel monomerleri kullanılmıştır. Deneysel çalışmalar sonucunda kovalent baskılamayla hazırlanan polimer için kolestrol ve estradiolün ayrımında elde edilen seçicilik faktörünün, non-kovalent baskılamayla hazırlanan polimerlere göre daha fazla olduğu ve pik genişliklerinin azaldığı belirlenmiştir. Kovalent baskılamayla hazırlanan MIP in daha fazla kolesterolü tuttuğu sonucuna varılmıştır. (11) Andaç ve arkadaşları çalışmalarında, iyon baskılanmış polimer sentezleyerek insan plazmasından yüksek dozdaki Cd(II) iyonlarının, seçicilik ile Cd(II) iyonlarını uzaklaştırmayı kalıplemişlerdir. Maksimum adsorpsiyon kapasitesi 32,5 mmol olarak bulmuşlardır. Baskılanmış polimerin gerçel seçicilik katsayıları, Cd (II)/ Pb(II), ve Cd(II)/ Zn(II) için 7,8 ve baskısız polimerlerde 1683 kere daha büyük olduğunu saptamışlardır. (12) 2.2.1.1. Kovalent Baskılamanın Avantajları Kovalent baskılamada monomer-kalıp molekül kompleksi oldukça kararlıdır, stokiyometrik oranlarda gerçekleşir ve homojen bir dağılım sağlanır. Polimerizasyon koşulları yüksek sıcaklık, yüksek veya düşük ph ve polar solventler için istenildiği gibi uygulanabilir, çünkü konjugatlar kovalent bağlarla oluşturulmuş ve oldukça kararlıdırlar. (13) 2.2.1.2. Kovalent Baskılamanın Dezavantajları Kovalent baskılamanın dezavantajlarının çokluğu nedeniyle bu yaklaşımın kullanımı daha sınırlıdır. Kovalent baskılamada monomer-kalıp molekül konjugatının sentezinde sık sık sorunlar çıkabilir ve sentez prosesi pek ekonomik değildir. Kalıp molekülün polimere tersinir olarak bağlanma sayısı sınırlıdır. (14;15) Ayrıca polimeri kullanarak kalıp tanıma basamağında kalıp ile polimer arasında kovalent bağ oluşumu genellikle yavaş bir basamakta gerçekleştiği için ve kromatografik ayırmalarda polimer sabit fazı ve analit arasında hızlı bir etkileşim gerçekleştiğinden zayıf kromatografik sonuçlar elde edilir. Kovalent bağ oluşumu nedeniyle bağlanma kinetikleri yavaştır. (16;17)

7 2.2.2. Non-Kovalent Baskılama Non-kovalent baskılamada fonksiyonel monomer ile kalıp molekülün bağlanması nonkovalent (hidrojen bağı, elektrostatik etkileşimler ve koordinasyon bağ oluşumu gibi) etkileşimlerle gerçekleşir. Polimerizasyondan sonra uygun çözücülerle kalıp molekül polimerden uzaklaştırılır. Kalıp molekül ile baskılanmış polimerler non-kovalent etkileşimlerle bağlanır. (18;19) Şekil 4. Non-kovalent baskılamanın şematik gösterimi Anderson ve Mosbach çalışmalarında, MIP ler üzerindeki enantiyomerik çözünmeyi araştırmak için non- kovalent ve non-iyonik etkileşimleri kullanmışlardır. MIP ler sadece kalıp molekül ve fonksiyonel monomerler arasındaki zayıf bağlar kullanılarak hazırlanmıştır. (20) Lu ve arkadaşları yaptıkları çalışmalarında kovalent olmayan MIP lerde, 2-Lfenilalaninamino piridin, 3-L-fenilalaninamino piridin, 4-L-fenilalaninamino piridini kalıp molekül olarak kullanmış ve 3 farklı MIP hazırlamışlardır. Bu MIP lerin enantiyomerik tanıma performansı, yüksek performanslı sıvı kromatografi yöntemiyle belirlenmiştir. Çalışmacılar, hazırlanan üç farklı baskılanmış polimerin enantiyomerik tanıma özellikleri üzerinde mobil fazın bileşiminin önemli rol oynadığını belirtmişlerdir. Çalışmada kullanılan organik ve sulu mobil fazların, piklerin kolonda alıkonma zamanlarını uzattığı, piklerde genişlik ve kuyruklanma gibi problemlere yol açtığı belirlenmiştir. Tunç ve arkadaşları çalışmalarında teofilin baskılanmış polimerleri (TIPs) non-kovalent baskılama yöntemiyle çeşitli monomerlerin bir arada kullanılmasıyla hazırlamışlardır. Çapraz bağlayıcı olarak etilen glikol dimetakrilat (EDMA) seçilmiştir. Çalışmada metakrilik asit ana monomer, akrilamit (ACM) ve 2- hidroksietil metakrilat (HEMA) ko-monomer olarak kullanılmıştır. Teofilin, kararlı yapısı, çok sayıda hidrojen bağı verici ve alıcı gruplarının olması ve fonksiyonel

