T.C. SÜLEYMAN DEMİREL ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ KİRAZLARDA ANAÇ/KALEM İLİŞKİLERİNİN BİYOKİMYASAL YÖNTEMLERLE İNCELENMESİ

Transkript

1 T.C. SÜLEYMAN DEMİREL ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ KİRAZLARDA ANAÇ/KALEM İLİŞKİLERİNİN BİYOKİMYASAL YÖNTEMLERLE İNCELENMESİ Sultan Filiz GÜÇLÜ Danışman: Prof. Dr. Fatma KOYUNCU DOKTORA TEZİ BAHÇE BİTKİLERİ ANABİLİM DALI ISPARTA-2010

2 İÇİNDEKİLER sayfa İÇİNDEKİLER... i ÖZET... iii ABSTRACT... iv TEŞEKKÜR... v ŞEKİLLER DİZİNİ... vi ÇİZELGELER DİZİNİ... vii SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ... ix 1. GİRİŞ KAYNAK ÖZETLERİ Aşı Uyuşmazlığı Aşı Uyuşmazlığının Önceden Tahmin Edilmesine Yönelik Yapılan Çalışmalar Peroksidaz İzoenzimi ve Aşı Uyuşmasındaki Rolü Fenolik Bileşikler ve Aşı Uyuşmazlığı MATERYAL VE YÖNTEM Bitkisel Materyal ve Özellikleri Yöntem Örneklerin alınması Peroksidaz izoenzimi ile ilgili çalışmalarda kullanılan yöntem Peroksidaz ekstraksiyonu Peroksidaz aktivitesinin tayini Ziraat kiraz çeşidi ve kiraz anaçlarının peroksidaz profillerinin çıkarılması Fenolik bileşiklerin tayininde kullanılan yöntem Fenolik bileşiklerin ekstraksiyonu Toplam fenolik madde içeriklerinin belirlenmesi Fenolik bileşiklerin HPLC ile belirlenmesi İstatistik Analizler ARAŞTIRMA BULGULARI Peroksidaz İzoenzimi ile İlgili Bulgular Peroksidaz aktivitesi i

3 Ziraat kiraz çeşidi ve kiraz anaçlarının peroksidaz profilleri Fenolik Bileşiklerle İlgili Bulgular Toplam fenolik madde içerikleri Fenolik bileşiklerin değişimine ilişkin elde edilen bulgular Gallik asit P-kumarik asit Kateşin Kuarsetin TARTIŞMA ve SONUÇ KAYNAKLAR ÖZGEÇMİŞ ii

4 ÖZET Doktora Tezi KİRAZLARDA ANAÇ/KALEM İLİŞKİLERİNİN BİYOKİMYASAL YÖNTEMLERLE İNCELENMESİ Sultan Filiz GÜÇLÜ Süleyman Demirel Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Bahçe Bitkileri Anabilim Dalı Danışman: Prof. Dr. Fatma KOYUNCU Kuş kirazı, Kara idris, Sarı idris, MaxMa 14, MaxMa 60, Gisela 5 ve CAB 6P anaçları üzerine aşılanmış 0900 Ziraat çeşidinin 1-yaşlı ağaçlarında yürütülen bu çalışmada; aşılama öncesi ve sonrasında aşı elemanlarında (anaç, aşı yeri, aşı sürgünü) peroksidaz aktivitesi, peroksidaz profilleri, toplam fenolik bileşikler ve polifenollerin değişimi incelenmiştir. Bu amaçla, toplam peroksidaz aktivitesi ve toplam fenolik madde içeriği spektrofotometreyle, peroksidaz profilleri Poliakrilamid Jel Elektroforeziyle (PAGE), ve fenolik madde değişimi ise Yüksek Basınçlı Sıvı Kromatografisi (HPLC) ile analiz edilmiştir. Aşılama öncesinde anaçların toplam peroksidaz aktiviteleri Ag.dk (Kuş kirazı) ile 7.83 Ag.dk (Kara idris) arasında değişmiş ve anaçlar arasındaki fark istatistik olarak önemli bulunmuştur. Peroksidaz aktivitesi Ag.dk olan 0900 Ziraat çeşidi ile en yakın değere Prunus avium anacı, en farklı değere ise Kara idris ve Gisela 5 anaçları sahip olmuştur. Aşılamadan sonra aşı yerinin altında ve aşı sürgününde peroksidaz aktivitesi artmıştır. Bu artış heterogenetik kombinasyonlarda özellikle de 0900 Ziraat /Gisela 5 ve 0900 Ziraat /Kara idris aşılarında daha yüksek değerdedir. Bulgularımız peroksidaz aktivitesinin aşı uyuşmazlığının erken belirlenmesinde bir araç olarak kullanılabileceğini ortaya koymaktadır. Aşısız anaçlarda, kalemde ve aşılamadan sonra aşı elemanlarında Rf=0.39 olan bir A bandı ve Rf=0.42 olan B bandı bulunmuştur Ziraat /Kuş kirazı aşılarının toplam fenolik madde miktarının heterogenetik aşı kombinasyonlarından daha düşük olduğu saptanmıştır. Heterogenetik kombinasyonların aşı sürgünlerinde 0900 Ziraat /Kuş kirazı aşılarından daha fazla miktarda p-kumarik asit belirlenmiştir. Kateşin miktarı ise homogenetik aşılamada bütün aşı elamanlarında genel olarak daha yüksektir. Kiraz çeşitleri için farklı genetik orijinli Prunus türlerinin anaç olarak kullanılması, Prunus avium anaçlarına göre aşı uyuşmazlığı bakımından risk faktörü olarak kabul edilebilinir. Anahtar Kelimeler: Peroksidaz, fenolik madde, aşı uyuşmazlığı, gallik asit, p-kumarik asit, kateşin, kuarsetin 2010, 103 sayfa iii

5 ABSTRACT Ph.D. Thesis INVESTIGATION OF ROOTSTOCK/SCION RELATIONSHİPS IN SWEET CHERRIES BY BIOCHEMICAL METHODS Sultan Filiz GÜÇLÜ Suleyman Demirel University Graduate School of Applied and Natural Sciences Department of Horticulture Supervisor: Prof. Dr. Fatma KOYUNCU In this study, which was carried out on 1-year old trees of 0900 Ziraat variety grafted on Kuş kirazı, Kara idris, Sarı idris, MaxMa 14, MaxMa 60 and Gisela 5 rootstocks; peroxidase activity, peroxidase profiles, total phenolic compounds and changes of amounts of poliphenols were investigated on graft partners (rootstock, graft area, scion) in both before and after grafting. For this purpose, total peroxidase activity and total phenolic compounds were determined by spectrophotometer, peroxidase profiles were determined by Poliakrilamid Gel Elektrophoresis (PAGE) and the change of phenolic compounds was determined by High Performance Liquid Chromatography (HPLC). Total peroxidase activities of rootstocks before grafting had changed between Ag.min (Kuş kirazı) and 7.83 Ag.min (Kara idris) and found statistically important. The peroxidase activity of 0900 Ziraat was Ag.min and the closest value occurred in Prunus avium rootstock. The most different values occurred in rootstocks of Kara idris and Gisela 5. The peroxidase activity has increased in rootstock and graft scion. This increase had higher values in heterogenetic combinations especially in 0900 Ziraat /Gisela 5 and 0900 Ziraat /Kara idris grafts. Our findings showed that peroxidase activity could be used as a parameter in early determination of graft incompatibility. An A Band with the value of Rf=0.39 and a B band with the value of Rf=0.42 have been determined in rootstocks and scion before grafting and graft partners after grafting. It was found that total phenolic compounds of 0900 Ziraat /Kuş kirazı grafts was lower than the heterogenetic graft combinations. More p-cumaric acid was determined in graft scion of heterogenetic combinations more than grafts of 0900 Ziraat /Kuş kirazı. However, the amount of catechin was generally higher than all graft partners of homogenetic grafting. For cherry varieties using genetically different Prunus as rootstocks could be accepted as a risk factor for graft incompatibility compared to the grafting with rootstocks of Prunus avium. Key words: Peroxidase, phenolic matter, graft incompatibility, gallic acid, p-cumaric acid, catechin, quarcetin 2010, 103 pages iv

6 TEŞEKKÜR Bu araştırma için beni yönlendiren, çalışma imkânı sağlayan ve çalışmanın her aşamasında bilgi ve tecrübeleri ile bana destek olan danışmanım sayın Prof. Dr. Fatma KOYUNCU ya sonsuz teşekkürlerimi sunarım. Tez çalışmam sırasında çok değerli katkı ve yardımlarını aldığım Tez İzleme Komitesi Üyeleri Sayın Hocalarım Prof. Dr. M. Atilla AŞKIN ve Prof. Dr. Serra HEPAKSOY a şükranlarımı sunmayı bir borç bilirim. Laboratuar çalışmalarımda ve tezimin yazım aşamasında değerli katkı ve yardımlarını esirgemeyen sayın hocalarım Prof. Dr. Mehmet Ali KOYUNCU ve Yrd. Doç. Dr. Mehmet POLAT a teşekkür ederim. Laboratuar çalışmalarında desteğini gördüğüm Yrd. Doç. Dr. Evrim ARICI ve istatistik değerlendirmelerindeki katkılarından dolayı Yrd. Doç. Dr. Özgür Koşkan a teşekkürlerimi sunarım. Tezime katkılarından dolayı Arş. Gör. Derya BAYINDIR, Arş. Gör. Funda CELEPAKSOY ve Mehmet Ali SARIDAŞ ile çalışmamın yürütülebilmesi için gerekli maddi desteği sağlayan (1609-D-08 no lu proje) SDU Bilimsel Araştırma Projeleri Yönetim Birimi Başkanlığı na teşekkür ederim. Tezimin her aşamasında bana güç veren, maddi ve manevi desteklerini sürekli yanımda hissettiğim sevgili eşime ve aileme sonsuz sevgilerimi sunarım. Sultan Filiz GÜÇLÜ ISPARTA, 2010 v

7 ŞEKİLLER DİZİNİ Şekil 2.1. Kirazda floem ve ksilem taşınımında meydana gelen muhtemel hormonal ilişkiler Şekil 2.2. Lignin biyosentez yolu Şekil 2.3. Şikimik asit yolu Şekil 3.1. Örneklerin alındığı fidanlıktan görünüm Şekil 3.2. Örneklerin alınması Şekil 3.3. Ektrakte edilmiş örnekler Şekil 3.4. HPLC cihazı ve örneklerin cihaza yerleştirilmesi Şekil 3.5. Denemede kullanılan standartlara ait kromatogram Şekil 4.1. Aşı elemanlarının farklı dönemlerdeki peroksidaz aktiviteleri Şekil 4.2. Aşı yapılmadan önce 0900 Ziraat kaleminin ve anaçların peroksidaz profilleri Şekil 4.3. Aşı yapıldıktan 12 ay sonra farklı bölgelerden alınan örneklerin peroksidaz profilleri Şekil 4.4. Aşı elemanlarının farklı dönemlerdeki toplam fenolik madde içerikleri Şekil 4.5. Aşı elemanlarının farklı dönemlerdeki gallik asit miktarları Şekil 4.6. Aşı elemanlarının farklı dönemlerdeki p-kumarik asit miktarları Şekil 4.7. Aşı elemanlarının farklı dönemlerdeki kateşin miktarları Şekil 4.8. Aşı elemanlarının farklı dönemlerdeki kuarsetin miktarları vi

8 ÇİZELGELER DİZİNİ Çizelge 3.1. Denemede kullanılan gradient program Çizelge 4.1. Aşısız anaçların ve kalemin peroksidaz aktiviteleri Çizelge 4.2. Aşılamadan sonra aşı yerinin altından alınan örneklerin peroksidaz aktiviteleri Çizelge 4.3. Aşılamadan sonra aşı yerinin üstünden alınan örneklerin peroksidaz aktivitesi Çizelge 4.4. Aşı yerlerinin peroksidaz aktiviteleri Çizelge 4.5. Aşısız anaçların ve kalemin toplam fenolik madde içerikleri Çizelge 4.6. Aşılamadan sonra aşı yerinin altından alınan örneklerin toplam fenolik madde içerikleri Çizelge 4.7. Aşılamadan sonra aşı yerinin üstünden alınan örneklerin toplam fenolik madde içerikleri Çizelge 4.8. Aşı yerlerinin toplam fenolik madde içerikleri Çizelge 4.9. Aşısız anaçların ve kalemin gallik asit miktarları Çizelge Aşılamadan sonra aşı yerinin altından alınan örneklerin gallik asit miktarları Çizelge Aşılamadan sonra aşı yerinin üstünden alınan örneklerin gallik asit miktarları Çizelge Aşı yerlerinin gallik asit miktarları Çizelge Aşısız anaçların p-kumarik asit miktarları Çizelge Aşılamadan sonra aşı yerinin altından alınan örneklerin p-kumarik asit miktarları Çizelge Aşılamadan sonra aşı yerinin üstünden alınan örneklerin p-kumarik asit miktarları Çizelge Aşı yerlerinin p-kumarik asit miktarları Çizelge Aşısız anaçların ve kalemin kateşin miktarları Çizelge Aşılamadan sonra aşı yerinin altından alınan örneklerin kateşin miktarları Çizelge Aşılamadan sonra aşı yerinin üstünden alınan örneklerin kateşin miktarları vii

9 Çizelge Aşı yerlerinin kateşin miktarları Çizelge Aşısız anaçların ve kalemin kuarsetin miktarları Çizelge Aşılamadan sonra aşı yerinin altından alınan örneklerin kuarsetin miktarları Çizelge Aşılamadan sonra aşı yerinin üstünden alınan örneklerin kuarsetin miktarları Çizelge Aşı yerlerinin kuarsetin miktarları viii

10 SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ ABA Absisik asit. C Santigrat derece CaCl 2 Kalsiyum klorür dk Dakika g Gram GA 3 Gibberellik asit HPLC High Performance Liquid Chromatography H 2 O 2 Hidrojen peroksit HCl Hidrokolorik asir IAA Indol-3-asetik asit μg Mikrogram mg Miligram ml Mililitre µl Mikrolitre M Molar mm Mili molar Na-acetate Sodyum asetat nm Nanometre PAGE Poliakrilamid jel elektroforezi (polyacrlecide gel electrophores) PVP Polyviniyl prolydone Rf Relative mobility (oransal ilerleme) rpm Revolutions per minute (dakikadaki devir sayısı) TEMED Tetrametiletilendiamin V Volt ix

11 1. GİRİŞ Ülkemiz birçok meyve türünün olduğu gibi kirazın da anavatanı sınırları içersindedir. Güney Kafkasya, Hazar Denizi ve Kuzey Anadolu bölgesi kirazın anavatanı olarak bilinmektedir. Sert çekirdekli meyve türlerinden olan kiraz, ülkemizde daha çok taze tüketim amacıyla yetiştirilen bir meyvedir. Dünya piyasasında önemli bir pazara sahip olan Türkiye, 0900 Ziraat kiraz çeşidi ile önem kazanmıştır (Özbek, 1978). Kirazlar tohumla çoğaltıldığında, heterozigot kalıtsal yapıları nedeniyle açılım gösterdiğinden, çelikle çoğaltılmalarında da çeşitli sorunlarla karşılaşıldığından vegetatif çoğaltma yöntemlerinden birisi olan aşı ile çoğaltılmaktadırlar (Öz, 1982; Webster and Schmidt, 1996). Diğer meyve türlerinde olduğu gibi kiraz yetiştiriciliğinde de iklim, toprak, hastalık, zararlı gibi engelleyici ve sınırlayıcı etmenlerin ortadan kaldırılmasında, verimlilik, erken meyveye yatma, meyve kalitesi gibi pazar isteklerinin karşılanmasında anaç kullanımı önem kazanmaktadır (Kaşka ve Yılmaz, 1974). Kiraz yetiştiriciliğinde uzun yıllar boyunca klasik yetiştiricilik yapılmış ve çöğür anaçlar kullanılmıştır. Kuş kirazının (Prunus avium L., mazzard) kirazlar için anaç olarak kullanılması neredeyse 2500 yıl öncesine dayanmakta olup, bu anaç kiraz ve vişne ile aşı uyuşmasının iyi olması nedeniyle hâlâ tercih edilen bir anaçtır. İdris (Prunus mahaleb) in kirazlara anaç olarak kullanılması ise Fransa da 1768 de başlamıştır lü yılların ortalarında Amerika da kullanılmaya başlanmış ve yirminci yüzyılın başlarında da tüm dünyada popüler hale gelmiştir. Tohumunun kolayca çimlenmesi, daha küçük taçlı ağaçlar oluşturması (kuş kirazının %75-80 i kadar), susuzluğa ve kirece toleranslı olması nedeniyle günümüzde de yaygın olarak kullanılan bir anaçtır (Webster and Schmidt, 1996). Modern kiraz yetiştiriciliğine geçilmesiyle çeşitli iklim ve toprak koşullarına uyumlu, hastalık ve zararlılara dayanımı iyi, birim alandan daha fazla ve yüksek kalitede ürün verebilecek ve erken dönemde verim sağlayabilecek anaç arayışına girilmiştir. Bu nedenle Avrupa ve Amerika da yapılan ıslah çalışmaları sonucunda elde edilmiş klon anaçlar kullanılmaya başlanmıştır. 1

12 Son 50 yılda 17 ülkede 100 den fazla kiraz anacının ortaya çıkmasıyla sonuçlanan projeler yürütülmüştür. Çoğaltma tekniklerinin 20. yüzyılın ikinci yarısından itibaren gelişmeye başlamasıyla başta Fransa, ABD, Almanya, Macaristan ve Belçika olmak üzere birçok ülke Prunus mahaleb, Prunus cerasus ve Prunus avium türlerinden seleksiyon veya türler arası melezlemelerle SL-64, F 12/1, Charger, Tabel/Edabriz, Stockton Morello, Weiroot serisi, CAB seleksiyonları, Colt, Gisela serisi gibi bazı klon anaçları elde etmişlerdir (Webster and Schmidt, 1996; Hrotkó, 2008) yılı verilerine göre ton kiraz üretim miktarıyla dünyada birinci sırada yer alan ülkemizde en fazla kuş kirazı ve idris çöğür anaçları kullanılırken son yıllarda MaxMa serileri, F 12/1, SL 64, Tabel Edabriz ve Gisela 5 klon anaçları da kullanılmaya başlanmıştır (Burak et al., 2008). Ayrıca özel firmalar tarafından piyasaya sürülen Inmil, Damil, PH-L, ve Colt anaçları da ülkemizde deneme aşamasındadır ton üretim miktarıyla ikinci sırada yer alan Amerika Birleşik Devletleri nde kirazlar için anaç olarak MaxMa serileri, F 12/1, Gisela 5, Gisela 6 ve Gisela 12 anaçları yaygın olarak kullanılmaktadır. Önemli kiraz üreticilerinden İtalya da ise anaç olarak Colt, SL 64, MaxMa 14, Prunus. mahaleb, kiraz çöğürleri ve CAB 6P yaygın olarak kullanılmaktadır. Tabel Edabriz, Gisela 5, Weiroot 158 ve Victor ise fidanlıklarda az ya da çok ticari anlamda kullanılmaktadır. Ayrıca üzerinde denemeler tamamlanmamış olan Gisela 6, P-HL serisi, Pi-Ku serisi ve Adara ümitvar görülmektedir. Mazzard F12/1, Vladimir, Prunus fruticosa, Inmil GM 9, Damil GM 61/1 ve Camil GM 79 anaçları da test edilmiş ve İtalya için uygun görülmemiştir (Anonymous, 2010; Godini et al., 2008). Kirazda klon anaç kullanımın yaygınlaşmasıyla anaçların sahip oldukları diğer özelliklerinin yanında, aşı uyuşması bakımından da çeşitlerle en iyi uyuşan anaçların belirlenmesi için yapılan araştırmalar yoğunluk kazanmıştır. Aşı uyuşmazlığı araştırıcılar tarafından uzun yıllardır üzerinde çalışılan ancak mekanizması henüz tam olarak çözülememiş oldukça karmaşık, anatomik, fizyolojik ve biyokimyasal bir süreçtir. 2

13 Aşı uyuşmasında çoğunlukla başlangıç aşamasında aşı noktası birleşmesi sağlanmakta, fakat zamanla, aşı noktasının başarısızlığından ya da anormal yapı oluşumlarından dolayı stres belirtileri görülmektedir. Bu stres belirtilerinden bazıları ağacın dış yapısında gözle görülebilir anormallikler şeklinde olabildiği gibi gözle görülemeyen bazı yapısal farklılıklar şeklinde de olabilmektedir (Hartmann et al., 1997; Pina and Errea, 2005). Uyuşmazlık aşamasında anaç ve kalem arasında başarılı bir birleşme olmaması birçok morfolojik ve fizyolojik olayla ilişkilidir. Kambiyum oluşumundaki düzensizlikler ve yeni dokuların farklılaşmasındaki eksiklikler, kusurlu lignifikasyonun meydana gelmesi ve vasküler devamlılığın eksikliği gibi değişiklikler ağacın aşı birleşme yerinden kırılmasına neden olmaktadır (Webster and Schmidt, 1996; Hartmann et al., 1997). Aşı uyuşmazlığının gözle görülür belirtilerini beklemek meyvecilikte büyük kayıplara yol açmaktadır. Bu nedenle uyuşmazlığın erken tespitine yönelik çalışmalar önem kazanmıştır. Aşı uyuşmazlığının önceden tahmin edilebilmesinde geliştirilecek bir metot sayesinde özellikle erken anaç seleksiyonu ve yeni çeşitlerin aşı uyuşması yönünden özelliklerinin belirlenmesinde büyük bir avantaj sağlayacaktır. Ayrıca uyuşur kombinasyonlar tercih edilirken uyuşmaz kombinasyonlardan kaçınılarak hem ürün kayıpları hem de ekonomik kayıplar önlenebilecektir (Gülen, 2000). Aşı uyuşmazlığının tespitine yönelik yapılan ilk çalışmalar arazi koşullarında gerçekleştirilmiş olup anaç ve kalemin büyüme özelliklerinin gözlenmesi üzerine olmuştur. Anaç ve kalemin fizyolojik gelişme periyotlarının aynı olmadığı durumlarda kombinasyonlar uyuşmaz olarak nitelendirilmiştir. Büyüme ve gelişme dönemleri aynı olan anaç ve kalemden oluşan kombinasyonlarda da uyuşmazlık görülünce bu yöntemin güvenilir olmadığı görülmüştür. Daha sonra teknolojinin de gelişmesiyle laboratuar çalışmalarında fizyolojik ve anatomik çalışmalara önem verilmiştir. Fizyolojik çalışmalarda anacın ve kalemin solunum hızlarının belirlenmesi, karbonhidrat taşınımının belirlenmesi gibi konulara ağırlık verilmiştir 3

14 (Moing, 1987). Aşı uyuşmazlığının açıklanmasında fizyolojik çalışmaların da yetersiz kalmasıyla anaçtan, kalemden ve aşı bölgesinden farklı dönemlerde örneklerin alınıp incelenmesi esasına dayanan anatomik çalışmalar üzerinde durulmuş ve bu konuda birçok meyve türünde çalışmalar yapılmıştır (Jeffree and Yeoman, 1983; Ünal ve Tanrısever, 1986; Andrews and Marques, 1993). Anatomik çalışmalar uzun yıllar boyunca önemini korumuş ancak zamanla bunların da aşı uyuşmazlığını açıklamada yetersiz kaldığı görülmüştür. Araştırıcılar aşı uyuşmazlığı hakkında daha ayrıntılı bilgi verecek hem daha hızlı, hem de daha güvenilir yöntemler araştırmaya başlamışlardır. Bu aşamada biyokimyasal analizlerle aşı uyuşmazlığının tespitine yönelik çalışmalar önem kazanmıştır. Biyokimyasal analizler ilk olarak aşı bölgesindeki letal maddelerin incelenmesi üzerine yoğunlaşmış, bu çalışmalarda aşı bileşenlerinin birinden diğerine geçen toksik maddelerin (prunasin) uyuşmazlığa neden olduğu bildirilmiştir (Özçağıran, 1974). Fenolik bileşiklerin birçok fizyolojik ve biyokimyasal olayda öneminin belirlenmesi üzerine aşı uyuşmazlığında da fenolik bileşiklerin rolleri araştırılmaya başlanmıştır (Errea, 1998). Benzer şekilde izoenzimlerin, özellikle de peroksidaz izoenziminin lignin oluşundaki görevinin belirlenmesi üzerine aşı uyuşmazlığına izoenzimler yönünden yaklaşımlar önem kazanmıştır (Gaspar et al., 1982). Bu yönteme göre anaç ve kalemden alınan kabuk örneklerinin izoperoksidaz profilleri karşılaştırılmakta ve benzer profile sahip olanlar uyuşur kombinasyonlar olarak nitelendirilmektedirler. Aşı uyuşmasının daha erken tespit edilmesi ile ürün kayıplarının önlenmesi, aşı bileşenlerine ve aşı noktasına daha az zarar vererek araştırma imkânının olması nedeniyle biyokimyasal yöntemler önem kazanmış ve son yıllarda da çalışmalar bu yönde devam etmektedir. Kirazda aşı uyuşmazlığı seksüel uyuşmazlık kadar yaygın olmamakla birlikte özellikle gecikmiş uyuşmazlık görülmekte ve bunun nedeni hâlâ tam olarak çözülememektedir. Aşılamadan sonraki ilk yıllarda her zaman gözle görülür uyuşmazlık belirtileri ortaya çıkmamaktadır. Belirtiler aşılamadan 4, hatta 10 yıl sonra görülebilmekte, ağacın kurumasına ve aşı yerinden kırılmasına neden olmaktadır. Kalemin farklı orijinden gelen bir anaç üzerine aşılanmasıyla kirazlarda da aşı uyuşmazlığı sorunu ortaya çıkabilmektedir (Sitarek, 2006). 4

15 Hrotkó (2008), kiraz için kullanılan anaçların elma anaçları kadar çok araştırılmadığını, kirazda aşı uyuşmazlıklarıyla ilgili çalışmaların çok sınırlı olduğunu bildirmiştir. Bu çalışma ile kirazda aşı uyuşmazlığının biyokimyasal yöntemlerle erken tespit olanaklarının araştırılması hedeflenmiştir. Bu amaçla 0900 Ziraat kiraz çeşidinin bazı kiraz anaçlarıyla olan kombinasyonlarından alınan kabuk örnekleri; peroksidaz aktivitesi, izoperoksidaz profilleri ve fenolik bileşiklerin belirlenmesi gibi farklı biyokimyasal yöntemler bir arada kullanılarak aşı uyuşmazlığı bakımından incelenmiştir. 5

16 2. KAYNAK ÖZETLERİ 2.1. Aşı Uyuşmazlığı Aşı uyuşmazlığı bugüne kadar birçok araştırıcı tarafından tanımlanmıştır. Yılmaz (1992), aşı uyuşmazlığını aşılanan iki bitkinin birlikte tam bir ortak doku oluşturamaması ya da yetersiz bir doku oluşturması, ilerleyen yıllarda bitkide fizyolojik çabaların, farklı iki parçanın karşılıklı olarak gereksinimlerini karşılamada yetersiz kalmaları ve tek bir bitki oluşturamamaları olarak tanımlamıştır. Başka araştırıcılar tarafından da aşılamadan sonra, farklı iki bitkinin birleşmesini gerçekleştirecek dokular arasında kaynaşma olmaması ve buna bağlı olarak başarısız kaynaşma uyuşmazlık olarak tanımlanmaktadır (Hartmann et al., 1997). Meyve ağaçlarında göz veya kalem ile anaç arasında karşılıklı bir ilişki söz konusudur. Aşı bileşenlerinin arasında başarılı bir aşı kaynaşmasının meydana geldiği, gelişmenin sağlıklı bir şekilde devam ettiği kombinasyonlara uyuşur kombinasyonlar, başarılı bir birleşmenin meydana gelmediği kombinasyonlara da uyuşmaz kombinasyonlar adı verilmektedir (Özçağıran, 1974; Yılmaz, 1992; Hattmann et al., 1997). Usenik ve Štampar (2000), aşı uyuşmazlığını, aşı kaynaşması sırasında fizyolojik ve biyokimyasal süreçte meydana gelen bir aksaklık sebebiyle aşı bileşenleri arasındaki zayıf birleşme olarak tanımlamışlardır. Koyuncu (2009), aşı uyuşmazlığını aşı başarısını etkileyen bütün faktörler (bitki cinsi, sıcaklık, nem, anacın ve kalemin büyüme faaliyetleri, çoğaltma teknikleri, virüs bulaşması, hastalık ve zararlılar, hormonlar ve diğer kimyasal maddeler arasındaki ilişkiler) optimum olduğu halde; aşılama sınırları içerisindeki iki bitkinin aşılandığı zaman, başarılı bir şekilde kaynaşma gösterememesi, tutma oranının çok düşük olması ve tek bir bitki gibi yaşamını devam ettirememesi olarak tanımlamıştır. 6

17 Santamour (1988), McCully (1983) i kaynak göstererek uyuşur bir aşı kombinasyonunda kaynaşma sırasında meydana gelen olayları a) kesim yüzeyinde nekrotik bir bölgenin meydana gelmesi b) bu bölgede kalemin ve anacın canlı hücrelerinin genişlemesi c) kallus oluşturmak için hücre bölünmesi d) anaç ve kalem arasındaki kohezyon kuvveti e) vasküler elementlerin farklılaşması e) kallus hücrelerinden vasküler kambiyumun farklılaşması ve f) yeni kambiyumdan ikincil floem ve ksilemin oluşması olarak basamaklara ayırmıştır. Aşı kaynaşmasındaki temel aşamalar; uygun sıcaklık ve nem koşulları altında anaç ile kalemin kambiyum bölgelerinin sıkıca temas etmesi, birleşme yerinde kallus hücrelerinin oluşumu, kallus hücrelerinin farklılaşması ve vasküler devamlılığın sağlanması olarak özetlenebilir (Moore, 1984; Hartmann et al., 1997). Bu aşamaların birinde veya birkaçında meydana gelen aksaklıklar aşı uyuşmazlığına neden olmaktadır. Aşı noktasında güçlü bir birleşmenin olmaması, ağacın büyüme sezonunda yapraklarında görülen sararmalar, erken yapraklanma, vegetatif büyüme döneminde sürgünlerin uçtan geriye doğru kuruması ve ağaçta hasta bir görüntünün oluşması, erken dönemlerde ağaçların ölmesi, anaç ve kalemlerde belirgin olarak büyüme farklılığının görülmesi, aşı noktasının altında veya üzerinde şişkinlik şeklinde aşırı büyümelerin olması, anacın fazla dip sürgünü vermesi, aşı noktasında ani kırılmalar ve kırılma yüzeyinin düzgün olması, aşı sürgünlerinin toprağa paralel büyümesi aşı uyuşmazlığında görülen dış görünüş belirtilerdir (Özçağıran, 1974; Hartmann et al., 1997). Bu belirtilerden bir veya birkaçının görülmesi aşı kombinasyonlarının mutlaka uyuşmaz olduğunu ortaya koymaz. Çünkü belirtilerden bazıları, çevre şartlarının elverişsiz olmasından, bitki besin elementi eksikliğinden, hastalık ve zararlılardan ya da aşı tekniğinde yapılan hatalar sonucunda da ortaya çıkabilmektedir. Uyuşmazlığın en güvenilir belirtileri olarak anaçların veya birkaç senelik gelişmeden sonra kalemin aşı yerinden oldukça düz bir yüzeyle ayrılması ve toprağa paralel büyüyen aşı sürgünleri örnek verilebilir (Özçağıran, 1974; Hartman et al., 1997). Aşı uyuşmazlığı mekanizması üzerine çalışmalar yoğunlaştıkça uyuşmazlık daha yakından incelenmeye başlanmış ve gruplara ayrılmıştır. Taşınır (translocated) tip uyuşmazlıkta anaç ve kalem arasına her iki aşı bileşeniyle de uyuşan bir ara anaç 7

