ANKARA TEKESİ SPERMASININ DONDURULMASINDA BAZI KRİYOPROTEKTANLARIN ETKİSİ

Transkript

1 TÜRKİYE CUMHURİYETİ ANKARA ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ANKARA TEKESİ SPERMASININ DONDURULMASINDA BAZI KRİYOPROTEKTANLARIN ETKİSİ Mustafa Numan BUCAK DÖLERME VE SUN İ TOHUMLAMA ANABİLİM DALI DOKTORA TEZİ DANIŞMAN Prof. Dr. Necmettin TEKİN 2007-ANKARA

2 ii Ankara Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü Dölerme ve Sun i Tohumlama Doktora Programı Çerçevesinde yürütülmüş olan bu çalışma, aşağıdaki jüri tarafından Doktora tezi olarak kabul edilmiştir Tez Savunma Tarihi: 23/02/2007

3 iii ÖNSÖZ Gen kaynaklarının etkili şekilde kullanılabilmesi gen kaynağını oluşturan gamet hücrelerinin başarılı bir şekilde dondurarak saklanmasını gerektirmektedir. Bu saklama çeşidi spermaların istenilen yerlere kolayca gönderilmesini, yapılacak hayvan ıslahında birörneklilik ve hız kazandırması, entansif yetiştiricilikte hastalıkların kontrol altına alınmasında büyük önem taşımaktadır. Dondurulmuş sperma ile bazı türlerde yapılan suni tohumlamada başarı sağlanırken, diğer bazı türlerde (keçi, koyun) fertilite başarısı sınırlı kalmaktadır. Bundaki temel neden, spermatozoanın dondurma işlemine olan duyarlılığıdır. Koç- Teke spermasının dondurulması/çözdürülmesi sonrası istenilen oranda motilite eldesine rağmen, fertilite oranının sınırlı olması, çalışmaları spermatozoon biyodinamiği ve tohumlama metodları üzerine yönlendirmiştir. Şu an keçi yetiştiriciliğinde dondurulmuş sperma laparoskopik tohumlama yönetiminde kabul edilir sonuçlar vermesine karşılık, tekniğin pratik olmaması, işçilik masrafları dahil bir takım masraflara neden olması kullanımını sınırlı bırakmaktadır. Bu anlamda, çalışmalar spermanın farklı katkı maddeleri içeren sulandırıcılarla ve farklı tekniklerde dondurulmasına eğilim göstermektedir. Dondurulmuş teke spermasının servikal tohumlamalarda kullanılmasında fertilitenin düşük oranda seyretmesi, spermatozoon membranında gelişen ultrastrüktürel yıkımlanmalar ve spermatozoanın dondurma/çözdürme sırasında ve genital kanalda ilerlerken yaşlanması erkek açısından başta gelen faktörlerdir. Yapılan bu tez çalışmasının amacı, teke sperması sulandırıcısına katılan kriyoprotektanların çözüm sonrası spermatolojik parametrelere etkisinin araştırılmasına yönelik olmuştur. Doktora programına başlama ve araştırma görevliliği süreciyle devam eden zaman dilimi içerisinde her anlamda beni destekleyen, bana yeni ufuklar açan, akademik araştırmalarda bilimsel ve sistematik bir bakış açısı kazanmamda sonsuz yardımları olan kıymetli hocam ve tez danışmanım Sayın Prof.Dr.Necmettin Tekin e, yakın ilgileri nedeniyle Anabilim Dalının diğer akademik ve idari personeline, beni hep sabırla ve ilgiyle karşılayan sevgili eşim Sibel Eren Bucak a şükranlarımı sunarım.

4 iv İÇİNDEKİLER KABUL VE ONAY ÖNSÖZ İÇİNDEKİLER SİMGELER VE KISALTMALAR ÇİZELGE VE RESİMLER İİ İİİ İV Vİ Vİİ 1. GİRİŞ Ankara keçisinin ırk özellikleri Morfolojik özellikleri Yaşam koşulları ve tiftik özellikleri Ankara keçisinin dölerme özellikleri Ankara keçilerde kızgınlık ve suni tohumlama Ankara tekesi spermasının özellikleri Tekelerde dölerme fizyolojisi Spermatozoon üretimi Testis fonksiyonlarının hormonal kontrolü Çiftleşme ve ejakülasyon Teke spermasının dondurularak uzun süreli saklanması Teke spermasında dondurma işlemlerini etkileyen 6 faktörler Teke spermasının dondurulmasında kullanılan sulandırıcılar Teke spermasının sulandırması ve sulandırma oranı Teke spermasının dondurulması-çözdürülmesi Teke spermasının dondurulmasında kullanılan kriyoprotektanlar Sakkaritler Antioksidanlar Spermanın kısa ve uzun süreli saklanmasında 15 antioksidanların etkisi Glutatyonun gamet ve embriyo üzerine etkisi 16

5 v Etilendiamintetraasetik asit (EDTA) GEREÇ VE YÖNTEM Hayvan materyali ve hayvanların bakım-beslemesi Spermanın alınması Spermanın sulandırılması ve dondurulması Spermanın in vitro değerlendirilmesi Nativ spermada değerlendirme Dondurulmuş-çözdürülmüş spermada değerlendirme Sperma değerlendirme parametreleri Toplam miktar Spermatozoa motilitesi Anormal spermatozoa oranı Ölü spermatozoa oranı Spermatozoa yoğunluğu Hipoozmotik şişme testi (HOST) İstatistiksel analiz BULGULAR Nativ spermada bulgular Dondurulmuş-çözdürülmüş spermada bulgular TARTIŞMA SONUÇ VE ÖNERİLER 34 ÖZET 36 SUMMARY 37 KAYNAKLAR 38 ÖZGEÇMİŞ 47

6 vi SİMGELER VE KISALTMALAR BHT Butilat hidroksitoluen CAT Katalaz DMSO Dimetilsülfoksit EDTA Etilendiamintetraasetik asit GP Glutatyon Peroksidaz GSSG Okside Glutatyon GSH Redükte glutatyon NADPH Nikotinamid Adenin Dinükleotid Fosfat ROS Serbest Oksijen Radikalleri SOD Süperoksit Dismutaz

7 vii ÇİZELGE VE RESİMLER Çizelgeler Çizelge 1. Miks edilen ejakülatlarda spermatolojik özellikler Çizelge 2. Faklı kriyoprotektan içeren sulandırılarla dondurulan Ankara tekesi spermasından çözüm sonrası elde edilen spermatolojik özellikler Resimler Resim 1. Çalışmada kullanılan Ankara tekeleri Resim 2. Spermanın alınması ve sulandırılmasında kullanılan ekipmanlar Resim 3. Sun i vajen ile tekeden spermanın alınması Resim 4. Tekelerden alınan ejakülatların bir tüpte miks yapılması. Resim 5. Spermanın sulandırılması kullanılan sulandırıcı grupları Resim 6. Spermanın sulandırma işlemi

8 1. Giriş Ankara Keçisi (Capra prisca) tiftik verimiyle özelleşmiş tiftik keçisi olarak ta anılmaktadır. Ankara Keçisinin, 13. yüzyılda Türklerin Hazer Denizinin doğusundan Anadoluya beraberlerinde getirdiği bir keçi ırkı olduğu bilinmektedir. Bu ırkın, Anadolu nun iklim ve coğrafi koşullarına uyum sağlayarak, bugünkü Ankara keçisinin özelliklerini kazandığı belirtilmektedir (Batu, 1951). Ankara keçisi, Orta Anadolu nun özgün ve özellikle yapağı (tiftik) verimi için yetiştirilen bir hayvan türüdür. Birçok ülkede mohair diye adlandırılan tiftik, bilindiği gibi bütün dünyaya yurdumuzdan yayılan Ankara keçisinin ürünüdür. Bu nedenle, dünya literatüründe Ankara Keçisi (The Angora Goat) olarak tanınmaktadır. Ankara keçisi özellikle tekstil endüstrisinde ham madde ihtiyacını karşılamak amacıyla tiftik üretimi ve yavru verimi için yetiştirilmektedir. Dünyada Ankara keçisi yetiştiriciliği yapılan başlıca ülkeler: Türkiye, Güney Afrika, ABD, Kanada, Yeni Zelanda, La Sota, Rusya, Arjantin ve Brezilya dır. Ancak bunlardan ilk üç ülke tiftik amaçlı yetiştiricilikte öne çıkmaktadır (Yalçın, 1982; Öztürk, 1989; Güneş ve ark., 2002). Türkiye Cumhuriyetin kuruluş yıllarında artış gösteren tiftik keçisi varlığı 1960 lı yıllara kadar bu artışını sürdürmüş, 1980 li ve 1990 lı yıllarda hızlı bir şekilde düşüş göstermiştir lu yıllarda Ankara keçisi sayısı 2,5-3 milyon civarındayken, bu rakamlar Türkiye İstatistik Kurumu son verilerinde (2005) Türkiye genelinde , Ankara da ise Ankara keçisi olduğu kaydedilmiştir. Bu azalmada tiftik fiyatlarındaki yetersizlik ve pazar sorunu, meraların bilinçsiz kullanımı ve ziraat alanlarına dönüştürülmesi, meraların orman alanı olarak kullanılması, yetiştiricilere gerekli bilginin verilerek yoğun yetiştiricilik yöntemlerine yöneltilmemesi, et fiyatlarının tiftik fiyatlarına göre daha fazla artması gibi nedenler rol oynamaktadır. Günümüzde Anadolu da Ankara keçisi yetiştirilmesinin başlıca nedeni, yetiştiricilerin geleneksel değerlere bağlılığındandır (Daşkıran, 2006; Namdar, 2006).