8 monomerlerle non-kovalent etkileşimler için uygun olduğundan bu çalışma için kalıp molekül olarak seçilmiştir. Hazırlanan polimerlerin bağlanma bölgelerinin heterojen dağılımda olduğu Langmuir izoterm modeline göre açıklanmışlardır. (21) 2.2.2.1. Non-Kovalent Baskılamanın Avantajları Günümüzde pek çok araştırmacı MIP hazırlamak için non-kovalent baskılamayı tercih etmektedir. (15;22) Non-kovalent yaklaşım polimerizasyon öncesinde non-kovalent etkileşimlerle kalıp molekül etrafında fonksiyonel monomerlerin düzenlenmesine imkan tanıdığından basit ve sorunsuzdur. Kovalent monomer-kalıp konjugatının sentezine gerek yoktur ve kalıp monomer kompleksi oluşturmak için farklı bağlanma etkileşimleri kullanılabilinir. Non-kovalent bağlanma kinetiği kovalent bağlanmayla kıyaslandığında enzim-substrat bağlanmasına benzer.(15) Polimerizasyondan sonra kalıp molekül polimerden kolayca uzaklaştırılır, çünkü non-kovalent etkileşimler daha zayıftır. Kalıp molekülün bağlanma kinetiği hızlıdır. Baskılanmış polimerler, kalıp molekülün yapısı ve reaktivitesi hakkında spesifik bilgi gerektirmeksizin hazırlanabilir. 2.2.2.2. Non-Kovalent Baskılamanın Dezavantajları Non-kovalent baskılamada polimerizasyon koşulları, non-kovalent etkileşimleri arttırmak amacıyla, sınırlıdır. Fonksiyonel monomerler bağ oluşum dengesini arttırmak amacıyla fazlaca kullanılır ve non-spesifik bağlanma bölgelerinin oluşumuna neden olabilir. Non-kovalent polimerlerde bağlanma bölgelerinin dağılımı heterojendir. Bu da non-spesifik bağlanmalara ve kalıp molekülün zayıf moleküller tanımasına sebep olabilmektedir. (23;24) Eğer hazırlanan polimerler kromatografi çalışmalarında kullanılırsa pik genişlemesine neden olabilir. (25;26) Görüldüğü gibi her iki yöntemin de birbirlerine göre üstünlükleri vardır. Yöntemin seçimi kalıp molekülün çeşidine, yapısına, seçiciliğin derecesine, zamana ve maliyete göre değişmektedir. 2.2.3. Yarı-Kovalent Baskılama Bu yöntem kovalent ve kovalent olmayan baskılamanın avantajlarının birleştirilmesidir. Kovalent yada kısmi kovalent bağ yapabilecek karakterdeki kalıp molekül monomer karışımıyla kovalent olmayan bağlar oluşturarak polimerize olur. Kalıp molekül ortamdan hidroliz ile uzaklaşır. Kalıp molekülün uzaklaşmasıyla fonksiyonel bölgeler

9 polimer içerisinde düzenli bir biçimde dağılır. Kalıp molekülün geri bağlanması nonkovalent etkileşimlere dayanır ve difüzyon dışında kinetik engelleme yoktur. Bazı moleküllerin (sterol akrilat kalıp molekülleri) hidrolizle ortamdan uzaklaştırılması zordur bu durumda ilave olarak ortama LiAlH 4 eklenir. (27;28) Ester formunda bu yöntemle baskılanan testesteron metakrilat, bazı fenolik bileşiklerin polimerleri örnek çalışmalardır. (29;30;31;16;13) Yarı-kovalent baskılamanın sınırlandırılmalarını ortadan kaldırmak için kalıp molekül ile fonksiyonel molekül arasına kalıp molekülle birlikte ortamdan uzaklaşan aracı gruplar kullanılabilir. Bu gruplar hem polimer oluşumu esnasında monomer kalıp molekülün birbirine bağlanmasını sağlar hem de non-kovalent geri bağlanmada sterik engellemeleri ortadan kaldırır. Bu amaçla, karbonat esterinin karbonil grubu ilk kullanılan aracı gruptur. Karbonil grubu aracılığıyla baskılanan moleküllere örnek olarak kolesterol, üre, üretan örnek verilebilir. (32;33) Nandrolon ve propofol polimerleri de son yıllardaki çalışmalardandır. (34;35) Salisilat(2-hidroksibenzoat) da aracı grup olarak kullanılabilir. Salisilat aracılı baskılamada amid hidrojeni ile ester oksijeni arasında oluşan intramoleküler hidrojen bağı bağlanma etkinliğini artırır ve fenil metakrilat esterinin ortamdan uzaklaştırılması da diğer gruplara oranla daha kolaydır. (36) Yarı-kovalent baskılama süspansiyon polimerizasyonunda (sulu) ve emülsiyon polimerizasyonunda da kullanılmaktadır. Şekil 5. Yarı-kovalent baskılamanın şematik gösterimi

