ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ

Transkript

1 ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ Özge TEMİZ Oreochromis niloticus da BEYİN DOKUSUNDA FENTHİONUN PİPERONİL BÜTOKSİD MODÜLATÖRLÜĞÜNDE GLUTATYON METABOLİZMASI, HSP70, ASETİLKOLİNESTERAZ AKTİVİTESİ ve LİPİD PEROKSİDASYONUNA ETKİLERİ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI ADANA, 2011

2 ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ Oreochromis niloticus da BEYİN DOKUSUNDA FENTHİONUN PİPERONİL BÜTOKSİD MODÜLATÖRLÜĞÜNDE GLUTATYON METABOLİZMASI, HSP70, ASETİLKOLİNESTERAZ AKTİVİTESİ ve LİPİD PEROKSİDASYONUNA ETKİLERİ Özge TEMİZ YÜKSEK LİSANS TEZİ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI Bu tez.../.../2011 Tarihinde Aşağıdaki Jüri Üyeleri Tarafından Oybirliği/Oyçokluğu İle Kabul Edilmiştir Prof.Dr. Nevin ÜNER Yrd.Doç.Dr. Yusuf SEVGİLER Yrd.Doç.Dr. Petek PİNER DANIŞMAN ÜYE ÜYE Bu tez Enstitümüz Biyoloji Anabilim Dalında hazırlanmıştır. Kod No: Prof. Dr. İlhami YEĞİNGİL Enstitü Müdürü Bu çalışma Ç.Ü. Araştırma Projeleri Birimi Tarafından desteklenmiştir. Proje No:FEF2009YL58 Not: Bu tezde kullanılan özgün ve başka kaynaktan yapılan bildirişlerin, çizelge, şekil ve fotoğrafların kaynak gösterilmeden kullanımı, 5846 sayılı Fikir ve Sanat Eserleri Kanunundaki hükümlere tabidir.

3 ÖZ YÜKSEK LİSANS TEZİ Oreochromis niloticus da BEYİN DOKUSUNDA FENTHİONUN PİPERONİL BÜTOKSİD MODÜLATÖRLÜĞÜNDE GLUTATYON METABOLİZMASI, HSP70, ASETİLKOLİNESTERAZ AKTİVİTESİ ve LİPİD PEROKSİDASYONUNA ETKİLERİ Özge TEMİZ ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI Danışman : Prof.Dr. Nevin ÜNER Yıl 2011 Sayfa:77 Jüri : Prof.Dr. Nevin ÜNER : Yrd.Doç.Dr. Petek PİNER : Yrd.Doç.Dr. Yusuf SEVGİLER Bu çalışmanın amacı OP insektisid ve avisid fenthionun sitokrom P450 inhibitörü PBO modülatörlüğünde Oreochromis niloticus da beyin dokusunda GSH metabolizmasına, lipid peroksidasyonuna, stres proteinlerine etkisi ve nörotoksik potansiyelini araştırmaktır. Bu amaçla balıklar 24 saat 0.5 mg/l PBO ön uygulamasından sonra mg/l fenthion ve 0.5 mg/l PBO içeren suda 24, 96 saat ve 15 gün sürelerle bekletilerek, tgsh, GSH, GSSG ve TBARS miktarları ile GSH/GSSG oranı, GPx, GR ve GST enzim aktiviteleri spektrofotometrik yöntemlerle, HSP70 miktarı ELISA test tekniği ile belirlenmiştir. Fenthionun kısa süreli etkide GSSG ve TBARS miktarlarında artışa, GSH/GSSG oranında ve GST aktivitesinde azalışa; uzun süreli etkide ise tgsh, GSH, HSP70 miktarlarında ve GSH/GSSG oranı ile GR ve GST aktivitelerinde artışa neden olduğu belirlenmiştir. PBO varlığında fenthionun, kısa süreli etkide tgsh, GSH miktarlarında ve GSH/GSSG oranında azalışa, GSSG, HSP70 ve TBARS miktarlarında artışa, uzun süreli etkide ise tgsh, GSH miktarları ve GSH/GSSG oranında azalışa, GSSG, HSP70 ve TBARS miktarlarında artışa neden olduğu bulunmuştur. Fenthionun tüm etki sürelerinde AChE inhibisyonuna neden olduğu ve PBO nun uzun süreli etkide fenthionun AChE inhibisyonu etkisini azalttığı belirlenmiştir. Bu çalışmada fenthionun lipid peroksidasyonunu ve HSP70 miktarını artırarak oksidatif strese neden olduğu ve fenthionun bu etkisinin GSH-bağımlı savunma tarafından giderilemediği belirlenmiştir. PBO nun GSH-bağımlı savunma, lipid peroksidasyonu ve stres proteinlerini etkileyerek fenthionun oksidatif stres etkisini artırdığı bulunmuştur. Fenthionun AChE inhibisyonu ile oluşturduğu nörotoksik etkileri PBO nun azalttığı belirlenmiştir. Anahtar Kelimeler: Fenthion, Piperonil Bütoksid, Glutatyon, Stres Proteinleri, Oreochromis niloticus I

