TEZ ONAYI Prof. Dr. Filiz ÖZÇELİK danışmanlığında, Simel BAĞDER tarafından hazırlanan bu çalışma 23/09/2008 tarihinde aşağıdaki jüri tarafından oybirl

Transkript

1 ANKARA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ TÜRKİYE DE DEĞİŞİK ŞARAP BÖLGELERİNDEN İZOLE EDİLMİŞ ŞARAP MAYALARININ TEKNOLOJİK ÖZELLİKLERİ Simel BAĞDER GIDA MÜHENDİSLİĞİ ANABİLİM DALI ANKARA 2008 Her hakkı saklıdır

2 TEZ ONAYI Prof. Dr. Filiz ÖZÇELİK danışmanlığında, Simel BAĞDER tarafından hazırlanan bu çalışma 23/09/2008 tarihinde aşağıdaki jüri tarafından oybirliği ile Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Gıda Mühendisliği Anabilim Dalı nda Türkiye de Değişik Şarap Bölgelerinden İzole Edilmiş Şarap Mayalarının Teknolojik Özellikleri konulu YÜKSEK LİSANS TEZİ olarak kabul edilmiştir. Danışman : Prof. Dr. Filiz ÖZÇELİK Jüri Üyeleri : Başkan : Prof. Dr. Filiz ÖZÇELİK, Ankara Üniversitesi Gıda Mühendisliği A.B.D. Üye : Doç. Dr. Ertan ANLI, Ankara Üniversitesi Gıda Mühendisliği A.B.D. Üye : Prof. Dr. Yeşim ÖZBAŞ, Hacettepe Üniversitesi Gıda Mühendisliği A.B.D. Yukarıdaki sonucu onaylarım Prof. Dr. Orhan ATAKOL Enstitü Müdürü

3 ÖZET Yüksek Lisans Tezi TÜRKİYE DE DEĞİŞİK ŞARAP BÖLGELERİNDEN İZOLE EDİLMİŞ ŞARAP MAYALARININ TEKNOLOJİK ÖZELLİKLERİ Simel BAĞDER Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Gıda Mühendisliği Anabilim Dalı Danışman: Prof. Dr. Filiz ÖZÇELİK Yerel, seçilmiş Saccharomyces cerevisiae suşlarının, şarap üretim bölgesinin iklim koşullarına ve substratlara daha iyi adapte olabilecekleri dikkate alınarak; bu çalışmada, önceki yıllarda, ülkemizin değişik şarap üretim bölgelerinden izole edilmiş, klasik biyokimyasal yöntemlerle tanımlamaları yapılmış ve maya kültür koleksiyonuna dahil edilmiş şarap mayalarının değerlendirilmesi ve şarap üretimi açısından önemli teknolojik özelliklerinin belirlenmesi amaçlanmıştır. Saccharomyces cinsine ait 10 adet yerel şarap mayası ve 1 adet referans ticari aktif kuru mayanın yüksek sıcaklıkta, düşük ph da ve yüksek şeker konsantrasyonunda gelişme, fermantasyon hızı, H 2 S üretimi, killer aktivite, yüksek etil alkole dayanıklılık, kükürt dioksite dayanıklılık, köpük oluşturma ve enzim profilleri gibi önemli bazı teknolojik özellikleri belirlenmiştir. Bu çalışma kapsamında incelenen tüm maya suşlarının 37 C de, 30 Brikste, ph 3.0 ve 4.0 te gelişebildikleri, 200 mg/l SO 2 ye dayanıklı oldukları; suşların % 60 ının zayıf, % 40 ının ise güçlü birer H 2 S üreticisi oldukları; fazla miktarda köpük oluşturdukları ve killer özellik göstermedikleri belirlenmiştir. Mayaların büyük çoğunluğunun % 14 (h/h) etil alkol konsantrasyonlarında gelişme ve fermantasyon yeteneğinde oldukları, besiyeri bileşimindeki şekerin neredeyse tamamını yüksek hızda fermente ederek, % (h/h) düzeylerinde etil alkol oluşturdukları tespit edilmiştir. Bir maya hariç, incelenen maya suşlarının şarap üretiminde kullanılmaları için uygun özelliklerde olmalarına karşın, enzimatik profilleri yönünden zayıf karakterde oldukları belirlenmiştir. Sonuç olarak; incelenen 10 yerel maya suşundan 9 tanesinin üstün teknolojik özellikler gösterdiği ve şaraplık olarak kullanıma uygun oldukları belirlenmiştir. Eylül 2008, 97 sayfa Anahtar Kelimeler: Saccharomyces cerevisiae, şarap fermantasyonu, endojen maya, teknolojik özellik i

4 ABSTRACT Master Thesis TECHNOLOGICAL PROPERTIES OF SOME WINE-YEAST STRAINS ISOLATED FROM DIFFERENT WINE REGIONS IN TURKEY Simel BAĞDER Ankara University Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Food Engineering Supervisor: Prof. Dr. Filiz ÖZÇELİK Local, selected S. cerevisiae strains are presumed to be better acclimated to micro-area conditions and substrates of the wine production region. In this study, it is purposed to evaluate the important technological properties of the wine yeast strains which had been previously isolated from different wine production regions of Turkey and identified by classical biochemical tests. Some important technological properties like ability to growth at high temperatures, low ph and high sugar concentration, fermentation rate, H 2 S production, killer activity, resistance to high ethyl alcohol and sulfur dioxide, foam production and enzymatic profiles of 10 local wine yeast strains belonging to the genus of Saccharomyces and one commercial active dry reference yeast strain were determined. All the yeast strains examined in this study were able to grow at 37 C, 30 Brix and ph 3.0 and 4.0; were resistant to high concentrations of sulfur dioxide. 60 % of the strains were weak H 2 S producers whereas the rest of them produced high level of H 2 S. They possessed high foam production. None of the strains had killer activity. Most of the strains had ability to growth and fermentation at concentrations of 14 % (h/h) ethyl alcohol, all the strains, except one, fermented almost all of the sugars in the media at high fermentation rate producing % (h/h) ethyl alcohol. Although all the strains, except one, had suitable characteristics for wine production, it was determined that they had little capacity of enzymatic activities. Consequently, of 10 local yeast strains, 9 strains were selected for their good oenological properties that showed their availability of use as wine starter culture. September 2008, 97 pages Key Words: Saccharomyces cerevisiae, wine fermentation, indigenous yeast, technological properties ii

5 TEŞEKKÜR Tezimin her aşamasında bilgi, öneri ve yardımlarını esirgemeyen, yakın ilgi ve desteğini gördüğüm danışman hocam Sayın Prof. Dr. Filiz Özçelik e ve desteklerini gördüğüm, her zaman yanımda olan sevgili aileme ve arkadaşım Özge Turfan a sonsuz teşekkürlerimi sunarım. Bu tez çalışması, TÜBİTAK tarafından desteklenen Türkiye de Değişik Şarap Üretim Bölgelerinden İzole Edilmiş Endojen Şarap Mayalarının Teknolojik Özelliklerinin Belirlenmesi ve Moleküler Yöntemlerle Tanımlanması konulu projenin bir bölümüdür. Simel BAĞDER Ankara, Eylül 2008 iii

6 İÇİNDEKİLER ÖZET... i ABSTRACT... ii TEŞEKKÜR... iii ŞEKİLLER DİZİNİ... vi ÇİZELGELER DİZİNİ... vii 1. GİRİŞ KAYNAK ÖZETLERİ Şarap Fermantasyonunun Mikrobiyolojisi Şarap Üretiminde Seçilmiş Yerel Mayaların Kullanımı Şarap Mayalarının Teknolojik Özellikleri Fermantasyon hızı Uçar asit oluşumu Yüksek sıcaklıkta gelişme Yüksek şeker konsantrasyonunda gelişme Düşük ph değerlerinde gelişme H 2 S üretimi Killer aktivite Köpük oluşumu Etil alkole dayanıklılık Kükürt dioksite dayanıklılık Enzim profilleri MATERYAL VE YÖNTEM Materyal Mikroorganizmalar Besiyerleri Yöntem Mayaların teknolojik özelliklerinin belirlenmesi Yüksek sıcaklıkta gelişme Düşük ph değerlerinde gelişme Yüksek şeker konsantrasyonunda gelişme Fermantasyon hızı H 2 S üretimi Killer aktivite Yüksek etil alkole dayanıklılık SO 2 ye dayanıklılık Köpük oluşturma Enzim profillerinin belirlenmesi Analizler Şıra analizleri ph Titrasyon asitliği iv

