ANKARA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ

Transkript

1 ANKARA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ BAL ARSI (Apis mellifera L.) (HYMENOPTERA: APIDAE)'NDA ZARARLI OLAN Varroa jacobsoni OUDEMANS (BAL ARISI AKARI) (ACARINA:VARROIDAE)'YE KARŞI KULLANILAN AMİTRAZ (VARROASET) IN BALLARDAKİ KALINTISININ ARAŞTIRILMASI Şebnem TÜZE BİTKİ KORUMA ANA BİLİM DALI ANKARA 2004 Her hakkı saklıdır 1

2 ÖZET Yüksek Lisans Tezi BAL ARISI(Apis mellifera L.) (HYMENOPTERA: APIDAE)' NDA ZARARLI OLAN Varroa jacobsonı OUDEMANS (BAL ARISI AKARI) (ACARINA: VARROIDAE)' YE KARŞI KULLANILAN AMİTRAZ(VARROSET)' IN BALLARDAKİ KALINTISININ ARAŞTIRILMASI Şebnem TÜZE Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Bitki Koruma Anabilim Dalı Danışman: Prof. Dr. Sultan ÇOBANOĞLU Bal arısı(apis mellifera L.) (Hymenoptera:Apidae)' nda zararlı olan Varroa jacobsoni Oudemans (Bal arısı akarı) (Acarina:Varroidae)' ye karşı kullanılan Amitraz' ın ballardaki kalıntısının araştırılması amacıyla yapılan bu çalışma, yılları arasında yürütülmüştür. Bu amaçla bal örnekleri Ankara nın, Polatlı, Kızılcahamam, Ayaş ilçelerindeki çiftçilerden temin edilmiştir. Toplam 40 adet örnek alınmış olup, bunların 32 si amitraz terkipli ilaçla ilaçlanmış 8 i ilaçlanmamış, kontrol olarak bırakılmıştır. Ekstraksiyon ve kalıntı analizleri A.Ü. Bilim ve Teknoloji Araştırma ve Uygulama Merkezi (BİTAUM) laboratuvarlarında gerçekleştirilmiştir. Alınan bal örneklerinde Amitraz kalıntısı Jansson (2000) ve Kolankaya (2002) nin önerdiği yöntem doğrultusunda araştırılmıştır.kalıntı analizleri Yüksek Basınçlı Sıvı Kromatografisi (HPLC) nde yapılmıştır. Alınan sonuçlarda ilaçlı 40 örneğin 6 sında kalıntı gözlenmiştir. Bu örneklerin iki tanesi Türk Gıda Kodeksi nin amitraz için belirlenen maksimum kalıntı limitinin ve Amerika Kimya Birliğinin hazırlamış olduğu kalıntı limitlerinin üzerine çıkmıştır. Bazı örnekler Türkiye limitlerini aşarken Amerika nın limitlerini aşmamıştır. Bir örneğimizde elde edilen kalıntı miktarı ise Türk Gıda Kodeksi nin kalıntı limit sınırının üstünde olup Amerika Kimya Birliğinin limitine yaklaşmıştır. 2003, 92 sayfa ANAHTAR KELİMELER: Arı Akarı, Kalıntı, Bal, Bal Arısı, Varroa jacobsoni, Apis mellifera, Amitraz 2

3 ABSTRACT Masters Thesis INVESTIGATION ON THE RESIDUES OF AMITRAZ(VARROASET) IN HONEY, USED TO Varroa jacobsoni OUDEMANS ( ACARINA: VARROİDAE) INFESTATIONS ON HONEYBEES (Apis mellifera L.) ( HYMENOPTERA: APIDAE) ŞEBNEM TÜZE Ankara University Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Plant Protection Supervisor: Prof. Dr. Sultan ÇOBANOĞLU The aim of the study is to determine the residues of amitraz, which is used against Varroa jacobsoni Oudemans harmful on honey bee (Apis mellifera) and carried out in , honey samples were taken from the farmers of Ayaş, Kızıcahamam and Polatlı districts of Ankara. Totally 40 samples were taken, 32 of these samples were treated with amitraz compounding pesticide, 8 of them were not treated with pesticide and left as the sample. The analysis were carried out in the laboratories of BITAUM. Amitraz residues on samples were studied through the methods suggested by Jansson (2000) and Kolankaya (2002). Residues analysis were conducted by HPLC. Residues of pesticide were determined out of the 6 samples from of the 40. The determined residue levels of these two samples were higer than maximum limits of Turkish alimantary codex and American chemistry society s level. The residue level of some of these sample were found higer than Turkish s limits while below to American s thershold. İn one sample the residue value was determined higer than Turkish alimentry codex level while very close to American chemistry society s level. 2003, 92 pages Key Words: Varroa mite, residues, honey, honeybees, Varroa jacobsoni, Apis mellifera, Amitraz 3

4 TEŞEKKÜR Bu konu üzerinde bana araştırma olanağı sağlayan ve çalışmanın her safhasında yakın ilgi ve önerileri ile beni yönlendiren danışman hocam Sayın Prof. Dr. Sultan ÇOBANOĞLU(Ankara Üniversitesi, Ziraat Fakültesi) na teşekkür ederim. Bu çalışmayı maddi olarak destekleyen Ankara Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri fonuna teşekkür ederiz. Çalışmalarım sırasında analizlerimin yapılmasında bana yardımcı olan Sayın Didem KAHYA (Ankara Üniversitesi Bilim ve Teknoloji Araştırma ve Uygulama Merkezi) ve Sayın Nilüfer VURAL (Ankara Üniversitesi Bilim ve Teknoloji Araştırma ve Uygulama Merkezi) a, yöntem ve verilerimin değerlendirilmesinde benden yardımlarını esirgemeyen Sayın Prof. Dr. Nevzat ARTIK a (Ankara Üniversitesi, Ziraat Fakültesi), bilgeleriyle beni aydınlatan Sayın Dr. Ertaç TUTKUN a, ayrıca önerileri ile katılımda bulunan jüri hocalarım Sayın Şerife BAYRAM (Ankara Üniversitesi, Ziraat Fakültesi) ve Sayın Ziya ŞİMŞEK (Ankara Üniversitesi, Çankırı Orman Fakültesi) ye, çalışmalarımda yardımcı olan sevgili arkadaşlarım Fatma Zehra AKGÜNLÜ, Gülay BERİŞ e ve beni her konuda destekleyen aileme teşekkürlerimi sunarım. Şebnem TÜZE Ankara, Ocak

5 İÇİNDEKİLER ÖZET...i ABSTRACT...ii TEŞEKKÜR...iii ŞEKİLLER DİZİNİ...vi ÇİZELGELER DİZİNİ...vii 1. GİRİŞ KAYNAK ÖZETLERİ MATERYAL ve YÖNTEM Materyal HPLC cihazının özellikleri Analiz koşulları Amitraz Yöntem Standart çözeltilerin hazırlanışı Bal örneklerinin analize hazırlanışı Kalibrasyon çalışması Geri kazanım çalışması Hesaplama ARAŞTIRMA BULGULARI Varroa jacobsoni ( arı akarı) nin Tanımı V. jacobsoni nin morfolojik özellikler, biyolojisi ve zarar şekli V. jacobsoni nin bulaşması ve yayılışı V. jacobsoni nin savaşımı Amitraz Analiz Sonuçlarının Değerlendirilmesi Amitraz ın farklı konsantrasyonlardaki standardı ile ilgili analizler Kalibrasyon çalışmaları Geri kazanım Balda amitraz kalıntısı ile ilgili analizler Hesaplamalar TARTIŞMA...66 KAYNAKLAR

