EGE ÜNIVERSITESI FEN BILIMLERI ENSTITÜSÜ (DOKTORA TEZI)

Transkript

1 EGE ÜNIVERSITESI FEN BILIMLERI ENSTITÜSÜ (DOKTORA TEZI) BAZI PATOJEN BAKTERILERIN ASIDE TOLERANS KAZANMASININ TANIMLANMASI VE GIDA SANAYINDEKI ÖNEMI Halil TOSUN Gida Mühendisligi Anabilim Dali Bilim Dali Kodu: Sunus Tarihi: Tez Danismani: Doç.Dr. Sahika AKTUG GÖNÜL Bornova-Izmir 2003

2 II

3 III Halil TOSUN tarafindan DOKTORA TEZI olarak sunulan Bazi Patojen Bakterilerin Aside Tolerans Kazanmasinin Tanimlanmasi ve Gida Sanayindeki Önemi baslikli bu çalisma E.Ü. Lisansüstü Egitim ve Ögretim Yönetmeligi ile E.Ü. Fen Bilimleri Enstitüsü Egitim ve Ögretim Yönergesi nin ilgili hükümleri uyarinca tarafimizdan degerlendirilerek savunmaya deger bulunmus ve tarihinde yapilan tez savunma sinavinda aday oybirligi/oyçoklugu ile basarili bulunmustur. Jüri Üyeleri: Imza Jüri Baskani : Prof. Dr. Mehmet KARAPINAR Raportör Üye : Doç. Dr. Sahika AKTUG GÖNÜL Üye Üye Üye : Prof. Dr. Ismail KARABOZ : Yrd. Doç. Dr. Nural KARAGÖZLÜ : Yrd. Doç. Dr. Ali Fazil YENIDÜNYA

4 IV

5 V ÖZET BAZI PATOJEN BAKTERILERIN ASIDE TOLERANS KAZANMASININ TANIMLANMASI VE GIDA SANAYINDEKI ÖNEMI TOSUN, Halil Doktora Tezi, Gida Mühendisligi Bölümü Tez Yöneticisi: Doç. Dr. Sahika AKTUG GÖNÜL Kasim 2003, 179 sf. Bu tezde Salmonella typhimurium ve Escherichia coli O157:H7 nin aside adaptasyonu saptanmis, aside tolerans kazanmis hücrelerin bazi çevresel streslere olan direnci belirlenmis ve aside adaptasyonun S.typhimurium ve E.coli O157:H7 nin bazi asidik gidalardaki canliliklari üzerine etkileri incelenmistir. S.typhimurium ph si 5,8±0,1 olan ortama maruz birakilarak aside tolerans kazandirilmistir. Aside tolerans kazandirilan S.typhimurium un sicaklik (45 C ve 50 C), tuz (%8 NaCl) ve organik asitlere (laktik asit ve asetik asit, ph 4,2±0,1) olan direnci artmis ancak soguga (3±0,1 C) karsi çapraz direnç kazanmamistir (p<0,05). Aside adaptasyon 4 C ve 20 C de depolanan salgam suyu ve mayonez ile 4 C de depolanan ayran ve kayisi nektarinda S.typhimurium un daha fazla sayida canli kalmasini saglamistir (p<0,05). Aside adaptasyon ayrica S.typhimurium un 4 C ve 20 C de depolanan pastörize ve pastörize edilmemis portakal sularinda da daha fazla sayida canli kalmasini saglamis ancak bu etki istatistiksel açidan önemli bulunmamistir (p<005). Yogurtta, 20 C de depolanan kayisi nektarinda

6 VI ve 4 C ve 20 C de depolanan seftali nektarinda ise aside adaptasyonun S.typhimurium un canliligi üzerine etkisiz oldugu saptanmistir (p<0,05). E.coli O157:H7, ph 4,5, 5,0, 5,5 de 1, 2, 3, 4 saat (asit soku yöntemi) ve 18 saat (aside alistirma yöntemi) tutularak aside adapte edilmistir. Aside alistirilan hücreler aside tolerans kazanmamis, asit sokuna maruz birakilan hücreler ise kontrol kültürüne göre aside tolerans kazanmis ve ph 4,5 de aside adapte edilen kültürün maksimum düzeyde aside tolerans kazandigi saptanmistir (p<0,05). ph 4,5, 5,0 ve 5,5 de aside adapte edilen E.coli O157:H7 nin, 54 C, 56 C ve 58 C de D degerleri saptanmistir. Her üç sicaklikta da ph 4,5 de aside adapte edilen E.coli O157:H7 nin en yüksek D degerlerine sahip oldugu saptanmistir (p<0,05). ph 5,0 de 4 saat (Tsai and Ingham, 1997, Metot 1) ve ph 4,5 de 2 saat (Metot 2) süreyle aside adapte edilen E.coli O157:H7 nin bazi asidik gidalardaki canliliklari saptanmistir. Aside adaptasyonun (Metot 1) 4 C ve 20 C de depolanan salgam suyu, elma ve portakal suyu ile 4 C de depolanan ayranda E.coli O157:H7 nin canli kalmasi üzerine etkisinin bulunmadigi saptanmistir (p<0,05). Metot 2 ye göre aside adapte edilen E.coli O157:H7 nin ise 4 C de depolanan salgam suyunda daha fazla sayida canli kaldigi saptanmistir (p<0,05). Ayrica aside adaptasyon (Metot 2), 4 C de depolanan elma suyunda E.coli O157:H7 nin canli kalma süresini artirmis ancak bu etki istatistiksel açidan önemli bulunmamistir(p<0,05). Yogurtta ise aside adaptasyonun (Metot 2) E.coli O157:H7 nin canli kalmasi üzerine etkisiz oldugu saptanmistir (p<0,05). Anahtar Kelimeler: S.typhimurium, E.coli O157:H7, aside tolerans kazanma, çapraz direnç, asidik gidalar.

7 VII ABSTRACT ACID TOLERANCE RESPONSE OF SOME PATHOGEN BACTERIA AND ITS IMPORTANCE IN FOOD INDUSTRY TOSUN, Halil PhD in Food Eng. Supervisor: Doç. Dr. Sahika AKTUG GÖNÜL November 2003, 179 p. In this thesis, acid adaptation of Salmonella typhimurium and Escherichia coli O157: H7 has been studied. The relationship of acid adaptation to tolerance of other environmental stresses was examined. The effects of acid adaptation on survival of S.typhimurium and E.coli O157: H7 in some acidic foods was also examined. S.typhimurium was adapted to acid by exposing the cells to ph 5.8±0.1. Acid adapted S.typhimurium was found to have increased tolerance towards various stresses including heat (45 C and 50 C), salt (8% NaCl), organic acids (lactic acid and acetic acid, ph 4,2±0,1 ) but no cross protection was noted for cold (3±0.1 C) (p<0.05). Acid adaptation enhanced the survival of S.typhimurium in turnip juice and mayonnaise stored at 4 and 20 C and in ayran and apricot nectar stored at 4 C (p<0.05). Acid adaptation also enhanced the survival of S.typhimurium in pasteurized and nonpasteurized orange juice stored at 4 C and 20 although it was statistically not significant (p<0.05). Acid adaptation did not enhance the survival of S.typhimurium in peach nectar stored at 4 and 20 C, apricot nectar stored at 20 C and yoghurt stored at 4 C (P<0.05).