9 Ankara keçisinin ırk özellikleri Morfolojik özellikleri Ankara keçisi, ufak yapılı, ince ve zarif vücut yapısına sahip bir ırktır. Yüz ve bacaklar dışında bütün beden, tarsal ve karpal mafsallara kadar ince, yumuşak, parlak ve lüleli tiftikle örtülüdür. Alnında kakülü bulunan ve karın altı tamamen tiftikle örtülü olanlarda tiftik verimi yüksektir. Sağrı omuzdan yüksektir, arka bacaklar önlerden biraz daha uzundur. Çoğunlukla beyazdır. Ankara yöresinde yetiştirilen Ankara keçilerinde baş ve ayaklar dahil tüm vücut beyazdır. Konya ve yöresi keçileri krem ve sarı renkli, Doğu ve Güneydoğu illerinde yetiştirilenler gümüşi gri, kahverengi ve siyah renktedir. Baş profili düzgündür. Küçük, zarif, alın geniş, gözler parlak ve bakışlar canlı, dudaklar ince, dişler muntazamdır. Başın yandan görünüşü dişilerde hafif iç bükey ya da düz, tekelerde ise dış bükeydir. Erkeklerde, boynuzlar iyi gelişmiş kendi ekseni etrafında kıvrılmış, geriye doğru yatıktır. Dişilerde ise, boynuzlar kısa ve arkaya kıvrıktır. Ancak, alçak, bataklık, nemli iklimlerde yetiştirilen Ankara keçisi sürülerinde ırk özellikleri bozulmaktadır (T.C. Resmi Gazete, 2004; Namdar, 2006) Yaşam koşulları ve tiftik özellikleri Ankara keçisinin bir step hayvanı oluşu, 800 metreden daha yüksek rakımlarda, kuru ve az yağışlı bir bölge olan Orta Anadolunun uygun yaşam alanı olmasına yol açmıştır. Ayrıca Siirt ve Mardin illerimizde de yaygındır. Ülkemizde tipik ırk özelliklerini üzerinde toplayan en saf örnekler Ankara yöresinde yetiştirilmektedir Yaşam süreleri ortalama 8-15 yıl arasındadır (Öztürk, 1989; Namdar, 2006). Ankara keçileri, diğer ırk keçilerden daha az olup, sürü yönetimleri kolaylıkla yapılabilmektedir. Ancak, diğer evcil hayvanlara nazaran daha fazla sağlık problemlerine ve parazit enfeksiyonlarına açıktır. Bu olumsuzluklar, iyi bakım ve beslemeyle kontrol altına alınabilmektedir (Sell, 1993). Ankara keçisi tiftiği, parlak elastik, zararlı güneş ışınlarını geçirmeyen, nem çeken, ısıya dayanıklı, kolayca boyanabilen ve kolay kir tutmayan bir elyaf özelliğindedir. Bir tekstil elyafı olmakla birlikte, genelde dokuma sanayiinde saf olarak kullanılmaz. Pamuk, yün ve akrilik gibi elyaflarla değişik oranlarda

10 3 karıştırılarak kullanılır. En büyük tüketimi tekstil sanayisinde olup, kumaşlarda, lüks battaniyelerde, halıcılıkta, trikotaj endüstrisinde, peruk, oyuncak sanayi ve paraşüt ipi yapımında kullanılmaktadır (Namdar, 2006). Bugün dünyanın birçok ülkesinde yetiştirilen Ankara keçisinin tiftiği, incelik ve yumuşaklık gibi önemli özellikleri bakımından yurdumuzda üretilen tiftikler seviyesine ulaştırılamamıştır. Diğer ülkelerde tiftik verimi ortalama 4 kg a kadar çıkartılmıştır. Yurdumuzda ise tiftik verimi ortalama 2,75 kg (1,37-6,50 kg) civarındadır (Mohair Council of America, 2006; Namdar, 2006) Ankara keçisinin dölerme özellikleri Ankara keçilerde kızgınlık ve suni tohumlama Keçilerde ergenlik yaşı, ırk, ısı, ışık ve besleme gibi çevresel etkilere göre 3-12 ay arasında değişim göstermektedir. Genel olarak keçiler, mevsimsel poliöstrik hayvanlardır. Çiftleşme mevsimi sonbahar ve erken kış dönemidir. Gün ışığının azalmaya başlaması, çiftleşme mevsimine girişi uyarır. Ayrıca sürüde tekenin varlığı östrusün başlamasına katkıda bulunur. Dişi keçi, ilk östrusta izleyen östruslara göre daha düşük doğurma oranına sahiptir. Ankara keçisinde doğumu izleyen sıfat sezonunda, yani yaklaşık olarak 7 aylıkken, ilk kızgınlık görülür. Doğum oranı ortalama %85,05, döl verimi 1,03, doğumdan sütten kesime kadar ki yaşama gücü oranı ortalama %92,67 dir (Tekin ve Muyan, 1985). Ankara keçilerinde kızgınlık süresi saat, kızgınlık siklusu süresi gün arasında değişmekte ve ovulasyon ise kızgınlığın sonuna doğru olmaktadır. Gebelik süreleri ise yaklaşık 148 gündür. Ankara keçilerinde kızgınlık başlangıcında ve kızgınlık başlangıcından 12 saat sonra taze spermayla yapılan tohumlamalardan her ikisinde de %94 oranında gebelik oranı elde edildiği bildirilmektedir (Tekin ve Muyan, 1985). Kızgınlık ortasından itibaren yapılan taze spermayla tohumlamalarda ise gebelik oranı düşmektedir. Yapılan çalışmalarda taze spermayla yapılan servikal tohumlamalardan %33-89 oranında gebelik alındığı bildirilmektedir. Bu oranlar üzerinde tohumlama dozu, spermanın bırakıldığı yer ve tohumlama zamanı etkili olmaktadır. Dondurulmuş spermayla yapılan servikal tohumlamalardan ise %38,5-73,0 arasındaki oranlarda gebelik, yaklaşık %40 oranında da kuzulama oranı elde

