BAŞKENT ÜNĐVERSĐTESĐ TIP FAKÜLTESĐ. Plastik, Rekonstrüktif ve Estetik Cerrahi. Anabilim Dalı

Transkript

1 1993 BAŞKENT ÜNĐVERSĐTESĐ TIP FAKÜLTESĐ Plastik, Rekonstrüktif ve Estetik Cerrahi Anabilim Dalı LOKAL HĐPOTERMĐNĐN RANDOM PATERNLĐ DERĐ FLEPLERĐNDE FLEP CANLILIĞI ÜZERĐNE ETKĐSĐ UZMANLIK TEZĐ Dr. Đbrahim Barış ÇAĞLAR ANKARA, 2011

2

3 1993 BAŞKENT ÜNĐVERSĐTESĐ TIP FAKÜLTESĐ Plastik, Rekonstrüktif ve Estetik Cerrahi Anabilim Dalı LOKAL HĐPOTERMĐNĐN RANDOM PATERNLĐ DERĐ FLEPLERĐNDE FLEP CANLILIĞI ÜZERĐNE ETKĐSĐ UZMANLIK TEZĐ Dr. Đbrahim Barış ÇAĞLAR TEZ DANIŞMANI Doç. Dr. Nilgün Markal ERTAŞ ANKARA, 2011

4

5 ÖZET Cerrahi başarıyı artırmak, hastanede kalış, maliyet ve ek cerrahi girişimleri azaltmak için flep canlılığının artırılması uzun süreden beri çalışmalara konu olmaktadır. Flep canlılığını artırmayı hedefleyen yöntemlere genel olarak önkoşullama yöntemleri denir. En iyi bilinenleri, cerrahi geciktirme, iskemik uzak iskemik önkoşullama, hipertermi, hipotermi, farmakolojik ajanlar ve büyüme faktörleridir. Hipotermi, ameliyattan 24 saat önce ve tek sefer uygulandığında, flep canlılığını artırır. Bu etki ısı şok proteinleri (HSP) üzerinden gerçekleşir. Aynı zamanda hipotermi, uygulandığı dokuda vazokonstrüksiyon ve hipoksi oluşturur. Lokal hipoksi, 2 hafta içerisinde dokuda yeni damar oluşumu meydana getirir. Bu sebeple uzun süre uygulanan hipoterminin deri fleplerindeki damarlanmayı ve buna bağlı olarak flep canlılığını artırması beklenir. Deri flepleri üzerinde bugüne dek yapılan araştırmalarda hipotermi tek sefer uygulanmış ve HSP ler üzerinden etkileri gösterilmiştir. Çalışmamızda, uzun süreli lokal hipoterminin random deri fleplerindeki flep canlılığı üzerine etkisi araştırıldı. Hipotermi uygulaması olarak buzlu su torbası ve soğutucu sprey yöntemleri karşılaştırıldı. Çalışmamızda 18 adet Sprague Dawley cinsi sıçan kullanıldı. Flep modeli olarak sırt bölgesinde, 3X9 cm boyutlu, kaudal pediküllü, random paternli deri flebi (modifiye McFarlane flebi) kullanıldı. 3 grup oluşturuldu. Grup I (kontrol grubu): soğuk uygulaması yapılmadan flep kaldırıldı. Grup II (buzlu su grubu): 14 gün boyunca buzlu su torbası ile sıçanların sırtlarına soğuk uygulandı, 15. günde flep kaldırıldı. Grup III (sprey grubu): 14 gün boyunca soğutucu sprey ile sıçanların sırtlarına soğuk uygulandı, 15. günde flep kaldırıldı. Tüm gruplarda flepler kaldırıldıktan sonra yerine dikildi ve 7 gün sonra flepteki canlı alan yüzdesi ölçüldü. Bütün sıçanlarda, günlerde, kanda VEGF düzeyi çalışıldı. Flepler makroskopik olarak incelendiğinde grup II nin fleplerindeki nekrotik bölgelerin grup I ve grup III e göre daha açık renkli olduğu gözlendi. Grup I ve grup III te nekrozun tam kat, grup II de kısmi kalınlıklı olduğu belirlendi.canlı alanların iii

6 toplam flep alanına oranı ortalama olarak grup I de %64,87, grup II de %57,69, grup III te %62,22 olarak bulundu. Grup II nin canlı alan ortalaması diğer gruplardan düşüktü, fark grup I (P=0,006) ve grup III (P=0,029) ile karşılaştırıldığında istatistiksel olarak anlamlıydı. VEGF kan seviyeleri, 1. gün grup I: 1,82 pg/ml, grup II: 2,78 pg/ml, grup III: 2,69 pg/ml, 4. gün grup II: 3,78 pg/ml, grup III: 1,23 pg/ml, 7. gün grup II: 1,62 pg/ml, grup III: 2,83 pg/ml, 15. gün grup II: 2,14 pg/ml, grup III: 1,57 pg /ml olarak bulundu. 1. gün değerleri arasındaki fark istatistiksel olarak anlamlı değildi. 4. gün değerleri, grupların kendi bazal değerleriyle (1. gün) karşılaştırıldığında, grup I de istatistikel olarak anlamlı fark görülmedi ancak grup III değerindeki düşme istatistiksel olarak anlamlıydı (P=0,031). 7 ve 15. gün değerlerindeki fark, hem gruplar arasında hem de grupların kendi bazal değerleriyle karşılaştırıldığında istatistiksel olarak anlamlı değildi. Çalışmamızın sonucunda flep canlılığında ve VEGF kan seviyelerinde artış görülmedi. Flep canlılığında atış olmamasının sebebi olarak 2 haftalık hipotermi süresinin yetersiz olması veya uzun süreli hipoterminin yeni damar oluşumuna sebep olmaması düşünüldü. Sonuç olarak elde ettiğimiz bulgular 2 hafta süreli hipoterminin random paternli deri fleplerindeki klinik kullanımının etkili olmayacağını gösterdi. Daha uzun süreli uygulamalarda canlılık artışı gösterilirse hipotermi, ucuz ve kolay uygulanabilir olması, yan etkisinin olmaması sebebiyle klinikte geniş kullanım alanı bulabilir. Anahtar kelimeler: Hipotermi, önkoşullama, VEGF. iv

7 ABSTRACT flaps. The effect of local hypothermia to flap viability on random pattern skin Researches aim at increasing flap viability to increase surgical success rates, reduce costs, additional procedures and hospital stay. Methods aimed at improving the overall viability of the flaps are called "preconditioning. The most well known ones are surgical delay, ischemic - remote ischemic preconditioning, hyperthermia, hypothermia, pharmacological agents and growth factors. When it is applied for one time 24 hours before surgery, local hypothermia increases flap viability. This effect is formed by the way of heat shock proteins (HSP). Hypothermia also causes vasoconstriction and hypoxia in the applied tissues. Local hypoxia is demonstrated to lead neovascularisation within 2 weeks. So long term hypothermia is assumed to increase new vessel formation and flap viability in skin flaps. Throughout the studies concerning skin flaps up to now, hypothermia has been applied for one time and the effects constituted by HSPs have been demonstrated. In this study we investigated the effect of long term local hypothermia on flap viability of random pattern skin flaps. Two diffrent hypothermia application methods, ice water bag and cooling spray were compared. Eighteen adult male Sprague-Dawley rats were used in this study. 3X9 cm sized, caudally pedicled, random pattern skin flap on the back of rat (modified McFarlane flap) was used as the flap model. 3 groups were formed. Group I (control group): Flaps were raised without any cold application. Group II (ice water group): Hypothermia was applied with ice water bags on the back of rats for 14 days. On the 15 th day, flaps were raised. Group III (spray group): Hypothermia was applied with cooling sprays on the back of rats for 14 days. On the 15 th day, flaps were raised. All flaps were sutured to their original places and the percentages of viable ares of flaps were measured 7 days later. Plasma VEGF levels of all rats were measured on the th days. v