7 Briks Öksele derecesi İndirgen şeker Fermantasyon denemelerinde yapılan analizler Şeker tayini Etil alkol tayini Uçar asit tayini Hücre kuru ağırlığı ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Mayaların Teknolojik Özelliklerinin Belirlenmesi Yüksek sıcaklıkta gelişme Düşük ph değerlerinde gelişme Yüksek şeker konsantrasyonunda gelişme Fermantasyon hızı H 2 S üretimi Killer aktivite Yüksek etil alkole dayanıklılık SO 2 ye dayanıklılık Köpük oluşturma Enzim profillerinin belirlenmesi Fermantasyon Denemelerinde Yapılan Analizlerin Sonuçları Şeker tayini Etil alkol tayini Uçar asit miktarı Hücre kuru ağırlığı Fermantasyon sonunda hesaplanan kinetik parametreler Şarap Fermantasyonları İçin Uygun Mayaların Seçimi SONUÇ KAYNAKLAR EK 1 Şırada İndirgen Şeker Tayininde Kullanılan Çözeltilerin Hazırlanışı EK 2 Glikoz Standart Eğrisi EK 3 Farklı mayalarla gerçekleştirilen fermantasyonlar süresince izlenen ağırlık azalmalarına ilişkin veriler ÖZGEÇMİŞ v

8 ŞEKİLLER DİZİNİ Şekil 4.1 Fermantasyon süresince farklı maya suşları tarafından gerçekleştirilen ağırlık azalmaları Şekil 4.2 Fermantasyon süresince farklı maya suşları tarafından gerçekleştirilen ağırlık azalmaları Şekil 4.3 Maya suşlarının BIGGY Agar üzerindeki renklerine göre H 2 S üretme dereceleri Şekil 4.4 Seçilen bazı mayaların enzim profilleri Şekil 4.5 Etil alkol standart eğrisi Şekil 4.6 Farklı maya suşlarının oluşturdukları etil alkol miktarları Şekil 4.7 Şarap fermantasyonları için uygun mayaların seçiminde kullanılan teknolojik kriterler vi

9 ÇİZELGELER DİZİNİ Çizelge 3.1 Çalışmada kullanılan maya suşları Çizelge 3.2 API-ZYM sonuçlarının değerlendirilmesinde kullanılan skala Çizelge 4.1 Maya suşlarının 37 ve 42 C de gelişme durumları Çizelge 4.2 Maya suşlarının düşük ph değerlerinde gelişme yetenekleri Çizelge 4.3 Maya suşlarının fermantasyon hızları Çizelge 4.4 Maya suşlarının H 2 S üretme dereceleri Çizelge 4.5 Maya suşlarının killer aktivite sonuçları Çizelge 4.6 Maya suşlarının duyarlılık testi sonuçları Çizelge 4.7 Maya suşlarının farklı etil alkol konsantrasyonlarında gelişme ve fermantasyon yetenekleri Çizelge 4.8 Maya suşlarının farklı SO 2 konsantrasyonlarında gelişme yetenekleri Çizelge 4.9 Hasandede şırasında gerçekleştirilen analizlerin sonuçları Çizelge 4.10 Maya suşlarının köpük oluşturma dereceleri Çizelge 4.11 Maya suşlarının API-ZYM test sistemi ile belirlenen enzim profilleri Çizelge 4.12 Farklı maya suşları ile gerçekleştirilen fermantasyon denemelerinin başlangıcında ve sonunda belirlenen D-glikoz miktarları Çizelge 4.13 Farklı maya suşları ile gerçekleştirilen fermantasyon denemelerinin başlangıcında ve sonunda belirlenen etil alkol miktarları Çizelge 4.14 Maya suşlarının fermantasyon sonunda oluşturdukları % (h/h) cinsinden etil alkol miktarları Çizelge 4.15 Maya suşlarının fermantasyon sonunda oluşturdukları uçar asit miktarları Çizelge 4.16 Maya suşlarının fermantasyon saflık değerleri Çizelge 4.17 Farklı maya suşları ile gerçekleştirilen fermantasyon denemelerinin başlangıcında ve sonunda belirlenen hücre kuru ağırlık miktarları Çizelge 4.18 Fermantasyon sonunda hesaplanan kinetik parametreler vii

10 1. GİRİŞ Ülkemiz yaklaşık 525 bin hektar bağ alanında, yılda yaklaşık 3.5 milyon ton üzüm üretimi gerçekleştirmektedir. Üretilen üzümlerin % 30 u sofralık, % 37 si kurutmalık, % 30 u pekmez, pestil, sucuk, şıra ve % 3 ü ise şaraplık olarak değerlendirilmektedir. Türkiye, dünya yaş üzüm üretiminde İtalya, Fransa, ABD ve İspanya dan sonra 5. sırada yer almaktadır. Dünya üzüm üretiminin % 64.3 ü şaraba işlenirken, % 7.6 sı kurutmalık ve % 20.9 u sofralık olarak değerlendirilmektedir (Anonim 2003). Ülkemiz bağ alanı ve üretilen üzüm miktarı bakımından üst sıralarda yer almasına karşın, şarap üretiminde gereken düzeylere ulaşılamamasının nedeni, şarabın iç tüketiminin az olması ve dış satımın düşük düzeylerde olmasından kaynaklanmaktadır. Dış satımı arttırmanın en önemli şartı da kaliteli ve standart özellikte ürün üretmektir (Şahin 1982). Şarap kalitesi, üretimde kullanılan üzümün bileşimi, işleme yöntemleri, fermantasyon ve dinlendirme koşullarına bağlı olmakla birlikte, şarabın bileşimi ve kalitesinde rol oynayan en önemli etken fermantasyonda kullanılan mayadır. Çünkü kaliteyi olumlu ya da olumsuz yönde etkileyen şarabın bileşimindeki maddeler, ya üzüm kökenlidir ya da fermantasyon süresince şarap mayaları tarafından oluşturulmaktadırlar (Şahin 1982). Yakın zamana kadar, şarap fermantasyonu üzümlerde ve şaraphanelerde bulunan endojen mayalar tarafından, doğal fermantasyon yolu ile gerçekleştirilmekteydi. Günümüzde, şarap üretiminin çoğunluğu hızlı, güvenilir fermantasyonu garantileyen ve mikrobiyel kontaminasyon riskini azaltan aktif kuru maya kullanımı ile gerçekleştirilmektedir (Orlić et al. 2005). Ticari olarak kullanılan S. cerevisiae kuru maya kültürleri, yüksek maya populasyonu sağlamak ve şıra fermantasyonunu kontrollü koşullarda gerçekleştirmek amacıyla, üzüm şırasına inoküle edilmektedir. Ancak; seçilmiş, yerel S. cerevisiae suşlarının starter kültür olarak kullanımı tercih edilmektedir. Çünkü; bu mayalar şarap üretim bölgesinin iklim koşullarına daha iyi uyum sağlamakta ve kolaylıkla baskın hale gelebilmektedirler. Seçilmiş yerel mayaların kullanımı, yalnızca kontrollü bir 1

