TON BALIĞI KONSERVELERİNDE KATI FAZ EKSTRAKSİYON VE HPLC METODU İLE BİSFENOL A VARLIĞININ İNCELENMESİ

Transkript

1 TÜRKİYE CUMHURİYETİ ANKARA ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ TON BALIĞI KONSERVELERİNDE KATI FAZ EKSTRAKSİYON VE HPLC METODU İLE BİSFENOL A VARLIĞININ İNCELENMESİ Buket ER GIDA HİJYENİ VE TEKNOLOJİSİ ANABİLİM DALI DOKTORA TEZİ DANIŞMAN Prof. Dr. Belgin SARIMEHMETOĞLU ANKARA

2 TÜRKİYE CUMHURİYETİ ANKARA ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ TON BALIĞI KONSERVELERİNDE KATI FAZ EKSTRAKSİYON VE HPLC METODU İLE BİSFENOL A VARLIĞININ İNCELENMESİ Buket ER GIDA HİJYENİ VE TEKNOLOJİSİ ANABİLİM DALI DOKTORA TEZİ DANIŞMAN Prof. Dr. Belgin SARIMEHMETOĞLU ANKARA

3 ii

4 iii İÇİNDEKİLER Kabul ve Onay İçindekiler Önsöz Simgeler ve Kısaltmalar Şekiller Çizelgeler ii iii iv v vi vii 1.GİRİŞ Bisfenol A Bisfenol A nınyapısı Bisfenol A nın Fiziksel ve Kimyasal Özellikleri Bisfenol A Tipi Reçineler Konserve Gıdalar ve Balık Konserveleri Konserve Gıdalar ve Bisfenol A Migrasyon ve Bisfenol A Bisfenol A nın Gıdalar ile Alınması Bisfenol A nın Metabolizması Bisfenol A nın Toksikolojik Etkileri Bisfenol A ile İlgili Yasal Düzenlemeler 22 2.GEREÇ VE YÖNTEM Gereç Yöntem Ekstraksiyon Öncesi İşlemler Brüt ve Net Ağırlık Saptanması Süzme Ağırlık Saptanması ph Ölçümü Ton Balığı Örneklerinde Bisfenol A Miktarlarının Saptanması Standartların Hazırlanması ve Kalibrasyon Eğrisi Örneklerde Bisfenol A nın Katı Faz Ekstraksiyonu Bisfenol A Alıkonma Zamanları Yöntemin Kesinliği (Tekrarlanabilirlik, Tekrar Üretilebilirlik) Yöntemin Tespit Limiti ve Hesaplama Limiti Yöntemin Verimliliğinin Hesaplanması Örneklerde Tuz Analizi İstatistiksel Analizler 43 3.BULGULAR 44 4.TARTIŞMA 58 5.SONUÇ VE ÖNERİLER 65 ÖZET 67 SUMMARY 68 KAYNAKLAR 69 EKLER 80 EK-1. Bazı Örneklere Ait Bisfenol A Pik Kromatogramları 81 ÖZGEÇMİŞ 85

5 iv ÖNSÖZ Gıdaların muhafazasında kullanılan yaygın ve çok eski bir teknik olan konserveleme, genel anlamda konserve kutusundaki gıdaya ısıl işlem uygulanarak gıdanın raf ömrünün uzatılmasıdır. Konserve kutuları genellikle çelik veya alüminyum metallerinden yapılmaktadır. Gıdaların bu metallerle temas etmemesi için de konserve kutusunun iç yüzeyi lak adı verilen bir tabaka ile kaplanmaktadır. Bu laklarda, bisfenol A tipi epoksi reçineler 1950 ve 1960 lardan beri kutuların iç yüzeyinin kaplanmasında sıklıkla kullanılmaktadır. Konserve kutularının kaplanmasında kullanılan bu kimyasallar, gıdalara migrasyon yolu ile geçerler ve insan sağlığı açısından zararlı olduklarından oldukça önemlidirler. Bisfenol A nın migrasyonu üretim yerleri, üretim metotları ve laklama materyallerine göre farklılıklar göstermekle beraber, gıdanın üretiminden tüketimine kadar çeşitli faktörlerden de etkilendiği için gıda güvenliği ve halk sağlığı açısından risk teşkil etmektedir. Bisfenol A nın yüksek miktarlarda üretilmesi ve plastiklerde çok fazla kullanılması nedeniyle çevresel kontaminasyon da meydana gelmektedir. Bunun sonucu olarak bisfenol A nın yarattığı kirliliğin deniz ve toprak ekosistemlerindeki önemi de küçümsenmemelidir. Gıda güvenliği açısından önemli bir migrant madde olan bisfenol A nın konservelerde migrasyonuna yönelik yurt dışında yapılmış kısıtlı sayıda çalışma bulunmaktadır. Ancak, literatür taramalarında Türkiye de gıdalarda bisfenol A araştırılması ile ilgili benzeri bir çalışmaya rastlanmamıştır. Tez çalışmamın yürütülmesinde bilgilerinden faydalandığım ve yardımını gördüğüm sayın danışman hocam Prof. Dr. Belgin SARIMEHMETOĞLU na, Bölüm Başkanımız Prof.Dr. İrfan EROL a başta olmak üzere değerli öğretim üyelerine, ilgi ve yardımlarını esirgemeyen Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi öğretim üyelerinden sayın hocalarım Prof. Dr. T.Haluk ÇELİK ve Prof.Dr. Ayhan FİLAZİ ye, Gazi Üniversitesi Eczacılık Fakültesinden Eczacılık Temel Bilimleri Anabilim Dalı Başkanı Prof.Dr. Aysel BAYHAN ÖKTEM e, Temel Eczacılık Bilimleri Bölüm Başkanı Prof. Dr. Gülderen YENTÜR e, Biyokimya Anabilim Dalı Öğretim Üyesi Doç.Dr. Aymelek GÖNENÇ e ve Farmasötik Mikrobiyoloji Anabilim Dalı Öğretim Üyesi Yrd. Doç. Dr. Fatma KAYNAK ONURDAĞ a, istatistiksel analizlerde yardımını aldığım Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi öğretim üyelerinden değerli arkadaşım Doç.Dr. İ.Safa GÜRCAN a, çalışma arkadaşlarıma, her zaman maddi ve manevi desteklerini hissettiğim başta annem Fatma ER, babam Mustafa ER ve ablam Çiğdem ER olmak üzere tüm aileme sonsuz teşekkürlerimi sunarım.

6 v SİMGELER ve KISALTMALAR ABD BADGE BFA CDC DNA EPA EC HPLC FDA FSA GC-MS NIOSH Amerika Birleşik Devletleri Bisfenol A Diglisidil Eter Bisfenol A Hastalıkların Kontrolü ve Önlenmesi Merkezi (The Centers for Disease Control and Prevention) Deoksi Ribonükleik Asit Birleşmiş Milletler Çevre Koruma Ajansı (U.S Environmental Protection Agency) Avrupa Komisyonu (European Commission) Yüksek Basınç/ Performans Sıvı Kromatografi (High Pressure/ Performance Liquid Chromatography) Amerika Gıda ve İlaç Dairesi (Food and Drug Administration) Birleşik Devletler Gıda Standartları Ajansı (Food Standards Agency) Gaz Kromatografi- Kütle spektrometrisi (Gas Chromatography Mass Spectrometry) Amerikan Ulusal İş Güvenliği ve Sağlığı Enstitüsü (National Instute for Occupational Safety and Health) LC ESI MS/MS Sıvı Kromatografisi-Elektrosprey İyonizasyon-Tandem Kütle Spektrometresi (Liquid chromatography Electrospray Ionization Tandem Mass Spectrometry) LC-MS Sıvı Kromatografi- Kütle spektrometrisi (Liquid Chromatography Mass Spectrometry) LD 50 Öldürücü Doz (Lethal Dose) RSD Bağıl Standart Sapma (Relative Standard Deviation) PVC Polivinil Klorür SCF Avrupa Birliği Gıda Bilimsel Komitesi (Scientific Committee for Food) SML Spesifik Migrasyon Limiti (Spesific Migration Limit) TDI Tolere Edilebilir Günlük Alım Miktarı (Tolerable Daily Intake ) TGK Türk Gıda Kodeksi TSE Türk Standartları Enstitüsü UGT Uridin Difosfat Glukuronil Transferaz