8 When flaps were examined macroscopically, necrotic areas of flaps in group II were observed more light-colored than group III and group I. The necrosis were defined as full thickness in group I and group III and partial thickness in group II. The percentages of the viable areas of the flaps were measured as 64.87% in group I, 57.69% in group II, 62.22% in group III. The average percentage of viable areas of flaps in group II was lower than group I and group III, and the differences were statistically significant (P=0.006 for group I and P = for group III). Blood levels of VEGF were as follows: on 1 st day, in group I: 1.82 pg / ml, in group II: 2.78 pg / ml, in group III: 2.69 pg / ml, on 4 th day, in group II: 3.78 pg / ml, in group III: 1.23 pg / ml, on 7 th day, in group II: 1.62 pg / ml, in group III: 2.83 pg / ml, on 15 th day in group II: 2.14 pg / ml, in group III: 1.57 pg / ml. The differences between the values of the1 st days amoung groups were not statistically significant. When the values of the 4 th day were compared with the baseline values (1 st day values) of the groups there was no statistically significant difference in group II but in group III the difference was statistically significant (P=0,031). When the values of the 7 th and 15 th days, were compared with both the values among the groups and the baseline values of each group, the differences were not statistically significant. At the end of our study no increase in flap viabilities and VEGF blood levels were demonstrated. The reason of no increase of flap viabilities were concerned as the inadequacy of cold application period or lack of neovascularisation effect of long term hypothermia application. As the conclusion, our results showed that application of local hypothermia for 2 weeks on random patern skin flaps wouldn t be efficient in clinical practice. If increase in flap viability were demonstrated through longer period hypothermia applications hypothermia could be in frequent use for clinical practice as a cheap and easy application which is devoid of side effects. Key words: Hypothermia, preconditioning, VEGF. vi

9 ĐÇĐNDEKĐLER Özet iii Đngilizce özet...v Đçindekiler dizini...vii Kısaltmalar dizini......ix Şekiller dizini...xii Tablolar dizini..xiv 1. Giriş ve Amaç.1 2. Genel Bilgiler Önkoşullama Yöntemleri Cerrahi geciktirme (klasik/stratejik) Đskemik Önkoşullama Uzak Đskemik Önkoşullama Hipertermi Hipotermi Farmakolojik ajanlar Büyüme faktörleri Öncül hücreler Hipoksiyi taklit eden ajanlar Diğer yöntemler Hipotermi Sistemik Hipotermi Sistemik Hipoterminin Vücut Sistemleri Üzerine Etkileri Lokal Hipotermi Lokal Hipoterminin Etkileri Yeni Damar Oluşumu Vaskülogenez VEGF Sinyal Yolu Anjiyopoietin Hipoksi / HIF Nitrik Oksit (NO) Reaktif Oksijen Türleri (ROS) Doğum Sonrası Dönemde Vaskülogenez Anjiyogenez Anjiyogenezin Basamakları Anjiyogenez Üzerine Etkili Mediatörler Oksidanlar ve Anjiyogenez Siklooksijenaz Enzimi ve Anjiyogenez Tedavi Edici Anjiyogenez ve Vaskülogenez Hipotermi ve Yeni Damar Oluşumu...37 vii

10 2.4 Vasküler Endotelyal Büyüme Faktörü (VEGF) VEGF Ailesi VEGF Reseptörleri VEGF nin Etkileri VEGF Sentezleyen Hücreler VEGF Sentezini Etkileyen Faktörler VEGF nin Fizyolojik Anjiyogenezdeki Rolü Hipotermi ve VEGF Gereç ve Yöntem Hayvanların Bakımı Kullanılan Malzemeler Buzlu Su Torbasının Hazırlanması Soğutucu Sprey Uygulaması Kanda VEGF Seviyesinin Ölçülmesi Dorsal Deri Flebinin Hazırlanması Yüzey Alan Ölçümü Đstatistiksel Analiz Deney Protokolü Bulgular Flep Canlılığı VEGF Kan Seviyeleri Tartışma Sonuç Kaynaklar..86 viii

11 KISALTMALAR ACTH: Ang: aptt: ATP: bfgf: BMP: BYD: Ca: camp: cgmp: CO: COX: DFO: ECM: EGF: EH: ELISA: enos: EPC: EPO: Fe: FGF: G: H 2 O 2 : HIF-1: HO: HSP: I/R: IGF: IL-1: Adrenokortikotropik Hormon Anjiyopoietin Aktive Kısmi Tromboplastin Zamanı Adenozin Trifosfat Bazik Fibroblast Büyüme Faktörü Kemik Morfojenik Proteini Beyaz Yağ Dokusu Kalsiyum Siklik Adenozin Monofosfat Siklik Guanozin Monofosfat Karbon Monoksit Siklooksijenaz Deferroksamin Ekstraselüler matriks Epidermal Büyüme Faktörü Endotel Hücresi Enzyme-Linked Immunosorbent Assay Endotelyal NOS Endotel Öncül Hücre (Endothelial Precursor Cell) Eritropoietin Demir Fibroblast Büyüme Faktörü Gauge Hidrojen Peroksit Hipoksi ile Đndüklenen Faktör (Hypoxia Inducable Factor) Hem Oksijenaz Isı Şok Proteini (Heat Shock Protein) Đskemi Reperfüzyon Đnsülin Benzeri Büyüme Faktörü Đnterlökin-1 ix

12 IL-6: IL-8: IP: inos: ĐP : KGF: KĐ: KL: KYD: L-NAME: MFLA: MMP: NE: nnos: NO: NOS: O 2: PDGF: PECAM-1: PEDF: PGC-1α : PGD2 PGE2: PGF2α: PGI2: PGF: PMNL: po 2 : PPAR-γ: PT: PTT: RIP: Đnterlökin-6 Đnterlökin-8 Đskemik Önkoşullama Đndüklenebilir NOS Đntraperitoneal Keratinosit Büyüme Faktörü Kemik Đliği Korpus Luteum Kahverengi Yağ Dokusu L-Nitro Arjinin Metil Ester Monofosforil Lipid A Matriks Metalloproteinazları Norepinefrin Nöronal NOS Nitrik Oksit Nitrik Oksit Sentaz Oksijen Molekülü Trombosit Kaynaklı Büyüme Faktörü Trombosit Endotel Hücre Yapışma Molekülü Pigment Epiteli Kaynaklı Faktör PPAR-γ koaktivatör-1α Prostaglandin D2 Prostaglandin E2 Prostaglandin F2α Prostaglandin I2 Plasental Büyüme Faktörü Polimorfonükleer Lökosit Kısmi Oksijen Basıncı Peroksizom Proliferatör Đle Aktive Edilen Reseptör-γ Protrombin Zamanı Kısmi Tromboplastin Zamanı Uzak Đskemik Önkoşullama x

13 ROS: SF : SSS: TGF: TKR: TMB: TNFα: TSH: TXA2: UCP-1: VAC: VE-cahedrin: VEGF : VEGFR-1: VEGFR-2: Reaktif Oksijen Türleri Serum Fizyolojik Santral Sinir Sistemi Transforme Edici Büyüme Faktörü Tirozin Kinaz Reseptörü Tetrametilbenzidin Tümör Nekroz Faktörü α Tiroit Uyarıcı Hormon Tromboksan A2 Uncoupling Protein -1 Vakum Yardımlı Kapama Vasküler Endotel - Cahedrin Vasküler Endotel Büyüme Faktörü VEGF reseptörü-1 VEGF reseptörü-2 xi

14 ŞEKĐLLER Şekil 2.1: Hem molekülünün katabolizması. Şekil 2.2: Nitrik oksit sentezi. Şekil 2.3: Lokal hipoterminin dokudaki etkileri. Şekil 2.4: Kapiller damarın yapısı. Şekil 2.5: Vaskülogenez. Şekil 2.6: Hipoksi ve oksidanların yeni damar oluşturma mekanizması. Şekil 2.7: Hipoterminin kahverengi yağ dokusu (KYD) üzerine etkisi. Şekil 2.8: Kahverengi yağ dokusunda ısı üretimi ve hipoksi oluşması. Şekil 2.9: Hipoterminin yeni damar oluşturma mekanizması. Şekil 2.10: VEGF ailesi ve reseptörleri. Şekil 3.1: Buzlu su torbası. Şekil 3.2: Temassız termometre. Şekil 3.3: Buzlu su torbasının ısısı. Şekil 3.4: Buzlu su torbasının uygulanması. Şekil 3.5: Buzlu su uygulaması sırasında sıçanın sırt ısısının ölçülmesi. Şekil 3.6: Buzlu su uygulamasından önce ve uygulaması sırasında sıçanın alın ve karın ısılarının ölçümü. Şekil 3.7: Soğutucu spreyler. Şekil 3.8: Soğutucu sprey uygulaması sonrasında sırt ısısının normale dönmesi. Şekil 3.9: Katı faz sandviç ELISA yöntemi. Şekil 3.10: 3X9 cm boyutlu dorsal deri flebinin çizimi. Şekil 3.11: Dorsal deri flebinin hazırlanması. Şekil 3.12: Flebin yerine dikilmesi. Şekil 3.13: Alan ölçümü için yerleştirilen beyaz kağıt. Şekil 3.14: Sıçanın düz yüzey üzerinde sabitlenmesi. Şekil 3.15: Bilgisayarda ölçüm yapılacak alanın seçilmesi. Şekil 3.16: Bilgisayarda measurement log aracı ile ölçüm yapılması. xii

