TÜRK FERMENTE SUCUĞUNDA FARKLI STARTER KÜLTÜR VE OLGUNLAŞMA SICAKLIKLARININ BİYOJEN AMİN OLUŞUMU ÜZERİNE ETKİSİ

Transkript

1 TÜRKİYE CUMHURİYETİ ANKARA ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ TÜRK FERMENTE SUCUĞUNDA FARKLI STARTER KÜLTÜR VE OLGUNLAŞMA SICAKLIKLARININ BİYOJEN AMİN OLUŞUMU ÜZERİNE ETKİSİ Ali GÜCÜKOĞLU BESİN HİJYENİ ve TEKNOLOJİSİ BÖLÜMÜ DOKTORA TEZİ DANIŞMAN Prof. Dr. Özlem KÜPLÜLÜ Bu tez, Ankara Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Müdürlüğü tarafından HPD proje numarası ile desteklenmiştir ANKARA

2 ii

3 iii İÇİNDEKİLER Kabul ve Onay İçindekiler Önsöz Simgeler ve Kısaltmalar Şekiller Çizelgeler ii iii vi vii viii x 1.GİRİŞ Et Ürünlerinin Sınıflandırılması Fermente Türk Sucuğu ve Fermente Sucuk Üretimi Üzerine Etkili Olan Bazı Faktörler ph Tuz Kültür Laktik Asit Bakterileri Micrococcaceae ve Staphylococcaceae Küfler Mayalar Biyojen Aminlerin Tanımı ve Genel Özellikleri Halk Sağlığı Açısından Biyojen Aminlerin Önemi Fermente Sucuklarda Biyojen Amin Oluşumunu Etkileyen Faktörler Sıcaklık ve ph Tuz Konsantrasyonu Kültür Biyojen Aminlerin Analiz Yöntemleri Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi HPLC Sisteminin Ekipmanları GEREÇ ve YÖNTEM Gereç 27

4 iv 2.2. Deneysel Türk Fermente Sucuk Yapımı Kültürlerin Düzeylerinin Saptanması Etin Doğal Florasında Bulunan Mikroorganizmaların Saptanması Sucuk Örneklerinin Alınması ve Mikrobiyolojik Analizlere Hazırlanması Mikrobiyolojik Analizler Aerob Mezofil Genel Canlı Saptanması Laktobasillerin Saptanması Mikrokok ve Stafilokokların Saptanması Enterobakterilerin Saptanması Koliform Bakterilerin Saptanması Enterokokların Saptanması Pseudomonas spp. Saptanması Oksidaz Testi Maya ve Küf Saptanması Biyojen Amin Miktarlarının Değerlendirilmesi Standartların Hazırlanması Geri Kazanım Örneklerin Hazırlanması ve Ekstraksiyonu Örnek Ekstraklarının Türevlendirilmesi Kültürlerin Biyojen Amin Oluşturma Yeteneklerinin Kontrolü Sucuk Örneklerindeki ve Kültürlerin Oluşturdukları Biyojen Amin Değerlerinin Hesaplanması Kimyasal Analizler ph Değerlerinin Ölçülmesi Tuz Miktarının Ölçülmesi Kuru Madde Miktarının Belirlenmesi Organoleptik Muayene İstatistiksel Analizler BULGULAR Mikrobiyolojik Analiz Sonuçları Aerob Mezofil Genel Canlı (AMGC) 42

5 v Laktik Asit Bakterileri (LAB) Mikrokok-Stafilokok Enterobakteri Koliform Enterokok Pseudomonas spp Maya-Küf Biyojen Amin Sonuçları Kültürlerin Biyojen Amin Oluşturma Yeteneklerinin Kontrolü Tiramin Histamin Kadaverin Putresin Feniletilamin Triptamin Spermin Spermidin Kimyasal Analiz Sonuçları ph Tuz Kuru Madde Organoleptik Muayene Sonuçları TARTIŞMA 97 SONUÇ ve ÖNERİLER 118 ÖZET 120 SUMMARY 121 KAYNAKLAR 122 ÖZGEÇMİŞ 130

6 vi ÖNSÖZ Beslenme insanoğlunun en temel gereksinimlerin başında gelmektedir. Bilim ve teknoloji alanında sağlanan gelişmeler dünyada refah ve kültür düzeyinin yükselmesine neden olmuş, bu durum insanlarda daha iyi ve sağlıklı yaşama isteğini doğurmuştur. Biyolojik değeri yüksek olan et ve et ürünleri, mineral maddeleri, vitaminleri ve özellikle esansiyel amino asitleri ve yağ asitlerini yeterli miktarda yapısında bulundurması nedeniyle insan beslenmesinde önemli bir yere sahiptir. Dünya üzerindeki zengin gıda kültürlerinden biri olan Türk beslenme kültürünün kökeni Orta Asya ya kadar uzanmaktadır. Türklerin Anadolu ya yerleşmesi ile birlikte tüm bu kültür ve geleneklerinin sentezi olan zengin gıda anlayışı oluşmuştur. Fermente Türk sucuğu da tarihi çok eskilere kadar uzanan geleneksel olarak tabir edilen bir et ürünüdür. Fermente sucuklarda, düşük hijyenik kalitede hammadde kullanımı, uygun olmayan koşullarda yapılan üretim ve yetersiz teknolojik işlemler arzu edilmeyen mikroorganizmaların bulunmalarına neden olmaktadır. Mikrobiyel açıdan güvenli ürün elde etmek halk sağlığı açısından yeterli olmamaktadır. Üründe, sağlığa zararlı hiçbir faktörün bulunmaması veya sınır değerleri aşmaması gerekmektedir. Biyojen aminler özellikle fermente ürünlerde yüksek düzeyde bulunabilen ve limit değerlerinin üstünde halk sağlığı açısından önemli sorunlar yaratabilen organik maddelerdir. Bu çalışmada, deneysel olarak yapılan Türk fermente sucuğunda farklı starter kültür kombinasyonları ve olgunlaşma sıcaklıklarının biyojen amin oluşturma üzerine etkisi araştırılmıştır. Tez çalışmamın konusunun seçiminde ve yürütülmesinde göstermiş olduğu ilgi ve katkıları nedeniyle başta danışmanım Prof. Dr. Özlem KÜPLÜLÜ olmak üzere bölüm başkanımız Prof. Dr. İrfan EROL, Prof. Dr. Sadi AKGÜN, Prof. Dr. T. Haluk ÇELİK, Prof. Dr. Belgin SARIMEHMETOĞLU, Doç. Dr. Haydar ÖZDEMİR, Doç. Dr. U. Tansel ŞİRELİ, Araş. Gör. Dr. Muammer GÖNCÜOĞLU ve bölümümüzün tüm araştırma görevlisi ve doktora öğrencisi arkadaşlarıma, HPLC aşamasında yardımını esirgemeyen Nilüfer VURAL a, istatistiksel değerlendirmede yardımlarını esirgemeyen Araş. Gör. Aytaç AKÇAY a, beni bu günlere kadar getiren ve desteklerini her zaman hissettiğim annem ve babam Zahide-Necdet GÜCÜKOĞLU na, kardeşim Aysun GÜCÜKOĞLU ile çok değerli hayat arkadaşım Burcu GÜCÜKOĞLU na ve beni geceleri uykusuz bırakmayarak tezimin yazılmasına yardımcı olan kızım Deren GÜCÜKOĞLU na sonsuz teşekkür ederim.

7 vii SIMGELER ve KISALTMALAR a w 0 C Su aktivitesi Santigrat derece M Molar ph Potansiyel hidrojen s Saniye ± Artı eksi µg Mikrogram µl Mikrolitre ANON Anonim AMGC Aerob mezofil genel canlı EBK Et ve Balık Kurumu DAO Diaminoksidaz DFD Dark, Firm, Dry FDA Food and Drug Administration FEN Feniletilamin GC Gaz kromatografisi GDL Glikono delto lakton GHP Good Hygiene Practice GMP Good Manufacturing Practice HACCP Hazard analysis Critical Control Point HİS Histamin HNMT Histamin-N-metiltransferaz HPLC High Performance Liquid Chromatography KAD Kadaverin KOB Koloni oluşturan birim LAB Laktik asit bakterisi LOG Logaritma LOD Limit of detection LOQ Liimit of quantitation MOAI Monoamin oksidaz inhibitör MAO Monoamin oksidaz MÖ Milattan Önce ND Not detected PCA Perklorik asit PCR Polymerase Chain Reaction PSE Pale, Soft, Exudative PUT Putresin SPRD Spermidin SPR Spermin TİR Tiramin TLC İnce tabaka kromatografisi TRP Triptamin TSE Türk Standartları Enstitüsü

8 viii ŞEKİLLER Şekil 1.1. Biyojen aminlerin oluşum mekanizması 12 Şekil 1.2. Biyojen amin oluşumunun metabolik yolu 13 Şekil 1.3. HPLC nin şematik gösterimi 26 Şekil 2.1. Fermente sucuk üretiminin şematik görüntüsü 29 Şekil 2.2. Organoleptik muayene şeması 40 Şekil 3.1. Biyojenik amin standartlarına ait kromotogram 67 Şekil 3.2. Sucuk örneklerine ait kromotogram 67 Şekil 3.3. Tiramin pik yüksekliğine ait kalibrasyon grafiği 69 Şekil 3.4. Histamin pik yüksekliğine ait kalibrasyon grafiği 69 Şekil 3.5. Kadaverin pik yüksekliğine ait kalibrasyon grafiği 69 Şekil 3.6. Putresin pik yüksekliğine ait kalibrasyon grafiği 69 Şekil 3.7. Feniletilamin pik yüksekliğine ait kalibrasyon grafiği 70 Şekil 3.8. Triptamin pik yüksekliğine ait kalibrasyon grafiği 70 Şekil 3.9. Spermin pik yüksekliğine ait kalibrasyon grafiği 70 Şekil Spermidin pik yüksekliğine ait kalibrasyon grafiği 70 Şekil de olgunlaştırılan sucuklarda olgunlaşma ve muhafaza periyodu boyunca tiramin miktarındaki değişim 72 Şekil de olgunlaştırılan sucuklarda olgunlaşma ve muhafaza periyodu boyunca tiramin miktarındaki değişim 72 Şekil de olgunlaştırılan sucuklarda olgunlaşma ve muhafaza periyodu boyunca histamin miktarındaki değişim 73 Şekil de olgunlaştırılan sucuklarda olgunlaşma ve muhafaza periyodu boyunca histamin miktarındaki değişim 75 Şekil de olgunlaştırılan sucuklarda olgunlaşma