7 vi ŞEKİLLER Şekil 1.1. Bisfenol A nın sentezi 3 Şekil 1.2. Bisfenol A nın kimyasal yapısı 3 Şekil 1.3. Bisfenol A tipi reçinelerin sentezi 5 Şekil 1.4. Geçirgen olmayan ambalaj materyalinden kimyasal madde migrasyonu 11 Şekil 1.5. Geçirgen ambalaj materyalinden kimyasal madde migrasyonu 11 Şekil 2.1. Örnekte ph ölçümü 28 Şekil 2.2. Varian prostar sistem HPLC 29 Şekil 2.3. Bisfenol A standartlarına ait kalibrasyon grafiği 30 Şekil 2.4. Bisfenol A standartlarına ait pik kromatogramları 31 Şekil 2.5. Örneğin rotavaporda uçurma işlemi 32 Şekil 2.6. Örneklerin katı faz ekstraksiyon basamakları 33 Şekil 2.7. Örneklerin florisil kartuştan katı faz ekstraksiyonu 34 Şekil 2.8. Eluatın azot gazı altında uçurma işlemi 34 Şekil 2.9. Bisfenol A alıkonma zamanı pik kromatogramları 35 Şekil Bisfenol A alıkonma zamanı pik kromatogramları 36 Şekil Gün içi tekrarlanabilirlik pik kromatogramları 37 Şekil Günlerarası tekrarlanabilirlik 1. gün pik kromatogramı 38 Şekil Günlerarası tekrarlanabilirlik 2. gün pik kromatogramı 38 Şekil Günlerarası tekrarlanabilirlik 3. gün pik kromatogramı 39 Şekil Günlerarası tekrarlanabilirlik 4. gün pik kromatogramı 39 Şekil Günlerarası tekrarlanabilirlik 5. gün pik kromatogramı 40 Şekil Günlerarası tekrarlanabilirlik toplam 5 gün pik kromatogramları 40 Şekil.3.1. Farklı markalara ait örneklerin ortalama bisfenol A miktarları (mg/kg) 51 Şekil.3.2. Farklı markalara ait örneklerin ortalama % tuz miktarları 51 Şekil.3.3. Farklı markalara ait örneklerin ortalama ph değerleri 52 Şekil.3.4. Örneklere ait bisfenol A miktarlarının standart değerle karşılaştırılması 57

8 vii ÇİZELGELER Çizelge 1.1. Bisfenol A nın fiziksel ve kimyasal özellikleri 4 Çizelge Balık konservesinin fiziksel ve kimyasal özellikleri 8 Çizelge 2.1. Bisfenol A standartlarına ait konsantrasyonlar ve alanlar 31 Çizelge 2.2. Bisfenol A nın alıkonma zamanları ve alanları 35 Çizelge 2.3. Gün içi tekrarlanabilirlik için alıkonma zamanları, alanlar ve %RSD değerleri 36 Çizelge 2.4. Günler arası tekrarlanabilirlik için alıkonma zamanları, alanlar ve %RSD değerleri 37 Çizelge 2.5. Standart ilave edilen örneklere ait bisfenol A konsantrasyonları ve %verim değerleri 42 Çizelge 3.1. A markasına ait ton balığı örneklerinin bisfenol A, tuz, ph ve süzme ağırlık miktarları 45 Çizelge 3.2. B markasına ait ton balığı örneklerinin bisfenol A, tuz, ph ve süzme ağırlık miktarları 46 Çizelge 3.3. C markasına ait ton balığı örneklerinin bisfenol A, tuz, ph ve süzme ağırlık miktarları 47 Çizelge 3.4. D markasına ait ton balığı örneklerinin bisfenol A, tuz, ph ve süzme ağırlık miktarları 48 Çizelge 3.5. A markasına ait ton balığı örneklerinin ortalama BFA, tuz, ph değerleri 49 Çizelge 3.6. B markasına ait ton balığı örneklerinin ortalama BFA, tuz, ph değerleri 49 Çizelge 3.7. C markasına ait ton balığı örneklerinin ortalama BFA, tuz, ph değerleri 50 Çizelge 3.8. D markasına ait ton balığı örneklerinin ortalama BFA, tuz, ph değerleri 50 Çizelge 3.9. Farklı Markalara ait ton balığı örneklerinin ortalama bisfenol A miktarları (mg/kg) 51 Çizelge 3.10 Farklı markalara ait ton balığı örneklerinin ortalama süzme ağırlık

9 viii değerleri (g) 53 Çizelge Farklı markalara ait ortalama bisfenol A miktarlarının karşılaştırılması 53 Çizelge Farklı tipteki ton balık konservelerine ait ortalama bisfenol A miktarlarının karşılaştırılması 54 Çizelge Farklı gramajdaki ton balık konservelerine ait ortalama bisfenol A miktarlarının karşılaştırılması 54 Çizelge Ton balığı örneklerine ait tuz miktarlarının marka, tip, gramaj açısından değerlendirilmesi 55 Çizelge Ton balığı örneklerine ait ph miktarlarının marka, tip, gramaj açısından değerlendirilmesi 56 Çizelge Farklı markalara ait ton balığı konservelerinin ortalama bisfenol A miktarlarının standart değer ile karşılaştırılması (mg/kg) 56

10 1 1.GİRİŞ Bisfenol A (BFA), bebek biberonlarında, gıda ve içecek ambalajlama materyallerinde hammadde olarak kullanılan polikarbonat plastikler ve epoksi reçinelerin monomeri olan endüstriyel bir kimyasaldır (Maragou ve ark., 2006; Podlipna ve Markl, 2007). Bisfenol A dünyada yaygın olarak kullanılan kimyasallardan biridir. Bisfenol A nın dünyadaki üretiminin 2006 yılında 3,9 milyon tondan fazla olduğu bilinmekte ve 2010 yılında yaklaşık 5 milyon ton olacağı tahmin edilmektedir. Dünyada özellikle Almanya, Hollanda, Amerika Birleşik Devleti ve Japonya gibi pek çok ülke bisfenol A açısından yüksek üretim kapasitesine sahiptir (Ballesteros-Gomez ve ark., 2009). Amerika da 2003 yılında bisfenol A kullanımının yaklaşık 862 bin ton olduğu bildirilmiştir. Bu tüketimin yaklaşık 3/4 nün gıda ve içeceklerin depolandığı polikarbonat kapların yapımında kullanılan monomerlere ait olduğu belirtilmiştir (Le ve ark., 2008). Dünyada üretilen bisfenol A nın % 70 i polikarbonat plastiklerin, % 25 i epoksi reçinelerin üretiminde kullanılmaktadır (Tsai, 2006). Epoksi reçineler deniz ürünleri, sebzeler, bira, alkolsüz içecekler ve süt tozu gibi gıdaların ambalajlanmasında kullanılan metal gıda kutularının iç yüzeyinin kaplanmasında, şarap ve su gibi sıvıların bulunduğu büyük depolama kapları ile değişik tiplerdeki gıda taşıyıcılarının yapılmasında kullanılmaktadır (Garcia ve Losada, 2004). Polikarbonatlar ise biberonlar ve su şişeleri gibi değişik plastik ürünlerin yapımında kullanılmaktadır (EC, 2002a; Matsumoto ve ark., 2003). Bu ambalaj materyallerinin yapımında proses doğru bir şekilde gerçekleşmezse bisfenol A tipi reçineler ve reaksiyon ürünlerinin gıdaya migrasyonu şekillenmektedir. Ayrıca bazı durumlarda bu maddeler gıda komponentleri ile reaksiyona girerek yeni bileşikler de oluşturabilmektedir (Garcia ve Losada, 2004).

11 2 Bisfenol A türevli bir epoksi monomeri olan bisfenol A diglisedileterin de (BADGE) epoksi reçinelerden ekstrakte edilebildiği ve gıdalara migrasyonu olduğu bildirilmiştir (Schaefer ve Simat, 2004). Amerikan Ulusal İş Güvenliği ve Sağlığı Enstitüsü (National Instute for Occupational Safety and Health- NIOSH) bisfenol A yı primer bir irritan, mutajen ve reprodüktif sistemi etkileyen bir ajan olarak tanımlamıştır. Bisfenol türevli bir madde olan bisfenol A diglisidil eteri ise tümorejen, mutajen ve irritant olarak bildirilmiştir. Son yıllarda bisfenol A nın düşük dozlarda bile endokrin sistemi etkileyebildiği belirtilmiştir (Salafranca ve ark., 1999; Lopez-Cervantes ve Paseiro-Losada, 2003). Gıdaya ambalaj materyallerinden migrasyonla geçen bisfenol A, gıda güvenliği ve kalitesi açısından önemli olması nedeniyle güncelliğini korumaktadır. Bu çalışmada, Ankara da tüketime sunulan yağda ve suda (light) muhafaza edilen ton balığı konservelerinin katı fazında, önemli bir migrant madde olan bisfenol A miktarlarının saptanması amaçlanmıştır. Ayrıca örneklerin bisfenol A miktarlarının Türk Gıda Kodeksine (TGK) uygunluğu değerlendirilerek, marka, tip, gramaj, ph ve tuz faktörlerinin bisfenol A miktarları üzerine etkileri de incelenmiştir.