11 fermantasyon sağlamak için değil, aynı zamanda şarap üretim bölgesine özgü tipik duyusal özelliklere sahip yöresel şarapların üretimine olanak sağlaması açısından da özel bir öneme sahiptir (De Cos et al. 1998, Orlić et al. 2005). Seçilen maya suşlarının, endüstriyel şarap üretimi için önemli bazı teknolojik özellikleri taşımaları gerekmektedir. Şarap üretiminde kullanılacak olan mayaların sahip olmaları gereken başlıca teknolojik özellikler; yüksek fermantasyon hızı, yüksek şeker ve alkol konsantrasyonuna dayanıklılık, farklı sıcaklık derecelerinde gelişebilme, düşük ph düzeyinde gelişebilme, az köpük oluşturma, yüksek düzeyde etil alkol üretimi, düşük seviyede uçar asit oluşturma, şarap endüstrisinde kullanılan çeşitli koruyucu maddelere (SO 2, potasyum sorbat gibi) karşı dayanıklılık, killer aktiviteye sahip olma ya da etkilenmeme, düşük miktarda asetaldehit üretimi ve iyi bir enzimatik profile sahip olmasıdır (Esteve-Zarzoso et al. 2000, Nikolaou et al. 2006). Şarap kalitesini geliştiren, yüksek fermantasyon gücüne sahip maya suşlarının seçimi; fermente olmuş şıradaki maya türlerinin izolasyonu, bu maya türlerinin tanımlanması ve sahip oldukları teknolojik özellikler göz önünde bulundurularak en uygun mayaların seçimi gibi bazı aşamaları gerektirmektedir (Pérez-Coello et al. 1999). Bu çalışmanın temel amacı; önceki yıllarda yapılmış çalışmalarda, ülkemizin değişik şarap üretim bölgelerinden izole edilerek klasik yöntemlerle tanımlanmaları yapılmış ve maya kültür koleksiyonuna dahil edilmiş şarap mayalarını değerlendirmek ve şarap üretimi açısından önem taşıyabilecek teknolojik özelliklerini netleştirmektir. 2

12 2. KAYNAK ÖZETLERİ 2.1 Şarap Fermantasyonunun Mikrobiyolojisi Şarap üretimi, dünyanın en eski biyoteknolojik proseslerinden biridir. Alkol fermantasyonunda üzüm şekerlerinin etil alkole dönüşümü Saccharomyces cinsine ait mayalar tarafından gerçekleştirilmektedir. Şarap fermantasyonları, seçilmiş mayalarla ya da üzümlerin yüzeyinde ve şaraphanelerde bulunan doğal flora ile gerçekleştirilmektedir. Saccharomyces ın iki türü olan S. cerevisiae ve S. bayanus mayaları şarap fermantasyonlarında yaygın olarak bulunmaktadırlar (Bisson 2004). S. cerevisiae, yüksek şeker ve düşük azot içeriği ile karakterize edilen üzüm suyunda gelişebilme yeteneğinden ötürü, alkol fermantasyonundan sorumlu temel maya türü olarak kabul edilmektedir. S. cerevisiae türleri yüksek miktarda etil alkol üreterek, Saccharomyces dışındaki mayaların gelişimini inhibe etmekte ve şıra fermantasyonu boyunca baskın hale gelmektedirler (Cocolin et al. 2004). Şarap fermantasyonları kompleks ekosistemler olup; başlangıçta Hanseniaspora, Candida ve Pichia spp. gibi Saccharomyces dışındaki mayaların gelişmesi ve daha sonra üzüm şırasını hızlı ve etkili bir şekilde fermente etme yeteneğine sahip, etil alkol ve SO 2 ye dayanıklı ve yüksek sıcaklıklarda canlı kalabilen S. cerevisiae nın ortama hakim olması ile tanımlanmaktadır (Cocolin et al. 2004). Olgun ve sağlam üzümlerin, genel olarak, kob/g düzeyinde mikrobiyel populasyona sahip olduğu ve bu populasyonun başta mayalar olmak üzere çeşitli laktik ve asetik asit bakterilerinden oluştuğu kabul edilmektedir. Alkol fermantasyonunda, diğer mikroorganizmaların gelişmeleri mayaların gelişmeleri ile baskılanmaktadır; çünkü mayalar, şıranın düşük ph değerlerinde ( ) hızla gelişip etil alkol üreterek, küflerin ve bakterilerin gelişimini inhibe etmektedirler (Fleet 1999). Asıl şarap mayası olan S. cerevisiae sağlam üzümlerde baskın maya türü olmayıp, üzüm florasında 50 kob/g den daha düşük konsantrasyonlarda bulunmaktadır. Bu nedenle, S. 3

13 cerevisiae nın şarap fermantasyonunda nasıl baskın mikroorganizma konumuna geldiği konusundaki sorular artmaktadır. Yağış miktarı, sıcaklık, üzüm çeşidi, tanenin olgunluğu, tanenin salkımdaki yeri, kuş, böcek, küf saldırısı nedeniyle fiziksel hasar, fungisit, insektisit vb. tarımsal ilaçların uygulanması gibi üzüm tanelerinin yüzeyindeki mikroorganizmaların oluşumunu ve gelişimini etkileyen pek çok iç ve dış faktörler bulunmaktadır. Ayrıca; üzümlerin dış yüzeyini kaplayan mumsu katman da, mikrobiyel hücrelerin üzüm yüzeyine tutunma yeteneklerini etkilemektedir. Elektron mikroskobu taramaları, üzüm tanesinin yüzey katmanının hasar gördüğü bölgelerde maya hücrelerinin daha yoğun bulunduğunu göstermektedir (Fleet 1999). Mayalar şarap fermantasyonunun anahtar özellikteki mikroorganizmaları olup, çeşitli şekillerde şarap kalitesini etkilemektedirler. Birincisi ve en önemlisi; alkol fermantasyonu ile etil alkol üretmelerinin yanı sıra yüksek alkoller, organik asitler, esterler, aldehitler, ketonlar ve sülfür bileşikleri gibi diğer bileşikleri de düşük miktarlarda oluşturmalarıdır. İkinci olarak; istenmeyen maya türlerinin üzüm şırası ya da şarapta gelişmeleri, şarapların bozulmasına ya da arzulanmayan özellikler kazanmalarına neden olabilmektedir. Ayrıca; fermantasyon sonunda otolize olarak hücre içi bileşenlerinin bazılarını şaraba aktarırlar. Bu bileşenler, sadece şarabın flavorunu etkilemekle kalmaz, aynı zamanda malolaktik ve bozulma etkeni bakterilerin gelişimini de teşvik edebilirler (Fleet 1990). Taze sıkılmış üzüm şırası, hücre/ml düzeyinde maya içermektedir. Bu mayalar, üzümlerin yüzeyinden ve üzüm suyu ile temas eden şaraphane ekipmanlarının (presler, pompalar, tanklar) yüzeyinden gelen türlerin bir karışımından oluşmaktadır. Alkol fermantasyonu tamamlandığında, maya sayısı yaklaşık kez artış göstererek, hücre/ml ye ulaşmaktadır (Fleet 1990). 4

14 2.2 Şarap Üretiminde Seçilmiş Yerel Mayaların Kullanımı Şarap fermantasyonunda saf maya kullanılması, spontan fermantasyonlardaki istenmeyen mikroorganizmaların gelişmelerinden kaynaklanabilecek olumsuzlukları büyük ölçüde engellemektedir. Tüm şarap mayalarının oluşturdukları fermantasyon ürünleri cins ve miktar olarak aynı değildir ve şarap kalitesine etkileri de farklıdır. Bu nedenle, kaliteli şarap üretimi için saf maya kültürü kullanılmasının yanı sıra, arzulanan kaliteye uygun şarap mayalarının belirlenip uygulamaya alınması, mutlaka gerçekleştirilmelidir (Özçelik ve Denli 1999). Saflaştırıldıktan sonra karakterize edilerek, kültür koleksiyonuna katılan mayalar ile üretilen şarapların kalitesinin, spontan fermantasyon yolu ile üretilenlerden daha iyi olduğu ifade edilmektedir. Son yıllarda, İspanya gibi geleneksel şarap üretimi yapan ülkelerde, kontrollü şıra fermantasyonu için özel olarak seçilmiş, yerel maya türlerinin kullanımında artış olduğu vurgulanmaktadır. Fermantasyon amacıyla ticari şarap mayalarının da kullanılabilmesine rağmen, uygun özelliklere sahip yerel maya türlerinin seçilmesiyle, belirli bir bölge üzümlerinden tipik duyusal nitelikler taşıyan şarapların üretilebileceği belirtilmektedir. Ticari aktif kuru S. cerevisiae maya suşlarının üzüm şırasına inoküle edilmesiyle, fermantasyonda yüksek maya populasyonu sağlanabilir ve kontrollü bir şıra fermantasyonu başarılabilir. Ancak; yerel seçilmiş S. cerevisiae suşlarının şarap üretim bölgesindeki iklim koşullarına çok iyi adapte olabilmeleri ve kolaylıkla floraya hakim olabilmeleri nedeniyle, şarap fermantasyonunda ticari mayalar yerine yerli maya türlerinin kullanılması daha iyi önolojik özelliğe sahip şarapların üretilmesi açısından önem taşımaktadır (Regodon et al. 1997, Nikolaou et al. 2006, Lopes et al. 2007). Nurgel (2000) Emir ve Kalecik Karası üzümlerinin şaraba işlenmesinde maya florasındaki gelişmeleri incelemiş; bunlar arasından seçilen endojen mayaların, starter olarak kullanılmaları durumunda, şarap kalitesi üzerine etkilerini araştırmıştır. Kültür mayaları kullanılan şaraplarda fermantasyonun daha kısa sürede tamamlandığı, 5

