ANKARA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ

Transkript

1 ANKARA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ Pediococcus acidilactici PBF SUŞU TARAFINDAN ÜRETİLEN BAKTERİYOSİNİN KARAKTERİZASYONU ve SAFLAŞTIRILMASI Burcu BİLER BİYOLOJİ ANABİLİM DALI ANKARA 2009 Her hakkı saklıdır

2 Doç. Dr. Özlem OSMANAĞAOĞLU danışmanlığında, Burcu BİLER tarafından hazırlanan Pediococcus acidilactici PBF suşu tarafından üretilen bakteriyosinin karakterizasyonu ve saflaştırılması adlı tez çalışması 25 Mayıs 2009 tarihinde aşağıdaki jüri tarafından oy birliği ile Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Biyoloji Anabilim Dalı nda YÜKSEK LİSANS TEZİ olarak kabul edilmiştir. Başkan: Doç. Dr. Candan GÜRAKAN Üye: Doç. Dr. Reyhan ÇOLAK Üye: Doç. Dr. Özlem OSMANAĞAOĞLU Yukarıdaki sonucu onaylarım Prof. Dr. Orhan ATAKOL Fen Bilimleri Enstitüsü Müdürü

3 ÖZET Yüksek Lisans Tezi Pediococcus acidilactici PBF SUŞU TARAFINDAN ÜRETİLEN BAKTERİYOSİNİN KARAKTERİZASYONU ve SAFLAŞTIRILMASI Burcu BİLER Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Biyoloji Anabilim Dalı Danışman: Doç. Dr. Özlem OSMANAĞAOĞLU Laktik asit bakterileri gıda endüstrisinde starter kültür olarak kullanılmaları, pilazmid tarafından kodlanan bakteriyosin üretim özelliklerinden dolayı gıdalarda raf ömrünü uzatmak için potansiyel biyolojik koruyucu rolüne sahip olmaları, probiyotik ürünlerin içeriğinde bulunmaları ile birlikte bazı LAB lerinin gıdalarda bozulmaya sebep olmaları bu bakteri grubunu hem endüstriyel açıdan hem de bilimsel arenada üzerinde yoğun çalışmaların yapıldığı oldukça önemli bir grup haline getirmiştir. A.Ü.F.F Biyoloji bölümü Mikrobiyal Genetik laboratuvarının kültür koleksiyonundan sağlanan ve bir fermente sosis izolatı olan Pediococcus acidilactici PBF suşunun birçoğu gıda bozulması ve gıda kaynaklı hastalıklar ile yakından ilişkili olan Pediococcus, Leuconostoc, Lactobacillus, Lactococcus, Staphylococcus, Enterococcus, Clostridium ve başta Listeria monocytogenes olmak üzere Listeria nın birçok türüne karşı antimikrobiyal bir madde ürettiği gösterilmiştir. ph değerine bağlı olarak bakteriyosin molekülünün hücre tutunumu (adsorpsiyon) ve hücrelerden ayrılmasını temel alan yöntem kullanılarak bakteriyosin ekstrakte edilip kısmen saflaştırılmış ve karakterizasyon çalışmaları kısmi-saflaştırılan bu ekstraktın kullanımı ile yapılmıştır. Proteolitik enzimlere duyarlı, ısıya ve organik çözücülere karşı dirençli ve geniş bir ph aralığında aktif olan bu antimikrobiyal madde çalışmanın ilerleyen aşamalarında anti-listerial bakteriyosin olarak adlandırılmıştır. SDS-PAGE (sodyum dodesil sülfat poliakrilamit jel elektroforez) çalışmaları bu bakteriyosinin protein yapısında bir madde olduğunu vurgulamış ve çalışmada Pediococcus acidilactici PBF suşunda bakteriyosin üretiminin 4.61 ve 6.68kDa moleküler ağırlıklarına sahip iki peptit tarafından kodlandığını gösterilmiştir. İyi üretim işlemleri ve sıkı bir sanitasyon ile birlikte Ped. acidilactici PBF suşu tarafından üretilen bakteriyosinin, gıdalarda bozulmalara sebep olan mikroorganizmaları ve sağlığı tehdit eden patojenleri kontrol altında tutabilmek amacıyla etkili bir katkı maddesi olarak kullanılabileceği düşünülmektedir. Mayıs 2009, 130 sayfa Anahtar Kelimeler: Laktik Asit Bakterisi, Pediococcus acidilactici, bakteriyosin, SDS-PAGE i

4 ABSTRACT Master Thesis CHARACTERIZATION AND PURIFICATION OF BACTERIOCIN PRODUCED BY Pediococcus acidilactici PBF Burcu BİLER Ankara University Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Biology Supervisor: Assoc. Prof. Dr. Özlem OSMANAĞAOĞLU Lactic acid bacteria are widely used as starter cultures in the food industry. Because of their plasmidcoded bacteriocin production speciality, they make expire date of the food longer and thought to be potential biopreservativies. This group of bacteria become very important both industrially and scientificaly in terms of their usage in probiotic products and some of them causes food spoilage. A food-grade Pediococcus acidilactici PBF which had been isolated from fermented sausage and obtained from Culture Collection of Microbial Genetics Laboratory of Biology Department of Ankara University was shown to produce an antimicrobial agent active against several species of Pediococcus, Leuconostoc, Lactobacillus, Lactococcus, Staphylococcus, Enterococcus, Clostridium and Listeria; many of which are associated with food spoilage and health hazards of food origin. By use of method based on the influence of ph on the adsorption and release of each bacteriocin from the cell surfaces, bacteriocin of Pediococcus acidilactici PBF was extracted, partially purified and used for the rest of the characterization studies. This antimicrobial agent is named as anti-listerial bacteriocin as it was found to be sensitive to proteolytic enzymes, effective against food-borne pathogen Listeria monocytogenes, resistant to heat and organic solvents and active over a wide range of ph. SDS-PAGE (Sosium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis) studies suggested that bacteriocin production in Pediococcus acidilactici PBF was encoded on two peptites with a molecular weights of 4.61 and 6.68 kda. The bacteriocin produced by Ped. acidilactici PBF strain under appropriate processes and strict sanitation can be used as an additive to control the growth of microorganisms which cause food decomposition and pathogens that threatens the health of living things. May 2009, 130 pages Key Words: Lactic Acid Bacteria, Pediococcus acidilactici, bacteriocin, SDS-PAGE. ii

5 TEŞEKKÜR İlk etapta bana kendisiyle birlikte çalışma şansını tanıyan, çalışmalarımda ilgi ve desteğini eksik etmeyen, teknik tecrübe ve bilgisinin yanında kültürel yönünden de faydalandığım, güçlü eğiticiliği ve pratik zekasıyla her zaman saygı duyduğum, deney çalışmalarımın ana materyali olan suşları temin edebilmek amacıyla Mikrobiyal Genetik laboratuvarının kültür koleksiyonunu hiç çekinmeden kullanımıma açan çok değerli danışman hocam; Sayın ÖZLEM OSMANAĞAOĞLU na, Tüm yardımları için laboratuvar arkadaşlarım Fadime Kıran, Pelin Doğan ve Duygu Akkaya ya, teknik çalışmalarımdaki katkılarından dolayı Başak Oral a son zamanlarımda manevi desteğini esirgemeyen arkadaşım Nihat Bilir e, Her zaman yanımda olan, her türlü sıkıntımı sıkıntısı, sevincimi sevinci kabul eden, varlıklarını hep en yakınımda hissettiğim, beni bugünlere kadar yetiştiren, maddi manevi hiçbir zaman desteklerini esirgemeyen, daha yolun çok başında olmama rağmen her şeye yetecek gücümün olduğunu her defasında yineleyerek anlatan, hayatımın her aşamasında varlıklarıyla güven ve gurur duyduğum iyi ki onların evladıyım diyebildiğim iki nadide insan sevgili babam MEHMET BİLER ve annem SEMRA BİLER e, Doğduğu günden itibaren hayatımın renklerini bir gökkuşağına çeviren, yanımda olmasından bile ayrı bir zevk duyduğum, her türlü sıkıntımı ve mutluluğumu paylaştığım, hayatımın en leri sıralamasında hep ilk sıralarda yer alacak olan canım kardeşim GÖKÇE BİLER e Ve; zorlu olan bu süreçte gösterdiğim azim, kararlılık ve sabırdan dolayı kendime, TEŞEKKÜRLER Burcu BİLER Ankara,Mayıs 2009 iii