12 BİSFENOL A Bisfenol A nın Yapısı Bisfenol A [2,2-bis(4-hidroksifenil)propan] aseton ve fenolün kondensasyonu ile oluşmaktadır (Krishnan ve ark., 1993; Prokop ve ark.,2004). Şekil 1.1 de Bisfenol A nın sentezi verilmiştir. Şekil 1.1. Bisfenol A nın sentezi (Prokop ve ark.,2004) Organik bir bileşik olan bisfenol A birbirine metil köprüsü ile bağlı iki fenol halkasından oluşur. Burada metil köprülerine iki fonksiyonel metil grubu bağlanmıştır (Kang ve ark., 2006b). Şekil 1.2 de Bisfenol A nın kimyasal yapısı gösterilmiştir. Şekil 1.2. Bisfenol A nın kimyasal yapısı (Kang ve ark., 2006b) Bisfenol A iki farklı yöntem ile üretilmektedir. İlk yöntemde düşük ph ve yüksek sıcaklık altında ve katalizör eşliğinde fenol ile aseton kondense edilir. Ham bisfenol A distilasyon yöntemleri kullanılarak saflaştırılır. Sıvı haldeki ürün filtreden süzülür ve daha sonra kurutulur. İkinci yöntem de birinciye benzemektedir. Ancak, bu yöntemde farklı katalizör ve saflaştırma teknikleri kullanılırak daha az oranda atık

13 4 elde edilir. Her iki yöntemde de elde edilen bisfenol A kristal veya pelet şekline dönüştürülür (Staples ve ark., 1998). Bisfenol A dan poliakrilatlar, poliesterler, fenol reçineler ve özellikle de epoksi reçineler ile polikarbonat plastiklerin üretiminde yararlanılmaktadır. Bu epoksi reçineler de konserve kutularının laklanmasında kullanılmaktadır. (Kang ve ark., 2006b) Bisfenol A nın Fiziksel ve Kimyasal Özellikleri Bisfenol A normal şartlar altında renksiz, kokusuz katı yapıya sahip bir maddedir. Endüstriyel olarak bisfenol A % 99,5 saflıkta pelet veya kristal şeklinde üretilebilmektedir (Staples ve ark., 1998; Cousins ve ark., 2002). Bisfenol A nın fiziksel ve kimyasal özellikleri Çizelge 1.1 de verilmektedir. Çizelge 1.1. Bisfenol A nın fiziksel ve kimyasal özellikleri (Cousins ve ark., 2002; Tsai, 2006) Parametre Değer Formül C 15 H 16 O 2 Molar kütle 228,29 g/mol Erime noktası 155 C Yoğunluk 1,04 g/cm 3 (20 C) 1,195 g/cm 3 (25 C) Suda çözünürlük 300 mg/l (25 C) Buhar basıncı 5,3x10-6 Pa Kaynama noktası (760 mmhg) 360,5 Alev alma noktası (açık kaplarda) 79,4 C 212,8 C ph 7 Bisfenol A monomeri polikarbonat plastiklere sertlik, dayanıklılık, şeffaflık ve diğer polimerler ile uyumluluk gibi üstün özellikler kazandırmaktadır (Ben-Jonathan ve Steinmetz, 1998; Tsai, 2006).

14 Bisfenol A Tipi Reçineler İki mol epiklorhidrin ile 1 mol bisfenol A nın reaksiyon ürünü olarak Bisfenol A Diglisidil Eter (BADGE) gibi epoksi reçineler oluşmaktadır. Bu epoksi reçineler yaygın olarak kullanılan ambalaj malzemeleridir (Poole ve ark., 2004). Şekil 2 de Bisfenol A tipi reçinelerin sentezi verilmiştir. Bisfenol A Epiklorhidrin BADGE Bisfenol A polimeri n Şekil 1.3. Bisfenol A tipi reçinelerin sentezi (Munguia-Lopez ve Soto-Valdez, 2001) Epoksi reçineler epoksid grup içeren polimerler olarak kaplama ve plastiklerde yapı komponenti olarak görev alırlar (Brotons ve ark., 1995; Matsumoto ve ark., 2003; Tsai, 2006). Bu reçineler ticari kullanımlarında ajanlar ve sertleştiriciler ile çapraz bağlanırlar. Sertleştiricilerin tipi veya ajanların çapraz bağlanması ortamın sıcaklığına bağlıdır (Poole ve ark., 2004). Muamele gören epoksi sistemler temelde inerttir ve karakterleri doğrultusunda değişik substratlara mükemmel adezyonları, kimyasal dirençlilikleri ve mükemmel termal mekanik ve elektriksel izolasyon özellikleri ile de eşsiz bir kombinasyona sahiptirler (Poole ve ark., 2004).

15 6 1.2.Konserve Gıdalar ve Balık Konserveleri Konserveleme işlemi gıdaların korunmasında kullanılan oldukça eski bir muhafaza yöntemidir. Bu yöntem güvenli ve daha uzun ömürlü gıdaların üretilmesinde kullanılmaktadır (Afoakwa, 2007). Gıdaların konserveleme işleminde gıda genellikle alüminyum ve çelik kutulara doldurulmaktadır. Konserveye dolum aşamasından önce veya sonra ısıl işlem uygulanmaktadır. Konservelenecek gıdalar ve ambalaj materyali ısıl işlem uygulanarak yeterli süre 100 C nin altında pastörize veya C de sterilize edilmektedir. Daha sonra konserve kutusunun kapağı hermetik olarak kapatılmaktadır. Uygulanan ısıl işlem gıda türüne göre değişmektedir. Yüksek asitli veya ph sı 4.5 in altında olan gıdalarda pastörizasyon işlemi kullanılırken düşük asitli veya ph sı 4.5 in üstünde olan gıdalarda ise sterilizasyon işleminden yararlanılmaktadır (Afoakwa, 2007). Meyve, sebze ve balık gibi farklı gıdaların muhafazası için konserveleme işlemi uygulanmaktadır. Ton balıklarının konservelenmesinde taze veya dondurulmuş balıklar içleri temizlendikten sonra duşlanarak yıkanmakta ve balığın ağırlığına göre saat arasında o C de ön pişirme işlemi uygulanmaktadır. Daha sonra balık eti soğutularak filetolarına ayrılmakta ve konserve kutularına doldurulmaktadır. Ayrıca kutuların içine salamura, tuz veya yağ eklendikten sonra kapakları hermetik olarak kapatılmakta ve sterilizasyon işlemi uygulanmaktadır. Sterilizasyon zamanı ve sıcaklığı kutu büyüklüğüne göre değişir. Yağda muhafaza edilen ton balıkları için sterilizasyon aşamasında 211x109 mm boyutlarındaki kutulara uygulanan sıcaklıkzaman parametrelerinin 121 o C de 40 dakika veya 115 o C de 65 dakika olması ve 603x408 mm boyutlarındaki kutular için ise 121 o C de 190 dakika veya 115 o C de 230 dakika olması önerilmektedir (Anon, 1999).