15 Şekil 3.17: Soğuk uygulamasının gruplara göre süresi. Şekil 4.1: Kaldırıldıktan 7 gün sonra grup I e ait deri fleplerinin fotoğrafları. Şekil 4.2: Kaldırıldıktan 7 gün sonra grup II e ait deri fleplerinin fotoğrafları. Şekil 4.3: Kaldırıldıktan 7 gün sonra grup III e ait deri fleplerinin fotoğrafları. Şekil 4.4: Canlı ve nekrotik alan yüzdelerinin gruplara göre karşılaştırması. Şekil 4.5: Gruplara ve günlere göre VEGF seviyelerinin grafiksel gösterimi. xiii

16 TABLOLAR Tablo 2.1: Önkoşullama yöntemleri. Tablo 2.2: Farmakolojik önkoşullama yöntemleri. Tablo 2.3: Diğer önkoşullama yöntemleri. Tablo 2.4: Lokal hipoterminin etkileri. Tablo 2.5: Hipoterminin etki mekanizmasında görev alan temel moleküller. Tablo 2.6: Vaskülogenez üzerine etkili faktörler. Tablo 2.7: Anjiyogenez üzerine etkili mediatörler. Tablo 2.8: VEGF reseptörleri ve ko-reseptörlerinin görevleri. Tablo 2.9: VEGF nin temel etkileri. Tablo 2.10: VEGF sentezini etkileyen faktörler. Tablo 3.1: Kullanılan farmakolojik ve kimyasal maddeler. Tablo 3.2: Kullanılan malzemeler. Tablo 4.1: Grup I (kontrol grubu) deri flebi canlı ve nekrotik alan yüzdeleri. Tablo 4.2: Grup II (buzlu su grubu) deri flebi canlı ve nekrotik alan yüzdeleri. Tablo 4.3: Grup III (sprey grubu) deri flebi canlı ve nekrotik alan yüzdesi. Tablo 4.4: Gruplara ve günlere göre ortalama VEGF kan seviyeleri. xiv

17 1. GĐRĐŞ ve AMAÇ Kanser ve travma gibi sebeplerle meydana gelen doku defektlerinin kapatılması, plastik cerrahinin önemli ilgi alanlarındandır. Flep cerrahisi defekt onarımında rutin olarak kullanılmaktadır. Kimi zaman bu defektler, iyi kanlanmayan, elastik özelliği azalmış ve çevre doku miktarı yetersiz alanlarda oluşur. Böyle durumlarda doku defektinin kapatılması daha zordur. Bu sebeple, flep nekrozunun azaltılması, flep canlılığının ve boyutunun artırılması uzun süreden beri araştırma konusu olmuştur. Ayrıca hastaya uygulanacak ameliyat sayısının, hastanede kalış süresinin, ekonomik kaybın ve psikolojik travmanın azaltılması için flep sağ kalımının artırılmasına yönelik yöntemlerin kullanılması önemlidir (1). Flep cerrahisindeki gelişmelere rağmen flep nekrozu halen önemli bir problemdir. Flep nekrozu tam veya kısmi olabilir. Literatürde kısmi flep nekrozu, serbest fleplerde %7-20, pediküllü fleplerde %20-33 oranında görülmektedir. Kısmi nekrozun sebebi olarak, iskemi-hipoksi veya geçici iskemi sonrasında görülen iskemireperfüzyon (I/R) hasarı düşünülmektedir (2-5). Araştırmalarda, flep nekrozunu engelleyecek veya miktarını azaltacak çeşitli yöntemler denenmektedir. Cerrahi geciktirme, başarısı kanıtlanmış uygulamalardandır (6). Ancak iki aşamalı ameliyat gerektirir, bu nedenle ek cerrahi risk taşır ve maliyeti yüksektir. Farmakolojik ajanlar diğer bir yöntemdir ancak sistemik olarak uygulandığından yan etkilere yol açabilmektedir (7). Büyüme faktörlerinin ve öncül hücrelerin kullanılması başarılı sonuçlar verse de maliyeti oldukça yüksektir ve teknik ekipman gerektirir (8-12). Diğer bazı yöntemlerse pratik olmadıklarından klinik uygulamada kendilerine yer bulamamıştır. Flep canlılığını artıracak yöntemin klinikte uygulanabilmesi için toksik etkilerinin olmaması, kolay uygulanabilir ve ucuz olması, ileri teknolojiye ihtiyaç duymaması gerekmektedir. Büyüme faktörleri ve öncül hücrelerle yapılan araştırmalarda, flepteki damar miktarının artırılması ile flep canlılığının arttığı gösterilmiştir (12-14). Hipotermi uygulaması ile bazı dokularda damarlanma artışı olduğu bilinmektedir (15-20). Ancak 1

18 flepler üzerinde bugüne kadar yapılan çalışmalarda hipoterminin sadece doku üzerinde yarattığı stres etkisi araştırılmıştır. Hipotermi kısa süreli uygulandığında dokuda stres yaratarak hipoksiye olan toleransı ve flep canlılığını artırır. Bu etkide yeni damar oluşumu gözlenmez Hipotermi, diğer önkoşullama yöntemleri ile karşılaştırıldığında, oldukça ucuz, kolay uygulanabilir bir yöntemdir ve toksik etkileri yoktur. Çalışmamızda, uzun süreli hipotermi uygulamasının flep canlılığını artırıp artırmadığını araştırdık. Uzun süreli hipotermi uygulamasının flep canlılığını artırdığı gösterilirse, klinikte geniş kullanım alanı bulacağını düşündük. 2

19 2. GENEL BĐLGĐLER 2.1 ÖNKOŞULLAMA YÖNTEMLERĐ Flepte nekroz oluşmasının sebebi olarak, iskemi-hipoksi veya geçici iskemi sonrasında görülen iskemi-reperfüzyon (I/R) hasarı düşünülmektedir. Đskemi ve hipoksi durumunda, flep canlılığı için kritik öneme sahip olan oksijen ve besin maddeleri flebe ulaştırılamaz. Bu durumdan asıl etkilenen kısım, dolaşımın en fazla bozulduğu distal bölgedir (21-22). I/R hasarında durum farklıdır, mikrovasküler perfüzyon bozukluğu flebin tamamını etkiler. Geçici iskemi sonrasında reperfüzyon ile beraber dokuya ulaşan lökositler, enflamatuvar yanıt başlatır, çok miktarda serbest radikal ve enflamatuvar sitokin üretilir. Sitokinlerin etkisiyle lökositler dokuya geçerek, hasara sebep olan enzimler salgılar. Bu şekilde doku hasarı ve dolaşım bozukluğu meydana gelir (23). Flep nekrozunu engellemeye yönelik uygulamalardaki ortak amaç dokuyu bir stres faktörüne maruz bırakarak, daha sonra karşılaşacağı iskemiye hazırlamaktır. Böylece doku, normalde ölümcül olabilecek iskemi miktarına tolerans geliştirir. Flep kaldırılmadan önce uygulanan ve dokuyu eğiten, adapte eden bu yöntemlere önkoşullama yöntemleri (preconditioning) adı verilmiştir. Başlıcaları, cerrahi geciktirme (klasik/stratejik), iskemik önkoşullama, uzak iskemik önkoşullama, hipotermi, hipertermi, farmakolojik ajanlar, büyüme faktörleri, öncül hücreler, hipoksiyi taklit eden ajanlardır (Tablo 2.1) Cerrahi Geciktirme Flebin nihai naklinden önce flep dolaşımının kısmen engellenmesi yöntemidir. Cerrahi geciktirme iki şekilde uygulanır (6). 1. Klasik (standart) Geciktirme: ilk ameliyatta flep, çevresinden veya tabanından kesilerek kısmen kaldırılır ve tekrar yerine dikilir gün sonra yapılan 2. ameliyatta tamamen kaldırılarak yeni yerine nakledilir. 2. Stratejik Geciktirme: ilk ameliyatta flebi besleyen damarlardan en az 1 tane dominant pedikül sağlam kalacak şekilde diğerleri bağlanır. 2-3 hafta sonra yapılan 2. ameliyatta flep tamamen kaldırılarak yeni yerine nakledilir. 3