6 EK...79 EK ÖZGEÇMİŞ

7 ŞEKİLLER DİZİNİ Şekil 3.1. Bal örneklerinin bazıları...14 Şekil 3.2. Rotary Evoparatörün önden görünümü...16 Şekil 3.3 Çalışmanın yapıldığı HPLC cihazının önden görünümü...17 Şekil 3.4. HPLC' nin kolon fırını...18 Şekil 3.5. Amitraz ın Açık formülü...20 Şekil 3.6. Bal örneği ve magnetik karıştırıcı...27 Şekil 3.7. Ekstraksiyonda kullanılan ayırma hunisi...27 Şekil 4.1. Varroa jacobsoni dişisinin elektron mikroskobundaki görünümü...31 Şekil 4.2. Varroa jacobsoni nin ışık mikroskoptaki görüntüsü...32 Şekil 4.3. Varroa jacobsoni erkeğinin elektron mikroskoptaki görünümü...33 Şekil 4.4. Varroa ile enfekteli kanatları deforme olmuş bal arılarının görüntüsü...37 Şekil 4.5. Ergin bir bal arısı üzerinde ergin ve nimf evresi de bulunan akarın görünümü...38 Şekil 4.6. Bal arısı pupaları üzerinde beslenen Varroa akarlarının görüntüsü Şekil 4.7. Amitraz ın 10 ppm' lik standardına ait HPLC kromatogramı...48 Şekil 4.8. Amitraz ın 8 ppm' lik standardına ait HPLC kromatogramı...49 Şekil 4.9. Amitraz ın 6 ppm' lik standardına ait HPLC Kromatogramı...49 Şekil Amitraz ın 4 ppm' lik standardına ait HPLC kromatogramı...50 Şekil Amitraz ın 2 ppm' lik standardına ait HPLC kromatogramı...50 Şekil Amitraz ın 1 ppm' lik standardına ait HPLC kromatogramı...51 Şekil Amitraz ın 0,5 ppm' lik standardına ait HPLC kromatogramı...51 Şekil Amitraz ın 0,1 ppm' lik standardına ait HPLC kromatogramı...52 Şekil Amitraz ın 0,05 ppm' lik standardına ait HPLC kromatogramı...52 Şekil Amitraz ın 0,01 ppm' lik standardına ait HPLC kromatogramı...53 Şekil Amitrazın farklı konsantrasyonlarındaki standartlarla elde edilen pik alanıyla ilgili regresyon analiz eğrisi...54 Sekil Geri kazanıma ait HPLC kromatogramı...55 Şekil İlaçlanmamış 1 no lu bal örneğine ait kromatogram...56 Şekil İlaçlanmamış 2 no lu bal örneğine kromatogram...57 Şekil İlaçlanmamış 3 no lu bal örneğine kromatogram

8 Şekil İlaçlanmamış 4 no lu bal örneğine kromatogram...58 Şekil İlaçlanmamış 5 no lu bal örneğine kromatogram...58 Şekil İlaçlanmamış 6 no lu bal örneğine kromatogram...59 Şekil İlaçlanmamış 7 no lu bal örneğine kromatogram...59 Şekil İlaçlanmamış 8 no lu bal örneğine kromatogram...60 Şekil İlaçlı 3 no lu bal örneğine ait HPLC kromatogramı...60 Şekil İlaçlı 4 no lu bal örneğine ait HPLC kromatogramı...61 Şekil İlaçlı 5 no lu bal örneğine ait HPLC kromatogramı...61 Şekil İlaçlı 6 no lu bal örneğine ait HPLC kromatogramı...62 Şekil İlaçlı 8 no lu bal örneğine ait HPLC kromatogramı...62 Şekil İlaçlı 11 no lu bal örneğine ait HPLC kromatogramı...63 Şekil 5.1. Arıcılığı sınırlayan zararlı, hastalık ve diğer etkenler...70 Şekil 5.2. Arıcılar tarafından varroa ya karşı kullanılan ilaçların kullanım oranları

9 ÇİZELGELER DİZİNİ Çizelge 3.1. T. C. Tarım ve Köyişleri Bakanlığı tarafından arıcılıkta kullanılmak üzere, ruhsatlandırılan veteriner ilaçlarında arı akarı (Varroa jacobsoni) na karşı kullanılan Antiparaziter ilaçlar...19 Çizelge 4.1. Amitrazın farklı konsantrasyonlardaki standardı ile ilgili HPLC Analiz sonucu alınan piklerin gözlendiği Zaman ve alanları...47 Çizelge 4.2. İlaçlı bal örneklerinden yapılan HPLC analizi sonuçu amitraz kalıntısı bulunan örneklerin pik alanları, gözlendiği zaman ve kalıntı miktarları...64 Çizelge 4.3. Türk Gıda Kodeksine Göre Balda bulunan bazı pestisitlerin maksimum kalıntı ve tolerans limitleri ve Amerika Kimya Birliğinin önerdiği limitler

10 1. GİRİŞ Bal arısı Apis mellifera Hymenoptera takımında, Apidae familyasında yer almaktadır. Dünya' da 4 tür bal arısı vardır. Bunlardan 3'ü Hindistan ve Uzak Doğu ülkelerinde yaşayan Apis cerena, Apis dorsata ve Apis florea adı verilen arılardır. Dördüncü ve en yaygını olan tür ise Apis mellifera dır (Kaftanoğlu et al. 1992). Bal arısı, bal, balmumu, arı sütü, propolis ve arı zehri yaparak insanlara sağladığı yararın yanı sıra yabani ve kültür bitkilerinde tozlaşmayı gerçekleştirerek de insanlığa önemli yararlar sağlamaktadır (Özbek 1990). Türkiye de farklı iklim ve ekolojik şartlara uyum sağlamış bal arısı ırk ve ekotiplerinin büyük genetik çeşitliliği söz konusudur. Her bir arı ırk ekotipi, morfolojik, fizyolojik ve davranış karakterleri açısından bulundukları bölgenin özelliklerini yansıtmaktadır. Yani tüm gen kaynaklarında olduğu gibi balarısı ırkları bakımından da Anadolu, Dünya üzerinde çok önemli bir konuma sahiptir (Sıralı 2002). Türkiye doğal koşullarının, elverişli iklim ve zengin bitki örtüsüyle dünyada yüksek arıcılık potansiyeline sahip şanslı ülkelerden biridir. Türkiye coğrafi konumu ve ekolojisi ile özellikle nisan ve eylül ayları arasında arıcılık faaliyetleri için ideal bir konuma sahiptir. Bugün dünyada yaklaşık 52 milyon koloniden ton bal üretilmektedir. Ülkemiz 4,3 milyon dolayında koloni sayısı ile dünyada üçüncü, ton bal üretimiyle dördüncü sıradadır. Koloni başına ortalama bal verimi 1999 yılı resmi rakamlarına göre 15,6 kg dır (Sıralı 2002). Ülkemizde koloni sayısı ve bal veriminin her yıl artış göstermesine karşın, bu durum var olan ekolojik zenginliğin gerektirdiği potansiyel açısından tatmin edici değildir. Yetersiz ana arı üretimi, yaşlı ana arı ve 10

11 standart olmayan arı kovanı kullanımı, yanlış bal arısı yönetimi ile hastalık ve zararlılar ülkedeki düşük bal verimin başlıca nedenlerindendir. Dünya arıcılarının en büyük sorunlarından birisi olan Varroa jacobsoni Acarina: Varroidae) nin gerçek konukçusu Hindistan arısı olarak bilinen A. cerana' dır. Uzun yıllardan beri V. jacobsoni ile birlikte yaşayan Hindistan arısı geliştirdiği çeşitli adaptasyonlar ve savunma mekanizmaları sayesinde parazite karşı kendisini korumakta, parazitin çoğalmasını ve koloniye zarar vermesini önlemektedir. A. cerana kolonilerinde Varroa' ya karşı herhangi bir mücadele yöntemi uygulamasına gerek duyulmamaktadır (Kaftanoğlu et al. 1992). Bal üretiminin arttırılması amacıyla Hindistan ve diğer Uzak Doğu ülkelerine A. mellifera kolonilerinin ithal edilmesi, gezginci arıcılık uygulamalarıyla sınır bölgelerinde A. cerana ve A. mellifera' nın bir araya gelmesi nedeniyle V. jacobsoni esas konukçusundan A. mellifera' ya geçmiştir (Kaftanoğlu et al. 1992). Hem ergin arı hem de gelişmekte olan larva ve pupanın kanı ile beslenen V. jacobsoni, kolonilerin gelişme hızını yavaşlatmakta, arıların ömür uzunluğunu azaltmakta, arılar üzerinde açtığı yaralardan hastalık yapan diğer mikroorganizmaların vücuda girmesine olanak sağlamakta ve önlem alınmadığı zaman kısa bir süre içerisinde koloninin sönmesine neden olmaktadır. Varroa nın 1976 yılında, doğal bulaşma yolları ile Bulgaristan dan ülkemize girmiş olduğu düşünülmektedir. İlk tespiti 1978 yılında İzmir ve Muğla dan gelen arıcıların başvurusu üzerine yapılmıştır. Tarım ve Orman Bakanlığı nın yılları arasında ülke çapında yapmış olduğu survey sonucunda 7 il dışında 60 ilin bu zararlıyla bulaşık olduğu anlaşılmıştır (Tutkun ve Boşgelmez 2003). Şu anda ülkemizin her yerine bulaşmış durumdadır. 11