4 ABSTRACT MSc THESIS EFFECTS of FENTHION on GSH METABOLISM, HSP70, ACETYLCHOLINESTERASE ACTIVITY and LIPID PEROXIDATION MODULATED by PIPERONYL BUTOXIDE in the BRAIN of Oreochromis niloticus Özge TEMİZ UNIVERSITY OF ÇUKUROVA INSTITUTE OF NATURAL AND APPLIED SCIENCES DEPARTMENT OF BİOLOGY Supervisor : Prof. Dr. Nevin ÜNER Year: 2011 Pages:77 Jury : Prof. Dr. Nevin ÜNER : Asst.Prof.Dr. Petek PİNER : Asst.Prof.Dr. Yusuf SEVGİLER The aim of the present study was to investigate the effects of organophosphorus insecticide and avicide fenthion modulated by PBO, an inhibitor of cytochrome P450, on GSH metabolism, lipid peroxidation, stress proteins and its neurotoxic potantial in the brain of juvenile Oreochromis niloticus. For this purpose, after the pretreatment of fish with 0.5 mg/l PBO for 24-h, the fish were placed in mg/l fenthion and 0.5 mg/l PBO containing water for 24-h, 96-h and 15-d. tgsh, GSH, GSSG and TBARS contents, GSH/GSSG ratio, GPx, GR, and GST enzyme activities were measured using spectrophotometric methods and HSP70 contents were determined by using ELISA test. It was determined that fenthion caused increases in GSSG and TBARS contents, decreases in GSH/GSSG ratio and GST enzyme activity in short term exposures; increases in tgsh, GSH, and HSP70 contents, GSH/GSSG ratio, GST and GR enzyme activities in long term exposure. It was found that, in the presence of PBO, fenthion caused decreases in tgsh, GSH contents and GSH/GSSG ratio and increases in GSSG, HSP70 ve TBARS contents in short term exposure; decreases in tgsh, GSH contents and GSH/GSSG ratio and increases in GSSG, HSP70 and TBARS contents in long term exposure. It was also determined that fenthion caused AChE inhibition in all exposure durations, and AChE inhibition effect of fenthion decreased by PBO in long term exposure. In this study, it was shown that the selected concentration of fenthion caused an oxidative stress and this effect of fenthion was not eliminated by the GSH-related defences. PBO increased the oxidative stress effect of fenthion by affecting GSH-related defence, lipid peroxidation and stress proteins. Fenthion caused neurotoxic effects by inhibiting AChE enzyme activity which is decreased by PBO. Key Words: Fenthion, Piperonyl butoxide, Glutathione, Stress Proteins, Oreochromis niloticus II

5 TEŞEKKÜR Çalışmalarım süresince her konuda yardım ve desteğini esirgemeyen tez danışmanım Sayın Prof.Dr. Nevin ÜNER e, Sayın Yrd.Doç.Dr. Petek PİNER e, Sayın Yrd.Doç.Dr. Yusuf SEVGİLER e sonsuz teşekkürlerimi sunarım. III

6 İÇİNDEKİLER SAYFA ÖZ I ABSTRACT II TEŞEKKÜR... III İÇİNDEKİLER.... IV ÇİZELGELER DİZİNİ... VIII ŞEKİLLER DİZİNİ... X 1.GİRİŞ Serbest Radikallerin Oluşumu Antioksidant Savunma Sistemi Glutatyon Isı Şok Proteinleri Lipid Peroksidasyonu Organofosforlu Pestisidler Fenthion Asetilkolinesterazlar Piperonil Bütoksid Beyin Deney Organizması ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR MATERYAL VE METOD Materyal Kimyasal Maddeler Cihazlar ve Diğer Gereçler Yöntem Toksisite Denemeleri Analiz yöntemleri Total Glutatyon Yöntemi IV

7 Okside Glutatyon Yöntemi Glutatyon Peroksidaz Yöntemi Glutatyon Redüktaz Yöntemi Glutatyon S-Transferaz Yöntemi TBARS Yöntemi Asetilkolinesteraz Yöntemi Bradford Yöntemi ile Protein Tayini HSP70 Miktarının Belirlenmesi İstatiksel Analiz BULGULAR ve TARTIŞMA Bulgular Çözücü Asetonun Parametrelere Etkileri Fenthion ve PBO Etkisinde Glutatyon ile İlgili Parametrelerdeki Değişimler tgsh Miktarındaki Değişimler GSH Miktarındaki Değişimler GSSG Miktarındaki Değişimler GSH/GSSG Oranındaki Değişimler GPx Aktivitesindeki Değişimler GR Aktivitesindeki Değişimler GST Aktivitesindeki Değişimler Fenthion ve PBO etkisinde HSP70 Miktarındaki Değişimler Fenthion ve PBO etkisinde TBARS Miktarındaki Değişimler Fenthion ve PBO etkisinde AChE Aktivitesindeki Değişimler Tartışma SONUÇ ve ÖNERİLER KAYNAKLAR. 59 V