20 Önkoşullama Yöntemleri 1. Cerrahi geciktirme (klasik/stratejik) 2. Đskemik Önkoşullama 3. Uzak Đskemik Önkoşullama 4. Hipotermi 5. Hipertermi 6. Farmakolojik ajanlar 7. Büyüme faktörleri 8. Öncül hücreler 9. Hipoksiyi taklit eden ajanlar 10. Diğer yöntemler Tablo 2.1: Önkoşullama yöntemleri. Cerrahi geciktirmenin mekanizması bugün bile tam olarak anlaşılamamıştır. Cerrahi geciktirmenin fizyolojisi üzerinde tartışmalar olmasına rağmen, sonuçları iyi bilinmektedir. Kısmi iskemiye maruz bırakılan dokunun damarlarında hipertrofi olur. Damarlar hipoksik gradient boyunca dizilim gösterir. Boğuk anastamozlar (choke anastamosis) açılır ve gerçek anastamoz haline gelir. Böylece komşu vasküler alanlar flebe dahil edilerek flep boyutu artırılır. Flep proksimal dolaşımındaki reaktif hipereminin sebep olduğu çalma etkisi (steal effect) engellenir, distale daha fazla kan akımı gelmesi sağlanır. Cerrahi geciktirme, yöntem olarak iki veya daha fazla basamaklı cerrahiye ihtiyaç duyar, bu da maliyeti ve komplikasyon riskini artırır Đskemik Önkoşullama (Ischemic Preconditioning, IP) Dokunun kısa bir süre iskemik bırakılması, sonra dolaşıma tekrar izin verilmesidir. Bu uygulamadaki amaç, dokunun reperfüzyon hasarına karşı toleransını artırmaktır. IP nin canlılığı artırıcı etkisi, kalp, beyin, karaciğer, böbrek dokularında ve fleplerde gösterilmiştir (24-28). Çalışmalarda, en etkili IP yönteminin 3 defa 10 dakika süreyle iskemi uygulanması olduğu gösterilmiştir. IP cerrahiden 24 saat önce 4

21 uygulandığında reperfüzyon hasarına karşı koruyucu etki gösterirken cerrahinde hemen önce uygulandığında hem reperfüzyon hasarına hem de mikrodolaşım bozukluğuna karşı koruyucu etki göstermektedir (29) Uzak Đskemik Önkoşullama (Remote Ischemic Preconditioning, RIP) Bu yöntemde iskemi - reperfüzyon durumu, cerrahi yapılacak bölgeden uzaktaki başka bir sahada oluşturulur. IP de olduğu gibi cerrahiden 24 saat önce veya hemen girişim öncesi uygulanabilir. Çalışmalarda, ekstremiteye bağlanan bir turnike ile sağlanan RIP in yağ-deri ve kas fleplerinin canlılığını artırdığı gösterilmiştir (30,31) Hipertermik Önkoşullama Dokunun 42 C ye ısıtılması şeklinde uygulanır. Artan ısı nedeniyle, ısı şok proteini denilen proteinler sentezlenir. En iyi bilinenleri HSP32, HSP70 ve HSP72 dir. Bu proteinler dokuları, spesifik olmayan strese karşı korurlar ve iskemiye olan toleransı artırırlar. Çalışmalarda, cerrahiden 6-24 saat önce uygulanan lokal veya sistemik hiperterminin, deri, kas-deri ve fasya-deri fleplerin canlılığını artırdığı gösterilmiştir (32-34) Hipotermik Önkoşullama Flebin cerrahi öncesinde 8-12 C ye soğutulmasıdır. Flep canlılığını artırdığı gösterilmiştir (35). Hipotermi, hem dokunun metabolizma hızını yavaşlatarak, hem de HSP sentezlenmesini sağlayak, iskemiye karşı toleransı artırır. Cerrahiden 24 saat önce uygulanır. Hipoterminin kısa ve uzun süreli uygulamasının doku üzerideki etkileri, hipotermi bölümünde ayrıntılı olarak tartışılmıştır Farmakolojik Önkoşullama Dokunun iskemik toleransını artırmak için uygulanan farmakolojik ajanlar ve etki mekanizmaları tablo 2.2 de gösterilmiştir. 5

22 2.1.7 Büyüme Faktörleri Flep dokusunda yeni damar oluşumu açısından en önemli önkoşullama yöntemleri, öncül hücrelerin kullanımı ve Vasküler Endotelyal Büyüme Faktörüdür (VEGF). Bu iki yöntem daha ayrıntılı olarak tartışılmıştır. Flep canlılığını artırma yöntemi olarak çeşitli büyüme faktörleri kullanılmıştır. Bunların en iyi bilinenleri Transforme Edici Büyüme Faktörü (TGF) izoformları, bazik Fibroblast Büyüme Faktörü (bfgf), Trombosit Kökenli Büyüme Faktörü (PDGF) ve VEGF dir (8-10). Önkoşullama Đçin Kullanılan Farmakolojik Ajanlar Farmakolojik Ajan Dextran Heparin Verapamil Isoxsuprine Prostaglandin I2 ve analogları Deksametazon Adenozin Ksantin analogları Ksantin oksidaz inhibitörleri Kalsitonin geni ile ilişkili peptid Monofosforil Lipid A (MFLA) Eritropoietin Đndometazin, Lökotrien B4 antagonisti Tromboksan A2 sentaz inhibitörü Siklosporin A Takrolimus (FK 506) Etki Mekanizması Mikrodolaşımın artması. Vazodilatasyon. Antienflamatuvar. Hafif enflamasyon oluşturulması. Antienflamatuvar, antiapopitotik. Antienflamatuvar. Nötrofil kemotaksisinin engellenmesi. Tablo 2.2: Farmakolojik önkoşullama yöntemleri. 6

23 VEGF Deneyesel çalışmalarda, damarlanmadaki artışın, iskemik fleplerin canlılığını artırdığı gösterilmiştir (13-14). VEGF, anjiyogenez ve vaskülogenez oluşmunda bilinen en etkili faktördür. Hayvan modellerinde ve klinikte, dokuya dışarıdan verilen VEGF proteini damarlanmayı ve flep canlılığını artırmış, flep prefabrikasyonunu hızlandırmıştır (36). Deneysel çalışmalarda, dokudaki VEGF miktarını artırmak için farklı yöntemler kullanılmaktadır. Bunların başlıcaları: 1- VEGF 165 proteininin dokuya verilmesi (37-45,47). Lokal uygulama o Kas içi o Dermis içi o Dermis altı o Cilt altı o Fasya altı o Topikal o Arter içi Sistemik ven içi uygulama 2- VEGF yi kodlayan genin dokuya verilmesi (38,48-50,52). VEGF kodlayan çıplak plazmidin cilt altı verilmesi. VEGF kodlayan adenovirüsün dermis altı verilmesi. Sistemik uygulama, VEGF aktivitesini azaltır bu nedenle tercih edilmemesi gerekir. VEGF protein önkoşullaması tek doz olarak uygulanacaksa, iskemiden hemen önce verilmesinin, 1 hafta önce verilmesine göre daha etkili olduğu gösterilmiştir. Dermis altı ve fasya altı uygulamaların yakın sonuçlar verdiği, topikal uygulamanın daha az başarılı olduğu görülmüştür. VEGF, damar geçirgenliğini artırdığından yüksek dozda kullanıldığında hematom oluşumu bildiren çalışmalar mevcuttur. Dışarıdan verilen VEGF proteini kısa ömürlüdür. Bu sebeple VEGF nin kendisinin değil onu kodlayan genin dokuya verilmesi yoluna gidilmiştir (53). Ancak VEGF kodlayan genin 7