12 Çeşitli ülkelerde V. jacobsoni' nin biyolojisi ve mücadelesi konularında birçok araştırılmalar yürütülmekte ve bu parazite karşı çok farklı korunma ve kontrol yöntemleri geliştirilmektedir.. Ancak parazitin kapalı yavru gözleri içerisinde çoğalması ve gelişmesini burada tamamlaması nedeniyle uygulanan ilaçların etkinliği azalmakta, bu nedenle sık aralıklarla uygulanan ilaçlara karşı Varroa nın direnci artmakta, arı ölümleri ve balda ilaç kalıntısı gibi sorunlarla karşılaşılmaktadır. Dünyada varroa mücadelesinde Amitraz, Fulvalinat, Koumufos, Formik asit, Bromopropilat, Malation gibi ilaçlar kullanılmaktadır (Shabanov 1980, Şenocak 1988, Cavallaro 1989, Kolankaya et al. 2001a). Ülkemizde, varroa yla mücadelede kullanılan ruhsatlı ilaçlar Flumethrin, Amitraz, Malathion, Bromopropylate, Formik asit ve Fluvalinate aktif maddeli preparatlardır. Bunlardan en çok Amitraz aktif maddeli preparatlar çiftçiler tarafından tercih edilmektedir (Aydın et al. 2003). Pestisit kalıntıları üzerinde yapılan ilk çalışmalar dünyada 1940 lı yıllarda, yurdumuzda ise 1950 li yılların sonunda başlamıştır. Arıcılıkta ilaç kullanımı sonucu oluşan kalıntı sorunu diğer ülkelerde de dikkatli bir şekilde izlenmektedir. Türkiye de yılları arasında, kalıntı analizi üzerine toplam 67 çalışma yapılmış, bunların da çoğu bekleme süresi tespitine yönelik ruhsatlandırma çalışmalarıdır (Durmuşoğlu ve Çelik 2001). Pazardan alınan örneklerdeki pestisit kalıntıları üzerine ilk çalışmalar ise Otacı et al. (1971) ve Güvener et al. (1977) tarafından gerçekleştirilmiştir. Yukarıda bahsedilen yayınlar içersinde ballarda kalıntı konusunda pek fazla çalışma yapılmamıştır. Sadece Bulkeri ve Tufan tarafından 1986,Güvener et al. tarafından da 1992 yılında yapılan çalışmalar bulunmaktadır yılından günümüze kadar gecen sürede de yeterli çalışma bulunmamaktadır. Bu çalışmada Ankara Bölgesinin çeşitli yerlerinden toplana bal örneklerinden Varroa ya karşı yapılan ilaçlamalarda yaygın şekilde kullanılan Amitraz ın ballarda kalıntı bırakıp bırakmadığı ve kalıntının boyutları çalışılmıştır. Çalışma yıllarında 12

13 Ankara Üniversitesi Bilim ve Teknoloji Araştırma ve Uygulama Merkezi (BİTAUM) inde yapılmıştır. Kalıntı analizlerinde Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografi (HPLC) yöntemi kullanılmıştır. 13

14 2. KAYNAK ÖZETLERİ Ülkemiz ekonomisinde önemli yere sahip olan arı ve arıcılıkta verimi sınırlayan faktörler arasında, hastalık ve zararlılar ön sırada yer almaktadır. Bu konu üzerinde dünyada yoğun çalışmalar bulunmaktadır. Arıcılığın doğrudan bitkilerle ilişkili olması, modern ve gezginci arıcılığın yaygınlaşması hastalık ve zararlılarının önemini her gecen gün biraz daha artmasına neden olmaktadır. Bunun sonucunda da arı hastalık ve zararlıları hızla yayılmakta, büyük oranda ürün, kolonilerin gücünde ve verimlerinde kayıplara neden olmaktadır. Bu durum yoğun olarak ilaç kullanımını ve beraberinde kalıntı sorununu gündeme getirmektedir. Dormal ve Çakıllar (1960) pestisitlerin ülkemizde üreticiler tarafından daha fazla ve kaliteli ürün elde etmek amacıyla gelişi güzel kullanıldığını, bunun da özellikle kalıntı ve dayanıklılık gibi pek çok sorunu beraberinde getirdiğini belirtmişlerdir. Pestisit kalıntıları ile ilgili ilk çalışmaların 1940 lı yıllarda başladığını, bu çalışmaların tolerans değerlerinin tespit edilmesi ve tespit edilen tolerans değerlerine göre son ilaçlama ile hasat arasındaki sürenin belirlenmesi çalışmaları olduğunu ifade etmişlerdir. Ayrıca araştırıcılar Walker et al. (1954)'a atfen 1950 li yıllarda Amerika Birleşik Devletlerinde pestisit kalıntısı araştırmalarının başladığını, Harries et al. (1969) a atfen de İngiltere de bu tip çalışmaların 1960 lı yıllarda başlayıp yürütüldüğü belirtmişlerdir. Kaya (1960) Türkiye de pestisit kalıntıları üzerine pek çok çalışma yapıldığını belirtmiş ve Metil bromid ile fümige edilmiş antep fıstıklarında kalıntı analiz çalışması yaparak bulunan kalıntı miktarının Amerika Birleşik Devletleri tolerans değerlerini aşmadığını ifade etmiştir. Güvener ve Otacı (1964) Tütün mildiyösüne karşı kullanılan Dithiocarbomatlı ilaçların bıraktığı kalıntıları incelemişler ve yapılan analizler sonucunda Polyram, Polyram 14

15 Combi, Dithan ve Lonacol isimli fungisitlerin kalıntı miktarının çok yüksek olduğunu vurgulamışlardır. Yiğit (1975) Organik fosforlu ilaçların şeftali sularındaki kalıntısını araştırmış ve Parathion, Malathion, Malaoxon ve Trichlorfon kalıntısı saptamış, ancak bulunan değerin tolerans değerlerinin çok altında olduğunu vurgulamıştır. Bunun sebebi olarak da meyve sularının işlenmiş ürün olduğunu belirtmiştir. Yiğit (1977) Marmara Bölgesinde birçok meyve ve sebzede pestisit kalıntısını araştırmıştır. Araştırmada kullanılan örneklerin %83 ünde çeşitli ilaç kalıntılarına rastlandığını vurgulamıştır. Örneklerin %4 ünde, %10-16 arasında değişen miktarlarda tolerans üstü kalıntı bulmuştur. Kalıntı tespit edilen etken maddelerden bazılarının DDT, Endosülfan, Parathion, Lindane ve Aldirin olduğunu ifade etmiştir. Shabanov (1980) ballarda kalıntı sorununun oluşmasında Amitraz ın mücadelede birkaç gün arayla 3-5 kez uygulanmasının etkili olduğunu belirtmiştir. Öder (1983) Varroa savaşımında kullanılan Amitraz ın, bol ve ucuz olması nedeniyle en çok kullanılan varroa mücadele ilaçları arasında yer aldığını belirtmiştir. Stoeppoler et al. (1986) balda Amitraz ın kalıntı oluşturmaması için mutlaka ilacın doğru zamanda ve tekniğine uygun olarak kullanılması gerektiğine dikkat çekmişlerdir. Bulakeri ve Tufan (1986) Marmaris-Fethiye yörelerinden toplanan 134 bal örneğinde pestisit kalıntısını araştırmış ve 27 adet bal örneğinde Malaoxone bulmuşlardır. Sonraki yıllarda Malaoxone kalıntısına giderek daha az rastlandığını belirtmişlerdir. 15