8 ÖZGEÇMİŞ.. 77 VI

9 VII

10 ÇİZELGELER DİZİNİ SAYFA Çizelge 3.1. Total Glutatyon Yöntemi. 26 Çizelge 3.2. Okside Glutatyon Yöntemi.. 28 Çizelge 3.3. Glutatyon Peroksidaz Yöntemi 30 Çizelge 3.4. Glutatyon Redüktaz Yöntemi.. 31 Çizelge 3.5. Glutatyon S-Transferaz Yöntemi. 32 Çizelge 3.6. TBARS Yöntemi.. 33 Çizelge 3.7. Asetilkolinesteraz Yöntemi.. 34 Çizelge 3.8. HSP70 Yöntemi Çizelge 4.1. O. niloticus da beyin dokusunda asetonun parametrelere etkileri Çizelge 4.2. O. niloticus da beyin dokusunda fenthion ve PBO nun tgsh ve GSH miktarına etkileri Çizelge 4.3. O. niloticus da beyin dokusunda fenthion ve PBO nun GSSG miktarına ve GSH/GSSG oranına etkileri Çizelge 4.4. O. niloticus da beyin dokusunda fenthion ve PBO nun GPx, GR ve GST enzim aktivitelerine etkileri Çizelge 4.5. O. niloticus da beyin dokusunda fenthion ve PBO nun HSP70 ve TBARS miktarlarına etkileri. 48 Çizelge 4.6. O. niloticus da beyin dokusunda fenthion ve PBO nun AChE enzim aktivitelerine etkileri. 49 VIII

11 IX

12 ŞEKİLLER DİZİNİ SAYFA Şekil 1.1. Enerji transferi sağlanarak oluşmuş farklı ROS türleri Şekil 1.2. GSH biyosentezi ve GSH redoks döngüsü.. 4 Şekil 3.1. GSH Standart Grafiği.. 27 Şekil 3.2. Protein Standart Grafiği Şekil 3.3. HSP70 Standart Grafiği X

13 XI

14 1.GİRİŞ Özge TEMİZ 1. GİRİŞ Dünya üzerinde pestisid çeşitliliğinin ve kullanımının artması, pestisidlerin ekosistem içerisinde ayrılmaz bir parça olmasına neden olmuştur. Deney hayvanları üzerinde yapılan akut ve kronik pestisid uygulamalarında, pestisidlerin toksikolojik ve farmakodinamik özellikleri ile ilgili önemli bilgiler bulunmuştur. Bu araştırmalarda pestisid toksisitesi, enzim aktiviteleri, belirli patolojik değişimler, mutajenik ve karsinojenik özellikler araştırılarak belirlenmektedir (Banerjee ve ark., 1999; EPA, 2002). Yapılan in vivo ve in vitro çalışmalarda deney hayvanlarında birçok pestisidin reaktif oksijen türleri (ROS) üretme yeteneği ve DNA hasarı oluşturmasına bağlı olarak sitotoksik potansiyele sahip olduğu gösterilmiştir (Castillo ve ark., 2002). Pestisidler, hücrede membrana bağlı enzimlerin ve reseptörlerin değişmesine, membran potansiyelini azaltarak membran bütünlüğünün bozulmasına yol açmaktadır (Fang ve ark., 2002). Aerobik organizmalar yüksek enerjili besin bileşiklerinin oksidasyon tepkimeleri yoluyla enerji sağlamaktadır. Bu tepkimeler hücrelerde önemli bir ROS kaynağıdır (Finkel ve Holbrook, 2000; Sohal ve ark., 2002). Canlılar ROS un zararlı etkilerinden korunmak üzere antioksidant savunma sistemlerini geliştirmişlerdir (Livingstone, 2001; Chauhan ve Chauhan, 2006; Limon-Pacheco ve Gonsebatt, 2009). Canlıda normal koşullarda antioksidant sistem ve ROS denge halindedir. ROS un fazla üretimi canlıda oksidatif strese neden olur (Chauhan ve Chauhan, 2006) Serbest Radikallerin Oluşumu Reaktif oksijen türleri; süperoksid (O2.- ), hidroksil (HO. ), hidrojen peroksid (H 2 O 2 ), alkoksil (RO. ) gibi serbest radikallerden oluşur. O2.- ilk oluşan serbest radikal olup dismutasyon tepkimeleri ile H 2 O 2 radikal olmayan türevlere dönüşmektedir. H 2 O 2 metallerin katalizörlüğünde Haber-Weiss ve Fenton tepkimeleriyle yüksek derecede reaktif HO. radikallerini oluşturur (Chauhan ve Chauhan, 2006; Banvalfi, 2011) (Tepkime 1, 2): 1

15 1.GİRİŞ Özge TEMİZ Haber-WeissTepkimesi: O Fe 3+ Fe 2+ + O 2 (1.1.) FentonTepkimesi: H 2 O 2 + Fe 2+ Fe 3+ + HO. + OH - (1.2.) Moleküler oksijenden (O 2 ) radikal oluşumu valans kabuğundaki elektronlardan kaynaklanmaktadır. Triplet oksijen radikal olmayan atom veya moleküller ile tepkime vererek onları radikallere dönüştürebilir. Moleküler oksijen ise enerji transferleri veya elektron transfer tepkimeleri ile radikal moleküllere dönüşebilir. Enerji transferi ile singlet oksijen ( 1 O 2 ) oluşurken, elektron transfer tepkimeleri ile kademeli olarak O2.- radikali, H 2 O 2 ve OH. radikalleri oluşur (Apel ve Hirt, 2004). Şekil 1.1.Enerji transferi sağlanarak oluşmuş farklı ROS türleri (Apel ve Hirt, 2004). Reaktif oksijen türlerinin hücre içerisinde DNA, proteinler ve lipidler üzerinde hasarlara neden olarak oksidatif stres oluşturduğu bilinmektedir (Wells ve ark., 1997; Wells ve ark., 2009) Antioksidant Savunma Sistemi Aerobik organizmalarda ROS un neden olduğu hücresel hasarları önleyen antioksidant savunma sistemi iki grupta incelenir. Enzimatik antioksidantlar; süperoksit dismutaz (SOD; EC ), katalaz (CAT; EC ), glutatyon peroksidaz (GPx; EC ), glutatyon S-transferaz (GST; EC ) (Ketterer, 2001), glutatyon redüktaz (GR; EC ) dır (Kelly, 1998). Enzimatik olamayan antioksidantlar ise askorbik asit (C vitamini), alfa-tokoferol (E vitamini), redükte glutatyon (GSH; L-γ-glutamil-L-sisteinil-glisin), β-karoten (provitamin A), karotenoidler ve flavonoidleri içermektedir (Valko ve ark., 2006). 2