9 ix ve muhafaza periyodu boyunca kadaverin miktarındaki değişim 76 Şekil de olgunlaştırılan sucuklarda olgunlaşma ve muhafaza periyodu boyunca kadaverin miktarındaki değişim 77 Şekil de olgunlaştırılan sucuklarda olgunlaşma ve muhafaza periyodu boyunca putresin miktarındaki değişim 78 Şekil de olgunlaştırılan sucuklarda olgunlaşma ve muhafaza periyodu boyunca putresin miktarındaki değişim 79 Şekil de olgunlaştırılan sucuklarda olgunlaşma ve muhafaza periyodu boyunca feniletilamin miktarındaki değişim 81 Şekil de olgunlaştırılan sucuklarda olgunlaşma ve muhafaza periyodu boyunca feniletilamin miktarındaki değişim 81 Şekil de olgunlaştırılan sucuklarda olgunlaşma ve muhafaza periyodu boyunca triptamin miktarındaki değişim 83 Şekil de olgunlaştırılan sucuklarda olgunlaşma ve muhafaza periyodu boyunca triptamin miktarındaki değişim 83

10 x ÇİZELGELER Çizelge 1.1. Et ürünlerinin sınıflandırılması 2 Çizelge 1.2. Türkiye de yılları arasındaki kırmızı et, kırmızı et ürünleri ve sucuk üretimi 4 Çizelge 1.3. Fermente sucuklarda starter kültürlerin etki mekanizmaları 7 Çizelge 2.1. Deneysel sucuk örneklerinin gruplandırılması 27 Çizelge 2.2. HPLC cihazının özellikleri ve biyojen amin analizi için kromatografi koşulları 34 Çizelge 3.1. Hammaddeye (Kıyma) ait mikrobiyolojik analiz bulguları 41 Çizelge 3.2. kültürlere ait mikrobiyolojik analiz bulguları 41 Çizelge 3.3. Sucuk örneklerinin olgunlaşma süresindeki aerob mezofil genel canlı düzeyi 42 Çizelge 3.4. Sucuk örneklerinin muhafaza süresindeki aerob mezofil genel canlı düzeyi 43 Çizelge 3.5. Sucuk örneklerinin olgunlaşma süresindeki aerob mezofil genel canlı sayılarının istatistiksel olarak değerlendirilmesi 44 Çizelge 3.6. Sucuk örneklerinin muhafaza süresindeki aerob mezofil genel canlı sayılarının istatistiksel olarak değerlendirilmesi 44 Çizelge 3.7. Sucuk örneklerinin olgunlaşma süresindeki laktik asit bakteri düzeyi 45 Çizelge 3.8. Sucuk örneklerinin muhafaza süresindeki laktik asit bakteri düzeyi 46 Çizelge 3.9. Sucuk örneklerinin olgunlaşma süresindeki laktik asit bakteri sayısının istatistiksel olarak değerlendirilmesi 47 Çizelge Sucuk örneklerinin muhafaza süresindeki laktik asit bakteri sayısının istatistiksel olarak değerlendirilmesi 47 Çizelge Sucuk örneklerinin olgunlaşma süresindeki mikrokok-stafilokok düzeyi 48 Çizelge Sucuk örneklerinin muhafaza süresindeki

11 xi mikrokok-stafilokok düzeyi 49 Çizelge Sucuk örneklerinin olgunlaşma süresindeki mikrokok-stafilokok sayılarının istatistiksel olarak değerlendirilmesi 50 Çizelge Sucuk örneklerinin muhafaza süresindeki mikrokok stafilokok sayılarının istatistiksel olarak değerlendirilmesi 50 Çizelge Sucuk örneklerinin olgunlaşma süresindeki enterobakteri düzeyi 51 Çizelge Sucuk örneklerinin muhafaza süresindeki enterobakteri düzeyi 52 Çizelge Sucuk örneklerinin olgunlaşma süresindeki enterobakteri sayılarının istatistiksel olarak değerlendirilmesi 53 Çizelge Sucuk örneklerinin muhafaza süresindeki enterobakteri sayılarının istatistiksel olarak değerlendirilmesi 53 Çizelge Sucuk örneklerinin olgunlaşma süresindeki koliform düzeyi 54 Çizelge Sucuk örneklerinin muhafaza süresindeki koliform düzeyi 55 Çizelge Sucuk örneklerinin olgunlaşma süresindeki koliform bakteri sayılarının istatistiksel olarak değerlendirilmesi 56 Çizelge Sucuk örneklerinin muhafaza süresindeki koliform bakteri sayılarının istatistiksel olarak değerlendirilmesi 56 Çizelge Sucuk örneklerinin olgunlaşma süresindeki enterokok düzeyi 57 Çizelge Sucuk örneklerinin muhafaza süresindeki enterokok düzeyi 58 Çizelge Sucuk örneklerinin olgunlaşma süresindeki enterokok sayılarının istatistiksel olarak değerlendirilmesi 59 Çizelge Sucuk örneklerinin muhafaza süresindeki enterokok sayılarının istatistiksel olarak değerlendirilmesi 59 Çizelge Sucuk örneklerinin olgunlaşma süresindeki Pseudomonas spp.düzeyi 60 Çizelge Sucuk örneklerinin muhafaza süresindeki Pseudomonas spp.düzeyi 61

12 xii Çizelge Sucuk örneklerinin olgunlaşma süresindeki Pseudomonas spp. sayılarının istatistiksel olarak değerlendirilmesi 62 Çizelge Sucuk örneklerinin muhafaza süresindeki Pseudomonas spp. sayılarının istatistiksel olarak değerlendirilmesi 62 Çizelge Sucuk örneklerinin olgunlaşma süresindeki maya küf düzeyi 63 Çizelge Sucuk örneklerinin muhafaza süresindeki maya küf düzeyi sayısı 64 Çizelge Sucuk örneklerinin olgunlaşma süresindeki maya ve küf sayılarının istatistiksel olarak değerlendirilmesi 65 Çizelge Sucuk örneklerinin muhafaza süresindeki maya ve küf sayılarının istatistiksel olarak değerlendirilmesi 65 Çizelge Kıymaya ait biyojen amin sonuçları 66 Çizelge HPLC analiz verilerinin doğrusallığı 68 Çizelge İn vitro ortamda starter kültür kombinsyonlarının, biyojen amin oluşturma yeteneklerinin saptanması aşamasındaki sayısal değerleri 71 Çizelge Sucuk örneklerinin olgunlaşma süresince oluşan tiramin miktarının istatistiksel olarak değerlendirilmesi 73 Çizelge Sucuk örneklerinin muhafaza süresince oluşan tiramin miktarının istatistiksel olarak değerlendirilmesi 73 Çizelge Sucuk örneklerinin muhafaza süresince oluşan histamin miktarının istatistiksel olarak değerlendirilmesi 75 Çizelge Sucuk örneklerinin muhafaza süresince oluşan kadaverin miktarının istatistiksel olarak değerlendirilmesi 77 Çizelge Sucuk örneklerinin olgunlaşma süresince oluşan putresin miktarının istatistiksel olarak değerlendirilmesi 79 Çizelge Sucuk örneklerinin muhafaza süresince oluşan putresin miktarının istatistiksel olarak değerlendirilmesi 80 Çizelge Sucuk örneklerinin muhafaza süresince oluşan feniletilamin miktarının istatistiksel olarak değerlendirilmesi 82 Çizelge Sucuk örneklerinin muhafaza süresince oluşan triptamin

13 xiii miktarının istatistiksel olarak değerlendirilmesi 84 Çizelge Olgunlaşma süresinde spermin miktarındaki değişim 85 Çizelge Muhafaza süresinde spermin miktarındaki değişim 85 Çizelge Hammaddeye (kıyma) ilişkin kimyasal analiz bulguları 86 Çizelge Sucuk örneklerinin olgunlaşma süresindeki ph değerleri 87 Çizelge Sucuk örneklerinin muhafaza süresindeki ph değerleri 88 Çizelge Sucuk örneklerinin olgunlaşma süresindeki ph değişimlerinin istatistiksel olarak değerlendirilmesi 89 Çizelge Sucuk örneklerinin muhafaza süresindeki ph değişimlerinin istatistiksel olarak değerlendirilmesi 89 Çizelge Sucuk örneklerinin olgunlaşma süresindeki tuz değerleri 90 Çizelge Sucuk örneklerinin muhafaza süresindeki tuz değerleri 91 Çizelge Sucuk örneklerinin olgunlaşma süresindeki tuz miktarı değişimlerinin istatistiksel olarak değerlendirilmesi 92 Çizelge Sucuk örneklerinin muhafaza süresindeki tuz miktarı değişimlerinin istatistiksel olarak değerlendirilmesi 92 Çizelge Sucuk örneklerinin olgunlaşma süresindeki kuru madde değerleri 93 Çizelge Sucuk örneklerinin muhafaza süresindeki kuru madde değerleri 94 Çizelge Sucuk örneklerinin olgunlaşma süresindeki kuru madde değişimlerinin istatistiksel olarak değerlendirilmesi 95 Çizelge Sucuk örneklerinin muhafaza süresindeki kuru madde değişimlerinin istatistiksel olarak değerlendirilmesi 95 Çizelge Organoleptik muayene sonuçları 96