16 7 Türk Standartları Enstitüsüne göre kutulanmış ton balığı konserveleri orkinos, yazılı orkinos, gobene balıklarının enine dilimlenerek ambalaj boyuna uygun olarak yerleştirildikten sonra, sızdırmaz şekilde kapatılmış ambalajlarda ısıl işlemle dayanıklı hale getirilmiş mamul olarak adlandırılır (TSE, 2010). Ülkemizde yetiştiriciliği yapılan ton balığı türü Thunnus thynnus dur. Ayrıca konserve yapımı için Hindistan, Tayvan, İspanya, Cezayir gibi ülkelerden dondurulmuş ton balıkları ithal edilmektedir. Türkiye'nin donmuş balık üzerine yoğunlaşmış su ürünleri ithalatının önemli bir miktarını işlenerek ihraç edilen orkinos balığı oluşturmaktadır. (DPT, 2007). Türk Standartları Enstitüsüne göre balık konserveleri aşağıda gösterildiği şekilde sınıflandırılır (TSE, 2010). Sınıflandırma Türler: Balık cinsine göre 3 tipe ayrılmaktadır Tür 1: Ton balığı konservesi Tür 2: Ton tipi balık konservesi Tür 2:Ton tipi olmayan balık konservesi Tipler: Konservenin hazırlanış şekline göre 4 tiptirler. Tip 1 yağda, Tip 2 sosta (sebzeli ve sebzesiz), Tip 3 balığın kendi suyunda (işlem sırasında balık etinden ayrılan suda) Tip 4 suda Çeşitler: Balık konservesi parça büyüklüklerine göre; Çeşit 1 bütün dilim (ton ve ton tipi) Çeşit 2 iri parçalı, Çeşit 3 küçük parçalı, Çeşit 4 kıyılmış olmak üzere dört çeşide ayrılır (TSE, 2010). Ayrıca aynı standartta balık konservelerinin fiziksel ve kimyasal özellikleri çizelge 1.2 de verildiği şekilde belirtilmiştir.

17 8 Çizelge Balık konservesinin fiziksel ve kimyasal özellikleri (TSE, 2010) Özellik Değer Kutu dolum oranı, % (v/v), en az 90 Tepe boşluğu oranı, % (v/v), en az 5 ph 4,0 6,9 Klorür oranı, % (m/m), en çok 2,5 Boyar madde Bulunmamalı Kalay, mg/kg Konserve Gıdalar ve Bisfenol A Konserve gıdalar alüminyumdan, krom kaplı çelikten veya çelik kaplı tenekeden yapılmış kutularda muhafaza edilebilmektedir. Gıda ile metal konserve kutusu arasındaki arzu edilmeyen etkileşimlerin ve korozyonların önlenerek gıdanın korunması için bu kutularda internal polimerik kaplamalar yani laklar kullanılmaktadır ve böylece gıda metal ile değil bu lak ile temas etmektedir (Grob, 2002; Manfredi ve ark., 2005; Thomson ve Grounds, 2005; Poças ve Hogg, 2007). Gıda türüne göre laklama değişiklik göstermektedir. Genellikle meyveler gibi asitli gıdalar için aside dirençli laklama ve sebze, baklagil ve et ürünleri gibi asidik olmayan gıdalar için sülfüre dirençli laklama olmak üzere iki çeşit laklama yöntemi bulunmaktadır (Ramaswamy ve Marcotte, 2006). Çeşitli lakların gıdalara karşı kimyasal dirençleri farklıdır. Bununla birlikte aynı lakın değişik gıdalara karşı direnci de farklılık gösterebilmektedir. Bu nedenle, içine konulacak gıdaya dayanıklı lakla kaplanmış kutuların kullanılması gerekir. Lak bakımından en sorunlu gıdalardan biri soslu balık konserveleridir çünkü balıkların sülfürlü gıdalar olmasının yanısıra soslarında asit bulunur. Bu nedenle lak seçiminde zorluklarla karşılaşılır. Soslu balıklar için en uygun çözüm; epoksi fenolik lak ile laklanmış kalaysız tenekeler veya iki parçalı derin çekme alüminyum kutuların kullanılmasıdır (Üçüncü, 2000). Konservelerde kullanılan en yaygın lak tipleri epoksifenolik, Polivinil klorür (PVC) organosol ve polyester fenolik laklardır (Goodson ve ark., 2002).

18 9 Metal ambalaj materyallerinin iç yüzeyinin laklanmasında genellikle bisfenol A nın temel komponent olduğu epoksi reçineler kullanılmaktadır (Schaefer ve Simat, 2004). Bu reçineler çözünebilme ve eriyebilme özelliğine sahiptirler (Munguia- Lopez ve Soto-Valdez, 2001). Epoksi reçine polimerizasyonunun tam olarak gerçekleşmesi ve reaksiyona girmeyen epoksi bileşiklerin miktarı migrasyon açısından önemlidir. Polimerizasyonun tamamlanmadığı durumlarda ortamda bisfenol A bulunabilmekte ve sıcaklığın etkisi ile de kolayca gıdaya transfer olabilmektedir (Brotons ve ark., 1995; Goodson ve ark., 2002). Ayrıca epoksi monomeri olan bisfenol A türevli bir migrant madde olan bisfenol A diglisidileter de migrasyona uğrayarak gıdalara geçebilmektedir (Schaefer ve Simat, 2004). Simoneau ve ark., (1999) yaptıkları çalışmada 382 konserve balık örneğinde bisfenol A diglisidileter miktarını araştırmışlardır. Sonuç olarak araştırmacılar 382 örneğin 12 sinde (%3) bisfenol A diglisidileter miktarının 1 mg/kg dan yüksek olduğunu belirtmişlerdir. Erkan ve ark., (2005) yaptıkları çalışmada Türkiyedeki marketlerden temin ettikleri farklı markalara ait balık örneklerinde bisfenol A diglisidileter (BADGE) miktarlarını araştırmışlardır. Çalışmada sardalya ve hamsi balıklarında yüksek miktarlarda bisfenol A diglisidileter saptadıklarını bildirmişlerdir Migrasyon ve Bisfenol A Bisfenol A epoksi reçinelerin yapımında yer alan bir monomerdir ve bu bileşiğin gıda maddelerine migrasyonu bilinen bir durumdur (Nakazawa ve ark., 2002; Ramakrishnan ve Wayne 2008). Polimerizasyonun tamamlanmaması veya polimerlerin kısmi hidrolizi sonucunda ambalajdan gıdaya bisfenol A migrasyonu gerçekleşmektedir (Estevez-Alberola ve Marco, 2004). Migrasyon, gıda maddesi ile ambalaj materyali arasındaki etkileşim ile meydana gelen kütle transferi olarak tanımlanmaktadır. Ambalaj materyalinden gıda

19 10 maddesine monomerler, plastik katkı maddeleri ve oligomerler gibi pekçok madde migrasyonla geçebilmektedir (Lau ve Wong, 2000). Migrasyon, global ve spesifik migrasyon olarak ikiye ayrılmaktadır. Global migrasyon ambalaj materyalinden gıdaya geçen tüm kimyasal bileşikleri ifade etmektedir. Spesifik migrasyon ise ambalaj materyalinden monomer gibi bir veya çok maddenin geçişini tanımlamaktadır (Giacin ve Brzozowska, 1987). Spesifik migrasyonda insan sağlığı için potansiyel tehlike olarak değerlendirilen bileşiklerin gıdaya transferinde sınırlandırmalar getirilmiştir (Giacin ve Brzozowska, 1987). Bir gıda maddesinin ambalajlanması sonucunda, gıda, ambalaj ve çevre birbirleriyle etkileşim içerisinde olmaktadır. Karşılıklı olan bu etkileşimler sonucunda hem ambalaj malzemesinden gıdaya hem de gıdadan ambalaj malzemesine madde geçişleri gerçekleşmektedir. Bunun sonucunda gıda maddesinin kalitesi bozulabilmekte, ambalajın bazı özellikleri değişebilmekte ve hatta ambalaj, koruyucu işlevini yitirebilmektedir (Üçüncü, 2000). Ambalaj materyalinde bulunan kimyasal maddelerin hareketi; molekülün yapısı ve büyüklüğüne, gıda maddesi ile etkileşimine ve gıda maddesinin gösterdiği dirence bağlı olmaktadır (Castle, 2007). Metal, cam, seramik gibi sert maddelerden oluşan materyaller geçirgen olmayan ambalajlar olarak adlandırılmaktadır. Bu ambalaj materyalleri iyi birer bariyer özelliği gösterir ve gıda maddesine migrasyon sadece ambalaj materyalinin gıda ile temas eden yüzeyinden şekillenmektedir. Ambalaj materyalinin diğer kısımlarından migrasyon şekillenmemektedir (Şekil 1.4) (Castle, 2007).