16 1.GİRİŞ Özge TEMİZ Antioksidant sistemde metalloenzimlerden biri olan SOD, O 2.- anyonunu indirgeyerek H 2 O 2 ve O 2 molekülüne dönüştürmektedir. (Tepkime 3): 2O H + SOD H 2 O 2 + O 2 (1.3.) Glutatyon peroksidaz ve diğer enzimler 3 farklı ROS çeşidinin H 2 O 2, lipid peroksidler ve peroksinitrit detoksifikasyonunda kullanılırlar. Selenyum bağımlı GPx 4 selenyum atomu içerir ve enzimin aktif bölgesi selenosistein olarak bulunur. Böylece GSH ın H 2 O 2 ile oksidasyonunu hızlandırır; sonuç olarak okside GSH (GSSG) ve su oluşur. (Tepkime 4): H 2 O 2 + 2GSH GPx 2H 2 O + GSSG (1.4.) Katalaz yalnızca H 2 O 2 yi substrat olarak kullanıp redüksiyonu sağlayarak su ve O 2 yi oluşturur. Bu enzim peroksizomlarda ve eritrositlerde bulunur (Laguerre ve ark.,2007). (Tepkime5): 2H 2 O 2 CAT 2H 2 O + O 2 (1.5.) Serbest radikaller vücutta antioksidant savunma mekanizmasının kapasitesini aştıkları zaman çeşitli toksik etkilere yol açabilir (Gutteridge, 1995). Hücre membranındaki yağ asitleri ile tepkimeye girerek peroksidasyon ürünleri oluştururlar. Lipid peroksidasyonu (LPO), organizmada bir serbest radikal etkisi sonucu membran yapısında bulunan doymamış yağ asidi zincirinden bir hidrojen uzaklaştırılmasıyla başlar ve malondialdehit (MDA) düzeyinin artmasına neden olur (Esterbauer ve ark., 1982). LPO oksidatif stresin önemli bir göstergesidir ve antioksidant sistemde düşük moleküler ağırlıklı GSH, oksidatif stres oluşumuna karşı önemli rol almakta ve tüm canlı türlerinde bulunmaktadır (Younes, 1999; Pandey ve ark., 2001). 3

17 1.GİRİŞ Özge TEMİZ Glutatyon Tripeptid yapıda olan GSH hücrede en bol bulunan düşük molekül ağırlığa sahip antioksidant sistem elemanıdır. Sisteinin sülfidril grubu redüksiyon ve konjugasyon tepkimelerinde GSH ın önemli bir bileşenidir (Forman, 2009). Birçok hücrede GSH derişimi 1-2 mm olduğu halde karaciğer hücrelerinde üretimi fazla olduğundan derişimi 1-10 mm arasında değişmektedir. Hücresel GSH derişimini düzenleyen birçok enzim vardır (Cnubben ve ark., 2001). γ Glutamil transpeptidaz (γ-gt; EC ) enzimi γ-peptid bağını kırarak hücre içinde GSH oluşumu için gerekli olan γ-glutamil rezidülerini transfer eder. İntraselüler GSH metabolizmasında glutamin (gln), sistin (cys-cys) ve glisin (gly) hücre içerisine alınır. Hücre içerisinde gln ve cys-cys glutamik asit (glu) ve sisteine (cys) dönüştürülür. γ glutamilsisteinil sentetaz (γ-gcs; EC ) enzimi ile L-γglutamil-L-sistein oluşturulur. Glutatyon sentetaz (GS; EC ) enzimi aracılığıyla L-γ-glutamil-L-sistein yapısına glisin amino asiti ATP varlığında bağlanarak GSH ı oluşturur (Van de Poll, 2008). Ökaryotik hücrelerde GSH ın depolanması 3 yerde yapılır: % 90 ı sitoplazmada, %10 a yakın kısmı mitokondride ve %1 den az kısmı da endoplazmik retikulumda bulunur (Shelly, 2009). Hücredeki tiyol redoks döngüsünün devamlılığı için GSH önemli bir rol oynar ve GSH; endojen ve eksojen radikallerin detoksifikasyonu, sisteinin taşınması ve depolanması, protein ve DNA sentezi, hücre döngüsü regülasyonu ve hücre farklılaşması gibi tepkimelerde rol almaktadır (Poon, 2004). Ayrıca sitosolik GSH, redoks döngüsünde ROS a substratı gibi davranarak direkt olarak bağlanıp inaktive edebilmektedir (Knapen, 2000). Şekil 1.2.GSH biyosentezi ve GSH redoks döngüsü (Van de Poll, 2008). 4

