Sunum planı. Protein yaşam döngüsü ve moleküler tıp Protein analiz yöntemleri Krotomotografik metotlar

Transkript

1 Dr. Suat Erdoğan

2 Sunum planı Protein yaşam döngüsü ve moleküler tıp Protein analiz yöntemleri Krotomotografik metotlar Yüksek basınçlı sıvı kromatografi (High- pressure liquid chromatography, HPLC). Kağıt kromotografi (Paper chromatography) İnce- tabaka kromotografi (Thin- layer chromatography, TLC).

3 Moleküler 0bbın amacı nedir? Moleküler tıbbın en önemli amacı, hücresel ve moleküler düzeyde beceri ve bilgi birikimini kullanarak bilimsel araştırmalar ve pratik klinikte hastalıkların teşhisi ve tedavisinde faydalanmaktır. Protein ve/veya modifiye proteinlerin varlığı, yokluğu veya yetmezlikleri özel fizyolojik durumlar veya hastalıklar ile ilişkili olabilir. Proteomik teknikleri biyomarkır (işaretleyici) geliştirilmesi, ilaç formülasyonu ve teşhis için kullanılabilir. Örn. biyomarkır: Prostat Spesifik Antijen (PSA) prostat kanserinin teşhisinde kullanılır.

4 Son yıllardaki araştırmaların çoğu, kanser, diyabet ve kalp hastalıkları ile ilişkili proteinlerin tespiti üzerinedir.

5 Proteinlerin yaşam döngüsü: Proteinler doğar, olgunlaşır, fonksiyonunu yerine ge?rir, yaşlanır ve ölür

6 Proteinler analiz öncesi saflaş0rılması gerekir Kapsamlı bir fiziksel ve fonksiyonel özelliklerin analizi için yüksek saflıkta protein elde zorunludur. Hücreler her biri farklı konsantrasyonlarda binlerce çeşit protein içerir. Protein analizlerinde özel saflaştırma yöntemleri kullanılmalıdır. Kromotografik teknikler bu amaçla kullanılır Bu teknikler bir proteini diğerinden; Büyüklüklerine Yüklerine Hidrobik yapıları ve Özel moleküllere (ligand) bağlanma kapasitelerine göre ayrıştırılabilir.

7 Kromatografi Kromatografi, bir karışımda bulunan maddelerin, biri sabit diğeri hareketli faz olmak üzere birbirleriyle karışmayan iki fazlı bir sistemde ayrıştırılması ve saflaştırılması yöntemidir. Çeşitli maddelerin hareketli faz yardımıyla, sabit faz üzerinde, değişik hızlarla hareket etmeleri veya sürüklenmeleri esasına dayanır. İlk kez Rus botanikçi Mikhail Tsvett (1903) tarafından geliştirilen bir yöntemdir.

8 Kromatografik Metotların Sınıflandırılması A. Ayırma Mekanizmasına Göre Sınıflandırma Adsorbsiyon Kromatografi Dağılma (Partition) Kromatografi İyon- değiştirme kromatografi Jel geçirgenlik Kromatografi (Moleküler- Exclusion) Zone Elektroforez Afinite (veya Bioafinite) Kromatografi Kiral Kromatografi B. Hareketli Faza Göre Sınıflandırma Sıvı Kromatografisi (LC) Gaz Kromatografisi (GC) C. Uygulanan Tekniğe Göre Sınıflandırma Kolon Kromatografi Düzlem Kromatografi (İnce Tabaka Kromatografi, TLC; Kağıt Kromatografi, PC) D. Kullanım Amacına Göre Sınıflandırma Analitik Kromatografi (Kalitatif Kromatografi; Kantitatif Kromatografi) Preparatif Uygulamalar (Karışımlardan Saf madde Elde Etme)