14 1 1. GİRİŞ İnsan organizmasının yapı taşlarını oluşturan amino asitlerin bir kısmının vücut dışından, özellikle de hayvansal orijinli gıdalardan alınması zorunludur. Bu ihtiyacın karşılanacağı gıdaların başında da et ve et ürünleri gelmektedir (Incze, 1998; Ordonez ve ark., 1999; Anon, 2006). Et ve et ürünleri çok uzun yıllardan beri insanlar tarafından sevilerek tüketilen hayvansal gıdaların başında gelmektedir. İnsanların beslenme alışkanlıklarının farklılaşması sonucunda bu ürünlere olan talebin artması, değişik tip ve özelliklerde et ürünleri üretimini artırmıştır. Bu durum konuyla ilgili çeşitli araştırmaların yapılmasına zemin hazırlamaktadır (Zeuthen, 1995; Essien, 2003). Et ve et ürünleri patojen mikroorganizmalar dahil olmak üzere çok geniş bir mikroorganizma grubunun gelişme ve çoğalmaları için iyi bir ortamdır. Tüketime sunulan ürünlerdeki hijyenik kalitenin düşük olmasıyla ortaya çıkan infeksiyon ve intoksikasyonlar halk sağlığı açısından oldukça önemlidir. Geleneksel veya modern yöntemlerle etin dayanıklı hale getirilmesinde ki amaçlardan birisi de, patojen veya bozulma yapan mikroorganizmaların yok edilmesi veya gelişme ve çoğalmalarının engellenmesidir. Ancak mikrobiyolojik açıdan güvenilir ürünler elde etmek sağlık açısından değerlendirmede yeterli olmamaktadır. Bu kapsamda üründe sağlığa zararlı hiçbir maddenin bulunmaması veya belirtilen sınırları aşmaması gerekmektedir (Campell-Platt, 1995; Lawrie, 1995; Ordonez ve ark., 1999). Et ürünleri içerisinde sucuk, et endüstrisinin en önemli dallarından birisini oluşturmaktadır. Bilhassa özel sektörün bu sahada yaptığı yatırımlar, bu konuda çok fazla teknik bilgi ve araştırma gerektirecek düzeye ulaşmıştır. (Kandemir, 2001; Anon, 2006).

15 Et Ürünlerinin Sınıflandırılması ümüzde birçok ülkede beslenme alışkanlıklarının farklılığına göre geleneksel veya değişik teknolojik işlemlerle et ürünleri üretilmektedir. Bunun doğal sonucu olarak et ürünlerinin sınıflandırılması Çizelge 1.1. de belirtildiği gibi değişiklik göstermektedir (Campell-Platt,1995). Çizelge 1.1. Et Ürünlerinin Sınıflandırılması (Campell-Platt, 1995). Ürün Tipi Ürün Özelliği Örnek Salamura et ürünleri Isı işlemi görmüş et ürünleri 1. Taze et ürünleri (Taze sucuklar) 2. Isı işlemi görmüş et ürünleri 2. Isı işlemi görmüş, dumanlanmış et ürünleri 4. Üretimde ısı işlemi görmemiş, dumanlanmış et ürünleri Kuru ve yarı kuru sucuklar Tuzlanmış ve/ veya kürlenmiş ve havada kurutulduktan sonra çemenlenmiş et Kürlenmez ve dumanlanmaz, tüketilmeden önce ısı işlemi görür. Dumanlanmaz,soğuk tüketilir. Tercihen tüketilmeden önce ısı işlemi görür, dumanlanabilir. Tüketilmeden önce ısı işlemi görür. Pastırma Bockwurst Bratwurst Taze domuz sucuğu Leberkase Braunschweiger Karaciğer sucuğu Liver cheese Frankfurters Wieners Berliner Bologna Cotto salami Kielbasa Mettwurst Fermente sucuklar Türk fermente sucuğu Kuru sucuk Macar salamı Chorizo Isı işlemi görmüş sucuklar Lebanon Bologna Genoa salami Pepperoni Yaz sucuğu Yarıkuru sucuk

16 3 Fermentasyon ve kurutma işlemleri eti uzun süre muhafaza etmek ve yeni ürün üretmek amacıyla kullanılan en eski yöntemlerdir. Et ürünlerinde fermentasyon işlemi mikroorganizma, et ve teknolojinin buluştuğu bir prosestir (Molly ve ark.,1997; Incze, 1998; Caplice ve Fitzgerald, 1999; Nassu ve ark., 2003; Sakhare ve Rao, 2003). Sucuk dünyada birçok toplum tarafından bilinen ve farklı üretim teknikleriyle çeşitlilik arz eden bir üründür. Sucuğa ait ilk bilgiler MÖ. 500 yılına kadar uzanmakta ve en eski yemek kitabı olarak bilinen Deipnosophists isimli kitapta sucuktan bahsedilmektedir (Zeuthen, 1995) Fermente Türk Sucuğu ve Fermente Sucuk Üretimi Üzerine Etkili Olan Bazı Faktörler Fermente Türk sucuğu, fazla miktarda baharat ihtiva eden, genelde orta düzeyde asidik lezzette, havada kurutulmuş ve dumanlama işlemi görmemiş fermente et ürünüdür. Sucuk üretimi, parçalanmış çiğ et ve yağ karışımına baharat, tuz, karbonhidrat ve diğer katkı maddelerinin ilave edilmesi ile oluşan, sucuk hamurunun doğal veya sentetik kılıflara dolumunu takiben belirli sıcaklık, relatif rutubet ve hava akımında olgunlaştırılması ve kurutulması proseslerini kapsamaktadır (İnal, 1969; Tekinşen ve ark., 1982; Yurtyeri ve ark., 1993). TS-1070 e göre Türk sucuğu, Kasaplık büyükbaş hayvan gövde etlerinden hazırlanan hamurun, doğal veya yapay kılıflara doldurulması ve bir süre bekletilerek olgunlaştırılması ile elde edilen et ürünüdür şeklinde tanımlanmıştır (Anon, 1984). Ülkemizde kırmızı et üretimi göz önüne alındığında sucuk üretimi toplam et ürünleri içerisinde önemli bir yer tutmaktadır. Bu ürünlere olan talebin Çizelge 1.2. de gösterildiği gibi yıldan yıla artması, bu konuda çok çeşitli araştırmaların yapılmasını zorunlu kılmaktadır (Anon, 2006; Anon, 2007).

17 4 Çizelge 1.2. Türkiye de yılları arasındaki kırmızı et, kırmızı et ürünleri ve sucuk üretimi (Anon, 2006; Anon, 2007). Yıllar (BinTon) Üretim Kırmızı et 675, , , , , ,914 Kırmızı et ürünleri (pastırma, salam, sosis, sucuk) 59,036 51,197 51,550 55,717 63,580 65,080 Sucuk 18,584 14,726 13,565 16,289 17,761 14,619 Üstün kaliteli sucuk üretiminde en önemli koşul, olgunlaşma sırasında sucuklarda istenilen düzeyde uygun mikroflorayı oluşturarak yeterli enzim aktivasyonunu sağlamaktır. Bunun için de yapılması gereken işlemler, öncelikle sucuk yapımına uygun üstün kaliteli hammadde ve katkı kullanımı, ürünün hijyenik koşullarda tekniğine uygun hazırlanması, dolum ve son olarakta en iyi üretim parametrelerinin belirlenerek uygulanması şeklinde sıralanmaktadır (Acton ve Dick, 1977; Dinçer, 1985) ph Etin ph sı sucuk kalitesini etkileyen en önemli faktörlerden biridir. Yüksek ph değerine sahip DFD et (dark, firm, dry/koyu, sert kuru), normal ph değerine sahip ete göre çok hızlı bozulmaya uğrayacağından ve su tutma kapasitesi yüksek olacağından fermente sucuk yapımına uygun değildir (Newton ve Gill, 1981; Öztan, 1999). Buna karşın normal etle birlikte, renk kalıcılığı yüksek olan ph sı düşük PSE etin (pale, soft, exudative/soluk, yumuşak, sulu) fermente sucuk yapımında kullanılabileceği bildirilmektedir (Lücke, 1985; Öztan, 1999; Arslan, 2002). Fermente sucuklarda ph nın düşürülmesi buna bağlı olarak sucuk yapısının oluşumu ve tat-koku gelişimi, ette mevcut olan ile daha sonra ilave edilen

18 5 karbonhidratların bakteriyel metabolizması sonucunda oluşan laktik asit oluşumuna bağlıdır. Bu nedenle, fermente sucukların yapılarında bazı karbonhidratların kullanılması ürünün kalitesini artırması bakımından zorunludur. Karbonhidrat miktarı ve çeşidi, laktik asit oluşumu ve sucuk mikroflora kompozisyonu açısından önemlidir. Hızlı metabolize olabilen karbonhidratların eklenmesi ph yı hızla düşürmekte, bu da düşük ph derecelerine duyarlı patojen mikroorganizmaların inhibisyonunu sağlamaktadır. Diğer yandan çok az karbonhidrat ilavesi, ph yı istenilen seviyeye düşürmediğinden, arzu edilmeyen mikroorganizmaların üremesini teşvik edebilmektedir. Fermente sucuklarda hızlı ve yavaş metabolize olabilen karbonhidratların birlikte kullanımı önerilmektedir. Bu amaçla sucuklarda en çok dekstroz, sakkaroz ve laktoz kullanılmaktadır (Pyrcz ve Pezacki, 1981; Lücke, 1985; Vural, 1992) Tuz Sucuklara % 2-4 oranında tuz ilavesi, sucuk hamurunun su aktivitesini (a w ) düşürmektedir. Bu da istenilmeyen mikroorganizmaların üremesini önlemekte ve ürün için yararlı bazı bakterilerin gelişimini kolaylaştırmaktadır. Ayrıca kürleme maddesi olarak tuz ile beraber kullanılan nitrat ve nitritin fermente sucuklardaki işlevleri, renk oluşumu, ransiditenin önlenmesi ve ortamda bulunması istenmeyen mikrofloranın gelişim ve fonksiyonlarının engellenmesi şeklinde sıralanmaktadır (Demasi ve ark., 1989; Noel ve ark., 1990; Öztan, 1995) Kültür Fermente sucuklarda arzulanan kıvam, lezzet, aroma ve rengin şekillenmesi olgunlaşma sırasında meydana gelen sucuk hamurundaki spontan mikroorganizmaların, enzimatik ve biyokimyasal reaksiyonlarına bağlıdır. Fermente sucuğun olgunlaşması ve buna bağlı olarak kalite niteliklerinin gelişmesinde en önemli faktör mikrobiyel aktivitelerdir. Olgunlaşmada laktobasiller, pediyokoklar, mikrokoklar ve stafilokoklar önemli rol oynar. Fermente sucuklarda arzu edilen