18 1.GİRİŞ Özge TEMİZ Glutatyon peroksidaz enzimi yapı olarak selenyum bağımlı ve selenyum bağımlı olmayan olarak 2 gruba ayrılır. Se-bağımlı GPx, H 2 O 2 ve organik hidroperoksidleri azaltmaktadır. Se-GPx enziminin 5 farklı (GPx1-5) türü vardır. Sebağımsız GPx ise yalnızca organik hidroperoksidlerin redüksiyonunu katalizler. Böylece GPx, oksidatif strese karşı önemli bir rol oynamaktadır. GPx, GSH varlığında ROS u temizlerken GSH GSSG ye yükseltgenir. GSSG ise NADPH varlığında GR ile yeniden GSH olarak indirgenir. GSSG ye NADPH dan bir elektron aktarılmasıyla redüksiyon gerçekleşir. GR yapısında flavinadenindinükleotid (FAD) taşımaktadır. Bu enzim sadece GSH indirgenmesinde değil GSH düzeyinin belirli bir seviyede tutulmasında da görev almaktadır (Cnubben ve ark., 2001). GST toksik bileşiklerin detoksifikasyonunda anahtar rol oynamaktadır, organizmada metabolizma sonucu açığa çıkan toksik bileşikler ile canlıda oluşabilecek hasarları önler (Marss, 1996). GST elektrofilik bileşiklerin farklı türleri ile GSH ın konjugasyonunu sağlamaktadır. GST ler tüm ökaryotik ve prokaryotik canlı sistemlerinde; sitoplazmada, mikrozomlarda ve mitokondri içinde bulunur. GST lerin şimdiye kadar bulunmuş 7 farklı çeşidi vardır. Bunlar; alpha (a), mu (m), pi (p), sigma (s), theta (u), kappa (k) ve zeta (z) dır. Bu sınıflandırma substrat seçiciliği, amino asit dizilişi ve kinetik enzim davranışına bağlıdır (Landi, 2004). Hücrede diğer bir savunma sistemi ısı şok proteinlerini de (HSP) içeren stres proteinleridir. Merkezi sinir sisteminde intraselüler redoks döngüsündeki değişimler, ağır metaller, amino asit analogları ve hücre için toksik diğer maddeler HSP sentezini artırmaktadır. Uzun süreli stres koşullarında HSP sentezi ile strese karşı hücrenin toleransı artırılmaktadır (Poon ve ark., 2004) Isı Şok Proteinleri Isı şok proteinleri ilk kez Ritossa (1962) tarafından yüksek ısı etkisinde meyve sineği (Drosophila busckii) nde belirlenmiştir ve ısı şok proteinleri (HSP ler) olarak tanımlanmıştır. Bu proteinler, başka faktörlerin de etkisi ile sentezlenmelerinden dolayı stres proteinleri adını almışlardır (Lewis ve ark., 1999). Bu tanım stresle 5

19 1.GİRİŞ Özge TEMİZ indüklenen metallotiyonein ve CYP450 gibi protein gruplarını içerse de terminolojide genellikle HSP ler için kullanılmaktadır (Iwama ve ark., 1998). Hücre proteinlerinin %2-5 ini oluşturan HSP ler, bakterilerden insana kadar tüm organizmalarda bulunan yüksek oranda korunmuş sitoprotektif proteinlerden olup kimyasal ve çevresel faktörlere karşı; nikotin, etanol, ağır metaller, oksidantlar, osmotik stres, amino asit analogları, metabolik değişim, yaşlanma, enfeksiyon, UV, sıcaklık, egzersiz gibi etkenler tarafından indüklenir (Kregel, 2002). Farklı hücresel süreçlerde oluşabilecek olan oksidatif stres gibi patolojik durumlarda ve aşırı ROS üretimi sonucu antioksidant enzim kapasitesinin aşılması gibi durumlarda HSP ler dengenin yeniden sağlanması için çalışmakta ve hücresel süreçlerde moleküler şaperon olarak görev yapmaktadırlar (Benjamin ve McMillan, 1998; Kalmar ve Greensmith, 2009). Moleküler şaperon olarak HSP lerin görevleri; hücrede ilk oluşumlarından itibaren proteinlerin spesifik katlanması, onarımı, değişimi ve hücre membranı üzerinde proteinlerin hareketi ve korunmasıdır (Kalmar ve Greensmith, 2009). Isı şok proteinleri, hücresel sinyal iletiminin düzenlenmesi, hücresel stres sonucu hücrenin yaşamı ya da ölümüne karar verilmesi, hücrenin kademeli olarak apoptozise uğratılmasında da görev alırlar (Poon, 2004). Bütün bu görevlerinin yanı sıra büyük moleküllü HSP ler birçok farklı türde bulunduğundan stres indikatörleri olarak, küçük moleküllü stres proteinleri ise türlere spesifik olduğundan tanısal amaçlar için kullanılırlar (Iwama ve ark. 1999). HSP ler moleküler büyüklüklerine göre alt sınıflara ayrılırlar, bunlar; düşük molekül ağırlıklı HSP ler (16-30 kda), HSP40, HSP60, HSP70, HSP90 ve büyük molekül ağırlıklı HSP110 dur (Kalmar ve Greensmith, 2009). HSP70 ailesi ksenobiyotik varlığında hücreleri hasardan koruyan bir protein ailesidir (Sharp ve ark., 1999). İlk olarak proteinlerin kontrolü ve diziliminde görev alır. HSP70 ile belirlenmiş olan yanlış dizilime sahip proteinler proteozom veya lizozomlarda yıkıma uğrar. Böylece hasarlı proteinlerin temizlenmesi HSP varlığında yapılır. Bazı durumlarda ise yanlış katlanmış proteinlerin yeniden düzenli bir şekilde katlanması sağlanarak bunlar kurtarılabilir (Kalmar ve Greensmith, 2009). 6