10 2.2.4. Metal-İyon Esaslı Baskılama Metal-iyonu baskılanmış polimer sentezinde, metal iyonları ya doğrudan kendileri ya da metal iyonlarının kompleksleri kalıp molekül olarak kullanılır. Metal iyonlarının kalıp molekül olduğu polimerlerde pre-polimer kompleksi, metal bağlayıcı ligandlar ile çapraz bağlanır ve emülsiyon damlasının yüzeyindeki fonksiyonel monomerler ile birlikte spesifik metal komplekslerinin polimerizasyonu gerçekleştirilir. Kristal baskılama yönteminde ise kristalin yüzeyinde metal iyonlarıyla etkileşim sonucunda tanıma gerçekleşir. Poli(4-vinilpiridin); Cu(II) Fe(III), Co(II) Zn(II) Cd(II) gibi geçiş metal iyonlarının dibromo bileşiklerinin kuartenizasyonuyla çapraz bağlanmasıyla metal baskılanmış polimerler hazırlanır. (18) Daha sonraki çalışmalar ise Cu +2 ile asidik polimer ya da kitosan ile Cu(II) ve Hg(II) yakalanması için kullanılan baskılanmış polimerlerdir. (37) Başka bir metal baskılanmış polimer hazırlama prosedürü de emülsiyon damlasının ara yüzeyinde yüklü ortam oluşturmaktır. Buna örnek olarak Cu(II) ve Ni(II) ) için hazırlanan çekirdek polimerde kompleksin yüklü kısmını metakrilik asit grupları oluşturur. (38)Metal iyonlarının kalıp molekül olarak baskılanması her ne kadar organik kalıp moleküllerin non-kovalent ya da kovalent baskılanmasına benzese de baskılamanın başarısı metal kompleksinin yapısal oluşumuna bağlıdır. Metal iyonu aracılı baskılamada bir ya da daha fazla değişebilir ligand bölgesine sahip polimerize olabilen metal kompleksleri, yüklü ve nötral kalıp moleküllerin baskılanmasında fonksiyonel monomer olarak kullanılabilirler. Geçiş metal iyonları bir çok farklı kompleks geometrisine ve ligand seçimliliğine olanak verir. Ayrıca; baskılamadan sonra ya da geri bağlama esnasında metal iyonları değiştirilebilir ve böylece polimer farklı amaçlar içinde kullanılabilir(enzim mimikleri) Örneğin; karboksipeptidaz A enzim mimiği hazırlanırken polimerde fonksiyonel monomere bağımlı seçici bölgelerin yanında bir de metal bağlama bölgeleri oluşturulur. Bu bölgelere Zn(II) bağlandığında katalitik aktivite artarken, Cu(II) bağlandığında aktivite de düşüş gözlenir. (39) Amino asit türevleri Co(III) kompleksi, kreatin ve timin Zn(II) kompleksi ve karbohidratlar Co(II)kompleksleri olarak baskılanabilir. (40)

11 2.3. Moleküler Baskılamanın Temel Bileşenleri Moleküler damgalı polimer tasarlanması ve hazırlanması aşamasında polimerizasyon bileşenlerinin; kalıp molekül, fonksiyonel monomer(ler), çapraz bağlayıcı uygun çözücü tespiti başarılı bir polimer tasarımı için önemli bir adımdır. Uygun bileşenlerin seçilmesi hazırlanan polimerin amaca uygunluğunu ve kullanılabilirliğini sağlayan en önemli faktördür. Bileşenler ve sahip olmaları gereken genel özellikleri aşağıda özetlenmiştir. 2.3.1. Kalıp Molekül Tüm moleküler baskılama proseslerinde kalıp molekül, baskılamanın başarısı açısından kilit rol oynar. Bağlanan fonksiyonel monomerler üzerindeki fonksiyonel gruplar kalıp molekülle etkileşime girer. Ancak, tüm kalıp moleküller çeşitli nedenlerle doğrudan kalıp olmaya elverişli olmayabilir. Polimerizasyon reçetesiyle uyumsuzluğa yol açmaması bakımından, kalıp molekül polimerizasyon şartlarında kimyasal olarak inert olmalıdır. Kalıp molekülün farklı reaksiyonlara girmesi ya da herhangi bir nedenle polimerizasyon koşullarında kararsız olması gibi durumlarda alternatif baskılama stratejileri ortaya çıkabilir. Bu durumda oluşan tanıma merkezleri beklenildiği gibi olmayacak, dolayısıyla moleküler baskılama, istenilen başarıyı gösteremeyecektir. Bir kalıp molekül incelenirken aşağıdaki sorular sorulmalıdır. i) Kalıp molekül, polimerize olabilecek grup taşıyor mu? ii) Kalıp molekül, polimerizasyonu inhibe edecek ya da geciktirecek fonksiyonel gruplar (Örneğin; tiol grubu) taşıyor mu? iii) Kalıp molekül polimerizasyonun gerçekleştiği yüksek sıcaklıklara (Örneğin; AIBN nin başlatıcı olarak kullanıldığı durumlarda sıcaklık 60 C civarında olur) veya UV ışını gibi şartlarda kararlı kalabilir mi? (41) Kalıp molekül ile ilgili bir diğer kısıtlama da molekül büyüklüğüdür. Çok büyük moleküllerin polimerin çapraz bağları arasından uzaklaştırılması zor olacağından moleküler baskılama işleminde genellikle küçük moleküller kalıp olarak tercih edilir. Ancak yeni geliştirilen yöntemlerle büyük moleküllerde baskılanabilmektedir. Tablo 1. de listelendiği gibi, ilaçlar, hormonlar, proteinler, pestisitler, amino asitler, karbonhidratlar gibi çok sayıda molekül, baskılama işleminde kullanılmıştır.