6 İÇİNDEKİLER ÖZET... i ABSTRACT... ii TEŞEKKÜR... iii SİMGELER DİZİNİ... viii ŞEKİLLER DİZİNİ... x ÇİZELGELER DİZİN... xi 1. GİRİŞ KAYNAK ÖZETLERİ Laktik Asit Bakterileri Lactococcus cinsi bakterilerin temel özellikleri Lactobacillus cinsi bakterilerin temel özellikleri Leuconostoc cinsi bakterilerin temel özellikleri Enterococcus cinsi bakterilerin temel özellikleri Pediococcus cinsi bakterilerin temel özellikleri Laktik Asit Bakterilerinin Önemi Starter kültür olarak kullanılmaları Probiyotik olarak kullanılmaları Bakteriyosin üretimi Bakteriyosinlerin kronolojik gelişimleri ve tanımlanması Bakteriyosinler ve gıdalarda kullanımı Bakteriyosinlerin diğer koruyucu maddeler ve proseslerle birlikte kullanılması Laktik Asit Bakterileri Tarafından Üretilen Bakteriyosinler Laktokoklar tarafından üretilen bakteriyosinler Laktobasiller tarafından üretilen bakteriyosinler Lökonostoklar tarafından üretilen bakteriyosinler Enterokoklar tarafından üretilen bakteriyosinler Pediokoklar tarafından üretilen bakteriyosinler Pediosin A iv

7 Pediosin PA-1/AcH Bakteriyosinlerin Sınıflandırılması ve Önemli Özellikleri Grup I bakteriyosinler Grup II bakteriyosinler Grup III bakteriyosinler Grup IV bakteriyosinler Bakteriyosinlerin fiziksel ve kimyasal özellikleri Bakteriyosinlerin etki mekanizmaları Bakteriyosin Üreten Türlerin Belirlenmesi ve Bakteriyosin Üretim Koşulları Laktik Asit Bakterileri Tarafından Üretilen Bakteriyosinlerin Saflaştırılması Pediosin Peptitlerinin Karakteristikleri ve Biyosentezi Pediosine Karşı İmmunite ve Bakteriyosinlerin Moleküler Genetiği MATERYAL ve YÖNTEM Materyal Bakteri kültürleri Kültür ortamları Tampon ve çözeltiler Moleküler markörler Kimyasallar Çözelti ve malzemelerin sterilizasyonu Bakteri kültürlerinin saklanması Yöntem Pediococcus acidilactici PBF suşu tarafından üretilen antimikrobiyal maddenin optimum üreme koşullarının belirlenmesi ve antimikrobiyal aktivitesi Bakteri stok kültürlerinin aktifleştirilmesi Ham (crude) bakteriyosinin elde edilmesi ve bakteriyosin üretiminin teşhisinde kullanılan temel metotlar Optimum inkübasyon zamanı Optimum sıcaklığın belirlenmesi v

8 Maksimum aktiviteli besiyerinin belirlenmesi Bakteriyosin aktivite ünitesinin ölçülmesi Antimikrobiyal aktivite spektrumunun belirlenmesi Pediococcus acidilactici PBF suşu tarafından üretilen bakteriyosinin stabilitesi ph nın bakteriyosin aktivitesi üzerine etkisi Sıcaklık uygulamasının bakteriyosin aktivitesi üzerine etkisi Enzim uygulamalarının bakteriyosin aktivitesi üzerine etkisi Organik çözücülerin bakteriyosin aktivitesi üzerine etkisi Pediococcus acidilactici PBF suşu tarafından üretilen bakteriyosin özelliği gösteren proteinlerin ayrılması Pediococcus acidilactici PBF suşu tarafından üretilen bakteriyosinin üretici hücrelerden adsorbsiyonu ile kısmi saflaştırılması ve eldesi Pediosin PBF nin sodyum dodesil sülfat-poliakrilamit jel elektroforeziyle (SDS-PAGE) tesbiti ve moleküler ağırlığının hesaplanması Protein büyüklüklerinin saptanması ARAŞTIRMA BULGULARI Antimikrobiyal Madde Üretim Özelliğinin Gösterilmesi Pediococcus acidilactici PBF Suşu Tarafından Üretilen Antimikrobiyal Maddenin Optimum Üretim Koşullarının Belirlenmesi Optimum inkubasyon zamanının tespiti Optimum sıcaklığın tespiti Maksimum aktiviteli besiyerinin tespiti Pediococcus acidilactici PBF Suşu Tarafından Üretilen Antimikrobiyal Maddenin Aktivite Ünitesinin Tespiti ve Antimikrobiyal Aktivite Spektrumu Pediococcus acidilactici PBF Suşu Tarafından Üretilen Antimikrobiyal Maddenin Tabiatı ph Sıcaklık Enzim vi

9 4.4.4 Organik çözücüler Kısmi Saflaştırılması Yapılan Bakteriyosin Bant(lar)ının SDS-PAGE Yöntemiyle Moleküler Büyüklüklerinin Tespiti İnhibitör Proteinlerin SDS-PAGE le Ayrılması ve Bakteriyosin Etkisinin Gösterilmesi TARTIŞMA ve SONUÇ Pediococcus acidilactici PBF Tarafından Üretilen Pediosin PBF KAYNAKLAR EKLER EK 1 Bakterilerinin gelişmelerinde kullanılan kültür ortamları EK 2 Tampon ve çözeltiler EK 3 Protein analizi için kullanılan moleküler markör EK 4 Kimyasallar ÖZGEÇMİŞ vii

10 SİMGELER DİZİNİ APS APT ATP BHI Bp CH CO 2 Da Dk DNA EDTA FDA Gr GRAS H 2 O 2 HCl Kb Kbp kda LAB Lc. Leu. Lb. M ma MDa Mg mm MRS Amonyum persülfat All Purpose Tween Adenozin Trifosfat Brain Heart Infusion Broth Baz çifti Karbonhidrat Karbondioksit Dalton Dakika Deoksinükleikasit Etilen Diamin Tetra Asetik Asit Amerikan Gıda ve İlaç Dairesi Gram İnsan ve Hayvan Tüketiminde Güvenilir (Generally Regarded as Safe) Hidrojen Peroksit Hidroklorik Asit Kilobaz Kilobaz çifti Kilo Dalton Laktik Asit Bakterisi Lactococcus Leuconostoc Lactobacillus Molar Miliamper Megadalton MiliGram Milimolar De Man, Rogosa and Sharpe Broth viii

11 N Normal NaCl Sodyum klorür NB Nutient Broth ºC Santigrat Derece PAGE Poliakrilamid Jel Elektroforezi Ped. Pediococcus PMF Proton İtici Gücü RSKK Refik Saydam Kültür Koleksiyonu SDS Sodyum Dodesil Sülfat SDS-PAGE Sodyum Dodesil Sülfat Poliakrilamid Jel Elektroforezi TEMED Tetra metil Etilen Diamin TGE Tripton Glukoz Yeast Ekstrakt Μ Mikro Μl Mikrolitre µm Mikromolar ix

