LABORATUVAR MATEMATİĞİ Dr. Zafer KÜÇÜKODACI GATA HEH Patoloji Servisi 22. ULUSAL PATOLOJİ KONGRESİ 7 Kasım 2012 Manavgat
AMAÇ 2.3. DNA extraction by boiling : Total DNA was extracted by a boiling method (Bell et al., 1998). Strains were grown overnight at 37 C on blood sheep agar plates (BioMe rieux, France). Three to five colonies of each sample were scraped from the surface of the agar plates and resuspended in 1 ml of sterile distilled water. The cell suspension was heated for 15 min at 100 C and was then centrifuged at 15,000 g for 10 min. The supernatant containing DNA was stored at 20 C until used as template for PCR reactions. 2.4. PCR amplification: Multiplex PCR (MPCR) assays were all directly performed from the supernatant obtained after the rapid DNA extraction method described above. An aliquot of 20 µl of this supernatant was added to 80 µl of a PCR mixture consisting of: 1x reaction buffer [16 mm (NH4)2SO4, 67 mm Tris-HCl (ph 8.8)], 0.2 mm concentration of each of the four deoxyribonucleoside triphosphates (datp, dctp, dgtp and dttp) (Promega Corp., Madison, WI), 2.5 mm MgCl2, 50 pmol of each Van primer and 4 pmol of each Ent primer, and 1.2 u of Taq DNApolymerase (Bioline, UK) After PCR amplification, 5 µl were removed and subjected to agarose gel electrophoresis (1.5% agarose, 1x TBE, 100V) to estimate the size of the amplified products by comparison with a 100-bp molecular size standard ladder (Roche Diagnostics, Germany). Claverie-Martin F et al. Diagn Microbiol Infect Dis. 2002;42:273-7
Laboratuvar matematiği 15000 g 50 pmol %1.5 agaroz jel 16 mm (NH 4 ) 2 SO 4 1x buffer Santrifügasyon Ölçü birimleri Konsantrasyon Molarite kavramı x faktörü
AMAÇ 1. Santrifugasyon birimlerini birbirine dönüştürme (rpm g) 2. Ölçü birimlerini birbirine dönüştürme (M μm) 3. Liyofilize maddeden istenilen konsantrasyonda hazırlama (primer) 4. Yüksek konsantrasyonlu çözeltiden düşük konsantrasyonlu kullanma (MgCl 2 ) 5. Konsantre çözeltilerin sulandırılması (10X X)
Komponent Volüm/reaksiyon Final konsantrasyon 10X PCR Buffer? 1X 25mM MgCI 2? 2.5 mm dntps (10 mm)? 200 M Primer A (liyofilize 855 g )? 0.2 M Primer B (liyofilize 424 g )? 0.2 M DNA Polym (d=5u/ L)? 2.5U/reaksiyon Template DNA (d=2ng/ L)? 20ng ddh 2 0 Toplam volüm 50 L
Santrifügasyon Yerçekimi etkisi yaratılarak maddelerin çökertilmesi Farklı kütleye sahip maddelerin ayrımı
Santrifügasyon Hız: RPM (Revolution per minute) RCF = Relative centrifugal forces = g RCF= (1.118 x 10-6 ) (rpm) 2 r RCF: Relative centrifugal forces (g) rpm: Revolution per minute r: Rotor yarıçapı
Nomogram
Laboratuvar matematiği 15000 g 50 pmol Santrifügasyon Ölçü birimleri
Ölçü birimleri Uzunluk = metre(m) Kütle = kilogram(kg) Madde birimi = mol(mol) Zaman = saniye(s) Elektrik akımı = amper(a) Isı = kelvin(k) Işık yoğunluğu = kandela(cd) International System of Units (SI)
Ölçü birimleri Mol: Bir maddenin avogadro sayısı (6,02x10 23 ) kadar molekül içeren miktarı Metre: Işığın bir vakum içerisinde saniyenin 1/299 792 458 sinde kat ettiği mesafedir. Kilogram: Kenarları 1 desimetre uzunluğunda olan bir küpün içerisindeki suyun kütlesidir. Litre: Kenarları 1 desimetre uzunluğunda olan bir küpün içerisindeki suyun hacmidir.
Metrik önekler Yotta Y 10 24 Zetta Z 10 21 Exa E 10 18 Peta P 10 15 Tera T 10 12 Giga G 10 9 Mega M 10 6 Kilo k 10 3 Hekto h 10 2 Deka da 10 1 Desi d 10-1 Santi c 10-2 Mili m 10-3 Mikro μ 10-6 Nano n 10-9 Piko p 10-12 Femto f 10-15 Atto a 10-18 Zepto z 10-21 Yocto y 10-24
Örnek 1 dl = 10-1 L 1 L = 10 3 ml = 10 6 μl = 10 9 nl 1 μg = 10-6 g 1 g = 10 3 mg = 10 6 μg 1 mol = 10 12 pmol 1 g/l = 100 mg/dl 1 mol/l = 10 3 nmol/μl
Laboratuvar matematiği 15000 g 50 pmol %1.5 agaroz jel Santrifügasyon Ölçü birimleri Konsantrasyon
Konsantrasyon Bir çözeltinin konsantrasyonu, çözeltinin belirli bir volümü içinde çözünmüş olan madde miktarıdır. Çözücü (solvent) denen dağıtıcı bir faz ile bir veya birçok dağıtılmış fazdan (çözünen, solüt) kurulan sıvı bir örnek durum çözelti (solüsyon) olarak tanımlanır
Konsantrasyon birimleri Formalite Molarite Molalite Normalite Mol kesri Yüzde Binde (ppt) Milyonda (ppm) Milyarda (ppb)
Yüzde miktar Total hacim içerisindeki miktar % olarak ifade edilmektedir. % W/V : Suda çözünen katılar için kullanılır. 50 ml %2 lik agaroz hazırlanması % V/V : Dilüe edilen solüsyonlar için kullanılır. 500 ml %70 lik etil alkol hazırlanması Çözünen madde kütlesi Hacim ağırlıkça yüzde = X100 Çözeltinin toplam hacmi
Örnek: 500 ml %70 lik etil alkol nasıl hazırlanır? %70 = Çözünen madde hacmi / 500 ml? = 0.70 x 500 ml? = 350 ml 100 ml de 70 ml 500 ml de? ml? = 500x70 / 100 = 350 ml 350 ml etil alkol 150 ml su eklenerek 500mL ye tamamlanır.