16 Taccheo (1988) Amitraz ın balda kalıcı olmadığını ve 3-4 hafta içersinde tamamen metabolitlere ayrıştığını vurgulamıştır. Cavallaro (1989) İtalya da yapılan Avrupa Birliği Uzmanlar grubu (EC-Expertts) arıcılık dalındaki toplantısında sunulan bildirilerin önemli bir bölümünün varroanın bulaşma yollarına ve savaşımına ayrıldığını, yine aynı toplantıda savaşımın hemen arkasından ilaçların kalıntı problemlerinin ele alınarak değerlendirildiğini ifade etmiştir. Cozzani ve Pietrogiacomo (1989) kontrolde kullanılan Amitraz ın daha çok akşam saatlerinde arıların kovana dönmesinden sonra, hava sıcaklığının 15-20ºC olduğu zamanlarda uygulanması gerektiğini belirtmişler ve uygulamanın 4 gün arayla 4'er kez yapıldığında olumlu sonuçlar alındığını da ifade etmişlerdir. Berzas et al. (1991) İspanya da Amitraz ın ballarda ciddi boyutlarda kalıntı içerdiğini spektrofotometrik yöntemlerle belirlemiş ve uygun yöntemlerle pik boyunu ölçmüşlerdir. Hammerling et al. (1991) Almanya da yılları arasında 330 adet bal örneğini Amitraz kalıntısı yönünden analiz etmişler ve balların %60 ında kalıntıya rastlamamış, ancak %8,5 inde 0.05 mg/kg dan daha fazla miktarlarda Amitraz kalıntısına rastladıklarını belirtmişlerdir. Neri et al. (1992) son Amitraz uygulamasıyla hasat arasında 4 hafta geçmesi gerektiğini belirtmişlerdir. Ayrıca bu şekilde kullanılmayan ilaçların balda kalıntı sorununa sebep olduğunu ifade etmişlerdir. 16

17 Tutkun ve İnci (1992) Amitraz kullanılmasıyla kovanda bulunan Varroa' nın solunum ve sinir sisteminin felç olmasından dolayı parazitin öldüğünü tespit etmişlerdir. İlacın daha sonra tekrar uygulanma amacının petek gözlerinden çıkan parazitlerin yok edilmesi olduğunu vurgulamışlardır. Lodesani et al. (1992) İtalya da varroa ya karşı denenen ilaçlar arasında yer alan Amitraz ın bal ve balmumunda kalıntı problemini araştırmış ve ilaçlamayı takip eden hasat dönemlerinde tolerans sınırlarının üzerinde kalıntı saptamışlardır. Güvener et al. (1992) ülkemizde Amitraz ve Malathion ile ilaçlanmış ballardaki kalıntı miktarını yılları arasında belirlemeye çalışmışlardır. İlaçlama yapılan kovanlarda Amitraz analizlerinden bir sonuç alamamışlar, Malathion kalıntısına rastlamış ancak tolerans seviyesinin altında bulmuşlardır. Abed ve Ducos (1993) a göre kimyasal ilaçlamanın kolay olması ve hızlı sonuç alınması nedeniyle arıcıların ilk tercihi haline geldiğini ifade etmişlerdir. Fernandez ve Lozano (1993) Amitraz, Bromoprophylate, Coumaphos ve Fluvalinate in ballardaki kalıntısını gaz kromotografik ve spektrofotometrik yöntemleriyle belirlemişler ve kalıntı değerlerinin 1-40 ppb/kg arasında değiştiğini ifade etmişlerdir. Cabras et al. (1993) baldaki kabul edilebilir kalıntı düzeyini araştırmışlardır. Baldaki izin verilen sentetik varroasid kalıntı miktarlarının çok düşük olduğunu ifade etmişlerdir. Bromopropylate için max. kalıntı limitini 0,05 mg/kg, Coumaphos için ise 0,01 mg/kg olarak bildirmişlerdir. Amerikan Kimya Birliği ise maksimum kalıntı limitini Amitraz için balda 1,0 mg/kg, balmumunda ise 0,6 mg/kg, Fulvalinate için 0,05 17

18 mg/kg, Malathion için 0,5 mg/kg bal olarak belirttiğini vurgulamışlardır. Organik klorlular için ise 0,001 mg/kg ADI daha az bulunması koşulu olduğunu vurgulamışlardır. Baxendale ve Keith (1993) günlük alınabilir dozun FAO/WHO' ya göre Amitraz için 0,003 mg/kg, Perizin için 0,0005 mg/kg, Malathion için ise 0,005 mg/kg vücut ağırlığı olarak verildiğini belirtmişlerdir. Bal ve bal mumunda genellikle organik klorlu pestisitlerin kalıntılarının uzun süre kaldığını da vurgulamışlardır. Atianza et al. (1993) Fulvalinate kalıntısının belirlenmesinde HPLC yönteminin diğer yöntemlerden (ince tabaka kromotografi ve gaz kromotografi yöntemi) daha etkin ve kolay sonuca ulaşılan bir yöntem olduğu vurgulamışlardır. Kayral (1993) ülkemizde de varroa ya karşı kullanılan ilaçların dünya ülkeleri ile paralel olduğunu ifade etmiştir. Amitrazın genellikle fümigant olarak bilindiğini ve daha çok fumigant şeritler ile tabletler şeklinde kullanıldığını belirtmiştir. Türkiye Kalkınma Vakfı tarafından yapılan araştırmalarda Amitraz ın ülkemizde Varroa ya karşı en çok kullanılan ilaçlar arasında olduğu belirlemiştir. Ruijter ve Matheson (1994) Hollanda' da arı kovanlarının sistemik ve diğer akarisitlerle varroa ya karşı ilaçlandıklarını belirtilerek bu zararlının kimyasal savaşımında karşılaşılan en önemli sorunlar arasında pestisitlerin ruhsatlandırılma, bal ve diğer arı ürünlerindeki kalıntı sorunu ile akarisitler ve diğer kimyasallar arasında oluşan sinerjistik etki problemi olduğunu vurgulamışlardır. Greef et al. (1994) Belçika da Fulvalinate ile ilaçlanan kovanlardan alınan 215 bal örneğinden sadece 1 inde çok düşük düzeyde kalıntı belirlemişlerdir. Buna karşılık 18

19 balmumunda kalıntı saptanan örnek sayısı yıllara göre değişerek (%25-95) farklı oranlarda gözlemlendiğini ifade etmişlerdir. Imdorf et al. (1995) İsveç te bitkisel kökenli ilaçlardan Thymol ün tek katlı kovanlarda yeterli etkiyi gösterdiği, buna karşılık çok katlı kovanlarda yeterli etkiyi göstermediğini belirtmişlerdir. Garcia et al. (1996) farklı laboratuarlardaki bal analizleri, birkaç istisna dışında, yüksek dozda akarisit uygulanan durumlarda kararlı lipofilik madde (yağda çözünür madde) kalıntılarının bulunabileceğini ifade etmişlerdir. Ancak özellikle akarisitlerin hasattan önce uygun zamanda ve tavsiye edilen dozlarda uygulandıklarında balda akarasit kalıntı problemine rastlanılmadığını açıklamışlardır. Jimenez et al. (1997) Amitrazın balmumunda kalıcı olmadığını aksine balmumunun degredasyonu hızlandırıcı etkiye sahip olduğunu ifade etmişlerdir. Ayrıca Yüksek sıcaklıklarında degredasyonu hızlandırıcı etkiye sahip olduğunu da vurgulamışlardır. Şener (1998) yılları arasında seralarda yetiştirilen domates ve hıyarlarda kullanılan Dithiocarbomatlı ilaç kalıntılarını araştırmıştır. Yapılan analizler sonucu kalıntı değerleri; domateslerde tolerans değerinin altında çıkarken, hıyarda tolerans değerinin altında çıkması için 7 gün bekleme süresinin geçmesi gerektiğini ortaya çıkarmıştır. Araştırıcı ilaç kalıntısından çok ilacın metabolitlerinin risk oluşturduğunu belirtmiştir. Selçukoğlu (1999) Çukurova da yaygın şekilde kullanılan Amitraz ve Fluvalinate kalıntısı bakımından 135 bal örneğini incelemiş; hiçbirinde Fluvalinate kalıntısına rastlamadığını belirtmiştir. 25 örnekte Amitraz kalıntısına rastladığını, örneklerin 19