11 4 edilmektedir (Ritar ve Salamon, 1983; Tekin ve Muyan, 1985; Sevinç ve ark., 1989; Sungur ve ark., 1993; Tekin ve ark., 1996) Ankara tekesi spermasının özellikleri Ankara tekelerinden sperma genelikle suni vajen ve elektroejakülatör yöntemleriyle alınmaktadır. Suni vajenle daha çok sezon içinde sperma alınabilmesi, sezon dışında elektroejalülatörle sperma alma arayışlarını doğurmuştur. İki yöntemle alınan spermaların kaliteleri üzerinde farklı görüşlerin olduğu belirtilmektedir (Tekin ve ark., 1996; Leboeuf ve ark., 2000). Ankara tekesinin spermatolojik özellikleri ise şöyle sıralanabilir; Ejakülat miktarı: 1,44-1,07 ml, spermatozoa motilitesi: %81,1-83,2 spermatozoa yoğunluğu: 2,1-3,1X10 9 /ml, anormal spermatozoa oranı: %2,1-4,2, ereksiyon değeri 2,2, yetiştirme mevsiminde günlük spermatozoa üretimi 4,0-6,4 X 10 9, ph: 6,7 (Tekin ve Muyan, 1985; Tekin ve ark., 1996; Leboeuf ve ark., 2000) Tekelerde dölerme fizyolojisi Spermatozoon üretimi (Spermatogenezis) Spermatogenezis işlemi, fötal hayatta gelişmektedir. Erken fötal hayatta seminifer tubül duvarlarında yer alan primordial hücrelerden spermatogonia denilen kök hücreler şekillenmektedir. Gelişen spermatogonialar canlının pubertaya erişim zamanına kadar inaktif kalır, daha sonra ise spermatozoon üretimi için bölünmeye başlarlar. Kök hücre spermatogoniumları diploid sayıda kromozom (2n=60) içerir ve pubertasta daha fazla sayıda diploid spermatozoa üretmek içi mitotik bölünmelere uğrar. Bölünmeler sonrası oluşan yeni spermatogoniumlar kök hücrelerden farklı olup, son aşamada primer spermatositlere farklılaşır. Primer spermatositlerin miyotik bölünmeleriyle de spermatidler oluşur. Spermatidler spermiozis işlemiyle bir takım morfolojik değişime uğrayarak spermatozoa halini alırlar. Bu süreç yaklaşık olarak 22 gün sürer.

12 Testis fonksiyonlarının hormonal kontrolü Testis fonksiyonları, spermatozoa ve androjenlerin üretimi, hipofizden salgılanan gonadotropinler tarafından sağlanmakta ve düzenlenmektedir. Gonadotropinlerin üretimi ve salınımı, çevresel uyarımlarla ilişkide olan beynin diğer merkezleriyle kontrol edilmektedir. Gonadotropinlerden LH (lüteinleştirici hormon), leydig hücreleri üzerine etkiyerek androjen üretimini uyarır. Androjenler ise spermatogenezisi başlatmaları için seminifer tubüller üzerine etkimektedir. FSH (folikül stimüle edici hormon) un rolü tam açık olmasa da pubertasta ve yetiştirme mevsiminde spermatozoa üretiminin başlaması için gereklidir. Fakat, spermatogenezisin devamı için gerekli olmadığı görülmektedir. Gonadotropinlerin salgılanmasını etkileyen ana dış kaynaklı uyarım gün uzunluğudur (Evans ve Maxwell, 1987). Fotoperiyodik etkiyle gün uzunluğunun kısalması, gonadotropin salgılanmasını artırarak testis fonksiyonlarının uyarılmasına neden olur. Uyarımda bulunan diğer faktörler, sıcaklık, besleme, hastalıklar, stres ve sosyal uyarımdır. Bu uyarımlar sonrası spermatozoon kalitesinde (yoğunluk, motilite ve dondurulabilirlik) artma gözlenmektedir (Evans ve Maxwell, 1987; Karagiannidis ve ark., 2000; Gacitua ve Arav, 2005). Yetiştirme mevsimi dışında gün uzunluğuna bağlı gonadotropin salınımında bir azalma olmasına rağmen, spermatozoa ve androjen üretimi için yeterli düzeyde gonadotropin üretimi gerçekleşmektedir. Yine de bu dönemde testis büyüklüğünde, spermotozoa üretiminde ve fertilitede düşmeler olmaktadır (Evans ve Maxwell, 1987) Çiftleşme ve ejakülasyon Tekeler normalde östrus gösteren dişilere ilgi gösterme şeklinde tepki verirler. Bu durum, temel seksüel uyarımın olfaktorik olduğunu göstermektedir. Olfaktorik uyarımda, feromon denilen kimyasal mesajların karşı cinsiyet tarafından algılanıp fiziksel ve davranışsal değişimlerin şekillenmesine yol açılmaktadır. Bu değişimler sonrasında erkekte dişiyle çiftleşme isteği ve davranışları meydana gelerek, koitus ile kısa süren ejakülasyon oluşmakta ve çiftleşme esnasında sperma anterior vajinaya bırakılmaktadır (Evans ve Maxwell, 1987).

13 Teke spermasının dondurularak uzun süreli saklanması Sperma başarıyla dondurulan ilk canlı hücrelerden olması bakımından önem taşımaktadır. Memeli spermatozoonlarının dondurulması ile kabul edilebilir fertilite sonuçların elde edilmesi bazı önemli faktörlerin etkisindedir. Bunlar arasında dondurma teknikleri, uygun sulandırıcı, spermatozoa sulandırma oranı, dondurma ve çözdürme hızı, türlere özgü spermatozoon fizyolojisi ve özellikleri sayılabilir (Purdy, 2006). Ayrıca, farklı türlere ait sperma hücrelerinin dondurulması, hücrelerin farklı büyüklük, şekil ve lipit bileşenine sahip olmasından dolayı ayrıcalık göstermektedir. Keçi yetiştiriciliğinde, dondurulmuş spermanın servikal tohumlamada kullanımı henüz tatmin edici sonuçlar vermemektedir. Spermanın dondurulması spermatozoonda yapısal, biyokimysal ve fonksiyonel hasara neden olarak, dişi genital kanaldaki fizyolojik uyarımlara karşı spermatozoonda prematür aktivasyona ve spermatozoon motilitesi, canlılığı ve fertilitesinde düşüşlere neden olabilmektedir (Maxwell ve Watson, 1996; Purdy, 2006). Söz konusu parametreler üzerinde yetiştirme mevsimin etkinliği önemli görülmekte ve yaygın görüşün dondurulacak spermanın normal yetiştirme mevsiminde alınması yönünde olmaktadır (Leboeuf ve ark., 2000). Bu bakımdan, sun i tohumlamanın entansif keçi üretim ve yetiştiriciliğinde önemli yere sahip olmasının yanında, elde edilecek sonuçlarda spermanın dondurulmasındaki başarı da önemli rol oynamaktadır (Purdy, 2006). Teke spermasının dondurma-çözdürme sonrası motilite, canlılık ve fertilitesinde saklama süresinin etkisi tartışmalıdır. Kimi araştırıcılar (Waide ve ark.,1977; Shamsuddin ve ark., 2000), saklama süresi uzunluğunun bu parametrelerde düşüşlere neden olduğunu bildirmesine rağmen, bazı çalışmalarda saklama süresinin etkili olmadığı belirtilmiştir (Ritar ve Salamon, 1983; Leboeuf ve ark., 2000) Teke spermasında dondurma işlemlerini etkileyen faktörler Teke spermasının dondurulmasnda birçok faktör etkili olmaktadır. Bunlar şöyle sıralanabilir (Leboeuf ve ark., 2000): 1- Spermanın dondurulmasında infertil ya da damızlık değeri olmayan erkeklerin kullanılması

14 7 2- Seminal plazmalı ya da plazmasız ejakülatların kullanılması, yıkama metotları, yıkama sıvısının bileşenleri, yıkama oranı ve santrifüj işlemi. 3- Sulandırıcının bileşenleri ve sulandırıcıda yumurta sarısının bulunup bulunmaması. 4- Sulandırma metotları, katılan gliserol oranı. 5- Ekilibrasyon zamanı. 6- Spermanın payet ya da pelet biçiminde dondurulması Teke spermasının dondurulmasında kullanılan sulandırıcılar İzotonik sulandırıcılarla yapılan dondurma ve çözdürme işlemleri, hücre membranı lipit katmanlarında gelişen değişikliklere bağlı olarak baş, akrozom ve kuyruk kısımlarında membran hasarına yol açmaktadır (Holt and North, 1991). Ortamın hipertonik olmasında ise, plazma ve akrozomal membran bütünlüğü yanında, mitokondriyi de içeren spermatozoon yapısı korunmaktadır. Buna disakkritlerle (trehaloz) oluşturulan hipertonik ortamın donma sırasındaki kristal formasyonunu azaltması ve oluşan intraselüler dehidrasyon kontrolünün rol oynadığı belirtilmektedir (Aisen ve ark., 2000; Aisen ve ark., 2005). Teke spermasının dondurulmasında en yaygın olarak kullanılan sulandırıcılar arasında, yağsız inek sütü-0,5 M glukoz, Tris-sitrik asit-glikoz-yumurta sarısı ve sitrat-glikoz-yumurta sarısı sulandırıları sayılabilir. İlk iki sulandırıcı Ankara tekesi spermasının dondurulmasında yoğun olarak kullanılmaktadır. Sulandırma oranlarının artması sulandırıcı bileşenlerinin yoğunluklarını azaltmayı gerektirmekte, daha düşük ozmolariteye sahip sulandırıcı oluşturulmasını sağlamaktadır (Corteel, 1975; Evans ve Maxwell, 1987; Ritar ve ark., 1990a; Purdy, 2006) Teke spermasının sulandırması ve sulandırma oranı Teke spermasının sulandırılması bir ya da iki etapta yapılabilmektedir. İki etaplı sulandırmada, spermanın tekeden alınımından sonra kriyoprotektan içermeyen sulandırıcıyla final sulandırma oranının yarısıyla sulandırılmakta ve daha sonra 5 o C ta üzerine kriyoprotektan içeren sulandırıcı ilk sulandırıcı miktarı kadar eklenerek final sulandırma işlemi gerçekleştirilmektedir. İki etaplı sulandırmanın diğerine göre bir üstünlüğünün olmadığı görülmüştür. Tek etaplı sulandırma,