12 Tablo 1. Başlıca kalıp moleküller ve uygulama alanları SINIF BİLEŞİK YAKLAŞIM UYGULAMA İlaçlar Timolol Non-kovalent Kiral ayırma Teofilin Non-kovalent Immunoassay Diazepam Non-kovalent Immunoassay Morfin Non-kovalent Immunoassay Naproksen Non-kovalent Kiral ayırma Ephedrine Non-kovalent Kiral ayırma Pentamidine Non-kovalent Ayırma Hormonlar Enkefalin Non-kovalent Immunoassay Böcek ilaçları Atrazine Non-kovalent Immunoassay / ayırma Proteinler Transferin Kovalent Ayırma RNase A Non-kovalent Ayırma Üreaz Non-kovalent Amino asitler Amino asit türevleri Non-kovalent Kiral ayırma Dansyl-Phe-OH Non-kovalent Sensör Peptidler Ac-Trp-Phe-OMe Non-kovalent Kiral ayırma Phe-Gly-anilide Non-kovalent Kiral ayırma Boc-Phe-Gly-OEt Non-kovalent Kiral ayırma Cbz-Ala-Ala-OMe Non-kovalent Kiral ayırma Cbz-Ala-Gly-Phe-OMe Non-kovalent Ayırma / Immunoassay Karbonhidratlar Galaktoz türevleri Non-kovalent Kiral ayırma Kovalent Ayırma / Immunoassay Glukoz türevleri Non-kovalent Kiral ayırma Fruktoz türevleri Non-kovalent Katalizör Koenzimler Pyridoksal türevleri Non-kovalent Ayırma Nükleotidler NAD+ Kovalent Ayırma Steroidler Kolesterol Kovalent Ayırma Boyalar Safranine O Non-kovalent Ayırma Rodanil mavisi Non-kovalent Ayırma Metal iyonları Ca(II) Metal Sensör Cu(II) Metal Ayırma Diğer Bis-imidazoller Metal Ayırma Mandelik asit Non-kovalent Kiral ayırma 2.3.2. Fonksiyonel Monomer Fonksiyonel monomerler, baskılanmış tanıma merkezlerindeki bağlanma etkileşimlerinden sorumludurlar. Non-kovalent bağlanma protokollerinde kalıp molekül

13 ile fonksiyonel monomer etkileşimini arttırmak için fazla oranda fonksiyonel monomer kullanılır. (kalıp/fonksiyonel monomer oranı 1:4 veya üzerinde olabilir) Diğer bir önemli faktör de kalıp molekülün fonksiyonalitesiyle fonksiyonel monomerin fonksiyonalitesinin uyumudur. (Örneğin; hidrojen bağı vericisi, hidrojen bağı alıcısı) Bu uyum kompleks oluşumunu dolayısıyla da baskılamanın etkisini arttırır. Birden fazla monomerin bir arada kullanıldığı durumlarda, monomerlerin reaktiflik oranlarının kopolimerleşmeyi desteklediğinden emin olmak gerekir. Moleküler baskılama da kullanılan tipik fonksiyonel monomerler karboksilik asitler, sülfonik asitler ve heteroarmik bazlardır. (42) Tablo 2. Moleküler baskılamada kullanılan başlıca fonksiyonel monomerler

14 2.3.3. Çapraz Bağlayıcı Baskılanmış polimerlerde çapraz-bağlayıcının üç temel fonksiyonu vardır. İlk olarak çapraz-bağlayıcı, polimerin matris yapısını kontrol eder buna bağlı olarak polimer jel formunda, makro gözenekli veya mikrojel pudra şeklinde olabilir. İkinci fonksiyon baskılanmış bağlanma merkezinin kararlılığının sağlanmasıdır. Çapraz bağlayıcı son olarak, polimer matrisin kararlılığını belirler. Moleküler baskılama işlemlerinde genellikle yüksek oranda çapraz bağlayıcı, baskılanmış polimerlerin tanıma merkezlerinin kararlılığını arttırmasının yanı sıra, makro gözenekli ve mekanik dayanıklılığı yüksek malzemeler elde edilmesi bakımından da tercih edilir. Bu nedenle moleküler olarak baskılanmış polimerler genelde %80 in üzerinde çapraz bağlayıcı içerirler. Birden fazla monomerin bir arada kullanıldığı durumlarda yukarıda bahsedilen özellikleri sağlayabilmek için çapraz bağlayıcının reaktiflik oranı ile monomerlerin reaktiflik oranı birbirleriyle uyumlu olmalıdır. Aksi takdirde fonksiyonel monomer yada çapraz bağlayıcı ajan daha baskın olarak polimerleşebilir ve kopolimerizasyon başarıyla gerçekleşemeyebilir. (43) Başarılı bir çapraz bağlayıcının gelişigüzel kopolimerizasyonun geçekleşmesine, fonksiyonel uçların meydana gelmesine ve düzenli bir şekilde polimerik yapı içinde dağılmasına olanak sağlaması gerekir. Çapraz bağlayıcı ajanın fonksiyonel monomere olan mol yüzdesi oranı da bir diğer önemli parametredir. Eğer oran çok küçükse, tanıma merkezleri birbirine çok yakın konumdadır ve birbirlerinden bağımsız olarak fonksiyon gösteremezler. Örneğin bir tanıma merkezine bir molekül bağlandığında bu bağlanma birçok komşu bağlanma merkezini inhibe edebilir. Aşırı yüksek mol oranlarında ise, çapraz bağlayıcı ajan fonksiyonel monomerler veya kalıp molekülle non-kovalent etkileşimlere girerek moleküler baskılamanın etkisini azaltabilir. (41)