8 VIII E.coli O157:H7 was adapted to acid by exposing the cells to ph 4.5, 5.0 and 5.5 for 1, 2, 3, 4 h (acid shock method) and 18 h (acid habituated method). Acid habituated cells did not tolerate acidic stresses whereas acid shocked cells tolerated acidic stresses better than nonadapted cells and cells adapted to acid at ph 4.5 had the highest acid tolerance (p<0.05). D values of E.coli O157:H7 adapted to acid at ph 4.5, 5.0, 5.5 and control culture at 54 C, 56 C and 58 C were determined. E.coli O157:H7 adapted to acid at ph 4.5 had the highest D values at all temperatures (p<0.05). Survival of E.coli O157:H7 adapted to acid at ph 5.0 for 4 h (Tsai and Ingham,1997 Method 1) and at ph 4.5 for 2 h (Method 2) was determined in some acidic foods. Acid adaptation (Method 1) did not enhance survival of E.coli O157:H7 in turnip juice, apple juice and orange juice stored at 4 C and 20 C, in ayran stored at 4 C (p<0.05). But acid adaptation (Method 2) enhanced the survival of E.coli O157:H7 in turnip juice stored at 4 C (p<0.05). Acid adaptation (Method 2) also enhanced the survival of E.coli O157:H7 in apple juice stored at 4 C but it was statistically not significant (p<0.05). Lastly acid adaptation (Method 2) did not enhance the survival of E.coli O157:H7 in yoghurt (p<0.05). Key words: Acid tolerance response, cross protection, acidic foods, S.typhimurium, E.coli O157:H7.

9 IX TESEKKÜR Bu çalisma süresince kiymetli görüslerinden yararlandigim danismanim sayin Doç. Dr. Sahika A. GÖNÜL e, tezin biçimlenmesinde degerli katkilarini aldigim Prof. Dr. Mehmet KARAPINAR ve Yrd. Doç. Dr. Nural KARAGÖZLÜ ye, laboratuvar çalismalarinda yardimlarini esirgemeyen Tek. Figen BECERIK, Tülay ÜZEL ve Gida Mikrobiyolojisi Bilim Dali nda çalisan arkadaslarima, tez süresince gösterdigi tüm destek ve anlayisindan dolayi sevgili esim Çigdem ve oglum Bera ya tesekkürü bir borç bilirim.

10 X IÇINDEKILER Sayfa ÖZET...V ABSTRACT...VII TESEKKÜR... IX IÇINDEKILER...X SEKILLER DIZINI...XVI ÇIZELGELER DIZINI...XIX 1.GIRIS ÖNCEKI ÇALISMALAR Bakterilerde Sitoplazma ph'sinin Düzenlenmesi Aside Tolerans Kazanma Salmonella typhimurium'un aside tolerans kazanmasi E.coli O157: H7'nin aside tolerans kazanmasi...7

11 XI IÇINDEKILER (devam) 2.3 Çapraz Direnç S.typhimurium'un çapraz direnç kazanmasi E.coli O157: H7'nin çapraz direnç kazanmasi S.typhimurium'un Aside Tolerans Kazanmasinin Asidik Gidalardaki Önemi E.coli O157: H7'nin Aside Tolerans Kazanmasinin Asidik Gidalardaki Önemi MATERYAL VE METOT Materyal Deney kültürleri Besiyerleri ve hazirlanislari Gida örnekleri Metot Mikroorganizmalarin sayimi S.typhimurium'un aside tolerans kazandirilmasi...29

12 XII IÇINDEKILER (devam) Aside tolerans kazandirilan S.typhimurium un çapraz direncinin saptanmasi S.typhimurium'un 50 C'de desimal ölüm süresinin saptanmasi Aside tolerans kazandirilan S. typhimurium un bazi asidik gidalardaki canliligi Aside tolerans kazandirilan S.typhimurium un yogurttaki canliligi E.coli O157:H7'nin aside tolerans kazandirilmasi Aside tolerans kazandirilan E.coli O157:H7'nin farkli sicakliklardaki desimal ölüm sürelerinin saptanmasi Farkli ph'larda aside tolerans kazandirilan E.coli O157:H7'nin z degerlerinin saptanmasi Aside tolerans kazandirilan E.coli O157:H7'nin bazi asidik gidalardaki canliligi Aside tolerans kazandirilan E.coli O157:H7'nin yogurttaki canliligi Istatistiksel analizler BULGULAR VE TARTISMA Salmonella typhimurium un Aside Tolerans Kazandirilmasi S. typhimurium un Sicakliga Karsi Çapraz Direncinin Saptanmasi...46

13 XIII IÇINDEKILER (devam) 4.3 S.typhimurium'un Laktik Asit ve Asetik Aside Karsi Çapraz Direncinin Saptanmasi S.typhimurium'un Soguga Karsi Çapraz Direncinin Saptanmasi S.typhimurium'un Tuza Karsi Çapraz Direncinin Saptanmasi S.typhimurium'un 50 C de Desimal Ölüm Süresinin Saptanmasi Aside Tolerans Kazandirilan S.typhimurium un Bazi Asidik Gidalardaki Canliliginin Saptanmasi Mayonez de S.typhimurium un canliliginin saptanmasi Salgam suyunda S.typhimurium un canliliginin saptanmasi Ayranda S.typhimurium un canliliginin saptanmasi Pastörize portakal suyunda S.typhimurium un canliliginin saptanmasi Pastörize edilmemis portakal suyunda S.typhimurium un canliliginin saptanmasi Kayisi nektarinda S.typhimurium un canliliginin saptanmasi Seftali nektarinda S.typhimurium un canliliginin saptanmasi Yogurtta S.typhimurium un canliliginin saptanmasi E.coli O157:H7 nin Aside Tolerans Kazandirilmasi...81

14 XIV IÇINDEKILER (devam) Aside alistirma yöntemi Asit soku yöntemi Aside Tolerans Kazandirilan E.coli O157:H7 nin Farkli Sicakliklardaki Desimal Ölüm Sürelerinin Saptanmasi C de desimal ölüm süresinin saptanmasi C de desimal ölüm süresinin saptanmasi C de desimal ölüm süresinin saptanmasi Farkli ph larda aside tolerans kazandirilan E.coli O157: H7 nin z degerlerinin saptanmasi Aside Tolerans Kazandirilan E.coli O157: H7 nin Bazi Asidik Gidalardaki Canliligi Aside tolerans kazandirilan E.coli O157: H7 nin ayrandaki canliligi Yöntem 2'ye göre aside tolerans kazandirilan E.coli O157: H7 nin yogurttaki canliligi Aside tolerans kazandirilan E.coli O157: H7 nin salgam suyundaki canliligi Aside tolerans kazandirilan E.coli O157: H7 nin elma suyundaki canliligi Aside tolerans kazandirilan E.coli O157: H7 nin portakal suyundaki canliligi...129

15 XV IÇINDEKILER (devam) 5. ÖNERILER KAYNAKLAR DIZINI EKLER ÖZGEÇMIS...179

16 XVI SEKILLER DIZINI Sekil Sayfa ph 5,8±0,1 de aside tolerans kazandirilan S.typhimurium un ph 3,45±0,1 de canliligi S.typhimurium un 45 C ve 50 C de sicakliga karsi çapraz direncin saptanmasi Aside tolerans kazandirilan S.typhimurium un ph 4,2±0,1 de laktik asitte canliligi Aside tolerans kazandirilan S.typhimurium un ph 4,2±0,1 de asetik asitte canliligi S.typhimurium un 4 C de ve 25 C de tuz çözeltisine (% 8 NaCl) karsi çapraz direncin saptanmasi S.typhimurium un 50 C de desimal ölüm süresi egrisi S.typhimurium un 4 C ve 20 C de depolanan pastörize portakal suyundaki canliligi S.typhimurium un 4 C ve 20 C de depolanan pastörize edilmemis portakal suyundaki canliligi...71