15 şaraplarda belirlenen aroma bileşenleri üzerinde kullanılan maya suşlarının önemli etkilerinin olduğu belirlenmiştir. Nikolaou et al. (2006) tarafından yapılan çalışmada, 84 adet S. cerevisiae maya suşu içerisinden önolojik kriterlere göre 6 adet maya suşu seçilmiş ve bu mayalarla yapılan fermantasyon denemelerinde, üretilen şarapların meyvemsi karakterinin yüksek olduğu ve panelistler tarafından beğenildiği ifade edilmiştir. Bu çalışmada, arzulanan özelliklerde şarap üretimi için seçilmiş mayaların kullanılmasının gerekliliği vurgulanmıştır. Regodon et al. (1997) endüstriyel maya seçimi için, SO 2 ye dayanıklılık, killer K 2 fenotipinin varlığı, 42 C de gelişme, köpük oluşumu, uçar asit, etil alkol üretimi ve kalıntı şeker miktarı gibi, mayaların bazı ölçülmesi kolay teknolojik özelliklerinin belirlenmesine dayalı, basit ve etkili bir prosedür yoluyla, İspanya daki Extremadura şarap bölgesinden izole ettikleri 86 adet yerel S. cerevisiae suşundan 9 tanesini seçmişlerdir. Seçtikleri 9 adet yerel maya suşunun 6 tanesinin (% 66.6) spontan fermantasyondan daha iyi özellikte şaraplar ürettiğini belirtmişlerdir. Bu mayaların 3 tanesinin, deneme kapsamındaki ticari mayaların en iyilerine kıyasla, daha çok beğenilen şaraplar ürettiğini ifade etmişlerdir. 2.3 Şarap Mayalarının Teknolojik Özellikleri Seçilmiş şarap mayaları, endüstriyel şarap üretimi için uygun olmalarını sağlayacak bazı teknolojik özelliklere sahip olmalıdırlar. Teknolojik özelliklerin belirlenmesi, fermantasyon prosesinin verimliliği açısından oldukça önemlidir. Teknolojik özelliklerin birçoğu maya suşları içinde büyük oranda farklılık göstermektedir. Bu nedenle, tüm izolatlardaki teknolojik özellikler mutlaka belirlenmelidir (Lopes et al. 2006). Şarap mayalarında aranan en önemli teknolojik özellikler şunlardır; düşük seviyede uçar asit oluşturmalı, yüksek alkol konsantrasyonuna dayanıklı olmalı, şıradaki şeker miktarına uyumlu oranda etil alkol oluşturmalı, 6

16 şekerin tamamını fermente etmeli, fermantasyon hızı yüksek olmalı, yüksek sıcaklıkta gelişebilmeli, kükürt dioksite dayanıklı olmalı, düşük seviyede kükürt dioksit oluşturmalı, düşük seviyede hidrojen sülfür oluşturmalı, düşük seviyede köpük oluşturmalı, fermantasyondan sonra kolayca dibe çökmeli, killer fenotipe sahip olmalı ya da killer mayalardan etkilenmemeli, düşük seviyede asetaldehit oluşturmalı, yeterli seviyede gliserol oluşturmalı, sınırlı seviyede yüksek alkol oluşturmalı (Pamir 1985, Reed and Nagodawithana 1988, Regodon et al. 1997, Özçelik ve Denli 1999, Nikolaou et al. 2006) Fermantasyon hızı Herhangi bir şarap mayasının seçiminde kullanılan en önemli kriter fermantasyon hızıdır (Reed and Nagodawithana 1988). Şarap mayalarının arzulanmayan mikroorganizmaların gelişmelerine fırsat vermeden hızla fermantasyona başlamaları ve belli bir zaman içerisinde fermantasyonu tamamlamaları ve şırada bulunan fermente olabilen şekerlerin tümünü fermente edebilme yeteneğine sahip olmaları istenmektedir (Özçelik ve Denli 1999, Esteve-Zarzoso et al. 2000). Fermantasyon hızı, fermantasyon süresince oluşan etil alkol ya da CO 2 in izlenmesiyle belirlenebilmektedir (Reed and Nagodawithana 1988). Aynı zamanda, şekerin zamana bağlı olarak azalması da değerlendirilerek fermantasyon hızı belirlenebilmektedir (Özçelik ve Denli 1999, Nurgel 2000). Iranzo et al. (1998), araştırdıkları 74 Saccharomyces suşunun % 69 unun 0.25 g CO 2 /L.h ten daha yüksek fermantasyon hızına sahip olduklarını göstermişler ve

17 değerinin uygun fermantasyon hızı olarak kabul edilmesi nedeniyle, bu suşların şarap üretimi için uygun olabileceğini belirtmişlerdir. Pérez-Coello et al. (1999), La Mancha bölgesindeki şıralardan izole ettikleri 174 Saccharomyces cerevisiae suşunun 143 tanesinin 0.2 g CO 2 /L.h den yüksek fermantasyon hızına sahip olduklarını belirlemişler; kalan 31 tane maya ise, 0.2 g CO 2 /L.h den düşük fermantasyon hızına sahip olduğundan, diğer teknolojik özelliklerine bakılmaksızın, çalışmadan çıkarılmıştır. Bu çalışmada fermantasyon hızı, 24 ve 72. saatler arasında oluşan g/l cinsinden CO 2 miktarı olarak belirlenmiştir. Orlić et al. (2005), test ettikleri S. cerevisiae suşlarının yüksek fermantasyon gücüne sahip olduklarını ve günde 2.0 g/l den daha fazla CO 2 ürettiklerini belirlemişlerdir. Regodon et al. (1997) tarafından belirtilen kritere göre, şarap mayalarının % 8 den daha yüksek konsantrasyonda etil alkol üretmesi ve fermantasyon sonundaki kalıntı şeker miktarının 4 g/l den düşük olması gerekmektedir. Seçilmiş şarap mayaları ile yaptıkları fermantasyon denemeleri sonunda, kalıntı şeker miktarını 1-4 g/l aralığında ve etil alkol miktarını ise % (h/h) olarak bulmuşlardır. Budroni et al. (2006) tarafından yerel şarap mayalarının teknolojik özelliklerini belirlemeye yönelik yapılan bir çalışmada, incelenen suşların % 75 inin % (h/h) düzeyinde etil alkol ürettiklerini ve suşların % 50 sinin fermantasyonun ilk 3 gününde, günde g CO 2 aralığında fermantasyon hızı gösterdiği belirtilmiştir. Bu veriler, test edilen yerel mayaların yüksek fermantasyon gücüne sahip olduklarını ve hızlı gelişme yeteneğinde olup, arzulanmayan doğal florayı baskılayabildiklerini göstermektedir. Nikolaou et al. (2006) tarafından yapılan çalışmada, test edilen mayalar arasında 17 maya suşunun, şekeri 4 g/l nin altına düşecek düzeyde fermente ettiği ve fermantasyonun başlangıç evrelerinde 0.2 g/l CO 2 den daha yüksek düzeyde bir fermantasyon hızı gösterdiği belirtilmiş, düşük kalıntı şeker miktarının fermantasyonun 8