20 % 72 sinde kalıntı düzeyinin 3,1-12 ppm arasında olup en yüksek dilimi içerdiğini belirlemiştir. Anonymous (1999) sentetik ve organik fosforlu ilaçlara karşı 7-12 yılda direnç geliştiren varrao, Amitraza karşı herhangi bir bağışıklık kazanamamıştır. Bu özellik, amitrazın varroa mücadelesi için kullanım şansını arttırmaktadır. Varroa ölümlerinin ortaya çıkması için 21 mg aktif madde/ kovan dozunun altında Amitraz dumanlarının kovanda bulunması, parazitin hareketinin azalmasına neden olmakta ancak ölüm meydana getirmemektedir. Kovanda 21 mg dan daha yüksek Amitraz aktif maddesinin bulunması, arı ölümlerine hatta ana arının ölmesine sebep olmaktadır. Filazi et al. (1999) farelerde immün sistem üzerine Amitraz ın etkisini araştırmışlardır. Ayrıca Amitraz ın etki mekanizması konusunda da çalışmışlardır. Fıratlı et al. (2000) gerek iç piyasada, gerekse dış satımda bal ve bal ürünlerinin pazarlanmasında ciddi sorunlar yaşandığını ortaya koymuşlardır. Türkiye ballarının kalıntı içerdiği, standartlara uymadığı gibi gerekçelerle iade edildiklerini, hatta AB (Avrupa Birliği) nin Türkiye den bal dışalımı 1999 yılı için askıya aldığını belirtmişlerdir. Durmuşoğlu ve Çelik (2001) ülkemizde pestisit kalıntısı çalışmalarının 1959 yılında Ankara Zirai Mücadele İlaç ve Aletleri Enstitüsü Kalıntı Analiz Laboratuarının kurulmasıyla başladığını ifade etmişlerdir. Pestisit kalıntıları ile ilgili bilinen ilk eserin Otacı ve Güvener (1959) tarafından gerçekleştirilen bir araştırma olduğunu belirtmişlerdir. Bu araştırmanın Hexachlorbenzenle ilaçlanmış tohumluk buğdaylarda kalıntı analizi için metot tespitine yönelik bir çalışma olduğunu da açıklamışlardır. 20

21 Çelik (2001) İzmir in Kemalpaşa ilçesinde yetiştirilen kirazlar üzerinde yapmış olduğu çalışmada 18 kiraz örneğinde organik fosforlu ilaç kalıntısını araştırmıştır. Bu örneklerin 11 tanesinde ilaç kalıntısına rastlamamış, 7 tanesinde ise farklı miktarlarda kalıntı tespit etmiştir. Bunlardan 3 kiraz örneğinde Phosalone kalıntısı ve 1 örnekte de Malathion kalıntı miktarının tolerans değerinin üzerinde bulduğunu belirtmiştir. Kolankaya et al. (2001 a) yapılan bir çalışmada Varroa' nın savaşımında farklı zamanlarda ve faklı ülkelerde çok sayıda kimyasal madde denenmiştir. Bunlar arasında en etkili olanların; Malathion (%99), Amitraz (%98), Bromoprophylate (%98), Coumaphos (%96), Fluvanilate (%98-100), Flumetrin (%99,8-99,9), Formik asit (%96,8), Thymol (%96) ve Bitkisel yağlar ( %97) olduğu bildirilmiştir. Kolankaya et. al. (2001 b) 2000 yılında bal ve polen örneklerinde yapılan GC analizleri sonucunda Amitraz ve Perizin uygulaması yapılan hiçbir örnekte bu insektisitlere ait kalıntı saptanmadığını belirtmişlerdir. Ayrıca kalıcı ve yağda çözünen insektisitlerin yağda çözündükleri için bal mumunda da çözünerek balmumu içinde biriktiğini ve zamanla bu miktarın artış gösterdiğini açıklamışlardır. Bal mumu içinde depolanan bu maddelerin bal mumunun tekrar kullanımı ile zamanla bala doğru hareket edebildiğini, bu nedenle de bal mumundaki konsantrasyon ne kadar yüksek olursa, balda da o kadar kalıntı tespit edilebildiğini belirtmişlerdir. Yağda çözünen insektisitlerden olan Amitrazın balda ve balmumunda stabil olmadığı için kalıntısının saptanamadığını ancak daha toksik olan 2.4 dimethlanilin metabolitinin balmumunda ölçülebilir olduğunu belirtmişlerdir. Tutkun ve Boşgelmez (2003) Ülkemizde Tarım ve Köyişleri Bakanlığı tarafından arıcılıkta kullanılmak üzere ruhsatlandırılan ilaçları liste halinde vermişlerdir. Piyasada bulunan ruhsatlı ilaçlardan 12 sinin 9 u Amitraz terkipli olduğunu belirtmişlerdir (Çizelge 3.1.). 21

22 Aydın et al. (2003) Güney Marmara Bölgesinde 2002 Mart ayında yapmış oldukları ankette arıcılara zarar veren en önemli hastalığın varroa (%58) olduğunu belirtmişlerdir. Varroa nın tedavisinde de en çok kullanılan etken madde Amitraz (%53) olurken en az kullanılan etken maddenin (%4) ise Formik asit olduğunu ifade etmişlerdir (Şekil ). Güncan (2003) Bursa nın Mustafakemalpaşa ilçesinde yetiştirilen sanayi domateslerinden alınan örneklerde bazı organikfosforlu insektisitlerin kalıntısıyla ilgili bir çalışmasında; hasat döneminin başında toplanan 15 örneğin 6 sında tolerans değerinin altında ve hasat döneminin sonlarına doğru alınan 15 örneğin 4 ünde tolerans değerinin altında Dichlorvos kalıntısına rastladığını ancak sadece 1 örnekte bulunan Parathion-methyl kalıntısı toleransın yaklaşık 3 katı üzerinde olduğunu ifade etmiştir. 22

23 3. MATERYAL VE YÖNTEM Materyal Bu çalışmanın materyalini Ankara nın, Polatlı, Kızılcahamam, Ayaş ilçelerindeki çiftçilerden 2002 yılında temin edilen 40 bal örneği oluşturmuştur. 32 si Amitraz lı preparatlarla önerilen dozda ilaçlanmış (Şekil 3.1.), 8 i ise kontrol olarak bırakılmıştır. Şekil 3.1. Bal örneklerinin bazıları Kalıntı analizlerinde kullanılan kimyasal maddeler Aseton, Diklorometan, Sodyumklorür, Susuz Sodyumsülfat, Aktif Karbon, Silicagel, Toluen (Kullanılan tüm kimyasal maddeler HPLC analizleri için uygun teknik özelliklerdedir). 23

24 Kalıntı analizlerinde kullanılan cam malzemeler 1 lt Cam Mezür, 100ml Cam Mezür, 500 lük Ayırma Hunisi, çeşitli boyutlarda Balon Joje ve Beher, Cam Huniler, Cam Kolon (Çap: 2,5 cm, Boy: 25cm, G2 filtreli teflon musluklu), Camsaati, Bal Kavonozları, Süzgeç Kağıdı, 2932' lik Rodajlı Evaparatör Balonu. Ayrıca bu çalışmada üretici firmadan temin edilen Amitraz standardı ile çalışılmıştır. Kalıntı analizlerinde kullanılan cihazlar Otomatik Pipet, Magnetik Karıştırıcı, HPLC Kolonu, Rotary Evoparatör, Hassas Terazi ve HPLC cihazı kullanılmıştır. Rotary Evoparatör özellikleri Çalışmada banyo sıcaklığı + 20 ile +180 C aralığında değişebilen, sürücü motor hızı rpm olan, Millipore vakum pompası bulunan Buchi R-200 model Rotary Evoparatör kullanılmıştır (Şekil 3.2.). 24

25 Şekil 3.2. Rotary Evoparatör ün önden görünümü Hassas Terazi özellikleri Bu araştırmada max: 80/220 g, min: 0,001 g tartabilen Scaltec SBC 21 marka hassas teraziyle çalışılmıştır HPLC cihazının özellikleri Yüksek Performanslı Sıvı Kromatograf (HPLC) analitik ayırma teknikleri amacı ile en yaygın kullanılan cihazdır. Yaygın kullanılma sebepleri duyarlılığı, kantitatif tayinlere kolaylıkla uyarlanabilir olması, uçucu olmayan veya sıcaklıkla kolayca bozunabilen bileşiklerin ayrılmasına uygunluğudur. En önemlisi ise sanayiinin birçok bilim dalının ve toplumun birinci derecede ilgilendiği maddelere geniş bir şekilde uygulanabilirliğidir. Bu tip bileşiklere örnek olarak amino asitler, proteinler, nükleik asitler, karbonhidratlar, ilaçlar ve pestisitler verilebilir. Örneğin Fulvalinate kalıntısının belirlenmesinde HPLC yönteminin diğer yöntemlerden (ince tabaka kromotografi ve 25