15 8 sulandırıcı hazırlama ve spermanın sulandırılma işlemini kolaylaştırması bakımından tercih edilmektedir (Evans ve Maxwell, 1987). Spermanın sulandırılmasında sulandırıcıya katılan yumurta sarısı ve sütün sperma hücrelerine zararlı etkileri olduğu belirtilmektedir. Söz konusu etkinin, yumurta sarısında bulunan lesitinlerin seminal plazmada bulunan fosfolipaz A enzimiyle ve süt sulandırıcısında bulunan bir komponent ile de bulbouretral bez kökenli SPU 3 olarak adlandırılan protein fraksiyonunun reaksiyona girerek, spermatozoanın soğutma ve dondurulmasında yaşamını baskıladığı, akrozom reaksiyonunu uyardığı ve hücre kromatinlerinde ayrışmalara neden olduğu bildirilmektedir (Iritani ve Nishikawa, 1961; Pellicer-Rubio ve Combarnous, 1998; Leboeuf ve ark., 2000). Belirtilen olumsuz etkilerin giderilmesi için, spermanın yıkanarak seminal plazmasından ayrılması gerektiği belirtilmektedir (Leboeuf ve ark, 2000). Spermayı yıkayarak seminal plazmasından ayırma işlemi, önce 1:5-1:10 oranında sulandırmayı ve dakika g de santrifüj işlemini gerektirmektedir. Yapılacak çift yıkama işlemi tek yıkama işlemine göre daha etkili sonuçlar vermektedir (Ritar ve ark., 1990a; Salamon ve Ritar, 1982). Fakat bazı yazarlar, yıkama işleminin zaman kaybettirici bir işlem olduğunu, yıkamayla seminal plazmadaki bazı yararlı etkenlerin kaybedildiği ve yıkama işlemi olmaksızın yapılacak dondurma işleminde diğer işleme göre çözüm sonu spermatozoon kalitesi üzerine bir faklılığın olmadığını belirtmektedir (Ritar, 1993; Villemure ve ark., 2003; Purdy, 2006). Iritani (1961) ve Roy ( 1957) fosfolipaz A aktivitesinin 2-3 dakikada 60 o C ta bozulduğunu göstermiştir. Ritar ve Salamon (1983), yıkanmaksızın dondurulacak spermaya %1,5 oranında yumurta sarısının katılabileceğini tavsiye etmişlerdir. Daşkın ve Tekin (1996) ise, yumurta sarısının teke spermasının sulandırılıp dondurulması üzerine olumlu etkilerinin olduğunu gözlemlemiştir. Spermanın sulandırma oranı, optimum tohumlama dozunun eldesinde önemli olmaktadır. Sulandırma işleminin 1:1-1:23 (sperma: sulandırıcı) oranları arasında yapılması tohumlamada optimum başarıyı sağlamaktadır (Purdy, 2006). Bazı araştırıcılar da (Ritar ve Salamon, 1983; Ritar ve ark., 1990b) başarılı dondurma ve fertilite oranının ml de X 10 6 oranında spermatozoaya sahip numunelerden elde edildiğini bildirmektedirler. Servikal tohumlamada kullanılacak dondurulmuşçözdürülmüş spermanın bir tohumlama dozunda yaklaşık 200 milyon, serviks

16 9 aracılığıyla yapılacak intrauterin tohumlamada 60 milyon, laparoskopik tohumlamada ise 20 milyon motil spermatozoa olması gerektiği belirtilmektedir (Evans ve Maxwell, 1987) Teke spermasının dondurulması-çözdürülmesi Yıkama işlemi yapılarak/yapılmaksızın yaklaşık olarak 1,5-4 saatte 4-6 o C a soğutulan sulandırılmış sperma, kuru buz üzerindeki yuvacıklarda pelet formunda ya da sıvı azot buharında payetlerde dondurulmaktadır (Evans ve Maxwell, 1987; Purdy, 2006). Pelet şeklinde dondurma işlemi, 0,1-0,3 ml lik sperma hacimleri halinde 79 o C taki kuru buz kalıpları üzerinde 2-4 dakikada gerçekleşmekte, donan peletler sıvı azotta (-196 o C) saklanmaktadır. Spermanın pelet şeklinde dondurulması maliyetini düşürmekte, tohumlamada kullanılmasını daha kolay hale getirmekte ve spermanın soğutulması esnasında gelişebilecek seeding olayına katkı sağlayarak çözüm sonrası spermatozoa motilitesi ve fertilitesinde payet şeklinde dondurmaya göre daha iyi sonuç vermektedir (Evans ve Maxwell, 1987; Ritar ve ark., 1990b; Leboeuf ve ark, 2000; Purdy, 2006). Ancak dondurulan peletlerin saklanması esnasında kontaminasyon riski, spermanın dozlanmasında ve depolanması sırasındaki markalama işlemlerinde güçlükler gözlenmektedir (Purdy, 2006; Lebeouf, 2000). Spermanın payette dondurulma işlemi, 0,25-0,5 ml lik payetlerde sıvı azot buharının 3-4 cm üzerinde 7-8 dakikada yapılmaktadır. Programlanabilir dondurma cihazı, büyük miktarlarda payette spermanın dondurulması ve soğutma/dondurma hızının kontrollü yapılmasında kullanılmaktadır. Kontrollü dondurma işleminde genellikle 4-5 o C tan -80 o C a 7-15 dakikada soğutma ve sıvı azota nakil; 4 o C tan 5 o C a 4 o C/dakika hızda, 110 o C a 25 o C/hızda, 140 o C a 35 o C/hızda soğutma ve sıvı azota nakil protokolleri kullanılmaktadır. Payette dondurma işlemi, pelet şeklinde dondurma işleme göre daha pahalı ve daha fazla iş gücünü doğurmaktadır (Leboeuf ve ark, 2000; Purdy, 2006). Teke spermasının dondurulmasında hızlı dondurma metodu, kriyoprotektif etkileri nedeniyle yavaş dondurmaya tercih edilmektedir. Çözüm sonu spermatozoon motilitesi, canlılığı ve fertilitesindeki farklılıklar soğutma hızına bağlanabilmekle beraber dondurma tekniği, spermanın dondurulmasına kadar olan işlemler,