19 6 kalite kriterlerinin oluşması, olgunlaşmada rol oynayan bu bakteri gruplarının florada bulunma düzeyleri ve oluşturdukları etkilerle yakından ilgilidir. Fermente sucukların duyusal kaliteleri, olgunlaşma sırasında et proteinlerinde oluşan proteolitik değişikliklere bağlı olarak şekillenir. Proteinlerin büyük kısmı mikrobiyel proteazlarla hidrolize olurlar. Hidroliz sonucu oluşan suda çözünebilen serbest amino asitler, peptidler, nükleotidler ve nükleosidler gibi azotlu bileşiklerin miktarında artış olmaktadır. Bu komponentlerin artışlarıyla orantılı olarak da sucuklar hoşa giden lezzet ve aromaya sahip olurlar (Vignolo ve ark., 1988; Hugas ve Manfort, 1997). Fermente sucukların kendine özgü nitelikleri kazanması mikroorganizmaların faaliyeti sonucu olmaktadır. Bu mikroorganizmalar ürüne hammaddeden yada üretim esnasında kullanılan alet ve ekipmandan kontaminasyonlarla veya mikrobiyel starter kültürlerin sucuklara katılması yoluyla girmektedir. kültürler, belirli sayıda canlı mikroorganizmaların tek veya karışık kültürlerini taze, donmuş veya liyofilize formda içeren, fermente gıda ürünlerinin (Fermente et ve süt ürünleri, meşrubat, bira vb) üretiminde kullanılan, enzimatik özellikleri sayesinde fermentasyon olaylarını hızlandıran ve arzu edilen nitelikte ürünlerin elde edilmesine olanak sağlayan mikroorganizmalardır. Koruyucu kültürler gıda kaynaklı zehirlenmeye neden olan, arzu edilmeyen mikroorganizmaların üremesini engelleyerek mikrobiyel güvenliği sağlayan kültürlerdir. Fermente et ürünlerinde starter kültürlerin biyolojik aktivitesi, aromanın oluşması, rengin gelişimi ve ürünün konsistensi gibi arzu edilen değişiklere neden olur ve ürüne özgü karakteri belirler. kültürler, sucuklarda fermentasyon sürecini kontrol etmek, olgunlaşma süresini kısaltmak, standart tip ve istenilen düzeyde kalite niteliklerine sahip fermente sucuk üretmek amacıyla kullanılmaktadır (Giesen ve ark., 1992; Yurtyeri ve ark., 1993; Dinçer ve ark., 1995). Fermente sucuk üretiminde kullanılacak starter kültürlerin, sucuğun doğal florasında bulunan ve olgunlaşmada rol oynayan mikroorganizmalardan seçilmeleri gereklidir. olarak kullanılacak kültürler sağlık açısından güvenli olmalarının yanı sıra kolay kullanılabilme özelliğini taşımalıdırlar. Fermente sucuk üretiminde kullanılan starter kültürler üründe renk, aroma ve konsistensin oluşumunu sağlarlar, koruyucu etki gösterirler, üretim süresini kısaltırlar ve standart ürün üretimini

20 7 sağlarlar. kültür kullanmaksızın fermente sucuk üretimi mümkün olmakla birlikte, bu tür üretimlerde doğal floranın değişkenliğine bağlı olarak hatalı ürünler ortaya çıkmaktadır (Arslan, 2002; Leroy ve ark., 2006). Fermente sucuk üretiminde hatalı üretim rizikosunu azaltmak, arzu edilen kalite niteliklerini elde etmek ve üretimde stabiliteyi sağlamak için, ürün tipine göre seçilmiş starter kültürler kullanılmaktadır. ümüzde et endüstrisinde starter kültür olarak kullanılan mikroorganizmaların etki mekanizmaları Çizelge 1.3. de gösterilmiştir (Lücke ve Hechelman, 1987; Yurtyeri ve ark., 1989). Çizelge 1.3. Fermente sucuklarda starter kültürlerin etki mekanizmaları (Lücke ve Hechelman, 1987; Yurtyeri ve ark., 1989). Kalite Kriterleri Etki Şekli Laktik asit bakterileri Mikrokok Stafilokok Mayalar Küfler RENK Nitrat redüksiyonu ph düşüşü Sucuğun merkezinde Eh-düşüşü H 2 O 2 in parçalanması AROMA Asit oluşumu Proteolitik etki Lipolitik etki Ransiditeyi geciktirme KIVAM OLUŞUMU KORUYUCU ETKİ ph-düşüşü ph-düşüşü Nitrat redüksiyonu Arzu edilmeyen floranın baskılan ması YÜZEYSEL KORUMA Oksijen ve ışıktan koruma Kurumayı geciktirme REZİDÜ OLUŞUMU Nitrit yıkımı Mikotoksin oluşumunu önleme : Yüksek düzeyde kesin etkili, ++: Önemli düzeyde etkili, +: Az düzeyde etkili, - : Etkisiz

21 Laktik Asit Bakterileri (LAB) Bu bakterilerden Lactobacillus plantarum, Lactobacillus sake, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus bavaricus, Lactobacillus brevis, Lactobacillus alimentarius, Lactobacillus carnis, Lactobacillus viridescens, Lactobacillus agilis, Lactobacillus casei sups. rhamnosus, Pediococcus pentosaceus, Pediococcus acidilactici, Pediococcus cerevisiae ve Pediococcus parvulus fermente sucuk teknolojisinde sıklıkla kullanılan türlerdir. Bu türler gram (+), sporsuz, katalaz negatif, fakültatif anaerob ve çubuk şeklindedirler. Optimum üreme sıcaklıkları farklı olup Lactobacillus sake ve Lactobacillus curvatus 20-, Pediococcus pentosaceus ve Lactobacillus plantarum C arasında, Pediococcus acidilactici 40 0 C nin üzerinde optimum aktivite gösterirler. kullanmaksızın C lerde olgunlaştırılan sucuklarda Lactobacillus curvatus ve Lactobacillus sake nin, 25 0 C nin üstünde olgunlaştırılan sucuklarda ise Lactobacillus plantarum un dominant olduğu belirtilmektedir. Lactobacillus plantarum farklı şekerleri fermente etmesine karşın, Lactobacillus sake yalnızca maltozu, Lactobacillus curvatus ise laktoz ve sakkarozu fermente eder. Laktobasiller ve diğer laktik asit bakterileri, fermente et ürünleri teknolojisinde etin doğal mikroflorası içinde spontan kültür, dominant kültür ve starter kültür olarak büyük öneme sahiptir. Fermente et ürünleri üretiminde fermentasyon sürecinde ürünün organoleptik özeliklerini etkileyecek asetat, etanol, format, suksinat, aseton ve karbondioksit gibi arzu edilmeyen bileşikleri üretmeyecek homofermentatif kültürler kullanılmalıdır (Schillinger ve Lücke, 1987; Lücke ve Hechelman, 1987; Arslan, 2002). Bu türler glikoz ve diğer karbonhidratlardan asit oluşturarak, ph değerini ve su aktivitesi (a w ) değerini düşürürler. Böylece sucuğa dayanıklılık ve aynı zamanda hafif laktik asit aroması ile indirekt olarak renk oluşumuna katkıda bulunurlar. Laktik asit bakterileri fermente sucukların kalitesini değişik şekillerde etkiler. Laktik asit bakterilerinin en önemli özelliği sucuk hamurunda doğal olarak bulunan ve sucuk hamurunun hazırlanması sırasında katılan karbonhidrat kaynaklarından laktik asit ve diğer organik asitleri oluşturmasıdır. Laktik asit oluşumu ve ph değerinin düşmesi ürüne asit lezzet verir, hijyenik kaliteyi düzenler, ürünün raf ömrünü uzatır ve ürüne özgü kırmızı renk oluşumunu aktive

22 9 eder (Lücke ve Hechelman, 1987; Honkavaara, 1988; Yurtyeri ve ark., 1989; Girard ve Bucharles, 1992; Leroy ve ark., 2006). Laktik asit bakterileri tarafından oluşturulan antibakteriyel etkiye sahip metabolitler vardır. Bu metabolitlerden bazıları diasetil, asetik asit, karbondioksit, laktik asit, reuterin, hidrojen peroksit, 2-pyrrolidone-5-carboxylic asit (PCA) ve bakteriyosin olarak sıralanmaktadır (Montel ve ark., 1993; Garriga, 1996; Leroy ve ark, 2006). Laktik asit bakterilerinin starter kültür olarak kullanımı, özellikle yüksek sıcaklık derecesinde (25 0 C veya üzerinde) olgunlaştırılan sucuklarda önemlidir. Çünkü yüksek sıcaklık derecelerinde olgunlaştırmadan kaynaklanacak, mikrobiyel rizikonun azaltılması ancak başlangıçtaki hızlı asitleşmeye bağlı olarak, ph değerinin düşürülmesi ile mümkündür. Laktik asit bakterileri genelde koruyucu özelliğe sahip olup özellikle ph değerinin düşmesini sağlayarak, arzu edilmeyen mikroorganizmaların gelişimini baskılarlar. Buna ilaveten et proteinlerinin izoelektrik ph değeri olan 5,30-5,40 a düşmesi ile hem sucuğun su kaybetmesini hem de proteinlerin koagüle olması ile sucukta bağlanmayı sağlarlar (Hammes ve Knauf, 1994; Leroy ve ark., 2006) Micrococcaceae ve Staphylococcaceae Bu familyalarda yer alan Micrococcus varians, Micrcoccus aurantiacus, Micrococcus aurantiacus M53, Staphylococcus carnosus, Staphylococcus xylosus, Staphylococcus simulans ve Staphylococcus saprophyticus sıklıkla kullanılan türlerdir. Bu türler gram (+), katalaz pozitif ve nitrat redükte eden, aerob koklardır. ph 5,4 ün altında üremezler. Kolay fermente edilebilir şekerler (monosakkarit) kullanıldığında ortamın ph sı çok çabuk düşeceği için bu mikroorganizmaların aktivitesi engellenir ve beklenen yarar sağlanamaz. Bu türlerin hepsi % 10 NaCl içeren besi yerlerinde üreyebilen, katalaz, lipaz ve proteaz enzimlerine sahip nitrat indirgeyen fakat anaerob koşullarda üreme yetenekleri zayıf olan