18 kullanıldığında uyuşmazlık önlenemez. Çünkü uyuşmazlığa neden olan faktör ara anaçtan karşı tarafa geçer. Taşınır tip uyuşmaz kombinasyonlarda kalem kısmında aşırı büyümeler görülmesine rağmen aşı bölgesinde normal vasküler bağlantı sağlanmaktadır. Bu uyuşmazlık tipinde aşı yerinde karbonhidratların hareketi sınırlanmakta ve aşı yerinin üst kısmında birikme, alt kısmında ise azalma meydana gelmektedir. Yapraklarda sararma, kök sisteminde bozulma, geriye doğru ölüm gibi belirtiler görülmektedir. Bu belirtilerin yanında bu tip uyuşmazlığın tipik belirtisi floem dejenerasyonu ve kabuk dokusunda nekrotik bir alanın kahverengi bir hat şeklinde oluşmasıdır. Myrobolan B erik anacı üzerine aşılı Hale s Early şeftali uyuşmaz kombinasyonunda araya her ikisiyle de uyuşan Brompton eriği kullanılırsa uyuşmazlığın ortadan kalkmadığı görülür. Dokular bozulur, zayıf bir birleşme meydana gelir. Şeftali kaleminin alt kısmında anormal miktarda nişasta birikir. Aşı yerinin altında, anaç gövdesinde ise az miktarda nişasta birikir. Bu uyuşmazlık tipinde kombinasyonun tersine çevrilmesiyle (anacın kalem, kalemin anaç olması halinde) meydana gelen karşıt kombinasyonlar uyuşma gösterebilir (Özçağıran, 1974; Moing, 1987; Errea, 1998). Diğer bir uyuşmazlık tipi olan yerleşik (localized) tip uyuşmazlıkta ise aşı bileşenleri arasına her ikisiyle de uyuşan ara anaç konulduğunda uyuşmazlık ortadan kalkmaktadır. Bu tip uyuşmazlıkta kambiyumdan farklılaşacak olan yeni floem, ksilem ve lignin oluşumunda problem vardır. Anaç ve kalemin iletim dokuları arasında karakteristik kesilmeler görülür. Kalem ile anaç aşı yerinden kırılarak birbirinden ayrılır. Yerleşik uyuşmazlıkta aşı noktasında meydana gelen kararmalar belirleyici rol oynamaktadır. Nişasta birikimi taşınır uyuşmazlıktaki kadar yoğun değildir (Özçağıran, 1974; Andrews and Marquez, 1993). Bu uyuşmazlık tipine en belirgin örnek ise ayva anacı (Cydonia oblanga L.) üzerine doğrudan aşılanan Barlett armut çeşidinde görülen uyuşmazlık şekli gösterilmektedir. Beurre Hardy veya Old Home gibi armut çeşitlerinin ara anaç olarak kullanılmasıyla uyuşmazlık tamamen ortadan kaldırılabilmektedir. Bu uyuşmazlık tipinde kombinasyonların karşıt kombinasyonlarında da uyuşmazlık görülmektedir (Özçağıran, 1974; Çelik, 1982; Moing and Carde, 1988; Dumanoğlu, 1991). 8

19 Bazı aşı kombinasyonlarında anaç ve kalem oldukça uzun bir süre normal bir gelişme gösterir. Daha sonra ağaçlarda gelişme birdenbire yavaşlar, bir süre sonra gelişme durur ve ağaçlar aynı gelişme mevsimi içersinde kurur. Bu duruma gecikmiş uyuşmazlık denir. Burada ortaya sonradan çıkan uyuşmazlığın kendisi değil, belirtileridir. Örneğin idris anacı ile kiraz arasındaki uyuşmalık dikimden 8-10 yıl sonra ortaya çıkabilir (Özçağıran, 1974; Errea, 1998). Bunların dışında bazı meyve türlerinde, yıllarca aşı uyuşmazlığı olarak bilinip kabul edilmiş, ancak daha sonra uyuşmazlık olmadığı anlaşılan latent virüs veya mikoplazma benzeri organizmalardan kaynaklanan aşı uyuşmazlığı belirtilerine çok benzeyen belirtiler görülmüştür. Aşı birleşmesinde meydana gelen başarısızlık uyuşmazlık belirtilerine benzer fakat nedeni patojenlerdir. Burada aşıda meydana gelen anormalliklerin, etkenin aşılama yoluyla belirti vermeyen dayanıklı bireyden hassas bireye geçtiği bildirilmiştir. Cevizlerde siyah çizgi (blacline) olarak adlandırılan bu duruma kiraz yaprak kıvırcıklık virüsü neden olmaktadır (Özçağıran, 1974; Santamour, 1988). Uyuşmazlık gösteren ağaçlarda aşı yerinde floem dokusu hücreleri ve ince bir kambiyum tabakası ölür. Ölü doku bir noktadan başlar ve aşı yerinin etrafına yayılarak ağacı çepeçevre kuşatır. Ölü kambium ve kabuk şeridinin genişliği önceleri birkaç hücreden ibarettir. Fakat daha sonra anaç tarafına doğru genişleme gösterir. Belirtinin ilk görünüşünün üzerinden 5 yıl veya daha fazla bir süre geçtikten sonra bu şeridin kalınlığı 5-30 cm ye ulaşır. Ölü şeridin üst kısmında kalem kurur. Siyah çizgi arazının görülmesini takiben 5 yıl içinde aşı yerinin altında anaçtan yeni sürgünler meydana gelir. Ölü şeridin ağaç gövdesini sarması ilerledikçe sürgünler de çoğalır (Özçağıran, 1974). Aşı uyuşmazlığının nedenleri ve mekanizması ile ilgili çeşitli görüşler mevcuttur. Uyuşmazlık kavramını bu görüşlerin hiç birisiyle tek başına açıklamak mümkün değildir. Bu görüşlerden birisi karşılıklı hücrelerin teması; hücre duvarı bozulması, hücre duvarı açıklıklarının görülmesi ve plasmodesmata oluşumu gibi temel aşamaları kapsayan hücresel tanıma (recognation) mekanizmasıdır. Bu hipoteze göre aşı bileşenlerinin karşılıklı teması sırasında ortaya çıkan parçalama enziminden dolayı hücre duvarının yıkımı gerçekleşmektedir (Jeffree and Yeoman, 1983). 9

20 Parkinson vd. (1987), hücresel tanıma olayında karşılıklı hücrelerden polisakkaritlerin enzimatik olarak serbest bırakılmasının rol oynayabileceğini savunmuşlardır. Plasmodesmatalar yüksek dinamik yapısıyla hücre duvarındaki gözenekleri birbirine bağlayan, her bir bitki hücresinin ona bitişik hücrelerle haberleşmesini sağlayan, aşı kaynaşmasında hücresel birleşmedeki rolleriyle önem kazanan yapılardır. Plasmodesmata oluşumundan sonra plasmalemmalar, kompleks yapı içersinden uyuşmazlığı kontrol eden protein moleküllerinin serbest bırakılmasını sağlamaktadır (Pina and Errea, 2005). Pina vd. (2009), plasmodesmatanın hücreler arası köprü kurulmasında, dolayısıyla aşı kaynaşmasındaki önemini dikkat çekmişler ve Prunus larda kallus kültürleriyle plasmodesmatanın aşı başarısı üzerine etkilerini incelemişlerdir. Diğer taraftan bu teori Marianna 2624 erik /şeftali kombinasyonu açıklamada yetersiz kalmaktadır. Çünkü bu kombinasyon ters çevrildiğinde kombinasyon uyuşmaz olmaktadır. Bu durum hücresel tanıma mekanizmasının aşı uyuşması için tek şart olmadığını desteklemektedir (Andrews and Marquez, 1993; Hartmann et al., 1997). Aşı bileşenlerinin yaralamaya karşı verdikleri tepki ve lignin oluşumu da uyuşmazlık olayının açıklanmasında yararlanılan görüşlerden birisidir. Güçlü bir aşı noktası için, hücre duvarındaki lignin büyük bir öneme sahiptir. Lignin oluşumunun ve karşılıklı olarak orta lamel oluşumunun engellenmesi zayıf aşı noktası oluşumuna neden olmaktadır (Hartman et al., 1997). Uyuşur armut/ayva aşı kombinasyonunda, aşı noktasındaki hücre duvarlarında oluşan ligninin diğer hücre duvarlarındakine yakın miktarda iken; uyuşmaz kombinasyondaki aşı noktasında bulunan hücre duvarlarında lignine rastlanmamıştır (Errea et al., 1994). Parankima hücrelerinin yeniden yapılanması, hücre farklılaşmasına etki eden faktörlerin içinde bulunduğu yaralanma ve ligninleşme mekanizması içerisinde değerlendirilmektedir (Andrews and Marquez, 1993; Donaldson, 2001). Hrotkó (2008), kirazlarda hormonal bir sistemin anaç/kalem ilişkilerini etkileyebileceğinden bahsetmiştir. Özellikle kiraz türünde aşı kaynaşmasıyla hormonal denge ile ilgili çok az çalışma bulunduğunu, yeni anaçlarla ilgili bilgilerimiz gelişirken, bu anaçların çeşitlerle uyuşma durumunun araştırılması 10

21 gerektiğini bildirmiştir. Kirazlarda büyüme sırasında meydana gelen olaylarda oksin ve sitokinin taşınması, bazı farklarla birlikte diğer meyve türleriyle benzerlik göstermektedir. Bu konunun açıklanmasında kullanılan hipotezlerden birisi sürgünkök iletişim sisteminde, floem ve ksilemde meydana gelen zincir reaksiyonlardır. Karbonhidratlar ve oksin floemden taşınırken, mineraller, GA ve sitokinin ksilemde taşınmaktadır. Bu taşınma olayı başarılı bir aşı kaynaşmasıyla yakından ilgilidir (Lockard and Schneider, 1981; Faust, 1989; Hrotkό, 2008). Oksinler, genç yapraklarda ve sürgün ucunda sentezlenip basipetal yönde taşınmaktadırlar (Salisbury and Ross, 1992; Taiz and Zeiger, 2006). Oksinlerin basipetal yönde, floemde taşınması kirazda bulunan oksin koruyucusu bazı fenolik bileşiklerin IAAoksidaz ve peroksidaz enzimlerinin parçalanmasıyla sekteye uğramaktadır. Farklı anaçların peroksidaz ve IAA-oksidaz enzimlerinin aktivitelerindeki mevsimsel değişimine etkili olabileceği düşünülmektedir (Schmidt and Feucht, 1981). Oksin akışının basipetal yönde sorunsuz bir şekilde gerçekleşmesiyle floemdeki kalburlu boruların ve tabakalarda bir anormallik gözlenmez ve başarılı bir aşı kaynaşması sağlanabilir. Floemde yetersiz oksin taşınımıyla daha küçük kalburlu borular ve gelişmemiş kalburlu tabakalar meydana gelmektedir. Bu da aşı yerindeki kaynaşmayı olumsuz etkilemektedir (Schmidt and Feucht, 1981). Anaçlarda ve kök floemlerindeki oksin taşınımı, anaçların genleri tarafından belirlenen katabolik ve koruyucu etkiler tarafından etkilenmektedir. Sitokininler, genç kök uçlarından sentezlenip, morfogenetik süreçte önemli bir rol oynamaktadırlar. Aşı noktasına ve kalem kısmına aşırı derece sitokinin uygulaması, uyuşmazlık fenolü olarak bilinen prunin oluşumuna neden olmaktadır. Gibberellinlerin aşı uyuşmasındaki rolleri tam olarak açıklığa kavuşmamakla birlikte, büyüme kontrolündeki etkileriyle bağdaştırılmaktadır (Feucht and Treutter 1991). Hrotkό (2008), kiraz aşılarında meydana gelebilecek muhtemel hormon değişimini Şekil 2.1. deki gibi özetlemiştir. 11

22 Sürgün ucu büyümesi; mevsimsel değişim anaçlar tarafından etkilenebilir. Genç yapraklarda oksin sentezlenmesi Yaprak büyümesi, fotosentez kapasitesi Oksin ve karbonhidratların floemde taşınması IAA korunması veya kateşin gibi fenolik bileşiklerden veya enzimlerden dolayı IAA parçalanması. Anaçlar tarafından mevsimsel farklılık IAA ve sitokinin dengesiyle dallanma gerçkeleşir Taşınan oksin aşı yerine ulaşır Aşı yerindeki taşınma kapasitesi Anaç floemine taşınma IAA kalburlu boruların oluşumunu kontrol eder aşı uyuşması meydana gelir. IAA korunması veya kateşin gibi fenolik bileşiklerden dolayı IAA parçalanması IAA-oksidaz, peroksidaz. Anaçlar tarafından mevsimsel farklılık Kök büyümesi. Karbonhiratlar, IAA taşınması ve genetik olarak anaçlar uygunsa Aşırı derecede sitokinin; prunin oluşumu ve muhtemel uyuşmazlık Aşı sürgünü Aşı uyuşması Minerallerin, gibberellinlerin ve sitokinininlerin ksilemde taşınması Kök uçlarından sitokinin sentezi Şekil 2.1. Kirazda floem ve ksilem taşınımında meydana gelen muhtemel hormonal ilişkiler (Hrotkό, 2008) Uyuşur aşı kombinasyonunda aşı kaynaşmasındaki başarının ve vasküler elementlerin oluşumunun oksin varlığıyla doğru orantılı olduğu, aşı kaynaşması için gerekli olan diğer şartlar sağlandığında bitki büyüme düzenleyicilerin hücre bölünmesini teşvik ederek kaynaşmada rol oynadığı başka araştırıcılar tarafından da bildirilmiştir (Stoddart and McCully, 1980; Errea, 1998). Bu şekildeki doğrudan etkilerinin yanında absisik asit, indol butirik asit ve gibberellik asit aşı uyuşmasında önemli bazı fenolik bileşiklerin sentezlenmesinde dolaylı olarak rol oynamaktadırlar. Uyuşmazlıkta rol oynadığı düşünülen flavonların sentezleri ABA ve GA tarafından 12

23 teşvik edilmektedir. Bu Flavonlar kallus gelişmesini engellemekte ve sentetik bir sitokinin olan benziladanin sentezini arttırmaktadırlar (Feucht and Treutter, 1991). Aşı bölgesinde kaynaşmanın sağlanabilmesi vasküler yapıyla çevrilmiş olan kallus dokusu sayesinde gerçekleşmektedir. Aşı işlemi sırasında kesilen vasküler dokulardan serbest kalan oksinlere reseptör olmakta bu da kallus dokusunun farklılaşarak ksilem ve floem arasındaki köprüyü oluşturmasını sağlamaktadır (Sachs, 1981; Hartmann, 1997). Aşı uyuşmazlığında bitki büyüme düzenleyici maddelerin rolü üzerine çalışmalar yoğunlaştıkça uyuşmazlık toksinleri mekanizması ön plana çıkmıştır. Bu mekanizmanın en iyi şekilde anlaşıldığı kombinasyon armut/ayva kombinasyodur. Quince-A ayva anacı üzerine Barlett armut çeşidi aşılandığında ayva anacında bulunan bir siyanogenik glikozit olan prunasin armut çeşidine geçer ve β-glikozidaz tarafından hidrolize edilerek aşı yüzeyinde siyanid ortaya çıkarılmaktadır. Siyanid, floem ve ksilemi yoğun olarak deformasyona uğratarak karşılıklı madde taşınımını durdurmaktadır. Aşı yüzeyinde hücresel nekroza sebep olmaktadır. Araya her ikisiyle de uyuşan Old Home ara anacı konulduğunda, prunasin metabolize olamaz ve kalem kısmına geçemez. Böylece uyuşmazlık durumu ortadan kalkmış olur (Özçağıran, 1974; Hartmann et al., 1997). Moore (1986), prunasinin uyuşmazlıkta oynadığı rolü şöyle özetlemiştir; 1) prunasin ayvanın vegetatif aksamında bulunurken, armutta yoktur. 2) aşı kaynaşması sırasında ayvada bulunan prunasin armuda geçer. 3) armut ve ayva arasındaki uyuşmazlığın derecesi armut dokularındaki glikozidaz enziminin oransal aktivitesine bağlıdır. 4) sıcaklığın artmasıyla glikozidin parçalanma reaksiyonu hızlanmaktadır. 5) aşı bölgesine polisulfat gibi bir kimyasal uygulaması glikozidaz aktivitesini, dolayısıyla da armut ve ayva arasındaki uyuşmazlık oranını azaltmaktadır. Ayva üzerine aşılı armutlarda fenolik bir madde olan arbutinin de anatomik bozulmalara neden olduğu ileri sürülmektedir. Parçalandığı zaman hidrosiyanik asit meydana getiren bir diğer glikozit de amigdalindir (C 20 H 27 NO 11 ). Yapılan çalışmalarda şeftalilerde amigdalin miktarının 13

24 yüksek, eriklerde daha düşük olduğu saptanmıştır. Uyuşmazlığın seyir durumuyla amigdalin miktarı arasında bir ilişki görülmektedir. Şeftalide uyuşmazlık daha hızlı, erikte ise daha yavaş seyretmektedir (Özçağıran, 1974) Aşı Uyuşmazlığının Önceden Tahmin Edilmesine Yönelik Yapılan Çalışmalar Aşı uyuşmazlığı ile ilgili çalışmalar uzun yıllardan beri sürmektedir. Meyve yetiştiriciliğinde ilk aşamada, aşı uyuşmazlığı tanımlanmaya çalışılmış, belirtileri hakkında araştırmalar yapılmıştır. Aşı uyuşmazlığının belirtileri ortaya konulduktan sonra uyuşmazlığa neden olan faktörler ve mekanizması araştırma konusu olmuştur. Sonraki yıllarda aşı uyuşmazlığı nedeniyle ürün kayıpları arttıkça araştırıcılar uyuşmazlığın erken tespitine yönelik çalışmalar yapmaya başlamışlardır. Anaç ve kalemin ayrı ayrı büyüme özelliklerinin incelenmesiyle başlayan çalışmalarda, uyuşmazlık belirtilerinin görülmesiyle uyuşur ve uyuşmaz kombinasyonlara karar verilmeye çalışılmıştır. Anacın ve kalemin farklı gelişme kabiliyetinde olmasının aşı uyuşmazlığı belirtisi olamayabileceğinin ortaya çıkmasından sonra bu yöntem geçerliliğini yitirmiştir. Aynı zamanda bu yöntem, uzun yıllar boyunca ağaçların incelenmesine gerek duyulması nedeniyle yetersiz kalmıştır (Errea et al., 2001). Bu nedenle laboratuar çalışmaları önem kazanmış, fizyolojik, anatomik ve biyokimyasal çalışmalar başlamıştır. Aşı uyuşmazlığının belirlenmesinde kullanılan tekniklerden biri olan fizyolojik çalışmaların temelini aşı noktasının altında ve üstünde, aşı bölgesinde nişasta birikimi, solunum oranı, anaçtan kaleme ve kalemden anaca su ve besin maddelerinin taşınım hızı ile uyuşmazlık arasındaki ilişki oluşturmaktadır. Bu konuda yapılan çalışmalar 70 li yıllar da başlamıştır ve halen devam etmektedir. Yapılan ilk çalışmalardan birisinde, Pyrus, Crataeagus, Sorbus ve Cydonia cinslerine giren 15 farklı anaç üzerine aşılanan Bartlett armut çeşidinin yapraklarında makro ve mikro element analizleri yapılmıştır. Analiz sonuçlarına göre kombinasyonlar arasında makro ve mikro element içerikleri bakımından büyük farklar bulunamamıştır. Şeftali ile uyuşan P2032 erik anacı ile uyuşmayan P18 anacında kombinasyondaki 14

25 karbonhidrat taşınımı ile ilgili yapılan çalışmada, floemde yoğun şeker birikimi görülürken uyuşmaz kombinasyonlarda floemdeki şeker miktarında önemli düzeyde düşüş görülmüştür (Moing and Carde, 1988). Usenik vd. (2008), Slovenya da yaptıkları bir çalışmada Lapins çeşidinin Weiroot 72, Weiroot 158, Weiroot 13, Gisela 4, Gisela 5, Gisela 195/20, Edabriz, Pi-Ku 4.20, MaxMa 14 ve F12/1 anaçlarıyla olan ilişkilerini incelemişlerdir. En yüksek ağaç boyu F 12/1 anacında, en az ağaç boyu Edabriz üzerine aşılanmış Lapins çeşidinde belirlenmiştir. En yüksek verim Pi-Ku 4.20 anacından elde edilirken, ürün kalitesinin en iyi olduğu kombinasyon Lapins /Gisela 5 olmuştur. Gonçalves vd. (2007), kirazlarda bazı anaç-kalem kombinasyonlarında su taşınımı, büyümenin kontrolü gibi özellikler incelenmişlerdir. Çalışmada kalem olarak Van kiraz çeşidi kullanılmış ve kuş kirazı, CAB 11E, MaxMa 14, Gisela 5 ve Edabriz anaçları üzerine aşılanmıştır. Çalışma sonucunda Van kirazının daha bodur özellik gösteren Edabriz, Gisela 5 ve CAB 11 E anaçlarıyla oluşturduğu kombinasyonlarda su taşınımının sınırlandığı, kök gelişiminin kuş kirazı üzerine aşılanmış kombinasyonda daha fazla olduğu bildirilmiştir. Aşı bileşenlerinden ve aşı noktasından çeşitli periyotlarda örnekler alınarak histolojik çalışmalar yapılması ve böylece uyuşan ve uyuşmayan kombinasyonlarda aşı bölgesi oluşumunun seyrinin temel alındığı anatomik çalışmalar, aşı uyuşmazlığının aydınlatılmasında önemli yer tutan çalışmalar olmuşlardır. Bu çalışmaların çoğu aşı bölgesinin incelenmesi, buradaki iletim ve kambiyum dokularının devamlılığı, nekrotik dokuların belirlenmesi buna bağlı olarak floemdeki deformasyonların incelenmesi şeklinde olmuştur (Moing and Carde, 1988; Seferoğlu vd., 2004; Frankenstein and Schmitt, 2006). Bunun yanında bazı çalışmalarda da uyuşur ve uyuşmaz kombinasyonların anaç ve kaleminde trake ve trakeidlerin incelenmesi, floem dokularındaki kalburlu boruların yapılarının karşılaştırılması gibi mikroskobik doku incelemeleri yapılarak elde edilen sonuçlar ile aşı uyuşmazlığı arasında ilişkiler kurulmaya çalışılmıştır. 15

26 Tüm şeftali çeşitleriyle uyuşan Myrobolan B klonu P 2032 anacı ve uyuşmaz P18 anacı üzerine S 4176 nektarin çeşidinin aşılandığı bir çalışmada ışık mikroskobu altında inceleme yapıldığında kambiyal aktivitenin önce anaçta durduğu, daha sonra kalemde durduğu bildirilmiştir. Ayrıca uyuşmaz kombinasyonlarda aşı bölgesinde floemde bazı değişiklikler olduğu görülmüştür. Uyuşur ve uyuşmaz kombinasyonların parankimatik hücre üretiminde herhangi bir fark görülmezken, uyuşmaz kombinasyonlarda kalburlu boruların uyuşur kombinasyonlara göre daha az sayıda olduğu bildirilmiştir (Moing and Carde, 1988). Yerleşik uyuşmazlığın en tipik örneği olan armut ayva kombinasyonunun anatomik olarak oldukça ayrıntılı incelendiği bir çalışmada uyuşmaz kombinasyonlarda aşı bölgesindeki nekrotik tabakanın fellojen dokusuyla çevrildiği ve bu bölgenin aşı bileşenleri arasında geçişe engel olduğu, uyuşur kombinasyonlarda ise aşı bölgesinde periderm halkalarının görüldüğü bildirilmiştir. Yine uyuşmaz kombinasyonlarda kabuğun iç yüzeyinde hem anaçta hem de kalemde uyuşur aşı kombinasyonlarındaki geçişe izin veren katmanlı bölgenin aksine, keskin bir çizgiyle sınırlandırılmış bölge görülmüştür (Ermel et al., 1999). Vegvari vd. (2008), Gisela 5, Prob, SL 64, Magyar, Bogdany, MaxMa14, CAB 11 E ve Prunus avium anaçlarının 1 yıllık sürgünlerinden kesit almışlar ve elektron mikroskop altında incelemişlerdir. Araştırıcılar Gisela 5 anacı daha küçük ksilem yüzeyine sahip iken, Prunus mahaleb ve Prunus avium anaçlarında ksilem yüzey alanının daha geniş olduğunu bildirmişlerdir. Ayrıca diğer anaçlarla karşılaştırıldığında Gisela 5 anacının daha kısa trakeidlere sahip olduğu saptanmıştır. Bu anaçta su taşınımının sınırlanabileceği, bu nedenle yaz sıcaklarına dayanımının daha az olabileceği bildirilmiştir. Turunçgillerde yapılan bir çalışmada mikro aşılama ile homogenetik ve heterogenetik kombinasyonlar elde edilmiştir. Aşı yapıldıktan 1, 2, 3, ve 6 hafta sonra aşı bölgesinin 1 cm altından ve üstünden epikotil parçaları alınmıştır. Rotary mikrotomda örneklerden alınan kesitler ışık mikroskobu altında incelenmiştir. Çalışmanın sonucunda tüm kombinasyonlarda kaynaşmanın gerçekleştiği, lignin 16

27 birikimi olan hücre duvarlarında ve ksilem elementlerinde dokuların safraninle boyanıp kırmızı renk aldığı bildirilmiştir. Homogenetik ve heterogenetik kombinasyonlar arasında hücre ve morfolojik yapıları bakımından çok önemli bir fark görülmemiştir (Ogata et al., 2005). Ülkemizde aşı uyuşmazlığı ile ilgili yapılan araştırmaların büyük bir çoğunluğunu anatomik çalışmalar oluşturmaktadır. Armut ayva aşı uyuşmazlığının incelendiği bir çalışmada aşı bölgesindeki nekrotik tabakalar tespit edilmiş, bunların yoğunluğu ile uyuşmazlığın derecesi arasında bağlantı kurulmaya çalışılmıştır. Nekrotik tabakalar ile anormal gelişmelerin varlığının ve miktarının, armut/ayva kombinasyonlarında uyuşmazlığa neden olduğu bildirilmiştir (Ünal ve Tanrısever, 1986; Dumanoğlu, 1991). Tekintaş (1988), cevizlerde aşı kaynaşmasının meydana gelişini takip etmek amacıyla, aşılamadan 12, 18, 26, 32, 40, 70, 120 ve 360 gün sonra yama aşıda ve aşılamadan 14, 18, 24, 32, 60, 75, 120, 240 ve 360 gün sonra da yongalı göz aşısında, anatomik ve histolojik incelemeler yapmıştır. Bu incelemelerde anaç ve kalemin birleşme yüzeylerinde nekrotik tabakalar belirlenmiştir. Bu tabakaların yama aşıda anaca oranla kabukta daha kalın ve yoğun, yongalı göz aşısında ise, anaç ve kalemde hemen hemen aynı yoğunlukta olduğu bildirilmiştir. Kallus dokusunun yama aşıda, anacın ksilem ve ksilem öz ışını hücrelerinden ve kabuğun floem ile floem öz ışını hücrelerinden; yongalı göz aşısında ise, anaç ve kalemin kambiyumları ile floem ve korteks dokularından meydana geldiği gözlenmiştir. Hepaksoy (1994), ayva anaçlarının armut çeşitleriyle olan uyuşma durumunu incelediği çalışmasında Akça, Ankara, B. Hardy, Mustafa Bey ve Williams armut çeşitlerini kalem olarak, Ayva A (EM A), Limon, Ören, Şeker Gevrek ve Turgutlu ayvalarını da anaç olarak kullanmıştır. Aşı yapıldıktan 1, 4 ve 12 ay sonra aşı yerlerinden enine ve boyuna kabuk örnekleri alınmış ve anatomik olarak incelenmiştir. Aşı yerinde meydana gelen kallus dokusu ve nekrotik alanların oluşum yerleri ile miktarları; anaç ve kalemin kambiyum, ksilem, floem ve korteks dokularının oluşumu ile birleşme durumları saptanmıştır. Çalışmanın sonunda Ayva 17

28 A anacının, Akça, Beurre Hardy, Ankara armutları için; Limon ayvasının, Beurre Hardy, Akça ve Mustafa Bey armutları için; Şeker Gevrek, Ören ve Turgutlu ayvalarının ise, Akça ve B. Hardy armutları için anaç olarak kullanılabilecekleri bildirilmiştir. Seferoğlu vd. (2004), 0900 Ziraat ve Starks Gold kiraz çeşitlerinin Gisela 5 ve SL 64 klon anaçları üzerine aşılanmasıyla oluşan kombinasyonları anatomik olarak incelemişlerdir. Aşı yapıldıktan 6 ay sonra her iki kombinasyonda da nekrotik bir yüzey ve yetersiz kambial devamlılık görülürken, aşılamadan 12 ay sonra başarılı bir aşı kaynaşmasının olduğu ve sağlıklı vasküler elementlerin oluştuğu bildirilmiştir. Demirsoy ve Bilgener (2006), şeftali/erik aşı kombinasyonlarında aşıdan 1, 4 ve 12 ay sonra aşı yerinin durumu incelemişlerdir. Uyuşur kombinasyonlarda kallus, kambiyum oluşumu ve vasküler farklılaşmanın aşıdan sonraki dört ay içerisinde gerçekleştiği görülmüştür. Yine uyuşur kombinasyonlarda aşılamadan bir yıl sonra alınan örneklerde aşı yerinde ve kalemde nişasta birikmediği saptanmıştır. Uyuşmaz kombinasyonlarda ise kallus hücrelerinin önemli bir kısmının farklılaşmadığı, aşıdan sonraki bir ay içerisinde bazı bölgelerde kambiyumun kısmen oluştuğu, aşıdan sonraki 4 ay içerisinde ise vasküler farklılaşmanın tam olarak meydana gelmediği ve nekrotik tabakaların arttığı gözlenmiştir. St Julien A erik anacı üzerine aşılı Red Globe şeftali ve Fantasia nektarin çeşitlerinin aşı uyuşma durumunun anatomik olarak incelendiği bir çalışmada aşılamadan 2 hafta, 1, 2, 3 ve 4 ay sonra aşı noktasının 1 cm altından ve üzerinden örnekler alınmıştır. Aşılamadan 2 hafta sonra yapılan mikroskobik incelemeler sonucunda anaç ve kalem arasında kallus dokusunun oluştuğu ve kallus köprüsünün kurulduğu, daha sonraki dönemlerde de kambiyal devamlılığın sağlandığı bildirilmiştir (Koyuncu vd., 2007). Scarlet Spur, Red Spur ve Redchief elma anaçlarının A2, B118, M111 (kuvvetli) ve M7, M16, Pj80 (yarı bodur) anaçlarına aşılandığı ve aşı gelişimin histolojik olarak incelendiği bir çalışmada alınan doku örneklerinde kombinasyonlar arasında 18