17 XVII SEKILLER DIZINI (devam) S.typhimurium un 4 C ve 20 C de depolanan kayisi nektarindaki canliligi S.typhimurium un 4 C ve 20 C de depolanan seftali nektarindaki canliligi S.typhimurium un yogurttaki canliligi Aside alistirma yöntemi ile aside tolerans kazandirilan E.coli O157:H7 nin ph 3,0 deki canliligi saat süreyle aside tolerans kazandirilan E.coli O157: H7 nin ph 3,0 deki canliligi saat süreyle aside tolerans kazandirilan E.coli O157: H7 nin ph 3,0 deki canliligi saat süreyle aside tolerans kazandirilan E.coli O157: H7 nin ph 3,0 deki canliligi saat süreyle aside tolerans kazandirilan E.coli O157: H7 nin ph 3,0 deki canliligi Farkli ph larda aside tolerans kazandirilan E.coli O157: H7 nin 54 C de desimal ölüm süresi egrisi Farkli ph larda aside tolerans kazandirilan E.coli O157: H7 nin 56 C de desimal ölüm süresi egrisi

18 XVIII SEKILLER DIZINI (devam) Farkli ph larda aside tolerans kazandirilan E.coli O157: H7 nin 58 C de desimal ölüm süresi egrisi ph 4,5 ve 5,0 de aside tolerans kazandirilan E.coli O157: H7 nin z egrisi ph 5,5 de aside tolerans kazandirilan E.coli O157: H7 ve kontrol kültürünün z egrisi Yöntem 1 e göre aside tolerans kazandirilan E.coli O157: H7 nin ayrandaki canliligi Yöntem 2 ye göre aside tolerans kazandirilan E.coli O157: H7 nin ayrandaki canliligi Yöntem 2 ye göre aside tolerans kazandirilan E.coli O157: H7 nin yogurttaki canliligi Yöntem 2 ye göre aside tolerans kazandirilan E.coli O157: H7 nin salgam suyundaki canliligi Yöntem 1 e göre aside tolerans kazandirilan E.coli O157: H7 nin elma suyundaki canliligi Yöntem 2 ye göre aside tolerans kazandirilan E.coli O157: H7 nin elma suyundaki canliligi Yöntem 1 e göre aside tolerans kazandirilan E.coli O157: H7 nin portakal suyundaki canliligi Yöntem 2 ye göre aside tolerans kazandirilan E.coli O157: H7 nin portakal suyundaki canliligi...133

19 XIX ÇIZELGELER DIZINI 2.1 Bazi ülkelerde Salmonella izole edilen taze sebzeler (Beuchat, 2002) Taze sebze, meyve ve pastörize edilmemis ürünlerin neden oldugu Salmonella kaynakli enfeksiyonlar (Beuchat, 2002) E.coli O157: H7 nin neden oldugu gida kaynakli hastaliklar ve olasi nedenleri (Bell, 2002) S.typhimurium un 600 nm dalga boyunda absorbans degerleri ph 5,8±0,1 de aside tolerans kazandirilan S.typhimurium un ph 3,45±0,1 de canliligi S.typhimurium un 45 C de sicakliga karsi çapraz direncinin saptanmasi S.typhimurium un 50 C de sicakliga karsi çapraz direncinin saptanmasi S.typhimurium un laktik aside karsi çapraz direncinin saptanmasi S.typhimurium un asetik aside karsi çapraz direncinin saptanmasi S.typhimurium un 3±0,1 C de soguga karsi çapraz direncinin saptanmasi...55

20 XX ÇIZELGELER DIZINI (devam) S.typhimurium un 4 C de tuz çözeltisine (% 8 NaCl) karsi çapraz direncinin saptanmasi S.typhimurium un 25 C de tuz çözeltisine (% 8 NaCl) karsi çapraz direncinin saptanmasi S.typhimurium un 4 C ve 20 C de depolanan mayonezdeki canliligi S.typhimurium un 4 C ve 20 C de depolanan salgam suyundaki canliligi S.typhimurium un 4 C de depolanan ayrandaki canliligi S.typhimurium un 4 C ve 20 C de depolanan pastörize portakal suyundaki canliligi S.typhimurium un 4 C ve 20 C de depolanan pastörize edilmemis portakal suyundaki canliligi S.typhimurium un 4 C ve 20 C de depolanan kayisi nektarindaki canliligi S.typhimurium un 4 C ve 20 C de depolanan seftali nektarindaki canliligi S.typhimurium un yogurttaki canliligi....78

21 XXI ÇIZELGELER DIZINI (devam) Aside alistirma yöntemi ile aside tolerans kazandirilan E.coli O157:H7 nin ph 2,5 deki canliligi Aside alistirma yöntemi ile aside tolerans kazandirilan E.coli O157:H7 nin ph 3,0 deki canliligi saat süreyle aside tolerans kazandirilan E.coli O157: H7 nin ph 2,5 deki canliligi saat süreyle aside tolerans kazandirilan E.coli O157: H7 nin ph 3,0 deki canliligi saat süreyle aside tolerans kazandirilan E.coli O157: H7 nin ph 2,5 deki canliligi saat süreyle aside tolerans kazandirilan E.coli O157: H7 nin ph 3,0 deki canliligi saat süreyle aside tolerans kazandirilan E.coli O157: H7 nin ph 2,5 deki canliligi saat süreyle aside tolerans kazandirilan E.coli O157: H7 nin ph 3,0 deki canliligi saat süreyle aside tolerans kazandirilan E.coli O157: H7 nin ph 2,5 deki canliligi saat süreyle aside tolerans kazandirilan E.coli O157: H7 nin ph 3,0 deki canliligi....94

22 XXII ÇIZELGELER DIZINI (devam) Yöntem 1 e göre aside tolerans kazandirilan E.coli O157: H7 nin ayrandaki canliligi Yöntem 2 ye göre aside tolerans kazandirilan E.coli O157: H7 nin ayrandaki canliligi Yöntem 2 ye göre aside tolerans kazandirilan E.coli O157: H7 nin yogurttaki canliligi Yöntem 1 e göre aside tolerans kazandirilan E.coli O157: H7 nin salgam suyundaki canliligi Yöntem 2 ye göre aside tolerans kazandirilan E.coli O157: H7 nin salgam suyundaki canliligi Yöntem 1 e göre aside tolerans kazandirilan E.coli O157: H7 nin elma suyundaki canliligi Yöntem 2 ye göre aside tolerans kazandirilan E.coli O157: H7 nin elma suyundaki canliligi Yöntem 1 e göre aside tolerans kazandirilan E.coli O157: H7 nin portakal suyundaki canliligi Yöntem 2 ye göre aside tolerans kazandirilan E.coli O157: H7 nin portakal suyundaki canliligi...132

23 XXIII 1. GIRIS Gida mikrobiyolojisinde gidalar, gida kaynakli hastaliklar açisindan degerlendirildiginde; güvenli gidalar ve riskli gidalar olmak üzere iki ana gruba ayrilir. Patojen mikroorganizmalarla bulasma olasiligi yüksek olan ve bu mikroorganizmalarin gelismesi ve/veya toksin olusturmasi için uygun bir ortam saglayan gidalar riskli gidalar olarak degerlendirilirken bu kosullara sahip olmayan gidalar güvenli olarak kabul edilmektedir. Güvenli gida gruplarinin en önemlilerinden biri yüksek asitlige sahip gidalardir. Bunun nedeni patojen mikroorganizmalarin genel olarak ph 4,6 nin altinda gelisememesidir. Bu yüzden dogal olarak asitli gidalar, fermente gidalar veya asitlendirilmis gidalar gida kaynakli hastaliklar açisindan güvenli kabul edilir. Ayrica bu gidalara uygulanan antimikrobiyal islemler, riskli gidalara uygulanan islemlere göre daha farklidir ve daha düsük isisal islem, daha düsük miktarda kimyasal koruyucu gibi uygulamalar söz konusu olur. Ayni sekilde yüksek asitli gidalar için hazirlanan veya önerilen standart ve spesifikasyonlar da bu gerçek dogrultusunda olup, patojen bakterilerin varligini saptamadan çok gidalarin bozulmasina yönelik mikroorganizma gruplari ile ilgili kriterleri içerir. Son yillarda, fermente et ve süt ürünleri, yüksek asitli meyve sulari, mayonez gibi asidik gidalardan kaynaklanan hastaliklar bu gidalarin güvenilirligi konusunda süphelerin ortaya çikmasina yol açmistir ve gida