15 Tablo 3. Moleküler baskılamada kullanılan başlıca çapraz bağlayıcılar 2.3.4. Çözücü(Porojen) Çözücü; kalıp molekül, fonksiyonel monomerler, çapraz bağlayıcı, başlatıcı ve tüm bileşenlerin tek bir fazda bir araya gelmesini sağlaması nedeniyle önemli bir ajandır. Bunun yanı sıra gözenek oluşumunu gerçekleştirerek makro gözenekli yapılar elde edilmesini sağlaması da bir diğer önemli fonksiyonudur. Bu nedenle çözücü kelimesi yerine sıklıkla porojen kelimesi de kullanılır. Polimerizasyon esnasında, çözücü molekülleri polimer yapı içinde dağılır ve polimerizasyon sonrasında çözücünün uzaklaşmasıyla polimer yapıda gözenekler oluşur. Makro gözenekli polimerik yapı hazırlanırken, porojenin özellikleri, polimerin morfolojisinin ve toplam gözenek hacminin kontrol edilmesinde kullanılabilir. Termodinamik açıdan iyi özelliklere sahip

16 çözücüler kullanılması, düzgün gözenek oluşumu ve yüksek spesifik yüzey alanı oluşumunu sağlarken, termodinamik açıdan zayıf çözücüler düzensiz gözenek oluşumuna ve düşük spesifik yüzey alanı oluşumuna neden olur. Çözücünün hacminin arttırılması, gözenek hacminin de arttırılmasını sağlar. Oluşan gözenekler, kalıp molekülün yapıdan uzaklaştırılmasında ve tekrar spesifik bağlanmayı sağlamada önemli ölçüde etkindirler. Çözücü seçimi aynı zamanda baskılamanın çeşidine de bağlıdır. Kovalent baskılamada bileşenleri istenen şekilde çözmesi halinde pek çok çözücü kullanılabilir. Ancak non-kovalent baskılama proseslerinde, çözücü, kalıp ve fonksiyonel monomer arasındaki etkileşim, kompleks oluşumunda kritik bir rol oynar. Çözücünün bu oluşumu desteklemesi ve dolayısıyla baskılamanın etkisini arttırıcı rol oynaması beklenir. En iyi çözücüler, toluen ve diklorometan gibi dielektrik sabiti düşük olan çözücülerdir. Polar çözücülerin kullanımı, kalıp molekül ile fonksiyonel monomer arasında oluşacak etkileşim kuvvetlerini azaltacak, bu da tanıma kapasitesini düşürecektir. Diğer yandan hazırlanan polimerin ortalama gözenek çapı da çözücü tipine bağlıdır. Örneğin, asetonitril oldukça polar bir çözücüdür ve dielektrik sabiti ε=36 dır. Bu nedenle, asetonitril varlığında kloroformdan (ε=5) daha makrogözenekli polimerler oluşur. Yüzey alanı ve makrogözenekliliğin azalması tanıma bölgelerine erişimi azaltacağından moleküler tanıma nın azalmasına neden olacaktır. (44) 2.3.5. Başlatıcı(İnsiyatör) Serbest radikal polimerizasyonunun başlamasını sağlayan moleküllerdir. Polimerizasyonun gerçekleştirileceği koşula göre örneğin hidrojen bağı oluşumuna dayanan polimerler hazırlanırken genelde düşük sıcaklıklarda reaksiyonu başlatan UV insiyatörler kullanılır. Ayrıca kalıp molekülün termal ve UV stabilitesi de insiyatör seçiminde önemli bir faktördür. (44)

17 Şekil 6. Moleküler baskılamada kullanılan başlıca başlatıcılar I): azobisizobutironitril II): azobisdimetilvaleronitril III): dimetilasetal benzil IV): benzoil peroksit V): 4,4 -azo(4-siyanovalerik asit) 2.3.6. Sıcaklık Kalıp-monomer kompleksinin oluşumu ortamın sıcaklığından etkilenir. Polimerizasyon sıcaklığının MIP performansı üzerindeki etkisi birkaç çalışmada incelenmiştir. (45;46;47) Düşük sıcaklıkta hazırlanan MIP ler yüksek sıcaklıkta hazırlanan MIP lerin aksine yüksek selektivite gösterir. Düşük sıcaklık fotokimyasal polimerizasyon için gereklidir. Mosbach ve arkadaşları. L-fenilalanin anilit baskılanmış polimerin enantiyo selektivitesi üzerinde bir çalışma yapmış. Başlama sıcaklığı 60,40 ve 0 ºC olarak ayarlanmış. Bu çalışma ile termik olarak hazırlanan tanımlı polimerlerin aksine düşük sıcaklıkta hazırlanan polimerlerin daha iyi selektivite gösterdiği görülmüştür. (45) Piletsky ve arkadaşları kromatografik deneylerle polimerizasyon sıcaklığının MIP in afinite ve spesifitesi üzerindeki etkisini analiz etmiştir. MIP in tasarlanmasında hesaplamalı yaklaşım kullanılmış. Bilgisayar modelleme tekniği kullanılarak en yaygın kullanılan fonksiyonel monomerlerin veri tabanına bakılarak suda yaşayan mikroorganizmanlarda bulunan siyano-bakteriyel toksin olan mikrositin-lr e baskılanmış polimerler tasarlanmıştır. (48) Aynı monomer birleşimi (MAA/EGDMA)