12 ŞEKİLLER DİZİNİ Şekil 2.1 Fermentasyon reaksiyonu sonucu laktik asit oluşumu... 4 Şekil 2.2 Katı besiyeri içeren petri plakada bakteriyosin zonunun oluşumu Şekil 4.1 Pediococcus acidilactici PBF suşu tarafından üretilen bakteriyosinin indikatör Lactobacillus plantarum NCDO 955 suşuna karşı oluşturmuş olduğu inhibisyon zonları Şekil 4.2 TGE besi ortamında 35ºC de gelişen Pediococcus acidilactici PBF suşunun büyüme hızı (OD 600 nm), asit üretimi (ph) ve pediosin üretimi (AU/ml) Şekil 4.3 BHI, MRS, M17, Ellikier, TGE ve TGE buffer besi ortamlarında pediosin üretimi Şekil 4.4 (a) Pediococcus acidilactici PBF suşu tarafından üretilen antimikrobiyal maddenin çeşitli indikatörlere karşı sergilemiş olduğu antimikrobiyal etki spektrumu (b) Kısmi olarak saflaştırılmış ekstraktın kullanımıyla belirlenen aktivite ünitesi (AU) Şekil 4.5 Pediococcus acidilactici PBF suşu tarafından üretilen antimikrobiyal maddenin farklı sıcaklıklarla muamelesi sonucunda Lactobacillus plantarum NCDO 955 suşuna karşı göstermiş olduğu aktivite Şekil 4.6 (a) Farklı enzimlerin(b) ve organik çözücülerin Pediococcus acidilactici PBF suşu tarafından üretilen antimikrobiyal madde üzerindeki etkileri Şekil 4.7 (a) Coomassie Blue ile boyanmış SDS-PAGE jel I: Kuyucuk 1, Moleküler ağırlık standartı (NOVEX Mark 12, INVITROGEN). Kuyucuk 2; Pediococcus acidilactici PBF suşu tarafından üretilen proteinler (20µl) (b) PAGE jel II (biyoanaliz için): Antimikrobiyal aktiviteden hangi bant(lar)ın sorumlu olduğunun belirlenmesi için indikatör bakteriyle kaplanmış jel. Kuyucukta Pediococcus acidilactici PBF suşu tarafından üretilen bakteriyosin (20µl) yer almaktadır x

13 ÇİZELGELER DİZİNİ Çizelge 2.1 Bazı bakteriyosinlerin kullanıldığı gıdalar ve etkileri Çizelge 2.2 Laktik asit bakterileri tarafından üretilen bakteriyosinlerin genel özellikleri Çizelge 2.3 İki peptitli Sınıf IIb nonlantibiyotik bakteriyosinler Çizelge 2.4 Laktik asit bakterileri tarafından üretilen iki peptitli bakteriyosinler Çizelge 2.5 Lactococcus lactis türünden elde edilen Nisin A lanthionin (Ala-S-Ala) bakteriyosinin, Pediococcus acidilactici türünden elde edilen pediocin PA-1/AcH, Leuconostoc gelidum türünden elde edilen lökosin A ve Lactobacillus sake türünden elde edilen sakasin A nonlanthionin bakteriyosinlerin amino asit sekansları Çizelge 2.6 Pediosin üretim özelliğinin pilazmid bağlantısı Çizelge 3.1 Çalışmada kullanılan bakteri türleri, gelişme ortamları ve optimum gelişim sıcaklıkları Çizelge 4.1 Sıcaklığın Pediococcus acidilactici PBF suşu tarafından üretilen pediosinin optik densitesi (OD 600 ), son ph ve aktivite ünitesi üzerindeki etkisi Çizelge 4.2 Pediococcus acidilactici PBF suşu tarafından üretilen antimikrobiyal maddenin aktivite spektrumu Çizelge 4.3 Geniş aralıktaki değişik ph değerlerinin Pediococcus acidilactici PBF suşu tarafından üretilen antimikrobiyal madde üzerindeki etkileri Çizelge 4.4 Farklı enzimlerin Pediococcus acidilactici PBF suşu tarafından üretilen antimikrobiyal madde üzerindeki etkileri Çizelge 4.5 Farklı organik çözücülerin Pediococcus acidilactici PBF suşu tarafından üretilen antimikrobiyal madde üzerindeki etkileri xi

14 1. GİRİŞ İnsanların sağlıklı büyüme ve gelişmelerinde tükettikleri gıdaların güvenilir olması oldukça önemlidir. Her geçen gün tüketici talebine bağlı olarak yeni gıdalar geliştirilmektedir. Bu gıdaların birçoğu bildiğimiz temel gıda kaynaklarından üretilmekte ve fiziksel, kimyasal ve mikrobiyolojik özelliklerinin geliştirilmesi ve muhafaza sürelerinin (raf ömrü) uzatılması için çeşitli katkı maddeleri kullanılmaktadır. Mikrobiyolojik problemlerin artmasıyla birlikte gıdalara ilave edilen katkı maddeleri ve antimikrobiyal maddelerinde sayısında artış gözlenmiştir. Ham madde ile birlikte tarımsal üretimde kullanılan hormonlar ve kimyasallara ek olarak ham maddenin işlenmesi sırasında ilave edilen bazı katkı maddeleri kalp hastalıklarına, astıma, alerjik sorunlara ve hatta kansere yol açmaktadır (Eaton and Klaassen 1996). Bununla beraber, yapılan son çalışmalarda gıda katkı maddelerinin (antioksidanlar, tatlandırıcılar, renklendiriciler vs.) bazılarının sağlıksız oluşu ve kullanım oranına bağlı olarak kanserojenik ve toksik etki yapabilmeleri, doğal ve güvenilir katkıların elde edilmesi ve kullanımı oldukça önemli hale getirmiştir. Teknolojik ve ekonomik olarak gelişmiş olan ülkelerde bunun gibi sorunlara sıkça rastlanılması başta beslenme alışkanlıkları olmak üzere doğallıktan uzaklaşıldığını göstermektedir. Bu durum daha doğal yapıya sahip antimikrobiyal maddelere ve üretim teknolojisi gereği kullanılan gıda katkılarına olan talebi arttırmaktadır. Bazı gıda katkı maddelerinin kanserojen özelliklerinin ortaya çıkmasından dolayı bir çok ülke ekolojik tarıma yönelmiş ve katkısız doğal ürünler elde etmeye başlamıştır. Bu ürünlerin maliyetinin çok yüksek olması tüketici talebini azaltmaktadır. Gıdaların korunması ve muhafaza sürelerinin uzatılmasında, düşük sıcaklık veya ısıl işlem uygulanması, paketleme yöntemleri gibi prosesler ve tuz, şeker ve antimikrobiyal katkı maddeleri gibi katkı maddeleri kullanılmaktadır. Ancak yine de gıda kaynaklı sağlık sorunlarıyla karşılaşılabilmektedir. Sağlıklarını düşünen tüketicilerin son günlerde gıdalarda kullanılan kimyasallara olan ilgilerinin artması, tüketime hazır dondurulmuş gıdaların piyasadaki pazar payını arttırmıştır. Bu gıdaların raf ömrünü uzatmak için dondurarak depolama ve vakum paketleme uygulanmaktadır (Motlagh et al. 1991). Gıdaların güvenliğinin sağlanmasında mümkün olduğunca proses uygulamasından kaçınılması ve doğal katkı maddelerinin kullanımı gerekmektedir. Bu amaçla biyokontrol yöntemi önerilmektedir. Yani; kimyasal formulasyona sahip gıda 1