24 aktarımında viral vektör kullanımının bildirilmiş yan etkisi vardır. Viral vektör konakta enflamatuvar ve savunma mekanizmalarını tetikleyerek doku iyileşmesini bozabilir (54). Rezende, sıçanlar üzerinde yaptığı çalışmada, çıplak insan VEGF 165 DNA sını, ciltaltı sahaya elektropolasyon yöntemiyle enjekte etmiştir. Sonuçta, elektropolasyon ile VEGF geni enjeksiyonunun, yöntem olarak, sadece gen veya VEGF protein enjeksiyonuna göre daha ucuz ve başarılı olduğu vurgulanmıştır (38) Endotel Öncül Hücreler (EPC) EPC ler, doğum sonrası dönemde, endotel hücrelerini oluşturan kök hücrelerdir (55). EPC leri belirlemekte kullanılan 3 farklı yüzey işaretleyicisi (surface marker) vardır: CD33, KDR, CD133 (12,55). Đnsanda, EPC ler, kordon kanı, periferik kan ve kemik iliğinde bulunur. EPC lerin periferik dolaşımdaki miktarı düşüktür. Doku canlılığını artırabilmek için kandan elde edilen hücre sayısının ve etkinliğinin artırılması gerekmektedir. Bu durumu aşabilmek için kullanılan yöntemler, kordon kanı kullanımı, VEGF geni nakli ve VEGF gibi büyüme fakörleri ile EPC lerin kemik iliğinden göçünün sağlanmasıdır (56). Kordon kanındaki miktar, periferik kanın 10 katı kadardır ve buradan elde edilen hücrelerin çoğalma oranları daha yüksektir (57,58). EPC ler, hipoksiye yanıt olarak sentezlenen VEGF nin etkisiyle kemik iliğinden ayrılarak periferik dolaşıma geçerler (59-62). Dolaşımdaki endotel öncül hücreler, sadece iskemik olan dokularda toplanır ve bu bölgelerde yeni damarlanma meydana getirirler (11). Ciddi hipoksi varlığında, EPC lerin çoğalmasının ve endotele yapışmasının arttığı belirlenmiştir. Aynı hipoksi derecesinde endotel hücrelerinin çoğalmadığı görülmüştür. Bu durum, iskemik dokudaki yeni damar oluşumunda EPC lerin dolayısıyla vaskülogenezin temel rol oynadığını düşündürmektedir (63). Tümör dokusunun içinde de derin hipoksi vardır. EPC lerin tümörün büyümesinde kritik öneme sahip olduğu gösterilmiştir (64). Bu bulgu da iskemik dokudaki yeni damar oluşumunda EPC lerin önemini ortaya koymaktadır. 8

25 Neovaskülarizasyonun gerekli olduğu, periferik damar hastalığı, myokardiyal iskemi, yara iyileşmesi, inme, retinopati ve tümör damarlanması durumlarında EPC lerin görev aldığı iyi bilinen bir durumdur (64-67). Bu sebeple, EPC lerin iskemik durumların tedavisinde kullanımı için çalışmalar hız kazanmıştır (56,68,69). EPC ler deney hayvanının kanından, kemik iliğinden veya insan kanından elde edilir. EPC ler, VEGF, FGF, Epidermal Büyüme Faktörü (EGF), Đnsülin Benzeri Büyüme Faktörü (IGF) gibi büyüme faktörleri ile kültüre edildikten sonra flep kaldırılacak dokuya nakledilir (12). Nakil zamanı önemli bir konudur. Bazı çalışmalarda flep kaldırılmasından hemen önce nakil yapılırken, bazılarında 28 gün önce yapılmıştır (11, 12). Ortalama süre 4-7 gündür. Nakil zamanına bağlı olarak kaldırılan fleplerin canlılığında ve damarlanmasında önemli artışlar belirlenmiştir. Park çalışmasında, insan kanından elde edilen EPC leri farelere nakletmiş ve random sırt flebi kaldırmıştır. Đnsan EPC lerinin nakledilen farelerde yeni damar oluşumu sağladığı görülmüştür. Fakat flep canlılığından önemli bir artış gözlenmemiştir (11). Bu kafa karıştırıcı durumun açıklaması şöyle yapılmıştır. EPC ler flep kaldırılmasından hemen önce verildiği için yeni damar oluşumu sağlandığında iskemik dokuyu kurtarmak için çok geç kalınmıştır. Zan tarafından yapılan çalışmada, cilt altı enjekte edilen EPC lerin aynı yöntemle verilen VEGF proteinine göre önemli derecede fazla flep canlılığı ve damarlanması sağladığı gösterilmiştir (12). Bu deneyde, nakil zamanı, flep kaldırılmasından 28 gün öncedir. Çalışmanın 2 önemli sonucu vardır. Birincisi, EPC nakli, VEGF proteininin verilmesine göre flep canlılığı ve damarlanması açısından daha başarılıdır. Đkincisi, EPC nakli, sadece flep damarlanmasını artırmamış, flep canlılığında da artışa sebep olmuştur. EPC naklinin VEGF proteini verilmesinden daha başarılı olmasına sebep olarak 3 faktör düşünülmektedir: 9

26 1- EPC ler verildikleri bölgede, sadece damar oluşturmakla kalmayıp, büyüme faktörleri de salgılamaktadır. Böylece bir anlamda büyüme faktörü de verilmiş olur. 2- EPC ler iskemik alana yöneldiklerinden, en ihtiyaç olan bölgede yeni damarlanma meydana getirirler. 3- VEGF proteini kısa ömürlüdür, etkili olabilmesi için tek doz genellikle yetersizdir. Zan çalışmasında çok önemli bir noktaya işaret etmiştir. EPC naklinin flep canlılığını artırabilmesi için, şiddetli iskemik etkiden birkaç hafta önce EPC ler dokuya nakledilmiş olmalıdır. Aksi taktirde, iskemik dokuyu kurtarabilmek için zamanında yeni damar oluşumu sağlanamayacaktır. Çalışmalarda önemle vurgulanan nokta, EPC lerin fonksiyonel damar yapısı oluşturması için en az 2 hafta süreye ihtiyaç duymalarıdır. EPC lerin iskemik dokuya 3. günde ulaştığı, 7. günde kümeler oluşturduğu ve 14. gün civarında fonksiyonel damarlar meydana getirdiği gösterilmiştir (11,55,63). Nakanishi çalışmasında sıçanların karın bölgesinden fasya-deri grefti alarak, sırt bölgesine nakletmiş ve nakilden sonra, grefte fasya altı planda EPC vermiştir (70). Greft canlılığı açısından kontrol grubu ile belirgin farklılık saptanmamıştır, ancak fasyal damarlanma, EPC nakli yapılan grupta belirgin artmıştır. Bazı çalışmalarda, EPC ler VEGF plazmidi eklendikten sonra dokuya nakledilmiştir. Sonuçta VEGF plazmidine sahip hücrelerin nakledildiği deneklerde, kandaki VEGF seviyesinin daha yüksek olduğu görülmüştür. Ayrıca flep canlılığının ve damarlanmasının da normal EPC nakledilen gruptan daha fazla olduğu belirlenmiştir (55). Zheng tarafından yapılan çalışmada, mezenşimal kök hücrelere VEGF 165 plazmidi eklenmiştir. Sonuçta, VEGF geni eklenen grupta, flep canlılığı, VEGF seviyesi ve damarlanma miktarı, diğer gruplara göre belirgin artmış olduğu görülmüştür (53). 10

27 2.1.9 Hipoksiyi taklit eden ajanlar (Hipoksimimetikler) Hipoksi, dokuda Hipoksi ile Đndüklenen Faktör-1α (HIF-1α) seviyesini artırarak yeni damarlanma meydana getirir. Hipoksimimetik denilen ajanlar bu etkiyi taklit ederler ve dokuda hipoksi olmamasına rağmen HIF-1α seviyesinin artmasına sebep olurlar. En iyi bilinenleri deferroksamindir (DFO). Deneysel çalışmalarda, deferroksaminin random deri fleplerinin canlılığını artırdığı gösterilmiştir (71). gösterilmiştir Diğer Yöntemler Flep canlılığını artırmak için uygulanan diğer yöntemler tablo 2.3 te Diğer Önkoşullama Yöntemleri 1. Botox 2. Elektrik uyarım 3. Denervasyon 4. Doku genişleticiler 5. Endotelin-1 6. Elektroşok dalgası 7. Hormonlar 8. Hiperbarik oksijen 9. Lazer 10. Mekanik gerilim Tablo 2.3: Diğer önkoşullama yöntemleri. 11