18 tamamlandığının bir göstergesi olduğu ifade edilmiştir. Fermantasyon hızı, fermantasyon koşullarına bağlı olarak çok fazla değişkenlik gösterebileceğinden, mayaların fermantasyon hızı kontrollü koşullarda belirlenmelidir. Bu nedenle; mayanın aşılama oranı, besiyeri ve fiziksel koşulların standart ve en uygun düzeylerde olması gereklidir (Nurgel 2000). Şarap fermantasyonun hızı, fermantasyonun başlangıç evrelerinde aşılama miktarına bağlıdır. Ancak; fermantasyonun ilerleyen evrelerinde, saatte oluşan CO 2 miktarı başlangıçtaki aşılama oranı ile ilgili olmayıp, mayaya bağlıdır (Reed and Nagodawithana 1988). İstenilen fermantasyon hızına ulaşabilmek için en önemli etken, uygun mayanın seçilmesidir. Ancak, hızlı fermantasyon sırasında açığa çıkan CO 2 gazı ile birlikte aroma kaybının da fazla olacağı göz önünde bulundurularak, bazı aromatik şarapların üretiminde fermantasyon hızı düşük mayalar tercih edilebilmektedir (Özçelik ve Denli 1999). Maya türünün dışında, etil alkol konsantrasyonu, ph, sıcaklık, CO 2 basıncı, şıranın briksi ve maya besinlerinin veya inhibitörlerinin varlığı gibi pek çok değişken de fermantasyon hızını önemli ölçüde etkilemektedir (Reed and Peppler 1973). Mayaların gelişme ve fermantasyon yetenekleri birbirleriyle korelasyon göstermeyebilir. Endüstride istenilen şarap mayalarında, fermantasyon hızının yüksek, gelişme hızının daha zayıf olması tercih edilmektedir (Benítez et al. 1983). Besin maddelerinin sınırlı olması, etil alkol toksisitesi, organik ve yağ asidi toksisitesi, killer aktivitenin ya da mikroorganizmalar tarafından üretilen diğer toksinlerin varlığı, katyon dengesizliği, çok yüksek sıcaklık, pestisit ve fungisit kalıntıları, mikrobiyel yarış ve hatalı teknolojik uygulamalar (aşırı SO 2 kullanımı, aşırı şıra durultması, yetersiz havalandırma, yetersiz sıcaklık kontrolü) gibi birçok faktörün fermantasyon hızını etkilediği belirtilmektedir. Bu faktörler sinerjik olarak birbirini etkilemektedir; yani faktörlerin birleşik etkisi, herhangi bir faktörün tek başına etkisinden daha fazla inhibe 9

19 edicidir. Örneğin; minimum ve maksimum gelişme sıcaklıkları etil alkol, organik asitler ve yağ asitleri varlığında değişmektedir (Bisson 1999). Yavaş veya tamamlanmamış alkol fermantasyonları, şarap endüstrisi için ciddi bir sorundur. Tamamlanmamış fermantasyon terimi, alkol fermantasyonunun sonunda şarapta istenen kalıntı şeker miktarından daha fazla şekerin kaldığı fermantasyonlar için kullanılmaktadır. Kalıntı şeker miktarı % 0.4 ten (4 g/l glikoz+fruktoz) düşük fermantasyonlar, şarap üreticileri tarafından tamamlanmış fermantasyon ve ürün de sek şarap olarak tanımlanmaktadır. Ancak; fermantasyonun bitimindeki son şeker konsantrasyonu, tipik olarak, % 0.2 nin altındadır. Yavaş veya tamamlanmamış bir fermantasyonda, arzulanan düşük kalıntı şeker miktarına ulaşmak için, ortalamadan daha uzun bir süreye gereksinim duyulmaktadır. Normal bir fermantasyonun, sıcaklığa bağlı olarak, genellikle 7-10 günde tamamlanmasına karşın, yavaş fermantasyonlar daha uzun, hatta aylarca sürebilmektedir. Fermantasyon sonrası yüksek şeker içeren şaraplar, mikrobiyel bozulmaya daha elverişli olup; bu şaraplar, mikrobiyel stabilitelerinden emin olunmadan şişelenmemelidir (Bisson 1999) Uçar asit oluşumu Uçar asitler, alkol fermantasyonu ve dinlendirme sırasında oluşmaktadırlar. Şaraptaki uçar asidin önemli bir kısmını asetik asit oluşturmakta, az miktarlarda propiyonik, formik, süksinik asitler de bulunmaktadır. Fermantasyon sonucunda oluşan uçar asit miktarı maya suşuna, şıranın bileşimine (asit, şeker, azotlu madde miktarı) ve fermantasyon koşullarına (sıcaklık, oksijen) bağlı olarak değişmektedir (Filiz 2005). Şarap mayalarının seçiminde esas alınan önemli özelliklerden biri de, mayaların oluşturdukları uçar asit miktarıdır. Şaraplarda yüksek konsantrasyonlarda asetik asit bulunması, sirke tadının oluşmasına sebep olabilmektedir. Asetik asidin duyusal özelliklere olumsuz etkisinden dolayı, şarap fermantasyonu boyunca oluşumu, kesinlikle istenmemektedir (Sipiczki et al. 2001). S. cerevisiae tarafından oluşturulan asetik asit düzeyi, normalde g/l dir (Orlić et al. 2005, Nikolaou et al. 2006). 10

20 Genellikle, 0.6 g/l den yüksek asetik asit konsantrasyonu hoşa gitmeyen olarak nitelendirilmektedir (Ooi et al. 2008). Regodon et al. (1997), şarap üretiminde kullanılacak olan mayaların 0.8 g/l den daha az düzeyde uçar asit oluşturması gerektiğini ileri sürmüşler ve yaptıkları çalışmada mayaların g/l arasında uçar asit oluşturduklarını belirlemişlerdir. Giudici and Zambonelli (1992), asetik asit üretiminin S. cerevisiae suşlarının kalıtsal bir özelliği olduğunu ve suşlara bağlı olarak değişkenlik göstererek, g/l aralığında değiştiğini belirtmişlerdir. Shinohara et al. (1994) tarafından yapılan bir çalışmada, fermantasyon sonunda g/l arasında uçar asit oluştuğu bildirilmiştir. Antonelli et al. (1999), 9 adet S. cerevisiae ve 4 adet S. bayanus suşunun şarabın uçucu bileşenlerine etkisini araştırdıkları çalışmada, tüm S. bayanus suşlarının düşük miktarlarda asetik asit üretirken, bazı S. cerevisiae suşlarının incelenen tüm maya suşları içerisinde en yüksek asetik asit konsantrasyonuna (0.38, 0.58 g/l gibi) ulaştıklarını belirtmişlerdir. S. cerevisiae ve S. bayanus tan üretilen şaraplarda g/l aralığında uçar asit ve g/l aralığında asetik asit bulunduğunu belirlemişlerdir. Esteve-Zarzoso et al. (2000) tarafından 5 adet yerel S. bayanus suşu ile gerçekleştirilen küçük çaplı fermantasyonlarda, uçar asidin g/l civarında olduğu; 17 adet yerel S. cerevisiae suşu ile gerçekleştirilen fermantasyonlarda ise, uçar asidin g/l aralığında olduğu belirlenmiştir. Bu mayalar arasından seçilen 3 adet S. cerevisiae suşu ile gerçekleştirilen endüstriyel ölçekli kırmızı şarap denemelerinde 0.75, 0.98, 0.64 g/l düzeylerinde; beyaz şarap denemelerinde ise 0.18, 0.59, 0.13 g/l düzeylerinde uçar asit oluşumu belirlenmiştir. Orlić et al. (2005), Kutjevo şarap bölgesinden izole ettikleri 23 adet S. cerevisiae 11