15 katkı maddelerine alternatif olarak doğal koruyucular ya da antimikrobiyal koruyucuların kullanımı tavsiye edilmektedir. Bu yöntemle; antagonistik mikroorganizmaların ve metabolitlerinin kullanımıyla patojen ve bozulma etmeni mikroorganizmaların inaktive edilmesi sağlanmaktadır (de Martinis et al. 2002). Laktik asit bakterilerinden uzun yıllardan beri çeşitli fermente gıdaların üretilmesinde yararlanılmaktadır. Bu şekilde laktik asit fermentasyonuna tabi tutulan bazı gıdaların üretilen organik asitlerden dolayı raf ömrünün uzadığı bilinmektedir. Ancak laktik asit bakterilerinin organik asitler dışında diğer mikroorganizmalara karşı antagonistik etki gösteren hidrojen peroksit, serbest yağ asitleri, amonyak, diasetil ve bakteriyosin gibi inhibitör maddeleri de ürettiği saptanmıştır (Daeschel 1989). Bakteriyosinler; üretici bakteriye yakın türlere karşı, bakterisidal aktivite gösteren protein yapısında maddelerdir (Klaenhammer 1988). Aynı zamanda insan ve çevre sağlığı üzerinde olumsuz etki içermeyen, ancak gıda bozulması ya da gıda kökenli hastalık etmeni olan mikroorganizmalara karşı güçlü bir koruma sağlayan doğada ve hatta uzun yıllardır tüketilen bazı gıdalarda yaygın olarak bulunan mikroorganizma türleri tarafından sentezlenen bileşikler bakteriyosinler olarak adlandırılmaktadır. Laktik asit bakterileri tarafından üretilen bakteriyosinin protein yapısında olan bir antimikrobiyal bileşen olması (de Martinis et al. 2002, Riley 1998) ve bakteriyosin üreten LAB lerinin fermente edilmiş gıda ürünlerinde doğal olarak bulunması bu bakterilerin biyoprezervatif olarak potansiyel kullanımlarına olan ilgiyi arttırmıştır ve kimyasal koruyucuların yerini alabilecek aday durumuna gelmesini sağlamıştır (de Vuyst and Vandamme 1994). Bakteriyosinlerinlerin gıdada antimikrobiyal aktivitelerinin yanı sıra doğal olmaları, renksiz, tatsız ve kokusuz olmaları da ürün özellikleri açısından oldukça önemlidir. Peptit ve protein yapılarında olmaları ise; pankreas kaynaklı proteolitik enzimlerden, mide salgılarından etkilenebildiklerini ve insan vücudunda sindirilebileceklerini göstermektedir. Ayrıca bazı bakteriyosinlerin (Grup 2) ısı stabilitelerinin olması, yüksek sıcaklıkta işlem gören birçok gıda maddesinde kullanılabilirliğini sağlamaktadır (de Martinis et al. 2002, Delves Broughton et al. 1996). Hatta bazı bakteriyosinler otoklavlama sıcaklığında bile stabil kalabilmektedir. Dolayısıyla bakteriyosinlerin et ve süt ürünleri başta olmak üzere 2

16 birçok gıdada kullanımı mümkün olmaktadır. Bakteriyosinler gıda maddesine doğrudan katılabildikleri gibi, bakteriyosin sentezleyen koruyucu kültürlerin gıdaya inokulasyonuyla veya gıdanın koruyucu ambalaj materyaliyle birlikte de kullanılabilirler. Böylelikle; uygun olan bakteriyosinin veya bakteriyosin üreten LAB sinin gıdalara eklenmesi hem raf ömrünü uzatacak hem de sağlıklı kabul edilecektir. Bu amacın gerçekleşebilmesi için kullanılacak olan bakteriyosin molekülünün iyi bir şekilde tanımlanıp saflaştırılması gerekmektedir. Gıda güvenliği açısından, patojen mikroorganizmaların gıdalarda gelişiminin önlenmesi sağlanmalıdır. Gıdalarda gelişen patojen mikroorganizmalar üzerinde antagonistik mikroorganizmaların ve bakteriyosin gibi metabolik ürünlerin etkili olması nedeniyle gıda güvenliğinde bakteriyosin kulanımının önemi oldukça artmıştır. Bu çalışmada; fermente gıda ürünlerinden izole edilen ve bir laktik asit bakterisi olan Pediococcus acidilactici PBF suşunun ürettiği bakteriyosinin karakterizasyonu (biyokimyasal ve fenotipik tekniklerin kullanımı ile) ve saflaştırılması amaçlanmıştır. 3

17 2. KAYNAK ÖZETLERİ Laktik asit bakterileri; Gram-pozitif, katalaz negatif, karbonhidrat fermentasyonu neticesinde son ürün olarak laktik asit oluşturan doğal bir grup olarak bilinmektedir. (Şekil 2.1) Morfolojileri kok veya çubuktan oluşan farklı uzunlukta zincir şeklindedir. Birkaç ayrıcalık gösteren üye dışında hepsi hareketsizdir. Sporolactobacillus imilinus hariç hiçbiri spor oluşturmaz. Laktik asit bakterileri Gram- pozitif bakteriler içerisinde düşük düzeyde guanin ve sitozin oranına sahip bir bakteri grubudur (Ludwig et al. 1993). Laktik asit bakterilerinin genomunun G+C içeriği % 50 nin altındadır ve bu bakteriler Clostridium filumuna dahil edilirler. Şekil 2.1 Fermentasyon reaksiyonu sonucu laktik asit oluşumu Toprak ve suda neredeyse hiç rastlanılmayan laktik asit bakterilerine; bazı bitkilerde, süt ve süt ürünlerinde, insan ve canlıların bağırsak sistemlerinde ve fermente gıdalarda rastlamak mümkündür. Laktik asit bakterileri mandıra ürünlerinin, et ve sebzelerin fermentasyonunda geniş bir kullanım alanına sahiptir (Stiles 1996). Vakum paketlenmiş et ürünleri gibi fermente ürünlerde LAB leri stoklama süreci boyunca dominant mikroflora olmaya başlamıştır (Shillinger and Lücke 1987, Shaw and Harding 1984). Bu durum etlerin dondurularak depolama ömürlerini ve talep edilebilirliklerini arttırmasına rağmen, (Sharpe and Pettipher 1983, Shillinger and Lücke 1987) etler, laktik asit bakterilerinin ürettikleri metabolik ürünler ve ph ın düşmesiyle 4

18 bozulabilmektedirler (Osmanağaoğlu 2003, Samelis et al. 2000, Yang and Ray 1992). Et endüstrisinde laktik asit bakterileri sucuk fermantasyonunda, aroma gelişimini teşvik etmeleri ve fermente sucukların korunması amacıyla, starter kültür olarak geniş bir şekilde kullanılmaktadır (Liepe 1983). LAB nin kullanımıyla üretilen organik asit, hidrojen peroksit, diasetil, inhibitör enzimler ve bakteriyosinler çoğu gıdayı kontamine eden mikroorganizmalara karşı güçlü bir antagonistik aktivite oluşturmaktadır (Piard and Desmazeaud 1992). Laktik asit bakterilerinin diğer organizmalar üzerindeki inhibisyon etkisi; ph ı düşürme, besiyeri için rekabet, hidrojen peroksite karşı ilgisi ve antimikrobiyal maddeler üretimi gibi birçok hareket mekanizmalarını içermektedir. Son yıllarda, biyolojik koruyucu (biyopreservatif) uygulamalarında özellikle bakteriyosin ve/veya diğer inhibitör madde üreten laktik asit bakterilerinin kullanımına olan ilgi artmıştır. Uzun yıllardan beri güvenle kullanılmaları, GRAS olarak belirlenmeleri ve ilginç metabolik karakteristikleri, geniş alanda endüstriyel uygulamalara olanak tanımaktadır Axelsson ve arkadaşlarının yapmış olduğu sınıflandırma dahilinde laktik asit bakterilerinden; Streptococcus, Carnobacterium, Enterococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus, Lactococcus, Tetragenecoccus, Vagococcus ve Weissella cinsleri gıdalarla yakından ilişkilidir (Axelsson et al. 1998, Stiles and Holzapfel 1997). Bunun yanı sıra bazı LAB türleri potansiyel sağlık faydaları sonucunda probiyotik olarak kullanılmaktadır. Gıdalara ilaveleri ve gıda fermentasyonunda sık kullanımları yüzünden LAB leri metabolik özellikleri, gelişim kabiliyetleri, endüstriyel işlemlere dirençliliği, son ürün oluşturmadaki gücü, raf ömrünü uzatması gibi durumları nedeniyle titizlikle karakterize edilmişlerdir (Temmerman et al. 2004). Laktik asit bakterileri; fermentasyonda oluşan ürünlerin cins ve miktarına göre sınıflandırıldıklarında homofermantatif ve heterofermantatif olarak ikiye ayrılırlar (Drian 1976). 5