20 11 Ambalaj Gıda x y z Şekil 1.4. Geçirgen olmayan ambalaj materyalinden kimyasal madde migrasyonu (Castle, 2007) Plastik, lateks ve elastomer olarak adlandırılan maddelerden geçirgen ambalaj materyalleri oluşmaktadır. Bu ambalaj materyalleri migrasyona karşı sınırlı bir direnç gösterir. Ambalaj materyalinin iç ve yüzey kısımlarından gıdaya migrasyon şekillenebilmektedir (Şekil 1.5). Ambalaj Gıda x y z Şekil 1.5. Geçirgen ambalaj materyalinden kimyasal madde migrasyonu (Castle, 2007) Bunun yanında özellikle yağ gibi gıda bileşenleri polietilen ve polipropilen gibi ambalaj materyali içerisine geçebilmektedir. Sonuçta, plastik bileşiklerinin

21 12 hareketliliği artmakta ve ambalajlanan gıda içerisine migrasyon şekillenmektedir (Arvanitoyannis ve Bosnea, 2004). Migrasyon, gıda ile ambalaj materyalinin temas yüzeyinin alanı, temas süresi, ambalaj materyalindeki migrant çeşidi ve konsantrasyonu, ambalaj materyalinin fiziksel ve kimyasal özellikleri, sıcaklık, gıda maddesinin agregat durumu, gıdanın yağlı, sulu, asitli olma gibi özellikleri ve ürün öğelerinin migrantlara olan ilgisi gibi bazı faktörlere bağlıdır (Üçüncü, 2000). Konserve kutusunun yüzeyinden bisfenol A migrasyonunu etkileyen ana faktör konservasyon işleminde kullanılan ısıtma süresi ve sıcaklığıdır (Munguia-Lopez ve Soto-Valdez, 2001; Takao ve ark., 2002; Goodson ve ark., 2002; Kang ve ark., 2003). Uygulanan sıcaklığın 121 C de 90 dakika olduğu durumda bisfenol A konsantrasyonunun en yüksek düzeyde olduğu bildirilmiştir (Munguia-Lopez ve Soto-Valdez, 2001; Munguia-Lopez ve ark., 2005). Yüksek sıcaklıklarda örneğin mikrodalga ile pişirilmede reçineler dekompozisyona uğramaktadırlar. Bunun sonucunda da ambalajdan gıdaya bisfenollerin migrasyonu daha yoğun ve hızlı olmaktadır (Jordakova ve ark., 2003). Kawamura ve ark., (2001) 120 o C sıcaklık uygulanan konserve kutularından suya bisfenol A migrasyonunu araştırmışlardır. A firmasında 10 ve 60 dakika süre ile uygulanan sıcaklık işleminden sonra sırasıyla 64 ve 87 ng/ml miktarlarında migrasyon saptamışlardır. B firmasında ise yine 10 ve 60 dakika süre ile uygulanan sıcaklık işleminden sonra sırasıyla 99 ve 166 ng/ml değerlerini elde etmişlerdir. Munguia-Lopez ve Soto-Valdez (2001) yaptıkları çalışmada ton ve jalapeno biber konservesinin suyunda bisfenol A ve bisfenol A diglisidil eter miktarlarının sırasıyla 0,6-83,4 µg/kg ve <0,25-4,3 µg/kg aralıklarında değiştiğini bildirmişlerdir. Bu çalışmada konservasyon işleminde ton balığına 90 dakika süresince 121 C, jalapeno biberine ise 9 dakika 100 C de sıcaklık uygulandığı belirtilmiştir.

22 13 Kang ve ark., (2003) ise yaptıkları çalışmada konserve yapımında uygulanan sıcaklık derecesinin süreden daha etkili olduğunu belirtmişlerdir. Bisfenol A migrasyonunu, 105 o C de 30 dakikada 1 ng/ml; 121 o C de 30 dakikada ise 5 ng/ml olarak bildirmişlerdir. Konserve kutusuna 121 o C de 60 dakika sıcaklık uygulanması sonucu bisfenol A migrasyon oranı 6 ng/ml iken 15 ve 30 dakikalık sıcaklık uygulanması sonucunda elde edilen değerin (5ng/ml) önemli miktarda değişmediğini bildirmişlerdir. Araştırmacılar konserve kutularına, %5-10 sodyum klorid varlığında veya bitkisel yağ varlığında 121 C de sıcaklık uygulandığında bisfenol A migrasyonunun arttığını da belirtmişlerdir (>10 ng/ml). Yoshida ve ark., (2001) konserve sebzelerin katı kısımlarında bisfenol A konsantrasyonunun sulu kısmına göre daha fazla olduğunu belirtmişlerdir. Bisfenol A'nın önce konservenin sulu kısmına daha sonra da muhafaza aşamasında katı kısmına geçtiğini bildirmişlerdir. Ayrıca, konserve kutusunun kaplamasından bisfenol A migrasyonu üretim yerleri, üretim metotları ve laklama materyallerine göre farklılıklar göstermektedir (Kang ve ark., 2006b). Biles ve ark., (1997) Amerika da, 14 adet epoksi kaplı kutuda muhafaza edilen bebek maması örneğinde HPLC yöntemiyle bisfenol A miktarlarını 0,1-13,2 ppb düzeylerinde saptamışlardır. Bu çalışmada bisfenol A miktarlarının saptanmasında yeni bir HPLC yöntemi geliştirilmiş ve geliştirilen yöntemi GC-MS (Gas Chromatography Mass Spectrometry) ile kontrol etmişlerdir. Kang ve Kondo (2002a) yaptıkları çalışmada Japon marketlerinden temin ettikleri metal kutuda muhafaza edilen içeceklerde ng/ml miktarlarında bisfenol A saptadıklarını bildirmişlerdir. Kang ve Kondo (2003) metal kutuda muhafaza edilen süt ve ürünlerinde (krema, süt ve tatlandırılmış süt) bisfenol A miktarlarını araştırdıkları çalışmada,

23 14 analize aldıkları örneklerde 21 µg/kg ve 43 µg/kg arasındaki miktarlarda bisfenol A tespit ettiklerini belirtmişlerdir. Kuo ve Ding (2004) Taiwan marketlerinden sağladıkları 6 adet toz bebek mamasında GC-MS yöntemiyle bisfenol A miktarlarını araştırmışlar ve bir bebek maması haricinde ng/g arasında bisfenol A saptadıklarını bildirmişlerdir. Braunrath ve ark., (2005) Avusturya marketlerinden sağlanan metal kutu ile ambalajlanmış içecekler, meyveler, sebzeler ve yağlı gıdalar olmak üzere toplam 38 adet gıda maddesinde HPLC yöntemiyle saptadıkları bisfenol A miktarlarının 0,1 ng/ml ile 38 ng/g arasında değiştiğini bildirmişlerdir. Maragou ve ark., (2006) Yunanistanda, LC-MS (Liquid Chromatography Mass Spectrometry-Sıvı Kromatografi- Kütle spektrometrisi) yöntemiyle metal kutuda muhafaza edilen 9 adet süt örneğinde bisfenol A miktarlarını araştırmışlar ve örneklerde <1,7-15,2 ng/g miktarlarında bisfenol A tespit ettiklerini belirtmişlerdir. Shao ve ark., (2007) Sıvı Kromatografisi-Elektrosprey İyonizasyon-Tandem Kütle Spektrometresi (Liquid chromatography Electrospray Ionization Tandem Mass Spectrometry-LC ESI MS/MS) yöntemiyle Beijing (Çin) marketlerinden temin ettikleri domuz, balık, tavşan, ördek ve tavuk etini kapsayan 27 et örneğinin 13 tanesinde 0,33-7,08 µg/kg oranlarında bisfenol A saptadıklarını belirtmişlerdir. Grumetto ve ark., (2008) İtalyan süpermarketlerinden topladıkları farklı markalara ait 42 adet doğranmış domates konserve örneğinde HPLC yöntemiyle bisfenol A miktarlarını araştırmışlar ve domates konservesi örneklerinin %52,4 ünde (22 adet) 20,5-115,3 μg/kg aralığında bisfenol A saptadıklarını bildirmişlerdir. Cao ve ark., (2009) Kanada Ottawa dan marketlerden temin ettikleri 72 adet meşrubatta HPLC yöntemiyle bisfenol A miktarlarını araştırmışlardır. Analize aldıkları 72 adet meşrubat örneğininin %69 unda 0,032-4,5 μg/l aralığında bisfenol A saptadıklarını belirtmişlerdir.