24 XXIV mikrobiyologlarini bu konu ile ilgili arastirmalara yöneltmistir (Hathcox et al., 1995; Raghubeer et al., 1995; Weagant et al., 1994). Asidik gidalarin neden oldugu gida kaynakli mikrobiyal hastaliklar ile ilgili olarak yürütülen laboratuar arastirmalari bazi patojen mikroorganizmalarin aside adapte olarak direnç kazandigini ortaya koymustur. Yürütülen genetik çalismalara göre bu özellik belli kosullar altinda indüklenebilir bir sistemdir. Bu arastirmalar, gida mikrobiyolojisinde ATR (acid tolerance response, aside tolerans kazanma) olarak adlandirilan bir kavramin ortaya atilmasina neden olmustur. ATR ile ilgili çalismalar daha çok Salmonella typhimurium, Escherichia coli, Listeria monocytogenes, Shigella flexineri üzerinde yogunlasmis olup konunun genetik yönünü aydinlatmaya yöneliktir (Foster, 1991; Gahan et al., 1996; Hickey and Hirshfield, 1990). Patojen bakterilerin aside tolerans kazanabilmeleri gida sanayinde asidik gida üreticilerinin de konuya egilmelerini ve bu tür gidalara uygulanan isisal islem veya diger antimikrobiyal faktörleri yeniden degerlendirme zorunlulugunu ortaya çikarmistir. Ayni sekilde asidik gidalara ait standartlarin güvenilirligi de tartisma konusu olmustur. Bu çalismanin amaci asidik gidalarda hastaliga neden olabildigi belirlenmis olan patojenlerden S.typhimurium ve E.coli O157: H7 nin aside adapte olma kosullarinin saptanmasi, ayrica aside tolerans kazanmis hücrelerin diger çevresel streslere olan direncinin belirlenmesi ve degisik gidalarda bu durumun olusturdugu riskin tespit edilmesidir.

25 XXV 2. ÖNCEKI ÇALISMALAR 2.1. Bakterilerde Sitoplazma ph sinin Düzenlenmesi Bazi bakteriler asidofildir ve asidik ortamlarda yasamayi tercih ederler. Diger bazi bakteriler ise nötral ph degerlerine sahip ortamlarda yasamayi tercih ederler ve nötrofiller olarak adlandirilirlar. Gida kaynakli patojen bakterilerin büyük kismi nötrofildir. Nötrofil bakteriler ortam kosullarina bagli olmakla birlikte ph si 4,6 dan düsük olan ortamlarda gelisemezler. Ancak bu tür bakteriler de yasam kosullarinda gerek gidalarda, fermantasyon sonucu olusan asitlere veya katki maddesi olarak ilave edilen asitlere maruz kaldiklari gibi, gerekse konakçi ortaminda mide ve sindirim sisteminde asidik ortamlara maruz kalirlar. Bu tür ortamlarda bakteri sitoplazma ph sini dengede tutarak asidin zararli etkisinden kendisini korumak zorundadir (Foster and Spector, 1995). Bakteriler bulunduklari ortamin ph sinda meydana gelen degisiklikleri algilayarak belirli bir süre içinde uyum saglama yetenegine sahiptir. Buna ph homeostasis denir (Hill et al., 1995; Padan and Schuldiner, 1987). Bakteri sitoplazmasi proton motiv gücünün etkisi sayesinde dis ortama göre daha baziktir. Bakteri gelismek ve yasamsal fonksiyonlarini sürdürebilmek için sitoplazma ph sini kontrol etmek zorundadir (Hickey and Hirshfield, 1990). Bakteri membrani hidrojen iyonlarina karsi tam

26 XXVI geçirgen degildir. Bu özellik sayesinde dis ortamda meydana gelen ph degisiklikleri sitoplazma ph sinin degismesini yol açmaz. Bunun yanisira sitoplazmada bulunan organellerin tamponlanma kapasitesinin yüksek olmasi da sitoplazma ph sinin korunmasina olanak saglar. Örnegin, E.coli nin sitoplazma ph si, dis ortamin ph si 4,5-7,9 degerleri arasinda degisirken yalnizca 0,1 birim degisiklik gösterir. Ancak ph homeostasisi olusturan bütün bu sistemler bakteriyi etkili bir sekilde asitten koruyamazlar. Özellikle zayif asitler bakteri membranindan kolaylikla geçerek sitoplazmada çözünmekte ve sitoplazma ph sini düsürebilmektedir. Zayif asitlerin etkisi ph düstükçe daha çok artmaktadir. Bu durumda bakteri üremeden ziyade hayatta kalmaya çalisir. Ancak dis ortamin ph si 4,6 nin altina düstügünde mevcut ph homeostasis sistemi bakterinin asitten korunmasi için yetersiz kalir ve bakteri hizla ölmeye baslar (Hill et al., 1995). Son yillarda bazi patojen bakterilerin asidik ortamlarda canli kalmalarina olanak taniyan ph homeostasisten farkli olarak protein sentezini gerektiren indüklenebilir aside direnç sistemleri gelistirdikleri ortaya konmustur. Bakterinin aside direnç kazanmasini saglayan bu sistemler belirli kosullar altinda indüklenmekte ve belirli genler tarafindan kontrol edilmektedir. Bu sistemlere ATR adi verilmektedir (Foster, 1991).

27 XXVII 2.2. Aside Tolerans Kazanma Bazi patojen bakteriler orta derecede asitli ortamlara belirli bir süre maruz kalirsa spesifik genler tarafindan kontrol edilen asit sok proteinleri sentezleyerek yüksek asitli ortamlarda canliliklarini sürdürebilmektedir. Bu özellige aside tolerans kazanma adi verilmektedir (Foster, 1991). Aside tolerans kazanmis patojen bakteriler hem gida sanayi hem de insan sagligi açisindan önem tasimaktadir. Çünkü gidalarin muhafazasinda ürünün asitlendirilmesi etkili bir muhafaza yöntemidir. Bu tür gidalarda aside tolerans kazanmis patojen bakteriler uzun süre canli kalabilirler (Leyer et al., 1995). Asit ayrica vücudun mikrobiyal tehlikelerden korunmak için kullandigi savunma sistemlerinden bir tanesidir. Midenin asidik ortami, bagirsaklarda bulunan kisa zincirli uçucu yag asitleri ve vücut savunma hücrelerinin asidik ortamlari vücudun bakterilerden korunmasinda son derece etkilidir. Ancak aside tolerans kazanmis patojen bakteriler mide ve sindirim sisteminde aside direnç göstererek canli kalabilir ve hastaliklara yol açabilirler. Aside tolerans kazanmis patojen bakterilerin bu sayede enfektif dozu düser ve hastalik yapma gücü artar (Riesenberg et al., 1996) Salmonella typhimurium un aside tolerans kazanmasi S.typhimurium nötrofil bir bakteri olmakla birlikte yasam kosullarinda karsilastigi asidik ortamlarda canli kalmasini saglayan sistemlere sahiptir. Bu sistemler dogal olarak bakterinin sahip oldugu