18 kullanılarak -30, -20, -10,0 ve 80 ºC sıcaklığında (-) efedrin baskılanmıştır. Deneysel sonuçlar polimerizasyon çözücüsü ve kalıp molekül gibi MIP bileşenlerinde bellekleme olabileceği gibi sıcaklık gibi bir faktöründe belleklenebileceğinin mümkün olduğunu göstermiştir. Düşük başlangıç sıcaklıklarının bazı durumlarda MIP in hazırlanmasında faydası dokunsa da yapılan gözlemlerde temel görüş monolit içinde iç sıcaklığın çevredeki sıcaklıktan yüksek olduğudur. Bu polimerizasyon işleminin ekzotermik yapısından kaynaklanmaktadır. Efedrin enantiyomerlerinin afiniteleri -10, 0, 20, 30, 40 ve 50 ºC de incelenmiş. Polimerizasyon sıcaklığının azalmasıyla polimerlerin afiniteleri ve spesitifesi artmakta olduğu görülmüştür.(48) 2.4. Serbest Radikal Polimerizasyonu Serbest radikal(ya da zincir uzaması) polimerizasyonu günümüzde birçok önemli ticari plastik maddenin oluşumunda kullanılan sentetik bir polimerizasyon metodudur. Birçok vinil monomeri(etilen, stiren, metil metakrilat) bu yöntemle yüksek verimlilikte polimerize olurlar. Sanayide yaygın kullanımı sayesinde monomerler piyasada kolaylıkla bulunur ve ucuzdurlar. MIP lerin oluşumunda monomer temininin kolay olması ve maliyetin düşük olması, polimerizasyonun ılımlı koşullarda gerçekleşmesi(atmosferik basınç, normal sıcaklıklar), yığın veya süspansiyonda birçok monomerin fonksiyonel grupları ile uyumlu polimerizasyon gerçeklemesinden dolayı serbest radikal polimerizasyonu tercih edilir. (44) Serbest radikal polimerizasyonu 3 aşamada meydana gelir; a) Başlama b) Zincir uzaması c) Sonlanma Serbest radikal polimerizasyonun da zincir uzama adımının hızı başlangıç adımından çok daha hızlıdır. Böylece saniyeler içinde düşük molekül ağırlıklı bir monomerden çok daha büyük molekül ağırlıklı bir ürün oluşur. Farklı özellikte birçok kimyasal insiyatör serbest radikal polimerizasyonunda kullanılabilir. Genelde polimerizasyon ortamına monomerin kütlece %1 i ya da polimerize olabilecek çifte bağ sayısının %1 i kadar eklenir. İnsiyatörün kimyasal özelliğine bağlı olarak radikal oluşturma hızı ve yöntemi

19 kontrol altında tutulabilir.(uv, sıcaklık, kimyasal/elektrokimyasal yöntemler ile) MIP sentezinde yaygın kullanılan serbest radikal polimerizasyonunun dezavantajı reaksiyonların geri dönüşümsüz olmasıdır. Bu nedenle sentez esnasında meydana gelen yan reaksiyonlar yada hatalar düzeltilemez bu da non-spesifik yada kalıp molekülün baskılanmadığı bölgelerin oluşumuna neden olabilir. Azo insiyatör olan AIBN(azobisizobutirilonitril) BPO(benzoil peroksit) UV veya termal olarak uyarılarak C-merkezli radikal oluşturma reaksiyonu şekil 7. de verilmiştir. Şekil 7. AIBN ve BPO(benzoil peroksit) serbest radikal oluşum reaksiyonları 2.5. Başarılı Bir Baskılanmış Polimerin Oluşturulması İyi bir MIP oluşumunu etkileyen faktörler; a) Monomer-kalıp oranı b) Fonksiyonel monomerin asidik ya da bazik karakteri c) Porojen (çözücü) seçimi d) Polimerizasyon koşulu e) Kalıp molekülün ve polimerin konformasyonu f) Çapraz bağlayıcının oranı

20 Fonksiyonel monomer-kalıp molekül oranı polimerizasyonda dikkat edilmesi gereken en önemli parametredir. Ortamda kalıp molekülün konsantrasyonundan daha fazla monomer konsantrasyonunun olması istenmeyen non-spesifik etkileşimleri artırırken sadece çok az bir oranda monomer kalıp molekül ile kompleksleşerek uygun bağlanma bölgeleri oluştururlar. Uygun fonksiyonel monomer kalıp molekül oranı deneme yanılma yoluyla veya bilgisayar modelleme metotlarıyla tespit edilebilir. Çözücünün polaritesi, mobil faz kompozisyonu, sıcaklık ve kalıp molekülün polimerden uzaklaştırılması sadece kapasite faktörünü etkiler. Polimerizasyon sıcaklığının kontrolünde bir diğer yöntem kalıp molekül-monomer etkileşiminin stabilizasyonudur. Genelde iyi baskılanmış polimerler düşük sıcakta termal ya da fotokimyasal insiyatörlerin kullanımıyla elde edilir. Serbest radikal polimerizasyonu ekzotermik bir reaksiyon olduğu için düşük sıcaklıklarda gerçekleşir. Yapılan çalışmalarda polimerizasyon reaksiyon ortamının dış sıcaklığı 80 C iken reaksiyon ortamının sıcaklığı 187 C olarak ölçülmüştür. (49) İyi bir MIP te olması gereken özellikler Tablo 5. de verilmiştir. Buna göre iyi bir MIP in özellikleri; sentez metodu, polimerin fiziksel özellikleri ve kalıp molekülün bağlanma karakteristiği başlıklarında toplanır. Tablo 4. İdeal MIP in taşıması gereken özellikler Sentez metodu Bir ya da birkaç kolay adımda polimerizsyon gerçekleşmesi, Polimerizasyon esnasında hata oluşumunu en az indirgeyecek dinamik baskılanması, Oluşacak polimerin fonksiyonelliği Fiziksel özellikler Yüksek stabilitede homojen baskılı bölgelerin bulunması, Çözünür ya da çözünmez kaliteli polimer karakterinde olması, Tekrar kullanılabilirliğinin iyi olması, Bağlanma bölgelerinin spektral yöntemler ile karakterize edilebilmesi Bağlanma Karakteristiği Olabildiğince yüksek afinitede kalıp molekülün bağlanabilmesi, Olabildiğince yüksek seçicilikte kalıp molekülün geri bağlanabilmesi, Hızlı bağlanma kinetiği, Bağlanma kinetiğinin kolaylıkla analizlenebilmesi.