29 herhangi bir uyuşmazlık belirtisine rastlanmamıştır. Yeterli kallus oluşumunun görüldüğü, başarılı bir kambiyal gelişme ve vasküler bağlantının aşılamadan yaklaşık 90 gün sonra gerçekleştiği bildirilmiştir (Polat et al., 2010). Aşı uyuşmazlığında kambiyal devamlılığın yanında anaç ve kalemin biyokimyasal yapısının öneminin vurgulanmasından sonra uyuşmazlığın erken tespitine yönelik araştırmalar biyokimyasal çalışmalar üzerine yoğunlaşmıştır. Bu çalışmalar kapsamında aşı bileşenlerinin birinden diğerine geçen toksik maddeler ve aşı noktasının üzerinde ve altında biriken fenolik bileşikler üzerinde durulmuş ve bunların uyuşmazlıktaki rolleri açıklanmaya çalışılmıştır Peroksidaz İzoenzimi ve Aşı Uyuşmasındaki Rolü Belli bir enzimin katalitik aktivitesi aynı, fakat elektriksel alanda göç, doku dağılımı, ısı, inhibitör ve aktivatörlere yanıtları farklı olan formlarına o enzimin izoenzimleri denir. Kısaca tanımlanacak olursa farklı moleküler forma ve kinetik özelliklere sahip olan ve aynı reaksiyonu katalize eden enzimlere izoenzim adı verilmektedir. İzoenzimler, enzimlerin çoklu moleküler formlarıdır. Amino asit dizinleri farklı proteinler olduğu halde aynı tepkimeyi katalize eden enzimler olup farklı dokularda farklı rollere sahiptirler. İzoenzim analizleri, çeşit tanımlamasından stres durumlarının teşhisine kadar bitkilerde pek çok alanda kullanılabilirliği kanıtlanmış moleküler markör teknikleridir (Taiz and Zeiger, 2006). Organizmaların izoenzim parmak izlerinde gösterdikleri benzerlik veya farklılık bu materyallerin taksanomik ve metabolik benzerlikleri ile ilgili bilgi verebilmektedir. İzoenzimlerdeki bu farklılıklar nitelik veya nicelik yönünden belirlenebilmektedir. İzoenzimlerin belirlenmesi elektroforez tekniği sayesinde mümkün olabilmektedir (Salisbury and Ross, 1992). Son yıllardaki aşı uyuşmazlığının erken tespitine yönelik çalışmalarda izoenzimler yönünden yaklaşımlar önem kazanmıştır. Güçlü bir aşı kaynaşmasında önemli olan 19

30 ligninleşme olayında peroksidaz izoenziminin rol oynadığının bilinmesi araştırıcıları bu enzim üzerinde çalışmaya yöneltmiştir. Bitki peroksidazları, izoenzimlerin çok geniş bir grubunu oluşturmakta ve hidrojen peroksit varlığında yüksek bitkilerde ligninleşme, suberinleşme, tepe tomurcuğu baskınlığı, soğuk toleransı, dinlenme, büyüme ve gelişme gibi bir çok fizyolojik olayda doğrudan veya dolaylı olarak rol oynamaktadır (Has- Schön et al., 2005; Rajeswari and Paliwal, 2008). Bunların yanında peroksidazlar, indol-3 asetik asit parçalanması, hücre duvarı oluşumu, patojenlere karşı savunma mekanizması ve çeşitli stres faktörlerinde (tuz stresi, yaralanma) biyokimyasal süreçte yer almaktadırlar (Lee at al., 2001; Huttova et al., 2004; Gülen et al., 2005). Her bitki, substrat spesifikliği ve bitkideki yerleşimi farklı olan çok sayıda peroksidaz izoenzimlerine sahiptir. Peroksidazlar sahip oldukları izoelektrik yüklerine göre anodik ve katodik peroksidazlar olmak üzere gruplandırılmaktadır. Anodik peroksidazların daha çok lignin ve süberin biyosentezine katıldıkları, katodik peroksidazların ise büyüme ve gelişmeyle ilgili olduğu düşünülmektedir (Hatzilazarou et al., 2006; Hamid and Ur- Rehman, 2009). Bitkilerdeki peroksidazlar lignin sentezindeki görevleri nedeniyle aşı kaynaşmasında önemlidirler. Lignin, bitkilerde selülozdan sonra bilinen doğal organik maddelerin içinde en bol bulunan organik maddedir. Fenilpropanoit grupların oldukça dallanmış bir polimeridir. Hem primer hem de sekonder olarak görev yapmaktadır (Marjamaa et al., 2009). Koniferil, kumaril ve sinapil alkol olmak üzere üç farklı feniloropanoit alkolden meydan gelmektedir (Şekil 2.2). Bu üç alkolün öncülü de fenilalenindir. Bu olay sırasında çeşitli sinnamik asit türevleri oluşmaktadır. Nişasta, kauçuk ve selüloz gibi diğer polimerlerden farklı olarak lignin birikimleri basit ve tekrarlı diziler halinde birbirine bağlanmazlar. Lignin, başta ksilem ve floem trakeitleri, odunsu boru elemanları olmak üzere çeşitli iletim ve destek doku hücrelerinin çeperlerinde bulunmakla beraber beraber ortamda zaten mevcut olan selüloz ve hemiselülozla sıkı temasın sonucu primer çeper ve orta lamelde de bulunabilmektedir. 20

31 Şekil 2.2. Lignin biyosentez yolu (Marjamaa et al., 2009) Ligninin mekanik sertliği iletim dokusunu güçlendirmekte, yukarı doğru büyüme sağlamakta ve negatif basıncın dokuda oluşturacağı herhangi bir çökmeye yol 21

32 açmaksızın, su ve minerallerin ksilem yoluyla iletilmesine izin vermektedir. Suyu ileten dokuda böylesine anahtar bir bileşen olması lignini diğer bileşenlerden ayırmaktadır (Taiz ve Zeiger, 2008). Hücre orta lamellerinde karbonhidrat birikimiyle başlayan lignin sentezinde daha yavaş gerçekleşen ikinci aşama selüloz mikrofibrillerinin birikmeye başlamasıdır. Lignin sentezinde son aşama sinnamik alkollerin oksidasyonudur ve bu aşama peroksidaz enzimi tarafından katalizlenmektedir (Fernandez-Garcia et al., 2004). Lignin oluşumunda peroksidazların rolü sinnamik alkollerin (Koniferil, kumaril ve sinapil) lignine polimerizasyonunu katalize etmekte ve lignin moleküllerinin primer hücre duvarı ve karbonhidratları proteinlere bağlanmasını sağlamaktadır (Stasolla et al., 2003). Aşı uyuşmazlığında anaç ve kalemin izoperoksidaz profillerinin karşılaştırılması ile ilgili yapılan ilk çalışmalar orman ağaçlarında olmuştur. Santamour (1983), kambiyum dokularından aldıkları örneklerde nişasta jel elektroforezi kullanarak meşelerde taksonomik sınıflandırmayı ve aşı uyuşma durumunu incelemiştir. Peroksidaz bantları benzer olanların yakın akraba olabileceğini ve aşılandıkları zaman başarı şansının yüksek olacağını bildirmiştir. Santamour vd. (1986), Çin kestanesinde yaptıkları bir çalışmada 3 adet major anyonik peroksidaz bandına rastlamışlar ve bu bantların uyuşmazlıkla ilgili olabileceğini bildirmişlerdir. Orman ağaçlarından akçaağaçta kambiyal isoperoksidaz tespiti yapılan bir çalışmada yine nişasta jel elektroforezi kullanılmış ve peroksidaz bantları 3-amino-9- ethylcarbazole ile boyanmıştır. Çalışmanın sonucunda hızlı ilerleyen bir A bandı ve ondan daha yavaş ilerleyen bir B bandı bulunmuştur. Ortak kambiyal peroksidaz bantlarına sahip olanların başarıyla aşılanabileceği bildirilmiştir (Santamour, 1989). Orman ağaçlarında yapılan bu çalışmalardan sonra uzunca bir süre kambiyal peroksidazlarla ilgili çalışmalar yapılmamış daha sonra hem sebzelerde hem de meyve ağaçlarında yeniden bu konuyla ilgili çalışmalara başlanmıştır. Asma anaçlarının çeşitlerle uyumunu belirlemesi için peroksidaz profillerinin 22

33 karşılaştırılmasından yararlanılsa da meyve yetiştiriciliğinde uyuşmazlık tahmininde peroksidaz profillerinin karşılaştırılması ile ilgili yapılan çalışmalar armut/ayva aşı kombinasyonları üzerinde yoğunlaşmıştır. Asmalarda elektrofotometrik yöntemlerle aşı uyuşmazlığının önceden tahmin edilmesine yönelik yapılan bir çalışmada 15 üzüm çeşidi ve 12 Amerikan asma anacının peroksidaz bant sayıları belirlenmiştir. Ortak peroksidaz bant sayılarına göre uyuşur ve uyuşmaz kombinasyonlar belirlenmeye çalışılmıştır (Gökbayrak et al., 2007). Gülen vd. (2002), Barlett ve Beurre Hardy armut çeşitleri ile QA ayva anacının uyuşma durumunun erken tespitine yönelik yaptıkları çalışmada peroksidaz izoenzim analizleri için en uygun yöntemi belirlemişlerdir. Çalışmada anacın ve kalemlerin yıllık sürgünlerinden alınan kabuk dokusu örnekleri kullanılmıştır. Çalışma sonucunda armut ve ayva için nişasta jel elektroforez sisteminde en uygun ekstraksiyon, jel ve boyama yöntemi belirlenmiştir. Petkou vd. (2004), armut/ayva kombinasyonundaki uyuşmazlığı açıklamak için yaptıkları çalışmada anacın ve kalemlerin kabuk dokuları yerine kallus kültürlerini kullanmışlardır. Kallus elde etmek için Tsakoniki, Abbe Fetel ve Williams armut çeşitleri ile EM A ayva anacının dormant tomurcukları kullanılmıştır. Peroksidaz bantları için poliakrilamid jel elektroforez (PAGE) yöntemi tercih edilmiştir. Çalışmaya göre Tsakoniki armut çeşidinin peroksidaz profilinin Abbe Fetel ve Williams armuduna göre EM A anacının peroksidaz profiliyle daha çok benzediği anlaşılmıştır. 17 armut çeşidiyle Quince A (QA) ayva anacının peroksidaz profillerinin karşılaştırıldığı başka bir çalışmada aşılama yapıldıktan yaklaşık 12 ay sonra kalem kısmından ve aşı noktasından kambiyum örnekleri alınmıştır. Poliakrilamit jel elektroforez tekniğinin (PAGE) boyama yöntemi olarak Wendel ve Weeden (1989) ın kullanığı yöntem seçilmiştir. Uyuşur kombinasyonlarda hem A peroksidaz bandının (Rf=0.86) hem de B izoenzim bandının (Rf=0.68) bulunduğu, uyuşmaz 23

34 kombinasyonlarda ise sadece B izoenzim bandının bulunduğu, A peroksidaz bandının bulunmadığı saptanmıştır (Davarynejad, 2008). İzoperoksidaz profillerinin karşılaştırılması üzerine yapılan çalışmaların çok sınırlı olması nedeniyle özellikle meyve ve bazı sebzelerde yöntem geliştirilememiştir. Peroksidaz profillerinin benzerliğinin yanı sıra peroksidaz aktivitesinin de aşı uyuşmasında önemli bir parametre olması nedeniyle spektrofotometrik ölçümlere dayanan peroksidaz aktivitesinin tayinine yönelik çalışmalar yapılmıştır. Fernandez-Garcia vd. (2004), domateslerde yaptıkları bir çalışmada Fanny çeşidini AR-9704 domates anacı üzerine aşılamışlardır. Aşılamadan 4, 8 ve 12 gün sonra aşı yerinden, aşı yerinin 2 mm üstünden ve altından, kontrol grubu olarak da aşılanmamış bitkilerde örnek alınmıştır. Peroksidaz aktivitesi için okumalar 470 nm de spektrofotometrede yapılmıştır. Aşı kombinasyonlarında kontrol grubuna göre daha yüksek peroksidaz aktivitesine rastlanmıştır. Aşılamadan sonra geçen süreyle peroksidaz aktivitesinin doğru orantılı olarak arttığı bildirilmiştir. RS59 ve RS62 kabak anaçları üzerine Arava kavununun oluşturduğu kombinasyonlarda anaç-kalem ilişkilerinin fiziksel ve biyokimyasal farklılıklarının incelendiği bir çalışmada aşı bölgesinden alınan örneklerde histolojik çalışmalar, su taşınımı, peroksidaz, hidrojen peroksit aktivitesi, suda çözünebilir şekerler ve nişasta konsantrasyonu incelenmiştir. Peroksidaz aktivitesinin ölçümü UV/VIS spektrofotometre kullanılarak 450 nm dalga boyunda gerçekleştirilmiştir. Aşı yapıldıktan 24 gün sonra uyuşur Arava /RS59 kombinasyonunda aşı bölgesindeki peroksidaz aktivitesinin uyuşmaz Arava/RS62 kombinasyonundan daha yüksek olduğu görülmüştür (Aloni et al., 2008). Meyve ağaçlarında aşı uyuşmazlığının erken tespitine yönelik yapılan çalışmalarda anaç ve kalemin, aynı zamanda aşı bölgesinin peroksidaz aktivitesinin belirlenmesine yönelik çalışmalar yok denecek kadar azdır. Bower ve Nel (1981), avokadolarda yaptıkları çalışmada uyuşur kombinasyonlarda daha yüksek peroksidaz aktivitesinin olduğunu bildirmişlerdir. Meyve ağaçlarında bu konuda yapılan ilk çalışmalardan 24

35 birisi kiraz/vişne aşı kombinasyonlarında ve aşılanmamış anaçlarda hücre sayısı ve anaç kambiyumlarındaki peroksidaz profilleri incelenmiştir. Örnek alma işlemi aşı noktasının 0-2 cm ve 2-4 cm altından, aşı bölgesinden ve aşı noktasının 0-2 cm ve 2-4 cm olmak üzere farklı bölgelerden gerçekleşmiştir. Bu çalışmanın sonucunda peroksidaz enzim aktivitesinin ve kambiyal hücre farklılaşmasının homegenetik aşılarda daha yüksek olduğu, dolayısıyla aşı uyuşmasının da daha başarılı olduğu belirlenmiştir (Feucht et al., 1983). Schmidt ve Feucht (1985), tarafından yapılan bir çalışmada kiraz ağaçlarında bu Sam kiraz çeşidi F12/1 ve Prunus cerasus klonlarından CER W10, W 11 ve W 13 anaçları üzerine aşılanmış ve 8 hafta boyunca her hafta aşı noktasının altından ve üzerinden kabuk örnekleri alınmıştır. Birinci ve ikinci haftada alınan kabuk örneklerinde uyuşur ve uyuşmaz kombinasyonların peroksidaz profillerinde herhangi bir farklılığa rastlanmamıştır. Bu süre boyunca tüm kombinasyonlar içinde en göze çarpan bant A3 adı verilen anyonik peroksidaz bandı olmuştur. Farklı aşı kombinasyonları karşılaştırıldığında uyuşur ve homospesifik Sam/F12/1 kombinasyonu en koyu bantlara sahip olmuştur. Bütün vişne klon anaçlarına aşılanmış Sam çeşidinde aşı bölgesinde daha az boyanan bantlara rastlanmıştır. Aşılama işlemi yapıldıktan sonra üçüncü ve dördüncü haftada alınan örneklerde de benzer sonuçlar alınmış, uyuşur kombinasyonlarda daha belirgin bantlar elde edilirken uyuşmaz kombinasyonlardaki bantların daha açık renkli olduğu görülmüştür. Aşılamadan sonraki beşinci ve altıncı haftalarda ise peroksidaz aktivitesinin azaldığı bildirilmiştir. Bu iki çalışma meyve ağaçlarında aşı uyuşmazlığının tespitinde peroksidaz profillerinin karşılaştırılması çalışmalarında temel oluşturmuş ancak kirazlarda anaçkalem ilişkilerinin araştırılmasında peroksidaz profillerinin karşılaştırılmasıyla ilgili başka çalışmalara rastlanılmamıştır. Meyve ağaçlarında başarılı bir aşı kombinasyonunun meydana gelebilmesi için gerekli olan şartlardan birisi de anaç ile kalem arasındaki yakın akrabalık derecesidir. Yakın akraba bitkiler birbiri üzerine aşılandıklarında aşı kombinasyonunun başarı şansı daha yüksek olmaktadır. Bu nedenle bitkiler arasındaki akrabalık derecesinin 25

36 aşılanmadan önce belirlenmesi yararlı olmaktadır (Hartmann et al., 1997). Bitkilerin akrabalık derecelerinin belirlenmesinde toplam proteinler yönünden yaklaşımlar önem kazanmıştır. İdris anaçları ile Lambert, 0900 Ziraat, Early Burlat, Bing, Bigerreu Gaucher, Vista, Noble çeşitleri arasındaki aşı uyuşmazlığının serolojik yöntemlerle erken belirlenmesine yönelik yapılan bir çalışmada idris anaçlarıyla kiraz çeşitleri arasındaki protein yakınlığı sırasıyla Lambert, 0900 Ziraat, Early Burlat, Bing, Bigerreu Gaucher, ve Van olarak belirlenmiştir (Kunter, 1998) Fenolik Bileşikler ve Aşı Uyuşmazlığı Başarılı bir aşı kaynaşmasında önem taşıyan diğer bir faktör olan fenolik bileşikler, yüksek yapılı bitkilerde var olan sekonder metobolitler olup, hidroksil, karboksil veya metoksil gibi bir veya daha fazla hidroksil grubu taşıyan en az bir aromatik halkaya sahip bileşikleridir. Fenol olarak adlandırılan en basit fenolik bileşik benzendir. Hidroksil kökü birden fazla olan fenolik bileşiklere ise polifenoller adı verilmektedir. Basit fenollerdeki benzen halkasına farklı radikal grupların bağlanmasıyla fenolik bileşikler oluşmaktadır (Karaçalı, 2002). Bunlar sinnamik asit, flavonoidler ve isoflovonoidler gibi monomer veya tanin ve lignin gibi polimer olabilirler (Errea, 1998). Fenolik bileşikler flavonoidler ve nonflavonoidler (flovanoid olmayanlar) olmak üzere ikiye ayrılırlar. Flavonoid olmayan gruplar hidroksisinnamatlar, hidroksibenzoatlar (gallik asit) ve stilbenler (resveratrol) den oluşmaktadırlar. Flavonoid grubu ise flavoneller (kateşinler), flavonoller (kuarsetin ve rutin) ve antosiyenlerden oluşmaktadırlar (Lopez-Velez vd., 2003). Flavanlar, bitkilerin çiçek petalleri, meyve, yaprak, tohum, polen, odun dokuları ve kabukları başta olmak üzere bütün bitki dokularında bulunmaktadır. Bitkilerde doğal olarak bulunan fenolik maddelerin en yaygın grubu flavonoidlerdir (Karaçalı, 2002). 26

37 Bitkisel fenoller madde metabolizması açısından sekonder maddeler grubu içinde yer alırlar ve bitkiler âleminde çok geniş bir yayılma alanına sahiptirler. Yapıları itibariyle birbirinden çok farklı maddeler, basit fenoller, fenolik asitler, fenil karbonil bileşikleri, flavanlar, flavanonlar, flavanoller, kalkon bileşikleri vb. gruplar altında toplanarak incelenirler. Aynı tür içinde yüzden fazla farklı fenolik maddeye rastlamak mümkündür. Bitkisel fenollerin önemi bilinen bazı özelliklerinden kaynaklanmaktadır. Bu maddelerin çoğu stabil bir moleküler yapıya sahiptirler. Bitkiler âleminde çok yaygın bulunan lignin ve tanenler gibi önemli polimerlerin yapı taşlarıdırlar. Enzim aktivitelerini etkilerler ve özellikle indol asetik asit oksidaz enzimi üzerindeki etkileri bitkilerdeki hormonal ilişkiler açısından büyük bir fizyolojik öneme sahiptir. Monofenoller söz konusu enzimin ko-faktörü olarak IAA in dekarboksillenmesini teşvik ederler. Buna karşılık bazı polifenoller, IAA-oksidaz enziminin faaliyetini engelleyerek IAA i parçalanmaktan korurlar. Bazı fenolik maddelerin, tohum dinlenmesinde ve çimlenmenin engellenmesinde rolleri bulunduğu bilinmektedir. Hastalık ve zararlılara karşı koruyucu etkileri bulunmaktadır. Bu konuda oldukça fazla araştırma yapılmıştır. Fenolik maddelerin genetik aktivite üzerine etkilerine dair bulgulara da rastlanmaktadır (Tanrısever, 1982; Taiz and Zeiger, 2006 ). Fenolik bileşikler, ayrıca bitki bünyesinde ortaya çıkan herhangi bir zararlanma karşısında, hızla zarar gören dokuda kimyasal bir bariyer veya duvar oluşturarak enfeksiyon ve çürümeye karşı korunma sağlamaktadırlar. Bitki dokusu zararlandığında, içsel fenollerin oksidasyonu veya mono ya da polifenolik bileşikler üreterek buna kimyasal bir yanıt verir. Zararlanan hücrenin bu ilk yanıtı sonucunda, hücrelerin içinde çeşitli bileşiklerden oluşan bir karışım ortaya çıkmaktadır. İkinci yanıt, zarar görmemiş hücrelerden gelir. Zararlanan hücrelere bitişik olan sağlam hücreler, onarım sürecini başlatırlar. Anahtar enzimler, ya basit fenollerin (klorogenik asit ) veya polimerik bileşiklerin (lignin ) birikimini sağlamak üzere aktif hale geçerler (Errea, 1998). Fenolik bileşiklerin sentezini açıklamada şikimik asit yolu kullanılmaktadır (Şekil 2.3). Bu yolda en önemli grup ligninlerdir. Bazı fenolik bileşiklerin oksidasyonu 27

38 sonucu aldehitlerin polimerizasyonuyla lignin oluşmaktadır. Fenolik bileşikler endoplazmik redikulumdan elde edilen boşluklarda sentezlenmekte ve hücrelerin geniş vakuollerinde birikmektedirler (Errea, 1998). Fenilalenin Lignin Sinnamik asit Kumarinler Benzoik asitler Stilbenoitler Kalkon Isoflavonoidler Flavanon Flavonoidler Pterokarpanlar Rotenoidler Flavonoller Flavonler Antosiyanlar Şekil 2.3. Şikimik asit yolu (Errea, 1998) Fenolik bileşikler aşı kaynaşmasında lignifikasyonda oynadıkları rolleri nedeniyle önemlidirler. Fenolik bileşiklerin sentezleri yaralanma, enfeksiyon, bitki hastalıkları, sıcak-soğuk zararları, tuz stresi gibi çeşitli stres faktörleri altında başlamakta veya hızlanmaktadır. Aşılama işlemi bir stres faktörü olarak düşünülecek olursa anaç ile kalem arasındaki uyumsuzluk vakuol membranlarda biriken fenolik bileşiklerin etkisiyle zayıf bir birleşme ve kötü bir aşı kaynaşmasına neden olmaktadır. Vakuollerde serbest kalan fenoller sitoplâzmada peroksidaz ve fenol oksidaz enzimleri tarafından okside olurlar. Peroksidazların varlığı fenolleri okside etmesi nedeniyle uyuşmayı da teşvik etmektedir. Sonuç olarak lignin sentezi gibi birçok kimyasal reaksiyonda toksik bir bileşik olan quinonlar okside olmaktadırlar. Bu nedenle aşı noktasında aşı uyuşmazlığı belirtilerinden birisi olan nekrotik alan 28

39 oluşmaktadır. Anaç ve kalemin vaskuler dokularından sentezlenen oksin, vaskuler dokuların başarılı bir şekilde farklılaşmasını sağlar ve başarılı bir aşı kombinasyonu oluşmasında etkilidir. Bazı polifenoller basipetal yönde taşınan oksin koruyucusu gibi görev yaparak başarılı bir aşı kaynaşması olmasını sağlamaktadırlar. Düşük oksin seviyesi ksilem ve floem farklılaşması ve lignin oluşumunu olumsuz yönde etkileyebilmektedir. Oksin yıkımıyla vasküler farklılaşma başarısızlığa uğramakta ve uyuşmaz kombinasyonlar meydana gelebilmektedir (Errea, 1998; Olmstead, 2004). Aşı uyuşmazlığının erken tespitine yönelik yapılan çalışmalarda genel olarak aşı noktasının altından, üzerinden ve aşı bölgesinden kabuk örnekleri alınmıştır. Bu örneklerin toplam fenolik madde ve ayrı ayrı fenolik bileşiklerinin belirlenmesi temel alınmıştır. Aşı noktasının üzerinde veya altında biriken fenolik maddeler aşı uyuşmazlığının nedeni olabilmektedirler (Feucht and Treutter, 1991; Errea et al., 2001). Feucht ve Treutter (1991) e göre Prunus türlerinin tipik fenolik bileşiği olan pruninin, dokularda birikmesiyle hücresel farklılaşmayı değiştirebilmekte, hücrelerde birikmekte ve böylece membranlara zarar vermektedir. Membranların zarar görmesi hücredeki seçici geçirgenlik özelliğinin kaybolmasına neden olmaktadır. Prunine ek olarak başka fenolik bileşikler de hücre membranlarından taşınımda görev almaktadırlar. Heterogenetik Prunus persica/prunus tomentosa ile homogenetik Prunus persica/prunus persica aşı kombinasyonlarının fenolik bileşiklerinin karşılaştırıldığı bir çalışmada, aşı bölgesinde A DMACA (p-dimethylamino-cinnamaldehyde) boyama metoduyla heterogenetik kombinasyonda fenolik bileşiklerin özellikle kallus dokularında yoğunlaştığı, bunun yanında yeni ksilemde de biriktiği belirlenmiştir. Fenolik bileşik birikiminin aşı bölgesinde kahverengi bir nekrotik tabaka oluşturduğu görülmüştür. HPLC analizlerinde de her iki anaçta da 4 adet fenolik bileşik belirlenmiştir. Bu bileşiklerden birisinin kateşin olduğu, diğer ikisinin prunin ve 29

40 naringenin olduğu düşünülmekte, sonuncusunun ise ne olduğu bilinmemektedir (Salvatierra et al., 1999). Usenik ve Štampar (2000), Lapins çeşidinin homogenetik ve heterogenetik kombinasyonlarında aşı noktasının altında ve üstünde fenolik madde içeriklerini incelemişlerdir. Farklı genetik orijinden gelen anaçlarla oluşturulan heterogenetik kombinasyonların fenolik madde içeriği ile kalemle aynı orijine sahip homogenetik kombinasyonlarda fenolik madde içeriği bakımından istatistiksel olarak önemli fark bulunmuştur. Çalışmada aşı noktasının üstünden alınan kabuk örneklerinde p-f asit ve genistein içeriği en yüksek Lapins /Pi-Ku 4/20 kombinasyonunda (0.31 mg/g; mg/g), prunin içeriği ise en yüksek Lapins /Gisela 5 kombinasyonunda saptanmıştır. Aşı noktasının altından alınan kabuk örnekleri karşılaştırıldığında ise p- kumarik asit içeriği en yüksek kombinasyon Lapins /F12/1, genistein ve prunin içeriği en yüksek kombinasyon da Lapins /Gisela 4 kombinasyonu olarak belirlenmiştir. Errea vd., (2001), kayısılarda aşı uyuşmazlığının erken tespitine yönelik yaptıkları çalışmada çeşit olarak Luizet ve Moniqui kayısı çeşitlerinden, anaç olarak da kayısı ile uyuşma kabiliyetleri farklı Marianna 2624, Myrabolan 605 AD ve kayısı anacı A 843 anaçlarından elde edilen kalluslar kullanılmış ve mikro aşılama yapılmıştır. Kullanılan çeşitlerden Luizet tüm anaçlarla uyuşurken, Moniqui kayısı anacı A843 ile uyuşur, Marianna 2624 ve Myrobalan 605 AD ile uyuşmayan bir çeşittir. Aşılamadan sonraki henüz birinci haftada fenolik bileşikler açısından uyuşur ve uyuşmaz kombinasyonlarda fark görülmüştür. Uyuşur kombinasyonlarda fenolik bileşik miktarı çok düşük bulunurken, uyuşmaz kombinasyonlarda oldukça yüksek düzeyde bulunmuştur. Usenik ve Štampar (2001), çeşit olarak Lapins kirazının kullanıldığı çalışmalarında anaç olarak F12/1 (homogenetik aşı) ve Gisela 4, Gisela 5, Gisela 195/20, MaxMa 14, Pi-ku 4/20, Tabel Edabriz, W 13, W 72 ve W 158 (heterogenenetik aşı) kombinasyonlarında aşı noktasının altından ve üstünden aldıkları kabuk örneklerinde fenolik bileşikleri ayrı ayrı incelemişlerdir. F12/1 ve Gisela 4 aşı noktasının altındaki 30

41 kateşin içeriği bakımından oldukça yüksek değerler almıştır. Gisela 4, Gisela 5, Gisela 195/20, MaxMa 14, Pi-Ku 4/20, Tabel Edabriz, W 13 ile oluşturulan kombinasyonlarda aşı noktasının üzerinde yüksek miktarda eriodictyol 7-glucosid içeriği saptanmıştır. Lapins -F12/1 aşı kombinasyonunda p-kumarik asit birikimi aşı noktasının altında görülürken, Lapins çeşidinin Gisela 5, Tabel Edabriz ve W 13 ile oluşturduğu kombinasyonlarda aşı noktasının üzerinde p-kumarik asit birikiminin oldukça fazla olduğu ortaya konmuştur. İstatistiksel olarak önemli olmamakla birlikte Gisela 5, Pi-ku 4/20, Tabel Edabriz, W 13, ve W 158 anaçlarında aşı noktasının üst kısmında daha fazla prunin olduğu görülmüştür. Fenolik bileşiklerin kayısılarda aşı uyuşmazlığında oynadıkları rollerin açıklanması için yapılan bir çalışmada Marlen, Leskora ve Betinka kayısı çeşitleri farklı genetik orijine sahip M-LE_1, Lesiberian, MY-KL-A, Tetra, Penta, Green Gage, Julior, MRS 2/5 ve Isthara anaçları üzerine aşılanmıştır. 1 yıllık kabuk örneklerinin HPLC de analizlenmesi sonucunda homogenetik ve heterogenetik aşı kombinasyonları arasında fenolik bileşik içerikleri bakımından fark görülmüştür (Usenik et al., 2006). 31