28 2.2 HĐPOTERMĐ Tedavi yöntemi olarak soğuk uygulaması, çok eski tarihlere uzanmaktadır. Edwin Smith Papürüsü nde (ĐÖ ) baş ve meme bölgesindeki yaralara soğuk uygulaması önerilmiştir (72). Travmada ilk kullanımı ise muhtemelen Homer in Đliad ında Patroklus tarafından, yaralı bacağına soğuk torbalar koymak şeklinde yapılmıştır (73). Kar ve buz, ağrıyı azaltmak, kanamayı durdurmak, iyileşmeyi hızlandırmak ve yaralı kişinin performansını artırmak için sıklıkla kullanılmıştır (73). Literatürde, hipoterminin 2 farklı uygulama şekli mevcuttur: Sistemik ve lokal hipotermi. Sistemik hipotemi, tüm vücudun C civarına (hafif hipotermi) soğutulmasıdır. Genellikle saat uygulanır ama 10 güne kadar uygulanması bildirilmiştir. Soğutma yöntemi olarak, yüzey alan soğutması veya soğuk sıvıların damar içine infüzyonu kullanılır (74). Sistemik hipotermide amaç, dokuların hipoksik kaldığı durumlarda (hipoksik ensefalopati, kardiyak arrest vb) metabolizma hızını düşürerek meydana gelen hücre hasarını azaltmaktır. Lokal hipotermi vücudun bir bölümünün 30 dakika boyunca 4-8 C ye soğutulmasıdır. Flep cerrahisinden 24 saat önce uygulanır. Dokuda, spresifik olmayan stres durumu oluşturarak mikrodolaşımı artırır. Cerrahi sonrasında canlılığını koruyan doku miktarını artırmayı hedefler. Aynı zamanda lokal hipotermi, girişimsel işlemler öncesi lokal anestezik olarak ve spor yaralanmalarında analjezik olarak kullanılmaktadır (75,76) Sistemik Hipotermi Hipoterminin iskemik hasara karşı sinir koruyucu etkisi, deneysel çalışmalarla kanıtlanmış iyi bilinen bir durumdur (77,78). Hipotermi (<25 C), uzun süreden beri yüksek riskli olgularda, beyni iskemik hasardan korumak amacıyla ameliyat süresince kullanılmaktadır (78). Beynin hipoksik hasara maruz kaldığı, yenidoğanın hipoksik iskemik ensefalopatisi, hepatik ensefalopatiye bağlı kafa içi basınç artışı, kardiyak arrest durumlarında, hipoterminin mortalite ve morbiditeyi azaltıcı etkisi gösterilmiştir ve kilinikte kullanılmaktadır (74,79-85). Akut serebrovasküler olay ve travmatik beyin hasarı vakalarında önerilmekle beraber etkinliği tam olarak kanıtlanmamıştır (74,86, 12

29 87). Akut kafa içi kanama hastalarında, kanama bölgesinin çevresindeki ödemi ve buna bağlı olarak mortaliteyi azalttığı belirlenmiştir (88). Đskemik kalbin oksijen kullanımını düşürmek, adenozin trifosfat (ATP) depolarının tükenmesini yavaşlatmak için kalp transplantasyonu ve diğer kardiyovasküler cerrahi ameliyatlarında da rutin olarak kullanılmaktadır. Diğer kullanım sahaları, spinal kord yaralanması, spinal kordun korunması, nörolojik hasarı olan hastada ateş durumlarıdır (74,79,82,89,90). Domuzlarda ve sıçanlarda yapılan deneysel çalışmalarda, hemorajik şok modelinde hipotermi uygulamasının mortaliyeti azalttığı gösterilmiştir (91-93). Myokardiyal enfarktüs modelinin kullanıldığı hayvan deneylerinde, hipoterminin hücre hasarını ve mortaliteyi azaltmaktadır (94) Sistemik Hipoterminin Vücut Sistemleri Üzerine Etkileri: Santral Sinir Sistemi: Hipotermi uygulamasıyla, beyin metabolizması yavaşlar, damarların - hücre zarının - kan beyin bariyerinin geçirgenliği azalır, serebral ödem geriler, kafa içi basınç düşer. Ayrıca enflamatuvar yanıt ve serbest radikal oluşumu azalır, hücre zarı stabilleşir, apopitoz ve hücre ölümü engellenir (74,79,90). Kardiyovasküler sistem: Metabolizma yavaşlar, kalp hızı ve tansiyon düşer, oksijen ihtiyacı, artyük ve kalp debisi azalır. Ritim bozukluğuna yatkınlık artar (74,95,96). Metabolizma: Metabolik hız %5-7 azalır, kalori ihtiyacı düşer, hafif asidoz oluşur, insülin duyarlılığı ve sekresyonu azalır (74,79,90). Đlaç metabolizması: Đlaç metabolizması yavaşlar ve ilaçların etki süreleri uzar (97). Pıhtılaşma sistemi: Normal kan pıhtılaşma mekanizması bozulur. Protrombin zamanı (PT) ve kısmi tromboplastin zamanı (PTT) uzar, fibrinolitik aktivite ve trombosit fonksiyonu bozulur (74,79,90). Đmmün Sistem: Nötrofil ve makrofaj fonksiyonları baskılanır, enflamatuvar cevap azalır. Lökositlerin hücre zarı esnekliğini kaybeder, enfeksiyona yatkınlık artar (74,79,90,98,99). Sıvı-elektrolit: Potasyum ve magnezyum hücre dışına çıkar. Ritim bozukluğu ve hipotansiyon ihtimali artar (74,79,90). 13

30 2.2.3 Lokal Hipotermi Rekonstrüktif cerrahide lokal hipotermi, vücudun bir bölümünün 4-8 C ye soğutulması (derin hipotermi) şeklinde kullanılmaktadır. Kritik şekilde uzamış iskemi zamanına rağmen, 6-7 C ye soğutulan kas-deri fleplerinin canlılığını koruduğu, ilk defa Donski tarafından gösterilmiştir (35). Sıçanın kremaster kasında yapılan bir çalışmada 4 C de 8-24 saat boyunca saklanan örneklerin canlılığını daha fazla koruduğu gösterilmiştir (100). 189 serbest flep üzerinde yapılan bir çalışmada, fleplere 4 saat boyunca uygulanan yüzey soğutmasının, fleplerde herhangi bir değişikliğe yol açmadığı ve serbest flep cerrahisini olumsuz etkilemediği belirlenmiştir (101). Kubulus tarafından, tavşanlar üzerinde yapılan bir çalışmada, flep cerrahisinden 24 saat önce uygulanan hipoterminin, flep canlılığını artırdığı gözlenmiştir (102). Bu deneyde lokal hipotermi, 4 C deki buzlu su torbasının 30 dakika boyunca, tavşanların kulak bölgesine temas ettirilmesiyle sağlanmıştır. Lokal hipoterminin etkilerinin araştırıldığı diğer çalışmalarda da, soğutma 30 dakika boyunca ve buzlu su torbası ile yapılmıştır (103,104) Lokal Hipoterminin Etkileri: Lokal hipoteminin canlılığı artırma mekanizması, sistemik hipotermiden farklıdır. Lokal hipotermide, doku 4-8 o C ye soğutulurken, sistemik hipotermide tüm vücut o C ye soğutulur. Yumuşak doku yaralanmasının patofizyolojisinde, hücresel metabolizma artışı, kanama, hiperemi, ödem ve lökosit toplanması vardır (98). Lokal hipotermi, uygulandığı süre boyunca, arterioler vazokonstrüksiyon oluşturarak, mikrodolaşım düzeyinde perfüzyonu azaltır. Soğuk uygulamanın son bulması ve dokunun ısınması ile beraber, reaktif hiperemi ve vazodilatasyon oluşur, mikroperfüzyon tam anlamıyla tekrar sağlanır (105). Kan akımı azalmasına rağmen doku canlılığı artmaktadır çünkü hipotermi nedeniyle dokunun metabolik ihtiyacı ve ödem azalır. 14