21 2.6. Moleküler Baskılanmış Polimerlerin Akılcı Tasarımı 2.6.1. Kombinasyonel Yaklaşım Kombinasyonel yaklaşım, potansiyel olarak uygun monomerlerin deneme yanılma analizinde sorun olmadan tespit edilebildiği bir yöntemdir. Kombinasyonel yaklaşım MIP in performansını en uygun hale getirmek için Takeuchi ve arkadaşlarıtarafından yarı-otomatik yaklaşım kullanılarak fonksiyonel monomer oranı değiştirelerek MIP in seleksiyonunu hazırlamak için kullanılmış.(50) Benzer şekilde Lanza ve Sellergen bağımsız bir şekilde in situ işlemi ve fonksiyonel monomer seçimini en uygun hale getirmek için sentezlenen maddelerin değerlendirilmesini sağlayan MIP üretiminin küçültülmesini, yarı-otomatik baskılamayı geliştirerek sağlamislardir (51) Altı tane baskılanmış polimer formülasyonları farklı fonksiyonel monomerler kullanılarak hazırlanmış. Şişelerdeki foto-kimyasal ışınlamadan sonra mini-mip ler (yaklaşık 55 mg) MIP lerin kapasitesini incelemek için iki taramadan geçirilmiştir Sellergen ve arkadaşları triazin baskılanmış MIP sentezlediğinde Takeuchi sülfonilüre herbisitlerini baskılamıştır. (50;51) Her iki deneyde de MIP bileşiminin en iyi şekilde seçimi ve hızlı bir şekilde değerlendirilmesi için birleşimsel tarama başarılı bir şekilde kullanılmıştır. En uygun bileşimin seçimi deney tasarımı ve değişken analizler kullanılarak daha kolay bir hale getirilmiştir. Cedefor ve arkadaşları beta-laktam antibiyotik olan penisilin G nin kalıp molekül olarak kullanıldığı yığın polimerizasyon yöntemi ile sentezlenen MIP lerin veri tabanını oluşturmuş. Veri tabanının çeşitliliği farklı fonksiyonel monomer ve çarpraz bağlayıcıların birleştirilmesi ve ön polimerizasyon karışımlarındaki bileşenlerin konsantrasyonunun stokiyometrisinin değişimi ile oluşturulmuştur. Üretilen 52 polimer sonradan işlenmiş ve değerlendirilmiştir. Yapılan çalışmalar penisilin G için en uygun fonksiyonel monomeri MAA, çarpraz bağlayıcının ise TRIM olduğunu göstermiştir.(52)

22 2.6.2. Hesaplamalı Yaklaşım Batra ve Shea MIP in formulasyonunu en iyi hale getirmek için bileşimsel ve hesaplamalı yaklaşımı kullandığını gösteren bir derleme yayınladılar. Baskılama sisteminin bileşenleri (fonksiyonel monomer, çözücü, başlatıcı, kalıp molekül) otomatik sistemde küçük çapta sistemik değişim gösterir. Çok sayıda polimer bu yolla hızlı ve etkili bir şekilde hazırlanabilir. Üretilen mini-mip ler performanslarının hangi bileşimde en iyi olduğunu saptanabilir. (53) Teorik moleküler modelleme benzer bir yaklaşımdır. Bu teknik uygulamalara yönelik potansiyel monomeri tahmin için kullanılan hesaplamalı yaklaşımlara dayanır. Bu işlem, istenen formül tespit edilene kadar MIP sentezinin tüm pratik yönlerini kaldırır. Bu stratejinin avantajları Subrahmanyam ve arkadaşlarıtarafından gösterilmiş. Subrahmanyam ve arkadaşları modelleme yapmadan polimerin üzerindeki keratininin tanımlanmasında katkıda bulunmuştur. MAA kullanılarak geleneksel yöntemlerle üretilen MIP ler keratin ve keratinini ayırt edemez. Uygun fonksiyonel monomerin seçilmesi için rasyonel metod geliştirilmiş. Böylece keratinine duyarlı polimerler elde edilmiştir. Bununla birlikte teknik ön polimer çözeltisinin özelliklerinin hesaplamalarına dayanır. Polimerizasyon esnasında meydana gelen termodinamik değişimler açıklanamamaktadır. (54) 2.6.3. Ön Polimerizasyon Etkileşimlerinin İncelenmesi Fonksiyon monomer-kalıp molekül kompleksini ön polimerizasyon karışımlarının uyumluluk derecesi UV spekroskopi analizleri ile karakterize edilebilir. Yapılan analizler kalıp molekülün metakrilik asit-etilen glikol dimetakrilat(kopolimerlerle çapraz bağlı) ta kompleksleşmeyi incelemek için bir metot sunmaktadır. Ayrıca monomer-kalıp bileşiminin bilinmesiyle hazırlanan polimerde seçici tanımlı bölgelerin sayısının tahminini sağlar. Başka bir çalışma da bupivakain baskılanmış polimerde 1 H- NMR çalışmaları kullanılarak kalıp molekül ve fonksiyonel monomer arasındaki etkileşimi belirlemek için yapılmışve bu elektrostatik etkileşimlerin jelleşme aşamasına kadar sürdüğünü görülmüştür. (55) Osman ve arkadaşları non-kovalent kompleks oluşumundan sorumlu fonksiyonel gruplar da ayrıntılı bir araştırma yapmıştır. Bu araştırmada FTIR spektroskopi ve 1H-