42 3. MATERYAL ve YÖNTEM 3.1. Bitkisel Materyal ve Özellikleri Deneme yılları arasında S.D.Ü. Deneysel ve Gözlemsel Öğrenci Araştırma ve Uygulama Merkezi ile Ziraat Fakültesi Bahçe Bitkileri Bölümü Derim Sonrası Fizyolojisi Laboratuarı nda yürütülmüştür. Çalışmanın bitkisel materyalini Eylül ayı başında T - göz aşısı ile Kuş kirazı, Kara idris, Sarı idris, MaxMa 14, MaxMa60, CAB 6P ve Gisela 5 anaçlarına aşılanmış 0900 Ziraat çeşidinin fidanları oluşturmuştur (Şekil 3.1.). Deneme süresince fidanlıkta sulama, gübreleme, bitki koruma gibi kültürel işlemler düzenli olarak gerçekleştirilmiştir. Fidanlıkta Kara idris anacının bulunmaması nedeniyle bu anaç, Ege Üniversitesi Ziraat Fakültesi Bahçe Bitkileri Bölümü nden temin edilmiştir. Şekil 3.1. Örneklerin alındığı fidanlıktan görünüm Denemede kullanılan 0900 Ziraat kiraz çeşidinin ve kullanılan anaçların özellikleri aşağıda verilmiştir. 32

43 0900 Ziraat Kuvvetli yaygın dallı gelişir. Meyve sapı ince 45 mm uzunluğunda, sap çukuru geniş ve orta derinliktedir. Meyve geniş kalp seklinde olup, çok iri, gram ağırlığında eni 26 mm, boyu 23 mm dir. Meyve kabuk rengi parlak koyu kırmızı, meyve eti çok sert, gevrek, çok lezzetli ve çok iyi kalitededir. Çekirdek ete az bağlıdır. Kendiyle uyuşmaz olup tozlayıcıları, Starks Gold, Merton Late, Lambert, Bigarreau Gaucher, Noble ve Jubilee dir. Ülkemizde yaygın olarak yetiştirilen ihracat şansı yüksek bir çeşittir. Avrupa da Türk Kirazı olarak anılmaktadır. Meyveleri çatlamaya dayanıklıdır (Özçağıran vd., 2005; Westwood, 1995). Kuş kirazı (Prunus avium L., mazzard) Kiraz ve vişne için kuvvetli bir anaç olup kumlu-tınlı, tınlı ve nispeten ağır topraklarda kullanılmaktadır. Havasız, çok nemli toprakları sevmez. Fazla toprak nemine, ağır topraklara ve yüksek taban suyuna karşı idristen daha toleranslıdır. Ağaçlar meyveye geç yatarlar ve uzun ömürlüdürler. Kiraz çeşitleriyle çok iyi aşı uyuşması göstermektedir. Bakteriyel kansere dayanıklı, kök kanserine hassastır (Özçağıran vd., 2005). İdris (Prunus mahaleb L.) Orta kuvvetli bir anaçtır, kuvvetli tipleri de bulunur. Kuş kirazına göre daha küçük ağaçlar oluşturur. Kumlu-killi, kireçli, ağır olmayan, geçirgen topraklarda iyi gelişir. Ağır, taban suyu yüksek olan topraklar için uygun değildir. Üzerine aşılanan çeşitlerle uyuşma durumu farklılık gösterir, iyi uyuşanlar olduğu gibi ileriki yıllarda uyuşmazlık gösterip aşı noktasında aşırı büyüme gösterenler de olabilir. Sarı idris ve Kara idris tipleri olup özellikle Ege Bölgesi nde tercih edilen kara idris anacında uyuşmazlık görülebilmektedir (Özçağıran vd., 2005). Maxma 14 (Brokforest, MaxMa 14) (Prunus avium x Prunus mahaleb) MaxMa serisi anaçlarının birçoğundan daha bodur olan MaxMa 14 anacı Fransa da, orijini olan Amerika dan daha fazla popülarite kazanmış bir anaçtır. Yapılan denemelerde üzerine aşılanan Montmorency çeşidinde, ürün fazlalığı sağlamakla beraber meyveyi küçülttüğü bildirilmiştir. Ayrıca bu yetiştirme koşullarında 33

44 yapraklarda gecikmiş uyuşmazlığın neden olabileceği stres belirtileri görülmüştür. Kök sürgünü vermeye eğilimlidir. Yarı bodur bir anaçtır, Mazzard F 12/1 in %40-60 ı, SL 64 ün % i kadar taç yapar. Phytophthora ve bakteriyel kansere dayanıklıdır. Birçok çeşitle aşı uyuşması iyidir. (Webster and Schmidt, 1996; Wertheim, 1998). MaxMa 60 (Prunus avium x Prunus mahaleb) Kiraz çeşitleriyle yüksek aşı uyuşma kabiliyetine sahip olan MaxMa 60, Phytophthora cambivora ve Phytophthora megasperma ya oldukça dayanıklıdır. Kuvvetli bir anaç olup ağaç başına verim yüksektir (Webster and Schmidt, 1996; Wertheim, 1998). CAB-6P (Prunus cerasus) İtalya nın Emilia Romagno bölgesinde selekte edilen yabani vişne (Prunus cerasus) klonudur. Çelikle veya doku kültürü ile kolay çoğaltılır. Mazzardın %20-30 kadar taç büyüklüğüne sahiptir. Bigarreau Moreau, Lapins, Van için en iyi anaç olarak önerilmektedir (Webster ve Schmidt, 1996). Gisela 5 (Prunus cerasus x Prunus canescens) Prunus cerasus x Prunus canescens hibritidir. Mazzard F 12/1 in %50 si kadar taç genişliği yapar. Ağır, killi ve oksijensiz ortamlara uygun değildir. Phytophtora dan zarar görür fakat PNRSV (Prunus Nekrotik Halka Leke Virüsü) ve PDV (Prunus Bodurluk Virüsü) enfeksiyonlarına toleransı azdır (Webster and Schmidt, 1996; Wertheim, 1998). 34

45 3.2. Yöntem Denemede kabuk örneklerinin alınma dönemleri aşı yapılmadan önce (başlangıç), aşı yapıldıktan 8 ve 12 ay sonra olarak planlanmıştır. Ayrıca aynı dönemlerde aşısız anaçlardan ve kalemden de kabuk örnekleri alınmıştır. Deneme, örneklerin peroksidaz enzim çalışmaları ve fenolik bileşiklerle ilgili çalışmalar olmak üzere iki bölümden oluşmaktadır Örneklerin alınması Örnekler, sabahın erken saatlerinde, aşı yerinin 4 cm altından ve üzerinden ayrıca aşı bölgesinden olmak üzere fidanın üç bölgesinden, keskin bir aşı bıçağı ile 1*2 cm büyüklüğünde ksileme çok fazla zarar vermeyecek şekilde dikkatlice kesilerek alınmıştır. Alınan kabuk örnekleri alüminyum folyoya sarılmış ve anında sıvı azot içersinde dondurulmuştur. Tüm örnekler analiz için kullanılıncaya kadar C de muhafaza edilmiştir. Şekil 3.2. de örnek alım aşamaları görülmektedir. 35

46 a b c c Şekil 3.2. Örneklerin alınması a) Örnek alınacak yerin çizilerek belirlenmesi b) Kabuk örneğinin çıkarılması c) Çıkarılan kabuğun alüminyum folyoya sarılması. d) Kabuk örneklerinin dondurulması Peroksidaz izoenzimi ile ilgili çalışmalarda kullanılan yöntem Peroksidaz ekstraksiyonu Peroksidaz ekstraksiyonu için Gülen (2000) in kullandığı yöntem temel alınmıştır. Çalışmanın enzim ekstraksiyonu aşamasında pek çok sorunla karşılaşılmış bu nedenle her anaç için farklı ön denemeler yapılmıştır. Gülen (2000) in kullandığı yöntemde ekstraksiyon solüsyon bileşimini oluşturan maddelerin dozlarında yapılan küçük değişikliklerle ve ön denemelerden elde edilen sonuçların da dikkate alınmasıyla geliştirilen yöntem, çalışmamızda ekstraksiyon yöntemi olarak kullanılmıştır. 36

47 0.1 M Potasyum fosfat ph ml 30 mm Borik asit 0.08 g 50mM L-Askorbik asit 0.40 g 17 mm Sodyum metabisülfit 0.16 g 16 mm Diethyldithio karbomik asit 0.13 g 1mM Etildiamin tetraasetik asit 20 mg %4 Polivinil prolidon g %1 Tween ml Solüsyon hazırlanırken tüm kimyasallar sırası ile karıştırılmış ve PVP-40 eklenmeden önce ph değeri; 7.5 a ayarlanmıştır. PVP-40 eklendikten sonra hacim 100 ml ye tamamlanmıştır. Örnek hazırlığı aşamasında tüm işlemler 4 0 C de gerçekleştirilmiştir. Örnekler sürekli buz kutusu içersinde tutulmuştur. Sıvı azotla ezilmiş 0.6 gr örnek üzerine 60 ml ekstraksiyon sıvısı ilave edilmiştir. Örnekler 4 0 C de 30 dk rpm de santrifuj edilmiştir. Üste çıkan süpertanat kısım peroksidaz aktivitesinin tayininde ve elektroforez analizlerinde taze olarak kullanılmıştır Peroksidaz aktivitesinin tayini Kabuk örneklerinin peroksidaz aktivitelerinin tayininde Cevahir (1997) ve Eryılmaz (2007) ın kullandıkları spektrofotometrik yöntem kullanılmıştır. Taze ağırlıkları belirlenen kabuk örneklerinin ektstraksiyon işlemi tamamlandıktan sonra üst sıvı peroksidaz aktivitesinin spektrofotometrik tayini için kullanılmıştır. Üst sıvıdan 100 mikrolitre alınarak, üzerine içinde % 0.1 Hidrojen peroksit (H 2 O 2 ) ve %0.25 guaiakol bulunan 1 ml 0.1 M ph 7.0 fosfat tamponu eklenmiştir. Hazırlanan karışımın 470 nm dalga boyundaki absorbansları 2 dakika boyunca 15 saniye aralıklarla ölçülmüştür. Elde edilen absorbans değerlerinin aritmetik ortalamaları alınarak, 1 gram kabuk örneğindeki peroksidaz enziminin 1 dakikadaki aktivitesi tayin edilmiştir. Peroksidaz aktivitesi ΔA/g.taze ağırlık.dk. cinsinden kantitatif olarak ifade edilmiştir. 37

48 Ziraat kiraz çeşidi ve kiraz anaçlarının peroksidaz profillerinin çıkarılması Peroksidaz izoenzimin profillerinin analizinde poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE) tekniği kullanılmıştır. Bu yöntemde elektroforezin gerçekleşeceği jel iki kısımdan oluşmaktadır ve örneklerin jelden geçirilme işlemi dikey olarak yapılmaktadır. Bu jellerden ilki ayırma jeli, ikincisi ise örnek tutma jelidir (Eriş ve Gülen, 2004). Ayırma jeli ve örnek tutma jelinin yoğunluklarıyla ilgili çok sayıda ön deneme yapılmıştır. Denemeler sonucunda %10 ayırma jeli (running gel) ve % 5 örnek tutma jeline (stacking gel) karar verilmiştir. Jellerin hazırlanmasında Gülen (2000) den alınan yöntem kullanılmıştır. Bu jellerin hazırlanması aşağıda ayrıntılı olarak verilmiştir. %10 luk ayırma jeli hazırlanması için; 1.25 ml Tris-HCL ph 8.9 stok solüsyonu 3.07 ml Acrylamide Bis stok solüsyonu 5.1 ml saf su 70 µl Amonyum persülfat stok solüsyonu 15 µl TEMED (tetrametiletilendiamin) sırası ile karıştırılmış ve mümkün olan en çabuk şekilde, bu karışıma 3.7 ml, bir mikropipet yardımıyla jel kasetine boşaltılmıştır. Jelin üzerine yine bir mikropipet yardımıyla ~100 µl saf su ilave edilerek jelin havayla teması kesilmiş ve donması sağlanmıştır. Bu şekilde hazırlanan jel bir saat içinde polimerize olup donmuştur. Bir saatlik polimerizasyon süresi sonunda örnek tutma jeli hazırlanarak donmuş olan ayırma jelinin üzerine konulmuştur. %5 lik örnek tutma jeli hazırlanması 625 µl Tris-HCL ph 6.7 stok solüsyonu 2.5 ml Acrylamide / Bis stok solüsyonu 1.8 ml saf su 36 µl Amonyum persülfat stok solüsyonu 8 µl TEMED sırasıyla karıştırılmış ve yine mümkün olan en çabuk şekilde kasetteki donmuş ayırma jeli üzerine bir mikropipet yardımıyla ~1.5 ml boşaltılmıştır. Bununla birlikte jel üzerinde örneklerin konulacağı 38

49 bölümlerin oluşturulması için, kasete, jel üzerine denk gelecek şekilde tarak yerleştirilmiş ve bu şekilde polimerizasyon için yaklaşık 1 saat beklenmiştir. 1 saatin sonunda donmuş olan jel üzerinden tarak yavaşça çıkarılmış ve jel kaseti elektroforezin gerçekleştirileceği tank içerisine yerleştirilmiştir. Bu arada jelin kurumaması için elektroforez solüsyonu tanka boşaltılmıştır (Gülen, 2000). Ekstrakte edilen ve buz kutusunda beklemekte olan örneklerin her birinden 15 µl alınarak jele enjekte edilmiştir. Elektroforez tankına tank içersindeki jellerin üzerini örtecek şekilde elektroforez solusyunu konulmuştur. Elektroforez işlemi 0.05 M Trisglycine (ph 8.3) solusyonunda yaklaşık 1 saat süreyle, 150 V akım şartlarında, 4 0 C de gerçekleştirilmiştir. Araştırma materyalimize özgü yapılan ön denemeler sonucunda Wendel ve Weeden (1989) yöntemi çalışmada kullanılacak boyama yöntemi olarak seçilmiştir. Elektroforez sonucunda kasetten çıkarılan jel, boya solüsyonunun içersine konulmuş, oda sıcaklığında karanlık koşullarda 1 saat bekletilmiştir. Wendel ve Weeden (1989) boyama solusyonunun hazırlanışı 50 mm Na-acetate buffer ph ml CaCl 2. 2H 2 O (Kalsiyum klorid) 132 mg H 2 O 2 (%3)-(Hydrogen peroxide) 0.5 ml 3-Amino-9 ethyl carbazole 50 mg DMF (Dimethylformamide) 4 ml Boya solusyonu boyama yapılmadan hemen önce taze olarak hazırlanmıştır. Sodyum asetat solusyonunun 100 ml si içerisinde CaCl 2. 2H 2 O eritilmiştir. Ayrı bir kapta 50 mg 3-Amino-9 ethyl carbazole üzerine 4 ml DMF eklenerek iyice çözündürülmüştür. Son olarak hidrojen peroksit eklenip iyice karıştırıldıktan sonra jel üzerine boşaltılmıştır. Jel üzerindeki bantların ilerleme mesafelerinin saptanabilmesi için Manganaris ve Alston (1992) tarafından önerilen yöntem kullanılmıştır. Buna göre enzim bandının 39

50 jelin başlangıç noktasına uzaklığı (Rf:0.0) ve işaret boyasının ilerleme masefesi (jel boyu) (Rf:1.0) temel alınarak bantların jel üzerindeki ilerleme mesafeleri (Rf) hesaplanmıştır. Rf :(0.0) Rf = (3.1) Rf :(1.0) Fenolik bileşiklerin tayininde kullanılan yöntem Fenolik bileşiklerin ekstraksiyonu Fenolik bileşiklerin ekstrakte edilmesinde Usenik ve Štampar (2000) ın kullandığı yöntemde bazı modifikasyonlar yapılmıştır. 100 mg küçük parçalara ayrılmış kabuk örneği üzerine 20 ml 0.4% Triton X-100 içeren aseton-su (80:20) karışımından oluşan ekstraksiyon sıvısı dökülmüş ve +4 0 C de 10 gün bekletilmiştir. Daha sonra örnekler 4000 rpm da 10 dakika santrifuj edilmişlerdir. Örneklerin sıvı kısmı alınıp 40 0 C de rotary evaparatörde aseton-su karışımı uzaklaştırılmıştır. 2 ml metanol ile kuru balon çözülmüş ve örnekler 0.45 µm filtreden süzülmüştür. Elde edilen örnekler kullanılıncaya kadar derin dondurucuda saklanmıştır (Şekil 3.3.). 40

51 Şekil 3.3. Ekstrakte edilmiş örnekler Toplam fenolik madde içeriklerinin belirlenmesi Toplam fenolik madde miktarının belirlenmesinde Folin-Ciocalteu kolorimetrik metodu kullanılmıştır. Spektrofotometrik okumalar 690 nm de yapılmış ve sonuçlar kateşin eşdeğeri olarak hesaplanmıştır Fenolik bileşiklerin HPLC ile belirlenmesi Fenolik madde bileşikleri Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi (High Performance Liquid Chromatography= HPLC) ile Usenik ve Štampar (2000) ın yönteminde bazı modifikasyonlar yapılarak analiz edilmiştir (Şekil 3.4). Denemede, örneklerin fenolik asitlerden gallik asit (gallic acid) ve p-kumarik asit (p-coumaric asit), flavonoidlerden kateşin (catechin) ve kuarsetin (quarcetin) içerikleri incelenmiştir. Denemede kullanılan gradient program Çizelge 3.1. de; standartlara ait kromotogram Şekil 3.5 de verilmiştir. 41

52 Şekil 3.4. HPLC cihazı ve örneklerin cihaza yerleştirilmesi HPLC cihazı ile ilgili koşullar aşağıda sunulmuştur. Dedektör: THERMO Surveyor PDA Plus Auto sampler and Column Oven: THERMO Surveyor AS Pump and Degasser :THERMO Surveyor LC Pump Kolon: Thermo Hypersil Gold 100 mm x4.6 mm, 5um Akış hızı: 0.6ml/dk Mobil faz: A: Asetik asit su (%10), B; Asetik asit-methanol (%5) Kolon sıcaklığı: 25 0 C Çizelge 3.1. Denemede kullanılan gradient program Zaman (dakika) A(%) B(%) Akış hızı (ml/dk) Başlangıç

53 kateşin p-kumarik asit gallik asit kuarsetin Şekil 3.5. Denemede kullanılan standartlara ait kromatogram 3.3. İstatistik Analizler Deneme 3 tekerrürlü olarak tesadüf parselleri şeklinde kurulmuş ve her tekerrürde 3 fidan kullanılmıştır. Elde edilen bulgular SPPS paket programında varyans analizi tekniği ile analiz edilmişlerdir. Grup ortalamalarının arasındaki farkların belirlenmesinde Tukey testi kullanılmıştır. 43

54 4. ARAŞTIRMA BULGULARI 4.1. Peroksidaz İzoenzimi ile İlgili Bulgular Peroksidaz aktivitesi Aşısız anaçlardan ve kalemden, deneme başlangıcında, 8 ve 12 ay sonra; aşılı kombinasyonlarda da aşı yerinin altından, üstünden ve aşı yerinden aynı dönemlerde örnekler alınmıştır. Alınan örneklerin peroksidaz aktiviteleri spektrofotometrik yöntemle belirlenmiştir. Aşısız anaçlardan ve 0900 Ziraat kaleminden alınan örneklerin dönemsel peroksidaz aktiviteleri Çizelge 4.1. de verilmiştir. Aşısız anaçlar değerlendirildiğinde anaç x dönem interaksiyonu istatistik olarak önemli değilken, hem anaçların hem de dönemlerin seviye ortalamaları arasındaki fark istatistik olarak önemlidir (p<0.01). Anaçlar arasındaki ortalamalar karşılaştırıldığında peroksidaz aktivitesinin en yüksek Kuş kirazı anacında (10.94 ΔA/g.dk.), en düşük ise Kara idris anacında (8.01 ΔA/g.dk.) olduğu saptanmıştır. Denemede kullanılan bütün anaçlar örnek alma dönemlerine göre değerlendirildiğinde, peroksidaz aktivitesi artmıştır. Başlangıca göre zamana bağlı olarak peroksidaz aktivitesindeki bu artış istatistik olarak önemli bulunmuştur. Benzer şekilde 0900 Ziraat kaleminden aşılanmadan önce alınan örneklerdeki peroksidaz aktivitesi de örnek alma dönemlerine bağlı olarak artmıştır (p<0.05). Aşısız kalemden alınan kabuk örneğinde en düşük peroksidaz aktivitesi denemenin başlangıcında belirlenirken, 12 ay sonra peroksidaz aktivitesi artarak en yüksek değerine ulaşmıştır Ziraat kaleminin peroksidaz aktivitesinin, aynı dönemlerdeki anaçların ortalama peroksidaz aktivitelerinden ve ortalama değerinin de anaçların ortalamalarından daha yüksek olduğu belirlenmiştir. 44

55 Çizelge 4.1. Aşısız anaçların ve kalemin peroksidaz aktiviteleri (ΔA/g.dk.) Örnek Alma Dönemi Başlangıç 8 ay 12 ay Ortalama Kuş kirazı a x Kara idris f Sarı idris e MaxMa b MaxMa c Gisela de CAB 6P d Ortalama 9.07 C y 9.22 B 9.30 A 0900 Ziraat B y AB A x Aynı sütunda farklı küçük harfle gösterilen değerler arasındaki fark istatistik olarak önemlidir. y Aynı satırda farklı büyük harfle gösterilen değerler arasındaki fark istatistik olarak önemlidir. p (anaçlar) <0.01, p (kalem) <0.05. Aşı yapıldıktan sonra aşı yerinin altından alınan örneklerin dönemsel peroksidaz aktiviteleri analizlenmiş, peroksidaz aktivitesi üzerine dönemlerin ve anaçların etkisi istatistik olarak önemli (p<0.01) bulunmuştur (Çizelge 4.2.). Denemenin başında, en yüksek enzim aktivitesi Kuş kirazı anacında, (10.80 ΔA/g.dk.) tespit edilirken, bu anacı sırasıyla MaxMa 14, MaxMa 60, CAB 6P, Sarı idris, Gisela 5 anaçları izlemiştir. En düşük peroksidaz aktivitesi ise Kara idris anacında gerçekleşmiştir (7.83 ΔA/g.dk.). Aşılamadan 8 ay sonra anaçların peroksidaz aktiviteleri 7.94 ΔA/g.dk. (Kara idris) ile ΔA/g.dk. (Kuş kirazı) arasında değişiklik göstermiştir. Bu dönemde kombinasyonun alt kısmından alınan örneklerde peroksidaz aktivitesinin Kuş kirazı, Sarı idris, MaxMa 60 ve Gisela 5 anaçlarında başlangıca göre önemli derece artış görülmüştür. Aşılamadan 12 ay sonra ise anaçların peroksidaz aktivitesi dalgalanmalar göstermiştir. Sarı idris ve CAB 6P anaçlarında 12 ay sonra peroksidaz aktivitesinde artış görülürken, diğer anaçlarda bunun aksine peroksidaz aktivitesi azalmıştır. 45

56 Çizelge 4.2. Aşılamadan sonra aşı yerinin altından alınan örneklerin peroksidaz aktiviteleri (ΔA/g.dk.) Örnek Alma Dönemi Başlangıç 8 ay 12 ay Ortalama Kuş kirazı a x C y a A a B Kara idris 7.83 e A 7.94 f A 7.73 f B 7.83 Sarı idris 8.53 d B 8.71 e A 8.74 e A 8.66 MaxMa b A 9.76 c A 9.01 d B 9.51 MaxMa c B 9.72 c A 9.37 c B 9.47 Gisela d C b A 9.44 b B 9.42 CAB 6P 8.78 d B 8.92 d B 9.02 d A 8.91 Ortalama x Aynı sütunda farklı küçük harfle gösterilen değerler arasındaki fark istatistik olarak önemlidir (p<0.01). y Aynı satırda farklı büyük harfle gösterilen değerler arasındaki fark istatistik olarak önemlidir (p<0.01). Aşı yapıldıktan sonra aşı sürgününün dönemsel peroksidaz aktivitesi değişimi Çizelge 4.3. de sunulmuştur. Aşı yerinin üst kısmından aşı yapıldıktan 8 ve 12 ay sonra alınan örneklerde, anaçların ve örnek alma dönemlerinin, peroksidaz aktivitesi üzerine etkisi istatistik olarak önemli bulunmuştur (p<0.01). 8. ayda alınan kabuk örneklerinde CAB 6P üzerine aşılı kalem en yüksek (21.07 ΔA/g.dk.) peroksidaz aktivitesine sahipken, Gisela 5 anacı üzerine aşılı olan kalem en düşük (12.21 ΔA/g.dk) değere sahip olmuştur. Aşı yapıldıktan 12 ay sonra ise peroksidaz aktivitesi 0900 Ziraat /Gisela 5 kombinasyonunda en yüksek değeri almıştır (28.56 ΔA/g.dk.). Bu dönemde aşı sürgünündeki en düşük peroksidaz aktivitesi ise 0900 Ziraat /Sarı idris kombinasyonunda saptanmıştır (15.30 ΔA/g.dk.). Örnek alma dönemleri karşılaştırıldığında tüm kombinasyonlarda 12 ay sonra peroksidaz aktivitesi artış göstermiştir (Çizelge 4.3.). 46

57 Çizelge 4.3. Aşılamadan sonra aşı yerinin üstünden alınan örneklerin peroksidaz aktivitesi (ΔA/g.dk) Örnek alma dönemi 8 ay 12 ay Ortalama 0900 Ziraat /Kuş kirazı d x B y d A Ziraat /Kara idris c B d A Ziraat /Sarı idris e B e A Ziraat /MaxMa b B b A Ziraat /MaxMa d B d A Ziraat /Gisela f B a A Ziraat /CAB 6P a B c A Ortalama x Aynı sütunda farklı küçük harfle gösterilen değerler arasındaki fark istatistik olarak önemlidir (p<0.01). y Aynı satırda farklı büyük harfle gösterilen değerler arasındaki fark istatistik olarak önemlidir (p<0.01). Aşı yerindeki peroksidaz aktivitesinin dönemlere bağlı değişimi Çizelge 4.4. de verilmiştir. Kombinasyonların aşı yerlerindeki peroksidaz aktivitelerinin değişimi anaçlara ve dönemlere göre istatistik olarak önemli bulunmuştur (p<0.01). 8. ayda 0900 Ziraat /Gisela 5 kombinasyonun aşı yerindeki peroksidaz aktivitesinin en yüksek olduğu, en düşük aktiviteye sahip kombinasyonun ise 0900 Ziraat /Kuş kirazı olduğu belirlenmiştir. 12. ayda tüm kombinasyonların aşı yerlerinden alınan kabuk örneklerinde peroksidaz aktivitesi azalmıştır. Bu dönemde de en yüksek aktivite gösteren kombinasyon 0900 Ziraat /Gisela 5 kombinasyonu olmuştur. Aşı yerindeki en düşük aktivite yine 0900 Ziraat /Kuş kirazı kombinasyonundan elde edilmiştir (Çizelge 4.4.). Çizelge 4.4. Aşı yerlerinin peroksidaz aktiviteleri (ΔA/g.dk) Örnek alma dönemi 8 ay 12 ay Ortalama 0900 Ziraat /Kuş kirazı f x A y d B Ziraat /Kara idris c A c B Ziraat /Sarı idris d A b B Ziraat /MaxMa b A a B Ziraat /MaxMa e A d B Ziraat /Gisela a A a B Ziraat /CAB 6P c A b B Ortalama x Aynı sütunda farklı küçük harfle gösterilen değerler arasındaki fark istatistik olarak önemlidir (p<0.01). y Aynı satırda farklı büyük harfle gösterilen değerler arasındaki fark istatistik olarak önemlidir (p<0.01). 47

58 Şekil 4.1. de her bir kombinasyonun farklı yerlerindeki peroksidaz aktivitesi örnek alma dönemlerine göre ayrı ayrı gösterilmiştir. Kuş kirazı anacında aşısız anaç ve kalem örneklerinde 8. ve 12. aylarda enzim aktivitelerinde önemli bir değişim olmamıştır. Anacın üzerine 0900 Ziraat kalemi aşılandığında, aşı yerinin alt kısmından alınan örneklerde 8. ayda enzim aktivitesi artmış, 12. ayda azalarak aşısız anaca yakın bir değer almıştır. Aşısız kalemde enzim aktivitesi bakımından dönemler arasında önemli bir fark görülmezken kuş kirazı üzerine aşılanmış kalemde enzim aktivitesi artmış ve bu artış 12. ayda da devam etmiştir. Aşılı kombinasyonda enzim aktivitesinin en fazla olduğu bölüm aşı yeri olmuş, bunu sırasıyla kalem ve anaç kısımları izlemiştir. Aşı yapıldıktan 12 ay sonra kalem kısmında peroksidaz aktivitesi artarken anaç ve aşı yerinde azalmıştır. Kara idris anacında aşı yapıldıktan sonra peroksidaz aktivitesinde çok önemli bir değişim olmamıştır. Bu anaç üzerindeki aşı sürgününden alınan örnekte, aşısız kaleme göre peroksidaz aktivitesi artmıştır. Aşı sürgünündeki peroksidaz aktivitesi aşı yapıldıktan 12 ay sonra da az da olsa artış göstermiştir. Bu kombinasyonda aşı yerindeki peroksidaz aktivitesi 8. ayda oldukça yüksek olup, 12 ay sonra belirgin bir şekilde düşmüştür. Sarı idris anacında aşı yapılmadan önce ve aşılandıktan sonra peroksidaz aktivitesi bakımından çok önemli bir fark görülmezken, aşı yerinin üst kısmında aşısız kaleme göre aktivitenin arttığı belirlenmiştir. Aynı yerden alınan örneklerde 12 ay sonra da bu artış devam etmiştir. Aşı yapıldıktan 8 ay sonra aşı yerinden alınan örneklerde peroksidaz aktivitesinin oldukça yüksek olduğu, 12 ay sonra ise aktivitenin azaldığı saptanmıştır. MaxMa 14 anacı, aşılanmadan önce ve sonra 8. ve 12. aylarda birbirine yakın değerler almıştır. Aşı sürgününden 8 ay sonra alınan kabuk örneklerinde peroksidaz aktivitesi aşısız kaleme göre artmış, 12 ay sonra da artmaya devam etmiştir. Aşı yerindeki peroksidaz aktivitesi bu anaçta da oldukça fazladır. Bu bölgedeki peroksidaz aktivitesinin diğer anaçlarda olduğu gibi 12. ayda azaldığı gözlenmiştir. 48