31 Sıcak iskemi durumunda, hipotermide olduğu gibi dokuda hipoksi oluşur. Ancak iskemi sonrasındaki reperfüzyon esnasında dokuya gelen lökositler şiddetli enflamatuvar yanıt oluşturarak, hasara sebep olur (I/R hasarı). Hipotermide durum faklı olup reperfüzyon esnasında enflamatuvar yanıt ve dolayısıyla doku hasarı oluşmaz (106). Deneysel bir çalışmada, farelerde TNF-α ile enflamasyon meydana getirilmiş ve lokal hipotermi uygulamasının bu durum üzerine etkileri araştırılmıştır. Sonuçta, soğuk uygulamasının enflamasyon nedeniyle ortaya çıkan, kapiller perfüzyon bozukluğu, artmış lökosit cevabı ve yapışması, makromoleküler sızma, apopitotik hücre ölümü durumlarını engellediği belirlenmiştir (98). Çalışmalarda, lokal hipoterminin iskemi ve I/R hasarına karşı koruyucu olduğu, flep canlılığını artırdığı gözlenmiştir (107). Hipoterminin etki mekanizması tam olarak ortaya konmamakla beraber mikrodolaşımı artırdığı ve enflamatuvar cevabı baskıladığı bildirilmiştir. Gözlenen diğer önemli etkileri, apopitozun ve lökosit yapışmasının azalması, endotel bariyer fonksiyonunun korunması, hücresel metabolizmanın yavaşlaması ve anti-oksidan etkidir (98,102,105,106) (Tablo 2.4). Hipotermi, kapiller düzeyde vazokonstrüksiyon meydana getirir. Bu durum kan akımını yavaşlatır ve hipoksi oluşturur (98). Doku düzeyinde, spesifik olmayan bir stres durumu meydana gelir. Dokunun buna tepkisi HSP sentezlemek olur. HSP ler, diğer stres proteinleri gibi, sonuçta oksidatif stres oluşturan değişik uyaranlara yanıt olarak sentezlenirler (108). Yapılan çalışmalarda soğuk uygulamasının HSP32, HSP70, HSP90, HSP110 seviyelerini artırdığı belirlenmiştir (102, ). Esas etki mekanizmasının HSP 32 üzerinden olduğu düşünülmektedir. HSP 32 nin katalizlediği reaksiyonların ürünleri bloke edildiğinde, soğuk uygulamasının koruyucu etkilerinin ortadan kalktığı gözlenmiştir (98). HSP 32 düzeyinin, soğuk uygulanan dokuda daha fazla arttığı ve daha uzun süre yüksek kaldığı belirlenmiştir (102). Soğuk uygulamasına bağlı olarak HSP 32 sentezlenmesinin, deri, kalp, santral sinir sistemi (SSS) gibi birçok farklı dokuda meydana geldiği tesbit edilmiştir (109, 110, 102). 15

32 Lokal Hipoterminin Etkileri Hücresel metabolizma yavaşlar Endotel bariyer fonksiyonu korunur Makromoleküler sızma azalır Mikroperfüzyon artar Apopitoz azalır Antioksidan etki oluşturur Enflamatuvar yanıt baskılanır Lökosit yapışması azalır ROS üretimi azalır Đskemik ve I/R hasarına karşı koruyucu etki Hücre canlılığında artış Tablo 2.4: Lokal hipoterminin etkileri. Hipoterminin, HSP 32 sentezine nasıl yol açtığı, tam olarak belirlenememiştir. Soğuk nedeniyle vazokonstrüksiyon oluşur, kan akımı yavaşlar, dokuda hipoksi meydana gelir, besin maddesi azalır (106). Hipoksinin, HSP 32 sentezine doğrudan yol açtığı düşünülmektedir çünkü önkoşullama yapılmadan flep kaldırılan dokularda HSP 32 düzeyinin, hafif derecede arttığı belirlenmiştir (102). Hipotermi ve asıl olarak hipoterminin sonlanmasıyla oluşan vazodilastasyon/hiperemi, dokuda serbest oksijen radikali oluşumuna yol açar (109,112). Bu oksidatif strese bağlı olarak HSP sentezlendiği bir diğer teoridir (102). Azalan besin maddeleri serbest radikal oluşumunu daha da artırır ve HSP 32 sentezini indirekt olarak etkileyebilir (108,113). Sonuç olarak, HSP 32 sentezlenmesinin, hipotermiye, tekrar ısınmaya, hipoksi kaynaklı oksijen radikallerine bağlı olduğu düşünülmektedir (102). 16

33 HSP 32, Hem-oksijenaz (HO) enziminin indüklenebilir izoformu olan HO-1 dir (114). HO-1, hem katabolizmasının hız kısıtlayıcı olan ilk basamağını katalizler, hem molekülünü parçalayarak, Biliverdin-IXa, Karbon monoksit (CO) ve Demir (Fe) meydana getirir (102,108,115) (Şekil 2.1). Bu enzimin diğer izoformları HO-2 ve HO-3 tür (108). Lokal hipotermiye bağlı olarak HO-1 yani HSP 32 sentezlendiği geçici spinal kord iskemisinin oluşturulduğu bir çalışmada gösterilmiştir (116). Şekil 2.1: Hem molekülünün katabolizması. Biliverdin-IXa, biliverdin redüktaz enzimi ile bilirubine indirgenir (Bkz Şekil 2.1) (108,117). Bilirubinin, güçlü antioksidan ve anti komplement sistemi özellikleri vardır. Serbest oksijen radikallerini ortamdan uzaklaştırarak, oksidatif hasara karşı koruyucu özellik gösterir (117,118). Bilirubin, lökosit yapışmasını azaltarak, enflamatuvar cevabı baskılar (98). CO nun da lökosit yapışmasını azaltıcı etkisi vardır, ancak antienflamatuvar etkinin oluşmasında bilirubinin baskın rolü olduğu düşünülmektedir (98,119). HO-1 in hem molekülünü parçalaması, ferritin sentezine yol 17

34 açar. HO-1 in etkisiyle oluşan demir, ferritin sentezinde kullanılır, böylece demirin toksik etki yaratması engellenir (115). CO potent bir vazodilatördür (120). Vasküler tonusu belirlemede gaz monoksitlerin [nitrik oksit (NO) ve CO] önemli rolü olduğunu gösteren bulgular mevcuttur (98,115,121). NO, nitrik oksit sentaz (NOS) enzimi tarafından, L-arginin den sentezlenir (Şekil 2.2). NOS, makrofaj, endotel, düz kas hücreleri ve diğer bazı hücrelerde bulunur (98,121). NOS enziminin 3 farklı izoformu vardır: Endotelyal NOS (enos), indüklenebilir NOS (inos) ve nöronal NOS (nnos). Şekil 2.2: Nitrik oksit sentezi. Yapısal (constitutive) form olan enos, sürekli aktiftir. enos aktivitesini daha da artıran 2 durum vardır: 1- Vazokonstrüksiyona - vazodilatasyona bağlı damar duvarında gerilim oluşması (shear stress). 2- Endotel reseptörlerinin asetilkolin gibi vazoaktif maddelerle uyarılması. Đndüklenebilir form olan inos, normalde çok az aktifken, enflamasyon durumunda TNF-α tarafından uyarılarak aktive olur. inos tarafından üretilen NO miktarı, enflamasyon durumunda enos tarafından üretilen miktarın 1000 katına ulaşabilir. NO, siklik guanozin monofosfat (cgmp) üretimini sağlar, cgmp hücre içinde kalsiyum (Ca) salınmasını inhibe eder ve düz kas gevşemesini sağlar (121). Aynı 18

35 zamanda NO, HO-1 yolunu da indükleyebilir. Dokularda NO üretilmesini sağlayan uyarıcı hipoksidir ancak "myojenik cevap etkisinin de NO üzerinde etkili olabileceği düşünülmektedir. Myojenik cevap, damar içi basınç yükseldiğinde, vazokonstrüksiyon oluşması, damar içi basınç düştüğünde ise vazodilatasyon gözlenmesidir (122). Hipotermi, vazokonstrüksiyona yol açar, kan akış hızı azalır ve damar içi basınç düşer, NO in buna bağlı olarak sentezlenebileceği düşünülmektedir. 3. izoform olan nnos, periferik ve santral sinir sistemleri ile Tip II çizgili kas liflerinde bulunur. Hücre haberleşmesinde görev alır. Endojen CO nun en önemli kaynağı, HO enzim sistemidir. Hem molekülünün yıkılması ile CO, Fe, Biliverdin-IXa meydana gelir (115) (Bkz Şekil 2.1). Yapılan çalışmalarda, CO ve NO nun beraber etki ederek, apopitotik hücre ölümünü azalttığı, vazodilatasyon oluşturduğu böylece mikroperfüzyonu artırdığı belirlenmiştir. CO ve NO yapısal ve işlevsel olarak benzemelerine rağmen, birbirlerinin yerini alamaz veya etkilerini artıramazlar. Hipotermiye bağlı vazodilatasyonun meydana gelmesi için her ikisinin beraber etkisi gerekmektedir. Herhangi birinin blokajı diğerinin varlığında bile, vazodilastasyon oluşmasını engeller (98). Bu durum hipotermiye bağlı mikrodolaşımın korunmasında ve doku canlılığının sağlanmasında NO ve CO nun birlikte çalıştığını gösterir. NO nun lökosit yapışmasını engelleyici özelliği bilinmektedir ancak NO bloke edilmesine rağmen, hipotermik önkoşullama uygulanan deneklerde lökosit yapışmasında azalma devam etmiştir (123). Hatta birçok yayında, muhtemelen peroksinitrit üretimi ile NO nun enflamasyonu artırdığı gösterilmiştir (123,124). Bu durum, enos tarafından sentezlenen NO nun vasküler tonüsü belirlemede, inos tarafından sentezlenen NO nun ise enflamasyonda (proenflamatuvar olarak) görev aldığını düşündürmektedir (125). Bu sebeplerden dolayı, soğuk uygulanması esnasında oluşan lökosit yapışmasını azaltıcı etkinin esas olarak CO ya bağlı olduğu düşünülmektedir (Tablo 2.5). 19