19 Homofermantatif laktik asit bakterileri glukozu; Fruktoz Di Fosfat yoluyla parçalayıp fermentasyon sonucu % oranında laktik asit üretirler (Drinan 1976). C 6 H 12 O 6 2(CH 3 - CHOH-COOH)(Laktik asit) Heterofermantatif laktik asit bakterileri ise glukozu; Hegzos Mono Fosfat yoluyla parçalayarak fermentasyon sonucu % 50 oranında laktik asit üretirken, bunun yanı sıra etanol, asetik asit, gliserol, mannitol ve fruktoz oluştururlar (Drinan et al. 1976). C 6 H 12 O 6 CH 3 - CHOH-COOH + CH 3 - CHOH-CO Laktik Asit Bakterileri Bilinen türlerin taksonomik düzeltmeleri ve yeni genuslarınun tanımlanmasıyla laktik asit bakterilerilerine; Aerococcus, Alloicoccus, Carnobacterium, Dolosigranulum, Enterococcus, Globicatella, Lactobacillus, Lactococcus, Lactosphaera, Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus, Vagoccus ve Weissella cinsleri dahildir (Axelsson et al. 1998). Gıda endüstrisi açısından önemli 11 farklı laktik asit bakterisi grubunun en önemli 5 tanesi Lactococcus, Enterococcus, Leuconostoc, Pediococcus ve Lactobacillus tur (Cogan 1996) Lactococcus cinsi bakterilerin temel özellikleri Karşılaştırmalı serolojik çalışmalar, lipit kompozisyonu, nükleik asit hibridizasyonu ve hücre duvarı kimyasal yapısının belirlenmesi sonucu elde edilen veriler ışığında Streptococcus cinsinden ayrılan bazı türler, Lactococcus cinsi altında sınıflandırılmıştır (Schleifer et al. 1985). Laktokoklar, homofermantatif özellikte olup karbonhidrat katabolizması sonucu ana ürün olarak L(+) laktik asit üretmektedirler. Bu bakteriler kok şeklinde, küre ya da kısa 6

20 zincir halinde birarada bulunmaktadır. Optimum gelişme sıcaklıkları 30 C dir. 10 C nin altında ve 45 C nin üzerinde gelişmeme özellikleriyle (Holt et al. 1994) hem streptokoklardan hemde enterokoklardan ayrılmaktadırlar. Lactococcus. lactis alttürleri özellikle fermente süt ürünlerinin üretiminde önemli role sahiptir Lactobacillus cinsi bakterilerin temel özellikleri Lactobacillus cinsi bakteriler çeşitli kaynaklarda laktik asit bakterilerine mensup, ince veya kalın çubuk şeklinde, Gram-pozitif, spor oluşturmayan bakteriler olarak tanımlanmaktadır (Kandler and Weiss 1986). Fermentasyon sonunda oluşan ürünlere göre homofermentatif veya heterofermentatif türleri bulunmaktadır. Kromozomlarındaki nükleik asit komposizyonunun % ini G+C oluşturmaktadır (Stiles and Holzapfel 1997). Oksijeni kullanma özelliğine göre mikroaerofilik ya da anaerob olup % 5 CO 2 li ortamda gelişme gösterebilirler. Genellikle katalaz ve oksidaz negatif olarak bilinirler (Hammes and Vogel 1995). Laktobasiller tarafından sentezlenen bakteriyosinler gıda sanayinde kullanılma potansiyeline en fazla sahip bakteriyosinlerdir Leuconostoc cinsi bakterilerin temel özellikleri Süt, peynir ve et gibi fermente ürünlerin oluşumunda ve organoleptik adı verilen tat, koku gibi özelliklerin kalitesinin belirlenmesinde büyük öneme sahiptirler (Dellaglio et al. 1995). Optimum gelişme sıcaklıkları C dir (Holt et al. 1994). Buzdolabı sıcaklığında da üreyebilme özellikleri vardır. Karbonhidrat fermentasyonu sonucunda sadece laktik asit üretmediğinden heterofermentatif özellik göstermektedir. Fermentasyon sonucunda D-laktat ve etanol ile gaz oluşumu gözlenir. Starter kültür içeriğine dahil olup sitrattan diasetil oluşumuna nedendirler. Bu da tat oluşumu için önemli bir kriterdir. Fermente ürünlerde baskın olan türleri: Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides ve Leuconostoc lactis tir (Dellaglio et al. 1995). 7

21 2.1.4 Enterococcus cinsi bakterilerin temel özellikleri Enterokoklar da laktokoklar gibi Streptococcus cinsine dahil edilmişler, daha sonra serolojik D-antijeni grubuna sahip olmaları ile sınıflandırmada ayrılmışlardır (Holt et al. 1994). Oksijen kullanma bakımından fakültatif anaerobik bakterilerdir. Fermentasyon sonucu farklı karbonhidrat formlarını L(+) laktik aside çevirir fakat gaz oluşturmazlar.% 6.5 NaCl de ve % 40 tuzda, C sıcaklık aralığında gelişim gösterebilirler. Katalaz negatif özellik yansıtmalarına rağmen bazı türleri yalancı katalaz aktivitesi verebilir (Doming et al. 2003). Optimum gelişme sıcaklıkları 37 C dir Pediococcus cinsi bakterilerin temel özellikleri Hücreler küre şeklinde olup ikili düzlemde tetrat şeklinde bölünmektedirler. Grampozitif ve fakültatif anerobtur. Karbonhidrat fermentasyonu sonucunda sadece laktik asit ürettiğinden homofermantatiftir. Optimum gelişme sıcaklıkları 35 C dir. Pediococcus acidilactici gibi 50 C de gelişen türleri bulunmaktadır. Katalaz negatiftirler. Pediococcus cinsi bakteriler 8 tür içermektedir. Bu sekiz türden Pediococcus acidilactici; Pediococcus pentosaceus, Pediococcus damnosus ve Pediococcus parvulusla yakından ilişkilidir (Collins et al. 1990). Pediococcus cerevisiae önceden bu cinsin içerisinde yer almasına rağmen şu an türleri Pediococcus acidilactici, Pediococcus pentosaceus, Pediococcus damnosus türleri içerisinde yer almaktadır (Kitahara 1974; Garvie 1986, Gherna and Pienta 1989). Pediococcus acidilactici ve Pediococcus pentosaceus un DNA/DNA homolojileri birbirlerine çok yakın olup sadece az bir karakteristik farkla birbirlerinden ayrılmaktadır. Pediococcus acidilactici türleri 50 C de gelişme gösterirken, maltozu fermente edememekte bununla birlikte Pediococcus pentosaceus 50 C de gelişme göstermemekte lakin maltozu fermente etmektedir. Ayrıca Pediococcus acidilactici hücreleri biraz daha ısıya karşı dirençlilik göstermektedirler (Kitahara 1974, Garvie 1986). 8