28 XXVIII sistemler ve belirli kosullar altinda indüklenebilen sistemler olmak üzere iki gruba ayrilir. S.typhimurium düsük ph ya sahip ortamlarda sitoplazma ph sini farkli aminoasit dekarboksilaz sistemleri kullanarak dengede tutmaya çalisir. Düsük ph ya sahip bir ortamda hücre içine giren hidrojen iyonlari; ornitin, arjinin ve lisin gibi aminoasitlerin hücre içinde dekarboksilasyonu reaksiyonlarinda harcanir. Dekarboksilasyon sonucu olusan ürün hücre disina atilirken yeni substrat hücre içine girer. Bu sekilde sitoplazma ph si dengede tutulmaya çalisilir. S.typhimurium da dogal olarak bulunan bu sistem bakterinin asitten korunmasi için çok etkili degildir (Bearson et al., 1997). Diger bir sistem ATR olup ph homeostasisten daha etkilidir ve ph homeostasisin etkili olamadigi ph degerlerinde bakterinin aside direnç kazanarak canli kalmasini saglar. ATR ph homeostasisten farkli olarak bazi spesifik genler tarafindan kontrol edilir. Bu genler rpos, PhoP ve Fur genleri olup asit soku proteinlerinin sentezlenmesinde rol oynarlar. RpoS tarafindan kodlanan alternatif sigma faktörü ise aside toleransin kazanilmasinda kritik regülatördür (Bearson et al., 1997). ATR logaritmik üreme döneminde veya duraklama döneminde indüklenebilir. ATR logaritmik üreme döneminde indüklenirse 50 adet asit soku proteini sentezlenir. Duraklama döneminde indüklenirse 15 adet asit soku proteini sentezlenir. Logaritmik üreme döneminde veya duraklama döneminde asit soku proteinlerinin sentezlenebilmesi için bakterinin kisa bir süre hafif asidik bir ortama (ph 5-6) maruz kalmasi gerekir. Bu isleme asit soku denir. Bakteri asit sokuna maruz kalmadan

29 XXIX öldürücü ph degerlerine sahip bir ortama (ph <3) maruz kalirsa asit soku proteinlerini sentezleyemez ve ölür. Ancak asit sokuna maruz kalmasi durumunda asit soku proteinlerinin sentezlenmesiyle aside direnç kazanarak böyle bir ortamda canli kalir (Foster, 1991; Foster and Spector, 1995). Foster and Hall (1991) bu konuda yaptigi bir çalismada S.typhimurium u ph si 4 ten düsük bir ortama maruz biraktiginda aside tolerans kazanan kültürün sitoplazma ph sinin aside tolerans kazanmamis kültüre göre daha yüksek oldugunu tespit etmistir. Aside tolerans kazanmamis kültür ortam ph si 4 ün altina düstügünde sitoplazma ph sini kontrol edemezken, aside tolerans kazanmis kültür ayni kosullarda sitoplazma ph sini 5 in üzerinde tutabilmektedir E.coli O157: H7 nin aside tolerans kazanmasi E.coli O157:H7, yüksek asitli ortamlarda canliligini devam ettirmesine olanak saglayan farkli direnç mekanizmalarina sahiptir. Bunlar asitle indüklenen aminoasit dekarboksilaz sistemleri, aside alistirma sistemi ve ATR dir. Aminoasit dekarboksilaz sistemleri, asitle indüklenen arjinin dekarboksilaz, asitle indüklenen glutamat dekarboksilaz ve asitle indüklenen oksidatif sistemlerinden meydana gelir ve E.coli O157:H7 de dogal olarak bulunur. Ilk iki sistemin çalismasi için ortamda arjinin veya glutamatin bulunmasi gereklidir. Bazi kosullarda her iki sistem de ayni anda aktif olabilir. Üçüncü sistem duraklama döneminde aktiftir ve karbonhidrata gerek duymadan

30 XXX çalisabilir. Bu sistemler bir yandan bakterinin asidik gidalarda yasamini sürdürmesineî olanak tanirken diger taraftan sindirim sisteminde karsilastigi olumsuz kosullara direnç göstererek hastalik yapma gücünü artirir (Bearson et al., 1997; Lin et al., 1996). Aminoasit dekarboksilaz sistemleri nötral ph larda bulunan bakterinin ph nin 3 veya daha altinda oldugu bir ortama maruz kalmasi durumunda indüklenir. Bu sirada asit sok proteinleri sentezlenmez. E.coli O157: H7 de bir baska aside direnç mekanizmasi da aside alistirmadir (acid habituation). Bu sistemde bakteri, ph 4,5-5,5 degerlerine sahip bir ortamda uzun süre (18 saat) kalirsa aside direnç kazanabilir. Bu hücreler ph 3,0-3,5 degerleri arasindaki ortamlara, ph 7,0 de üreyen hücrelere göre daha fazla direnç gösterirler (Bearson et al., 1997; Buchanan and Edelson, 1996). Bir baska aside adapte olma sekli E.coli O157: H7 nin aside tolerans kazanmasidir. ATR ilk defa S.typhimurium da kesfedilmis bir sistemdir. E.coli O157: H7 de ATR nin indüklenmesi S.typhimurium da oldugu gibidir. Asit sokuna maruz kalinmasiyla sentezlenen asit soku proteinleri yardimiyla bakteri letal ph degerlerine sahip bir ortama maruz kalmasi durumunda aside direnç kazanarak yasamini sürdürür (Brudzinski and Harrison, 1998). ATR de asit soku proteinlerinin sentezlenmesini özel genler saglar. Bu proteinler bakteriyi asidin zararli etkisinden korur. Heyde and Portalier (1990), E.coli O157: H7 nin bulundugu ortam ph sinin 6,9 dan 4,3 e düsmesi durumunda en az 16 polipeptitin

31 XXXI sentezlendigini bulmustur. Bunlardan 7 tanesi asit soku proteini olarak tanimlanmistir. Bu proteinlerin indüksiyonunu rpo- sigma faktörü düzenler. Bir hipoteze göre inegin sindirim sistemi bahsedilen bu aside tolerans kazanma mekanizmalarindan bir veya daha fazlasinin indüklenmesine olanak saglamaktadir. Kontamine olmus gidanin yenmesiyle daha önceden aside adapte olan bakteri, konakçinin midesinden geçerek bagirsaklarda kolonize olmakta ve enfeksiyona neden olmaktadir. Aside direnç sistemleri sogukta depolama boyunca da etkinligini devam ettirmektedir. E.coli O157: H7, et ürünlerine veya diger gidalara bulastiginda gida uygun kosullarda depolansa bile aside direnç özelligini korumaktadir (Lin et al., 1996). Ancak E.coli O157: H7 nin aside tolerans kazanmasina, bakterinin üreme dönemi, ortamin ph si, ortamda bulunan asidin cinsi, ortamin içerigi gibi faktörlerin etki ettigi de unutulmamalidir (Buchanan and Edelson, 1996; Hsin- Yi et al., 2002) Çapraz Direnç Bakterinin bir stres kosuluna adapte olduktan sonra diger streslere karsi da direnç kazanmasina çapraz direnç denir (Bearson et al., 1997). Bakterilerde çapraz direncin kazanilmasini saglayan mekanizmalar tam olarak aydinlatilamamistir. Ancak farkli stres kosullarinda ayni tip genlerin indüklenmesinin veya indüklenen genlerin birden fazla strese karsi islevinin olmasinin çapraz direnci olusturdugu düsünülmektedir.

32 XXXII Patojen bakterilerin bir strese adapte olduktan sonra diger stres kosullarina da direnç kazanmasi gida sanayiinde oldukça önem kazanmaktadir. Çünkü gidalarin muhafazasi amaciyla uygulanan kimyasal koruyucular, düsük sicaklik, isil islemler veya radyasyon uygulamalari sirasinda gidada bulunan bakterilerin maruz kaldiklari kosullara çapraz direnç kazanmalari onlarin direncini artiracaktir. Böylelikle uygulanan islem kosullarinda inhibe olmasi veya ölmesi beklenen bakteri canli kalarak gidanin tüketilmesi durumunda hastaliklara neden olabilecektir S.typhimurium un çapraz direnç kazanmasi S.typhimurium da ATR nin indüklenmesi sonucu bakteri zayif organik asitler, etanol, hidrojen peroksit, tuz, sicaklik, yüzey aktif ajanlar ve antibiyotiklere karsi çapraz direnç kazanir (Leyer and Johnson, 1992; Leyer and Johnson, 1993). Ancak isi soku veya ozmotik soka maruz kalan S.typhimurium da ATR indüklenmez. Bu açidan degerlendirildiginde bakterinin çapraz direnç kazanmasinda aside maruz kalarak ATR indüklemesi diger çevresel streslere maruz kalmasina göre daha önemlidir ve ATR nin indüklenmesi birçok çevresel streslere karsi bakteride çapraz direnç olusturmaktadir. Aside tolerans kazanmanin disinda S.typhimurium un çapraz direnç kazanmasini saglayan diger önemli stres açlik (starvation) stresidir. Açlik stresine maruz kalarak açliga tolerans kazanan bakteri diger bazi çevresel streslere de direnç kazanabilir. Örnegin, karbon açligina tolerans kazanan S.typhimurium