26 gaz kromotografi yöntemi) daha etkin ve kolay sonuca ulaşılan bir yöntem olduğu bilinmektedir (Atianza et al.1993). Bileşikler özel olarak dolgu maddesi taşıyan kolonlardan bir hareketli faz (metanol, su, asetonitril, tampon çözeltileri,...) yardımıyla geçirilmekte ve kolon içinde ayrılan bileşikler sırasıyla bir detektöre gönderilerek piklerin yükseklik veya alanlarından hareketle kantitatif tayini, ve alıkonma zamanları (Retention Time) bulunarak kalitatif analiz gerçekleştirilmektedir. Bu çalışmadaki HPLC cihazının kısımları, markası ve özellikleri aşağıda verilmiştir (Şekil 3.3.). Pompa: TermoFinnigan Marka, Surveyor Model, Analitik Pompa Detektör: TermoFinnigan Marka, Surveyor Model, Photo Diode Array Detektör Kolon fırını: TermoFinnigan Marka, Surveyor Model, Autosampler, sıcaklığı 30ºC Loop: 20 µl/l Kolon: Phenomenex Luna 5µ C18 (250x4,60 mm) (Şekil 3.4.) Şekil 3.3. Çalışmanın yapıldığı HPLC cihazının önden görünümü 26

27 Şekil 3.4. HPLC' nin kolon fırını Analiz koşulları Mobil faz: %80 Asetonitril, %20 Su İzokritik çalışma yapılmıştır. Akış hızı: 1 ml/dak. Tarama Aralığı: nm Enjeksiyon hacmi: Örnek 20µl Çalışma Zamanı: 17 dak. Yazılım Programı: Chromquest çalışılmıştır. Kullanılan bal örnekleri g olarak alınmıştır. 27

28 Amitraz Amitraz (N,N -[(methylimino)dimethylidyne] di-2,4-xylidine), bitki ve hayvanlarda akarisid, larvasid ve insektisid olarak kullanılan amin ve hidrazin türevi bir bileşiktir. 1973' te The Boots Company tarafından geliştirilmiş Taktic, Mitac, Triatox ticari adlarıyla piyasaya sürülmüştür. Günümüzde üretici firmaları Atabay, Aventis, Defensa, Rotam, Wujin dir. Ülkemizde de varroa ya karşı kullanılan ilaçlar dünya ülkeleri ile paralellik arz etmektedir. Genel olarak fümigant olarak bilinmekte ve daha çok fumigant şeritler ile tabletleri kullanılmaktadır (Çizelge 3.1.). Çizelge 3.1. T. C. Tarım ve Köyişleri Bakanlığı tarafından arıcılıkta kullanılmak üzere, ruhsatlandırılan veteriner ilaçlarından arı akarı (Varroa jacobsoni) na karşı kullanılan Antiparaziter ilaçlar (Tutkun ve Boşgelmez 2003) İLACIN TİCARİ ADI ETKİLİ MADDE RUHSAT SAHİBİ RUHSAT TARİHİ Perizin %3,2 sol Asuntol Bayer- İstanbul Bayvarol füm. Şerit* Flumethrin Bayer Rulamit-VA körük rulo Amitraz Arı Kimya-İst Vamitrat-VA füm.şerit Amitraz Arı Kimya Varromatik-V körük * Amitraz Akıncı kimya-ist Varromatik füm. Şerit * Amitraz Akıncı kimya Varmitas füm. Şerit Amitraz Arısan-İst Rulotas füm. Körük Amitraz Arısan-İst İmpamit füm. Şerit Amitraz İmpa- İst Plusmat körük rulo Amitraz İmpa- İst Varroason füm. Şerit Amitraz İleriş-İst Varation-TKV toz Malathion TKVakıf- Ank Folbex-VA füm.şerit * Bromopropylate Novartis-İst Apistan füm. Şerit * Fluvalinate Sanafi- Doğu-İst Milkat plakası * Formik Asit Forzam- Adana Formiset füm. Çubuk Formik Asit Arı Farma-Ank Rulovarde füm. Körük Amitraz Taşkın-İst Varroset füm. Körük** Amitraz Arı Farma-Ank *İşaretli ilaçlar piyasada bulunmamaktadır. ** Denemede seçilen formülasyon 28

29 Türkiye Kalkınma Vakfı tarafından yapılan araştırmalarda Amitraz ın ülkemizde varroa ya karşı en çok kullanılan ilaçlar arasında olduğu belirlenmiştir (Kayral 1993). Aşağıda verilen amitrazın kimyasal ve fiziksel özellikleri Atabay Tarım ve Veteriner İlaçları Sanayi ve Ticaret A.Ş. den temin edilmiştir. Amitraz Spesifikasyonu 1. Ticari Adı: Amitraz 2. Üretici Firma: Atabay Tarım Veteriner İlaçları Sanayii ve Ticaret A.Ş. 3. Etkin Maddenin Kimyasal Adı: N,N -[(methylimino)dimethylidyne] di-2,4-xylidine (IUPAC). Genel Adı : Amitraz (BSI,E-ISO, ANSI,ESA,BAN,JMAF) Açık Formülü: Şekil 3.5. Amitrazın Açık formülü Molekül Formülü: C 19 H 23 N 3 Molekül Ağırlığı: 293,4 4. Teknik Maddenin Bileşimi Saflık: Min. % 97 Amitraz Kirlilik : Max. %0,4 Isopropyl alkol Max. %0,1 Rutubet Max. %0,2 Sülfat Külü 5. Teknik Maddenin Fiziksel Ve Kimyasal Özellikleri 29

30 Fiziksel görünüşü: Krem renkte, kristalize toz Koku: Hafif amin kokusunda Erime noktası: 86-87ºC Buhar Basıncı: 3,8x 10-7 mm,hg 20ºC Özgül ağırlığı: 1,128 g/cm 3 Çözünürlüğü: Oda sıcaklığında çözünürlüğü: Su da : 0,001 g/l Aseton da : 300 g/l Toluen de : 300g/l Methonol da : 20 g/l Parlama noktası: Parlayıcı değildir Parçalanma noktası: 190ºC den itibaren hafif parçalanmaya başlar Korozivitesi : Korozif değildir. 6.Stabilitesi: Depolama stabilitesi: Nemli ortamlarda hidrolitik parçalanma sonucu N,N-di-(2,4-dimethylphenyl) formamide parçalanır. Depolama sırasında iç stabilizatör olarak Paraformaldehyde ile stabilitesi sağlanır. Orijinal ambalajında ağzı kapalı olarak, normal şartlarda depolanması halinde en az 1 yıl süreyle aktif madde miktarında değişiklik olmaz. Hidroliz Stabilitesi: Yüksek asidik ve yüksek alkali ortamda hidrolize olur. ph 7 20ºC de : 12 hafta süre ile stabildir. ph 2 20ºC de : 1 günde %86 oranında parçalanır ph 2 20ºC de : 12 hafta sürede %20 oranında parçalanır Sıcaklık Stabilitesi : 190ºC sıcaklıkta 9 saatten itibaren ölçülebilir derecede parçalanma başlar. Fotostabilitesi: Işıkta ve toprak yüzeyinde çabuk parçalanır. DT 50 < 1 saattir. 7. Kullanımı: Kontak ve solunum etkili insektisit ve akarisittir. Kültür bitkilerinde zararlı olan Tetranychidae, Eriophyidae, Aphididae, Aleurodidae, Coccidae, Diaspididae, Margaroidae, Pseudococcoidae, Psylidae, familyalarına dahil sokucu ve emici böcekler ile Lepidoptera 30