24 Bisfenol A nın Gıdalar ile Alınması Bisfenol A ya konserve sebze, içecek, balık ve et ürünlerinde rastlandığı belirtilmiştir. Gıdalardaki bisfenol A kontaminasyonunun çoğunluğu bisfenol A içeren kaplardan migrasyon ile şekillenmektedir. Bisfenol A nın gıdaya migrasyonu ile de vücuda alınımı gerçekleşmektedir (Kang ve ark., 2006b). Birçok firmanın bebek biberonlarında, çocuklar için gıda taşıma kaplarında, konserve kutuları ve gıda ambalaj materyallerinde bisfenol A kullanımına dikkat ettiği belirtilmektedir. Fakat insanların serum ve idrar gibi biyolojik örneklerinde bisfenol A'ya rastlandığı bildirilmektedir (Matsumoto ve ark., 2003; Calafat ve ark., 2005; Fukata ve ark., 2006). Bu da bisfenol A'nın gıdalara migrasyonunu ve sonuçta tüketildiğini göstermektedir (Sajiki ve ark., 2007). Hastalıkların kontrolü ve önlenmesi Merkezi (The Centers for Disease Control and Prevention USA CDC) 2007 yılında Amerika da 6 yaş ve üstü 2,517 insanda idrar örneklerinde bisfenol A düzeylerini araştırmışlardır. Bu kişilerin yaklaşık olarak %93 ünde bisfenol A varlığını bildirmişlerdir. Bu çalışmada, erkeklere ait örneklerdeki ortalama bisfenol A düzeylerinin (3,2 µg/l) kadınlara ait örneklerdeki ortalama bisfenol A düzeylerine (2,4 µg/l) göre daha yüksek olduğu ve bununla birlikte en yüksek düzeylerin çocuk ve gençlerin idrar örneklerinde (3,7-4,2 µg/l) tespit edildiği belirtilmiştir (CDC, 2008). Gıdaların bisfenol A ile kirlenmesinde atık suların da önemi vardır (Fürhacker ve ark., 2000). Aynı zamanda sucul yaşamın bisfenol A ile kirlenmesinde temel kaynağı fabrikalar ve topraktan gelen atık sular oluşturmaktadır. Bu nedenle de balıklarda bisfenol A biriktiği görülmüştür. Ayrıca kirlilik denizlerde tatlı sulara göre daha yüksek olduğu için denizlerdeki canlılar bisfenol A dan daha çok etkilenmektedir (Lee ve ark., 2008).

25 16 Basheer ve ark., (2004) yaptıkları çalışmada Singapurdaki süpermarketlerden sağlanan taze deniz ürünlerinde 13,3 ve 213,1 ng/g miktarlarında bisfenol A saptadıklarını bildirmişlerdir. Çevre Koruma Ajansı (U.S Environmental Protection Ajency- EPA) bisfenol A'nın kabul edilebilir alım miktarını 50 µg/kg va/gün olarak bildirmiştir (EPA, 1993). 1.6.Bisfenol A nın Metabolizması Etik açıdan ve bireysel duyarlılığı belirlemedeki zorluklar nedeniyle bisfenol A (BFA)'nın metabolizması ile ilgili olarak insanlarda yapılan çalışmalar sınırlı sayıdadır. Bununla birlikte bisfenol A' nın metabolize edilmesinde yapılan in vivo hayvan deneylerinde karaciğerin önemli rol oynadığı belirtilmektedir (Kang ve ark., 2006a). Oral yolla alınan bisfenol A gastrointestinal sistemde elimine edilerek büyük kısmı dışkı ile atılmaktadır ve idrarda ise bisfenol A nın glukuronid asit metaboliti bulunmaktadır (Fürhacker ve ark., 2000). İnsanlarda ve hayvanlarda BFA-glukuronid en büyük bisfenol A metabolitini oluşturur ve düşük östrojenik aktivite göstermektedir (Inoue ve ark., 2004; Vandenberg ve ark., 2007). Bisfenol A nın metabolizması, türler ve soylar arasındaki farktan dolayı çeşitlilik göstermektedir. Alım yolu, doz ve deney hayvanlarında fark olmasına rağmen, serbest bisfenol A'nın dışkı ile % 56-82, idrar ile de % oranında atıldığı belirtilmektedir (Kang ve ark., 2006a). Calafat ve ark., (2005), Amerika da 394 yetişkinin idrar örneklerinde yaptıkları çalışmada, örneklerin %95 inde bisfenol A miktarını 0,1 µg/l den fazla tespit ettiklerini bildirmişlerdir.

26 17 Memelilerde bisfenol A metabolizmasında glukuronidasyon ve sülfasyon olmak üzere iki yolun olduğu belirtilmektedir. İnsanda, bisfenol A mide-bağırsak kanalından hızlı bir şekilde absorbe edildikten sonra glukuronik asit veya sülfat ile birleşmektedir (Inoue ve ark., 2004; Lee ve ark., 2008). Glukuronidasyon karaciğerde endojen ve eksojen bileşiklerin salınmasında metabolik yolu oluşturmaktadır. Bisfenol A glukuronik asit ile birleştiğinde karaciğer mikrozomlarında UDP-glukuronil transferaz (UGT) ile glukuronidasyona uğratılmaktadır. Daha sonra da kandaki BFA-glukuronid böbreklerden hızlı bir şekilde süzülmekte ve idrar ile dışarı atılmaktadır. Günde 0,6 ile 71,4 µg bisfenol A alan insanların idrarları ile bisfenol A nın %20 sini attıkları bildirilmiştir (Yokota ve ark., 1999; Lee ve ark., 2008). Bazı araştırmacılara göre insanların karaciğerindeki mikrozomların glukuronidasyon metabolizmasının ratlardaki gibi gelişmiş olmadığı ve metabolik kinetiğin diğer memelilere göre insanlarda farklı olduğu belirtilmektedir (Elsby ve ark., 2001). İntestinal glukuronidasyon, ekskresyon oranı ve bisfenol A klerens oranı gibi etkenlerden dolayı bisfenol A'nın metabolizma modeli insan ve ratlarda farklılıklar göstermektedir (Vandenberg ve ark., 2007). Yokota ve ark., (1999) ratların karaciğerinde glukuronidasyonun UGT'nin izoformu olan UGT2B1 enzimi ile gerçekleştiğini belirtmiştir. Hepatik glukuronidasyon hamilelerde daha zayıf şekillenir. Bunun nedeni de UGT miktarının hamilelikte azalması olarak gösterilmiştir (Inoue ve ark., 2004). Ayrıca insanda fetal dönemde karaciğerdeki UGT seviyesi yetişkin karaciğerindekine göre düşük düzeydedir (Cappiello ve ark., 2000; Matsumoto ve ark., 2002; Strassburg ve ark., 2002). Ratların karaciğerindeki mikrozomal sitokrom P450 enziminin de bisfenol A metabolizmasında rol aldığı belirtilmektedir. Sitokrom P450, BFA'yı 5-hidroksi BFA ve bisfenol semikinon yolundan bisfenol-o-kinon'a metabolize etmektedir (Atkinson ve Roy, 1995a,b).

27 18 Bisfenol A'nın sülfasyonu, memelilerde bisfenol A metabolizması içerisinde yer alan karaciğerdeki sülfotransferazlar ile gerçekleştirilmektedir. İnsanlardaki sülfotransferazlar arasında basit fenol (P)-fenol sülfotransferaz ve termostabil fenol sülfotransferaz bisfenol A'nın sülfasyonunda görev almaktadırlar (Suiko ve ark., 2000; Nishiyama ve ark., 2002; Shimizu ve ark., 2002). Rat karaciğerinde sülfasyon ve glukuronidasyondan sonra bisfenol A metabolitlerinin safraya geçtiği bildirilmektedir (Inoue ve ark., 2001). Ayrıca hamilelik ile ilgili olan metabolik değişiklikler gebe olan hayvan ve insanlarda bisfenol A'nın metabolizması ve ekskresyonunda değişikliklere neden olmaktadır. Yapılan çalışmalarda bisfenol A'nın gebe anne ve fetus tarafından absorpsiyonunun hızlı olduğu ve plasentanın bisfenol A'ya bir engel oluşturulmadığı belirtilmektedir (Kuroda ve ark., 2003; Takahashi ve Oishi, 2000). Bazı çalışmalarda ise hayvan testlerinde bisfenol A nın oral yolla alındıktan sonra plasental bariyeri kolayca geçerek fetusa ulaştığı bildirilmektedir (Kuroda ve ark., 2003). Zalko ve ark., (2003) fare model çalışmasında 25 µg/kg gibi düşük dozda bisfenol A'nın plasental bariyeri geçebildiğini bildirmişlerdir. Ayrıca Japonya da maymunlarda ve farelerde bisfenol A nın plasental transferi ile ilgili yapılan bir çalışmada; gebe maymunlar ve farelere sırasıyla 50 mg/kg va ve 100 mg/kg va bisfenol A deri altı yoluyla verilmiştir. Farelerde bisfenol A alınmasından 30 dakika sonra yavrunun serum, karaciğer, beyin, uterus ve testis gibi iç organlarında bisfenol A belirlendiği belirtilmiştir. Maymunlarda ise bisfenol A nın alınmasından 1 saat sonra yavrunun karaciğer, böbrek ve beyin gibi iç organlarında bisfenol A bulunduğu bildirilmiştir (Uchida ve ark., 2002). Bisfenol A glukuronid, karaciğer mikrozom yolu ile oluşan en büyük metabolittir. Diğer metabolitler ise, BFA diglukuronid, 5-hidroksi BFA, BFA sülfat konjugat'tır (Atkinson ve Roy, 1995a; Nakagawa ve Suzuki, 2001; Shimizu ve ark., 2002).