59 8 Ay 12Ay A AA K AK AY A AA K AK AY A AA K AK AY A AA K AK AY A AA K AK AY A AA K AK AY A AA K AK AY Peroksidaz aktivitesi ( A/g.dk.) Kuş kirazı Kara idris Sarı idris MaxMa14 MaxMa60 Gisela5 CAB 6P Anaçlar A aşısız anaç, AA aşılı anaç, K kalem, AK aşılı kalem, AY aşı yeri. Şekil 4.1. Aşı elemanlarının farklı dönemlerdeki peroksidaz aktiviteleri 49

60 MaxMa 60 anacında 8. ayda alınan örneklerde aşısız anaçla aşılı anacın peroksidaz aktiviteleri arasında çok önemli bir fark görülmemiştir. Aşı yapıldıktan 12 ay sonra ise peroksidaz aktivitesi aşılı anaçta azalmıştır. Aşı yapıldıktan sonra, aşısız kalemle karşılaştırıldığında, aşılı kalemde daha yüksek peroksidaz aktivitesi belirlenmiştir. Gisela 5 anacında aşı yapılmadan önce alınan kabuk örneklerindeki peroksidaz aktivitesinde 8. ve 12. aylarda önemli bir fark görülmemiştir. Bu anaçta en belirgin farklardan birisi aşılanmış kalemde 12 ay sonra meydana gelen enzim aktivitesi artışı, bir diğeri de yine aşı bölgesinde diğer anaçlardan daha yüksek enzim aktivitesidir (Şekil 4.1.). Diğer anaçlarda olduğu gibi bu anaçta aşı yerinde 8 ay sonra saptanan yüksek enzim aktivitesi 12 ay sonra azalma göstermiştir. CAB 6P aşısız ve aşılı anaç örneklerinde diğer anaçlara benzerlik göstermiş, diğer anaçlarda olduğu gibi bu anaçta da aşılı kalemdeki enzim aktivitesi 8. ve 12. aylarda artış göstermiştir. Aşı bölgesinde, 8. ayda tespit edilen yüksek peroksidaz aktivitesi 12. ayda azalmıştır. Genel olarak değerlendirildiğinde; aşısız anaçlarda peroksidaz aktivitesi bakımından çok fark görülmemekle birlikte en yüksek değer Kuş kirazı, en düşük ise Kara idris anaçlarından elde edilmiştir. Aşılamadan sonra en yüksek peroksidaz aktivitesi yine Kuş kirazı anacından elde edilmiştir. 8. ayda en yüksek peroksidaz aktivitesi 0900 Ziraat /MaxMa 14 kombinasyonun kalem kısmından gözlenirken, 12. ayda 0900 Ziraat /Gisela 5 kombinasyonunda kalem kısmında peroksidaz aktivitesinde önemli bir artış meydana gelmiştir. Tüm anaçlarda, aşılama yapıldıktan 8 ay sonra aşı bölgesinde yoğun bir peroksidaz aktivitesi saptanmış, aşı yapıldıktan 12 ay sonra tüm kombinasyonlarda azalmıştır. Aşı yerinde en yüksek peroksidaz aktivitesi 0900 Ziraat /Gisela 5 kombinasyonundadır. Bunu sırasıyla MaxMa 14, CAB 6P, Sarı idris ve Kara idris anaçları izlemiştir. Aşı bölgesinde peroksidaz aktivitesinin en düşük olduğu kombinasyon ise 0900 Ziraat çeşidinin Kuş kirazı ile oluşturduğu kombinasyonda aşı bölgesinden alınan örneklerde gözlenmiştir. Aşılı kombinasyonlar karşılaştırıldığında tüm kombinasyonlarda en düşük peroksidaz aktivitesi aşı yerinin alt kısmından alınan örneklerde, daha sonra aşı yerinin üst 50

61 kısmından alınan örneklerde, en yüksek ise aşı yerinden alınan örneklerde saptanmıştır Ziraat kiraz çeşidi ve kiraz anaçlarının peroksidaz profilleri Aşılama yapılmadan önce 0900 Ziraat çeşidinden ve anaçlardan alınan kabuk örneklerinin peroksidaz profilleri Aktif Poliakrilamid Jel Elektroforez (PAGE) tekniği kullanılarak belirlenmiştir. Kalemin ve anacın peroksidaz profilleri birbirine oldukça yakın çıkmış Rf değeri 0.39 olan A bandı ve Rf değeri 0.42 olan B bandı hem kalemde hem de anaçlarda belirlenmiştir. Aşısız anaçlar arasında peroksidaz aktiviteleri bakımından çok fark olmadığı görülmektedir (Şekil 4.2.). A B Şekil 4.2. Aşı yapılmadan önce 0900 Ziraat kaleminin ve anaçların peroksidaz profilleri. Soldan sağa Ziraat 2. Kuş kirazı 3. Kara idris 4. Sarı idris 5. MaxMa MaxMa Gisela 5 8. CAB 6P Aşı yapıldıktan 12 ay sonra aşı yerinin alt kısmından (anaç), aşı bögesinden ve aşı yerinin üst kısmından (kalemden) alınan kabuk örneklerine ait peroksidaz profilleri Şekil 4.3. de verilmiştir. Aşısız anaçlarda ve kalemde deneme başlangıcında belirlenen A (Rf 0.39) ve B bantları (Rf 0.42) 12 ay sonra da net olarak gözlenmiştir. Aşısız anaçlarla aşı bölgesinin alt kısmından alınan örnekler karşılaştırıldığında bantların yoğunluklarında az da olsa fark gözlenmiştir Ziraat /Kara idris ve 0900 Ziraat /Gisela 5 kombinasyonlarının anaç kısımlarından alınan kabuk 51

62 örneklerinde, bant desenlerinin diğer kombinasyonlara göre daha açık renkli olduğu görülmüştür. Peroksidaz yoğunluğu tüm kombinasyonlarda belirgin bir şekilde artmakla beraber artışın en fazla olduğu kombinasyonun 0900 Ziraat /Gisela 5 kombinasyonunun aşı bölgesinde olduğu saptanmıştır. Bunula birlikte 0900 Ziraat /MaxMa 14 aşı bölgesinde de belirgin bir artış kaydedilmiştir. Şekil 4.3.c den de görüldüğü gibi aşı bölgesinin üst kısmından alınan kabuk örneklerinde peroksidaz enzimine ait bant desenleri anaç kısmından alınan örneklerle benzerlik göstermektedir. Aynı dönemde aşı bölgesinden alınan örneklere göre daha az boyanan peroksidaz bantları elde edilmiştir (Şekil 4.3.). a b c Şekil 4.3. Aşı yapıldıktan 12 ay sonra farklı bölgelerden alınan örneklerin peroksidaz profilleri. a. Aşı yapıldıktan 12 ay sonra aşı bölgesinin alt kısmından alınan örneklerin peroksidaz profilleri Sırasıyla; 1. Kuş kirazı, 2. Kara idris, 3. Sarı idris, 4. MaxMa 14, 5. MaxMa 60, 6. Gisela 5, 7. CAB 6P. b. Aşı yapıldıktan 12 ay sonra aşı bölgesinden alınan örneklerin peroksidaz profilleri c. Aşı yapıldıktan 12 ay sonra aşı bölgesinin üzerinden alınan örneklerin peroksidaz profilleri 52

63 4.2. Fenolik Bileşiklerle İlgili Bulgular Aşılama yapılmadan önce Kuş kirazı, Sarı idris, Kara idris, MaxMa 14, MaxMa 60, Gisela 5 anaçları ile 0900 Ziraat kaleminden aşılamadan 8 ve 12 ay sonra bu anaçların 0900 Ziraat ile olan kombinasyonlarından alınan kabuk örneklerindeki toplam fenolik madde miktarı spektrofotometrik olarak kateşin eşdeğeri cinsinden belirlenmiştir Toplam fenolik madde içerikleri Aşı yapılmadan önce farklı dönemlerde anaçlardan alınan kabuk örneklerinde, toplam fenolik madde miktarı üzerine dönemlerin ve anaçların etkisi istatistik olarak önemli bulunmuştur (p<0.01). Denemenin başlangıcında alınan örneklerde toplam fenolik madde miktarı mg/g (Kuş kirazı) ile mg/g (CAB 6P) arasında değişmiştir (Çizelge 4.5.). Denemeye başladıktan 8 ay sonra yine en yüksek toplam fenolik madde miktarı CAB 6P ve Gisela 5 anaçlarından elde edilmiştir. Bu anaçları Kara idris, MaxMa 60 ve MaxMa 14 anaçları izlemiştir. Toplam fenolik madde miktarı en düşük olan anaç bu dönemde de Kuş kirazı anacı olmuştur. 12. ay analizlerinde de toplam fenolik madde miktarı bakımından anaçların sıralaması değişmemiştir (Çizelge 4.5.). Sarı idris, MaxMa 14 ve MaxMa 60 anaçlarında toplam fenolik madde miktarındaki dönemsel değişim istatistik olarak önemliyken (p<0.01), diğer anaçlarda önemli bulunmamıştır. Diğer anaçlarda ise toplam fenolik madde miktarındaki değişim çok önemli bulunmamıştır. Aşısız 0900 Ziraat kaleminden 8 ay sonra alınan örneklerdeki toplam fenolik madde miktarındaki artış istatistik olarak önemlidir (p<0.01). Başlangıçta mg/g olan toplam fenolik madde miktarı 12 ay sonra artarak mg/g olmuştur. 53

64 Çizelge 4.5. Aşısız anaçların ve kalemin toplam fenolik madde içerikleri (mg/g) Örnek Alma Dönemi Başlangıç 8 ay 12 ay Ortalama Kuş kirazı d x A y e A e A Kara idris b A b A b A Sarı idris c A d B d B MaxMa b A c B bc A MaxMa b A c B c B Gisela a A a A a A CAB 6P a A a A a A Ortalama Ziraat 16.53B y 17.29A 17.41A x Aynı sütunda farklı küçük harfle gösterilen değerler arasındaki fark istatistik olarak önemlidir (p<0.01). y Aynı satırda farklı büyük harfle gösterilen değerler arasındaki fark istatistik olarak önemlidir (p<0.01). Toplam fenolik madde miktarı bakımından aşılanmış anaçlar karşılaştırıldığında, örnek alma dönemlerinin ve anaçların toplam fenolik madde miktarı üzerine etkisi istatistik olarak önemli bulunmuştur (p<0.01). Çizelge 4.6. dan da görüldüğü gibi aşı yapıldıktan 8 ay sonra alınan örneklerde en yüksek toplam fenolik madde miktarı CAB 6P (18.40 mg/g) ve Gisela 5 (18.31 mg/g) anaçlarında, en düşük ise Kuş kirazı (14.86 mg/g) anacında saptanmıştır. Aşı yerinin altından 12 ay sonra alınan örneklerde de toplam fenolik madde miktarı en düşük olan anaç Kuş kirazı olurken (15.01 mg/g), en yüksek anaçlar CAB 6P ve Gisela 5 anaçları olmuşlardır (18.49 mg/g; 18.47mg/g). Çizelge 4.6. Aşılamadan sonra aşı yerinin altından alınan örneklerin toplam fenolik madde içerikleri (mg/g) Örnek Alma Dönemi Başlangıç 8 ay 12 ay Ortalama Kuş kirazı d x B y d A d A Kara idris b A b A bc A Sarı idris c B c B c A MaxMa b A b A b A MaxMa b A b A bc A Gisela a A a A a A CAB 6P a A a A a A Ortalama x Aynı sütunda farklı küçük harfle gösterilen değerler arasındaki fark istatistik olarak önemlidir (p<0.01) y Aynı satırda farklı büyük harfle gösterilen değerler arasındaki fark istatistik olarak önemlidir (p<0.01). 54

65 Aşı yapıldıktan 8 ve 12 ay sonra aşı sürgünlerinin toplam fenolik madde miktarı Çizelge 4.7. de sunulmuştur. Kombinasyonun kalem kısmında toplam fenolik madde miktarının aylara ve anaçlara göre değişimi istatistik olarak önemlidir (p<0.01). 8. ayda en yüksek değer, Gisela 5 anacı üzerine aşılanmış kalemden (39.17 mg/g) elde edilirken, bu anacı CAB 6P, MaxMa 60, MaxMa 14, Kara idris ve Sarı idris anaçları izlemiştir (Çizelge 4.7.). Aşı yapıldıktan 8 ay sonra toplam fenolik madde miktarı en düşük değer 0900 Ziraat / Kuş kirazı kombinasyonundan, en yüksek ise 0900 Ziraat /Gisela 5 kombinasyonundan elde edilmiştir. Aşı yapıldıktan 12 ay sonra ise CAB 6P en yüksek değeri (34.17 mg/g) alırken, bu anacı Gisela 5 ( mg/g) izlemiştir. MaxMa 14 ve MaxMa 60 anaçları birbirine yakın değerlerle bu anaçları izlemiştir. Aşı yapıldıktan 12 ay sonra tüm kombinasyonların kalem kısmında toplam fenolik madde miktarı azalmıştır Kuş kirazı, Kara idris, Gisela 5 ve CAB 6P kombinasyonlarındaki bu azalma istatistik olarak önemliyken diğerlerinde önemsiz bulunmuştur (p<0.01). Çizelge 4.7. Aşılamadan sonra aşı yerinin üstünden alınan örneklerin toplam fenolik madde içerikleri (mg/g) Örnek alma dönemi 8 ay 12 ay Ortalama 0900 Ziraat /Kuş kirazı f x A y f B Ziraat /Kara idris d A d B Ziraat /Sarı idris e A e A Ziraat /MaxMa c A c A Ziraat /MaxMa c A c A Ziraat /Gisela a A b B Ziraat /CAB 6P b A a B Ortalama x Aynı sütunda farklı küçük harfle gösterilen değerler arasındaki fark istatistik olarak önemlidir (p<0.01). y Aynı satırda farklı büyük harfle gösterilen değerler arasındaki fark istatistik olarak önemlidir (p<0.01). Çizelge 4.8. de kombinasyonların aşı yerlerine ait toplam fenolik madde miktarları sunulmuştur. Kombinasyonların aşı yerlerindeki toplam fenolik madde miktarında anaç x kalem interaksiyonu istatistik olarak önemli bulunmuştur (p<0.01). Aşı yapıldıktan 8 ay sonra aşı yerinde en fazla toplam fenolik madde miktarı 0900 Ziraat / Gisela 5 (56.85 mg/g) kombinasyonunda belirlenirken, bunu 0900 Ziraat /CAB 6P (54.27 mg/g) takip etmiştir. Sarı idris ve kuş kirazı anaçlarının aşı yerleri en az toplam fenolik madde içeren bölgeler olmuştur. Aşı yapıldıktan 12 ay 55

66 sonra toplam fenolik maddenin en yoğun olduğu aşı yeri yine 0900 Ziraat/Gisela 5 kombinasyonu iken, en az olduğu aşı yeri ise 0900 Ziraat /Kuş kirazı kombinasyonunu olmuştur. Örnek alma dönemlerinin toplam fenolik madde içeriği üzerine etkisi MaxMa 14 ve MaxMa 60 anaçlarıyla oluşturulan kombinasyonlar dışında istatistik olarak önemli bulunmuştur (p<0.01). Kombinasyonların aşı yerlerinde aşı yapıldıktan 12 ay sonra 8 aya göre azalma kaydedilmiştir. Çizelge 4.8. Aşı yerlerinin toplam fenolik madde içerikleri (mg/g) Örnek alma dönemi 8 ay 12 ay Ortalama 0900 Ziraat /Kuş kirazı f x A y f B Ziraat /Kara idris e A e B Ziraat /Sarı idris f A d B Ziraat /MaxMa c A b A Ziraat /MaxMa d A c A Ziraat /Gisela a A a B Ziraat /CAB 6P b A b B Ortalama x Aynı sütunda farklı küçük harfle gösterilen değerler arasındaki fark istatistik olarak önemlidir (p<0.01). y Aynı satırda farklı büyük harfle gösterilen değerler arasındaki fark istatistik olarak önemlidir (p<0.01). Kombinasyonların toplam fenolik madde miktarlarındaki dönemsel değişim her bir anaç için Şekil 4.4. de toplu olarak sunulmuştur. Aşısız Kuş kirazı anacıyla aşılı Kuş kirazı anacı arasında toplam fenolik madde miktarı bakımından çok fark olmamakla birlikte, aşı yapıldıktan 12 ay az da olsa bir artış görülmüştür. Aşı yapıldıktan sonra aşı yerinin üst kısmından alınan örneklerde aşısız kaleme göre daha yüksek toplam fenolik madde belirlenmiştir. Aşısız kalem ve aşılı kalemden alınan örnekler, aşısız ve aşılı anaçtan alınan örneklerden daha fazla toplam fenolik maddeye sahiptirler. Kuş kirazı anacında toplam fenolik maddenin en yüksek olduğu bölge aşı yeri olmuştur. Aşı yerindeki toplam fenolik madde aşı yapıldıktan 12 ay sonra azalmıştır. 56

67 8 Ay 12Ay 57 Toplam fenolik madde (mg/g) A AA K AK AY A AA K AK AY A AA K AK AY A AA K AK AY A AA K AK AY A AA K AK AY A AA K AK AY Kuş kirazı Kara idris Sarı idris MaxMa14 MaxMa60 Gisela5 CAB 6P Anaçlar A aşısız anaç, AA aşılı anaç, K kalem, AK aşılı kalem, AY aşı yeri. Şekil 4.4. Aşı elemanlarının farklı dönemlerdeki toplam fenolik madde içerikleri (mg/g) 57

68 Kara idris anacında aşısız ve aşılı anaç hem 8 ayda hem de 12 ayda birbirlerine çok yakın değerler almışlardır. Kara idris anacı üzerine aşılanan 0900 Ziraat kaleminden alınan örneklerde, aşısız kaleme ve anaca göre daha yüksek miktarda fenolik madde saptanmıştır. Bu kombinasyonda da fenolik madde miktarının en yüksek olduğu bölge aşı yeridir. Aşı yapıldıktan 12 ay sonra aşı yerindeki toplam fenolik madde miktarı düşmüştür. Sarı idris anacı üzerine 0900 Ziraat kalemi aşılandığında toplam fenolik miktarında az bir artış görülmüştür. Aşı yapıldıktan 8 ay sonra aşısız kaleme göre kalemdeki fenolik madde miktarında artış gözlenmiş, 12 ay sonra ise fenolik madde miktarında önemli bir değişiklik olmamıştır. Aşı yerinde toplam fenolik madde miktarının bu kombinasyonda da yüksek olduğu görülmektedir. Aşı yapıldıktan 12 ay sonra aşı yerindeki toplam fenolik madde içeriğinde az da olsa bir düşüş kaydedilmiştir. Toplam fenolik madde içeriği bakımından MaxMa 14 ve MaxMa 60 anaçları birbirine oldukça yakın değerler göstermişleridir. Her ikisinde de aşısız ve aşılı kalemdeki toplam fenolik madde miktarı aşısız ve aşılı anaçlardakinden yüksek bulunmuştur. Kombinasyonların aşı bölgesindeki fenolik madde miktarı her ikisinde de diğer bölgelerden yüksektir. Gisela 5 anacı üzerine 0900 Ziraat kalemi aşılandığı zaman anaçta, toplam fenolik madde miktarında çok az bir artış olmuştur. Şekil 4.4. den görüldüğü gibi kombinasyonda aşı yerinin üst kısmından alınan örneklerde aşısız kaleme göre toplam fenolik madde artmış, aşı yapıldıktan 12 ay sonra ise azalmıştır Ziraat /Gisela 5 kombinasyonunun aşı yerinde oldukça yüksek miktarda toplam fenolik madde belirlenmiştir. Aşı yapıldıktan 12 ay sonra bu bölgedeki toplam fenolik madde miktarında azalma görülmüştür. Aşısız CAB 6P ile aşılı CAB 6P anacı karşılaştırıldığında, toplam fenolik madde bakımından çok önemli bir fark görülmemiştir. Bu anaç üzerine aşılanmış kalemde fenolik madde miktarı artmıştır. Aşılandıktan 12 ay sonra, aşı sürgünündeki toplam fenolik madde miktarı azalmıştır. Aşı yerinde, toplam fenolik madde miktarının diğer 58

69 bölgelerden yüksek olduğu, aşı yapıldıktan 12 ay sonra çok az da olsa bir düşüş olduğu görülmüştür. Toplam fenolik madde miktarı bakımından aşısız anaçlar arasında en yüksek değerler CAB 6P ve Gisela 5 anaçlarından elde edilmiştir. Diğer anaçların birbirlerine yakın değerler aldıkları Şekil 4.4. den görülmektedir. Aşısız anaçlar içersinde toplam fenolik madde miktarı en düşük olan ise Kuş kirazıdır Ziraat çeşidiyle aşılandıktan sonra anaçların toplam fenolik madde miktarında az da olsa artış meydana gelmiştir. Aşı yapıldıktan sonra kalem kısmında fenolik madde miktarları tüm kombinasyonlarda artmış, bu artış en fazla Gisela 5 ve CAB 6P ile oluşturulan kombinasyonlarda meydana gelmiştir. 12 ay sonra ise kombinasyonların aşı sürgünlerinde toplam fenolik madde miktarının az ya da çok azaldığı görülmüştür. Toplam fenolik madde miktarı en yüksek değerine tüm kombinasyonlarda aşı yerinde ulaşmıştır Ziraat /Gisela 5 kombinasyonun aşı yerindeki fenolik madde miktarı diğer kombinasyonlardan daha yüksektir. MaxMa 14 ve MaxMa 60 anaçları ile oluşturulan kombinasyonlardaki aşı yerlerinde toplam fenolik madde miktarının 12 ay sonra değişiklik göstermediği, diğer kombinasyonlarda azalma meydana geldiği görülmüştür Fenolik bileşiklerin değişimine ilişkin elde edilen bulgular Aşısız anaçlardan ve kalemden denemenin başlangıcında, 8 ve 12 ay sonra kabuk örnekleri alınmıştır. Farklı aşı elemanlarının farklı dönemlerdeki fenolik bileşikleri HPLC (High Performance Liquid Chromatography, Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi ) ile belirlenmiştir. Araştırmada aşı uyuşmazlığında rol aldıkları öngörülen gallik asit, p- kumarik asit, kateşin ve kuarsetin bileşiklerinin dönemsel değişimleri incelenmiştir. 59

70 Gallik asit Aşısız anaçlardan farklı dönemlerde alınan örneklerde gallik asit miktarı bakımından anaç x dönem interaksiyonu önemli bulunmuştur. Başlangıçta alınan örneklerde en yüksek gallik asit miktarı 3.16 mg/g ile Gisela 5 anacında olmuştur. Gallik asit içeriğinin en düşük olduğu anaçlar ise Kara idris ve Kuş kirazı anaçlarıdır (1.25 mg/g; 1.26 mg/g). 8 ay ve 12 ay sonra alınan örneklerde de gallik asit miktarı en yüksek olan anaç Gisela 5 olmuştur (Çizelge 4.9.). Anaçların örnek alma dönemlerindeki gallik asit içerikleri dalgalanmalar göstermiştir Kuş kirazı ve Kara idris anaçlarındaki değişim istatistik olarak önemli bulunmazken, diğer anaçlardaki dönemlere göre gallik asit miktarındaki değişim istatistik olarak önemli bulunmuştur (p<0.01) Ziraat kaleminde 8 ay sonra alınan örneklerde gallik asit miktarı artmış, 12 ay sonra yeniden azalmıştır. Çizelge 4.9. Aşısız anaçların ve kalemin gallik asit miktarları (mg/g) Örnek Alma Dönemi Başlangıç 8 ay 12 ay Ortalama Kuş kirazı 1.26 e x A y 1.22 e A 1.34 d A 1.27 Kara idris 1.25 e A 1.35 e A 1.19 d A 1.26 Sarı idris 1.62 d A 0.94 f B 1.16 d B 1.24 MaxMa c B 1.63 d C 3.52 b A 2.54 MaxMa b B 2.71 c B 3.09 c A 2.87 Gisela a B 4.09 a B 4.11 a A 4.12 CAB 6P 2.72 bc B 3.19 b A 3.20 c A 3.04 Ortalama Ziraat 3.76 B y 3.89 A 3.71 B 3.79 x Aynı sütunda farklı küçük harfle gösterilen değerler arasındaki fark istatistik olarak önemlidir (p<0.01). y Aynı satırda farklı büyük harfle gösterilen değerler arasındaki fark istatistik olarak önemlidir (p<0.01). Aşı yapıldıktan sonra anaçların gallik asit miktarındaki değişim Çizelge da sunulmuştur. Aşılanmış anaçlarda galllik asit miktarı üzerine anaçların ve dönemlerin etkisi istatistik olarak önemlidir (p<0.01). Aşı yapıldıktan 8 ay sonra en yüksek gallik asit değeri 4.20 mg/g olup Gisela 5 anacından, en düşük gallik asit miktarı ise Kuş kirazı ve Kara idris anaçlarından elde edilmiştir. 12 ay sonra da yine en yüksek gallik asit içeriğine sahip anaç Gisela 5 olmuştur. Bu dönemde gallik asit miktarının en düşük olduğu anaç ise Sarı idris anacı olmuştur. Kuş kirazı anacında 60

71 aşı yapıldıktan 8 ay sonra gallik asit miktarı artmış, 12 ay sonra istatistik olarak önemli olmasa da azalmıştır. Sarı idris anacı aşısız anaca göre 8 ay sonra daha düşük bir gallik asit düzeyine sahip olmuş, 12 ay sonra ise değer yeniden yükselişe geçmiştir. MaxMa 14 anacında gallik asit miktarı 8 ay sonra artan, 12 ay sonra azalan bir değer alırken, MaxMa 60 anacında bu değer önce artmış, sonra azalmıştır. Gisela 5 ve CAB 6P anaçlarında gallik asit miktarı örnek alma dönemleri boyunca artmıştır (Çizelge 4.10.). Çizelge Aşılamadan sonra aşı yerinin altından alınan örneklerin gallik asit miktarları (mg/g) Örnek Alma Dönemi Başlangıç 8 ay 12 ay Ortalama Kuş kirazı 1.26 e x B y 1.94 d A 1.88 d A 1.69 Kara idris 1.25 e B 1.89 d A 1.96 d A 1.70 Sarı idris 1.62 d B 1.21 e AB 1.39 e A 1.41 MaxMa c B 2.79 c A 2.83 c A 2.70 MaxMa b A 2.96 c A 2.85 c A 2.88 Gisela a B 4.20 a A 4.70 a A 4.02 CAB 6P 2.71 bc B 3.78 b A 3.84 b A 3.44 Ortalama x Aynı sütunda farklı küçük harfle gösterilen değerler arasındaki fark istatistik olarak önemlidir (p<0.01). y Aynı satırda farklı büyük harfle gösterilen değerler arasındaki fark istatistik olarak önemlidir (p<0.01). Farklı anaçlar üzerine aşılanmış 0900 Ziraat aşı sürgünün anaçlara ve dönemlere göre galik asit miktarındaki değişim istatistik olarak öenmli değildir (p<0.01). Anaçların ve dönemlerin seviye ortalamaları arasındaki fark ise istatistik olarak önemlidir (p<0.01). Gisela 5, CAB 6P, MaxMa 14, MaxMa60 ve kara idris anaçlarıyla oluşturulan kombinasyonlardan alınan örnekler birbirine yakın değerler alırken, kalemdeki en düşük gallik asit miktarları Sarı idris ve Kuş kirazı anacıyla oluşturulan kombinasyonlardan elde edilmiştir (Çizelge 4.11.). 61

72 Çizelge Aşılamadan sonra aşı yerinin üstünden alınan örneklerin gallik asit miktarları (mg/g) Örnek alma dönemi 8 ay 12 ay Ortalama 0900 Ziraat /Kuş kirazı b x 0900 Ziraat /Kara idris a 0900 Ziraat /Sarı idris b 0900 Ziraat /MaxMa a 0900 Ziraat /MaxMa a 0900 Ziraat /Gisela a 0900 Ziraat /CAB 6P a Ortalama 4.00 B y 4.08 A x Aynı sütunda farklı küçük harfle gösterilen değerler arasındaki fark istatistik olarak önemlidir (p<0.01). y Aynı satırda farklı büyük harfle gösterilen değerler arasındaki fark istatistik olarak önemlidir (p<0.01). Aşı yapıldıktan sonra aşı yerlerinden alınan örneklerin gallik asit miktarındaki değişim anaçlara ve dönemlere göre istatistik olarak önemli (p<0.01) bir değişim göstermiştir. 8. ayda en yüksek gallik asit içeriği 0900 Ziraat /MaxMa 60 kombinasyonunda saptanmış, (3.91 mg/g), bu kombinasyonu sırasıyla Gisela 5, CAB 6P ve MaxMa 14 anaçlarıyla oluşturulan kombinasyonlar izlemiştir. Aşı yerindeki en düşük gallik asit miktarı ise 0900 Ziraat /Kuş kirazı kombinasyonunda belirlenmiştir. Aşı yapıldıktan 12 ay sonra ise 0900 Ziraat /CAB 6P aşı yerinde en yüksek gallik asit miktarı saptanmıştır (3.80 mg/g). Bu anacı Gisela 5, MaxMa 60 ve MaxMa 14 anaçları takip etmiştir. Aşı yapıldıktan 12 ay sonra aşı yerlerindeki gallik asit miktarları diğer kombinasyonlarda azalmış, bazılarında da artmıştır (Çizelge 4.12.). Çizelge Aşı yerlerinin gallik asit miktarları (mg/g) Örnek alma dönemi 8 ay 12 ay Ortalama 0900 Ziraat /Kuş kirazı 2.88 c x A y 2.71 e B Ziraat /Kara idris 2.93 c A 2.97 d A Ziraat /Sarı idris 2.82 c A 2.23 f B Ziraat /MaxMa b A 3.26 c A Ziraat /MaxMa a A 3.52 b B Ziraat /Gisela b B 3.74 ab A Ziraat /CAB 6P 3.22 b B 3.80 a A 3.51 Ortalama x Aynı sütunda farklı küçük harfle gösterilen değerler arasındaki fark istatistik olarak önemlidir (p<0.01). y Aynı satırda farklı büyük harfle gösterilen değerler arasındaki fark istatistik olarak önemlidir (p<0.01). 62