31 larvalarına karşı mücadelede kullanılır. Veteriner amaçlı olarak Arachnida, Demodecidid, Siphonoptera, Trichodectidae takımlarına dahil hayvanlarda dış parazitlerin ve bal arılarında V. jacobsoni mücadelelerinde kullanılır. 8. Toksisitesi: Aktif Madde olarak; Akut oral LD50 : farelerde 800mg/kg Akut dermal LD50 : Farelerde > 1,600 mg/kg Akut solunum : (6-saat) farelerde 65 mg/l LC50 N.O.E.L.: (2yıl) farelerde 50 mg/kg A.D.I.(Günlük Alınabilir Doz): İnsanlarda 0,003 mg/kg dır. Etki mekanizması: Amitraz böceklerde oktopamine duyarlı adenilat siklazı etkinleştirmek suretiyle etkisini gösterirken (E 2 Sentezi), memelilerdeki etki şekli tam olarak anlaşılamamıştır (Filazi et al. 1998). Ateş düşürücü ve yangı giderici etkileri olup prostaglandin sentezini engeller. Metabolitinin α-2 reseptörleri ile oluşan etkilerine ilaveten postsinaptik reseptörleri uyararak göz bebeklerinde daralma yapar. İn vitro ve in vivo karaciğerde monoamin oksidazı durdurur. Solunum baskılanmasına sebep olur (Jones 1990, Lucio et al. 1991). Varroa savaşımında kullanılan amitraz, bol ve ucuz olması nedeniyle en çok kullanılan varroa mücadele ilaçları arasında yer almaktadır. Savaşımda kullanılan amitraz daha çok akşam saatlerinde arıların kovana dönmesinden sonra hava sıcaklığının ºC olduğu zamanlarda uygulanmaktadır. Uygulama 4 gün süreyle 4' er kez yapıldığında olumlu sonuçlar alınmaktadır. Amitraz kullanılmasıyla kovanda bulunan varroanın solunum sistemiyle sinir sistemi felç olmakta ve parazit ölmektedir. İlacın daha sonra tekrar uygulanması parazitlerin petek gözlerinden çıkan parazitlerin de yok edilmesi amacıyla yapılmaktadır (Öder 1983, Cozzani ve Pietrogiacomo 1989, Tutkun ve İnci 1992). 31

32 Sentetik ve organik fosforlu ilaçlara karşı 7-12 yılda direnç geliştiren varrao paraziti, amitraza karşı herhangi bir bağışıklık kazanamamıştır. Bu özellik, amitrazın varroa mücadelesi için kullanım şansını artırmaktadır (Anonymous 1999). Kinetik: Ağızdan ve deriden kolayca emilir. Hayvanlarda en çok karaciğer, safra, göz ve bağırsaklarda toplanır. Hızla N-2,4 dimetil fenil-n-formamidine (BTS-27271) metabolize olur. 3-metil-4-aminobenzoik asit son metaboliti olup idrarla atılır (Jones 1990). Akut Zehirlenme: Genel zehirlenme belirtileri daha çok preparattaki ksilen ve diğer çözücülerden kaynaklanır (Jones 1990). Solunum pnömonisi, merkezi sinir sistemi ve solunum baskılanmasına neden olur. BTS metabolitine bağlı olarak tansiyon düşmesi, sakinleşme, kan şekerinde ve vücut ısısında düşme gözlenir. Amitraz zehirlenmelerinde yohimbin, tolazoin ve atipamezol gibi α-2 reseptör antigonistleri panzehir olarak kullanılır (Lucio et al. 1991, Filazi et al. 1998) Yöntem Standart çözeltilerin hazırlanışı Standart stok çözeltinin hazırlanışı: 1 mg/ml Amitraz standart çözeltisini hazırlamak için 100 ml lik balon jojeye %97 saflıkta toz Amitraz dan 100 mg tartılmıştır. Üzerine Asetonitril (Acetonitrile) ilave edilerek 100 ml ye tamamlanmıştır. Bu işlemlerin sonucunda 1 mg/ml lik Amitraz standart çözeltisi hazırlanmıştır. Bu standart stok çözeltiden 10 farklı konsantrasyonda standart çözelti hazırlanmıştır. 32

33 Amitraz standart çözeltilerinin (10ppm, 8ppm, 6ppm, 4 ppm, 2 ppm, 1 ppm, 0,5 ppm, 0,1 ppm, 0,05 ppm, 0,01ppm) hazırlanışı 10 ppm lik konsantrasyon, Fomülde C= derişim, V= hacim olarak alınmıştır C 1 x V 1 = C 2 x V 2 formülünden 1000 ppm x V 1 = 10 ppm x 25 ml V 1 =250/1000= 0,25 ml bulunmuştur ve 1000 ppm lik standart stok çözeltiden 0,25 ml. alınmış 25 ml lik balon jojeye konulmuş ve hacmine kadar Asotonitrille tamamlanmıştır. 8 ppm lik konsantrasyon, C 1 x V 1 = C 2 x V 2 formülünden 10 ppm x V 1 = 8 ppm x 10 ml V 1 = 80/10 = 8 ml bulunmuştur ve 10 ppm lik standarttan 8 ml alınmış 10 ml lik balon jojeye konulmuş ve hacmine kadar Astonitrille tamamlanmıştır. 6 ppm lik konsantrayon, C 1 x V 1 = C 2 x V 2 formülünden 10 ppm x V 1 = 6 ppm x 10 ml V 1 = 60/10 = 6 ml bulunmuştur ve 10 ppm l ik standarttan 6 ml alınmış 10 ml lik balon jojeye konulmuş ve hacmine kadar Astonitrille tamamlanmıştır. 33

34 4 ppm lik konsantrasyon; 10 ppm lik standarttan 4 ml alınmış 10 ml lik balon jojeye konulmuş ve hacmine kadar Astonitrille tamamlanmıştır. 2 ppm lik konsantrasyon; 10 ppm lik standarttan 2 ml alınmış 10 ml lik balon jojeye konulmuş ve hacmine kadar Astonitrille tamamlanmıştır. 1 ppm lik konsantrasyon; 2 ppm lik standarttan 5 ml alınmış 10 ml lik balon jojeye konulmuş ve hacmine kadar Astonitrille tamamlanmıştır. 0,5 ppm lik konsantrasyon; 2 ppm lik standarttan 2,5 ml alınmış 10 ml lik balon jojeye konulmuş ve hacmine kadar Astonitrille tamamlanmıştır. 0,1 ppm lik konsantrasyon; 0,5 ppm lik standarttan 2 ml alınmış 10 ml lik balon jojeye konulmuş ve hacmine kadar Astonitrille tamamlanmıştır. 0,05 ppm lik konsantrasyon; 0,1 ppm lik standarttan 5 ml alınmış 10 ml lik balon jojeye konulmuş ve hacmine kadar Astonitrille tamamlanmıştır. 0,01 ppm lik konsantrasyon; 0,05' lik standarttan 2 ml alınmış 10 ml lik balon jojeye konulmuş ve hacmine kadar Astonitrille tamamlanmıştır. Standartlar hazırlandıktan sonra HPLC de analiz edilerek amitraz aktif maddesinin kromatogramda yeri tespit edilmiştir. Piklerin gözlendiği zaman aralığı 10,268 ile 8,058 dakika arasında değişmektedir. Fakat genellikle 10' uncu dakikada pik oluşmuştur. 34

35 Sadece 0,01 ppm lik konsantrasyonda zamanda bir kayma oluşmuştur, bunun nedeni ise çok düşük konsantrasyon olmasıdır. Amitraz standartlarının yeri tespit edildikten sonra bal örneklerinin ekstraksiyon işlemine geçilmiştir. Ekstraksiyonlar aşağıdaki yönteme göre hazırlanmıştır: Bal örneklerinin analize hazırlanışı İlaçlamadan yaklaşık 15 gün sonra örnekler kalıntıyı araştırmak amacıyla analize tabi tutulmuştur. Bal örnekleri bu bekleme süresinde güneş almayan bir ortamda oda sıcaklığında bekletilmiştir. Kalıntı analizleri Ankara Üniversitesi Bilim ve Teknoloji Araştırma ve Uygulama Merkezi (BİTAUM) laboratuarlarında gerçekleştirilmiştir. Bal örneklerindeki pestisit kalıntı analizi için çoklu kalıntı analiz metodu kullanılmıştır (Van Rillaer ve Beernaert 1989, Jimenez et al. 1998). Her bir bal örneğinden g alınıp, 200 ml aseton-su (1:1) yani 100 ml aseton 100 ml su karışımına konularak magnetik karıştırıcıda 1 saat 8 derece hızda ısıtılmadan oda sıcaklığında karıştırılmıştır (Şekil 3.6.). Karıştırma işlemi bitiminde bu karışıma 10 ml diklorometan, 3 ml doymuş NaCl ve 50 ml su ilave edilerek ayırma hunisinde alınmış, çalkalanarak pestisit ekstraksiyonu yapılmıştır (Şekil 3.7.). Ayrılan fazlar beherlere toplanarak üst faz tekrar ayırma hunisine konulmuştur. İçersine 10 ml diklorometan, 3 ml doymuş NaCl ve 50 ml su ilave edilmiştir. Bu işlem bir kez daha tekrarlanmıştır. Böylelikle pestisitlerin bulunduğu fazlar toplanmıştır. Bir beher içersine toplanan fazlar susuz sodyum sülfattan geçirilerek suyu alınmıştır. Suyu alınan numune 38 C de rotary evoparatörde buharlaştırmak suretiyle hacmi 2-3 ml azaltılmıştır. Böylece elde edilen total bal ekstraktı önce kromotografik kolondan geçirilerek yıkama (clean-up) işlemine alınmıştır. Yıkama kolonu; 5 g silicagel (0.5 g silicagel ve aktive edilmiş karbon 1:5 oranında karışımdan) ve 1 g susuz sodyum sülfat içermektedir. Elde edilen bal 35