28 19 Atkinson ve Roy (1995b) bisfenol-o-kinon'un in vitro ve in vivo koşullarda DNA'ya bağlandığını belirtmişlerdir. Sonuçta, in vivo bisfenol A alımı ile DNA da meydana gelen modifikasyon ile hepatotoksisiteye neden olabileceği belirtilmiştir. Yoshihara ve ark., (2001) BFA'nın metabolizması sonucu oluşan bazı metabolitlerin östrojenik aktivitesinin daha yüksek olduğunu belirtmiştir. 4-metil-2,4-bis(phidroksifenil)pent-l-ene (MBP) metabolitinin bisfenol A'ya göre daha toksik ve 250 kat daha östrojenik etkili olduğu belirtilmektedir (Ishibashi ve ark., 2005). Buna karşın BFA glukuronid ve 5-hidroksi BFA'nın bisfenol A'ya göre daha düşük düzeyde östrojenik olduğu bildirilmektedir (Nakagawa ve Suzuki, 2001; Shimizu ve ark., 2002). 1.7.Bisfenol A nın Toksikolojik Etkileri İnsanlarda bisfenol A nın oluşturduğu etkileri belirten bilimsel çalışmalar mevcuttur. Bisfenol A'nın düşük dozlarda alınması sonucunda farklı dokularda çok çeşitli biyolojik etkiler meydana getirdiği ve lipofilik özellikte olduğu içinde insanda yağlı bölgelerde birikebildiği belirtilmiştir (Wetherill ve ark., 2007; Ben-Jonathan ve ark., 2009). Bisfenol A nın primer endokrin bozukluğu yanında endojen östrojenlerin aktivitesinde azalma veya artma, ayrıca androjen sistem üzerine etkileri, tiroid hormon fonksiyonunda bozukluk, merkezi sinir sistemi fonksiyonunda farklılık ve immün sistemin baskılanması gibi etkileri sözkonusudur (Wetherill ve ark., 2007). Bisfenol A nın akut oral toksisitesinin belirlenmesi için yapılan bir çalışmada 5 er adet dişi ve erkek rata oral yolla 2000 mg/kg ve 5000 mg/kg miktarlarında bisfenol A verildiği belirtilmiştir. Bu çalışmada, bisfenol A nın 2000 mg/kg konsantrasyonunda ölüme neden olmadığı, 5000 mg/kg konsantrasyonunda erkeklerden 1 inin ve dişilerin hepsinin öldüğü ve sonuçta da dişilerin erkeklerden daha hassas olduğu belirtilmiştir. Diğer bir çalışmada ise erkek ve dişi farelerde bisfenol A nın akut oral toksisitesi araştırılmıştır. LD 50 değerinin erkek ve dişi fareler için sırasıyla 5200 ve 4100 mg/kg olduğu bildirilmiştir (ECB, 2003).

29 20 Bisfenol A'nın sekonder metabolik ve farmakokinetik etkileri sonucunda da endojen steroid hormonlarda biyoçeşitliliğin etkilendiği belirtilmiştir. Bu sekonder etkiler sonucunda sitokrom P450 enziminde modifikasyon meydana gelerek serum hormon bağlayıcı proteinlerde değişiklik meydana geldiği belirtilmiştir. Yapılan çok sayıdaki çalışma sonucunda bisfenol A'nın dişilerde fertiliteyi azalttığı ve oosit gelişiminde östrojeni baskıladığı bilinmektedir. Kronik olarak düşük dozlarda bisfenol A tüketimi fare oositlerinde mayotik anöploidiye neden olduğu ve sonuçta da bisfenol A'nın dişilerde mayozu bozduğu bildirilmiştir. Fakat bisfenol A'nın moleküler mekanizmasının tam olarak belirlenmesi için araştırmaların yapılması gerektiği belirtilmiştir (Wetherill ve ark., 2007) da ilk defa Dodds ve Lawson tarafından bisfenol A nın östrojenik aktivitesi farkedilmiştir (Rykowska ve Wasiak, 2006). Birçok araştırmacı bisfenol A'nın endokrin bozukluğuna neden olmasının görmezden gelinebileceğini bildirmektedir (Gray ve ark., 2004). Fakat yapılan çalışmalarda bisfenol A'nın annenin vücudundan fetusa geçebildiği, fetusun üreme organlarında anormalliklere neden olduğu ve davranış değişikliklerine neden olduğu belirtilmektedir. Böylece bisfenol A nın fetal periyot doğrultusunda insanları etkileyebildiği bildirilmiştir (Sajiki ve ark., 2007). Ayrıca Mielke ve Gundert-Remy (2009) yaptıkları çalışmada aynı miktarda bisfenol A ya maruz kalınması durumunda yenidoğanların kanındaki bisfenol A konsantrasyonunun yetişkinlere göre yüksek olduğunu bildirmişlerdir. Bunun nedeninin de yenidoğanlarda glukuronidasyon aktivitesinin henüz tam gelişmemesi ve bisfenol A nın sülfasyon yoluyla tam olarak yıkımlanmaması olduğunu belirtmişlerdir. Bisfenol A güçlü bir anti androjenik etki de göstermektedir. Bisfenol A'nın bazı hücre sistemlerinde androjen reseptör antagonisti olarak davrandığı ve endojen androjenlerin salınımını engellediği bildirilmektedir. Bunun yanında bisfenol A'nın prostat hacmini ve ağırlığını da arttırdığı, testosteron biyosentezini de % 25 oranında azalttığı ve tiroid hormon reseptörlerine karşı antagonist etki gösterdiği de bilinmektedir (Wetherill ve ark., 2007).

30 21 Takeuchi ve Tsutsumi (2002) yaptıkları çalışmada bisfenol A ya maruz kalmış sağlıklı erkek, sağlıklı kadın ve polikistik over sendromlu kadınların bisfenol A serum düzeylerini karşılaştırmışlardır. Sağlıklı erkeklerin serumlarındaki bisfenol A düzeyinin (1,49±0,11 ng/ml) sağlıklı kadınlara (0,64±0,10 ng/ml) göre yüksek olduğunu belirtmişlerdir. Ayrıca hiperandrogenizm ile karakterize olan polikistik over sendromlu kadınların serumlarındaki bisfenol A düzeyinin de (1,04± 0,10 ng/ml) sağlıklı kadınlara göre yüksek olduğunu bildirmişlerdir. Takeuchi ve ark., (2004) yaptıkları çalışmada bisfenol A ya maruz kalmış obez veya obez olmayan polikistik over sendromlu kadınların bisfenol A serum düzeylerinin sağlıklı kadınlardan daha yüksek olduğunu bildirmişlerdir. Bununla birlikte sağlıklı obez olmayan kadınların bisfenol A konsantrasyonlarının sağlıklı obez kadınlara göre daha yüksek olduğunu belirtmişlerdir. Bunun sonucunda da beden kitle indeksi ile bisfenol A düzeyleri arasındaki pozitif korelasyonun önemli olduğunu bildirmişlerdir. Ayrıca araştırmacılar bisfenol A düzeyleri ile testosteron ve androjen düzeyleri arasında da pozitif korelasyon olduğunu belirtmişlerdir. Amerika da kadınlardaki kısırlığın en yaygın formu polikistik over sendromudur. Amerikalı kadınların %5-10 unda polikistik over sendromu nedeniyle kısırlık görülmektedir (EWG, 2002). Hiroi ve ark., (2004) yaptıkları bir çalışmada yüksek konsantrasyonlardaki bisfenol A nın östrojen reseptörlerine bağlanarak östrojenik etki gösterebildiğini ve böylece endometriyal hiperplaziyi arttırdığını bulmuşlardır. Araştırmacılar bisfenol A ve östrojen bağlantılı hastalıklar arasında kompleks bir ilişki olduğunu bildirmişlerdir. Hanaoka ve ark., (2002) yaptıkları çalışmada ise işleri nedeniyle epoksi reçinelere maruz kalan erkeklerin, folikülü sitimule eden hormonlarının salınımının epoksi reçinelere maruz kalmayanlara göre düşük olduğunu bildirmişlerdir. Erkeklerde bu hormonun azalması sonucu sperm üretiminin düşmesiyle kısırlık oluşabilmektedir.

