KROMOTOGRAFİK YÖNTEMLER A. METODUN ÖZETİ Kromatografi, bir karışımda bulunan maddelerin, biri sabit diğeri hareketli faz olmak üzere birbirleriyle karışmayan iki fazlı bir sistemde ayrılması ve saflaştırılması yöntemidir. Yöntem karışımın gözenekli bir ortamda, hareketli bir çözücü etkisiyle, karışım bileşenlerinin farklı hareketleri sonucu birbirinden ayrılması olgusuna dayanır. Hareket eden faza hareketli faz, bahsedilen gözenekli ortama ise adsorban veya sabit faz denir. Kromatografi yardımıyla başka metotlarla birbirinden ayrılmaları çok zor ve hatta imkânsız olan maddeleri saf olarak ayırmak mümkündür. Kromatografi; laboratuarlarda pek çok organik ve anorganik maddenin tayininde (karbonhidrat, lipit, yağ asitleri, aminoasitler, proteinler ve türevleri, vitaminler) doping kontrollerinde, kanda, alkol ve zehirli gazların tespitinde, sentezlenen veya ayrıştırılan maddelerin saflıklarının kontrolünde başarıyla kullanılan bir metottur. Kromatografik çalışmaların ortak amacı; madde karışımlarını analitik veya preparatif amaçla birbirlerinden ayırmaktır ve kromatografik metotların bütün farklı modellerinde esas olan; hareketli (mobil) bir fazın, sabit (stasyoner, hareketsiz) yapıda bir faz içerisinden akması veya geçmesidir. Bütün kromatografik metotlar numune içerisindeki maddelerin sabit ve hareketli fazla etkileşimi sonucu ayrışmaları esasına dayanır. Bu ayrışmanın nedeni, maddelerin hareketli veya sabit faza olan farklı ilgileridir. Kromatografi tekniğinin temelinde üç ana unsur yer alır. 1. Sabit faz: Bu faz daima bir "katı" veya bir "katı destek üzerine emdirilmiş bir sıvı tabakasından" oluşur. 2. Hareketli faz: Bu faz daima bir "sıvı" veya "gazdan" oluşur. 3. Sabit faz, hareketli faz ve karışımında yer alan maddeler arasındaki etkileşimin türü: Kromatografide "yüzey tutunması veya adsorpsiyon" ile "çözünürlük" olguları temel etkileşim türlerini oluştururlar. Şayet sabit faz bir "katı" ise, karışımdaki maddelerle sabit faz arasında "yüzey tutunması (adsorpsiyon)" etkileşimi gerçekleşir. Bir kantitatif analiz tekniği olan kromatografide ayırmayı etkileyen parametreler: Kolon ile ilgili olanlar; Kolonun türü Kolonun boyutları Hareketli faz ile ilgili olanlar; Hareketli fazın türü Hareketli fazın bileşimi Hareketli fazın akış hızı
Ölçüm ile ilgili olanlar; Detektör türü Dalga boyu vb Örnek ile ilgili olanlar; Örneğin derişimi Örneğin hacmi KROMATOGRAFİ Türleri şu şekildedir 1. Gaz Kromatografisi 2. Sıvı Kromatografisi Gaz-sıvı kromatografisi (Durgun faz: sıvı) Adsorpsiyon kromatografisi (sıvı-katı) Gaz-katı kromatografisi (Durgun faz: katı) Partitisyon kromatografisi ( sıvı-sıvı) İyon değişimi kromatografisi Jel filtrasyon kromatografisi Uygulanacak olan deneyde Sıvı Kromotografisi Türleri içerisinden Adsorpsiyon kromotografisi uygulanacağı için metot bilgisi bölümünde sadece kısımda yer alan türler kısaca açıklanmıştır. 1. Gaz Kromatografisi Dağılım katsayıları birbirine yakın maddeleri içeren karışımlar gaz kromatografisi ile birbirinden ayrılır. Dağılma katsayısı K=Xm (A) / Xm (B) dir. Xm(A), A çözücüsündeki m maddesinin mol kesridir. Xm(B), B çözücüsündeki maddenin mol kesridir. Kromatografi de iki faz vardır ve bunların neden olduğu iki tür kuvvet mevcuttur. a) Durgun faz ve neden olduğu alıkoyucu kuvvet b) Hareketli faz ve neden olduğu sürükleyici kuvvet (N, He, Ne gibi) Gaz kromatografisinde hareketli faz gazdır. Adını da bundan almıştır. Sabit fazın yapısına göre gaz kromatografisi ikiye ayrılır. 