23 10 mikroorganizmalardır. kültür olarak kullanılan, mikrokok ve stafilokok türlerinin metabolik etkileri ve bazı fizyolojik özellikleri birbirinden farklı olduğu için, üretimde genelde karışım halinde kullanılmaları gerekir. Fermentasyon sürecinde mikrokok ve stafilokoklar; nitratın nitrite, nitritin nitritoksite dönüşümünde, proteolizisde ve trigliseridlere karşı lipolitik aktivasyonda önemli rol oynarlar (Selgas ve ark., 1993). Ayrıca bu starter kültürler, sucuk içerisindeki kalıntı nitrat ve nitrit miktarını düşürmesi yönüyle de ayrı bir önem taşırlar. Laktobasiller tek başlarına starter kültür olarak kullanıldıklarında sucuklarda renk ve aroma kusurları oluşturduklarından, bu kusurları azaltmak için laktobasiller ve mikrokoklar kombine olarak kullanılmaktadır. Mikrokok ve stafilokokların nitrat redüksiyon aktiviteleri sucuğun ph değeri ile yakından ilgili olup, ph 5,0 değerinin altına düştüğü durumlarda, bu bakterilerin nitrat redüksiyon aktivitelerinin çok yavaşladığı veya tamamen durduğu bilinmektedir (Yurtyeri ve ark., 1989; Hammes ve Knauf, 1994; Hammes ve Hertel, 1998; Arslan, 2002; Leroy ve ark., 2006) Küfler Küfler, proteolitik ve lipolitik aktiviteleri nedeniyle fermente sucuklarda karakteristik yüzey görünümünü ve arzu edilen aroma oluşumunu sağlamaktadır. Küf üremesiyle, oksijenin ransidite ve renk değişimiyle sonuçlanabilecek olumsuz etkileri önlenebilmektedir. Küfler teknolojik olarak önemli olan ektoproteaz ve ektolipaz enzimlerini üretirler. Ektoproteaz proteinleri kısa zincirli peptitlere ve aminoasitlere, ektolipaz ise yağların gliserin ve serbest yağ asitlerine kadar parçalar. Yüksek moleküler ağırlığa sahip olmayan bu parçalanma ürünleri organoleptik olarak aktif bileşiklerdir ve ürünün aroma kazanmasına katkıda bulundukları bildirilmektedir (Yurtyeri ve ark., 1989; Geisen ve ark., 1992; Hammes ve Knauf, 1994; Leroy ve ark., 2006). Fermente et ürünleri teknolojisinde kullanılacak starter küf kültürlerinin toksijenik ve patojenik potansiyeli olmamalıdır, sucuk yüzeyinde gelişebilecek diğer mikroorganizmalar ile rekabet edebilmeli, karekteristik küf aroması verebilmeli, proteolitik ve lipolitik aktiviteye sahip olmalıdır. Penicillium nalgiovense, Penicillium camembertii ve Penicillium candidum gibi türler bazı ülkelerde

24 11 geleneksel olarak üretilen fermente sucuklar ile bazı peynirlerin yapımında (Camembert) kullanılmaktadır (Hammes ve Knauf, 1994) Mayalar Fermente sucuk üretimine uygun ve insan sağlığı için zararlı olmayan Debaryomces hansenii ve Candida famata fermentasyon sürecinde oluşan kırmızı rengi stabilize etmek ve karekteristik maya aromasının gelişimini sağlamak amacıyla fermente et ürünlerinde starter kültür olarak kullanılmaktadır. Bu mikroorganizmalar tuz toleransı yüksek, aerob, a w 0,87 değerinde üreyebilen mikroorganizmalardır. Sucuğun yüzeyinde ve sucuk hamurunun dış kısımlarında üreme yeteneğine sahip olan mayalar fermentasyon sürecinde mikrokoklar tarafından gerçekleştirilen nitratın nitrite indirgenme tepkimesini engellemektedir (Yurtyeri ve ark., 1989; Hamnes ve Knauf, 1994; Leroy ve ark., 2006) Biyojen Aminlerin Tanımı ve Genel Özellikleri Proteince zengin fermente gıdalarda mikrobiyolojik değişimler sırasında gelişen olaylardan en önemlisi proteolizisdir. Proteolizisde, proteinler önce eksopeptidazlar vasıtasıyla yüksek molekül ağırlıklı peptidlere, daha sonrada endopeptidazlar vasıtasıyla serbest amino asitlere kadar indirgemektedir. Oluşan serbest amino asitlerin önemli bir kısmı daha sonradan gelişen yıkımlanma reaksiyonlarına girerek amin yapısında vasoaktif toksik maddelerin oluşumuna sebep olmaktadır (Halasz ve ark., 1994; Bardöcz, 1995; Masson ve ark., 1997; Lehane ve Olley, 2000). Fermente gıdalarda, proteinlerin yıkımlanmasına bağlı olarak amin oluşumu Şekil 1.1. de gösterildiği şekilde aldehit ve ketonların aminasyonu, spesifık amino asitlerin mikrobiyel dekarboksilasyon yolu ile sekonder dönüşümü ya da azotlu bileşiklerin ve azotlu parçalanma ürünler gibi nitrojen içeren komponentlerin hidrolizi şekilde meydana geldiği bildirilmektedir (Nout, 1994; Santos, 1996; Shalaby, 1996; Leuschner ve ark., 1998).

25 12 Şekil 1.1. Biyojen aminlerin oluşum mekanizması (Santos, 1996). Biyojen aminler gıdalarda mikrobiyel aktivite sonucu amino asitlerin dekarboksilasyonu veya aldehit ve ketonların aminasyonu ile oluşan düşük molekül ağırlıklı organik bazlardır (Buatti ve ark., 1995; Hornero- Mendez ve Garrido- Fernandez, 1997; Soleas ve ark., 1999). Bu aminler kimyasal yapılarına göre alifatik (putresin, kadaverin), aromatik (tiramin, feniletilamin) ve heterosiklik (histamin, triptamin) olmak üzere üç gruba ayrılırken içerdikleri azot sayısına göre de monoaminler, diaminler ve poliaminler olarak gruplandırılırlar (Til ve ark., 1997). Aminoasitlerden karboksil kökünün parçalanmasıyla söz konusu aminoasitin amini oluşmaktadır. Aminoasitlerden karbondioksidin ayrılmasına dekarboksilasyon, ilgili enzime dekarboksilaz adı verilir. Dekarboksilasyondan sorumlu enzimler hem hayvansal ve bitkisel dokular hem de mikroorganizmalar tarafından oluşturulabilirler. Genellikle dekarboksilazlar ya özel olarak bir tek aminoaside ya da bir dizi farklı aminoaside etki ederler. Çeşitli bakteri türlerinin aminoasitleri dekarboksile etme kabiliyetleri farklıdır. Bazı türler birçok aminoasiti dekarboksile ederken bazıları ise substrata özel dekarboksilaz aktivitesine sahip olup yalnız bir tek aminoasite etki ederler (Santos, 1996; Shalaby, 1996; Leuschner ve ark., 1998).

26 13 Biyojen aminlerden en yaygın olarak histamin ve tiramin bilinmesine rağmen triptamin, putresin, kadaverin, serotonin, spermidin, spermin, agmatin ve feniletilamin gibi aminler de birçok gıdada dekarboksilaz aktiviteleri sonucu oluşmaktadır. Kadaverin, putresin, histamin, tiramin, triptamin gibi biyojen aminler Şekil 1.2. de gösteridiği biçimde sırasıyla lisin, ornitin, histidin, tirozin ve triptofan aminoasitlerinin dekarboksilasyonu sonucu oluşmaktadır (Ten Brink ve ark., 1990; Halasz ve ark., 1994; Moret ve Conte, 1996). Şekil 1.2. Biyojen amin oluşumunun metabolik yolu (Halasz ve ark., 1994).

27 14 Gıdalarda aminoasitleri dekarboksilaz enzimi ile indirgeyen ve biyojen amin oluşumuna neden olan birçok mikroorganizma izole edilmiştir. Bunlardan, patojenlerin yanısıra patojen olmayan ve starter kültür niteliğinde olan türlerin de bulunduğu bildirilmektedir. Bu mikroorganizmalara Bacillus, Pseudomonas, Photobacterium türleri, Enterobakterilerden; Citrobacter, Klebsiella, Escherichia, Proteus, Salmonella ve Shigella türleri, Mikrokok ve stafilokoklardan, Staphylococcus ve Micrococcus türleri, Laktik asit bakterilerinden; Lactobacillus, Enterococcus, Carnobacterium, Pediococcus, Lactococcus ve Leuconostoc türleri ile Mayalardan; Debaryomyces ve Candida türleri örnek olarak verilmektedir (Suzzi ve Gardini, 2001). Gıdalarda genelde önemli olan biyojen aminler histamin, kadaverin, tiramin, triptamin, feniletilamin, spermin ve spermidin olarak belirtilmektedir. Biyojen aminlerden histamin ve tiramin, biyolojik aktiviteli, düşük molekül ağırlıklı organik bazlar olup insan ve hayvan fizyolojisinde bazı önemli fonksiyonlara aracılık eden kimyasal etkisi güçlü biyolojik olarak aktif aminlerdir. Bunlardan diamin grubuna dahil olan histamin, sokucu insektlerin tükrük bezi sekreti, arı zehiri, ısırgan otu ve çavdar mahmuzu gibi bitkisel ve hayvansal dokularda, monoamin grubuna dahil olan tiramin ise gıdaların pek çoğunda özellikle de fermente gıdalarda doğal olarak tirozin derivatı şeklinde bulunmaktadır. Balık ve balık ürünleri, fermente et ürünleri, kokuşmuş etler, jambon, tavuk, peynir, lahana turşusu, muz, soya sosu, şarap ve bira gibi bir çok gıdanın normal bileşiminde histamin ve tiraminin bulunduğu, ya da fermente gıdaların üretimi sırasında proteolitik süreçle ilgili olarak spesifık amino asitlerin mikrobiyel dekarboksilasyonu sonucu oluştuğu bildirilmektedir (Halasz ve ark., 1994; Nout, 1994; Bardöcz, 1995; Santos, 1996; Shalaby, 1996; Masson ve ark., 1997; Lehane ve Olley, 2000).