17 10 tohumlama teknikleri gibi faktörler de teke spermasının fertilitesinde önem taşımaktadır (Purdy, 2006). Spermanın çözdürülmesi ise pelet ya da payet formunda dondurulmasına göre değişmektedir. Pelet formunun çözdürülmesi 37 o C lık çözdürme sıvılarında yapılmaktadır. Payet formunun çözdürülmesinde ise birçok çözdürme ısı ve süreleri kullanılmaktadır. Bu ısı ve süreleri; 37 o C ta saniye, 40 o C a 20 saniye, 70 o C ta 7 saniyedir. Fakat ilk iki çözdürme protokolü başarıyla kullanılmaktadır. 70 o C ta 7 saniyede çözüm işlemi, en iyi sonuçları vermesinin yanında saha koşullarında uygulanabilirliğini sınırlı tutmaktadır (Evans ve Maxwell, 1987; Purdy, 2006) Teke spermasının dondurulmasında kullanılan kriyoprotektanlar Spermanın dondurulmasında kullanılacak sulandırıcıda kryoprotektif özellikli maddelerin bulunması gereklidir. Kriyoprotektanlar (soğuk şokuna karşı koruyucu maddeler) hücrenin soğutulması, dondurulması ve çözdürülmesi esnasında gelişen fiziksel, kimyasal ve oksidatif stresi ve bunlardan doğan ısı şoku, ozmotik değişim, intraselüler kristal oluşumu ve oluşan serbest oksijen radikallerinin oluşturduğu hasarları azaltmak amacıyla kullanılmakta, direk olarak çözüm sonu spermatolojik parametreleri ve fertiliteyi etkilemektedir. İnternal özellikli kriyoprotektanların (gliserol, dimetilsülfoksit, etilen glikol) hücre içinde oluşan donma ve çözünme esnasında gelişen hasara karşı, bazı eksternal kriyoprotektanların ise (dissakkartiler, trehaloz, sükroz, raffinoz, laktoz, dekstran; yumurta sarısı; antioksidanlar, redükte glutatyon, okside glutatyon, vitamin C; yüzey genişletici maddeler, SDS; EDTA) hücre dışında benzer etkisi son zamanlarda anlaşılmış, sperma sulandırıcılarında kullanılmaya başlanmıştır (Chen ve ark., 1993; Ball ve ark., 2001; Aisen ve ark., 2005; Funahashia ve Sano, 2005). Hücre dondurulmadan önce kriyoprotektanlarla inkubasyona tabi tutularak, intraselüler bakımdan dengeye gelmesi sağlanmaktadır. Kriyoprotektanların bu noktada en önemli özellikleri; düşük moleküler ağırlığa sahip olmaları ve belirli oranlarda katıldığında toksik etki göstermemeleri olmaktadır (Palasız ve Mapletopt, 1996; Isachenko ve ark., 2000). Hücre dondurma sıvılarındaki kryoprotektanların toksitesini azaltmak için, hücrelerin kryoprotektanlara maruz kalma süresinin kısaltılması ve geçirgen özelliği olmayan kriyoprotektanların kullanımı gibi

18 11 uygulamalar önerilmektaedir (Palasız ve Mapletopt, 1996; Massip, 2001). Kriyoprotektanlar biyoenerjik denge üzerine doğrudan etki yaparlar. Bu proseste membranlardaki iyon değişimleri ve fosforilasyon/defosforilasyon geniş ölçüde ATP tüketimini artırmaktadır. Kriyoprotektanların kimyasal yapısındaki C/OH oranının yüksek olması, koruyucu etkinliğini azaltmaktadır (Arav ve ark., 1993; Storey ve ark., 1998). Sulandırıcıda kullanılacak oranları ve koruyucu etkileri hayvan türüne, hücredeki geçirgenlik farklılıklarına, spermanın dondurma metotlarına, sulandırıcının bileşenlerine ve tonisitesine bağlıdır (Evans ve Maxwell, 1987; Jarkson ve ark., 1997). İnternal kryoprotektanlar (hücreye penetrasyon özelliğine sahip olanlar), ozmotik olarak spermatozoanın dehidrasyonuna neden olan eriyiklerdir. Dehidrasyon işleminin başlamasından kısa bir süre sonra, ortamdaki kriyoprotektan ve su dengeye gelerek, benzer intra- ve ekstrasellüler yoğunluğa ulaşırlar. Spermatozoanın düşük oranda intrasellüler suya sahip olması, hücrelerinin donma noktasını düşürmesi ve daha az oranda intrasellüler buz kristallerinin oluşumuna yol açması, hücrenin hasar görmesini ve fertilite oranındaki düşüşleri azaltmaktadır. İnternal kriyoprotektanlar, hücre membranı lipit ve proteinlerinde yeni düzenlemelere neden olur. Bu düzenleme membran esnekliğinde artışı, düşük ısılarda daha fazla dehidrasyonu, sonuçta ta dondurma işlemi sonrası hücrenin yaşama gücünü artırmayı beraberinde getirmektedir (Mazur, 1996; Palasız ve Mapleyopt, 1996; Gao ve Crister, 2000; Purdy, 2006). Teke spermasının dondurulmasında bir çok internal özellikli kriyoprotektan (gliserol, DMSO, etilen glikol, propilen glikol ve bunların kombinasyonları) denenmiş, fakat en fazla kullanılanı çözüm sonu en iyi koruma ve iyileşmeyi sağlamasından dolayı gliserol olmuştur. Sulandırıcıya katım oranları ise %4-7 arasında değişim göstermektedir. Gliserolün sulandırıcıya tek adımda ve 37 o C ta katılması diğer katım prosedürlerine göre optimum sonucu sağlamaktadır (Leboeuf ve ark, 2000; Purdy, 2006). Eksternal kriyoprotektanlar (hücreye penetrasyon özelliğine sahip olmayanlar) spermatozoon plazma membranını geçemedikleri için ekstrasellüler olarak etkilerinden dolayı, plazma membranında değişimlere; sıvı ve katyonlara karşı permeabilite artışına yol açmakta ve ekstrasellüler ortamda gelişen kristalizasyonu azaltmaktadır. Ayrıca lipit peroksidasyonunu ve hücre membranındaki esnekliğinin

19 12 kaybını önledikleri, ayrıca da membran proteinlerinde stabilizasyon sağladıkları bilinmektedir Sulandırıcıya katılmalarnda internal kriyoprotektanlara sinerjik etki yapmakta ve gelişecek olası toksik etkileri azaltmaktadır (McWilliams ve ark., 1995; Cabria ve ark., 2001; Purdy, 2006) Sakkaritler Eksternal kriyoprotektan olarak görev yapan sakkaritler ozmotik basıncı artırarak hücresel dehidrasyonu uyarırlar. Bu amaçla intrasellüler kristal oluşum sıklılığını daha da azaltmış olurlar. Şekerler spermatozoon plazma membranındaki fosfolipitlerle etkileşime girerek, donma işleminde daha uygun yaşam ortamı sağlama amacıyla, membranlarda yeni düzenlemelere yol açarlar. Trehaloz, iki D-glikoz molekülünün bağlanmasıyla oluşmuş bir disakkarit bileşiğidir (Richards ve ark., 2002). Tam olarak etki mekanizması bilinmemekle birlikte, spermatozoa plazma membranına penetre olduğu, donma ve çözüm esnasında membran fosfolipitlerinin polar baş gruplarıyla hidrojen bağları kurarak yüzey artığı sağladığı, fosfolipitlerde meydana gelen ısı değişimlerini, fosfolipit açil zincirleri arasındaki van der waals etkileşimlerini, reaktif oksijen radikallerinin salınımını ve bu salınımla beraber spermatozoon ve sperma plazmasındaki redükte glutatyon (GSH) tükenimini azalttığı ileri sürülmektedir. Ayrıca hücreyle ortam arasında ozmotik tamponlayıcı olarak görev yaparak soğuk şokuna karşı koruma sağlamaktadır (Mcwilliams ve ark., 1995; Gao ve Crister, 2000; Aboagla ve Terada, 2003; Aisen ve ark., 2005; Purdy, 2006). Son yıllarda trehaloz teke spermasının dondurulmasında sulandırıcıya katılmaya başlamış, sulandırıcıya mm oranlarında ilavesi, çözüm sonrası %66,0±2,9-78,0±1,8 oranları arasında motilite eldesi önemli bulunmuştur. Sağlam akrozom yönüyle en yüksek oran (%60 üzeri) ise yine trehaloz içeren sulandırıcıdan elde edilmiştir. Trehaloz dondurma öncesi ortamda teke spermatozoasında membran bütünlük ve esnekliğini de artırmıştır (Aboagla ve Terada, 2003; Purdy, 2006). Yapılan bir çalışmada, koç spermasının dondurulmasında, sulandırıcıya 100 mm trehaloz eklenmesi, çözüm sonu motiliteyi (%65), akrozom bütünlüğünü (%75) ve HOS test oranını (%50) kontrole göre önemli oranda koruyarak iyileştirmiş,