22 Pediococcus cinsi bakteriler bazen Micrococcus cinsi bakterilerle karıştırılabilmektedir. Bunun nedeni morfolojik olarak benzemeleri ve tuza olan toleranslarıdır. Micrococcus ların pigmentli olması ve asite karşı toleranslı olmaması iki cins arasındaki ayrımı güvenle sağlamaktadır. Pediokoklar doğal olarak mandıra ürünlerine, etlerde, taze sebze, bira ve şarap gibi fermente ürünlerde bulunmaktadır. Bunlar doğal olarak sebze ve etlerin fermentasyonlarının kontrolüyle ilişkili olup (Bacus and Brown 1981, Garvie 1986) peynirin oluşmasında ikinci flora gibidir (Bhowmilk and Marth 1989). Pediokoklar sadece aromaya katkıda bulunmayıp, şekil ve renk gelişimini de sağlamaktadır. Fakat bazı pediokok türleri özellikle kendine yakın laktik asit bakterilerine ve diğer bazı bakterilere karşı gelişimi engelleme yeteneği göstermekte ve bu gelişimi engellenen bakteriler arasında gıdayı bozan ve hastalık yapan mikroorganizmalarda bulunmaktadır (Bhunia et al. 1988, Daeschel and Klaenhammer 1985, Gonzalez and Kunka 1987). 2.2 Laktik Asit Bakterilerinin Önemi Laktik asit bakterileri gerek fermente ürünlerde starter kültür olarak kullanımı gerekse bakteriyosin gibi gıdada bozulmaya neden olan bakterilerin gelişimini engelleyen antimikrobiyal madde üretim yetenekleri ile gıda endüstrisi için vazgeçilmez unsurlardır. Laktik asit bakterilerinin diğer üyeleri özellikle laktobasiller insanların ve hayvanların gastrointestinel sistemlerinde önemli bir alanı işgal eder ve bunların sağlıklı kalmak ve iyi hissetmek adına bir kaç probiyotik yararı olduğu düşünülmektedir. Bu yararlar arasında normal mikroflorayı olumlu etkilemesi, patojenlerin yok edilmesi ve mukozal bağışıklığın stimülasyonu/modifikasyonu yer almaktadır Starter kültür olarak kullanılmaları Laktik asit bakterilerinin en önemli karakteristik özelliklerinden biri; süt şekeri olan laktozu kullanarak fermentasyon sonucunda laktik asit üretmeleridir. Bu reaksiyonu başlatan kültür ürüne öncelikli olarak verilir ki buna da starter kültür denir. Starter bakterilerin kullanımları ile hatalı ürün tehlikesini en az düzeye indirgemek, daha kaliteli ve standart tipte ürünler elde etmek amaçlanmıştır (Gilliland 1986). 9

23 Et ürünlerinde son 25 yıldır özellikle de son 10 yıldır starter kültürler yoğun bir şekilde kullanılmaktadır. Bu ürünlerin üretiminde kullanılan starter kültürler; Lactobacillus plantarum, Lactobacillus sake, Lactobacillus curvatus, Pediococcus acidilactici ve Pediococcus pentosaceus un uygun kombinasyonları içermektedir. Starter bakteriler çeşitli şekilde ürüne bulaşan kontaminant mikroorganizmalar, gıda zararlısı veya gıda kaynaklı patojen bakteriler üzerinde de inhibisyon özelliği göstermektedir (Bacus and Brown 1981). Starter bakterilerin oluşturduğu inhibitör maddeler arasında küçük moleküllü antibiyotikler, laktik asit, hidrojen peroksit, hidrojen sülfür, litik enzimler, bakteriyosin veya bakteriyosine benzer maddeler bulunmaktadır (Hammes et al. 1990, Andersson et al. 1988, Geisen et al. 1992). Organoleptik özellikler dediğimiz tat, koku gibi özelliklerin yanı sıra fermentasyonu sağlayıp peynir, krema, tereyağ ve yoğurt gibi birçok ürün oluşumunda mühim görev üstlenmektedirler. Mezofilik starter kültürlerden bazıları laktik asit üretirken, bazıları ise sitrik asit fermentasyonu gerçekleştirmektedir. Ve asetoin/diasetil, CO 2 oluşturmaktadır. Diasetil özellikle süt ürünlerinde tat oluşumu için önemlidir (Cogan 1996) Probiyotik olarak kullanılmaları Yunanca kökenli bir kelime olup yaşam için anlamına gelmektedir. Tarihten günümüze kadar birçok şekilde anlatılan bu terim son olarak 1999 da Kneifel tarafından; vücuda alındığında konakçının gastrointestinal mikroflorasına olumlu etkileri olan canlı mikroorganizmalar olarak tanımlandırılmıştır (Kneifel et al. 1999). Laktik asit bakterileri, bağırsak florasına olumlu etkileriyle bağışıklık sistemini kuvvetlendirerek, vücudun doğal savunmasını güçlendirir. Ancak bunu yapabilmeleri için bu bakterilerin mideden geçerken canlı kalabilmeleri ve böylece bağırsaklarda gelişme olanağı bulabilmeleri gerekmektedir. Laktik asit bakterilerinden probiyotik üretiminde kullanılanlar genellikle; Lactobacillus ve Bifidobacterium cinsine ait türlerdir. 10

24 Probiyotik olarak kullanılan laktik asit bakterilerinin sağlığa faydalı diğer etkilerini de sıralayacak olursak; Laktoz intoleransının hafifletilmesi. Kan lipitlerinin düşürülmesi ve kalp hastalığı riskinin azaltılması. Ürogenital infeksiyonlar (Üriner ve vajinal kanal hücrelerine yapışma, H 2 O 2 gibi inhibitör maddelerin üretimi). Kolon kanseri riskinin azaltılması. İmmun sistemin güçlendirilmesi (Beyaz kan hücrelerinin fagositik aktivitelerinin arttırılması, IgA üretiminin arttırılması). İltihabi veya alerjik reaksiyonların azaltılması (Sitokin sentezinin düzenlenmesi). Helicobacter pylori infeksiyonu (Laktik asit üretimi). İntestinal sistem infeksiyonlarının engellenmesi (İntestinal mukozaya yapışmak suretiyle patojenlerin yapışmasının engellenmesi). Barsak florası üzerine olumlu etki (Toksik metabolit üretiminin azaltılması yoluyla, aşırı gelişmiş olan floranın aktivitesinin etkilenmesi) Bakteriyosin üretimi Birçok gıda kaynaklı laktik asit bakterisi türü; Lactococcus, Pediococcus, Leuconostoc, Lactobacillus, Enterococcus, Streptococcus, Carnobacterium ve Propionibacterium bakteriyosin adı verilen küçük antimikrobiyal proteinler üretmektedirler. Bu antimikrobiyal proteinler birçok Gram-pozitif bakteriye karşı bakterisidal etki göstermekte, gıdanın bozulmasını sağlayan ve gıda kaynaklı hastalıklara neden olan bazı mikroorganizmaları da inhibe etmektedir (Tagg et al. 1976, Ray and Daeschel 1992a, Klaenhammer 1993, Hoover and Steenson 1993, Vuyst and Vandamme 1994, Jack et al. 1995). 11