Örnek: 50 ml %2 lik agaroz nasıl hazırlanır? %2 = Çözünen madde kütlesi (m) / 50 ml m = 0.02 g/ml x 50 ml m = 1 g 100 ml de 2 g 50 ml de? g? = 2x50 / 100 = 1 g 50 ml sıvı içerisinde 1 g agaroz çözdürülür.
Laboratuvar matematiği 15000 g 50 pmol %1.5 agaroz jel 16 mm (NH 4 ) 2 SO 4 Santrifügasyon Ölçü birimleri Konsantrasyon Molarite kavramı
Molarite Bir litre çözelti içerisindeki çözünen maddenin mol sayısıdır M ile gösterilir Molarite = Çözünen madde mol sayısı Toplam hacim (L)
Molarite Çözünenin gram ağırlığının moleküler ağırlığına bölünmesine bir mol denir Bir çözeltinin molaritesi 3 kısım içerir Maddenin gram ağırlığı Maddenin moleküler ağırlığı Çözücü miktarı
ELEMENTLERİN ATOMİK AĞIRLIKLARI Element Sembolü Atomik ağırlığı Aliminyum Al 27.0 Baryum Ba 137.3 Demir Fe 55.9 Fosfor P 31.0 Hidrojen H 1.0 Kalsiyum Ca 40.1 Karbon C 12.0 Klorür Cl 35.5 Magnezyum Mg 24.3 Oksijen O 16.0 Sodyum Na 23.0 Potasyum K 39.1
Örnek: 500 ml 0.1M NaOH çözeltisi nasıl hazırlanır? M = 0.1 V = 500 ml = 0.5 litre M = Çözünen(mol) / Çözelti(litre) 0.1 = Çözünen / 0.5 L Çözünen = 0.1 X 0.5 = 0.05 mol veya 0.05 X 40 = 2g NaOH 2g NaOH tartılır. 500mL lik balon jojeye konur. Az miktarda suda çözdükten sonra hacim çizgisine kadar saf su ile doldurulur
Örnek: 3,6 nmol miktarındaki oligonükleotitten 50 pmol/ L konsantrasyonda olacak şekilde sulandırınız M = Mol / Hacim (V) M = 50 pmol/ L mol = 3.6 nmol V =? V = mol / M V = 3,6x10-9 mol / 5x10-11 mol/ L V= 72 L 1 L de 50 pmol? L de 3,6 nmol 3,6x10 3 pmol / 50 pmol = 72 L
Değişen konsantrasyon hesaplamaları Yüksek konsantrasyolu bir çözeltiden düşük konsantrasyonlu bir çözelti hazırlanmak istendiğinde C 1 X V 1 = C 2 X V 2 formülü kullanılır
Örnek: %70 lik alkolden, 100 ml %40 lık alkol nasıl hazırlanır? C 1 x V 1 = C 2 x V 2 %70 x V 1 = %40 x 100 ml V 1 = %40 x 100 / %70 V 1 = 57.14 ml Çözeltiyi hazırlayabilmek için 57.14 ml %70 lik alkol alınır ve saf su ile 100 ml ye tamamlanır
Örnek: 10mM kontrasyonundaki dntp miks solüsyonundan ne kadar konursa 50 µl master miks içerisinde 200 M final konsantrasyona ulaşılır? C 1 x V 1 = C 2 x V 2 10 mm x V 1 = 200 M x 50 L V 1 = 0,2 mm x 50 L / 10 mm V 1 = 1 L
Laboratuvar matematiği 15000 g 50 pmol %1.5 agaroz jel 16 mm (NH 4 ) 2 SO 4 1X buffer Santrifügasyon Ölçü birimleri Konsantrasyon Molarite kavramı X faktörü
X faktörü 10x, 5x, 20x konsantre solüsyonlar Kullanım öncesi, çalışma konsantrasyonuna dilüe edilir.
Komponent Volüm/reaksiyon Final konsantrasyon 10x PCR Buffer 5? L 1X 25mM MgCI 2 5? L 2.5 mm dntps (10 mm) 1? L 200 M Primer A 10 pmol? (liyofilize 855 g ) 0.062 g 0.2 M Primer B 10 pmol? (liyofilize 424 g ) 0.061 g 0.2 M DNA Polym (d=5u/ L) 0.5? L 2.5U/reaksiyon Template DNA (2ng/ L) 10? L 20ng ddh 2 0 Toplam volüm 50 L