36 ekstraktları hazırlanan bu kolona konularak 250 ml diklorometan, toluen ve aseton (100:2:2) karışımı ile yıkanmıştır. Kolondan geçirilen örnek daha sonrada 38 C rotary evaporatörde buharlaştırılarak 2ml ye indirilmiştir. Şekil 3.6. Bal örneği ve magnetik karıştırıcı Şekil 3.7. Ekstraksiyonda kullanılan ayırma hunisi 36

37 Yıkama işlemi yapılan 2 normal ilaçlı örnek yıkama yapılmadan HPLC ye verilmiş hiçbir Amitraz kalıntısı gözlenememiştir Bunun üzerine 8 inci kontrol örneğinden 15 g bal alınıp içersine 0,5 g saf amitraz katılıp ekstraksiyona tabi tutulmuş ancak yıkama işlemi yapılmamıştır. Elde edilen ürün aktif karbondan geçirilerek rotary evoparatörde buharlaştırılmış hacmi 2-3 ml' ye ininceye kadar uçurulmuştur. Daha sonra örnek HPLC de okutulmuş ve pik oluşturduğu gözlenmiştir. Bu denemenin sonucunda yapılan tartışmalarda amitraz aktif maddesinin cam kolonda yani yıkama işlemi esnasında ilacın silicagel tarafından tutularak kolonda kaldığı kanısına varılmış ve daha sonraki örnek analizlerinde yıkama işlemi olmaksızın örnekler doğrudan ekstraksiyona alınmıştır. Ekstaksiyonları tamamlanan bal örnekleri viallere konulmuş ve autosampler (otomatik örnekleyici) a yerleştirilerek HPLC de analiz edilmiştir Kalibrasyon çalışması Kalıntı analizi yapılacak, amitraz etken maddeli standarttan, asetonitril içinde stok çözelti elde edilmiştir. Bu stok çözeltiden 10, 8, 6, 4, 2, 1, 0.5, 0.1, 0.05 ve 0.01 ppm lik standart çözeltiler hazırlanmıştır. Standart çözeltilerinin kalibrasyon çalışmaları daha önce detaylı şekilde verilen cihaz ve analiz şartlarında gerçekleştirilmiştir. On farklı konsantrasyondaki standartlar üç kez analiz edilerek kalibrasyon eğrileri elde edilmiştir Geri kazanım çalışması Bal örneklerinden amitraz kalıntısının ekstraksiyonu için yöntem saptandıktan sonra geri kazanım çalışmaları gerçekleştirilmiştir. Bu amaçla ilaçlanmamış örneğe belirli 37

38 miktarda standart ilave edilerek daha önce detaylı şekilde verilen cihaz ve analiz şartlarında analiz yapılarak metodun performansı hesaplanmıştır Hesaplama Amitrazın kalibrasyon grafiği ve istatistiki hesaplamalar office 2000 deki excel programı yardımıyla yapılmıştır. Sonuçta, ilaç konsantrasyonu ve kromatogram alanları (Pik) arasındaki ilişki regresyon analiziyle ortaya konulmuş ve korelasyon doğrusu çizilmiştir. 38

39 4. ARAŞTIRMA BULGULARI Varroa jacobsoni ( Arı akarı) nin Tanımı Şube : Arthropoda Altşube : Chelicerata Sınıf : Arachnoidae Takım : Acarina Alttakım : Parasitiformes Familya : Varroidae Altfamilya : Varroinae Cins : Varroa Tür : Varroa jacobsoni Oudemans Arı akarı olarak bilinen V.jacobsoni ilk kez 1904 yılında E. Jacobson tarafından Java' da Hint arısı (Apis indica)' nın larva gözlerinden toplanmış ve Hollanda' lı Oudemans tarafından aynı yıl Varroa jacobsoni olarak tanımı yapılmıştır (Tutkun ve İnci 1992). Arı akarı bal arılarının larva, pupa ve erginleri üzerinde yaşayan ve uzun süre dikkati çekecek bir belirti göstermeden çoğalan tehlikeli bir dış parazit akardır V. jacobsoni nin morfolojik özellikleri, biyolojisi ve zarar şekli Ergin dişi arı akarı, koyu kızıl-kahverenkte veya koyu kahverengi olup enlemesine oval şekildedir. Ortalama 1, 10 mm uzunluğunda; 1, 57 mm genişliktedir. Vücut, sırt ve karından basık olup üst kısmı hafif dış bükeydir. Sert bir kitin tabakasıyla kaplı olan 39

40 kalkan şeklindeki sırt levhası, üstten bakıldığı zaman ağız parçaları ve bacakları önemli ölçüde gizler, kenarları ise karına doğru hafifçe kıvrılmıştır (Şekil 4.1.). Dişi ve erkekte vücut iki ana bölümden yapılmıştır. Bunlar ön ve orta kısımda besin alma organlarının yer aldığı gnatosoma ile, vücudun geri kalan ve dört çift bacağı da içine alan idiosomadır. Bacakların arka kısmında bulunan alanda birbirinden ayrı dört tipik lob ve bir anal delik vardır (Şekil 4.2.). Şekil 4.1. Varroa jacobsoni dişisinin elektron mikroskobundaki görünümü (Kolankaya et al. 2001b) Ağız parçaları sokucu-emici şekilde gelişmiştir. Ağızda keskin, eğri uçlu iğne gibi sivri bir çift chelicera bulunmaktadır. Asalak arının segmentleri arasına cheliceranın ön kısmındaki çengel şeklindeki iğneler yardımıyla tutunur, cheliceranın kesici ucu böceğin derisinin kolayca deler. Cheliceraların her iki yanında bir çift uzun, hareketli pedipalpus bulunur. Bunlarda kutikulanın delinmesine yardım ederler ve açılan yaraya girerler. Hemolenf, akarın yutak kaslarının çalışması ile ağız boşluğundan vücuda çekilir. Bacaklar kısa, kuvvetli ve kalın yapıdadır. Birinci çift bacaklar üzerinde duygu kılları bulunur. Bunlar özellikle koku alma görevini yerine getirirler. Bacakların uçlarında yapışmayı sağlayan vantuz şeklinde loblar bulunur. 40

41 Şekil 4.2. Varroa jacobsoni nin ışık mikroskobundaki görüntüsü (Tutkun ve İnci 1992) L: loblar; A: anal delik Arı akarının vücut şekli, bal arısı üzerinde kolayca tutunmasına elverişlidir. Bacakların üzerinde bulunan yapışmayı kolaylaştırıcı vantuzlar ve karın bölgesindeki kıllar, arının bu akarı üzerinden atmasını hemen hemen imkansız kılmaktadır. Genellikle arının ilk abdomen segmentleri arasına tutunurlar. Asalak, bal arısının baş ve thoraksı arasına, thoraks ve abdomeni arasına da yerleşebilir. Arıya ulaştıkları her yerde kolayca segmentler arası zara girebilirler ve emgi yapabilirler. Erkeklerin vücudu, ön kısımda hafifçe daralan bir daire şeklindedir (Şekil 4.3.). Sırt kalkanı hafif dış bükey durumdadır ve ince bir kitin tabakasıyla örtülüdür. Dişilerden daha küçüktür. Renkleri beyaz-gri veya sarımtrak olup; uzunlukları 0.85 mm, genişlikleri ise 0.78 mm' dir. Ağız parçaları, bal arısının larva ve erginlerinin derisini delmeye ve hemolenfini emmeye uygun yapıda değildir. 41