20 1.GİRİŞ Özge TEMİZ HSP70 ailesi, en indüklenebilir HSP grubudur, kemirgenlerde 71 kda, insanlarda 72 kda moleküler ağırlıkta bulunmaktadır. Bu grup içerisinde HSC70 (P72; HSC73; Hspa8), indüklenebilir formu olan HSP72 ve yapısal olarak glukoz ve proteinden oluşan endoplazmik retikulumda yer alan GRP75 bulunur (Poon, 2004). Sinir sisteminde oluşan çeşitli hasarlara karşı HSP70 sentezinin önemli derecede arttığı belirlenmiştir. Denatüre olmuş proteinlerin aktive ettiği HSF ler (ısı şoku transkripsiyon faktörü) ile HSP sentezi indüklenir. Aktif hale geçen HSF ler fosforile olmuş tridimer formlarıyla çekirdeğe giriş yapar. HSF çekirdeğe girdiğinde stres proteinleri elemanları (HSE) ile birleşerek DNA yapısındaki HSP genlerinin transkripsiyonu sağlanır. HSP70 denatüre proteinlere ATP-bağımlı şekilde bağlanır (Poon, 2004; Franklin ve ark., 2005). Sucul organizmalarda (alg, rotifer, yumuşakçalar, eklembacaklılar, kabuklular, balık vb.) yapılan toksikolojik çalışmalarda, HSP70 gibi büyük moleküllü stres proteinlerinin genelde protein denatürasyonuna sebep olan toksik maddelere hücresel düzeyde verilen tepkinin biyomarkırları olduğu ortaya konmuştur (Currie ve Tufts, 1997; Deane ve Woo, 2005) Lipid Peroksidasyonu Çoklu doymamış yağ asidleri (PUFA) (-CH=CH-CH 2 -CH=CH-) hidrojence zengin metilen grupları (CH 2 ) içerir. PUFA nın ROS saldırısına uğramasıyla zincirleme tepkimeler başlar ve peroksil radikalleri oluşur. Bu zincirleme tepkimeler lipid peroksil (LOO. ) radikallerinin ayrımı ile karbon zinciri uzunlukları farklı çeşitli aldehit grupları oluştururlar. Bu tepkimeler sonucu oluşan son ürün, ROS dan daha kararlı yapıdadır (Poon, 2004). Lipid peroksidasyon süreci bir dizi zincir tepkime ile başlatılır. Bir yağ molekülünün peroksidasyonu; inisiyasyon, degradasyon ve terminasyon tepkimelerini içerir. İnisiyasyon evresi: HO. radikali, bir lipid substratından (LH) bir hidrojen atomu (H + ) kopararak bir lipid radikali (L. ) oluşturur. 7

21 1.GİRİŞ Özge TEMİZ Degradasyon evresi: Zincirleme tepkimeye giren lipid radikaline O 2 eklenir LOO. ile lipid peroksit oluşur. Terminasyon evresi: Antioksidantlar ile zincir tepkime son bulur ve stabil son ürün oluşur (Porter ve ark., 1995). (Tepkime 8,9,10) ; LH + HO - L - + HOH (1.6.) L. + O 2 LOO - (Lipid Peroksil Radikali) (1.7.) LH + LOO - L - + LOOH (Lipid Hidro Peroksid) (1.8.) Lipid peroksidasyonu sürecinde zincirleme tepkimelerin sonucu lipid alkolsil radikaller (LO - ), malondialdehid (MDA; HOC CH 2 CHO) gibi aldehidler, alkanlar, lipidepoksidler ve alkoller oluşur. Bu ürünlerin çoğu toksiktir (Sole ve ark.,1990). Dokularda hasar oluşturan ROS un hücre üzerinde etkisinin araştırılmasında biyomarkır olarak lipid peroksidasyon ürünü malondialdehid (MDA) oluşma miktarı ölçülmektedir. MDA miktarı tiyobarbitürik asit tepkimesi ile ölçülebilir (Valavadinis ve ark., 2006) Organofosforlu Pestisidler Organofosforlu pestisidler (OP), genellikle esterler, amidler veya fosfonik asidin tiyol türevleridir ve biyolojik özelliklere sahip kimyasal ajan gruplarının bir formudur (Karalliedde, 1999). Organofosforlu pestisidler fosfat, tiyo, ditiyofosfat ve organik kısımdan oluşmaktadır. Çoğu durumda fosfat kısmı yerine dialkil grubu bağlanmaktadır. Organofosforlu pestisidler biyolojik etkilerini, beyin ve diğer dokuların hücresel bileşenlerine özellikle metabolitlerine ayrılıp elektrofilik saldırı yaparak gösterdiği öne sürülmektedir. Nörotoksisite birçok pestisitin ortak karakteristiğidir (Fang ve ark., 2002). Omurgalılarda OP ler fosforlu yapısından sağlanan fosforik asitle etki gösterir ve canlıda kas dokusunda en çok bulunan asetilkolinesteraz (AChE; EC ), plazma ve karaciğerde en çok bulunan butirilkolinesteraz (BChE; EC 8