73 Gallik asit miktarı dönemlere ve anaçlara göre oldukça dalgalı bir değer almıştır. Gallik asit içeriği bakımından Kuş kirazı incelendiğinde aşı işleminden sonra aşısız anaçlara göre miktarın arttığı görülmüştür (Şekil 4.5.). Aşısız anaçta 12 ay sonra bu artış devam ederken, aşılı anaçta az da olsa bir azalma gözlenmiştir. Kalem kısmında ise aşısız kaleme göre düşüş meydana gelmiş, aşı yapıldıktan 12 ay sonra bu değer yeniden yükselmiştir. Aşı yerindeki gallik asit miktarı 12 ay sonra, 8 aya göre azalmıştır. Aşısız Kara idris anacında 12 ay sonra, 8. aya göre gallik asit miktarı düşmüştür. Aşı yapıldıktan sonra gallik asit miktarı yükselmiş, 12 ay sonra az da olsa bu artış devam etmiştir. Aşısız kalemle Kara idris anacı üzerine aşılı kalem karşılaştırıldığında, aşılanmış kalemde gallik asit miktarı daha fazladır. Aşısız kalemde bu miktar 12 ay sonra azalırken, aşılı kalemde artığı görülmüştür. Aşı yerinden 8 ay sonra alınan örneklerde gallik asit miktarının anaçlardan yüksek, aşısız ve aşılı kalemden daha düşük olduğu belirlenmiştir. Aşı yapıldıktan 12 ay sonra aşı yerinden alınan örneklerde 8 aya göre az bir artış olduğu kaydedilmiştir. Kara idris anacında en yüksek gallik asit içeriği aşı yerinin üst kısmından 12 ay sonra alınan örneklerde saptanmıştır. Gallik asit miktarı Sarı idris anacında değerlendirilecek olursa aşı yapıldıktan 8 ve 12 ay sonra aşısız anaca göre miktarın arttığı görülmüştür. Hem aşısız anaçta hem de aşılı anaçta 12 ay sonra alınan örneklerde 8 aya göre daha yüksek gallik asit mitarı belirlemiştir. Aşı yapılmadan önce kalemde 12 ay sonra meydana gelen düşüşün tersine aşı yapıldıktan 12 ay sonra, 8. aya göre yükselme kaydedilmiştir. Aşılı kalemdeki gallik asit miktarının aşılı anaçtakine göre oldukça yüksek olduğu, aşı yerinde kalemdekine göre daha az gallik asit bulunurken, anaçtakinden daha fazladır. 63

74 8 Ay 12Ay A AA K AK AY A AA K AK AY A AA K AK AY A AA K AK AY A AA K AK AY A AA K AK AY A AA K AK AY Gallik asit miktarı (mg/g) Kuş kirazı Kara idris Sarı idris MaxMa14 MaxMa60 Gisela5 CAB 6P Anaçlar A aşısız anaç, AA aşılı anaç, K kalem, AK aşılı kalem, AY aşı yeri. Şekil 4.5. Aşı elemanlarının farklı dönemlerdeki gallik asit miktarları (mg/g) 64

75 Aşısız MaxMa 14 anacında gallik asit miktarında 12 ay sonra, dikkate değer bir artış meydana gelirken, aşılı anaçta bu dönemde gallik asit içeriğinin 8. aydan çok az yüksek olduğu belirlenmiştir. Aşısız kalemde 12 ay sonra bir azalma kaydedilirken, 8 aya göre aşı yapıldıktan 12 ay sonra daha fazla gallik asit bulunmuştur. Sarı idris üzerine aşılanmış kalem ile aşısız kalem karşılaştırılacak olursa; aşılama işleminden sonra gallik asit miktarının kalemde arttığı görülmüştür. Aşı yerinde de aşı yapıldıktan 12 ay sonra gallik asit miktarı artmıştır (Şekil 4.5.). Aşısız MaxMa 60 anacında gallik asit miktarı 12 ay sonra 8 aya göre daha yüksektir. Aşı yapıldıktan sonra anacın gallik asit miktarı artmış, bu artış 12 ay sonra az da olsa devam etmiştir Ziraat kaleminde, aşı yapıldıktan 12 ay sonra kalemde 8 aya kıyasla az bir artış kaydedilmiştir. Aşı yapılmadan önce alınan örneklerde 12 ay sonra gallik asit azalmıştır. Aşısız kalemle kıyaslandığında 8. ve 12. aylarda aşılı kalemde yüksek miktarda gallik asit olduğu belirlenmiştir. Gallik asit miktarı aşı yerinde 12 ay sonra azalmıştır. Aşı yapılmadan önce Gisela 5 anacından alınan örneklerde diğer anaçlardan daha yüksek değerde gallik asit olduğu, bu değerin 12 ay sonra az da olsa arttığı kaydedilmiştir. Üzerine 0900 Ziraat aşılanmış Gisela 5 anaçlarında aşısız anaca göre gallik asit miktarında azalma kaydedilmiştir. Diğer anaçlardan farklı olarak aşı yerindeki en düşük gallik asit miktarı bu anaçta tespit edilirken 12 ay sonra aşı yerinde gallik asit miktarı da artış göstermiştir (Şekil 4.5.). CAB 6P anacında aşı yapılmadan önce 8. ay ve 12. ay arasında çok fazla bir değişiklik görülmemiştir. Aşılı anaçta gallik asit artmış ve 12. ayda az bir artış devam etmiştir. Aşılanmamış kalemdeki gallik asit miktarının anaçtan daha fazla olduğu 12 ay sonra ise aşısız kalemdeki miktarın azaldığı belirlenmiştir. Aşı yapıldıktan sonra kalemdeki gallik asit miktarı artmıştır. Kombinasyonun aşı yerinde 8. ayda aşısız anaca yakın değerde gallik asit olduğu, bu değerin 12 ay sonra arttığı belirlenmiştir. Şekil 4.5. den görüldüğü gibi aşısız anaçlar değerlendirildiğinde, gallik asit miktarı en yüksek Gisela 5 anacında, en düşük ise Sarı idris anacında saptanmıştır. Bunun 65

76 dışında, Kuş kirazı ve Kara idris anaçlarında da gallik asit miktarının Gisela 5 anacı başta olmak üzere, CAB 6P, MaxMa 60 ve MaxMa 14 anaçlarından daha düşük olduğu bulunmuştur. Aşılı anaçlardaki gallik asit miktarı karşılaştırıldığında yine en yüksek değerin Gisela 5 anacında, en düşük değerin ise Sarı idris anacında olduğu belirlenmiştir. Denemede aşılı kalemlerde genel daha yüksek gallik asit bulunurken, en yüksek gallik asit miktarı yine 0900 Ziraat/Gisela 5 kombinasyonunun kaleminden elde edilmiştir. Sarı idris üzerine aşılanmış kalemde en düşük gallik asit miktarı bulunmuş, bunu takiben Kara idris ve Sarı idris anaçlarında birbirine yakın ve diğer anaçlardan daha az gallik asit olduğu saptanmıştır. Kombinasyonların aşı yerlerindeki en yüksek gallik asit miktarları Gisela 5 ve CAB 6P anaçlarında bulunmuştur. Gallik asit miktarları aşılı kombinasyonlardaki bölgeler bakımından kıyaslanacak olursa en az aşı yerinin altında, onu takiben aşı yerinde ve en fazla da aşı yerinin üst kısmında belirlenmiştir P-kumarik asit Aşı yapılmadan önce anaçlardan alınan örneklerde p-kumarik asit içeriğinde anaçlara ve dönemlere göre meydana gelen değişim istatistik olarak önemlidir (p<0.01) Ziraat kaleminden aşılanmadan alınan kabuk örneklerinde dönemlerin p-kumarik asit miktarı üzerine etkisi istatistik olarak önemlidir (p<0.01). Denemenin başlangıcında p-kumarik asit miktarı 0.06 mg/g ile 0.23 mg/g arasında değişiklik göstermiştir. 12 ay sonra alınan kabuk örneklerinde p-kumarik miktarı en yüksek olan anaç Sarı idris anacı, en düşük olan anaçlar ise Kuş kirazı ve MaxMa 14 olmuştur Ziraat kaleminin p-kumarik asit miktarı üzerine örnek alma dönemlerinin etkisi istatistik olarak önemli bulunmuştur (p<0.01). Denemenin başlangıcında 1.17 mg/g olan p-kumarik asit miktarı örnek alma dönemleri boyunca yükselmiş ve 12 ay sonra 1.28 mg/g değerine ulaşmıştır (Çizelge 4.13.). 66

77 Çizelge 4.13 Aşısız anaçların p-kumarik asit miktarları (mg/g) Örnek Alma Dönemi Başlangıç 8 ay 12 ay Ortalama Kuş kirazı 0.14 ab x A y 0.09 b A 0.11 bc A 0.11 Kara idris 0.21a A 0.12 ab B 0.07 c B 0.13 Sarı idris 0.23 a A 0.22 a A 0.18 ab A 0.21 MaxMa b B 0.09 b AB 0.13 abca 0.09 MaxMa b B 0.17 ab AB 0.20 a A 0.16 Gisela b AB 0.13 ab A 0.05 c B 0.09 CAB 6P 0.10 b B 0.19 ab A 0.11 bc B 0.13 Ortalama Ziraat 1.17C y 1.23B 1.28A 1.23 x Aynı sütunda farklı küçük harfle gösterilen değerler arasındaki fark istatistik olarak önemlidir (p<0.01). y Aynı satırda farklı büyük harfle gösterilen değerler arasındaki fark istatistik olarak önemlidir (p<0.01). Aşılanmış anaçların p- kumarik asit miktarları üzerine dönemlerin ve anaçların etkisi istatistik olarak önemlidir. (p<0.01). Aşı yapıldıktan 8 ay sonra kombinasyonun alt kısmından alınan örneklerde p-kumarik asit miktarı 0.07 mg/g ile 0.17 mg/g arasında değişiklik göstermiştir. Anaç kısmından 12 ay sonra alınan örneklerde ise Kuş kirazı 0.21 mg/g p-kumarik asit miktarının en yüksek olduğu, Gisela 5 ise 0.02 mg/g ile en düşük p-kumarik asit miktarına sahip olan anaç olmuştur. Örnek alma dönemlerinin anaçların p-kumarik asit miktarına etkisi ise Gisela 5 ve CAB 6P anaçlarında önemli bulunmuştur (Çizelge 4.14.). Çizelge Aşılamadan sonra aşı yerinin altından alınan örneklerin p- kumarik asit miktarları (mg/g) Örnek Alma Dönemi Başlangıç 8 ay 12 ay Ortalama Kuş kirazı 0.14 ab x A y 0.17 a A 0.21 a A 0.18 Kara idris 0.21 a A 0.13 ab A 0.12 bc A 0.16 Sarı idris 0.23 a A 0.17 a A 0.17 ab A 0.19 MaxMa b A 0.11 b A 0.05 cd A 0.07 MaxMa b A 0.07 c A 0.07 cd A 0.09 Gisela b A 0.10 b A 0.02 d B 0.07 CAB 6P 0.10 b A 0.07 c AB 0.05 cd B 0.07 Ortalama x Aynı sütunda farklı küçük harfle gösterilen değerler arasındaki fark istatistik olarak önemlidir (p<0.01). y Aynı satırda farklı büyük harfle gösterilen değerler arasındaki fark istatistik olarak önemlidir (p<0.01). 67

78 Aşı yapıldıktan 8 ve 12 ay sonra aşılı kombinasyonların üst kısmından alınan kabuk örneklerindeki p-kumarik asit değişimi Çizelge 4.15 de sunulmuştur. Aşı sürgününden alınan örneklerde anaç x dönem interaksiyonu istatistik olarak önemli bulunmuştur (p<0.01). 8. ayda p-kumarik asit miktarı en yüksek olan kombinasyon 0900 Ziraat /Gisela 5 kombinasyonudur. Bu dönemde en düşük p-kumarik asit miktarı ise 0900 Ziraat /Kuş kirazı kombinasyonundan elde edilmiştir (0.39 mg/g). Aşı yapıldıktan 12 ay sonra alınan örneklerde p-kumarik asit miktarı bakımından en yüksek ve en düşük değerler, 8. ayda elde edilen değerlerle aynı kombinasyonlardan alınmıştır (Çizelge 4.15.). Kuş kirazı ve Sarı idris anacına aşılı kalemlerde 12 ay sonra p- kumarik asit miktarında meydana gelen azalma, istatistik olarak önemli bulunmuştur (p<0.01). Diğer anaçlarda istatistik olarak önemli olmasa da 12 ay sonra p-kumarik asit miktarında genel bir düşüş kaydedilmiştir. Çizelge Aşılamadan sonra aşı yerinin üstünden alınan örneklerin p- kumarik asit miktarları (mg/g) Örnek alma dönemi 8 ay 12 ay Ortalama 0900 Ziraat /Kuş kirazı 0.39 d x A y 0.26 c B Ziraat /Kara idris 0.46 c A 0.41 c A Ziraat /Sarı idris 0.49 c A 0.33 c B Ziraat /MaxMa b A 0.68 b A Ziraat /MaxMa ab A 0.79 ab A Ziraat /Gisela a A 0.89 a A Ziraat /CAB 6P 0.81 ab A 0.73 ab A 0.77 Ortalama x Aynı sütunda farklı küçük harfle gösterilen değerler arasındaki fark istatistik olarak önemlidir (p<0.01). y Aynı satırda farklı büyük harfle gösterilen değerler arasındaki fark istatistik olarak önemlidir (p<0.01). Aşı yapıldıktan 8 ve 12 ay sonra kombinasyonların aşı yerlerinden alınan örneklerin p-kumarik asit miktarları Çizelge da gösterilmiştir. Aşı yerlerinden alınan örneklerde anaç x zaman interaksiyonu istatistik olarak önemlidir (p<0.01). Aşı yapıldıktan 8 ay sonra aşı yerinde en yüksek p-kumarik asit miktarı 0900 Ziraat /Gisela 5 kombinasyonundan (0.36 mg/g), en düşük p-kumarik asit ise 0900 Ziraat /Kara idris (0.17 mg/g) kombinasyonundan elde edilmiştir. 12 ay sonra alınan kabuk örneklerinde de 8. ayda olduğu gibi en yüksek p-kumarik asit miktarı Gisela 5 anacıyla oluşturulan kombinasyondan, en düşük ise Kara idris anacıyla oluşturulan kombinasyondan elde edilmiştir (Çizelge 4.16.). Sarı idris anacının aşı yerinde p- 68

79 kumarik asit miktarında 12 ay sonra meydana gelen azalma istatistik olarak önemlidir (p<0.01). Çizelge Aşı yerlerinin p-kumarik asit miktarları (mg/g) Örnek alma dönemi 8 ay 12 ay Ortalama 0900 Ziraat /Kuş kirazı 0.28 ab x A y 0.25 ab A Ziraat /Kara idris 0.17 b A 0.13 b A Ziraat /Sarı idris 0.30 ab A 0.22 ab B Ziraat /MaxMa ab A 0.19 ab A Ziraat /MaxMa ab A 0.27 ab A Ziraat /Gisela a A 0.34 a A Ziraat /CAB 6P 0.32 ab A 0.29 ab A 0.30 Ortalama x Aynı sütunda farklı küçük harfle gösterilen değerler arasındaki fark istatistik olarak önemlidir (p<0.01). y Aynı satırda farklı büyük harfle gösterilen değerler arasındaki fark istatistik olarak önemlidir (p<0.01). P-kumarik asit miktarı bakımından anaçlar toplu olarak değerlendirildiklerinde, Kuş kirazında, aşısız anaçta aşı yapıldıktan 12 ay sonra p-kumarik asit miktarının arttığı belirlenmiştir. Üzerine 0900 Ziraat aşılanmış anaçta kumarik asit aşısız anaca göre daha yüksektir. Aşılı anaçta da p-kumarik asit, aşı yapıldıktan 12 ay sonra artış göstermiştir. Aşısız kalemde oldukça yüksek düzeyde bulunan p-kumarik asit miktarında aşı yapıldıktan sonra dikkat çekici bir azalma kaydedilmiştir (Şekil 4.6.). Bu düşüş aşı yapıldıktan 12 ay sonra da devam etmiştir. Aşı yerindeki p-kumarik asit miktarı aşılı kaleme göre daha azdır. Burada da aşı yapıldıktan 12 ay sonra değerin azaldığı görülmektedir. Kara idris anacında aşısız anaçtan alınan örneklerde 12 ay sonra kumarik asit miktarı azalmıştır. Aşılı anaçta çok önemli bir değişiklik olmayıp, aşısız anaca göre az bir artış meydana gelmiştir. Aşısız anaçta olduğu gibi burada da 12 ay sonra p-kumarik asit miktarı azalmıştır (Şekil 4.6.). 69

80 8 Ay 12Ay 1,6 70 P-kumarik asit miktarı (mg/g) 1,2 0,8 0,4 0,0 A AA K AK AY A AA K AK AY A AA K AK AY A AA K AK AY A AA K AK AY A AA K AK AY A AA K AK AY Kuş kirazı Kara idris Sarı idris MaxMa14 MaxMa60 Gisela5 CAB 6P Anaçlar A aşısız anaç, AA aşılı anaç, K kalem, AK aşılı kalem, AY aşı yeri. Şekil 4.6. Aşı elemanlarının farklı dönemlerdeki p-kumarik asit miktarları (mg/g) 70

81 Sarı idris anacında aşı yapıldıktan sonra p-kumarik asit aşısız anaca göre azalmıştır. Aşı yapıldıktan 8 ay sonra kalem kısmında da p-kumarik asit aşısız kaleme göre daha azdır. Aşı yapıldıktan 12 ay sonra kalem kısmında p-kumarik asit miktarındaki düşüş devam etmiştir. Aşı yerinde aşılı kalemden daha az p-kumarik asit bulunmuştur. MaxMa 14 anacında Aşısız anaçla aşılı anaç arasında p-kumarik asit miktarı bakımından çok önemli bir fark görülmezken, aşısız anaçta 12 ay sonra p-kumarik asit artmış, aşılı anaçta ise azalmıştır. MaxMa 60 anacına 0900 Ziraat kalemi aşılandığı zaman anaçtaki p-kumarik asit miktarında önemli bir düşüş kaydedilmiştir. Aynı şekilde aşılı kalemde de p-kumarik asit, aşısız kalemdeki oranına göre azalmıştır. Gisela 5 anacında aşı işlemi ile p-kumarik asit miktarı anaçta yine azalmıştır. Aşı yapıldıktan 12 ay sonra da bu düşüş devam etmiştir. Gisel 5 anacında aşılı kalemde p-kumarik asit miktarının oldukça yüksek olduğu, aşı yapıldıktan 12 ay sonra azaldığı belirlenmiştir. Aşı yerinde aşılı kalemden daha az, aşılı anaçtan daha fazla kumarik asit bulunmaktadır. CAB 6P anacında aşı yapılmadan önce 12 ay sonra p-kumarik asit azalmıştır. Aşı yapıldıktan sonra aşısız anaca göre daha az p-kumarik asit bulunmaktadır. Aşılı anaçta p-kumarik asit miktarı 12 ay sonra azalmıştır. Bu anaç üzerine aşılanmış kalemde de p-kumarik asit yüksek düzeydedir. Aşı yapıldıktan 12 ay sonra kumarik asit miktarında azalma kaydedilmiştir. Aşı yerinde, p-kumarik asit miktarı yine kalemdekinden daha azdır. Şekil 4.6. genel olarak değerlendirilecek olursa; p-kumarik asit, aşısız anaçlarda en fazla Sarı idris anacındadır. Aşılı anaçlarda ise yine en yüksek değerler Sarı idris ve Kuş kirazı anaçlarından elde edilmiştir. Aşılı kombinasyonlarda aşı yerinin alt kısmında en az CAB 6P, en fazla Kuş kirazı anacındadır. Aşı noktasının üst kısmından alınan tüm örneklerde aşısız kaleme göre daha az p-kumarik asit bulunmaktadır. Aşı yerinin üst kısmından alınan örneklerde Gisela 5 ve CAB 6P 71

82 birbirine yakın değerler alarak en yüksek p-kumarik asit miktarına sahip olmuşlardır. Tüm örneklerde aşı yerlerinde kalem kısmından daha az, anaç kısmından daha fazla kumarik asit bulunmuştur Kateşin Aşısız anaçlara ait kateşin içerikleri Çizelge de sunulmuştur. Aşısız anaçlar kateşin miktarı bakımından karşılaştırıldığında anaçların ve dönemin kateşin miktarı üzerine etkisi istatistik olarak önemli bulunmuştur (p<0.01). Denemenin başlangıcında anaçlarda kateşin miktarının 5.12 mg/g (Kuş kirazı) ile 3.50 mg/g (MaxMa 14) arasında değiştiği görülmektedir. Aşısız anaçlardan 8 ay sonra alınan örneklerde en yüksek kateşin miktarı Kuş kirazı anacında (6.21 mg/g), en düşük ise başlangıçta olduğu gibi MaxMa 14 anacında (3.80 mg/g) saptanmıştır. 12 ay sonra Kuş kirazı yine en yüksek kateşin içeriğine sahipken, bunu izleyen anaçlar Gisela 5, Sarı idris, CAB 6P ve Kara idris anaçları olmuştur (Çizelge 4.17.). Alınan tüm örneklerde 12 ay sonra kateşin miktarı artmıştır. Dönemlere bağlı olarak kateşin miktarında meydana gelen bu artış, istatistik olarak önemlidir (p<0.01). 12 ay sonra alınan örneklerde de en yüksek kateşin miktarına 8.15 mg/g ile Kuş kirazı anacı sahip olmuştur. Çizelge Aşısız anaçların ve kalemin kateşin miktarları (mg/g) Örnek Alma Dönemi Başlangıç 8 ay 12 ay Ortalama Kuş kirazı 5.12 a x C y 6.21 a B 8.15 a A 6.49 Kara idris 4.21 d C 4.59 d B 5.16 cd A 4.65 Sarı idris 4.88 bc C 4.96 c B 5.21 c A 5.02 MaxMa e C 3.80 e B 4.20 e A 3.83 MaxMa d C 4.96 c B 5.10 d A 4.76 Gisela b C 5.21 b B 5.33 b A 5.17 CAB 6P 4.82 c C 4.99 c B 5.16 cd A 4.99 Ortalama Ziraat 4.20C 4.86B 5.12A 4.73 x Aynı sütunda farklı küçük harfle gösterilen değerler arasındaki fark istatistik olarak önemlidir (p<0.01). y Aynı satırda farklı büyük harfle gösterilen değerler arasındaki fark istatistik olarak önemlidir (p<0.01). 72

83 Aşılı anaçların kateşin içerikleri karşılaştırıldığında anaç x dönem interaksiyonu istatistik olarak önemli bulunmuştur (p<0.01). 8. ayda anaçların kateşin içeriği mg/g (Kuş kirazı) ile 5.10 mg/g (CAB 6P) arasında değişmektedir. 8. ayda Kuş kirazı anacını Sarı idris ve Kara idris anaçları izlemiştir (Çizelge 4.18.). Aşı yapıldıktan 12 ay sonra aşı yerinin alt kısmından alınan örneklerde en yüksek kateşin miktarı yine Kuş kirazı anacından elde edilirken, kateşin miktarının en düşük olduğu anaç CAB 6P anacı olmuştur. Kateşin miktarı aşı yapıldıktan 8 ay sonra tüm anaçlarda önemli bir artış göstermiştir. Bu artış 12. ayda da devam etmiştir. Çizelge Aşılamadan sonra aşı yerinin altından alınan örneklerin kateşin miktarları (mg/g) Örnek Alma Dönemi Başlangıç 8 ay 12 ay Ortalama Kuş kirazı 5.12 a x C y a B a A Kara idris 4.21 e B 7.02 c A 7.13 c A 6.12 Sarı idris 4.88 c C 7.89 b B 8.21 b A 6.99 MaxMa f C 5.50 e B 5.96 e A 4.99 MaxMa e C 5.94 d B 6.46 d A 5.54 Gisela b C 5.98 d B 6.30 d A 5.75 CAB 6P 4.82 d C 5.10 f B 5.50 f A 5.14 Ortalama x Aynı sütunda farklı küçük harfle gösterilen değerler arasındaki fark istatistik olarak önemlidir (p<0.01). y Aynı satırda farklı büyük harfle gösterilen değerler arasındaki fark istatistik olarak önemlidir (p<0.01). Aşı sürgünlerinin kateşin miktarları üzerine dönemlerin ve anaçların etkisi istatistik olarak önemli bulunmuştur (p<0.01). Farklı anaçlar üzerine aşılanmış 0900 Ziraat kaleminde aşı yapıldıktan 8 ay sonra en yüksek kateşin içeriği Kuş kirazı anacında (12.98 mg/g), en düşük kateşin içeriği ise CAB 6P anacında (6.88 mg/g) saptanmıştır. Aşı yapıldıktan 12 ay sonra değerler mg/g ile 6.93 mg/g arasında değişiklik göstermiştir (Çizelge 4.19.). Aşılı kombinasyonların kalem kısmında kateşin miktarındaki artış, 0900 Ziraat /CAB 6P kombinasyonu dışında istatistik olarak önemli bulunmuştur (p<0.01). 73

84 Çizelge Aşılamadan sonra aşı yerinin üstünden alınan örneklerin kateşin miktarları (mg/g) Örnek alma dönemi 8 ay 12 ay Ortalama 0900 Ziraat /Kuş kirazı a x B y a A Ziraat /Kara idris b B b A Ziraat /Sarı idris 8.94 c B 9.21 c A Ziraat /MaxMa d A 8.98 c B Ziraat /MaxMa d A 8.36 d B Ziraat /Gisela e A 8.21 d B Ziraat /CAB 6P 6.88 f A 6.93 f A 6.91 Ortalama x Aynı sütunda farklı küçük harfle gösterilen değerler arasındaki fark istatistik olarak önemlidir (p<0.01). y Aynı satırda farklı büyük harfle gösterilen değerler arasındaki fark istatistik olarak önemlidir (p<0.01). Kombinasyonların aşı yerlerinden alınan örneklerinde anaç x dönem interaksiyonu istatistik olarak önemlidir (p<0.01). Aşı yerinde kateşin miktarının en yüksek olduğu kombinasyon 0900 Ziraat /Kuş kirazı iken, en düşük kateşin miktarı 0900 Ziraat / CAB 6P kombinasyonunun aşı yerinde saptanmıştır. Aşı yapıldıktan 12 ay sonra tüm kombinasyonların aşı yerindeki kateşin miktarı azalmıştır (Çizelge 4.20.). Çizelge Aşı yerlerinin kateşin miktarları (mg/g) Örnek alma dönemi 8 ay 12 ay Ortalama 0900 Ziraat /Kuş kirazı a x A y a B Ziraat /Kara idris b A b B Ziraat /Sarı idris c A c B Ziraat /MaxMa c A c B Ziraat /MaxMa d A d B Ziraat /Gisela e A e B Ziraat /CAB 6P f A f B Ortalama x Aynı sütunda farklı küçük harfle gösterilen değerler arasındaki fark istatistik olarak önemlidir (p<0.01). y Aynı satırda farklı büyük harfle gösterilen değerler arasındaki fark istatistik olarak önemlidir (p<0.01). 74

85 Şekil 4.7. de kombinasyonların kateşin içeriklerinin dönemsel değişimi sunulmuştur. Kuş kirazı anacı aşı yapılmadan önce daha düşük kateşin miktarına sahipken, aşı yapıldıktan 8 ay sonra kateşin miktarı yükselmiş ve bu artış 12. ayda da devam etmiştir. Aynı artış 0900 Ziraat çeşidi Kuş kirazı üzerine aşılandığında da aşı sürgününde gerçekleşmiştir. Kombinasyonun aşı yerinde de oldukça yüksek miktarda kateşin saptanmıştır. Aşı yerinde biriken kateşinin 12. ayda alınan örneklerde azaldığı görülmektedir. Aşısız Kara idris anacından alınan örneklerde 12 ay sonra kateşin miktarı artmıştır. Aşı yapıldıktan sonra da kateşin miktarında artış gözlenmiştir. Aşısız anaçla aşısız kalem karşılaştırıldığında kateşin miktarı kalemde çok az bir farkla daha yüksektir. Aşı yapıldıktan sonra kalemdeki kateşin miktarı artmıştır. Bu kombinasyonda kateşinin en fazla olduğu bölge yine aşı yeridir. Sarı idris anacında kateşinin değişimi incelendiğinde aşılı anaçta kateşin miktarının arttığı, 12 ay sonra da bu artış çok az miktarda devam ettiği görülmektedir. Aşı yapıldıktan sonra aşı sürgününden alınan örneklerde kateşin miktarı aşısız kaleme göre daha yüksektir. Aşı yerinde kateşin birikiminin diğer bölgelere göre daha fazla olduğu bulunmuştur(şekil 4.7). Aşı yapılmadan önce MaxMa 14 anacından 12 ay sonra alınan örneklerde 8 ay sonra alınan örneklere göre kateşin miktarında az bir artış görülmüştür. Aşı sürgününde de aşısız kaleme göre kateşin miktarı artmıştır Ziraat /MaxMa 14 kombinasyonunda kateşin miktarının en fazla olduğu bölge aşı yeridir. Aşı yapıldıktan 12 ay sonra aşı yerinde çok önemli olamamakla birlikte azalma meydana gelmiştir. MaxMa 60 anacında aşı yapıldıktan sonra kateşin miktarı artmıştır. Aşı yapıldıktan 12 ay sonra anaçtaki kateşin miktarı artışı devam etmiştir. Aşısız kalemle karşılaştırıldığında aşı sürgününde de artış görülmüştür. Aşı yerinde 8 ay sonra belirlenen kateşin miktarı bu kombinasyonda da yüksektir. Aşı yapıldıktan 12 ay sonra aşı yerindeki kateşin miktarı düşmüştür. 75

86 8 Ay 12Ay A AA K AK AY A AA K AK AY A AA K AK AY A AA K AK AY A AA K AK AY A AA K AK AY A AA K AK AY Kateşin miktarı (mg/g) Kuş kirazı Kara idris Sarı idris MaxMa14 MaxMa60 Gisela5 CAB 6P Anaçlar A aşısız anaç, AA aşılı anaç, K kalem, AK aşılı kalem, AY aşı yeri. Şekil 4.7. Aşı elemanlarının farklı dönemlerdeki kateşin miktarları (mg/g) 76

87 Aşılı Gisela 5 anacında, kateşin değerinde aşısız anaca göre az bir artış gözlenmiştir. Aşı sürgünündeki kateşin miktarı bu kombinasyonda da aşısız kaleme göre daha yüksektir. Aşı yerinde yine yüksek miktarda kateşin bulunmuş, bu değer aşı yapıldıktan 12 ay sonra azalmıştır. CAB 6P anacında aşısız anaçla aşılı anaç arasında çok önemli bir fark yoktur. Aşı sürgününde aşısız kaleme göre daha fazla kateşin saptanmıştır. Kateşin miktarı aşı yerinde yüksek düzeydedir. Genel olarak değerlendirildiğinde, hem 8. ayda hem de 12. ayda Kuş kirazı anacı aşısız ve aşılı haldeyken en yüksek kateşin içeriğine sahip olan anaç olmuştur. Aynı zamanda 0900 Ziraat /Kuş kirazı aşı sürgünündeki kateşin miktarı diğer kombinasyonlardan daha yüksektir. Kateşin içeriği bakımından en düşük değerler 0900 Ziraat çeşidinin CAB 6P ile oluşturduğu kombinasyondan elde edilmiştir. Aşı yerlerindeki kateşin miktarı bütün kombinasyonlarda yüksek düzeydedir Kuarsetin Çizelge de aşısız anaçlardan alınan kabuk örneklerinin kuarsetin içerikleri bakımından dönemler ve anaçlar arasındaki fark istatistik olarak önemli değildir. Kuarsetin içeriği bakımından kalem ve anaçlar birbirine çok yakın değerler bulunmuştur. Başlangıçta anaçların kuarsetin içerikleri 0.70 mg/g ile 0.82 mg/g arasında değişmiştir. Genelde dönemlere bağlı olarak anaçlarda kuarsetin içeriklerinde artış meydana gelmiştir. Kuarsetin içeriği bakımından anaçlar değerlendirildiğinde ise en yüksek kuarsetin içeriği Kuş kirazı anacında saptanmıştır. 77