9 Kolon kromotografisi Bu tekniğin amacı, karışımlardaki belirli bileşiklerin ayrıştırılmasını sağlamaktır. Kolon kromotografinde sabit faz matriks; cam, plastik veya çelikten tüp içerisine doldurulmuş küçük boncuklardan oluşur (kolon). Mobil faz (hareketli faz) kolondan boncukların geçişine izin vermezken, mobil fazın sıvı içindeki akışına imkan sağlar. Hareketsiz faz boncuklar kimyasal iyon değiştirme, hidrofobik etkileşim veya afinite kromatografisi için gerekli olan, asidik, bazik, hidrofobik ya da ligand benzeri gruplarla yüzeyleri kaplanıp türevleri oluşturulabilir. Hareketli faz kolonun uç kısmından çıktığında otomatik olarak küçük porsiyonlar halinde (fraksiyon) tüplere toplanır.

10 Column Chromatography ü Column chromatography is a way of separating things based on a certain characteristic. The matrix of the column effect the criteria for with the mixture is separated and the separations seep through the column and are collected at the bottom. ü The purpose of the technique is to separate certain components based on many different matrices available.

11 hhp:// 6Q9mQ4

12 Yüksek- Basınçlı Sıvı Kromotografisi (HPLC) anali?k ayırma tekniği olarak en yaygın kullanılan cihazdır Yaygın kullanılma sebepleri duyarlılığı, kantitatif tayinlere kolaylıkla uyarlanabilir olması, uçucu olmayan veya sıcaklıkla kolayca bozunabilen bileşiklerin ayrıştırılmasına uygunluğudur. En önemlisi ise sanayinin birçok bilim dalının ve toplumun birinci derecede ilgilendiği maddelere geniş bir şekilde uygulanabilirliğidir. Bu tip bileşiklere örnek olarak amino asitler, proteinler, nükleik asitler, karbonhidratlar, ilaçlar ve pestisitler verilebilir. HPLC ünitesi: Degasser, pompa, autosampler, kolon ve dedektör olmak üzere dört kısımdan oluşmaktadır. Degasser; mobil fazlarda mevcut çözünmüş gazların giderilmesini sağlar.

13 HPLC

14 hhp://

15 Boyut dışlama kromatografisi (Size- Exclusion Chromatography) Proteinleri boyutlarına göre ayrıştırır. Kolon malzemesi poröz mikroskopik taneciklerden oluşur. Küçük moleküller poröz matriksin içine girebildikleri için, kolonun içinden geçen hareketli faza geri dönmeleri zaman alır; büyük moleküller ise hareketli fazın akıntısı ile hızla kolondan geçerler. Poröz matrikse giren moleküllerin matriksin içinde geçirdikleri süre büyüklükleri ile orantılıdır. Protein saflaştırılmasında, kolondan çıkan eluent zamana bağlı olarak farklı deney tüplerinde toplanır. Saflaştırılacak proteinin bulunmadığı tüplerdeki malzeme atılır; kalan çözelti, arzulanan protein ve onunla aynı boydaki diğer proteinlerden oluşur.

16 Size exclusion chromatography ü Size- exclusion chromatography, uses porous particles to separate molecules of uncommon sizes. ü It is commonly used to separate biological molecules, and to determine molecular weights and molecular consequence distributions of polymers.

17 İyon değişimi kromatografisi Maddelerin iyonik grupları ile iyon değiştiricideki iyonik grupların eşdeğer miktarlarının karşılıklı yer değiştirmesi esasına dayanır. İyon değiştirme kromatografisi, kullanılan iyon değiştiricinin anyon veya katyon aktarmasına göre sırasıyla anyon değiştirme kromatografisi veya katyon değiştirme kromatografisi olarak adlandırılır.

18 İyon değişimi kromotografisi

19 Afinite Kromatografisi Seçiciliği fazla olan bu yöntem, kromatografi tekniklerinin en yenisidir. Antijen Antikor Enzim Substrat Reseptör İlaç gibi oldukça spesifik etkileşimlere dayanır.