1. Sabit fazı katı olan gaz-katı kromatografisi 2. Sabit fazı sıvı olan gaz sıvı kromatografisi Genelde gaz kromatografisi denilince akla gaz-sıvı kromatografisi gelir. Çünkü en çok kullanılan budur. Kromatografi türü Durgun faz Hareketli faz Etkin kuvvet Sıvı-Gaz Sıvı Gaz Adezyon Katı-Gaz Katı Gaz Absorbsiyon 2. Sıvı Kromatografisi
a) Adsorpsiyon Kromatografisi Ayrılacak bileşenlerin sabit katı faz üzerinde tersinir olarak adsorblanmaları esasına dayanır. Burada hareketli faz, adsorban üzerinde sıvı olarak hareket eder. Bileşenler birbirlerinden katı yüzeye olan farklı derecede ilgileri nedeniyle ayrılırlar. Adsorpsiyon denge sabiti büyük olan bileşen yüzeyde daha uzun kalırken, küçük olan daha kısa sürede kalmakta, hiç adsorplanmayan bileşen ise kolonda hiç geciktirilmeden hareketli faz ile taşınarak dışarı çıkmaktadır. Yüzeye adsorplanan bileşenler ise yüzeyle etkileşmelerine bağlı olarak farklı kalma sürelerinde kolonu terk etmektedir. Adsorpsiyon kromatografisinde sabit faz olarak adsorplama yapabilecek bir katı kullanılır. En çok kullanılan yüzeyleri polar sabit fazlar alümina ve silikajeldir. İyi bir sabit faz; 1. Ayrılması gereken maddeleri parçalamamalı, 2. Ayrılması beklenen maddeler ile kimyasal reaksiyon vermemeli, 3. Adsorpsiyon kapasitesi yüksek olmalı, 4. Adsorpladıkları maddeleri kolaylıkla geri vermelidir. Sabit faz olarak genellikle polar katılar kullanıldığından, hareketli faz olarak apolar veya çok az polar sıvılar kullanılır; benzen, oktan, kloroform gibi. Ayrılacak bileşenin sabit fazla etkileşmesi dipol-dipol çekmeleri, Van Der Waals kuvvetleri veya hidrojen bağları sonucunda gerçekleşir. Adsorpsiyon kromatografisi, polarlıkları farklı bileşenlerden oluşan karışımların ayrılmasında çok iyi sonuç verir. İyi bir hareketli faz; 1. Sabit fazın özelliklerini değiştirmemeli, 2. Örnekteki bileşenlerin hepsini çözmeli, 3. Düşük viskozitede olmalı, 4. Ekonomik ve istenen saflıkta kolayca bulunabilir olmalıdır. b) Partitisyon ( Sıvı-Sıvı ) Kromatografisi Bu kromatografi türünde ayrılacak bileşenin, durgun sıvı ile çözücü arasındaki dağılma oranı ayrılmanın ne kadar başarılı olacağını belirler. Bu nedenle dağılma kromatografisi olarak da adlandırılır. Destek katısı üzerine kaplanan bir sıvı sabit fazı oluşturur, diğer sıvı da hareketli fazı oluşturur: Bu Kromatografi, bu iki sıvı fazda çözünürlüğü farklı olan her bileşeni ayırmada kullanılabilir. Ayırma, bileşenin iki fazdaki dağılma oranına göre gerçekleşir. Burada sabit faz ve hareketli faz karışmamalı ve birbirlerini çözmemelidir. Durgun fazda çözünürlüğü yüksek olan bileşenler kolonda uzun süre kalırken, çözünürlüğü düşük olanlar daha kısa süre kalır. Sabit faz ayrılacak bileşen için iyi bir çözücü, fakat hareketli faz için kötü bir çözücüdür; yani iki fazın polarlıkları farklı olmalıdır. Hareketli fazın durgun fazdan daha az polar olduğu sistemlere normal faz kromatografi; tersi duruma ters faz kromatografi denir.