88 Çizelge Aşısız anaçların ve kalemin kuarsetin miktarları (mg/g) Örnek Alma Dönemi Başlangıç 8 ay 12 ay Ortalama Kuş kirazı 0.82öd* Kara idris Sarı idris MaxMa MaxMa Gisela CAB 6P Ortalama Ziraat *Değerler arasındaki fark istatistik olarak önemli değildir. Anaçlara aşı yapıldıktan sonra anaçlardan alınan örneklerde anaçların ve dönemlerin ortalamaları arasındaki fark, istatistik olarak önemli bulunmuştur (p<0.05). Kuarsetin miktarı en yüksek olan anaçlar CAB 6P (1.11 mg/g) ve Gisela 5 (1.05 mg/g) olarak belirlenmiştir. MaxMa 14 ve MaxMa 60, Kuş kirazı, Kara idris anaçları birbirine yakın değerler alarak bu anaçları izlemişlerdir (Çizelge 4.22.). Aşı yerinin alt kısmından alınan örneklerde kuarsetin miktarının en az olduğu anaç Sarı idris anacıdır (0.78 mg/g). Çizelge Aşılamadan sonra aşı yerinin altından alınan örneklerin kuarsetin miktarları (mg/g) Örnek Alma Dönemi Başlangıç 8 ay 12 ay Ortalama Kuş kirazı ab x Kara idris ab Sarı idris b MaxMa ab MaxMa ab Gisela a CAB 6P a Ortalama 0.77 B y 0.99 A 1.08 A x Aynı sütunda farklı küçük harfle gösterilen değerler arasındaki fark istatistik olarak önemlidir (p<0.01). y Aynı satırda farklı büyük harfle gösterilen değerler arasındaki fark istatistik olarak önemlidir (p<0.01). Aşı yapıldıktan sonra aşı yerinin üst kısmından 8 ve 12 ay sonra alınan örneklerde anaçların ve dönemlerin kuarsetin miktarı üzerine etkisi istatistik olarak önemli bulunmuştur (p<0.05). Aşı yapıldıktan 8 ay sonra alınan örneklerde Gisela 5, CAB 78

89 6P ve MaxMa 60 anaçlarının kullanıldığı kombinasyonlardan alınan aşı sürgünlerinde en yüksek kuarsetin miktarları saptanırken, bu anaçları MaxMa 14 ve Kuş kirazı anaçları izlemiştir. Bu dönemde kuarsetin içeriği en az olan anaçlar Kara idris ve Sarı idris anaçları olmuşlardır. Aşı yerlerinin üst kısmından 12 ay sonra alınan örneklerde kuarsetin miktarı en fazla CAB 6P anacında (1.33 mg/g) belirlenmiştir. Bu anacı Gisela 5 ve MaxMa 60 anaçları takip etmişlerdir. Aşılı kalemden 12 ay sonra alınan örneklerde, tüm kombinasyonlarda 8. aya göre kuarsetin miktarının düştüğü kaydedilmiştir (Çizelge 4.23.). Çizelge Aşılamadan sonra aşı yerinin üstünden alınan örneklerin kuarsetin miktarları (mg/g) Örnek alma dönemi 8 ay 12 ay Ortalama 0900 Ziraat /Kuş kirazı 0.97 ab x A y 0.86 b A Ziraat /Kara idris 0.92 b A 0.83 bb Ziraat /Sarı idris 0.87 b A 0.79 ba Ziraat /MaxMa ab A 0.88 bb Ziraat /MaxMa a A 0.94 ab B Ziraat /Gisela a A 1.02 ab B Ziraat /CAB 6P 1.49 a A 1.33 a A 1.41 Ortalama x Aynı sütunda farklı küçük harfle gösterilen değerler arasındaki fark istatistik olarak önemlidir (p<0.01). y Aynı satırda farklı büyük harfle gösterilen değerler arasındaki fark istatistik olarak önemlidir (p<0.01). Çizelge de aşı yerlerinin kuarsetin içerikleri gösterilmiştir. Anaçların ortalama kuarsetin miktarları arasındaki fark, istatistik olarak önemli iken, dönemler arasındaki fark istatistik olarak önemli değildir (p<0.01). Kuarsetin miktarı en yüksek olan aşı yeri, 0900 Ziraat /CAB 6P kombinasyonun aşı yeridir (1.32 mg/g). Aşı yerinde, kuarsetin miktarının en düşük olduğu aşı yeri ise 0900 Ziraat /Kara idris kombinasyonudur. 79

90 Çizelge Aşı yerlerinin kuarsetin miktarları (mg/g) Örnek alma dönemi 8 ay 12 ay Ortalama 0900 Ziraat /Kuş kirazı ab x 0900 Ziraat /Kara idris b 0900 Ziraat /Sarı idris ab 0900 Ziraat /MaxMa ab 0900 Ziraat /MaxMa ab 0900 Ziraat /Gisela ab 0900 Ziraat /CAB 6P a Ortalama 1.24* 1.21 x Aynı sütunda farklı küçük harfle gösterilen değerler arasındaki fark istatistik olarak önemlidir (p<0.01). *Değerler arasındaki fark istatistik olarak önemli değildir. Şekil 4.8. de kuarsetin miktarının anaçlara ve dönemlere göre değişimi gösterilmiştir. Kuş kirazı anacında aşı yapıldıktan sonra aynı dönemde aşısız anaçtan alınan örneğe göre kuarsetin miktarı artış göstermiştir. 12. ayda alınan örneklerde ise aşılı anaçta kuarsetin miktarı azalmıştır. Aşı yapılmadan önce aşısız kalemin kuarsetin miktarı aşısız anaçtan daha düşüktür. Aşı yapıldıktan sonra kalemdeki kuarsetin miktarı artmıştır. 12 ay sonra alınan örneklerde ise kuarsetinin kalem kısmında azaldığı görülmüştür. Aşı yapıldıktan 8 ay sonra aşı yerinden alınan örneklerde kombinasyondaki aşı yerinin kuarsetin miktarının diğer bölgelerden daha fazla olduğu, 12 ay sonra alınan örneklerde de azaldığı görülmüştür. Aşısız Kara idris ve 0900 Ziraat ile bunların kombinasyonları kuarsetin miktarı bakımından karşılaştırılacak olursa aşısız anaçta 12 ay sonra alınan örneklerde miktarın arttığı Şekil 4.8. den görülmektedir. Üzerine 0900 Ziraat aşılanan kalemde, kuarsetin miktarı aşısız kaleme göre artış göstermiştir. Bu artış 12. ayda da devam etmiştir. Aşı yapılmadan önce kalemden alınan örneklerle Kara idris üzerine aşılanmış kalemden alınan örnek karşılaştırıldığında, aşılı kalemde daha yüksek miktarda kuarsetin saptanmıştır. Aşılı kalemdeki kuarsetin miktarı aşı yapıldıktan 12 ay sonra azalmıştır. 80

91 1,8 1,6 8 Ay 12Ay 81 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 A AA K AK AY A AA K AK AY A AA K AK AY A AA K AK AY A AA K AK AY A AA K AK AY A AA K AK AY Kuarsetin miktarı (mg/g) Kuş kirazı Kara idris Sarı idris MaxMa14 MaxMa60 Gisela5 CAB 6P Anaçlar A aşısız anaç, AA aşılı anaç, K kalem, AK aşılı kalem, AY aşı yeri. Şekil 4.8. Aşı elemanlarının farklı dönemlerdeki kuarsetin miktarları (mg/g) 81

92 Sarı idris anacında aşılı anaçta aşısız anaca göre daha yüksek kuarsetin miktarı belirlenmiştir. Hem aşısız hem de aşılı anaçta 12 ay sonra alınan örneklerde 8 ay sonra alınan örneklere göre, kuarsetin miktarı daha yüksektir Ziraat /Sarı idris kombinasyonun kalem kısmından alınan örnekte aşısız kaleme göre ve kombinasyonun alt kısmından alınan örneğe göre daha yüksek miktarda kuarsetin belirlenmiştir. Kombinasyonun kalem kısmında 12 ay sonra kuarsetin miktarı azalmıştır. Kuarsetin en yüksek değerine bu kombinasyonda da aşı yerinde ulaşmıştır. Aşı yerindeki kuarsetin miktarının da 12 ay sonra azaldığı kaydedilmiştir. MaxMa 14 anacında aşı yapıldıktan sonra anaçtaki kuarsetin miktarı artmıştır. Şekil 4.8. den de görüldüğü gibi bu anaçta aşı yapıldıktan 12 ay sonra alınan örneklerdeki kuarsetin artışı belirgindir. Aynı zamanda bu anaç üzerine aşılanan 0900 Ziraat kaleminden alınan örneklerde de aşısız kaleme göre belirgin bir artış, 12 ay sonra da yine belirgin bir düşüş kaydedilmiştir. Bu kombinasyonda aşı yerindeki kuarsetin miktarı kalem kısmındaki kuarsetinden daha azdır. Aşı yerindeki kuarsetin miktarı 12 ay sonra azalma göstermiştir. Aşısız MaxMa 60 anacındaki kuarsetin miktarı üzerine 0900 Ziraat aşılanınca artış göstermiştir. Aşısız anaçta da aşılı anaçta da 12 ay sonra alınan örneklerde kuarsetin miktarı artmıştır. Kombinasyonun üst kısmından alınan kalem örneğinde aşısız kaleme göre oldukça yüksek miktarda kuarsetin saptanmıştır. 12 ay sonra alınan örneklerde ise kalem kısmında kuarsetin miktarının azaldığı görülmüştür. Aşı yerinde kalem kısmından daha az kuarsetin belirlenmiş, 12 ay sonra bu miktar daha da azalmıştır. Gisela 5 anacından aşılanmadan önce alınan örneklerde 12 ay sonra kuarsetin miktarı artmıştır. Üzerine 0900 Ziraat aşılandıktan sonra anaç kısmından alınan örneklerde aşısız anaca göre artış kaydedilmiştir. Kombinasyonların kalem kısmındaki kuaersetin miktarı bakımından kalem kısmındaki en belirgin artış 0900 Ziraat / Gisela 5 kombinasyonunda gerçekleşmiştir. Buradaki artış aşı yapıldıktan 12 ay sonra düşüşe geçmiştir. Aşı yerinde kalem kısmından daha az kuarsetin olduğu görülmüştür. 82

93 CAB 6P anacında da aşısız örneğe göre aşılanmış kabuktan alınan örnekte kuarsetin miktarında yükselme meydana gelmiştir. Hem aşısız hem de aşılı anaçta 12 ay sonra kuarsetin miktarı artmıştır. CAB 6P üzerine aşılanan 0900 Ziraat kaleminde de aşısız kaleme göre artış gözlenmiştir. 12 sonra kalemdeki kuarsetin miktarı düşmüştür. Aşı yerinin kuarsetin miktarı aşı yerinin anaç kısmından daha yüksek, kalem kısmından daha düşük bulunmuştur. Aşısız anaçlarda kuarsetin miktarı en yüksek Kuş kirazında tespit edilirken, aşı yapılmadan önce alınan örneklerin tümünde 12 ay sonra kuarsetin miktarında artış meydana gelmiştir. Aşı yapıldıktan sonra kuarsetin değeri tüm anaçlarda yükselmiştir. Aşılı anaçlarda da 12 ay sonra bu artış devam etmiştir. Aşı yapıldıktan sonra tüm kombinasyonların kalemlerinden alınan örneklerde aşısız kaleme göre kuarsetin miktarında artış meydana gelmiş, bu yükselmenin en fazla Gisela 5, CAB 6P, MAxMa 60 ve MaxMa 14 anaçlarında olduğu belirlenmiştir. Yine tüm kombinasyonlarda Gisela 5 ve MaxMa 60 anaçlarında daha belirgin olmak üzere kuarsetin miktarında 12 ay sonra azalma meydan gelmiştir 0900 Ziraat çeşidinin tüm anaçlarla oluşturduğu kombinasyonlarda aşı yerindeki kuarsetin miktarı kalemden daha düşük, anaçtan daha yüksektir (Şekil 4.8.). 83

94 5. TARTIŞMA ve SONUÇ Bu çalışmada 0900 Ziraat kiraz çeşidinin Kuş kirazı, Kara idris, Sarı idris, MaxMa 14, MaxMa 60, Gisela 5 ve CAB 6P anaçlarıyla oluşturduğu kombinasyonlar aşı uyuşması bakımından incelenmiştir. Çalışmada, aşı kaynaşmasında rol oynadıkları düşünülen peroksidaz izoenzimi ve bazı fenolik bileşikler (gallik asit, p-kumarik asit, kateşin ve kuarsetin) üzerinde durulmuştur. Peroksidazların çoklu formları (EC ) bütün yüksek bitkilerde bulunmaktadırlar. Peroksidazlar, fenolik bileşik oksidasyonu, IAA oksidasyonu, ligninleşme ve polisakkaritlerin parçalanması gibi çok önemli hücresel reaksiyonlarda rol oynamaktadırlar (Clemente, 1998; Hiraga et al., 2001). Bununla birlikte patojenlere karşı savunma mekanizmasında ve tuz, hava kirliliği gibi bitki için stres oluşturacak koşullarda da görev almaktadırlar (Lee et al., 2001). Peroksidazlar, ligninleşmede de dolaylı olarak rol oynayarak aşı uyuşmazlığı kapsamında incelenen enzimler haline gelmişleridir. Çalışmamızın ilk bölümünü oluşturan peroksidaz izoenzimi analizlerinde farklı dönemlerde alınan örneklerin peroksidaz aktiviteleri ve peroksidaz profilleri karşılaştırılmıştır. Aşı yapılmadan önce anaçların ve 0900 Ziraat kaleminin peroksidaz aktiviteleri karşılaştırıldığında, Kuş kirazının en yüksek peroksidaz aktivitesine sahip olarak, 0900 Ziraat kalemine en yakın değeri aldığı görülmüştür Ziraat ile aşı uyuşmasının sorunlu olduğu bilinen Kara idris anacı ise anaçlar içerisinde peroksidaz aktivitesi en düşük anaç olmuş, 0900 Ziraat ile aralarında çok fark olduğu görülmüştür. Yüksek peroksidaz aktivitesinin ligninleşmeyi olumlu yönde etkilediği bir çok araştırmacı tarafından rapor edilmiştir ( Feucht et al., 1983; Donaldson, 2001; Fernandez-Garcia, 2004; Has- Schön, 2005). Bizim çalışmamızda da en yüksek peroksidaz aktivitesinin 0900 Ziraat çeşidiyle en iyi uyuşur anaçta görülmesi ve en düşük peroksidaz aktivitesinin de 0900 Ziraat çeşidiyle uyuşma problemi olan Kara idris anacında saptanması, çalışmamızı bu görüşle desteklemektedir. 84

95 Aşı yapıldıktan 8 ay sonra tüm anaçlarda peroksidaz aktivitesinde artış meydana gelmiştir. Ayrıca aşı yapıldıktan sonra kalem kısmından alınan örneklerde de aşısız kalemlere göre daha yüksek peroksidaz aktivitesi olduğu görülmüştür. Peroksidaz enziminin aktivitesinin açıklanmasında çok çeşitli hipotezler mevcuttur. Bunlardan bir tanesi de daha önce belirtildiği gibi peroksidaz enziminin stres koşullarında daha aktif hale gelen bir enzim olmasıdır (Lee et at., 2001; Rajeswari and Paliwal, 2008; Has- Schön et al., 2005). Aşı da bitkiler için bir stres faktörü olarak düşünülürse, aşı yapıldıktan sonra hem anaç kısmında, hem de kalem kısmında peroksidaz aktivitesindeki artış bu görüşle desteklenmektedir. Çalışmamızda, aşı yapıldıktan sonra aşı yerinin alt kısmında, aşı yerinin üst kısmına ve aşı yerine göre daha düşük peroksidaz aktivitesinin olması, anacın bu stres faktörüne daha erken adapte olduğunu, kalem ile aşı yerinin yaralama işlemine gösterdikleri tepkinin daha yüksek olduğunu düşündürmektedir. Fernandez-Garcia vd. (2004), domateste aşı uyuşmasıyla ilgili yaptıkları çalışmada, 4, 8 ve 15 gün sonra peroksidaz aktivitesini belirlemişlerdir. Hem anaç hem de kalem kısmında, aşı yapıldıktan 8 gün sonra arttığını, 15 gün sonra bu aktivitenin daha da artarak en yüksek değere ulaştığını bildirmişlerdir. Benzer şekilde kavunda yapılan bir çalışmada da aşı yapıldıktan 14 ve 24 gün sonra aşısız anaçlar ve aşılı anaçlar karşılaştırıldığında, üzerine aşı yapılmış anaçlarda aşısız anaçlara göre daha yüksek peroksidaz aktivitesi saptanmış ve bu aktivite aşı yapıldıktan 24 gün sonra daha da yükselmiştir (Aloni et al., 2008). Bu çalışmalara paralel şekilde bizim çalışmamızda da aşı yapıldıktan 12 ay sonra kombinasyonların kalem kısmında peroksidaz aktivitesinde artış gözlenmiştir. Aynı genetik orijinden gelen anaç ve kalemin aşılanması sonucunda oluşan aşı kombinasyonu homogenetik aşı, farklı orijinden gelen anaç ve kalemin aşılanmasıyla oluşan kombinasyonları da heterogenetik aşı olarak tanımlanmıştır. Meyve ağaçlarında aşı uyuşmazlığının araştırılmasında uyuşmazlığa bu yönde yaklaşımlar önem kazanmıştır. Homogenetik ve heterogenetik kombinasyonların peroksidaz aktiviteleri ve fenolik bileşik içeriklerinin farklı olabileceği, her kombinasyonun aşı olayına verdiği tepkinin de farklı olabileceği bildirilmiştir (Feucht, 1983; Olmstead, 2004). Kombinasyonların peroksidaz aktivitesindeki farklılıkların bu genetik sistemle alakalı olabileceği düşünülmektedir. Homogenetik aşılarda peroksidaz 85

96 aktivitesinin heterogenetik aşılara göre daha düşük olduğu, heterogenetik aşılarda, aşı yerinin üstünde ve altında peroksidaz aktivitesinin daha fazla olduğu bildirilmiştir (Schmidt and Feucht, 1981; Feucht et al., 1983). Araştırıcılar bu olayı da farklı genetik orijine sahip iki bitkinin birbirlerine aşılanması sırasında, iki farklı hücrenin birbiriyle ilişkiye geçebilmesi aşamasında aynı genetik orijinden gelen bitkilerin aşılanmasına göre daha yüksek peroksidaz aktivitesine sahip olabileceklerini bildirmişleridir. Burada peroksidaz aktivitesinin yüksek olmasının nedeni, aşı uyuşmazlığı veya virüs hassasiyetinden daha çok aşı bileşenlerinin dokuları arasındaki farklı genetik yapıdır. Bizim çalışmamızda da aşı yapıldıktan 8 ay sonra aşı yerindeki en yüksek peroksidaz aktivitesi heterogenik bir kombinasyon olan 0900 Ziraat /Gisela 5 kombinasyonunda saptanmıştır. Bunun yanında homogenetik ve 0900 Ziraat ile uyuşma problemi olan Kara idris anacının da aşı yerinde yüksek aktivitiye sahip olması dikkat çekicidir. Kirazla en iyi uyuşan anaç olarak bildiğimiz ve kuvvetli ağaçlar meydana getiren homogenetik Kuş kirazı ile oluşturulan kombinasyonda aşı yerindeki en düşük peroksidaz aktivitesi saptanmıştır. Desteklenen homogenetik aşı tepkisinin yanında, 0900 Ziraat/Kuş kirazı kombinasyonun aşı yerinde peroksidaz aktivitesinin daha az olması bu bölgede ligninleşmenin daha çabuk bittiğini düşündürmektedir. Elde ettiğimiz bu bulgu Schmidt ve Feucht un peroksidaz aktivitesindeki azalmanın gelişimin tamamlanması ve yön değiştirmesiyle ilgili olabileceği görüşüyle paralellik göstermektedir. Aşı yapılmadan önce anaçlardan, 0900 Ziraat çeşidinden aşı yapıldıktan sonra aşı yerinin altından, üstünden ve aşı yerinden 12 ay sonra alınan örneklerin peroksidaz profilleri Poliakrilamid Jel elektroforez (PAGE) tekniği kullanılarak çıkartılmıştır. Kombinasyonların farklı yerlerinden, farklı zamanlarda alınan kabuk örnekleri karşılaştırıldığında, hepsinde Rf değeri 0.39 olan bir A bandı ve Rf değeri 0.42 olan B bandının bulunduğu görülmüştür. Dolayısıyla aşı uyuşmasıyla ilgili olabilecek farklı bir banda rastlanmamıştır. Ancak bileşenlerin peroksidaz profilleri spektrofotometre ile kantitatif olarak belirlenen enzim aktiviteleriyle paralellik göstermektedir. Daha yüksek peroksidaz aktivitesine sahip olan örneklerde daha koyu bantlar görülmüştür. Bununla birlikte peroksidaz profillerinde aşı yapıldıktan 86

97 12 ay sonra, aşı yapılmadan önce anaçlardan alınan örneklere göre daha koyu bantların olduğu görülmektedir. Bu konuda yapılan ilk çalışmalardan birinde, Santamour vd. (1983), meşe ve kestanede izoenzim bantlarının profillerine bakılarak aşı uyuşmazlığının önceden tahmin edilebileceğini bildirmişlerdir. Ayvalarda yapılan bir çalışmada uyuşur kombinasyonlarda hem A peroksidaz bandının (Rf=0.86) hem de B izoenzim bandının (Rf=0.68) bulunduğu, uyuşmazda ise sadece B izoenzim bandının bulunduğu, A izoenzim bandının bulunmadığı saptanmıştır (Gülen, 2002). Yine armutlarda Tsakoniki, Abbe Fetel ve Williams armut çeşitlerinin kalem olarak, EM A anacının da anaç olarak kullanıldığı bir çalışmada uyuşur Tsanokini /EM A kombinasyonunun enzim profilinde, uyuşmaz Williams /EM A kombinasyonunda olmayan bir bant olduğu saptanmıştır (Petkou, 2004). Çalışmamızda kullanılan kombinasyonlarda bantların yoğunluklarında farklılık görülmekle birlikte literatürlerde bildirilen bant farklılıklarına rastlanmamıştır. Araştırma kombinasyonlarımızın izoenzim bantları peroksidaz aktivitesi bulgularına paralel olarak yoğunlukları bakımından farklılık göstermiştir. Heterogenik aşılarda hem peroksidaz aktivitesi hem de izoenzim bant yoğunlukları bakımından homogenetik olan 0900 Ziraat / Kuş kirazı kombinasyonuna göre daha yüksek değer ve yoğunluk belirlenmiştir. İzoperoksidaz bantlarında net bir farklılık görülememesi sadece peroksidaz profillerine bakılarak kirazlarda uyuşmazlığın erken tespiti için yeterli olmayacağını düşündürmektedir. Nitekim Gökbayrak vd. (2007), asmalarda aşı uyuşmazlığının önceden tahmin edilmesinde peroksidaz ve esteraz enzimlerinin yanıltıcı olabileceğini bildirmişlerdir. Araştırıcılar, bu enzim sonuçlarının virüsten veya Agrobacterium vitis infektesinden kaynaklanabileceğini rapor etmişlerdir. Bizim çalışmamızda ortaya çıkan sonuçlardan birisi de 0900 Ziraat /Gisela 5 kombinasyonun aşı yerinde meydana gelen yüksek peroksidaz aktivitesidir. Bu durumun heterogenik aşı olmasından kaynaklanabildiği gibi Gisela serilerinin virüse hassasiyetinden de oluşabileceğini düşünmekteyiz. Çalışmamızda, aşı yapıldıktan sonra anaçlarda toplam fenolik madde içeriğinde aşısız anaçlara göre çok fark görülmemiştir. Aşısız kalemle aşılı kalem 87

98 karşılaştırıldığında ise aşılı kalemde toplam fenolik madde miktarında belirgin bir artış olmuştur. Kalem kısmındaki bu artış 12 ay sonra az da olsa azalmaya dönmüştür. Toplam fenolik maddenin en yoğun olduğu yer aşı yeri olarak saptanmıştır. Aşı yerinde en fazla toplam fenolik madde birikimi 0900 Ziraat /Gisela 5 kombinasyonunda meydana gelmiştir. Bu kombinasyonu 0900 Ziraat çeşidinin CAB 6P ve MaxMa 60 ile oluşturduğu kombinasyonlar izlemektedir. Aşı yerinde toplam fenolik madde miktarı en düşük olan kombinasyon ise homogenetik 0900 Ziraat /Kuş kirazı olmuştur. Feucht ve Treutter (1991), bodur anaçlarla oluşturulan kombinasyonlarda aşı yerinde daha fazla fenolik asit birikimi olduğunu bildirmişlerdir. Toplam fenolik bileşiklerin aşı uyumasındaki rolleriyle ilgili çok sınırlı çalışma olup, bunlardan birisi Uapaca kirkiana (yabani yenidünya) da yapılmıştır. Bizim çalışmamıza benzer olarak, bu çalışmada da heterogenetik kombinasyonların aşı yerlerinde homogenetik kombinasyonlara göre daha yüksek toplam fenolik madde miktarı saptanmıştır (Mng omba et al., 2008). Altun (2003), 0900 Ziraat kiraz çeşidinin sürgün ve yapraklarında fenolik madde içeriklerinin mevsimsel değişimin saptanması üzerine yaptığı bir araştırmada sürgündeki toplam fenolik madde miktarının eylül-mart döneminde en yüksek seviyede olduğunu belirtmiştir. Araştırıcı lignifikasyonla birlikte daha fazla fenolik maddeye ihtiyaç duyulduğunu, bu nedenle ligninleşmenin başladığı dinlenme periyodu ile birlikte sürgünlerde toplam fenolik madde miktarının arttığını bildirmiştir. Bizim çalışmamızda da aşı yapıldıktan 8 ay sonra alınan örneklerde aşı yerinde ve kalemde oldukça yüksek miktarda bulunan toplam fenolik madde miktarının bu döneme kadar gerçekleşen ligninleşme ile ilgisi olabileceğini düşünmekteyiz. Buna ek olarak fenolik bileşikler, bitkide savunma mekanizması olarak da görev yapmaktadırlar. Virüs hassasiyeti olan anaçlarda yüksek fenolik madde miktarının bir nedeni de bu olabilmektedir (Bennett and Walsgrove, 1994; Dirr et al., 1994). Aşı, bitkiler için bir stres faktörü olarak düşünelecek olursa aşılanmış bitkide daha fazla fenolik madde birikimi, kombinasyonların özellikle kalem kısmında fenolik maddenin yüksek olması, aşı bileşenlerinin yaralamaya verdiği tepki olarak değerlendirilebilinir. Çalışmamızda ayrıca aşı bileşenlerinin tümünde aşı yapıldıktan 8 ay sonra yüksek miktarda bulunan toplam fenolik maddenin aşı yapıldıktan 12 ay sonra azaldığı belirlenmiştir. Aşı yapıldıktan sonra 88

99 geçen süreyle birlikte toplam fenolik madde miktarının azaldığı başka araştırıcılar tarafından da bildirilmiştir (Martelock et al., 1994). Usenik (2006), aşı yapıldıktan 12 ay sonra yaralamanın neden olduğu ilk stres belirtilerinin ortadan kalkmaya başladığını, bu nedenle özellikle flavanol birikimlerinin dengelenmeye başlayıp normale döndüğünü 48 ay sonra da tamamen stabil hale geleceğini rapor etmiştir. Bu bilgiler bizim de sonuçlarımızı desteklemektedir. Fenolik bileşiklerin aşı uyuşmasındaki rolleri tam olarak çözülemediyse de bazılarının IAA oksidaz enzimini aktivite ettiklerini, bazılarının ise bunun tersine bu enzimi engelledikleri bilinmektedir (Salvatierre et al.,1999). Çalışmamızda fenolik asitlerden gallik asit ve p-kumarik asit içeriklerinin anaçta, kalemde ve aşı yerinde değişimi incelenmiştir. Gallik asit miktarı diğer fenolik bileşiklerden farklı olarak aşısız heterogenetik anaçlarda ve heterogenetik aşı sürgünlerinde homogenetik anaçlara ve kombinasyonlara göre çok önemli bir fark göstermemiştir. Çalışmamızda gallik asit miktarının en farklı olduğu nokta, homogenetik ve heterogenetik kombinasyonların anaç kısmında saptanmıştır. Homegenetik kombinsyonlarda aşı yapıldıktan sonra anaçta gallik asit miktarında meydana gelen artış, heterogenetik kombinasyonların anaç kısmında meydana gelen artıştan daha yüksektir. Yani aşılama işlemi anaçtaki gallik asit değişimini kalemdekinden daha fazla etkilemektedir. Bu faaliyetin anaçta daha fazla olması belki de daha kuvvetli ağaçlar meydana getirmektedir. Çalışmamızdaki diğer fenolik asit p-kumarik asitin anaçlardaki değişimi kullanılan anaca göre farklılık göstermiştir. Aşı yapıldıktan sonra p-kumarik asitin daha çok aşı yerinde ve aşı yerinin üst kısmında (kalemde ) biriktiği saptanmıştır. Buralarda da özellikle heterogenetik aşılarda kalem kısmında meydana gelen p-kumarik asit birikimi dikkat çekicidir. En yüksek p-kumarik asit miktarı 0900 Ziraat Gisela 5 kombinasyonunun kalem kısmından 8 ay sonra alınan örneklerde saptanmıştır. Çalışmamızda homogenetik kombinasyonlarda aşı yerinin üst kısmında heterogenetik kombinasyonlara göre daha az miktarda p-kumarik asit olduğu belirlenmiştir. Bununla birlikte homogenetik kombinasyonlarda aşı yerinin altında 89