28 Halk Sağlığı Açısından Biyojen Aminlerin Önemi Biyojen aminler gıdalarda iki nedenden dolayı önem arz etmektedirler. Birincisi, biyojen amin miktarının kalite indikatörü olarak kabul edilir olması ikincisi ise sağlığa etkili toksik etkilerinin bulunmasından ileri gelmektedir. Gıdaların mikrobiyel bozulması sırasında dekarboksilaz aktivitesi arttığından biyojen aminlerin varlığı gıda bozulmasının göstergesi olması açısından önem taşımaktadır. Bu nedenle amin miktarı mikrobiyel bozulmanın bir indikatörü olarak değerlendirilmektedir (Bardöcz, 1995). Biyojen amin oluşumunda, gıdanın mikrobiyel kalitesi ve kontaminasyon düzeyi ile gıdaya ısı işleminin uygulanıp uygulanmaması, ortamda bulunan dekarboksilaz pozitif mikroorganizma miktarı, dekarboksilatif enzimler için gerekli olan kofaktörlerin varlığı, serbest amino asit miktarı ile ortamın ph değeri gibi faktörlerinin dışında, imalat koşullarının hijyenik kalitesi ve imalat sırasında bazı kontaminasyonların önlenemeyişinden kaynaklanan sorunlar, doğal gelişmesi beklenen fermentasyonun kontrol altına alınamaması, depolama ve olgunlaşma şartlarının yetersiz ve elverişsiz olması, olgunlaşma süresinin uzunluğu ve depolama sıcaklığı gibi unsurların önemli etkiye sahip olduğu bildirilmektedir (Halasz ve ark., 1994; Bardöcz, 1995; Masson ve ark., 1997; Lehane ve Olley, 2000). Merkezi sinir sisteminde bir nörotransmitter olan histamin toksisitesini, selüler membran üzerindeki antihistaminik duyarlılıkları birbirinden farklı H 1 ve H 2 reseptörleri ile etkileşerek ortaya çıkarmaktadır. Bu nedenle, histamin zehirlenmesinde gözlenen semptomlar, H 1 ve H 2 reseptörlerini fazlaca bulunduran kardiyo vasküler sisteme bağlı olarak şekillenmektedir. Histamin, kalbi stimüle ederek, ekstravasküler düz kaslarda daralma ya da genişleme ile hipotansiyona neden olmaktadır. Periferal kan damarları, kapillar ve arterlerdeki dilatasyon sonucunda, damar permeabilitesini artırarak, doku içerisine plazmanın sızmasına, kızarıklığa ve baş ağrısına sebep olmaktadır (Barke ve Hough, 1993; Leurs ve ark., 1995).

29 16 Histaminin, sensorik ve motor nöronlarını, H 1 reseptörlerinin aracılığı ile stimüle etmesi, uterus, solunum sistemi ve barsak kanalı düz kaslarında kontraksiyonlara neden olur. Solunum sisteminde, astım ve bronşit gibi bazı patofizyolojik durumlara, sindirim sisteminde ise abdominal kramp, ishal ve kusmaya neden olmaktadır. Parietal hücreler üzerinde lokalize olan H 2 reseptörleri ise, mide asidi miktarı ve ph gibi önemli fonksiyonların düzenleyicisi olduğundan gastrik asit sekresyonunu stimüle ederek peptik ülsere sebebiyet verdiği bildirilmektedir (Barke ve Hough, 1993; Asagoe ve ark., 1995; Masson ve ark., 1997; Nieri ve ark., 1997). Tiramin ise sempatik sinir uçlarına etki edip, indirekt olarak adrenalin ve nöradrenalinin salınmasını sağlayan önemli bir metabolitdir. Vücudun pek çok fonksiyonu sempatik sinir sistemiyle kontrol edildiğinden, tiraminin alınımıyla birlikte, bu sistemle ilgili, bazı fizyolojik reaksiyonların meydana geldiği belirtilmektedir. Kan damarlarını daraltarak kan basıncını arttırıp tansiyon yükselmesine, dolaşım kollapsı ve periferal vasokonstrüksiyona, kardiyak gücün ve kalp ritminin artmasına, pupiler ve palpebral dokuda genişlemeye, tükürük, gözyaşı salgısı ve solunum sayısında artışa neden olmaktadır. Ayrıca kan şekeri düzeyinde artış yaptığı da belirtilmektedir (Bardöcz, 1995; Shalaby, 1996). Histamin zehirlenmesinde inkubasyon süresi, gıdanın alınımıyla semptomların çıkışı arasındaki süre birkaç dakika ile birkaç saat arasında değişmektedir. Semptomlar spontan olarak kaybolabildiği gibi bazen bir veya bir kaç gün devam edebilmektedir. Genellikle boyunda ve yüzde kırmızı lekeler, kaşıntı, ürtiker, ödem ve lokalize yangı, yüksek ateş, ağız çevresinde sancı ve yanma hissi, mide bulantısı, kusma, ishal ve abdominal kramplar gözlenmektedir. Çarpıntı, titreme, heyecanlanma, dilin şişmesi, baş ağrısı ve baş dönmesi, hızlı ve zayıf nabız ile kan basıncının azalması gibi semptomlara da neden olmaktadır. Ağır şoklarda bronkospazm, respiratorik problemler ve intraserebral hemoraji ile de karşılaşıldığı bildirilmektedir (Bardöcz, 1995; Anon, 1998; Lehane ve Olley, 2000).

30 17 Tiramin miktarı yüksek gıda tüketimine bağlı olarak hipertensif kriz, kalp çarpıntısı, baş ağrısı, hipertansiyon ve migren gözlendiği, bazı vakalarda ise akciğer ödemine, solunum ve kalp yetmezliğine, nörolojik bozukluklara ve intrakranial hemorajilere rastlandığı bildirilmektedir (Nout, 1994; Shalaby, 1996). Bunun yanında bazı biyojen aminlerin, et ve et ürünlerinde kullanılan nitrit ve diğer kürleme ajanları ile karsinojenik bileşikler oluşturduğu vurgulanmaktadır (Warthesen, 1975). Gıdalarla alınan ya da barsak bakterilerince oluşturulan histamin, sindirim sisteminde bulunan monoaminoksidaz (MAO) ve diaminoksidaz (DAO) ile karaciğerde aktivitesini gösteren histamin-n-metiltransferaz (HNMT) tarafından metabolize edilmektedir. Tiramin ise genellikle, karaciğer, böbrek ve barsaklarda bulunan tiramini indirgeyici özelliğe sahip, tip A ve tip B MAO lar sayesinde metabolize edilmektedir (Merickel ve Edwards, 1995). Histamin halkası HNMT tarafından katalizlenen metilasyon reaksiyonu ile N-metilhistamine, daha sonra da MAO tarafından okside edilerek metil imidazolasetik aside dönüştürülmektedir. DAO da, histamini, imidazol asetaldehid, amonyak ve H 2 O 2 oluşturmak üzere okside etmektedir. Tiramin ise, oksidatif deaminasyon yoluyla zararsız fenolik aside (4-hidroksifenilasetik asit), N- metiltransferaz tarafından, N- metiltiramin ve N-metilamine, dopamin-hidroksilaz tarafından da oktopamine okside edilerek indirgenir. Oral yolla alınan aminlerin metabolize olmadan emilimini önleyen savunma mekanizmaları (MAO ve DAO gibi barsak sistemi enzimleri) tarafından indirgenerek, kan dolaşımına ulaşmaları engellenip toksik etki yaratmaları imkansız hale getirilmektedir (Bardöcz, 1995; Shalaby, 1996). Aminlerin az miktarlarının bile parçalanmasının engellenip kan dolaşımına ulaşarak toksik ve zararlı etki göstermesine neden faktörler, gıdalarda detoksifıkasyon olabilecek miktardan fazla histamin ve tiramin bulunuşu, alerjisi