36 20 Şekil 2.3: Lokal hipoterminin dokudaki etkileri. NO: Nitrik oksit CO: Karbon monoksit Fe: Demir

37 Hipoterminin Etki Mekanizmasındaki Temel Moleküller Apopitoz Vazodilatasyon, mikroperfüzyon Lökosit yapışması ( bu özellik esas olarak bilirubine aittir) Apopitoz Vazodilatasyon, mikroperfüzyon Antioksidan etki Lökosit yapışması, enflamatuvar yanıt Tablo 2.5: Hipoterminin etki mekanizmasında görev alan temel moleküller. 21

38 2.3 YENĐ DAMAR OLUŞUMU (Neovaskülarizasyon) Yeni damar oluşumu, embriyo gelişiminde, doku ve organların büyüme sürecinde, yara iyileşmesinde çok önemlidir (126). Rekonstrüktif cerrahide, flep canlılığını artırabilmek için yeni damar oluşumunun sağlanması ve mevcut damarlanmanın artırılması önemli araştırma konularıdır. Kapillerler, organizmada besin maddeleri ve oksijen (0 2 ) ile artık ürünlerin değiştirildiği kalp-damar sistemin en son kısmıdır. Histolojik yapısı oldukça basittir. Tek sıra endotel hücrelerinden meydana gelir. Lümenin içini glikokaliks tabaka kaplar ve endotel hücrelerini kan hücrelerinden korur. Bazal membran en dış tabakayı meydana getirir ve kapillerin tübüler şeklini korumasını sağlar (127) (Şekil 2.6). Kapillerlerin duvarında daralma ve genişlemeyi sağlayan düz kas hücreleri yoktur. Bunun yerine perisitler bulunur ve kapillerin daralmasını ve genişlemesini sağlar. Tek bir perisit birden fazla kapilleri kontrol eder (128). Şekil 2.4: Kapiller damarın yapısı. 22

39 Dokularda yeni damar oluşumu, farklı mekanizmaların tek tek veya beraber çalışmasıyla meydana gelir. Bunlar: Anjiyogenez, vaskülogenez, arteriogenez ve lenfanjiyogenezdir (129). Anjiyogenez, yeni damar oluşumunun mevcut kapiller yataktan meydana gelmesidir. Vaskülogenez, öncül hücrelerin farklılaşarak, damarlanma olmayan bir bölgede yeni damar yapısı oluşturmasıdır (130). Arteriogenez, arteriollerin büyüyerek olgun arterler haline gelmesi durumudur. Lenfanjiyogenez, anjiyogenezde olduğu gibi mevcut lenfatiklerden yenilerinin gelişmesidir. Lenfanjiyogenez, yara iyileşmesi durumunda büyük öneme sahiptir (129). Tanımsal olarak, anjiyogenez ile arteriogenezin ayrılmasının sebebi, uyaranlarının farklı olmasıdır (131). Đn vitro ortamda, anjiyogenez için en kuvvetli uyaran hipoksidir. Arteriogenez oluşmasındaki en önemli faktör ise fiziksel kuvvetler, özellikle gerilim kuvvetidir (shear stres). Deneysel çalışmalarda, kronik olarak artmış sıvı gerilim kuvvetinin, arteriogenez için en önemli uyaran olduğu belirlenmiştir (131). Canlıda, yeni damar oluşumu birçok farklı durumda görülür. Neovaskülarizasyon için esas uyaran, dokuya taşınan besin maddesi ve O 2 miktarı ile dokunun metabolik ihtiyacı arasındaki uyumsuzluktur (132,133). Bu uyumsuzluk, memelilerde, anabolik aktivite artışı (ör. anabolik steroid kullanımı), katabolik aktivite artışı (ör. hipertiroidi) ve hipoksi durumlarında yeni damar oluşumuna sebep olur ( ). Yeni damar oluşumu üzerine etkili başka faktörler de saptanmıştır. Mekanik gerilim uygulamasının kapiller yatakta artışa neden olduğu gözlenmiştir. Astım hastalarında, hava yolu düz kaslarının gerilmesi yeni damar oluşumuna yol açmaktadır (137). Orta seviyede lokal ısı artışının (42 C) anjiyogenez meydana getirebileceği gösterilmiştir. Bu durumun büyüme faktörlerindeki bir artışa mı yoksa metabolik hızın artmasına mı bağlı olduğu tam olarak bilinmemektedir (138). Egzersiz ile çizgili kaslarda yeni damar oluşumu meydana geldiği görülmüştür (139,140). Hipotermi uygulamasının da yeni damar oluşumunda etkili olduğunu gösteren çalışmalar mevcuttur (15,16,18). Sistemik ısı artışı ise, anjiyogenezi inhibe eder (141). 23

40 Yeni damar oluşumu sırasında endotel hücre çoğalması ve göçü, bazı büyüme faktörleri ve onların reseptörleri tarafından kontrol edilir (142). Büyüme faktörlerinin kendilerine ait reseptörleri vardır. Araştırmalar VEGF ve reseptörünün, bu konuda kilit rol oynadığını gösteriyor (143). Ek olarak, kapiller yatakta büyüme, bazı inhibitör maddeler tarafından da düzenlenir. Bu inhibitörler arasında anjiyostatin, matriks metalloproteinazları (MMP) ve anjiyopoietin-2 bulunur ( ). Hayvan deneyleri ve hücre kültürlerinde, pigment epiteli kaynaklı faktörün (PEDF) anjiyogenezi etkili şekilde inhibe ettiği gösterilmiştir (147,148). Ayrıca PEDF, VEGF nin damar geçirgenliğini artırıcı özelliğini de baskılamakta ve doku ödemini azaltmaktadır. Fareler üzerinde yapılan çalışmalarda, PEDF nin hipotermik hasara bağlı beyin ödemini önemli deredece azalttığı görülmüştür (149) VASKÜLOGENEZ Vaskülogenez, endotel öncül hücrelerin farklılaşarak endotel hücrelerini (EH) oluşturması ve yeni damarlanma meydana getirmesidir (127). Uzun yıllar vaskülogenezin, embriyonun dolaşım sistemini oluşturan, sadece erken embriyonik döneme ait bir durum olduğu düşünülmüştür. Yakın zamandaki çalışmalar, erişkin hayattaki yeni damar oluşumunda da vaskülogenezin önemli rol oynadığını göstermektedir (150). Yara iyileşmesindeki yeni damar oluşumu sürecinde hem anjiyogenezin hem de vaskülogenezin rol aldığı belirlenmiştir (65,151). Yapılan çalışmalarda, ekstremite iskemisi, flep iskemisi, vasküler greft endotelizasyonu, yara iyileşmesi durumlarında ve kalp krizi sonrası dönemde, vaskülogenez meydana geldiği gösterilmiştir (55, ). EH leri, embriyoda anjiyoblastlardan, erişkinde kemik iliğindeki (KĐ) EPC lerden farklılaşarak damar yapısı meydana getirir (156). Erişkinde meydana gelen vaskülogenezin klinik önemi, EPC lerin daha önce damar yapısı olmayan bir bölgede yeni damarlanma oluşturmasıdır. Buna karşılık anjiyogenezdeki neovaskülarizasyon, mevcut damar yapısından gelişir. 24