21 mayası ile yaptıkları fermantasyon denemeleri sonucunda, oluşan uçar asit miktarlarının g/l düzeyinde olduğunu belirtmişlerdir. Ooi et al. (2008), inceledikleri S. cerevisiae şarap mayası suşlarının g/l düzeyinde asetik asit ürettiklerini belirlemişlerdir Yüksek sıcaklıkta gelişme Şarap mayalarının optimum gelişme sıcaklığı C dir. 30 C nin altındaki sıcaklıklarda fermantasyon hızları yavaşlamakta, ancak 7-8 C de bile, yavaş da olsa, fermantasyon yapabilmektedirler. 40 C nin üzerindeki sıcaklıklarda ise, fermantasyon yeteneklerini büyük ölçüde kaybetmektedirler (Özçelik ve Denli 1999). Fermantasyon sıcaklığı, fermantasyon halindeki şıranın mikrobiyel ekolojisini ve mayaların biyokimyasal reaksiyonlarını, doğrudan etkilemektedir. Saccharomyces dışındaki mayaların, düşük sıcaklıklarda etil alkole dayanıklılıkları arttığından, bu sıcaklıklarda, Saccharomyces ten daha iyi gelişme gösterdikleri belirtilmektedir. Bu mayaların alkol fermantasyonu süresince dayanıklılıkları da, fermantasyon sıcaklığına bağlıdır. Maya populasyonu içerisindeki türlerin farklılığı, şarabın kimyasal ve duyusal kalitesini etkilemektedir. Sıcaklığın maya metabolizmasını ve bunun bir sonucu olarak da gliserol, asetik asit, süksinik asit gibi ikincil metabolitlerin oluşumunu etkilediği belirtilmektedir (Torija et al. 2003). Şarap fermantasyonu boyunca, önemli miktarda ısı açığa çıkmakta ve soğutma uygulanmaz ise, ortamda 5-10 C lik bir sıcaklık artışı görülebilmektedir (Nurgel 2000). 37 C ye kadar çıkabilen yüksek sıcaklık, hem mayanın aktivitesini hem de şarabın kalitesini olumsuz etkilemektedir. Düşük sıcaklıklarda, şarabın meyvemsi karakterini ve fermantasyon bukesini belirleyen ester ve asetaller daha fazla oluşmaktadır (Kunkee 1984). 12

22 29 C civarında fermantasyon iyice yavaşlamakta, daha yüksek sıcaklıklarda (37 C) ise fermantasyon tamamen durabilmektedir (Fugelsang and Edwards 2007). Sıcaklığın, S. cerevisiae nın etil alkol toleransı üzerinde önemli bir etkisi bulunmaktadır. Yüksek sıcaklıklarda, özellikle 20 C nin üzerindeki sıcaklıklarda, S. cerevisiae nın etil alkole karşı duyarlılığı artmaktadır. Düşük sıcaklıklarda, etil alkole dayanıklılığı artmakta; ancak, sıcaklık 5 C nin altına düştüğünde, maya strese girerek tekrar etil alkole duyarlı hale gelmektedir. Bu reaksiyonlar, sıcaklık ve etil alkolün hücre membranı lipitlerinin biyolojik fonksiyonu üzerindeki birleşik etkisinden kaynaklanmaktadır (Heard and Fleet 1988, Nurgel 2000). Bu nedenle; yüksek alkol ve yüksek sıcaklık koşullarında fermantasyonun tamamlanabilmesi için, sıcağa dayanıklı mayaların seçimi oldukça önemlidir. Şarap fermantasyonu ekzotermik bir reaksiyon olup, fermantasyon sırasında önemli miktarda sıcaklık oluşmaktadır. Oluşan bu sıcaklığın bir kısmı giderek kaybolmakta veya zararlı etkisi olmaksızın, ortama dağılmaktadır. Ancak; yüksek hacimli fermantasyon kaplarında bu sıcaklığın çoğu korunarak, şarabın sıcaklığını yükseltmektedir. Örneğin; başlangıç sıcaklığı 20 C olduğunda, sıcaklık 10 C veya daha fazla artarak 30 C nin üzerine çıkabilmektedir. Bu sıcaklık değerleri, mayanın inhibe olmasına ya da gelişmesinin tamamen durmasına neden olabilmektedir. Böyle tamamlanmamış fermantasyonlarda, şarap daha düşük etil alkol ve daha yüksek kalıntı şeker içermektedir. Bu nedenle, fermantasyonda uygun sıcaklığın sağlanması zorunludur (Hutkins 2006). Charoenchai et al. (1998), 22 adet Kloeckera apiculata, Torulaspora delbrueckii, Pichia anomola, çeşitli Candida türleri ve S. cerevisiae şarap mayası suşları ile yaptıkları çalışmada 10, 15, 20 ve 25 C de gerçekleştirdikleri fermantasyonlar boyunca gelişme hızı ve maksimum hücre kuru ağırlıklarını incelemişlerdir. Tüm türlerin gelişme hızının sıcaklıkla arttığını bulmuşlardır. Mayaların maksimum hücre kuru ağırlıklarının 15 C ye kadar arttığını, daha yüksek sıcaklıklarda, suşa bağlı olarak, sabit kaldığını ya da artma veya azalma gösterdiğini belirlemişlerdir. K. apiculata nın pek çok suşunun ve C. pulcherrima, C. stellata ve C. colliculasa nın bazı suşlarının, S. cerevisiae dan daha 13

23 hızlı gelişme gösterdiğini ve bunun da şarap fermantasyonlarında erken gelişmelerinden kaynakladığını belirtmişlerdir. Nikolaou et al. (2006), 110 adet S. cerevisiae maya izolatı içerisinden seçtikleri 6 izolatın tümünün 37 C de gelişme gösterirken, 42 C de 4 tanesinin gelişebildiğini belirlemişlerdir. Torija et al. (2003), İspanya daki bir şarap üretim bölgesinden izole ettikleri 20 adet S. cerevisiae suşu ile 5 farklı sıcaklıkta (15, 20, 25, 30 ve 35 C) yürüttükleri fermantasyon denemelerinde, sıcaklığın maya gelişmesi, maya metabolizması ve şarabın bileşim ve kalitesine etkisini araştırmışlardır. Bu çalışmanın sonucunda; sıcaklık arttıkça, hücrenin canlılığında bir azalma olduğu gözlenmiştir. 25 ve 30 C de mayalar normal gelişme kurvesi gösterirken, 35 C de önemli miktarda canlılık kaybı görülmüştür. Yüksek sıcaklıklarda fermantasyonun hızlı başlamasına karşın, fermantasyon sonunda yüksek oranda maya ölümünün gerçekleştiği belirtilmiştir. Bu durumun, yavaş fermantasyona ya da şekerlerin kullanımını güçleştirerek, yüksek şeker içeriğine sahip tamamlanmamış fermantasyona sebep olabileceği belirtilmiştir. Aksine, düşük sıcaklıklarda daha yavaş başlayan fermantasyonlarda, yüksek oranda biyokütle fermantasyon boyunca korunduğundan, tüm şekerler kullanılarak fermantasyon tamamlanmıştır. Sıcaklığın sadece fermantasyon kinetiğini (fermantasyonun hızı ve süresi) değil, aynı zamanda şarabın kimyasal bileşimini belirleyen maya metabolizmasını da etkilediği belirtilmiş ve sıcaklık arttıkça etil alkol verimi azalırken; asetik asit, süksinik asit, asetaldehit ve gliserol gibi ikincil metabolitlerin miktarlarının arttığı ifade edilmiştir. Saccharomyces sensu stricto grubuna ait mayalar mezofilik olmalarına karşın, farklı temel sıcaklık noktalarına sahiptirler. Sıcaklık, taksonomik açıdan önem taşımakta ve 37 C de gelişme yetenekleri, taksonomik gruplandırılmalarında önemli bir faktör olarak kabul edilmektedir. Bu kritere göre, 37 C de gelişebilen S. cerevisiae ve S. paradoxus, bu kapasiteye sahip olmayan S. bayanus ve S. pastorianus tan ayrılmaktadır. 37 C de gelişemeyen ve optimum gelişme sıcaklığı 30 C den düşük olan Saccharomyces suşları 14