22 1.GİRİŞ Özge TEMİZ lipofilitesinin bir ölçüsüdür. LogK ow değeri 3 den küçük olan bileşikler hidrofilik, logk ow değeri 4 ün üzerinde olan bileşikler ise lipofilik karakterlidirler (Noble, 1993). Moleküler formülü: C 10 H 15 5O 3 PS 2 Moleküler ağırlığı: 278.3kDa Kimyasal Formülü: IUPACC adı: O,O-DimethylO-[3-methyl-4-methylsulfanyl) phenyl] phosphorothioate Kapalı Formülü: ), plazma ve hepatik karboksilesterazlar (aliesteraz), paraoksonazlar ve diğer atipikesterazların inhibisyonunuu sağlar. AChE inhibisyonu OP lerin toksisitesi için en çok araştırılan biyomarkırdır (Abdollahi, 2004). Birçok OP bileşiğinin yapısında fosfora çift bağlı sülfür atomu vardır. Toksik hale gelmeleri için metabolik aktivasyon ile oksonlara dönüşmeleri gerekir. Oksidatif desülfürasyon olarak adlandırılan ve karaciğerde mikrozomal CYP450 enzimleri tarafındann katalizlenen bu biyotransformasyon tepkimesi sonucunda OP bileşiği toksik hale gelir (Jokanovic, 2001) Fenthion Fenthion, tarımda ve çiftlik hayvanları üzerinde ektoparazitlere karşı yaygın olarak kullanılan geniş spektrumlu OP avisid ve insektisiddir (Roberts ve Hudson, 1999). Amerika Birleşik Devletleri Çevre Koruma Örgütü, Ö (ABD-EPA) tarafından sınırlı üretimi olan pestisidler içerisinde yer almaktadır (EPA, 2001). Oktanol/su partisyon bileşiğin katsayısı (logk ow ) 4.09 dur (Lambropoulou ve Albanis, 2002). Bir oktanol-su partisyonn katsayısı, o bileşiğin belirli bir sıcaklıktaki (1.9.) 9

23 1.GİRİŞ Özge TEMİZ Ticari adları: MPP, mercaptophos, OMS 2, ENT 25540, Bay 29493, Baycid, Baytex, Dalf, DMTP, Entex, Lebaycid, Mercaptophos, Prentox Fenthion 4E, Queletox, Spotton, Talodex, Tiguvon. Buhar Basıncı: 4 mpa (20 o C de), 10 mpa (30 o C de) Oktanol/su partisyon katsayısı: logk OW = 4.09 Sudaki çözünürlüğü: 2 mg/l (20 o C de) Erime Noktası: 7.5 o C Kaynama Noktası: 87 o C (0.01 mm Hg da) Hidroliz: ph 7 de ve 25 C Kimyasal Grup: Organofosforlu bileşik OPP Kimyasal Kodu: (EPA, 2001; ) Bitkiler ve hayvanlarda beş farklı fenthion metaboliti izole edilmiştir; fenthion sülfoksid, fenthion sülfon, fenthion okson, fenthion okson sülfoksid, fenthion okson sülfon. Bu metabolitler ana bileşikten daha yüksek toksisite göstermektedir (Cabras ve ark., 1993; Molinari ve ark., 1998). Fenthionun sürüngen, kuş ve balıklarda yapılan histopatolojik testlerde kronik uygulamada toksik etkilerinin olduğu rapor edilmiştir (Mullie ve ark., 1999; Zutshi ve Murthy, 2001). Fenthion, AChE enzimini inhibe ederek kolinerjik sinapsların post sinaptik zarlarının kalıcı depolarizasyonuna ve sonunda hayvanların felç olmasına ve ölümüne neden olur (Costa, 2006). Fenthion okson formuna kolayca dönüşmediği için daha güvenli bir pestisid olarak geliştirilmiştir (Roberts and Hutson, 1999). Bununla birlikte Carassius auratus da fenthionun okson formuna dönüşerek yüksek derecede toksik etki yarattığı bulunmuştur (Kitamura ve ark., 2000). ABD-EPA tarafından verilen toksisite sınıflandırmasının ikinci grubunda yer alan fenthion, orta derecede toksik bir bileşiktir (EPA, 2001). Bayer firmasının üretim ve kullanımdan kaldırılması isteği ABD-EPA tarafından uygun görülerek 30 Kasım 2004 tarihiyle fenthion kullanımı yasaklanmıştır (EPA, 2006a). Çukurova Bölgesi nde zeytin ve buğday üretiminde zararlılara karşı 2008 yılında L, 2009 yılında 3.263L ve 2010 yılında L fenthion kullanılmıştır. Fenthion imalatı ve fiili ithalatı 30 Haziran 2010 tarihi itibariyle Türkiye genelinde yasaklanmıştır. Stokların 10