25 Bakteriyosinlerin kronolojik gelişimleri ve tanımlanması Bakterilerin hayatta kalma yeteneği iç ve dış faktörlere ve aynı ekolojik çevre için yarışan diğer antagonist mikroorganizmaların ürettiği antimikrobiyal madde miktarının azlığına bağlıdır (Klaenhammer 1993). Farklı organizmalar arasında birbirinin gelişimini engelleyen ve destekleyen etkileşimler olmaktadır. Pasteur ve Joubert 1877 yılında yaptığı bazı çalışmalarda bakteriler arasında antagonistik etkileşimi göstermiştir (Pasteur and Joubert 1877). Bu etkileşimin bir kimyasal maddeden kaynaklandığı ilk olarak 1925 yılında Andre Gratia tarafından rapor edilmiştir (Gratia 1925). Principle V olarak adlandırılan Escherichia coli nin bir türü tarafından üretilen bakteriyosin Escherichia coli nin diğer türlerine karşı etkili bulunmuştur. Kolisin terimi 1946 da Fredericq ve Gratia tarafından kullanılmıştır (Gratia and Frederiq 1946) yılında Rogers Lactobacillus bulgaricus üzerine Lactococcus lactis tarafından üretilen bir maddenin inhibitör etki yaptığını saptamış ve bu madde daha sonra nisin olarak adlandırılmıştır. (Rogers 1928, Montville and Chen 1998) yılında nisin WHO tarafından yasal bir gıda katkı maddesi olarak kabul edilmiştir (Cogan and Hill 1993). Bakteriler tarafından üretilen protein yapısındaki antimikrobiyal maddenin tanımlanması ve isimlendirilmesinde Bakteriyosin terimi ilk olarak 1953 yılında Jacob ve arkadaşları tarafından kullanılmıştır (Jacob et al. 1953) yılına kadar bakteriyosinlerle ilgili yapılan çalışmalarda pek bir aşama kaydedilmemiş, 1969 yılında nisinin gıda koruyucu katkı maddesi olarak kullanımına izin verildikten sonra bakteriyosin kullanımının belirli bir potansiyel oluşturduğu fark edilmiş ve araştırmalar yoğunlaştırılmıştır. Bakteriyosinler; bakteriler tarafından sentezlenen, antimikrobiyal etkiye sahip, genelde yakın türlerin inhibisyonunda etkili, kısa veya uzun zincirli protein benzeri yapılardaki maddeler olarak tanımlanmaktadır (Klaenhammer et al. 1995, Gorris 1996, Eijsink et al. 1998). Bakteriyosinler protein yapısında, doğal olduklarından bunların et ve süt ürünleri başta olmak üzere birçok gıdada kullanımı mümkün olmaktadır. Bakteriyosinler gıda 12

26 maddesine doğrudan katılabildikleri gibi, bakteriyosin sentezleyen koruyucu kültürlerin gıdaya inokulasyonuyla veya gıdanın koruyucu ambalaj materyaliyle birlikte de kullanılabilirler. Böylelikle; uygun olan bakteriyosinin veya bakteriyosin üreten LAB sinin gıdalara eklenmesi hem raf ömrünü uzatacak hem de sağlıklı kabul edilecektir. Birçok kaynakta bakteriyosinler ve antibiyotikler karıştırılmaktadır. Günümüz sınıflandırılmasında bakteriyosinler antibiyotiklerden tamamen farklı moleküller olarak kabul edilmektedir. Temel farklılıklara bakıldığında; Bakteriyosinler genellikle gelişme fazında üretilirken, antibiyotikler gelişimin durma fazında üretilen ikincil metabolitler olarak tanımlanmaktadır (Vuyst and Vandamme 1991, 1992, Nes et al. 2002). Bakteriyosinler ribozomal olarak sentezlenirken, antibiyotikler enzimatik bir işlenme sonucu aktif hale geçmektedirler. Bakteriyosinler pre-peptitler olarak sentezlenmekte daha sonra posttranslasyonel işlemlerle N-terminal lider peptitin uzaklaştırılmasıyla aktif form olan olgun bakteriyosinlere dönüşmektedirler. Üretici hücreler kendi bakteriyosinlerine karşı genetik olarak bağışıklık kazanmışlardır. Bu bağışıklık proteinlerini kodlayan genler bakteriyosinin yapısal genleriyle bağlantılı olup, antibiyotik bağışıklığını yöneten genetik belirleyiciler yapısal antibiyotik genleriyle bağlantılı değildir. Mevcut antibiyotiklerin gıdalarda kullanımı tıbben mümkün olmamaktadır. Bu nedenle bakteriyosin tanımı içerisinde sadece bakteriler tarafından sentezlenen antimikrobiyal maddelerin yer alması gerektiği kanısına varılmıştır (Rammelsberg and Radler 1990; Riley 1998). 13

27 Bakteriyosinler ve gıdalarda kullanımı Gıda güvenliği açısından, patojen mikroorganizmaların gıdalarda gelişiminin önlenmesi gerekmektedir. Gıdalarda gelişen patojen mikroorganizmalar üzerinde antagonistik mikroorganizmaların ve bakteriyosin gibi antimikrobiyal maddelerin etkili olması sebebiyle, gıda güvenliğinde bakteriyosin kullanımının önemi oldukça artmıştır. Bakteriyosinlerin antimikrobiyal aktivitelerinin yanı sıra, peptit veya protein yapılarında olmalarından dolayı mide salgılarından etkilenebildikleri ve insan vücudunda sindirilebilecekleri anlaşılmıştır. Ayrıca bazı Grup II bakteriyosinlerin ısı stabilitelerinin olması, yüksek sıcaklıkta işlem gören birçok gıda maddesinde kullanılabilirliğini sağlamaktadır. Bakteriyosinlerin et ve süt ürünleri başta olmak üzere birçok gıdada kullanımı mümkün olmaktadır (Cleveland et al. 2001) (Çizelge 2.1). Bakteriyosinler doğrudan gıda maddesine katılabildikleri gibi, bakteriyosin sentezleyen koruyucu kültürlerin gıdaya inokulasyonuyla ya da gıdanın koruyucu ambalaj materyaliyle birliktede kullanılabilmektedir. Bu amaç doğrultusunda koruyucu kültür olarak daha çok laktik asit bakterileri, bakteriyosin olarak ise kullanımına izin verilen nisin kullanılmaktadır. Gıdaların korunmasında bakteriyosinlerin kullanımını esas alan alternatif bir yaklaşım da, bakteriyosin üreticisi canlı kültürlerin kullanımıdır. Bu yaklaşımda bakteriyosin üreticisi suşların; starter kültürler ya da starter kültür karışımlarının bir parçası olarak kullanımı veya gıdalara ilave edilmesi önerilmektedir (O Sullivan et al. 2002a). Genelde gıdada kullanımları için bakteriyosin üreticisi suş seçiminde kullanılan bazı unsurlar mevcuttur. Bunlardan bazıları aşağıdaki şekilde sıralanabilir; Tüketicilerin bu konudaki endişelerinin giderilmesi amacıyla üretici suş tercihen GRAS (insan ve hayvan tüketiminde güvenilir kabul edilen özelliklere sahip) olmalıdır. Bakteriyosin Listeria monocytogenes ve Clostridium botulinum gibi patojenlerin dahil olduğu geniş bir aktivite spektrumuna sahip olmalıdır. 14

28 Bakteriyosinlerin, tüketici sağlığı üzerinde olumsuz etkileri olması istenmemektedir. Bakteriyosinlerin ilave olunan üründe güvenlik, aroma bileşenlerinin geliştirilmesi gibi yararlı etkileri olmalıdır (Holzapfel et al. 1995, Horn et al. 2004). Bakteriyosin ısı stabil olmalıdır. Bununla birlikte bakteriyosinlerin gıdalarda koruyucu olarak kullanımı gıda zehirlenmelerinde rol oynayan Gram-negatif patojenlere karşı kullanıma hazır bir bakteriyosinin mevcut olmaması (Gorris 1996), bazı bakteriyosinlerin genetik determinantları açısından stabil olması (Gorris 1996) ve tüketicilerin bu konudaki endişelerinin giderilmesi amacıyla güvenli (GRAS) olduklarının kanıtlanması gibi zorluklar neticesinde kısıtlanmaktadır. Bahsedilen kısıtlayıcı faktörlere rağmen son yıllarda yapılan araştırmalar sonucunda bu unsurları ortadan kaldırabilecek bulgular geliştirilmiştir Bakteriyosinlerin diğer koruyucu maddeler ve proseslerle birlikte kullanılması Bakteriyosinler özellikle Gram-pozitif mikroorganizmalar üzerinde etkili olmalarına rağmen Gram-negatif mikroorganizmalar üzerinde fazla etkili olamamaktadır. Dolayısıyla Gram-negatif olan patojen mikroorganizmaların da olduğu düşünüldüğünde sadece bakteriyosin kullanımıyla gıdaların güvenliğinin sağlanamayacağı nettir. Bu sebeple, bakteriyosinle birlikte diğer koruyucu katkıların veya proseslerin kullanılması gerekmektedir. Gram-negatif bakterilerin dış zarlarının stabilitesi bozulduğunda bakteriyosinlere karşı hassasiyet göstermektedirler. Böylelikle bakteriyosinle birlikte hücre zarını bozabilecek trisodyum fosfat veya EDTA gibi şelatlayıcı ajanların kullanılmasının inhibisyon etkisi yapabileceği bildirilmiştir. EDTA, Gram-negatif mikroorganizmaların lipopolisakkarit kısmında Mg +2 iyonuna bağlanarak dış zarın yapısını bozup, bakteriyosinin sitoplazmik zara ulaşmasını sağlamaktadır. 15