33 XXXIII ayni zamanda sicaklik, oksidatif stres ve ozmotik strese karsi da çapraz direnç kazanir (Bearson et al., 1997 ; Foster and Spector, 1995) E.coli O157: H7 nin çapraz direnç kazanmasi E.coli O157: H7 de çevresel streslere direnç saglayan en önemli gen rpos genidir. Birçok arastirmaci rpos geninin regule ettigi proteinlerin açlikla indüklendigini, sicaklik ve asit de dahil olmak üzere farkli streslere karsi çapraz direnç sagladigini belirtmistir (Arnold and Kaspar, 1995; Cheville et al., 1996). Bazi dondurulmus ürünlerde, soguk sokuna maruz kalan E.coli O157: H7 nin soguk sokuna maruz kalmayan hücrelere göre daha uzun süre canli kaldigi görülmüstür. Ancak önceden ph 5,0 te aside adapte edilen hücrelerde bu etki olusmamaktadir (Bollman et al., 2001). Ayrica soguk stresi E.coli O157: H7 nin sicakliga olan direncini düsürürken donma-çözünme direncini artirmaktadir. Donma-çözünme direnci; bakterinin, yaklasik -20 C de belirli bir süre kalarak donduktan sonra oda sicakligina maruz kalarak çözünmesi sirasinda gösterdigi direnç olarak tanimlanir. E.coli O157: H7 nin donma-çözünme direnci aside adapte olmasi durumunda artmaktadir. Açlik stresi de E.coli O157: H7 nin donma-çözünme direncini artirmaktadir (Arnold and Kaspar, 1995; Cheville et al., 1996; Goldstain et al., 1990). E.coli O157: H7 de subletal isisal uygulamalarin, bakterinin aside olan toleransini artirdigi bilinmektedir. Bu çapraz direnç sicaklik ve asit

34 XXXIV soku proteinlerinin sentezlenmesi ile meydana gelir. Bu özellik hafif isitma islemi uygulandiktan sonra asidik koruyucu kullanilan gidalarda E.coli O157: H7 nin uzun süre canli kalmasina neden olabilir (Wang and Doyle, 1998) S.typhimurium un Aside Tolerans Kazanmasinin Asidik Gidalardaki Önemi Salmonella dünyada yaygin olarak bulunan bir bakteri olup primer kaynagi saglikli veya hasta insan ve omurgali hayvanlarin bagirsaklaridir den fazla serotipi bulunan Salmonella nin S.typhi ve S.paratyphi türleri disindaki serotipleri salmonellozis etmeni olup gastroenteridise neden olurlar (Karapinar ve Gönül, 1998). S.typhyimurium gram negatif basil seklinde, 37 C de ph 6,5-7,5 degerleri arasinda optimum üreyen, %3-4 NaCl içeren ortamda inhibe olan, donma sicakligina dirençli, isinlamaya ve isisal uygulamalara dirençsiz bir bakteridir. Lisin dekarboksilaz ve ornitin dekarboksilaz pozitif, üre negatiftir. Indol üretmez (ICMSF, 1996). Salmonella nin enfektif dozu serotipe, gida çesidine, tüketicinin yasina ve fizyolojik sartlara bagli olarak degisiklik gösterir. Klinik belirtilerin ortaya çikmasi için hücrenin vücuda alinmasi gerektigi bildirilmekle birlikte yapilan çalismalar birçok vakada enfektif dozun bu sayinin oldukça altinda oldugunu göstermistir. Klinik belirtiler karin agrisi, ates, bas agrisi, bulanti, kusma ve ishaldir. Hastada ishal orta

35 XXXV siddetli veya çok sulu seyredebilir. Diski kanli degildir. Hastada susuzluk ortaya çikar. Belirtiler kontamine gidanin alimindan 5-72 saat sonra ortaya çikar ve hasta 1-7 gün sonra tibbi bir tedaviye gerek duyulmadan iyilesebilir. Ancak özellikle bebek ve yaslilarda ölüme yol açabilir (Karapinar ve Gönül, 1998). Salmonella nin su ve gidalara bulasmasi insan ve hayvana ait diski veya lagim sulari yoluyla meydana gelir. Çiftlik hayvanlarinda enfeksiyon, yedikleri kontamine yemlerden, tasima sirasinda veya hayvan pazarinda, mezbahalarda hayvandan hayvana veya insandan hayvana temas yoluyla gerçeklesebilmektedir (ICMSF, 1996). Kümes hayvanlari, insan gida zincirinde asemptomatik Salmonella yayicisi hayvanlar içerisinde en önemli yeri tutar. Enfekteli damizliklardan temin edilen yumurtalar veya civcivler enfeksiyonun hizli bir sekilde yayilmasinda en önemli faktörlerdendir (Karapinar ve Gönül, 1998). Hayvanlarin uygun olmayan kosullarda tasinmasi ve mezbahalarda haslama, tüy yolumu ve sogutma kademelerinde meydana gelen çapraz bulasmalar da enfeksiyonun yayilmasinda önemli noktalari olusturur (Karapinar ve Gönül, 1998). Salmonella enfeksiyonlarinda hayvansal kaynakli ürünler öncelikli olarak görülmekle birlikte son yillarda meyve, sebze ve ürünleri ile bazi asidik gidalarinda Salmonella enfeksiyonlarinda aracilik ettigi

36 XXXVI görülmektedir. Meyve ve sebzeler patojen mikroorganizmalarla ekili alanlarda, hasat sirasinda veya sonrasinda, fabrikada islenirken, dagitim sirasinda veya servise hazirlanirken bulasabilir (Beuchat, 2002). Çizelge 2.1 de bazi ülkelerde Salmonella izole edilen sebzelere örnekler verilmistir. Çizelge 2.1. Bazi ülkelerde Salmonella izole edilen taze sebzeler (Beuchat, 2002). Gida Enginar Fasulye Pancar Lahana Kirmizi biber Hindiba Rezene Marul Marul Marul Maydanoz Ispanak Ülke Ispanya Tayland Ispanya Ispanya Hollanda Ispanya Hollanda Italya Hollanda Ispanya Ispanya Ispanya Pozitif Örnek Sayisi/Toplam sayi (Pozitif örnek yüzdesi) 3/25 (%12) 30/344 (%8,7) 4/52 (% 7,7) 7/41 (%17,1) 2/26 (%7,7) 2/13 (%15,3) 2/26 (%7,7) 82/120 (%68,3) 2/28 (%7,1) 5/80 (%6,3) 1/23 (%4,3) 2/38 (%5,3)

37 XXXVII Meyve ve sebzelerin büyük çogunlugunun ph lari patojen bakterilerin gelismesini inhibe edecek düzeydedir. Ancak son yillarda meyve, sebze ve ürünlerinden kaynaklanan Salmonella nin neden oldugu enfeksiyonlar meydana gelmektedir (Çizelge 2.2). Bu tür ürünlere Salmonella hayvansal gübreler araciligiyla veya kontamine suyun kullanilmasi sonucu bulasmaktadir. Salmonella nin asidik gidalarda canli kalarak enfeksiyon meydana getirmesinin en önemli nedenlerinden birisi maruz kaldigi asidik ortama tolerans kazanmasidir. S.typhimurium un aside tolerans kazanmasi durumunda bazi asidik gidalarda aside direnç kazanarak daha uzun süre canli kalabilecegini gösteren çalismalar vardir. Bu çalismalardan bir tanesinde Leyer and Johnson (1992), aside tolerans kazanmis S.typhimurium un peynirin fermantasyonu asamasinda, aside tolerans kazanmamis kültüre göre daha uzun süre canli kaldigini tespit etmislerdir. Ayni çalismada aside tolerans kazanmis S.typhimurium un 5 C de iki ay boyunca depolanan çedar, Isviçre ve mozzarella peynirlerinde aside tolerans kazanmamis kültüre göre daha uzun süre canli kaldigi da tespit edilmistir.