20 13 fertilitede ortalama %45,85 oranda gebelik elde edilmiştir (Aisen ve ark., 2000; Aisen ve ark., 2002). Koçlarda trehalozun (50 mm) çözüm sonrası sperma ve oksidatif stres üzerine etkilerini araştıran bir grup araştırmacı da (Bucak ve ark., 2007), trehalozun çözüm sonrası spermatozoon motilitesi ve canlılığında önemli oranda (%59,0±2,9 ve %66,0±4,4) artışlara neden olduğunu göstermiştir. Aynı çalışmada trehaloz kontrol grubuna göre daha düşük lipid peroksidasyon oluşumunu (8,6±0,2 ve 9,2±0,5 nmol/ml) vermiş ve GSH ve vit E seviyelerini de önemli oranda (2,3±0,8 nmol/ml ve 3,3±0,2 mg/dl) yükseltmiştir Kas hücresinin dondurulmasında trehalozun membran yapısını ve fonksiyonunu koruduğu, hücre katmanlarını stabilize ettiği ve intramembranöz partiküllerin agregasyonunu önlediği gösterilmiştir (Rudolph ve Crowe, 1985; Anchordoguy ve ark., 1987). Bir grup araştırıcı (Storey ve ark., 1998b), farelerde yaptıkları bir çalışmada, sulandırıcıya katılan trehalozun diğer bazı poliol grubu kriyoprotektanlara ve raffinoza karşı dondurma öncesi ve sonrası plazma membran bütünlüğünde (%94±3 ve %48±6) önemli oranda koruma sağlamıştır Koçlarda ise gliserolün yokluğunda yapılan dondurma işleminde trehaloz ve sükrozun glikoza göre daha yüksek çözüm sonu motilitesi verdiği görülmüştür (Molina ve ark., 1994). Fakat bazı araştırıcılar da (Chen ve ark. 1993; Foote ve ark., 1993) boğalarda yaptıkları çalışmalarda, trehalozun (0,05-0,10 M) kontrole göre çözüm sonrası motilite (%60 ve %65) ve fertilite üzerinde (%73,1 ve %71,3) önemli etki yapmadığını göstermişledir Bu durumun ise trehalozun düşük dozda (0,05-0,1 M) kullanımından ileri geldiğini bildirilmiştir (Aboagla ve Terada, 2003). Teke spermasının dondurulmasında sulandırıcıya ilave edilen trehaloz, kontrol grubuna göre çözüm sonu motilite oranında koruma sağlamazken (%54,0±2,9 ve %53,0±3,0), ölü oranı (%25,0±1,3 ve %27,6±1,5) ve anormal spermatozoa oranı (%5,3±0,7 ve %10,4±1,0) bakımından en iyi korumayı sağlamıştır (Bucak ve Uysal, 2007). Sakkaritlerin koruyucu etkilerini molar ya da kitle konsantrasyonlarına göre gösterdikleri tartışmalıdır. Molar etkinin ortamdaki elektrolit yoğunluğunu bastırarak ya da ortamdaki donmamış kanalların büyümesini sağlayarak gösterildiği

21 14 belirtilmektedir. Şekerlerin kitlesel etkileri ise eksternal ortamdaki metastable kristal formasyonu na katkı sağlayarak gösterdikleri sanılmaktadır. Son aylarda yapılan bir çalışmada şekerlerin kitlesel yoğunluğunun molar miktarlarına göre daha da etkinlik gösterdiği saptanmıştır (Koshimoto ve Mazur, 2002) Antioksidanlar Spermanın dondurulması-çözdürülmesi esnasında oluşan membran lipit faz değişime, ozmotik-mekanik strese ve ortamdaki serbest oksijene bağlı olarak gelişen lipit peroksidasyonu ve bunun sonucu olarak oluşan serbest oksijen radikalleri (ROS; başlıcaları: süperoksit anyon radikali, hidroksi radikali, hidrojen peroksit), ekstraselüler kristal oluşumu, bunların sonucu olarak gelişen membran proteinlerindeki denaturasyon, hücre organellerinde yapısal deformasyon, DNA da kırılmalar ve hücresel lizis antioksidanların ilavesiyle azaltılabilmekte, çözüm sonu spermatozoon fonksiyonlarını iyileştirmektedir (Aitken, 1995; Maxwell ve Watson, 1996; Oehninger ve ark., 2000; Bilodeau ve ark., 2002). Antioksidanlar bu etkilerini ortamdaki oksijen yoğunluğunu azaltarak, gelişecek ya da başlamış olan zinzir reaksiyonunu önleyerek/kırarak, ortamda oluşmuş peroksitleri parçalayarak etki gösterirler (Cheeseman ve Slater, 1993; Marxwell, 1995; Sardesai, 1995; Thomas, 1995). Spermanın dondurulması-çözdürülmesi, oluşan ROS ürünlerinin yarattığı oksidatif stresle ve spermatozoon membranındaki sülfidril gruplarının yeniden düzenlenmesiyle yakın ilişkilidir. Bununla birlikte, sülfidril gruplarında açılmalar; miktar ve dağılımında değişimler, spermatozoada prematür kapasitasyon, spermadaki bazı antioksidan seviyelerinde düşme ve taze spermaya göre lipit peroksidazyonuna daha duyarlı hal meydana gelmektedir (O flaberty ve ark.,1997; Bilodeau ve ark., 2000; Mazur ve ark., 2000; Chatterjee ve ark., 2001). Bu sırada gelişen ısı değişimleri de membran sol-jel dengesini bozan stresin bir diğer kaynağıdır (Quinn, 1989). Serbest oksijen radikallerinin toksik etkilerine karşı koymak için, spermatozoa ve seminal plazma lipit peroksidasyonuna karşı bir takım antioksidanları içermektedir (Alvarez ve Storey, 1983; Nissen ve Kreysel, 1983; Jeulin ve ark., 1989). Bu antioksidanların bir kısmı ortamda oluşan ROS ürünleri

22 15 temizleyicisi (albumin, taurin, hipotaurin, vitamin E), diğer bir kısmı enzimsel [katalaz (CAT), superoksit dismutaz (SOD), glutatyon peroksidaz (GP)], bir grup ise zincir reaksiyonlarını kırıcısı (ürat, askorbik asit, vit E, thiol bileşikleri) olarak etkimektedir (Halliwell ve Gutteridge, 1989; Sikka, 1996). Fakat bu antioksidan sistemi, ROS ürünlerinin olası toksik etkilerine ve oksidatif hasara karşı koymada yeterli gelmemektedir (Taylor, 2001). Bu amaçla sperma sulandırıcılara katılan bazı antioksidanların kısa ve uzun süreli saklamada ortamda oluşan lipit peroksidasyonun yarattığı oksidatif hasarı minimize ettiği ve canlılığı koruduğu saptanmıştır Spermanın kısa ve uzun süreli saklanmasında antioksidanların etkisi Koç spermasının 7-14 günlük kısa süreli saklanmasında süperoksit dismutaz (SOD, 800 U/ml) ve CAT (200 U/ml) spermatozoanın yaşama süresini, motilitesini, akrozom bütünlüğünü ve fertilitesini iyileştirdiği rapor edilmiştir (Stojanov ve ark., 1994; Maxwell ve Stojanov, 1996). Ayrıca dondurulması üzerinde de, sulandırıcıya katılan SOD, katalaz ve taurinin çözüm sonu motiliteyi ve fertiliteyi iyileştirdiği belirtilmiştir (Maxwell ve Watson, 1996; Sanchez-Partida ve ark., 1997; Uysal ve ark., 2000). Teke spermasında da sulandırıcıya ilave edilen SOD, katalaz ve sitokrom C altı, GP ise on iki günlük kısa süreli saklamada spermatozoon canlılığında artışlar sağlamış, (Stojanov ve ark., 1994) teke spermasının dondurulmasında da, sulandırıcıya katılan katalaz (200 U/ml), sodyum pruvat (0,11 mg/ml) ın çözüm öncesi ve sonrası progressif motiliteyi artırdığı gözlenmiştir (Khalifa ve El-Saidy, 2006). Aygırlarda yapılan bir çalışmada sulandırıcıya ilave edilen antioksidanların (katalaz, BHT, vitamin E, vitamin C, tempo) 72. saate kadar saklanan spermatozoa motilitesinde önemli oranda bir iyileşme yapmadığı gösterilmiştir (Ball ve ark., 2001). Fakat bu antioksidanlardan (BHT, 0,02-1,25 mm; vitamin E, 1-80 µg/ml; tempo, 0,039-1,25 µg/ml) vitamin C (1-400µg/ml) nin dışındakiler hindi spermasının kısa süreli saklanmasında (48 saat) spermatozoa yaşamını, membran bütünlüğünü ve motilitesini iyileştirmiştir. Araştırma sonuçları itibariyle vitamin C nin düşük dozlarda katılmasıyla antioksidan görevi gördüğünü, yüksek dozlarda katılması ise protektif özellikte olduğunu düşündürmektedir (Donoghue ve Donoghue, 1997).