31 18 olan, astım ya da ülser hastalığı bulunan hassas bireylerde de olduğu gibi, kişisel dispozisyona bağlı olarak kanın dezaminazlarında (MAO ve DAO gibi) eksiklik ya da yetersizlikler olması, yıkımlanmayı sağlayan doğal enzim aktivitesi mekanizmalarının herhangi bir inhibitör madde ile engellenmesi olarak sıralanmaktadır (Barke ve Hough, 1993; Bardöcz, 1995; Shalaby, 1996). Gıdalarla alınan biyojen aminlerden kaynaklanan zehirlenmelerde birçok faktörün rol oynadığı bildirilmektedir. Bunlar arasında MAO, DAO ve HNMT gibi detoksifikasyon enzimlerini inhibe ederek aminlerin parçalanmasını engelleyip, kan dolaşımına katılmalarına neden olan inhibitör maddeler en önemli faktörlerdir. Bunlara antidepresif etkili nialmid, fenelzin, izopropilhidrazid, isoniazid, tansiyon düşürücü pargilin, antibakteriyel rurazolidon, antihistaminik, antimalarya, aminoguanidin ve quinakrin gibi farmakolojik ajanlar, putrefikasyon ürünleri, karnosin ve anserinler, triptamin, putresin, kadaverin, feniletilamin, spermin ve spermidin gibi gıda kökenli biyojen aminler örnek olarak verilmektedir (Bardöcz, 1995; Shalaby, 1996). Toksik olarak düşünülen gıdadaki minimum histamin ve tiramin düzeyleri, gıdalarda bulunan potansiyel etkiyi arttırıcı faktörlerin toksisitede ki rollerine bağlı olduğundan, literatürlerde ki toksisite sınır değerleri farklılıklar göstermektedir. Simidu ve Hibiki (1955), histaminin balıklardaki toksik dozunu 60 mg/100g olarak bildirmişlerdir (Anon, 2004). Sandler ve ark. (1974), 3 mg feniletilamin in migrene neden olduğunu, 6 mg tiraminin ise monoamin oksidaz inhibitörü olarak etki ettiğini saptamışlardır. Ayres ve ark. (1980), toplamda 40 mg biyojen amin alınmasının toksik etki oluşturacağını bildirmişlerdir. Taylor (1985), gıdalarda toplam biyojen amin miktarının 1000 mg/kg olmasının sağlık açısından tehlikeli olduğunu bildirmişlerdir. Ten Brink ve ark. (1990), histaminin gıdalardaki limit değerini 100 mg/kg, alkollü içeceklerde 2 mg/l, tiraminin gıdalardaki değerini mg/kg, feniletilamin in gıdalardaki değerini ise 30 mg/kg olarak belirlemişlerdir. Hernandez- Jover ve ark. (1997), feniletilamin in toksik değerini 30 mg/kg olarak rapor etmişler

32 19 ve bu biyojen aminin histamin, putresin ve kadaverinin etkisini artırdığını saptamışlardır. Maijala ve Eerola (1993), gıdalarla alınan histaminin 8-40 mg nın hafif, mg nın orta, 100 mg üstünün ise şiddetli zehirlenmeye neden olduğunu saptamışlar bununla beraber gıdalarda histamin zehirlenmesine neden olan limit değeri 100 mg/kg olarak belirlerken, tiraminde ise bu değeri mg/kg olarak bildirmişlerdir. Stratton ve ark. (1991), 396 mg/kg putresini toksik değer olarak kabul etmişlerdir. Amerika Birleşik Devletleri, Gıda ve İlaç İdaresi (FDA), histaminin 50 mg /100 g ton balığı düzeyini, sağlıklı bir insanda tehlike oluşturan limit olarak belirlemiştir. Tiramin için ise, mg/kg düzeyinin resmi olarak belirlenen bir limit olmamakla birlikte tehlikeli olabileceği bildirmiştir. Ayrıca, yüksek konsantrasyondaki putresin ve kadaverinin, histamin ve tiramin zehirlenmelerinde indükleyici etkisinin olduğunu bildirmiş ancak limit konusunda bir saptama getirmemiştir (Anon, 1998). Avrupa Birliğinin 91/493 CEE kodlu direktifinde histaminin toksik limit değeri balıklarda mg/100g olarak bildirilmiştir (Anon, 1991). Ülkemizde biyojen aminlerden yalnızca histamin miktarının balıklarda (uskumru, sardalya vb.) 100 mg/kg ve şaraplarda 10 mg/kg ı aşmaması gerektiği yönünde yasal limit belirtilmiştir (Anon, 2002) Fermente Sucuklarda Biyojen Amin Oluşumunu Etkileyen Faktörler Fermente sucuklarda ham materyalde saptanan biyojen aminler spermin ve spermidin olarak belirlenirken, diğer biyojen aminlerin üründeki mikrobiyel gelişmenin artması sonucu yüksek değerlerde ortaya çıktığı belirtilmektedir. Gıdalarda biyojen aminlerin oluşumunda, amin üreten mikroorganizmaların dekarboksilaz aktivitesini etkileyen bazı faktörlerin sağlanması gereklidir. Bunlardan ph, sıcaklık, tuz konsantrasyonu, starter kültürlerin varlığı en önemli faktörler arasında yer almaktadır (Suzzi ve Gardini, 2001).

33 Sıcaklık ve ph Sıcaklık, bakterilerin amin üretimini büyük ölçüde etkilemektedir. Amin oluşumu için optimal sıcaklık değerleri, bakteri türlerine göre değişir. Biyojen amin miktarlarının, depolama süresi ve sıcaklığı ile pozitif korelasyon içinde olduğu bildirilmektedir (Santos, 1996, Masson ve ark., 1997). Masson ve ark. (1997), Carnobacterium divergens in asidik koşullarda (ph <5) maksimal tiramin ürettiğini ve bu üretimin 23 0 C de 5 0 C ye göre daha hızlı olduğunu belirtmektedir. ph, dekarboksilaz aktivitesini ve dolayısıyla biyojen amin oluşumunu etkileyen en önemli faktörlerden biridir. Biyojen amin oluşumunun, asidik ortamlarda bakteri için koruyucu bir mekanizma olduğu bildirilmektedir (Maijala ve Eerola, 1993; Maijala, 1994; Teodorovic ve ark., 1994; Mason ve ark.,1997). Asidik ortamlarda amino asit dekarboksilaz aktivitesi daha güçlü olmaktadır. Amin oluşumunda ph 4,0-5,5 arasındaki koşullar optimum olarak saptanmıştır (Santos, 1996; Teodorovic ve ark., 1994). Asidik ortamlarda (ph 5,0), Lactobacillus bulgaricus un amino asit ilave edilerek kuvvetlendirilmiş broth da daha fazla histamin, tiramin ve triptamin ürettiği tespit edilmiştir (Maijala, 1994). Glikoz gibi fermente olabilen karbonhidratların varlığı, bakterilerin gelişmesini ve amino asit dekarboksilaz aktivitesini arttırır. Çünkü, şekerin parçalanması ile laktik asit oluşumundan dolayı ph düşüşü sağlanmaktadır. Glikoz konsantrasyonunun % 0,5-2 olduğu durumlar, optimal kabul edilirken, % 3 ü aştığı durumlarda enzim oluşumunun inhibe olduğu bildirilmektedir (Santos, 1996; Masson ve ark., 1997). Sucuk üretiminde kullanılan GDL (Glucano-delta-lactone), glukonik aside hidroliz olur. Bu şekilde hızlı bir ph düşüşü sağlanır. Maijala ve Eerola (1993), tarafından yapılan bir çalışmada, kıyma örneklerine GDL ilave edilerek sağlanan ph

34 21 azalmasının biyojen aminler üzerine etkisi araştırılmıştır. GDL ilaveli örneklerde kontrol grubuna göre, hızlı bir ph düşüşü yanında mikroorganizma sayıları ile histamin ve putresin seviyelerinde önemli bir azalma sağlamışlardır Tuz Konsantrasyonu Tuz, fermente sucuk üretiminde ürüne çeşni vermesi, yüksek su bağlama yeteneği, ozmotik basıncı arttırması ve dolayısı ile bakteriyostatik özelliği nedeniyle sucuk hamuruna katılmaktadır. Tuz, miyofibriler proteinlerin eriyebilirliği ve fermentasyon sürecinde sarkoplazmik proteinlerin presipitasyonunu hızlandırır. Bu sürecin sonunda tuzun higroskopik özelliği nedeniyle miyofibriler proteinlerde koagulasyon görülür. Koagule miyofibriler proteinlerinin sucuğun yağ partiküllerini ve etini birarada tutan yapıştırıcı bir madde olduğu düşünülmektedir. Karışımdaki su aktivitesinin azalması ve diğer faktörler, patojen mikroorganizmaları da içeren mikroorganizmaların baskılanmasını, laktik asit bakterilerinin ise çoğalmasını aktive eder. Bununla birlikte, % 2-3 oranındaki tuz miktarının üründe arzu edilen tekstürü sağladığı, % 2 den daha az tuz miktarının ise üründe tekstürü olumsuz yönde etkilediği bildirilmektedir (Katsaras ve Budras, 1992; Vösgen, 1994; Flores ve Bermell, 1996). Biyojen amin oluşumunda, ortamın tuz konsantrasyonu önemli bir faktördür. Tuz konsantrasyonunun % 5 den fazla olmasının histamin oluşumunu azalttığı bildirilmektedir (Beutling, 1994). Ababouch ve ark. (1991), üç ayrı proteus türü ile yaptıkları çalışmalarında, % 8 NaCl ilavesinin etkili bir şekilde histidin dekarboksilaz aktivitesini azalttığını belirtmektedirler. Diğer taraftan, kuvvetli bir histamin oluşturma aktivitesine sahip olarak tanımlanan Staphylococcus capitis in % 10 NaCl bulunan deneysel koşullarda yaklaşık 400 mg/ml histamin üretebildiği rapor edilmiştir (Hernandez-Jover ve ark., 1996).