24 kriyotolerant suşlar olarak da tanımlanmaktadırlar (Guidici et al. 1998, Rainieri et al. 1998). Kriyotolerant suşlar, biracılık ve şarapçılıkta yoğun olarak rastlanılan ve özellikleri iyi bilinen maya suşlarıdır C de çok iyi fermantasyon yapabilmekte, malat sentezleyerek ve yüksek oranda gliserol, süksinik asit ile düşük miktarda asetik asit üreterek, kendilerine özgü bir fermantasyon profili göstermektedirler (Rainieri et al. 1998). Saccharomyces sensu stricto grubu içerisinde mezofilik S. cerevisiae mayalarının bulunmalarına karşın, termotolerant olarak adlandırılan suşlar da yer almaktadır. Aslında optimum gelişme sıcaklıkları S. cerevisiae ve S. paradoxus mayalarınınki ile aynıdır. Ancak; maksimum gelişme sıcaklıkları, genellikle 40 C ye ulaşabilecek şekilde daha yüksektir ve 42 C ye kadar fermantasyon yapabilmektedirler. Termotolerant S. cerevisiae suşları, malatı % 40 oranına kadar parçalayarak ve yüksek miktarda gliserol, süksinik asit ve asetik asit oluşturarak, farklı bir fermantasyon profili göstermektedirler (Rainieri et al. 1998). Regodon et al. (1997), İspanya daki Extremadura şarap bölgesinde bağ bozumu süresince sıcaklığın 35 C yi aşabildiğini ve çoğu şarap işletmesinde soğutma sistemlerinin bulunmamasından ötürü duran fermantasyonları önlemek amacıyla, yüksek sıcaklığa dayanıklı maya suşlarının seçilmesinin önemli olduğunu vurgulamışlardır. Bu nedenle; özellikle 42 C de gelişme gösterebilen maya suşlarını seçmeye çalışmışlar ve yaptıkları denemeler sonucunda, üzerinde çalıştıkları mayaların 37 C de geliştiğini, mayaların % 75 inin de 42 C de gelişebildiğini belirlemişlerdir Yüksek şeker konsantrasyonunda gelişme Şarap mayalarının yüksek şeker konsantrasyonlarında gelişebilme özelliği, özellikle sıcak bölgelerde yetiştirilen, yüksek şeker içeriğine sahip (30 Briks) üzümlerin şıralarının fermantasyonu için önem taşımaktadır (Iranzo et al. 1998). Üzüm ve şıradaki 15

25 şeker konsantrasyonu çok yüksek olduğunda, osmotik basıncın artmasıyla birlikte mayalar inhibe olabilmektedirler (Hutkins 2006). Üzüm şırasındaki yüksek başlangıç şeker konsantrasyonu lag fazın süresini uzatarak gelişme hızını düşürmekte, hücre sayısını azaltmakta ve fermantasyonun son evrelerinde etil alkol toleransını düşürerek, maya gelişmesini olumsuz etkileyebilmektedir (Charoenchai et al. 1998). Maya gelişmesinin yüksek şeker konsantrasyonlarına, fermantasyon hızına kıyasla, çok daha duyarlı olduğu belirtilmektedir. Şarap mayaları, % 30 şeker konsantrasyonlarının üzerinde çalışabilmeli ve % alkol oluşturabilmelidirler (Özçelik ve Denli 1999). Iranzo et al. (1998), inceledikleri 74 Saccharomyces suşunun tamamının, 30 Briksteki şırada gelişme gösterdiğini belirtmişlerdir. Charoenchai et al. (1998), K. apiculata, T. delbrueckii, P. anomola, çeşitli Candida türleri ve S. cerevisiae türlerini içeren 22 adet şarap mayası suşu ile yaptıkları çalışmada, yüksek şeker konsantrasyonunun mayaların gelişme hızları ve hücre kuru ağırlıkları üzerine etkisini araştırmışlardır. Şıranın şeker konsantrasyonu 200 g/l den 300 g/l ye yükseldiğinde, bazı maya suşlarının gelişme hızında düşme ve test edilen tüm mayaların son hücre kuru ağırlık değerlerinde ise, ciddi bir azalma gözlemlemişlerdir. Mayaların yüksek şeker konsantrasyonlarında hücre kuru ağırlık değerlerinin düşük olmasını, yüksek osmotik basınç nedeniyle, hücrelerin muhafaza gereksiniminin artmasına ve dolayısıyla hücre verim katsayısının azalmasına bağlamışlardır Düşük ph değerlerinde gelişme Saccharomyces mayaları, düşük ph değerlerine karşı dayanıklı olup, ph aralığındaki şıralarda kolaylıkla gelişebilmektedirler (Bisson 1999). Ancak, ph değeri arttıkça fermantasyon hızı da artmaktadır. Örneğin, başlangıç briksi 25 ve sıcaklığı 16

26 21 C olan bir şırada fermantasyon hızı ph 3.0 te 0.12 (briks/saat); ph 3.5 te 0.16; ph 4.0 te ise 0.19 olarak bulunmuştur. 2.8 in altındaki ph larda hem gelişme hem de fermantasyon inhibe olmaktadır. Maya gelişme hızı 3.5 ve 4.0 ph değerlerinde, 3 e göre daha yüksektir. Ayrıca, yüksek ph değerlerinde fermantasyon daha erken başlamaktadır (Reed and Peppler 1973). Ough (1966) tarafından yapılan çalışmada, 21 C de ph 4.0 te fermantasyonun 17 saat sonra; ph 3.5 te 23 saat sonra; ph 3.0 te ise 62 saat sonra başladığı belirlenmiştir. Üzüm şırasının ph değeri, mayaların gelişmesi ve bakteriyel populasyonun oluşumunda önemli rol oynamaktadır. Farklı mikroorganizma türlerinin gelişme hızları ve metabolit üretimleri, ph değişikliklerinden farklı şekilde etkilenmektedir. Saccharomyces mayalarının gelişme ve fermantasyon hızları, şıranın ph sı 3.0 civarına düştüğünde azalma göstermektedir ve tamamlanmamış veya yavaş fermantasyon riski artmaktadır. Şıra ve şarabın ph sı, şarap üretiminde kullanılan SO 2, sorbik asit, fumarik asit gibi çeşitli antimikrobiyel ajanların aktivitesinde de önemli rol oynamaktadır. K + ve H + nin üzüm şırasındaki nisbi oranlarının, alkol fermantasyonunun başarılı bir şekilde tamamlanmasında önemli rolü olduğu, K + /H + oranının en az 25/1 olması gerektiği belirtilmektedir (Fugelsang and Edwards 2007). Charoenchai et al. (1998), 22 adet değişik cins ve türdeki mayalar (K. apiculata, T. delbrueckii, P. anomola, S. cerevisiae ve Candida türleri) ile ph sı 3.0 ve 4.0 olan besiyerlerinde gerçekleştirdikleri fermantasyon denemelerinde, mayaların gelişme hızı ve hücre ağırlıklarında bir farklılık gözlememişlerdir. Şıradaki asidin çeşidi de fermantasyon hızını etkilemektedir. Laboratuvarda hazırlanan şıraların tartarik, L-malik ya da sitrik asit ile hazırlanması durumunda, aynı ph değerleri elde edilmesine karşın, fermantasyon hızının tartarik asit ile yüksek, sitrik asit ile en yavaş olduğu belirtilmiştir (Reed and Peppler 1973, Ough 1966). Maya suşlarının etil alkol, organik asit ve yağ asidi toleransı, düşük ph değerlerinde azalmaktadır. Saccharomyces mayaları, fermantasyon boyunca protonlar salgılamakta 17

27 ve bu nedenle ortamın ph sını 0.3 birim kadar azaltabilmektedirler. Ayrıca; şıra ph sı bakteri türlerinin çeşitliliğini, böylece fermantasyon sırasındaki mikrobiyel populasyonu önemli düzeyde etkilemektedir (Bisson 1999) H 2 S üretimi Şarap fermantasyonu boyunca H 2 S üretimi, çürük yumurta kokusunu andıran, arzulanmayan bir kokuya neden olduğundan, şarap mayalarında istenmeyen bir özelliktir (Sipiczki et al. 2001, Nowak et al. 2004). H 2 S, şırada bulunan elementel kükürdün ve diğer kükürtlü bileşiklerin (bisülfit, tiyosülfat, methionin, sistin vb.), fermantasyon sırasında, mayaların sülfit redüktaz aktivitesi ile indirgenmesi sonucunda oluşmaktadır. H 2 S, düşük algılanma eşik değerine sahip olduğundan, duyusal bozukluklara neden olabilen bir bileşiktir (Özçelik ve Denli 1999, Budroni et al. 2006). H 2 S şarap, bira gibi alkollü içkilerin üretimi süresince arzulanmayan miktarlarda oluşabilmektedir. H 2 S, fermantasyon boyunca inorganik sülfat gibi sülfür bileşiklerinin enzimatik ya da kimyasal yolla indirgenmesi ile meydana gelmektedir. Maya tortularının üzerinde depolama da H 2 S üretimi ile sonuçlanabilmektedir. H 2 S in şarap ve biralarda bazı metallerle temas ile de üretilebileceği belirtilmiştir. Şaraptaki H 2 S konsantrasyonunu etkileyen en önemli kaynakların, kükürt dioksit ve elementel kükürt olduğu bilinmektedir (Shütz and Kunkee 1977). Iranzo et al. (1998), test ettikleri Saccharomyces cinsine ait mayaların % 61 inin H 2 S ürettiğini belirtmişlerdir. Pérez-Coello et al. (1999), kurşun asetat yöntemini kullanarak, 143 maya suşunun H 2 S üretimlerini kalitatif olarak incelemişler ve bunun sonucunda 54 suşun pozitif iken, 89 tanesinin negatif özellik gösterdiğini belirlemişlerdir. 18