24 1.GİRİŞ Özge TEMİZ kullanımına 31 Ağustos 2011 tarihine kadar 14 ay süreyle müsaade edileceği bildirilmiştir (Tarım ve Köyişleri Bakanlığı, Adana Bitki Koruma Şube Müdürlüğü, Çukurova Bölgesi pestisid satış raporları sonuçları) Asetilkolinesteraz Kolinesterazlar genellikle AChE ve BChE olarak iki büyük sınıfa ayrılmaktadır. Balık beyin ve kaslarında genellikle AChE, karaciğer ve plazmada ise BChE daha fazla bulunur (Fulton ve Key, 2001). AChE nörotransmitter bir madde olarak görev yapan asetilkolinin (ACh) kolin ve asetik asite hidrolizinden sorumlu bir enzimdir (Vale, 1998; Pope ve ark., 2005). AChE aktivitesinin engellenmesi durumunda parasempatik ve sempatik motor sinirler ve merkezi sinir sistemi çalışmasında aksaklıklar oluşur (Lotti, 1995). Organofosforlu pestisidler, enzimin aktif bölgesindeki serin rezidüsü ile kovalent bağ kurmaları sonucunda nörotransmitterin doğal katabolizmasını engellemek üzere inhibisyon yaparlar (Galgani ve Bocquené, 2000; Dailianis ve ark., 2003). ACh birikimi sonucu, sinapslar ve nöromuskular kavşaklarda aktivasyon artıp sonuçta kolinerjik sistem uyarısı yoğunlaşmaktadır (Soreq ve Zakut, 1993; Hazarika ve ark., 2003; Tuovinen, 2004). Farklı ksenobiyotiklerle çalışılarak AChE inhibisyonu çeşitli türlerde gösterilmiştir (Pan ve Dutta, 1998). Akuatik kirlenmede AChE aktivitesi biyomarkır olarak kullanılmaktadır (Dembele ve ark., 2000) Piperonil Bütoksit Piperonil bütoksit (PBO; IUPAC adı; 5-[2-(2-butoxyethoxy)ethoxymethyl] -6- propyl-1,3-benzodioxole; CAS Numarası ) zararlı kontrolünde piretroid sinerjisti olarak kullanılmaktadır. PBO piretroid esterlerinin etkisini 10 kata kadar artırmaktadır (Casida ve ark., 1983). Bu etki, PBO nun karmaşık işlevli oksidazları inhibe etme ve birçok mikrozomal metabolizmayı engelleme temeline dayanmaktadır 11

25 1.GİRİŞ Özge TEMİZ (Hodgson ve Levi, 1998). PBO bazı OP lerin aktivasyonu sırasında Faz I biyotransformasyon enzimlerini inhibe etmektedir (Li ve ark, 2007). Piperonil bütoksit, geçtiğimiz 10 yıl içerisinde yeni pestisidlerin geliştirilmesinde yaygın olarak kullanılmıştır. Bugün ABD de kaydedilmiş 1500 üründe aktif madde olarak PBO bulunmakta ve tarım, sanayi, yaşam alanları ve ticari olarak pek çok uygulamalarda sinerjist olarak kullanılmaktadır (EPA, 2006b). PBO, CYP450 inhibisyonuna neden olduğu için toksik etkiyi artırmak amacıyla bazı OP pestisidlere de sinerjist olarak eklenmektedir (Siegfried ve Scharf, 2001). Organizmada elektrofilik bileşiklerin detoksifikasyonunda 3 farklı enzim grubuyla oluşturulan ortak faz bulunmaktadır. Faz I tepkimeleri sitokrom P450 (CYP450; EC ) monooksijenaz enzim gruplarını içerir. GST gibi faz II detoksifikasyon enzimleri için Faz I tepkimelerinde yükseltgenme, indirgenme ve hidroliz gibi tepkimeler gerçekleşir ve substrata aktif gruplar eklenir, böylece faz II konjugasyon tepkimelerine substrat hazırlanır. Faz II de konjugasyon tepkimeleri sülfat, asetat, glukuronik asit, GSH ve glisin gibi endojen maddeler ile gerçekleşir. Bu yolla ara metabolitlerin hidrofilik özellikleri artırılır ve böbrek veya gastrointestinal sistemden atılımları sağlanır. Organizmalarda faz I ve faz II enzimlerinin spesifik substratlara uygun çok sayıda izoformları bulunmaktadır. Faz III tepkimelerinde görev alan enzimler ise ATP-bağımlı membran pompaları ile parçalanmış toksikantları tanır ve membran dışına atılımı sağlanır (Marss, 1996) Beyin Omurgalı canlılarda enerji metabolizmasının tüm organlar içerisinde en duyarlı ve karmaşık işleyişi beyin de görülür. Beyine kan geçişi sırasında kan-beyin engeli (BBB) olarak bilinen yapı beyine kanla geçen maddelerin transfer oranını sınırlar. Beyin dokusu omurgalı canlılarda primatlar hariç toplam vücut ağırlığının %1 ini oluşturur. Fakat sıcakkanlı omurgalılarda toplam vücut enerjisinin %1.5-%8.5 arasında enerji kullanımı yaparken soğukkanlı omurgalılarda ise %2.7-%3.4 kadar vücut toplam enerjisini kullanmaktadır. Omurgalı hayvanlarda, hayati ve aktif organlarından biri olan beynin bilimsel çalışmalarda kullanılması biyolojik değişim 12