20 Kolonun dolgu maddesine, (dekstran, poliakrilamid, selüloz vb) spesifik protein ile kompleks yapabilen bir ligand bağlanır. Afinite kolonundan saflaştırılması istenilen molekül çözeltisi geçirilirse sadece istenilen molekül kolondaki ligand tarafından tutulur. İstenmeyenler ise kolondan uygun bir tamponla ayrıştırılır. Kolonda tutulan ilgili molekül spesifik elüsyonla kolondan alınır. Afinite kromotografi Bu metotla kompleks karışımlardan belirli bir maddeyi küçük miktarlar halinde ayırmak mümkün olur.

21 Jel Elektroforezi ile proteinlerin ayrış0rılması Büyüklük, yük ve konformasyon bakımından birbirlerinden farklılık gösteren yüklü makromolekülleri (protein, nükleik asit) yüksüz bir ortamda birbirinden ayırt etmek için jel elektroforez yöntemi kullanılır. Aminoasit, protein gibi makromoleküller elektriksel alanda net yüklerine bağlı olarak pozitif ya da negatif kutba doğru hareket eder. Sonuç olarak; proteinler elektriksel bir ortamda yükü ile doğru orantılı ancak şekli ve büyüklüğü ile ters orantılı bir hızda hareket ederler. Bir partikülün jel elektreoforezinde göç oranını etkileyen faktörler; (i) Elektriksel alan gücü, (ii) Partikülün net yükü ve (iii) Elektroforez ortamının yoğunluğudur.

22 Elektroforez çeşitleri Poliakrilamit jel elektroforezi (PAGE): Poliakrilamit jellerin kullanıldığı genellikle proteinlerin ayrılmaları için kullanılır. 2. Agaroz jel elektroforezi: Nükleik asitlerin ayırt edilmeleri için kullanılır. 3. Pulsed Field Jel elektroforezi: Büyüklükleri 10 Mb a kadar olan moleküllerin ayırt edilmelerinde kullanılan bir sistemdir. 4. Nişasta jel elektroforezi

23 SDS- PAGE

24 Proteinlerin amino asit dizi analizi Bir proteinin amino asit içeriğini belirlemek için, peptid bağlarını hidroliz etmek amacıyla örnek ilk önce hidroklorik asit ile muamele edilir. İdrar ve diğer vücut sıvılarından elde edilen örneklerdeki proteinlerin amino asit yapısının belirlenmesinde çeşitli metotlar kullanılır. Örn. Edman Yöntemi

25 Edman Reaksiyonu (Edman degreda?on) En önemli ve en çok kullanılan metottur. Edman reaksiyonuyla sadece N- terminal ucu tanınmaz, aynı zamanda bu reaksiyonun tekrarlanması ile uzun polipeptidlerin amino asit sırası tam olarak tespit edilir. Fenilizotiyosiyanat (PITC) alkali ortamda peptidin N- terminal amino grubu ile reaksiyona girerek N- terminal amino asidin fenilizotiyosiyanat türevi oluşur. Polipeptid parçalanmaz, sadece bir amino asit eksik polipeptid kalır. Bu reaksiyon son amino aside kadar devam ettirilir. Amino grubu modifiye olmuş (örn. asetil, formil grupları) proteinlerde bu reaksiyon çalışmaz.

26 Edman Yöntemi ile polipep?d dizgesinin belirlenmesi

27 Amino asit dizgesi saptanırken 1. Protein zinciri denatüre edilerek moleküler yapı çözülür, 2. - S- S- bağları açılır, 3. Daha küçük peptidlere yıkımlanır (proteazlar ile), 4. Küçük peptidlerin (oligopeptidler) dizeleri saptanır ve böylece 5. Büyük proteinin amino asit dizgesi hesaplanır.

28 Niçin protein sekans analizi yapılır? Protein sekans analizi, bir proteinin amino asit dizgesinin belirlenmesidir. Ayrıca, proteinlerin konformasyonu hakkında bilgi verir. ü Canlılardaki proteinlerin yapı ve fonksiyonlarının belirlenmesi, ü hücresel işlemlerin anlaşılması, ü özel metabolik yollar ve ü hastalıklarda ilaç geliştirilmesine yardımcı olur.