28 Sipiczki et al. (2001), Kuzey Macaristan daki Tokay bölgesindeki şaraphanelerden izole ettikleri şarap mayalarının teknolojik özelliklerini inceleyerek, bu mayaların bölgeye özgü starter kültür olarak kullanım olanaklarını araştırmışlardır. Bu kapsamda inceledikleri teknolojik özelliklerden biri olan maya suşlarının H 2 S üretme yeteneklerini, BIGGY Agar üzerindeki kahverengileşme derecesine göre belirlemişlerdir. İnceledikleri 3 izolatın da güçlü birer H 2 S üreticisi olduğunu ifade etmişlerdir. Orlić et al. (2005), şıranın fermantasyonu boyunca mayalar tarafından H 2 S oluşturulmasının, şarap üretiminde uzun süren ve ciddi bir problem olduğunu belirtmişlerdir. Maya suşlarının H 2 S üretimi bakımından çok fazla farklılık gösterdiğini vurgulamışlar ve inceledikleri tüm S. cerevisiae suşlarının düşük konsantrasyonlarda H 2 S ürettiklerini belirlemişlerdir. Budroni et al. (2006) tarafından, yerel şarap mayalarının teknolojik özelliklerini belirlemeye yönelik yapılan çalışmada, incelenen suşların % 50 sinden fazlasının BIGGY Agar üzerinde krem (2) ve açık kahverengi (3) renkte koloniler oluşturarak, düşük H 2 S üretme yeteneğine sahip oldukları belirtilmiştir. Lopes et al. (2007), inceledikleri tüm endojen maya izolatlarının, ticari starter mayalar da dahil olmak üzere H 2 S üretme yeteneğine sahip olduklarını, ancak bu mayaların % 51.7 sinin orta düzeyde H 2 S ürettiklerini belirtmişlerdir Killer aktivite Mayaların killer özellikleri, ilk kez 1963 yılında Bevan ve Makower tarafından S. cerevisiae da bulunmuştur. Killer mayalar olarak adlandırılan bu mayalar, duyarlı mikrobiyel hücreleri inhibe edici etki gösteren protein ya da glikoproteinler üreterek ortama salgılamaktadırlar. Salgılanan bu proteinler, killer protein ya da killer toksin olarak adlandırılmaktadır. (İzgü et al. 2004). 19

29 Killer faktörü ilk kez S. cerevisiae maya türünde keşfedilmiş olmakla birlikte, Hansenula, Candida, Kloeckera, Hanseniaspora, Pichia, Torulopsis, Kluyveromyces ve Debaryomyces cinsine ait diğer mayalarda da killer özellik görülmüştür (Ribéreau- Gayon et al. 2006, Fleet 1990). İlke olarak, bir tür içerisindeki suşlar, sadece kendi türü içerisindeki diğer suşlara etkilidir. Ancak, daha fazla sayıda maya türü incelendiğinde, farklı türler arasında da killer etkileşimi olabileceği anlaşılmıştır (Fleet 1990). Mayalar killer özellikleri yönünden dört ayrı fenotip göstermektedirler. Bunlar; killer (K), duyarlı (S), nötral (N), killer-duyarlı (K-S) suşlardır. Killer suşlar, aynı tür ya da farklı cins türlerinin duyarlı suşlarına karşı öldürücü olan bir toksin salgılamaktadırlar ve kendi ürettikleri toksine karşı dirençlidirler. Nötral suşlar toksin üretmezler, ancak killer toksine karşı dirençlidirler. Killer-duyarlı suşlar ise, killer faktöre sahip olup, aynı zamanda diğer killer mayaların toksinine karşı da duyarlıdırlar (Van Vuuren and Jacobs 1992, Türkmen 1993, Özçelik et al. 1996, Kapsopoulou et al. 2008). Duyarlı hücrelerdeki toksin aktivitesi membran geçirgenliğinin değişmesiyle, bazı durumlarda DNA replikasyonunun inhibe olması ya da G 1 fazındaki hücre bölünmesinin durdurulması ile açıklanabilmektedir (İzgü et al. 2004). Killer proteinler, genetik olarak, linear bir çift sarmallı DNA, bir kromozom ya da sitoplazmik çift sarmallı RNA virüsleri ile kodlanmışlardır. Killer proteinlerin aktivite ve stabilitesi ph ve sıcaklığa bağlı olup, genellikle, ph aralığında ve C de aktif ve stabildirler (İzgü et al. 2004). Killer toksinler, etki spektrumlarına ve diğer killer mayalarla etkileşimlerine göre 11 gruba ayrılmaktadırlar (K 1 -K 11 ) (İzgü et al. 2004). İlk 3 grup (K 1, K 2, K 3 ) toksinleri S. cerevisiae ya özgüdür. K 1 toksini, protein yapısında olup, üretimi ve stabilitesi için gerekli optimum ph değeri dir. K 1 toksininin etkin olduğu ph aralığının şarabın ph değerinden yüksek olması nedeniyle, K 1 toksini şarap üretiminde önemli değildir ve 20

30 maya kontaminantlarının gelişiminin kontrolü amacıyla kullanılmazlar. K 2 toksini ise, glikoprotein yapısında olup, ph aralığında etkilidir ve şarapçılıkta önemlidir (Van Vuuren and Jacobs 1992, Özçelik and Dönmez 1993, Ribéreau-Gayon et al. 2006). Şarap endüstrisinde, geniş ph aralığında aktivite gösteren, şaraptaki duyarlı S. cerevisiae ve Saccharomyces dışındaki mayaların birçoğuna karşı öldürücü etkiye sahip toksinler üreten K 2 killer mayalardan yararlanılmaktadır (Van Vuuren and Jacobs 1992). K 2 ve bazen de K 3 killer mayaları şarap endüstrisinde ciddi bazı problemlere sebep olabilmektedir, çünkü bunların toksinleri duyarlı şarap mayalarına karşı öldürücü özelliktedir. K 4 -K 11 tip killer toksinleri, Saccharomyces cinsi dışındaki mayalar tarafından üretilmekte olup, şarap endüstrisi açısından önem taşımamaktadırlar (Özçelik and Dönmez 1993). Toksin üretimi killer mayalara, duyarlı mayalara karşı bir avantaj sunmaktadır. Yabani killer mayalar ile kontamine olan bazı endüstriyel fermantasyon proseslerinde, bu mayalar baskın hale geçerek ürünü bozmaktadırlar. Killer mayalar kendi ürettikleri toksinlere karşı bağışık olmalarına rağmen, diğer grup toksinlerinin etkilerine karşı duyarlıdırlar. Bu nedenle, fermantasyonda kontaminasyonu önlemek için önerilen genel çözüm; kontaminantı inhibe edici özelliğe sahip killer toksinler üretebilen ve diğer türlerin toksinlerine karşı bağışık endüstriyel türler oluşturmaktır (İzgü et al. 2004). Killer mayalar, şarap endüstrisinde pek çok nedenden dolayı büyük önem taşımaktadırlar. Birincisi, killer mayalar tamamlanmamış ya da arzulanmayan fermantasyonların bir kısmından sorumlu olabilmektedirler. Starter olarak katılan S. cerevisiae, endojen S. cerevisiae ya da Saccharomyces dışındaki türlerin killer suşları tarafından zarar görebilmekte ve bu da yavaş fermantasyona ya da fermantasyonun daha az arzulanan bir maya ile tamamlanmasına yol açabilmektedir. İkinci olarak, fermantasyonun S. cerevisiae nın istenen killer suşları ile yürütülmesi, istenmeyen endojen suşların gelişmesini sınırlandırarak avantaj sağlayabilmektedir. Ayrıca; modern genetik mühendisliği teknikleri, hem istenen fermantasyon özelliklerine sahip hem de endojen maya türlerinin gelişmesini kontrol altına alabilen, geniş spektrumlu killer 21