100 biriken p-kumarik asit miktarı, heterogenetik kombinasyonların anaç kısmından daha fazladır. Bu sonuçlarımız Usenik ve Stampar (2000) ile Usenik (2006) in yaptıkları çalışmalarla birebir örtüşmektedir. Usenik ve Stampar (2000), Lapins çeşidinin F 12/1 (Prunus avium) üzerine aşılanmasıyla oluşan homogenetik kombinasyonların aşı sürgünlerinde heterogenetik kombinasyonlara göre daha az p-kumarik asit olduğunu bildirmişleridir. Aynı şekilde Mng omba vd (2008), Uapaca kirkiana da yaptıkları aşı uyuşmazlığı çalışmasında heterogenetik kombinasyonlarda aşı yerlerinin üst kısmında biriken p- kumarik asitin uyuşmazlığa neden olabileceğini bildirmişlerdir. p-kumarik asit birikimi ve bazı flavonoidlerin zayıf kallus formasyonuna neden olabileceği rapor edilmiştir. P-kumarik asit, oksin-oksidaz kofaktörü olup, aşı kaynaşması sırasında dolaylı yoldan rol oynayabilmektedir. Stres koşullarında p-kumarik asitten prunin ve genistein sentezlendiği düşünülmektedir. Prunin ve genistein birikimiyle ATP sentezi sekteye uğramakta bu da IAA taşınmasında sorunlar çıkarmaktadır. Fenolik asitler bitki büyüme ve gelişmesini engelledikleri gibi, IAA taşınımı da engellemektedirler. Uyuşmaz kombinasyonlardaki kalburlu boruların farklılaşmasındaki sorun, IAA konsantrasyonunun azalmasıyla paralellik göstermektedir. Meydana gelen bu metabolik olaylar dışarıya aşı uyuşmazlığının belirtileri ve ağaçların ölmesi şeklinde yansımaktadır (Usenik, 2006). Bu bilgilere göre bodurluğun mekanizmasının açıklanmasında önemli bir rolü olan IAA hormonunun parçalayıcısı oksin oksidaz enzimi p-kumarik asit miktarının artmasıyla teşvik edilmektedir. Parçalanan oksin, aşı elemanlarına daha az miktarda taşınmakta, bu da daha bodur ağaçlar meydana getirmektedir. Bizim çalışmamızda da p-kumarik asit miktarı en fazla bodur 0900 Ziraat /Gisela 5 kombinasyonundan elde edilmiştir. Bu kombinasyondaki p-kumarik asit miktarının fazla olması hem ağaçların bodurlaşmasına, hem de aşı bileşenlerinin kalburlu borularının sorunlu bir şekilde farklılaşmasına neden olmaktadır. IAA taşınmasının bu şekilde engellenmesi kalem kısmından taşınan maddelerin kök kısmına ulaşmasını da engellemektedir. Bu da bize bu mekanizmanın 0900 Ziraat /Gisela 5 kombinasyonunda aşı bileşenleri arasında meydana gelen büyüme farklılıkları ve aşı yerindeki aşırı şişkinliğin nedeni olabileceğini düşündürmektedir. Nitekim aşı yapıldıktan sonra aşı bileşenleri arasında meydana gelen bu farklılık ligninleşme tamamlandıktan sonra ortadan kalkmaktadır. Yani ligninleşme sırasında 90

101 yüksek miktarda ihtiyaç duyulduğu için, yüksek miktarda sentezlenen fenolik bileşikler, ligninleşme bittikten sonra daha az sentezlenmektedir. Bu şekilde IAA taşınmasını engelleyecek herhangi bir sorun oluşmamakta ve taşınma işlemi normal bir şekilde gerçekleşmektedir. Çalışmamızda fenolik bileşiklerden kateşinin aşı yapıldıktan sonra hem anaç kısmında hem de kalem kısmında arttığı belirlenmiştir. Aşı yerinin üstünde, en yüksek kateşin değeri 0900 Ziraat/Kuş kirazı kombinasyonundan, en düşük kateşin değeri ise 0900 Ziraat /CAB 6P kombinasyonundan elde edilmiştir. Kalem kısmından alınan örneklerde aşı yapıldıktan 12 ay sonra tüm kombinasyonlarda kateşin miktarının az ya da çok arttığı kaydedilmiştir. Aşı yerinin alt kısmında kateşin miktarının yine tüm anaçlarda arttığı, ancak bu artışın kalem kısmındaki kadar yüksek olmadığı görülmüştür. Kombinasyonların aşı noktasındaki kateşin miktarında aşı yapıldıktan 12 ay sonra az da olsa bir azalma görülmüştür. Aşı yerinde de en yüksek kateşin miktarı 0900 Ziraat/Kuş kirazı kombinasyonundan elde edilmiştir. Aşı yerinde kateşin miktarının en az olduğu kombinasyon 0900 Ziraat /CAB 6P kombinasyonu olmuştur. Salvatierre vd. (1999), daha kuvvetli ağaçlar meydana getiren Prunus persica/prunus persica kombinasyonunda Prunus persica/prunus tomentosa kombinasyonuna göre daha fazla kateşin içeridiğini bildirmiştir. Bizim çalışmamızda da daha kuvvetli ağaçlar meydana getiren Kuş kirazı üzerine aşılı 0900 Ziraat çeşidinde daha yüksek düzeyde kateşin bulunmaktadır. Aynı şekilde kateşin IAA koruyucusudur ve buna ek olarak dışardan kateşin uygulaması kallus hücrelerinin gelişmesinde, hücre bölünmesinde etkilidir. Kateşin, IAA ile birlikte kök gelişimini sağlamakta ve güçlü ağaçlar meydana getirmektedir. Çalışmamızda incelenen diğer bir flavonoid kuarsetindir. İncelenen diğer fenolik bileşiklerle karşılaştırıldığında, kuarsetinin aşısız anaçta, kalemde ve aşı bileşenlerinde çok önemli bir fark göstermediği, stabil kaldığı belirlenmiştir. Kuarsetinin homogenetik ve heterogenetik kombinasyonlar karşılaştırıldığında heterogenetik kombinasyonların kalem kısmında homogenetik kombinasyonlara göre daha yüksek olması dikkat çekicidir. Ayrıca heterogenetik kombinasyonlarda 91

102 kuarsetin miktarının en yüksek olduğu bölge kalem kısmıyken, homogenetik kombinasyonlarda aşı yeri bölgesinde daha fazla kuarsetin olduğu görülmüştür. Kuarsetinin heterogenetik kombinasyonlarda ve özellikle kalem kısmında daha yüksek olması bu fenolik bileşiğin de bodurlukta rol oynadığını düşündürmektedir. Ayrıca aşılama işlemiyle anaçta ve kalemde çok fazla değişikliğe uğramaması, bu fenolik bileşiğin stres koşullarından daha az etkilendiğini düşündürmektedir. Kirazlarda anaç/kalem ilişkilerinin biyokimyasal yöntemlerle incelenmesi amacıyla yapılan bu çalışmadan elde ettiğimiz sonuçlar aşağıda özetlenmiştir: Ziraat kaleminin aşılamadan önceki peroksidaz aktivitesine en yakın peroksidaz aktivitesi, bu çeşitle uyuşma durumu en iyi olan Kuş kirazı anacının aşılanmamış örneklerinde belirlenmiştir. Özellikle gecikmiş uyuşmazlığın sıkça rapor edildiği Kara idris anacının peroksidaz aktivitesi ise hem diğer anaçlara hem de 0900 Ziraat çeşidine göre en düşük değeri göstermiştir. Çalışmamızdan elde edilen bu sonuç aşılamadan önce anaç ve kalemden elde edilecek peroksidaz aktivitesi değerlerinin aşı uyuşmazlığının erken belirlenmesi amacıyla kullanılabileceğini ortaya koymaktadır. 2. Aşılamadan sonra aşı yerinin altında (anaçta) ve aşı sürgününde (kalemde) peroksidaz aktivitesi artmıştır. Bu artış heterogenetik kombinasyonlarda özellikle de 0900 Ziraat /Gisela 5 ve 0900 Ziraat /Kara idris aşılarında daha yüksek değerdedir. 3. Aşısız anaçlarda, kalemde ve aşılamadan sonra aşı elemanlarında Rf=0.39 olan bir A bandı ve Rf=0.42 olan B bandı bulunmuştur. 4. Toplam fenolik madde miktarı aşı yapıldıktan sonra hem anaçta hem de aşı sürgününde aşısızlara göre artmıştır. Heterogenetik kombinasyonlarda, homogenetik kombinasyonlara göre toplam fenolik maddenin daha yüksek olduğu saptanmıştır. 92

103 5. Diğer fenolik maddelerden farklı olarak gallik asit miktarındaki artış, homogenetik anaçlarda ve kombinasyonlarda heterogenetik kombinasyonların anaç kısmında meydana gelen artıştan daha yüksektir. Sürgün kısımlarındaki gallik asit içeriği ise yakın değerler almışlardır. 6. P-kumarik asitin miktarı heterogenetik aşıların, aşı sürgününde daha yüksek olması bu fenolik asitin oksin taşınmasındaki rolünü ortaya koymaktadır. 7. Kateşin miktarının homogenetik aşılarda hem anaç kısmında hem de aşı sürgününde, heterogenetik kombinasyonlara göre daha yüksek olduğu belirlenmiştir. 8. Aşılama işlemine en az tepki veren fenolik bileşik kuarsetin olmuştur. Kuarsetin miktarının heterogenetik kombinasyonların aşı sürgünlerde daha yüksek düzeyde saptanması, bu fenolik bileşiğin de gelişim kuvveti ile ilgili olabileceğini düşündürmektedir. Aşı uyuşmazlığının mekanizması oldukça kompleks ve üzerinde halen yoğun araştırmaların yapıldığı bir konudur. Uyuşmazlığın erken belirlenmesi için geliştirilecek yöntemler büyük maddi ve zaman kayıplarını da önleyecektir. Bu kapsamda kirazlarda anaç/kalem ilişkilerinin birden fazla biyokimyasal yöntemin bir arada kullanılarak yapıldığı bu tez çalışması sonuçlarının bilim ve meyvecilik çevrelerine katkı sağlayacağını ve referans oluşturacağını düşünmekteyiz. Hem peroksidaz enzimi hem de fenolik bileşiklerle ilgili araştırmaların farklı çeşit/ anaç kombinasyonlarında incelenmesinin daha kesin sonuçlar alınmasını sağlayacağı kanısındayız. 93

104 6. KAYNAKLAR Aloni, B., Karni, L., Deventurero, G., Levin, Z., Cohen, R., Katzir, N., Lotan- Pompan, M., Edelstein, M., Aktas, H., Turhan, E., Joel, D.M., Horev, C., Kapulnik, Y., Physiological and biochemical changes at the rootstockscion interface in graft combinations between Cucurbita rootstocks and melon scion. The Journal of Horticultural Science and Technology, 83 (6), Altun, B., Ziraat Kiraz Çeşidinin Sürgün ve Yapraklarında Fenolik Madde İçeriklerinin Mevsimsel Değişimlerinin Saptanması Üzerine Bir Araştırma. Ondokuz Mayıs Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Bahçe Bitkileri Anabilim Dalı, Yüksek Lisans Tezi, 51s, Samsun. Anonymous, Food and Agriculture Organization of The United Nations (FAO). Erişim Tarihi: Andrews, P.K. and Marquez, C.S., Graft incompatibility. Horticultural Reviews, 15, Bennet R.C, Wallsgrove R.M., Secondary metabolites in plant defence mechanisms, Tansley Review No. 72. New Phytopatologist, 127, Bower, J.P., Nel, M., Avocado (Persea americana) (Mill.) stock-scion interactions as evidenced by peroxidase activity and stem growth. South African Avocado Growers Association Yearbook, 4, Burak, M., Akçay, M.E., Yalçinkaya, E., Türkeli, Y., Effect of some clonal rootstocks on growth and earliness of 0900 Ziraat sweet cherry. Acta Horticulturae, 795, Cevahir, G., Yüksek Bitkilerde Aşı Birliği Kurulması Sırasında Oluşan Fizyolojik ve Anatomik Değişiklikler. İstanbul Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Biyoloji Ana Bilim Dalı, Doktora Tezi, 92s, İstanbul. Clemente, E., Purification and thermostability of ısoperoxidase from oranges. Phytochemistry, 49 (1), Çelik, M., Bazı Armut Çeşitleri için En Uygun S. Ö. Ayva Anacı Seçimi ve Aşı Uyuşmazlığının Biyokimyasal Analiz Yöntemleri ile Belirlenmesi. Ankara Üniversitesi Ziraat Fakültesi, Doçentlik Tezi, 91s, Ankara. Davarynejad, G.H., Shahriari, F. and Hamid, H., Identification of graft incompatibility of pear cultivars on Quince rootstock by using isozymes banding pattern and starch. Asian Journal of Plant Sciences, 7 (1),

105 Demirsoy, H., Bilgener, Ş., Bazı uyuşur ve uyuşmaz şeftali/erik aşı kombinasyonlarında aşı yerinin anatomik olarak incelenmesi. Ondokuz Mayıs Üniversitesi Ziraat Fakültesi Dergisi, 21 (1), Dirr, U., Feucht, W., Treutter, D., Effect of nutrient deficiency on accumulation and leankage of the stress metabolite prunin. Acta Horticulturae, 381, Donaldson, L.A., Lignification and lignin topochemistry-an ultrastructural view. Phitochemistry, 57, Dumanoğlu, H., Bazı S. Ö. Ayva Anaçları ve Armut Çeşitlerinde Kalburlu Boruların Anatomik Yapısı ile Uyuşma Arasındaki İlişkiler. Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, Bahçe Bitkileri Ana Bilim Dalı, Doktora Tezi, 116s, Ankara. Eriş, A., Gülen, H., Moleküler Biyoloji (Temel Bilgiler). Uludağ Üniversitesi Ziraat Fakültesi Ders Notları No:98, 138. Bursa. Ermel, F.F., Kervella, J., Catesson, A.M., Poessel, J.L., Localized graft incompatibility in pear/quince (Pyrus communis/cydonia oblonga) combinations: multivariate analyses of histological data from 5-month-old grafts. Tree Physiology, 19, Eryılmaz, F., Bakır (Cu) Uygulanmış Mısır (Zea mays L.) Fidelerindeki Antioksidan Aktivitelerinin Fizyolojik ve Anatomik Yönden İncelenmesi. İstanbul Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Biyoloji Ana Bilim Dalı, Doktora Tezi, 223s, İstanbul. Errea, P., Felipe, A., Herrero, M., Graft establishment between compatible and incompatible Prunus spp. Journal of Experimental Botany, 45, Errea, P., Implications of phenolic compounds in graft incompatibility in fruit tree species. Scientia Horticulturae, 74, Errea, P., Garay, L., Marin, J.A., Early detection of graft incompatibility in apricot (Prunus armeniaca) using in vitro techniques. Physiologia Plantarum, 112, Faust, M., Physiology of Temperate Zone Fruit Trees. John Wiley and Sons Inc., 338p., New York, Singapore. Fernandez-Garcia, N., Carvajal, M., Olmos, E., Graft union formation in tomato plants: peroxidase and catalase involvement. Annual. of Botany, 93,

106 Feucht, W., Scmid, P.P.S., Christ, E., Compatibility in Prunus avium/prunus cerasus grafts during initial phase. II. reduction of cell number and peroxidases in the rootstock cambium. Scientia Horticulturae, 21, Feucht, W., Treutter, D., Phenol gradients in opposing cells of Prunus heterografts. Advances Horticultural Science, 5, Frankenstein, C. and Schmitt, U., Microskopic studies on modified wall structure and lignin topochemistry in xylem fibres of poplar after wounding. Maderas Science Technology, 8 (2), Gaspar, T.H., Penel, C.L., Thorpe, T. and Grappin,H., Chemistry and Biochemistry of Peroxidases, a survey of Their Biochemical and Physiological Roles in Higher Plants. Uni. Og Geneve, p Godini, A., Palasciano, M., Camposeo, S., Pacifico, A., A nine-year study on the performance of twelve cherry rootstocks under non-irrigated conditions in Apulia (Southern Italy). Acta Horticulturae, 795, Gonçalves, B., Correia, C.M., Silva, A.P., Bacelar, A.E., Santos, A., Ferreira, H., Moutinho-Pereira, J.M., Variation in xylem structure and function in roots and stems of scion-rootstock combinations of sweet cherry tree (Prunus avium L.). Trees, Gökbayrak, Z., Söylemezoğlu, G., Akkurt, M., Çelik, H., Determination of grafting compatibility of grapevine with electrophoretic methods. Scientia Horticulturae, 113, Gülen (Sertli), H., Ayva ve Armutlarda Anaç/Kalem İlişkilerinin İzoenzim Analizleriyle Araştırılması. Çukurova Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Bahçe Bitkileri Anabilim Dalı, Doktora Tezi, 135s, Adana. Gülen, H., Küden, A., Kreps, S.L., Arora, R., Armut ve ayvada nişasta jel elektroforez tekniğine göre peroksidaz izoenzim analizleri için en uygun yöntemin belirlenmesi. Uludağ Üniversitesi Ziraat Fakültesi Dergisi, 16, Gülen, H., Çelik, M., Polat, M. and Eriş, A., Cambial isoperoxidases related to graft compatibility in pear-quince graft combinations. Turkish Journal of Agriculture Foresty, 29 (1), Hamid, M., Ur-Rehman, K., Potential application of peroxidases. Food Chemistry, 115, Hartmann, H.T., Kester, D.E., Davies, Jr,F., Geneve, R.L., Plant Propagation Principles and Practies. Sixth Edition, Prentice Hall, New Jersey. 96

107 Has- Schön, E., Lepeduš, H., Jerabek, L., Cesar, V., Influence of storage temperature on total peroxidase activity in crude extracts from Picea abies L. Karst. Needless. Croatica Chemica Acta, 78 (3), Hatzilazarou, S.P., Syros, D.T., Yupsanis, A.T., Bosabalidis, M.A., Economou, S.A., Peroxidases, lignin and anatomy during in vitro and ex vitro rooting of Gardenia (Gardenia jasminoides Ellis) microshoots. Journal of Plant Physiology, 163, Hepaksoy, S., Ayva Anaçlarının Armut Çeşitleriyle Uyuşma Durumları Üzerine Araştırmalar. Ege Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Bahçe Bitkileri Ana Bilim Dalı, Doktora Tezi, 112s, İzmir. Hiraga, S., Sasaki, K., Ito, H., Ohashi, Y., Matsui, H., A large family of class III plant peroksidases. Plant Cell Physiolog, 42 (5), Hrotkó, K., Progress in cherry rootstock research. Acta Horticulturae, 795, Huttová, J., Mistrík, I., Ollé-Šimonovičová, M., Tamás, L., Cadmium induced changes in cell wall peroxidase isozyme pattern in barley root tips. Plant Soil Environmental, 52 (6), Jeffree, C.E. and Yeoman, M.M., Development of intercellular connection between opposing cells in a graft union. New Phytologist, 93, Karaçalı, İ, Bahçe Ürünlerinin Muhafaza ve Pazarlanması (3. Baskı). Ege Üniversitesi Ziraat Fakültesi Yayınları No: 494. Ege Üniversitesi Basımevi. Bornova, İzmir. Kaşka, N., Yılmaz, M., Bahçe Bitkileri Yetiştirme Tekniği. Çukurova Üniversitesi Ziraat Fakültesi Yayınları No:79, Ders Kitabı 2 (Hartmann, H.T., Kester, D.E. Tercüme), Adana. Koyuncu, F., Kaçal, E., Yıldırım, A.N., Red Globe şeftali ve Fantasia nektarin çeşitleri ile St. Julien A anacının uyuşma durumlarının belirlenmesi. 5. Ulusal Bahçe Bitkileri Kongresi, 4-7 Eylül, Erzurum. Koyuncu, F., Anaç Kalem İlişkileri. Basılmamış Yüksek Lisans Ders Notu. Kunter, B., Bazı Kiraz Çeşitleri ile İdris (Prunus mahaleb L.) Arasındaki Aşı Uyuşma Durumunun Serolojik Yöntemle Erken Dönemde Belirlenmesi. Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Bahçe Bitkileri Anabilim Dalı, Doktora Tezi, 168s., Ankara. Lee, H.S., Kim, S.E. and Lee, Y.M., Prufication and charecterization of cationaic isoperoxidase from scented-geranium. Phytochemistry, 58,

108 Lockard, R.G., Schneider, G.W., Stock and scion growth relationships and the dwarfing mechanism in apple. Horticultural Reviews, 3, Lopez Velez, M., Martinez, F., Del Vale-Ribes, C., The study of phenolic compounds as natural antioksidants in wine. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 43 (3), Manganaris, A.G., Alston, F.H., Inheritence and linkage relationships of peroxidase isoenzymes in apple. Theoritical Apply Genetic, 83, Marjamaa, K.İ., Kukkola, E.M., Fagerstedt, K.V., The role of xylem class III peroxidases in lignification. Journal of Experimental Botany, 60 (2), Martelock, G., Bauer, H., Treutter, D., Characterization of Prunus avium L. varieties with phenolic compounds. Fruit Variety journal. 48, McCully, M.E., Structural Aspects of Graft Development. P: In: R. Moore (Editor). Vegetative Compatibility Responses in Plants. Baylor University Press, Waco, TX. Mng omba, S.A., Du Toit, E.S., Akinnifes, F.K., The ralationship between graft incompatibility and phenols in Uapaca kirkiana Müell Arg. Scientia Horticulturae, 117, Moing, A.,1987. Grafting incompatibility of peachon Myrobolan plum: A study of stoma physological and structural aspects. Horticultural Abstaracts, 57,7562. Moing, A. and Carde, J.P., Growth, cambial activity and phloem structure in compatible and incompatible peach/plum grafts. Tree Physiology, 4, Moore, R., A model for graft compatibility-incompatibility in higher plants. American Journal of Botany, 71 (5), Moore, R., Graft incompatibility between pear and quince: the influence of metabolites of Cydonia oblongo on suspension cultures of Pyrus communis. American Journal of Botany, 73 (1), 1-4. Ogata, Tsuneo, Kabashima, Y., Shiozaki, S., Horiuchi, S., Journal of The Japanese Society for Horticultural Science, 74 (3), Olmstead, M.A., Vaskuler and Metabolic Impact of Dwarfing Rootstocks on Sweet Cherry (Prunus avium, L.), Michigan State University, phd Thesis, 208p. Öz, F., Kiraz ve Vişne Yetiştiriciliği. Atatürk Bahçe Araştırma Enstitüsü Yayınları, 3, 32s., Yalova. 98

109 Özbek, S., Özel Meyvecilik (Kışın yaprağını Döken Meyve Türleri). Çukurova Üniversitesi Ziraat Fakültesi Yayınları, No:128.Ders kitabı 386s, Adana. Özçağıran, R., Meyve Ağaçlarında Anaç ile Kalem Arasındaki Fizyolojik İlişkiler. Ege Üniversitesi Ziraat Fakültesi Yayınları, No:243, İzmir. Özçağıran, R., Ünal, A., Özeker, E., İsfendiyaroğlu, M., Ilıman İklim Meyve Türleri Sert Çekirdekli Meyveler Cilt-1 3.Baskı. Ege Üniversitesi Basım Evi, İzmir. Parkinson, M., Jeffree, C.E., Yeoman, M.M., Incomaptibility in cultured explant-grafts between members of the Solanaceae. New Phytologist, 107, Petkou, D., Diamantidis, G., Vassilakakis, M., Anionic peroxidase isoform profiles from calli and barks of pear cultivars and of the quince rootstock EM A. Journal of Biological Research, 2, Pina, A., Errea, P., A review of new advances in mechanism of graft compatibility-incompatibility. Scientia Horticulturae, 106, Pina, A., Errea, P., Schulz, A., Martens, J.H., Cell-to-Cell Transport Through Plasmodesmata in Tree Callus Cultures. Tree Physiology Advance Access Published Online on January 6, Polat, M., Dolgun, O., Yıldırım, A., Aşkın, A.M., Gökbayrak, Z., Graft union of spur varieties grafted on different rootstocks. Journal of Food, Agriculture and Environment, 8 (2), Rajeswari, V., Paliwal, K., Peroxidase and catalase changes during in vitro adventitious shoot organogenesis from hypocotyls of Albizia odoratissima L. f. (Benth). Acta Physiologica Plantarum, 30, Sachs, T., The control of patterned differention of vasculer tissues. Advances in Botanical Research, 9, Salisbury, F.B., Ross, C.W., Plant Physiology, 4th edn. Publishing, Belmont, 619p. CA. Salvatierra, G.M.A., Hiroshi, G., Shuichi Iwahori., Histochemical observation and HPLC analysis of phenolic compounds at the graft union of dwarf peach trees grafted onto Prunus tomentosa. Journal of Japan Society Horticulturae Science, 68 (4), Santamour, F.S.Jr., Cambial peroxidase patterns in Quercus related to taxonomics classification and graft compatibility. Bulletin of The Torrey Botanical Club, 110 (3),

110 Santamour, F.S.Jr., McArdle, A.J., Jaynes, R.A., Cambial isoperoxidase patterns in Castanea. Journal of Environmental Horticulture., 4 (1), Santamour, F.S.Jr., Graft compatibility in woody plants: an axpanded perspective. Journal of Environmental Horticulture., 6 (1), Santamour, F.S.Jr., Cambial peroxidase enzymes related to graft incompatibility in Red Maple. Journal of Environmental Horticulture., 7 (1), Seferoğlu, G., Tekintaş, E.F., Özyiğit, S., Determination of grafting union success in 0900 Ziraat and Starks Gold cherry cultivars on Gisela 5 and SL 64 rootstoock. Pakistan Journal of Botany, 36 (4), Schmidt, P.P.S., Feucht, W., Differentiation of sieve tubes in compatible and incompatible Prunus graftings. Scientia Horticulturae, 15, Schmidt, P.P.S., Feucht, W., Compatibility in Prunus avium/prunus cerasus graftings during the initial phase. III. isoelectrofocusing of proteins, peroxidases and acid phosphatases during union formation. Journal of Horticultural Science, 60 (3), Sitarek, M., Incompatibility problems in sweet cherry trees on dwarfing rootstocks. Latvian Journal of Agronomy, 9, Stasolla, C., Katahira, R., Tharpe, T.A., Ashihara, H., Prunin and pyrimidine nücleotide metabolism in higher plants. Journal of Plant Physiology. 160, Stoddart, F.L., McCully, M.E., Effects of excision of stock and scion organs on the formation of the grafth union in Coleus: A histological study. Botany, 141, Taiz, L., Zeiger, E., Plant Physiology 4th Edition, Sinauer Associates, 764p. USA. Taiz, L., Zeiger, E., Bitki Fizyolojisi (Üçüncü Baskıdan Çeviri; Çeviri Editörü İsmail Türkan). Palme Yayıncılık. 689s. Ankara. Tanrısever, A., Kiraz grubu Prunus türlerinde falavan içeriği ile büyüme gücü arasındaki ilişkiler üzerine araştırmalar. Ege Üniversitesi Ziraat Fakültesi Dergisi, 19 (2), Tekintaş, F.E., Cevizlerde (J.regia L.) Aşı Kaynaşması ve Aşı ile İlgili Sorunlar Üzerinde Araştırmalar. Doktora tezi, Ege Üniveristesi Fen Bilimleri Enstitüsü Bahçe Bitkileri Anabilim Dalı, 105s., İzmir. 100

111 Usenik, V., Štampar, F., Influence of various rootstocks for cherries on p- coumaric acid, genistein and prunin content and their involvement in the incompatibility process. Gartenbauwissenchaft, 65 (6), Usenik, V., Štampar, F., Different rootstocks for cherries-influence on polyphenol content and graft incompatibility. Proc. 7th International Symposim On Orch&Plant Syst. Eds. J. W. Palmer & J. N. Wünssche. Acta Horticulturae, 557. Usenik, V., Krška, B., Vičan, M., Štampar, F., Early detection of graft incompatability in apricot (Prunus armeniaca L.) using phenol analyses. Scientia Horticulturae, 109, Usenik, V., Fajt, N., Štampar, F., Sweet cherry rootstock testing in Slovenia. Acta Horticulturae, 795, Ünal,A.,Tanrısever,A., Bazı Ayva ve armut çeşitlerinde kalburlu boruların yapıları ve bunların uyuşmazlıkla ilişkileri üzerinde araştırmalar. Tubitak Doğa Bilim Dergisi, 10 (2), Végvári, Gy., Hrotkό, K., Magyar, L., Hajagos, A., Csigai, K., Histological investigation of cherry rootstocks. Acta Horticulturae, 795, Webster, A.D., Schmidt, H., Rootstocks For Sweet and Sour Cherries. p In: Webster and Looney (eds.), Cherries Crop Physiology, Production and Uses. 513p. CAP Intl.UK. Wendel, J.F., Weeden, N.F., Visualization and Interpretation of Plant Isozymes (D.E.Soltis and P.S.Soltis eds.). Isozymes in Plant Biology. Dioscordes Press, Portland, Oregon, Wertheim, S.J., Rootstock Guide. Apple, Peer, Cherry, European Plum. Fruit Research Satation. 144p. Wilhelminadorp, The Netherlands. Westwood, M.N., Temperate- Zone Pomology, Physiology and Culture, 3th Edition. Timberpress, ISBN , 523p. Porland, Oregon. Yılmaz, M., Modern Bahçe Bitkileri Yetiştirme Tekniği. Çukurova Üniversitesi Ziraat Fakültesi Yayınları Ders Kitapları, Adana. 101

112 ÖZGEÇMİŞ Adı Soyadı : Sultan Filiz GÜÇLÜ Doğum Yeri ve Yılı: Afyon/1979 Medeni Hali : Evli Yabancı Dili : İngilizce Eğitim Durumu (Kurum ve Yıl): Lise : Uşak Anadolu Öğretmen Lisesi Lisans : Süleyman Demirel Üniversitesi Ziraat Fakültesi Bahçe Bitkileri Bölümü Yüksek Lisans : S. D. Ü. Ziraat Fakültesi Bahçe Bitkileri Bölümü Çalıştığı Kurum ve Yıl: S. D. Ü. Fen Bilimleri Enstitüsü S. D. Ü. Atabey M. Y. O 2009-Devam ediyor Yayınları (SCI ve diğer makaleler) Koyuncu, F., Akıncı Yıldırım, F., Koyuncu, M.A., Tosun (Güçlü), F., Isparta yöresindeki üç farklı ceviz populasyonun fenolojik özelliklerinin ıslah açısından incelenmesi. Bahçe 34(1), Koyuncu, F, Tosun (Güçlü) F., Evaluation of pollen viability and germinating capacity of some sweet cherry cultivars grown in Isparta, Turkey. Acta Horticulturae 795 ISHS, Volume: 1, p: Koyuncu, M.A., Koyuncu, F., Kuleaşan, H., Dilmaçünal, T., Güçlü, F., Çetinbaş, M., Cold storage of fresh cut Grany Smith apples in normal (air) atmosphere conditions. 10 th Controlled and Modified Atmosphere Research Conference, April, Akdeniz Üniversitesi Ziraat Fakültesi Bahçe Bitkileri Bölümü, Antalya (basımda). Koyuncu, M. A., Dilmaçünal, T., Çetinbaş, M., Koyuncu, F., Güçlü, F., Effects of some teratments on quality cahnce of Grany Smith apples during cold storage. 6 th International Postharvest Symposium, April, Akdeniz Üniversitesi Ziraat Fakültesi Bahçe Bitkileri Bölümü, Antalya (basımda). Roversı, A., Mozzone, G.,Castellıno, L., Tosun (Güçlü), F., Nocciolo: produzioni più elevate e frutti migliori con la potatura verde.fruttıcoltura - n