38 XXXVIII Çizelge 2.2. Taze sebze, meyve ve pastörize edilmemis ürünlerin neden oldugu Salmonella kaynakli enfeksiyonlar (Beuchat, 2002). Yil Yer Gida ABD ABD ABD ABD ABD Isviçre Finlandiya ABD ABD ABD Karpuz Elma Cideri Karpuz Domates Domates Alfalfa filizi Alfalfa filizi Portakal suyu Alfalfa filizi Alfalfa filizi Leyer et al., (1995) elma ciderinde (düsük alkollü elma suyu) yaptigi çalismada ise aside tolerans kazanmis S.typhimurium un 4 C de depolanan örnekte 28 saat sonra yalnizca 10 kat azalirken, aside tolerans kazanmamis kültürün ayni kosullarda tamamen öldügünü tespit etmistir.

39 XXXIX 2.5. E.coli O157: H7 nin Aside Tolerans Kazanmasinin Asidik Gidalardaki Önemi E.coli hayvanlarin ve insanlarin barsak sistemlerinin normal florasinda bulunan zararsiz bir bakteridir. Ancak insanlarda hastaliklara neden olan patojen türleri de bulunmaktadir. Bu patojen türler virülans özellikleri, patojenite mekanizmalari, klinik sendromlar ve O: H serotiplerine göre siniflandirildiginda baslica; enteropatojenik (EPEC), enterotoksijenik (ETEC), enteroinvasiv (EIEC), enterohemorajik (EHEC), diffuse- adhering (DAEC) ve entero- aggregative (EaggEC) olmak üzere alti grupta toplanmaktadir (Halkman vd., 2001). E.coli O157: H7 EHEC grubu içinde bulunan bir serotip olup 1982 yilinda gida kaynakli bir patojen oldugu tanimlanmistir (Padhye and Doyle, 1992). E.coli O157: H7 gram negatif basil seklinde, fakültatif anaerob, 37 C de ph 7,2 de optimum üreyen, hareketli, % 6,5 NaCl içeren ortamda gelisebilen, donma sicakligina dirençli, isinlamaya ve isisal uygulamalara dirençsiz bir bakteridir. 24 saatte sorbitolü fermente edememesi, ß- glukuronidaz enzim aktivitesine sahip olmamasi ve C de gelisememesi veya çok zor gelisebilmesi özellikleri ile diger E.coli suslarindan ayrilir (Coia, 1998; Halkman vd., 2001). E.coli O157: H7 Shigella dysenteriae tip 1 in ürettigi shiga toksin ile homolog yapida shiga benzeri toksin 1 (stx 1) ve shiga

40 XL benzeri toksin 2 (stx 2) olarak adlandirilan iki ayri toksin üretir. Bu toksinler HeLa ve Vero doku kültürü hücrelerine toksik etki yaparlar. Bundan dolayi verotoksin 1 ve 2 (VT-1 ve VT-2 ) olarak da adlandirilirlar. Günümüzde verotoksin üreten 100 den fazla E.coli serotipinin oldugu bilinmektedir. Ancak E.coli O157: H7 verotoksin üreten en önemli sus olup, bilinen en tehlikeli gida kaynakli patojen bakteriler arasinda degerlendirilmektedir. H7 disindaki diger H tipleri de tanimlanmistir. Ancak bunlar verotoksijenik degildir (Coia, 1998). E.coli O157: H7 nin enfektif dozu 100 hücreden daha azdir. Insanlarda, hemorajik kolitis (HC), hemolitik üremik sendrom (HUS) ve trombotik trombositopenik purpura (TTP) olarak adlandirilan ve ölümle sonuçlanabilen hastaliklara neden olur. HC, krampli karin agrilari ile baslar, saat içinde sulu diyare ile devam eder, diyare sirasinda görülen kan artar ve diski tümüyle kan olur. Hastalarin yarisinda kusma görülürken ates pek görülmez. Hastalik 3-9 gün sürer. HUS E.coli O157: H7 nin neden oldugu enfeksiyonlarin içinde en tehlikeli olanidir. Böbrek yetmezligine yol açar. Hastalara diyaliz ve kan nakli gerekebilir. Merkezi sinir sistemi etkilenir. Sarilik, yüksek tansiyon veya kalp yetmezligine yol açabilir. Bu hastaliga Stx 1 toksini neden olur. Hastalik ölümle sonuçlanabilir. TTP ise beyinde kan pihtisina neden olur. Genellikle ölümle sonuçlanir ancak HUS ve HC e göre daha az görülür (Coia, 1998; Halkman vd., 2001). E.coli O157: H7 nin neden oldugu enfeksiyonlarda HUS veya TTP görülme orani % 20 dir. HUS gelisen vakalarin %5 i ölümle sonuçlanmaktadir. Bu oran okul öncesi çocuklarda veya 65 yasin

41 XLI üzerindeki yaslilarda % 50 ye kadar yükselmektedir (Todd and Dundas, 2001). E.coli O157: H7 nin baslica kaynagi sigirlar olmakla birlikte koyun, geyik, domuz, kedi, köpek ve kuslar gibi diger sicak kanli hayvanlarda da bulunabilmektedir. Insanlara, tasiyici veya hasta hayvanla temas sonucu, kisiden kisiye bulasma veya kontamine gidanin tüketilmesi sonucu bulasir. Suyun veya topragin fekal yollarla kirlenmesi ise ekili alanlarda ürünlere tasinmasina neden olur. Geçmis yillarda meydana gelen E.coli O157: H7 nin neden oldugu gida kaynakli hastaliklarda, yetersiz isisal islem görmüs et ürünleri, çig süt, taze sikilmis meyve sulari, elma cideri, yogurt, peynir, sosis, mayonez ve beyaz turp filizi gibi gidalarin tüketildigi görülmektedir (Bell, 2002). E.coli O157: H7 dondurulmus veya sogukta saklanan ürünlerde, düsük su aktivitesine sahip ürünlerde ve asidik gidalarda uzun süre canliligini sürdürebilir. Bu ortamlarda karsilastigi olumsuz çevre kosullarina adapte olarak direnç kazanabilir (Hsin- Yi and Chou, 2001; Leenanon and Drake 2001). E.coli O157: H7 birçok yolla insanlara bulasarak hastaliklara yol açabilir. Mezbahanelerde derinin yüzülmesi veya iç organlarin çikarilmasi sirasinda ete bulasabilir veya E.coli O157: H7 ile enfekte olmus hayvanla temas sonucu çalisanlara geçebilir. Bazi durumlarda gida çalisanlari da bu bakterinin yayilmasina neden olabilir. E.coli O157: H7 ile kontamine olmus gübreler, kullanildiklari tarimsal alanlara bu