35 22 Carnobacterium divergens in tiramin üretiminin araştırıldığı bir çalışmada % 10 NaCl nin tiramin oluşumunu inhibe ettiği bildirilmektedir (Masson ve ark., 1997) Kültür Fermente sucuk üretiminde, amin üretmeyen starterlerin kullanılması gerekmektedir. Amin üretmeyen starter kültürlerin kullanılması ile amin pozitif laktik asit bakterilerinin gelişimi büyük ölçüde önlenebilmektedir. Fermente sucuklarda kullanılan starter kültür, non-starter laktik asit bakterileri ile rekabet edebilir. kültür kullanımı ile hem ürün kalitesi gelişir, hem de biyojen amin seviyeleri düşürülebilir (Maijala, 1994; Santos, 1996). Bover- Cid ve ark. (1999a), yaptıkları çalışmada sucuk örneklerini 3 gruba ayırmışlar birinci gruptaki örneklerde starter kültür kullanmazken, ikinci gruptaki örneklerde Staphylococcus xylosus starter kültürünü, üçüncü gruptaki örneklerde ise Staphylococcus carnosus starter kültürünü kullanmışlar C de 21 gün olgunlaştırma sonrasında tiramin miktarı 1. grupta 85 mg/kg, 2. grupta 60 mg/kg, 3. grupta ise 23 mg/kg olarak saptamışlar. Kadaverin miktarını ise 1. grupta 35 mg/kg, 2. grupta 30 mg/kg, 3. grupta ise 25 mg/kg olarak belirlemişlerdir. Bover-Cid ve ark. (2001), yaptıkları diğer bir çalışmada, Lactobacillus curvatus ve Staphylococcus xylosus starterlerini içeren sucuk örneklerinde 15 0 C de 21 gün olgunlaşmanın ardından tiramin miktarını 30 mg/kg olarak belirlerken, starter kullanılmamış kontrol grubu örneklerde tiramin miktarını 85 mg/kg olarak saptamışlardır. Komprda ve ark. (2004), P. pentocsaceus + S. carnosus ve S. xylosus + S. carnosus + L. farciminis starter kültürlerini içeren iki gruba ayrılmış sucuk örneklerini 1. gün 27 0 C de, günler arasında 20 0 C de, günler arasında

36 C de, 21 gün süre ile olgunlaştırmışlar. Olgunlaşma sonrasında soğuk dumanlama uygulanan sucuk örneklerinde biyojen amin miktarlarını ölçmüşler. P. pentosaceus + S. carnosus starter kültür karışımını içeren örneklerde tiramin putresin ve kadaverin miktarlarını S. xylosus + S. carnosus + L. farciminis starter kültür karışımını içeren örneklere göre daha fazla saptamışlardır. Türk fermente sucuğunda biyojen amin miktarlarının belirlenmesine yönelik çeşitli çalışmalar yapılmıştır. Ayhan ve ark. (1999), Türk fermente sucukları üzerine yaptıkları çalışmada, starter kültür olarak L. sake, P. pentosaceus, S. carnosus ve S. xylosus kullanmışlar, 25 0 C de olgunlaştırmanın ardından sucukları vakum ambalaj ile ambalajsız olarak +4 0 C de muhafaza etmişler, starter kültür kullanılan ve vakum ambalaja alınan sucuk örneklerinde tiramin miktarını, vakum ambalaja alınmış kontrol grubu örneklerinden daha fazla saptamışlardır. Şenöz ve ark. (2000), yaptıkları çalışmada 20 sucuk örneğinde histamin ve tiramin biyojen aminlerini bütün örneklerde tespit etmişler, histamini 6,72-362,22 mg/kg, tiramini 208, ,28 mg/kg aralığında saptamışlar, triptamini yalnızca 15 örnekte saptarlarken değerini ise 25,01-619,11 mg/kg aralığında bildirmişlerdir. Çolak ve Uğur (2002), S. xylosus ve P. pentosaceus içeren starter kültür kullandıkları fermente sucukları 23 0 C de olgunlaştırmışlar, örnekleri buzdolabı (+4 0 C) ve oda sıcaklığında () muhafazanın ardından 180. güne kadar biyojen amin miktarlarını ölçmüşler, oda sıcaklığında muhafaza edilen örneklerde biyojen amin miktarlarını daha yüksek saptamışlardır. Erkmen ve Bozkurt (2004), çalışmalarında analize aldıkları 50 sucuk örneğinde biyojen amin miktarlarını belirlemişler triptamini 0-126,9 mg/kg, feniletilamini 0-31,9 mg/kg, putresini 0-918,9 mg/kg, kadaverini 0-6,7 mg/kg, histamini 1,5-478,2 mg/kg, serotonini 0-12,4 mg/kg, tiramini 1,2-316,3 mg/kg, spermini ise 0,1-50,0 mg/kg aralığında saptamışlardır.

37 24 Ekici ve ark. (2004), 46 Türk fermente sucuğunda histamin düzeyini belirlemeye yönelik yaptıkları çalışmada, histamin miktarının ortalama değerini 32,13 mg/kg olarak belirlemişlerdir Biyojen Aminlerin Analiz Yöntemleri Gıdalarda biyojen amin miktarlarının ölçülmesinde birçok teknikten yararlanılmaktadır. Bunlar, ince tabaka kromatografisi (TLC), gaz kromatografisi (GC), yüksek basınç sıvı kromatografisi (HPLC) gibi kromatografik birçok yöntemin yanı sıra sadece histaminin tayin edildiği fluorimetrik yöntemler de geliştirilmiştir Ancak high performance liquid chromatography (HPLC) analitik ayırma teknikleri amacı ile en yaygın kullanılan cihazdır. Yaygın kullanılma sebepleri duyarlılığı, kantitatif tayinlere kolaylıkla uyarlanabilir olması, uçucu olmayan veya sıcaklıkla kolayca bozunabilen bileşiklerin ayrılmasına uygunluğudur. Bu tip bileşiklere örnek olarak amino asitler, proteinler, nükleik asitler, karbonhidratlar, ilaçlar ve pestisitler verilebilir (Önal, 2006) Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi Kromatografi, bir karışımda bulunan bileşenlerin birbirinden ayrılmasını gerçekleştiren yöntemlerin genel adıdır. Bu yöntemlerde genellikle belli uzunluktaki bir kolon, bir dolgu maddesi ile doldurulur ve bu madde sabit faz adını alır. Örnek, kolonun bir ucundan sokulur ve bir hareketli faz ile kolonun bir ucundan öteki ucuna kadar sürüklenerek taşınır. Dolgu maddesiyle etkileşmesi nedeniyle bu taşınım sırasında örnek, kolondaki sabit faz tarafından bir miktar tutulur. Bu tutulma, örnekteki farklı bileşenler için farklı miktarlarda olur. Örnekteki bileşenler sabit faz ile hareketli faz arasında belli bir dağılım gösterirler (Levins, 2003).

38 25 Sıvı kromatografisi, bileşiklerin fiziksel ve kimyasal özelliklerindeki farklardan yararlanarak birbirinden ayrılmasını sağlar. Analiz, yüzeyi geniş katı bir destek üzerinde hareketsiz duran faz ile bu faz üzerinde hareket eden faz arasında, ayrılması istenen bileşiklerin göç etme hızlarının farklı olmasından yararlanılarak yapılır. Hareketsiz fazı üzerinde taşıyan katıya destek katısı (support), hareketsiz faza durucu faz (stationary phase) ve hareketli faza taşıyıcı faz (mobile veya carrier phase) denir. Sıvı kromatografisinin özelliği taşıyıcı fazın sıvı olmasıdır. Ayrılması istenen karışım, üzeri durucu fazla kaplanmış destek katısıyla doldurulmuş cam veya metal bir kolondan geçirilerek ayırma gerçekleştirilir. Ayrılan bileşenler kolonun diğer ucundan farklı zamanda çıkar ve uygun bir dedektör ile tesbit edilip miktarıyla orantılı olarak kaydedilir. Ayrılmanın gerçekleştiği kolondan çıkan akışkanın toplamına kolon efluent i bunun hareketli faza ait kısmına eluent, ayrılmış bileşene ait kısmına eluat denir (Brian, 1996; Kazakevich ve MacNazir, 2000; Önal, 2006). Sıvı kromatografisinde ayırma sıvı halde yapıldığından uygulama alanı çok büyük molekülleri kapsayabilir. Yeni tip sıvı kromatografisi, bir kolona silikajel gibi bir adsorban koymak ve ayrılacak bileşiği bir sıvı fazla beraber tabii akışıyla bu kolondan geçirmek suretiyle yapılan kolon kromatografisinden kavram olarak çok farklıdır. Burada taşıyıcı sıvı, pnomatik veya mekanik çalışan pompalarla kolona basılarak yüksek hareketli faz hızı sağlanmakta, ayırma çabuk ve tam olarak gerçekleşmektedir. Ayrılan bileşik kolon çıkışına bağlanan uygun bir dedektör ile tespit edilip kaydedilir. Böyle yüksek hızla gerçekleştirilen ayırmaların yapıldığı sıvı kromatografi sistemlerine yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) denir. HPLC örneği Şekil 1.3. de resmedilmiştir (Önal, 2006) HPLC Sisteminin Ekipmanları Bu sistem pompa, enjektör, kolon, dedektör, rekorder veya data sistemini kapsamaktadır. Sistem Şekil 1.3. de gösterildiği gibi birbirine bağlanmıştır. Kolonda ayrışmalar gerçekleşir, sabit fazın mikrometrelik delikli partikülleri kapsamasından dolayı mobil fazın kolondan geçmesi yüksek basınçlı pompa ile mümkün olur.

39 26 Kromatografinin işlevi çözeltinin kolonun en yüksek noktasına enjekte edilmesi ile başlar. Komponentlerin ayrışımı, analizi istenilen maddeler ile mobil fazın kolon içerisinden pompalanması sonucu oluşur. Gerçekte her komponent kolondan dar bir bant şeklinde sıyrılır ve kaydedici üzerinde görülür. Sıyrılan komponentlerin belirlenmesi dedektörün kullanımına bağlı olarak ya kaydedici ile ya da bütün şekilde yapılır. Dedektörün her bir komponente olan tepkisi grafik rekorder üzerinde veya bilgisayar ekranında görülür. Kromatografi ile ilgili dataları toplamak, depolamak ve analiz etmek için bilgisayarlar, entegrasyonlar ve diğer data işlemci ekipmanları yaygın şekilde kullanılır (McDonald, 1986; Önal, 2006). Kontrol ve Veri Ünitesi Dedektör Atık Pompa Oto Örnekleyici HPLC Kolonu Fraksiyon Toplayıcısı Şekil 1.3. HPLC sistemini oluşturan ekipmanlar. Bu çalışmada, farklı starter kültür karışımlarının (Lactobacillus sake + Staphylococcus xylosus; Lactobacillus plantarum + Staphylococcus carnosus ve Lactobacillus curvatus + Staphylococcus carnosus + Staphylococcus xylosus) ve farklı olgunlaşma sıcaklık derecelerinin ( ve ) Türk fermente sucuğunda biyojen amin oluşumu üzerine etkisinin belirlenmesi amaçlanmıştır.