29 Çizelge 2.1 Bazı bakteriyosinlerin kullanıldığı gıdalar ve etkileri Bakteriyosin Uygulanan gıda Etkileri Nisin A Yeniden şekillendirilen et ürünleri Bakteriyel inaktivasyon Nisin A Pediocin AcH Enterocin 4 Piscicolin 126 Leucocin A Lactocin 705 Pediocin AcH Pediocin Pediocin AcH Pediocin PA-1 Enterocin Ricotta peynirinde Listeria monocytogenes in kontrolü için kullanılmıştır. Pediocin AcH sentezleyen Lactobacillus plantarum WHE 92, olgunlaşmanın başlangıcında Munstar peynirinin yüzeyine spreylenmiştir. Enterocin sentezleyen Enterococcus faecalis INIA4, Manchego peyniri üretiminde kullanılmıştır. Jambonda Listeria monocytogenes kontrolü için kullanılmıştır. Leuconostoc gelidium UAL 187 vakum paketlemiş sığır etinde bozulma kontrolü için kullanılmıştır. Kıyılmış sığır etinde Listeria monocytogenes in gelişimini önlemek için kullanılmıştır. Tavuk eti sosisinde Listeria monocytogenes i inhibe etmek için pediocin üreten Pediococcus acidilactici kullanılmıştır. Şarap ve fırıncılık ürünlerinde kullanım potansiyeli araştırılmıştır. Tavuk etine pediocin preparatı ilave edilmiştir. Fermente sosiste starter olarak Pediococcus acidilactici kullanılmıştır. Jambon, domuz eti, tavuk göğsü eti ve sosiste kullanılmıştır. Listeria monocytogenes i 8 hafta etkili bir şekilde inhibe etmiştir. Listeria monocytogenes in gelişimi engellenmiştir. Listeria monocytogenes Ohio yu inhibe ederken, Listeria monocytogenes Scott A yı inhibe etmemiştir. Ticari bakteriyosinden daha etkili bulunmuştur. Lactobacillus sake in etkisiyle bozulma 8 haftaya kadar geciktirilmiştir. Listeria monocytogenes in kıyılmış etlerde gelişimini önlemiştir. Etkili bir şekilde Listeria monocytogenes sayısını azaltmıştır. Bu tür ürünlerde kullanım potansiyelleri olduğu belirlenmiştir. 5 C de 28 gün Listeria monocytogenes gelişimini kontrol etmiştir. Listeria monocytogenes i etkili bir şekilde kontrol etmiştir. Çeşitli şartlar altında Listeria monocytogenes gelişimini kontrol etmiştir. 16

30 Yapılan kapsamlı bir çalışmada lactosin 705 ve enterocin CRL35 bakteriyosinleri değişik Listeria türleriyle bulaştırılmış kıyma ve et sularında ayrı ayrı ve kombine olarak denenmişlerdir. Denemelerin neticesinde Listeria türlerinin 24 saatlik depolama sürecinde büyük oranda inhibe olduğu ve özellikle iki bakteriyosinin birlikte kullanıldığında etkinin daha güçlü olduğu belirlenmiştir (Vignolo et al. 2000). Son yıllarda yapılan bir çalışmada bakteriyosinlerin gıda içerisindeki kullanımlarının yanı sıra ambalaj materyaline katıldığında da etkili olabildiği gösterilmiştir (Coma et al. 2001). Bu çalışmada kullanılan hidroksipropilmetilselüloz içerisine Nisin bakteriyosini eklenmiş ve bu materyalin Listeria innocua ve Staphylococcus aureus inhibisyonunda etkili olduğu görülmüştür. Bakteriyosinlerin etki spektrumlarını genişletmek maksadıyla birkaç farklı bakteriyosinin birlikte kullanımının patojenler üzerinde daha etkili olabileceği gösterilmiştir (Halin et al. 1993). Ayrıca bakteriyosin uygulamasına ek olarak gıdanın asitliğinin değiştirilmesi veya tuz içeriğinin arttırılmasının etki alanını genişlettiği kanıtlanmıştır (Vignolo et al. 2000, Rodgers 2001).Yapılan başka bir çalışmada laktisin 3147 bakteriyosini ve sodyum laktat taze sosislerde sodyum metabisülfit yerine koruyucu olarak kullanılmıştır. Elde edilen bulgular eklenen bakteriyosin ve organik asitin sosislerde Salmonella kentucky ve Listeria innocua ya karşı sodyum metabisülfit yerine kullanılabileceğini, Clostridium perfringens e karşı ise kısmen etkili olduğunu göstermiştir (Scannel et al. 2000). 2.3 Laktik Asit Bakterileri Tarafından Üretilen Bakteriyosinler Laktik asit bakterilerinin sentezlediği bakteriyosinler birbirinden farklı özellikte olup etki spektrumları, genetik determinantları ve biyokimyasal özellikleri farklılık göstermektedir. Genellikle düşük moleküler ağırlığa sahip olup (3-10kDa), hidrofilik ve hidrofobik kısımları bulunmaktadır. ph aralıkları geniş, izoelektrik noktaları yüksektir (de Martinis et al. 2002). Nisin ve pediocin AcH asidik koşullarda yüksek sıcaklığa daha dayanıklı olup, nisin otoklavlandıktan sonra aktivitesinin % 40 ını ph 6.8 de ise % 90 ını kaybetmektedir (Yıldırım ve Yıldırım 2000). Laktik asit bakterilerinin ürettiği bakteriyosinlerin çoğu katyonik, hidrofobik veya amfilik moleküller olup, aminoasit kalıntısı içermektedir (Chen and Hoover 2003). Laktik asit bakterileri tarafından üretilen bakteriyosinlerin antimikrobiyal özelliğinin gözlemlenmesi 17

31 aktifleştirildiği besiyeri üzerinde oluşturduğu zonlarla belirlenmektedir (Şekil 2.2). Laktik asit bakterileri tarafından üretilen bakteriyosinlerde ortak özellikler mevcuttur (Çizelge 2.2). Şekil 2.2 Katı besiyeri içeren petri plakada bakteriyosin zonunun oluşumu Laktokoklar tarafından üretilen bakteriyosinler Laktokoklar tarafından üretilen bakteriyosinler; diplococcin, lactococcin, nisin ve lactostrepsin lerin üyelerini içermektedir. Laktokoklarda tanımlanan ilk protein benzeri madde diplococcin dir. Lactococcus lactis subsp. cremoris suşları tarafından üretilen bu bakteriyosin; α-kimotripsin, pronaz ve tripsin enzimlerine karşı duyarlı kda büyüklüğünde bir peptittir. Moleküler ağırlığı, ısı stabilitesi ve bakterisidal etkisi nedeniyle, diplococcin in membrana etkili bir antimikrobiyal olduğu düşünülmektedir (Davey and Richardson 1981, Klaenhammer 1993). 18