42 XLII bakteriyi tasir ve bu alanlarda yetisen ürünlere bulasmasina neden olur. (Bell, 2002). Et ürünleri, çesitli peynirler, çig süt, salatalar, salata soslari, sandviç, turp filizi gibi gidalarin yani sira patojen bakteriler açisindan güvenilir gidalar grubuna giren yogurt, meyve sulari, pastörize edilmemis elma sarabi, taze sikilmis meyve suyu E.coli O157: H7 nin neden oldugu hastaliklarda rol oynayan gidalara örnek olarak verilebilir (Halkman vd., 2001). Amerika da yillari arasinda E.coli O157: H7 nin neden oldugu hastalik vakalarinin %52 si sigir etinden yapilan ürünler, %16 si kisiden kisiye bulasmalar, %14 ü meyve ve sebze tüketimi, %12 si su ve %5 i diger gidalarin tüketimi sonucu meydana gelmistir. Amerika Hastalik Önleme Dairesinin (US Center for Disease Control) raporuna göre Amerika da yilda EHEC vakasi meydana gelmekte, bu vakalarda 250 kisi ölmekte ve milyon dolar zarar meydana gelmektedir. Amerika, Arjantin, Avusturya, Belçika, Danimarka, Almanya, Italya, Israil, Isviçre ve Güney Afrika E.coli O157: H7 nin neden oldugu gida kaynakli hastaliklarin görüldügü ülkelere örnek olarak verilebilir (Anonymous, 1997). Bugüne kadar E.coli O157: H7 nin neden oldugu en büyük salgin, 1996 yilinda Japonya nin Sakai sehrinde okullarda yemekte verilen beyaz turp filizinin yenmesi sonucu meydana gelmistir. Bu salginda 5727 kisi hastalanmistir. Bu rakam sehir nüfusunun %0,5 ini meydana getirmektedir (Anonymous, 1997). Çizelge 2.3 de E.coli O157: H7 den kaynaklanan hastaliklarda rol oynayan gidalar ve olasi bulasma nedenleri gösterilmistir.

43 XLIII Çizelge 2.3. E.coli O157: H7 nin neden oldugu gida kaynakli hastaliklar ve olasi nedenleri (Bell, 2002). Yil ve Ülke Organizma Ürün Olasi neden ABD E.coli O157: H7 Stx 1 ve Stx 2 Köfte (beefburger) Kontamine etin yetersiz pisirilmesi, E.coli O157: H7 nin tüketime kadar üründe canli kalmasi Avusturya VTEC O111: NM Çig fermente et ürünü Çig etin kontaminasyonu, yetersiz islem kontrolü, son ürüne çapraz bulasma 1991 ve 1996 ABD E.coli O157: H7 Taze sikilmis elma suyu Elmalarin yere düsmesi ve kontamine gübre ile temasi, yetersiz yikama islemi, E.coli O157:H7 nin düsük ph ve sogukta meyve suyunda canli kalmasi 1996 ABD E.coli O157: H7 Salata Tarim alanlarinin kontamine su ile sulanmasi, bu alanlara hayvanlarin girmesi, yikama suyunun kontamine olmasi, hijyenik kosullarin yetersizligi 1996 Japonya E.coli O157: H7 Beyaz turp Filizlenmeden önce Stx 1 ve Stx 2 filizi içeren kontaminasyon, yikama okul yemegi sirasinda canli kalmasi çimlenme sirasinda üreme

44 XLIV Amerika da pastörize edilmeden yapilan elma cideri ve taze sikilarak tüketilen elma suyunun tüketilmesi sonucu E.coli O157: H7 nin neden oldugu birçok hastalik vakasi meydana gelmistir. Bu vakalarin birçogunda ishal ve HUS un gelistigi görülmüstür. Elma bahçelerinde yere düsen ve toprakla veya gübreyle temas eden elmalara E.coli O157: H7 nin bulastigi sanilmaktadir. Bu vakalardan sonra arastirmacilar elma ciderinde E.coli O157:H7 nin canliligini arastirmislar ve 4 C de sogukta depolama süresince elma ciderinde bakterinin haftalarca canli kalabilecegini tespit etmislerdir (Miller and Kaspar, 1994; Leyer et al., 1995; Ryu and Beuchat, 1998; Zhao et al., 1993). E.coli O157:H7 sucugun fermentasyonu, kurutulmasi ve depolanmasi asamalarinda canli kalabilir. Cosansu and Ayhan (2000), E.coli O157:H7 nin vakumla paketlenmis sucuklarda 2 ay, vakumla paketlenmemis sucuklarda 1 ay canli kalabilecegini tespit etmistir. Sosis üretiminde de E.coli O157:H7 fermentasyon, kurutma ve depolama asamalarinda canliligini sürdürebilir (Glass et al., 1992). Cutter and Siragusa (1994), sigir karkaslarina bulasan E.coli O157: H7 nin organik asitlerle karkasa yapilan duslama islemi ile tamamen yok edilemeyecegini göstermistir. Asidik gidalarda yapilan çalismalar, bakterinin aside tolerans kazanmasi durumunda, mayonez, ketçap ve bazi meyve sularinda aside olan direncini artirabilecegini göstermistir (Hsin- Yi and Chou, 2001; Tsai and Ingham, 1997; Weagant et al., 1994).

45 XLV 3. MATERYAL VE METOT 3.1. Materyal Deney kültürleri Deneylerde kullanilan Salmonella typhimurium NRRL E 4463 susu Ege Üniversitesi Mühendislik Fakültesi Gida Mühendisligi Bölümünden temin edilmistir. Escherichia coli O157: H7 932 susu ise Prof. Dr. M. P. Doyle un (Center for Food Safety and Quality Enhancement, Department of Food Science and Technology, The University of Georgia, Griffin, Georgia, USA) kültür koleksiyonundan temin edilmistir. Kültürler Tryptic Soy Agar (TSA, Oxoid CM 131) besiyerinde üç ayda bir transfer edilmek suretiyle +4 C de stok kültür olarak saklanmistir. S.typhimurium deneylerde kullanilmadan önce stok kültürden E Glikoz besiyerine aktarilarak iki kez 37 C de 24 saat inkübe edilerek aktiflestirilmistir. E.coli O157:H7 ise stok kültürden Tryptic Soy Broth (TSB, Oxoid CM 129) besiyerine aktarilarak iki kez 37 C de 24 saat inkübe edilerek aktiflestirilmistir Besiyerleri ve hazirlanislari S.typhimurium deneylerinde kullanilan E Glikoz besiyeri (EGB, ph 7,0) ve E Tamponu (ph 7,0) içeriginden hazirlanmistir. Deneylerde

46 XLVI kullanilan diger besiyerleri ise dehidre formda ticari ürünler olup üretici firmanin önerisi dogrultusunda hazirlanmistir. EGB besiyerini hazirlamak için 10 g MgSO 4.7H 2 O (Baker 168), 100 g sitrik asit monohidrat (Carlo Erba ), 500 g K 2 HPO 4 (Merck A857401) ve 175 g NaHNH 4 PO 4.4H 2 O (Acros ) tartilmis ve 670 ml suda eritilmistir. Hazirlanan bu stok çözelti 50 kat seyreltildikten sonra 99 ml çözelti içine %0,4 lük glikoz (Oxoid L71) çözeltisinden 1 ml ilave edilmis ve 121 C de 15 dakika sterilize edilmistir (Vogel and Bonner, 1956). E Tamponu, EGB besiyeri için hazirlanan stok çözelti 50 kat seyreltilerek hazirlanmis ve 121 C de 15 dakika sterilize edilmistir (Vogel and Bonner, 1956) Gida örnekleri Deneylerde kullanilan gida örnekleri Izmir den temin edilmis olup orijinal ambalajlarinda laboratuara getirilmis ve analize alinincaya kadar buzdolabinda korunmustur. Yogurt yapiminda kullanilan çig süt ise Ege Üniversitesi Ziraat Fakültesinden temin edilmis olup ayni gün deneylerde kullanilmistir. Deneylerde kullanilan gida örnekleri mayonez, salgam suyu, ayran, taze sikilmis portakal suyu ve pastörize edilmis seftali nektari, kayisi nektari, elma suyu ve portakal suyudur. Mayonez; bitkisel yag, yumurta, su, sirke, tuz, seker, limon suyu konsantresi ve çesitli baharatlardan üretilmis olup raf ömrü bir yildir. Salgam suyu; su, tuz, siyah havuç ve salgam turpundan üretilmistir. Raf ömrü bir yildir.