Fiziksel olarak destek katısı üzerine tutturulmuş durgun sıvı, taşıyıcı sıvı tarafından kolayca sürüklenip götürülebilir (kolon kanaması) ve destek katısı üzerindeki durgun fazın miktarı zamanla değişir. Böylece kolonlarla yapılan ayırmaların, tekrarlanabilirliliği az olmakta, kolon kısa zamanda işe yaramaz duruma gelmektedir. Bunu önlemek için sabit faz katı destek üzerine kimyasal olarak bağlanmaktadır. Böylece kolonların ömrü uzun olmakta ve tekrarlanabilir ayırmalar gerçekleşmektedir. c) İyon Değişimi Kromatografisi Çözeltideki iyonların, ters yüklü destek katısı iyonlarına olan ilgisine dayalı bir ayırmadır. Durgun faz zayıf ya da kuvvetli, katyon ya da anyon değiştirici bir reçinedir. Reçinenin sabit yükü (-) ise buna katyon değiştirici reçine, (+) ise de anyon değiştirici reçine adı verilir. Analiz sırasında reçinenin tamamen iyonlaşmış durumda olması gerekmektedir. Hareketli faz genellikle tamponlanmış: istenen iyonların oluşmasına neden olan belli bir ph değerinde sulu çözeltidir ve yükü katının sabit yükünün tersi olan zıt iyonu içerir. Yükü, hareketli fazın zıt iyonları ile aynı olan iyonik yapıdaki örnek bileşenleri katıya bağlanmak için zıt iyonlarla yarışırlar. Zıt iyonu yerinden ederek katıya kuvvetle bağlanan uygun yükte- bileşenler kolonda uzun süre kalırken, katıya zayıfça bağlanan, uygun yükte olmayan veya yüksüz olan bileşenler kolonu çabuk terk eder. İyon değiştirme kromatografisi, kullanılan iyon değiştiricinin anyon veya katyon aktarmasına göre sırasıyla anyon değiştirme kromatografisi veya katyon değiştirme kromatografisi olarak adlandırılır. Cl - ve I - karışımının nitrat bağlanmış anyon değiştirici RNO 3 ile bileşenlerine ayrılmasında geçerli dengeler aşağıdaki biçimdedir: Cl - + RNO 3 RCl + NO 3 - I - + RNO 3 RI + NO 3 - R: Çözünmeyen Matriks RNO 3 : Anyon Değiştirici d) Jel-Filtrasyon Kromatografisi Kimyasal olarak inert olması gereken katı faz, bir jel ya da gözenekli bir organik bileşiktir. Hareketli faz katı gözeneklerini doldurmuştur. Ayırma, örnek bileşenlerinin molekül büyüklüklerine göre olur. En içteki gözeneklere ulaşabilen küçük moleküllü bileşenler, kolonda uzun süre kalırken, büyük moleküllüler daha kısa süre kalırlar. B. DENEYİN AMACI Bu deneyle kolon kromatografisi yöntemi aracılığıyla metilen mavisi ve metil oranjın ayrılmaları amaçlanmıştır.
C. ARAÇ, GEREÇ VE MALZEMELER Alumina, Etanol (%95), Metil oranj Metilen mavisi Cam Kolon, Cam yünü, Erlen D. DENEYİN YAPILIŞI Bir veya iki mg metil oranj ve 5 mg metilen mavisi 2.5 ml etanol içinde çözülür. Şekilde gösterildiği gibi alumina dolgu maddeli bir kolon hazırlanır. Kolonun dolgu maddesi hareketli faz olarak kullanılıcak etonol ile doyurulur. Hazırlanan metilen mavisi ve metil oranj karışımından yaklaşık 50 ml e kolonun üst kısmından ilave edilir. Etonel ilavesi ile yürütme işlemine başlanır. Kolon boyunca mavi boyanın turuncu boyadan daha hızlı şekilde aşağı indiğini ve ayrıldığını göreceksiniz. Kolondan gelen çözeltide mavi rengi alacaktır. Çözelti renksizleşinceye kadar devam edin. Mavi boyayı içeren çözeltiyi farklı bir behere aktarın. Metil oranj, kolon dolgusu tarafından çok daha fazla adsorblandığı için, yürütücü çözeltiyi daha polar bir çözelti ile değiştirmeliyiz. Ayrıma hunisindeki etanolü saf su ile değistirin. Metil oranj tamamen kolondan temizlenene kadar çözelti eklemeye devam edin. Daha sonra ayrılan çözeltiyi baska bir behere aktarın. Artık ayrı kaplarda iki boyaya sahipsiniz. Şekil 1 Kolon kromotografisi aparatı