31 22 Ayrıca bisfenol A ya hava veya deri yoluyla temas nedeniyle maruz kalınması durumunda çeşitli olumsuz etkiler görüldüğü belirtilmiştir. Ev ortamındaki tozlardan dolayı bisfenol A ya maruziyet 707 ng/g a kadar ulaşabilmektedir. Solunum sistemi yoluyla kişi başına günde 0,008 μg ve 0,014 μg bisfenol A alınabilmektedir. Buna karşın gıdalarla alımı kişi başına günde 1,7 2,7 μg arasındadır. Bisfenol A ya mesleki nedenlerle maruz kalanlar dışında bütün yaş gruplarında temel bisfenol A kaynağı tüketilen gıdalardır (Dekant ve Völkel, 2008). Yenidoğanların gıdalarında bisfenol A miktarı 0,1-13,2 ppb düzeylerinde olabilmektedir. Bu maruziyet çocuklar açısından önemlidir. Bisfenol A nın 1 ng/l den az konsantrasyonlarda alınması östrojenik aktiviteyi etkileyebilmektedir (Rykowska ve Wasiak, 2006). Yüksek kaynama noktası ve düşük buharlaşma basıncına sahip olan bisfenol A nadiren buharlaşma gösterir. Dolayısıyla bisfenol A'nın inhalasyonu göz ardı edilmektedir (Staples ve ark., 1998). Fare ve ratlarda yapılan bir çalışmada 90 gün süresince inhalasyon yoluyla 150 mg/m 3 konsantrasyonunda bisfenol A alınması sonucunda karaciğer, böbrek ağırlığında artma ve önemsiz derece iltihaplanma görüldüğü belirtilmiştir (EC, 2002c). Estlander ve ark., (1999) yaptıkları çalışmada 10 yıldır gıda ürünleri ambalajlanmasında çalışan 44 yaşındaki bir kadının ellerini korumak için 4 yıl bisfenol A içeren PVC eldiven kullanımından sonra ellerinde egzema geliştiğinin belirlendiğini bildirmişlerdir. 1.8.Bisfenol A ile İlgili Yasal Düzenlemeler Ambalaj materyallerinden gıda maddelerine toksik maddelerin migrasyonu önemli bir sağlık sorunudur (Arvanitoyannis ve Bosnea, 2004). Avrupa Birliği düzenlemelerinde gıda ile temas halindeki materyallerin insan sağlığını tehlikeye atacak, gıdanın organoleptik özelliklerinin bozulmasına veya gıdada kabul

32 23 edilmeyecek niteliksel değişikliklere neden olacak miktarlarda gıda maddelerine geçmemesi gerektiği bildirilmektedir (EC, 1990). Bisfenol A ilk kez 1986 da Avrupa Birliği nin Bilimsel Gıda komitesi (Scientific Committee for Food-SCF) tarafından plastik materyallerde kullanımı ve gıda maddeleri ile temas halinde bulunması ile değerlendirilmeye alınmıştır. Aynı zamanda bu komite tarafından ratlar ve farelere 90 gün uygulanan deneyler sonucunda bisfenol A nın geçici olarak tolere edilebilir günlük alım miktarı (Tolerable Daily Intake-TDI) 0,01 mg/kg va/gün olarak bildirilmiştir. Ayrıca gıda maddelerinin tüketimi ile yetişkinlerin vücut ağırlığı baz alınarak günlük 0,00048 mg/kg ve çocukların ise 0,0016 mg/kg bisfenol A ya maruz kalabildikleri belirtilmiştir (EC, 2002a). Ambalaj materyalinden gıdaya geçen zararlı bileşiklerden tüketiciyi korumak amacıyla Avrupa Birliğinde plastik ambalajlama materyalleri için Avrupa Komitesi tarafından direktifler oluşturulmuştur. Bu konuyla ilgili ilk direktif 1976 yılında yayımlanmıştır. Bu direktifte Avrupa Birliğine üye ülkelerde uyulması gereken ve çeşitli toksik bileşiklerin limitlerinin analitik metotlarla belirlenmesi gerektiği belirtilmektedir (EC, 1990). Avrupa Birliğinin 90/128/EEC komisyon direktifinde toplam migrasyon limitleri belirtilmiştir. Toplam migrasyon limiti gıdalara ambalaj materyalinden geçen bileşiklerin toksikolojik etkilerine bakılmaksızın kontrol edilmesini sağlamakta ve spesifik migrasyonların azaltılması sonucunda gıda ile temasta olan ambalaj materyalinin kullanılmasının uygun olabileceğini belirtmektedir. Aynı zamanda bu direktifte bisfenol A nın plastik materyallerin yapımında monomer veya başlangıç maddesi olarak kullanılmasına izin verilmiştir. Gıda maddeleri ile teması sonucunda gıdada meydana gelecek migrasyonun spesifik limitinin 3 mg/kg olması gerektiği belirtilmiştir. (EC, 1990). Plastik materyaller ile ilgili bilgiler 2002 yılında Avrupa Birliği komisyonunun 2002/72/EC direktifiyle yeniden düzenlenmiştir. Bu direktifte gıda ile temas halinde

33 24 bulunan materyallerin yapımında kullanılan bütün monomerleri, başlangıç maddelerini ve katkı maddelerini içeren bir liste mevcuttur (EC, 2002b). Komisyonun 2002/72/EC direktifinde verilen listede kimyasalların gıda maddelerine migrasyon düzeylerinin sınırları da belirtilmiştir. Listede belirtilmeyen maddelerin kullanımı yasaktır. Bu yüzden, olası bir maddenin geçişinde insan sağlığının tehlikeye gireceği de bilinmelidir. Ayrıca listede özel migrasyon limitleri veya bazı monomerler için migrasyona uğrayan bileşikler üzerinde bir sınırlama getirilmiştir (Lau ve Wong, 2000). Gıda maddeleri ile temasta bulunan madde ve malzemeler ile ilgili 2002/72/EC sayılı komisyon direktifinde bisfenol A nın spesifik migrasyon limiti (SML) 0,6 mg/kg olarak belirtilmiştir (EC, 2002b). Bisfenol A'nın migrasyonu hakkında Amerika Gıda ve İlaç Dairesi (Food and Drug Administration-FDA) tarafından herhangi bir limit oluşturulmamıştır (Tsai, 2006). Türkiye de bisfenol A ilgili yapılan düzenlemeler Avrupa Birliği direktiflerine uyumludur. Türk Gıda Kodeksinin 2008/7 numaralı tebliği 2002/72/EC sayılı Gıda Maddeleri ile Temasta Bulunan Madde ve Malzemeler ile ilgili komisyon direktifi dikkate alınarak Avrupa Birliği ne uyum çerçevesinde hazırlanmıştır. Bu Tebliğ; son hali ile gıdaya temas edebilen veya etmesi tasarlanan, tamamen plastikten oluşmuş olan madde ve malzemeleri, çok katlı plastik madde ve malzemeleri ve iki veya daha fazla farklı plastik malzemenin bir araya gelmesiyle tıpalardaki contaları oluşturan plastik katlar veya plastik kaplamaları kapsar (TGK, 2008). Türk Gıda Kodeksinin sayılı resmi gazetede yer alan 2005/31 numaralı Gıda Maddeleri ile Temasta Bulunan Plastik Madde ve Malzemeler Tebliği nde bisfenol A nın spesifik migrasyon limiti (SML) 0,6 mg/kg olarak belirtilmiştir. Bu tebliğ daha sonra 2008 yılında sayılı resmi gazetede yer alan 2008/7 numaralı Gıda Maddeleri ile Temasta Bulunan Plastik Madde ve Malzemeler Tebliği nde Değişiklik Yapılması Hakkındaki Tebliğ ile düzenlenmiş fakat bisfenol A nın SML değeri değişmemiştir (TGK, 2005; TGK, 2008).