23 NMR spektroskopik veriler kullanılarak 2-aminopiridin(kalıp molekül) ve metakrilik asit (fonksiyonel monomer) arasında oluşmuş olan kompleks incelenmiştir. (56) Şekil 8. de gösterildiği gibi FTIR sonuçlarına göre 2-APY ve MAA arasında: kooperatif etkileşimi sonucu çıkarabilir. FTIR ve 1 H-NMR verileri ön polimerizasyonunun daha iyi anlaşılmasını sağlayarak titrasyon ile etkileşimlerin stokiyometrisinin belirlenmesinde birbirini tamamlar. Ayrıca bu veriler FTIR kullanılarak elde edilen MIP performansı hakkındaki tahminlerde kolaylık sağlar. Şekil 8. Aminopiridin ile metakrilik asit arasındaki etkileşim mekanizması 2.7. Polimerizasyon Yöntemleri Farklı analitik uygulamalardaki gereksinimlerin çeşitliliği polimer hazırlama yönteminin seçiminde kısıtlamalara neden olmaktadır. Farklı polimerizasyon yöntemleri şunları içermektedir: Küresel tanecik üreten perflorukarbon sıvısında süspansiyon polimerizasyonu (Küresel tanecikler 5-50 µm arasında değişmektedir.) (57) Mikron boyutlu küresel tanecikler üreten mineral yağında süspansiyon polimerizasyonu (58) Spiral mikrokanalda süspansiyon polimerizasyonu (59) Mikron boyutlu küresel tanecikler üreten sulu iki basamaklı şişme metotları(60) Mikron boyutlu parçacıklar üreten çok basamaklı şişme yöntemleri (61) Tek tip submikron parçacıklar oluşturan çöktürme polimerizasyonu (62) Submikrometre MIP üreten çekirdek kabuğu emülsiyon polimerizasyonu (63)

24 Yüzeyler ve parçacıklar üzerine aşılanmış MIP filmleri (64;65) Polimerik küresel taneciklerin üretimi oldukça basittir ancak bununla birlikte hazırlamadaki yüksek kayıplardan dolayı tekniklerin kolayca endüstriyel uygulamalara aktarılmasında sorun oluşmaktadır.ayrıca yukarıdaki tüm moleküler baskılama tariflerinde uygulanamayan çoğu polimerizasyon yöntemleri ancak belirli koşullarda kullanılabilir. (66) Örneğin;flurokarbon polimerizasyon yönteminde asetonitril çözücü olarak kullanılırsa uygun olmaz.aksine mineral yağı polimerizasyon yönteminde ise sadece asetonitril gibi çözünmeyen porojenik çözücüler uygundur.çekirdek kabuğu nanoparçacıkları ve iki basamaklı şişme gibi sulu faz metotlarında çoğu polar molekül kalıplar ile çalışıldığında işlem başarısız olur. Küresel tanecik üretiminin bir diğer dezavantajı ise baskılama tekniklerinin çoğunun non-kovalent bağlarla olmasıdır. Örneğin, kalıp-molekül arasındaki etkileşiminin hidrojen bağlarıyla olması su bazlı küresel tanecik biçimleri için uygun değildir. Yeni MIP şekillerinin üretim metotları aktif bir araştırma alanıdır. 2004 te Pérez-Moral ve Mayes çalışmalarında MIP lerin hazırlanmasında yığın, süspansiyon, çökme, iki basamaklı şişme ve emülsiyon çekirdek kabuğu gibi kullanılan polimerizasyon yöntemlerini kapsamlı bir şekilde araştırıp karşılaştırmışlar. Farklı metotlarda üretilen polimerlerin dıştan görünümleri şekil 9. da gösterildiği gibi SEM ve TEM taramasıyla karakterize edilip değerlendirilmiş. Süspansiyon ve iki basamaklı şişme metotları ile hazırlanan polimerler küresel şekilde 6-40 µm çapında, çekirdek kabuğu yöntemiyle hazırlanan 72 nm çapında tek boyutlu küresel yapıda, çöktürme yöntemi ile hazırlan polimerler ise 700 nm boyutunda biraz düzensiz şekilli olduğu görülmüştür

25 Şekil 9. Farklı polimerizasyon yöntemiyle hazırlanmış polimerlerin SEM ve TEM mikroskoplarındaki görüntüleri Aşağıdaki bölümde baskılanmış polimerler için kullanılan farklı polimerizasyon yöntemleri açıklanmaktadır.