23 Glutatyonun gamet ve embriyo üzerine etkisi Glutatyon, lipit peroksidasyonu sonucu oluşan ROS ürünlerine karşı koruyucu etkisi non-enzimatik özelliğinde olan, memeli sperma ve genital kanalında da bulunan ve protein yapısında olmayan bir thiol, L-g-glutamyl-L-cysteinylglycine, bileşidir. Bu thiol bileşiği, hücre içi redoks işleminin sürdürülmesi yanında hücredeki ekzojen ve endojen bileşimlerin antioksidayonunda ve detoksifikasyonunda önemli rol oynar. Antioksidan sistemdeki rölü, suda çözünen antioksidanları rejenere etme yateneğine sahip olmasıdır. Memeli spermasındaki glutatyon seviyesi türe özgü farklılıklar gösterir (Irvine, 1996; Baumber ve ark., 2000; Luberda, 2005). Glutatyon, redükte glutatyon (GSH) ve okside glutatyon (GSSG) olmak üzere iki formda bulunmaktadır. ROS ürünlerine karşı glutatyonun koruyucu etkisi, glutatyon peroksidaz, glutatyon redüktaz gibi enzimlerle etkileşime girmesiyle kolaylaştırılır. Canlı dokularda, yapısında selenyum içeren enzim olan glutatyon peroksidaz, GSH varlığında peroksidasyon sonucu oluşmuş hidrojen peroksit ve lipit peroksitlerinin indirgenmesini katalize ederek, GSSG ye dönüşür. Bu dönüşüm sırasında GSH, glutatyon peroksidazın substratı görevi görmesiyle peroksidayonu yavaşlatarak motilite kaybını, intrasellüler enzim salınımını ve kromatin hasarını azaltır. Tersine işlemde ise, pentoz fosfat yoluyla GSSG, glutatyon redüktaz enzimiyle nikotinamid adenin dinükleotid fosfat (NADPH) varlığında GSH a indirgenmektedir (Aitken, 1989; Sinha ve ark., 1996; Luberda, 2001). Spermatozoanın aerobik ortamda inkübasyonunda intraselüler GSH ın azalması, GSSG yoğunluğunun artışıyla ilişkili değildir. Bu işlemde GSH ın diğer moleküllerle verdiği reaksiyonlar önemli olabilmektedir. GSH daki azalmaya, membran proteinlerinin GSH ile disülfit bağlarıyla bağlanması (protein-s-s-glutatyon) ve hem GSH ın hemde GSSG nin aerobik ortamda hücre membranından dış ortama geçişi neden olmaktadır. Oluşan disülfit yapı, oksidatif atağa kaşı membran proteinlerini korumaktadır (Van Klaveren ve ark., 1997; Bilodeau ve ark., 2000). Glutatyonun sulandırıcılara katılması, ortamda bulunan ROS ürünleriyle reaksiyona girerek ve donma esnasında membran proteinlerindeki sülfür gruplarında gelişen bozulma ve dağılmayı kısmen önleyerek oksidatif hasara karşı koruyucu etkinlik oluşturur. (Shan ve ark., 1990; Chatterjee ve ark., 2001). Boğa ve domuzlarda yapılan çalışmalarda dondurma ve çözdürme işlemlerinin, spermada

24 17 bulunan doğal glutatyon seviyesini düşürdüğü saptanmıştır (Bilodeau ve ark., 2000; Gadea ve ark., 2004). Bunun yanında domuzlarda yapılan çalışmalarda sulandırıcıya ilave edilen glutatyonun kontrole göre çözüm sonrası fertiliteye (%84,6±3,8 ve %81,2±4,4) önemli katkılar yapmadığı belirtilmiştir (Gadea ve ark., 2005). Tekelerde yapılan bir çalışmada da glutatyon (5 mm) çözüm sonrası motiliteyi (%53,6±0,4), akrozom anomalilerini (%6,2±0,5) önemli oranda korumuştur. Fertilite üzerindeki etkisi ise önemli sayılmamıştır (Sinha ve ark., 1996). Glutatyonun kısa süreli saklanan koç sperması üzerine etkisi ise 6. saatte spermatozoon motilitesini (%77,9±1,8) ve 30. saatte canlı oranını (%51,7±4,4) önemli oranda korumasıyla ortaya çıkmıştır (Bucak ve Tekin, 2007). Glutatyonun fertilizasyon medyumuna ilavesi blastosist oranını artırmaktadır. Oositte ise sitoplazmik mutarasyonda ve kromatin dekondensasyonu sonrası fertilizasyonu takiben erkek pronükleus oluşumunda önemli rol oynamakta, ayrıca miyotik ağ morfolojisinin korunmasında gelişen oksidatif atağa karşı durmaktadır (Gardiner ve Reed, 1994; Eppig, 1996; Sutovsky ve Schatten, 1997; Boquest ve ark., 1999; Kim ve ark., 1999) Etilendiamintetraasetik asit (EDTA) EDTA permeabl olmayan bir şelat özelliğinde olduğundan, spermatozoon motilitesinde zararlı bir etkisi olmadığı bildirilmektedir. İnsanlarda yapılan bir çalışmada sulandırıcıya 0,5 mm ve 1 mm oranında katılması, spermatozoanın inkübasyonunda motil kalma süresine katkı sağlamaktadır (Kuo ve ark., 1998; Sørensen ve ark., 1999). EDTA in buradaki etkisi, seminal plazmada bulunan ve yüksek miktarlarıyla spermatozoon üzerinde toksik etki gösteren bazı metallerle (kalsiyum, çinko) şelat oluşturarak ortamdaki metal yoğunluğunu düşürmesi, bu nedenle de motiliteyi iyileştirmesi yönüyledir (Riffo ve ark., 1992). Tekelerde sulandırıcıya 1mg/ml dozunda EDTA in ilavesinin çözüm sonrası spermatozoon motilitesini artırdığı (%65,4) gösterilmiştir (Khalifa ve El-Saidy, 2006). Bunun yanında EDTA in yüksek oranda kullanımı, seminal plazmada bulunan çoğu metali bağlayabileceğinden spermatozoon motilitesini kötüleştirmekte ve spermisidal etki oluşturmaktadır (Sørensen ve ark., 1999; Lee ve ark., 2002; Zairi ve ark., 2005).

25 18 Koçlarda yapılan bir çalışmada dondurma/çözdürme sonrası, trehaloz ve EDTA (1,5 gram/litre) kombinasyonunun en yüksek plazma membran bütünlüğü oranını (%60) verdiği gösterilmiştir. Trehalozun membran fosfolipitlerindeki antioksidan olarak koruyucu etkisi, EDTA ile hücreden ve membrandan kalsiyumun uzaklaştırmasıyla azalmaktadır. Bu durum Ca 2+ ile trehaloz arasındaki sinerjik etkiyi göstermektedir (Aisen ve ark., 2005). Koçlardaki bir başka çalışmada da, sulandırıcıda EDTA in trehalozla kombine kullanımıyla oluşan sinerjik etki, çözüm sonrası termoresistans ( 0. ve 4.saatte) üzerinde açıkça görülmüş, sırasıyla motilite oranları %72,3, %57,6 olarak belirlenmiş, çözüm sonrası akrozom bütünlüğünde de önemli oranda (%62,4) koruma sağlanmıştır. EDTA nın yalnız kullanımı çözüm sonrası 0. saatte kontrole göre motilite üzerinde koruma sağlarken (%67,7, %63,4), 4. saatte ise önemli farklılık görülmemiştir (%27,9, %32,1 (Aisen ve ark., 2000). EDTA in etkisinin geçirgen olmayan ve suda eriyen moleküllerinin antioksidatif etki göstermesiyle şekillendiği ve hidrojen peroksitin toksik etkisini fenton tipi reaksiyonla nötralize ederek gösterdiği ortaya atılmıştır (Bilodeau ve ark., 2002). Sulandırıcılara ilave dilen EDTA in Ca 2+ ile H bağıyla birleşip kalsiyumun spermatozoon canlılığı ve akrozom bütünlüğü üzerindeki baskılayıcı etkisini elimine etmektedir (Bakas ve Disalvo, 1991; Hammertstedt, 1993; Bailey ve Buhr, 1995). Bir başka çalışmada da, EDTA (5 mm) ile kullanılan diğer bazı antioksidanların (SOD, Katalaz, pruvat) sinerjik etkisi vardır. H 2 O 2 ile inkübe edilmiş spermaya EDTA in ilavesi dondurulmuş/çözdürülmüş spermatozoon motilitesini iyileştirmiş ve intrasellüler ATP kaybını engellemiştir (Bilodeau ve ark., 2002). Yapılan bu tez çalışmasının amacı, teke sperması sulandırıcısına katılan kriyoprotektanlarla çözüm sonrası spermatolojik parametrelerin iyileştirilmesi neticesinde sahada yapılacak tohumlama uygulamalarıyla fertilite sonuçlarının artırılmasına yönelik olarak, literatürdeki söz konusu kriyoprotektanlarla ilgili bilgi eksikliğinin giderilmesi ve Ankara keçisi spermasının dondurulmasındaki etkilerinin araştırılması olmuştur.

26 19 2. Gereç ve Yöntem 2.1. Hayvan materyali ve hayvanların bakım-beslemesi Çalışmada, yetiştirme mevsimi içinde Lalahan Hayvancılık Merkez Araştırma Enstitüsü bünyesindeki Ankara tekesi sürüsünden seçilen, fertil ve 3-4 yaşlı üç baş Ankara tekesi kullanılmıştır. Hayvanlarda düzenli ve rutin sağlık kontrolleri ve aşım sezonuna girerken flushing uygulaması yapılmıştır Spermanın alınması Sperma, yetiştirme mevsimi içinde haftada iki ve her tekeden en az altı kez olmak üzere sun i vajen yardımıyla Ankara tekelerinin dişiye atlatılmasıyla alınmıştır Spermanın sulandırılması ve dondurulması Ankara tekelerinden alınan ejalülat örneklerinden makroskopik ve mikroskopik özellikleri yönüyle normospermi gösterenler karıştırılmıştır (miks ejakülat). Miks spermanın yoğunluğu hemositometrik yöntemle tespit edilerek, her payette (0,25 mm 3 ) yaklaşık 200 milyon motil spermatozoa olacak şekilde sulandırma işlemine alınmıştır. Miks spermadan dört eşit miktarda numuneler alınarak 37 o C taki su banyosundaki cam tüplerde alıkonulmuştur. Spermanın sulandırılmasında temel sulandırıcı olarak, Tris-sitrik asit-glikoz-yumurta sarısı-gliserol sulandırıcısı kullanılmıştır. Spermaların sulandırılmasında kullanılan temel sulandırıcı: Tris (Hidroksimetilaminometan) 375 mm Sitrik asit 124 mm Glikoz 41,625 mm Distile suyla 100 ml ye tamamlanmış ve %9 oranında yumurta sarısı ve % 6 oranında gliserol eklenmiştir. Temel sulandırıcının ph sı 6,8-7,0 olarak ayarlanmıştır. Sulandırma grupları, kontrol (temel sulandırıcı) ve bu sulandırıcıya farklı oranlarda üç ayrı kriyoprotektan katılmış 10 ml lik sulandırıcılardan oluşmuştur.

27 20 Kontrol ve kriyoprotektan içeren sulandırıcı grupları: 1- Temel sulandırıcı + Trehaloz (100 mm) + EDTA (0,015 gr/10 ml) 2- Temel sulandırıcı + Okside glutatyon (GSSG, 5 mm) 3- Temel sulandırıcı + Trehaloz + EDTA + GSSG (Kombine) 4- Temel sulandırıcı (Kontrol) Miks ejakülattan her bir deney tüpüne 0,5 ml sperma konulduktan sonra belirtilen sulandırıcılarla sulandırma işlemini takiben payetlere çekilerek 2,5 saat +5 o C ta ekilibrasyona bırakılmıştır. Ekilibrasyonu izleyen süreçte sıvı azot buharında dondurulan (~-100 o C) sperma numuneleri -194 o C taki sıvı azotta değelendirilmek üzere saklanmıştır.

28 21 Resim 1. Çalışmada kullanılan Ankara tekeleri Resim 2. Spermanın alınması ve sulandırılmasında kullanılan ekipmanlar Resim 3. Suni vagen ile tekeden spermanın alınması Resim 4. Tekelerden alınan ejakülatların bir tüpte miks yapılması

29 Resim 5. Spermanın sulandırılmasında kullanılan sulandırıcı grupları Resim 6. Spermanın sulandırma işlemi 22

30 Spermanın in vitro değerlendirilmesi Nativ spermada değerlendirme Miks edilmiş ejakülatlarda spermatolojik özellikler [toplam miktar, motilite, yoğunluk, anormal spermatozoa oranı, ölü spermatozoa oranı, hipoozmotik şişme testi (HOST)] belirlenmiştir Dondurulmuş-çözdürülmüş spermada değerlendirme Dondurulan sperma örnekleri, su banyosunda 37 o C ta 20 saniyede çözdürülmüştür. Çözdürülmüş her bir sperma numunesinde spermatozoa motilitesi, anormal spermtozoa oranı, ölü spermatozoa oranı ve HOST yönüyle spermatolojik özellikler belirlenmiş ve karşılaştırılmıştır Sperma değerlendirme parametreleri Toplam miktar Ankara tekelerinden alınan ejakülat örnekleri dereceli bir tüpte miks edildikten sonra ml olarak miktarı kaydedilmiştir Spermatozoa motilitesi Motilitesi tayin edilecek miks spermadan ısıtma tablalı mikroskopta lamın üzerine bir damla alınarak üzeri lamel ile kapatılmıştır. Mikroskop sahasında X200 büyütmeli objektifte ileri yönde aktif düzgün hareket eden spermatozoanın oranı (%) motilite değeri olarak kaydedilmiştir Anormal spermatozoa oranı Sperma numunelerinde anormal spermatozoa oranı sıvı fikzasyon yöntemi ile belirlenmiştir. Fikzasyon amaçlı 0,5 ml Hancock sıvısı içine 1-2 damla sperma numunesi damlatılmıştır. İyice karışımları sağlandıktan sonra karışımdan bir damla sperma lam üzerine alınarak üzerine lamel kapatılmıştır. İmmersiyon objektifinde (1000X) 400 spermatozoa sayılarak anormal spermatozoa oranı % olarak

31 24 belirlenmiştir. Normal spermatozoa yapısı dışındaki yapılar anormalite olarak kabul edilmiştir. Hancock sıvısının hazırlanışı: 1. karışım: NaCl (9 gram) 2. karışım: A- Na 2 HPO 4.2H 2 O (21,682 gram) Bidistile su (500 ml) Bidistile su (500 ml) B- KH 2 PO 4 (22,254 gram) Bidistile su (500 ml) 200 ml A ile 80 ml B karıştırılarak 2. karışım hazırlanır ve Hankok sıvısı; Formalin (62,5 ml) 1. karışım (150 ml) 2. karışım (150 ml), bidistile suyla 500 ml ye tamamlanarak hazırlanmıştır Ölü spermatozoa oranı Spermalarda ölü spermatozoa oranının belirlenmesinde eozin-nigrozin boyama sıvısı kullanılmıştır. Isıtma tablasındaki lam üzerine bir kısım sperma numunesi 4 kısım boyama sıvısı konarak karıştırılmış ve frotileri çekilerek kurutulmuştur. Bu çekilde hazırlanan frotilerde mikroskopta (400 X büyütme) 400 spermatozoa sayılarak ölü spermatozoa oranı % olarak belirlenmiştir. Spermatozoon baş kısmının tamamının ya da bir bölümünün boya alması ölü spermatozoa oranını göstermiştir. Eozin-nigrozin boyama sıvısının hazırlanışı: Eozin (1,67 gram) Nigrozin (10 gram) Sodyum sitrat (2,9 gram), 100 ml distile suya tamamlanarak hazırlanmıştır. Boyama sıvısı kullanımdan önce filtre edilmiştir Spermatozoa yoğunluğu Sperma yoğunluğunun belirlenmesinde hemositometrik yöntem kullanılmıştır. Nativ spermadan alınan numunelerin sulandırılması ve tespiti için Hayem sıvısı kullanılmıştır. Bu sıvının 5 ml sine otomatik pipetle 0,01 ml sperma numunesinden alınarak, 1/500 oranında sulandırılmıştır. Thoma lamında 10 büyük karede sayılan spermatozoa yoğunluğu şu formüle göre yapılmıştır: