ANKARA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ

Transkript

1 ANKARA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ Streptococcus salivarius subsp. thermophilus ve Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus SUŞLARINDA LİZOGENİNİN ARAŞTIRILMASI Emel KAHRAMAN GIDA MÜHENDİSLİĞİ ANABİLİM DALI ANKARA 2006 Her hakkı saklıdır

2 ÖZET Yüksek Lisans Tezi Streptococcus salivarius subsp. thermophilus ve Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus SUŞLARINDA LİZOGENİNİN ARAŞTIRILMASI Emel KAHRAMAN Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Gıda Mühendisliği Anabilim Dalı Danışman: Prof. Dr. Nezihe TUNAİL Bu çalışmada; 30 u çiğ, 43 ü pastörize sütlerden izole edilmiş, 10 u endüstriyel starter kökenli 83 adet S. thermophilus ve yine 22 si çiğ süt, 12 si pastörize sütlerden izole edilmiş, 5 i endüstriyel starter kökenli ve 1 adet Lb. bulgaricus ATCC suşunun da dahil olduğu 40 adet Lb. bulgaricus olmak üzere toplam 123 suş ile çalışılmıştır. S. thermophilus ve Lb. bulgaricus suşlarında mitomisin C (MC) ilavesi, ultraviyole (UV) ışını uygulaması ve sıcaklık yükseltilmesi ile lizogeni durumları araştırılmıştır. Ayrıca suşların faja direnç durumları pastörize sütlerden izole edilmiş 53 S. thermophilus suşu ile 12 Lb. bulgaricus suşunda belirlenmiştir. Direnç çalışmalarına Lb (referans suş) ve Ch-Lb12 (endüstriyel suş) olmak üzere 2 adet Lb. bulgaricus suşu da dahil edilmiştir. Pastörize sütlerden izole edilmiş olan 43 adet yerel S. thermophilus suşunun tamamı kendi türünün 13 fajından hiçbiri ile liziz plağı göstermemiştir. Yine tüm suşlar St 447 dışında kendi türünün fajları olmayan 12 adet Lb. bulgaricus fajına da tam dirençli bulunmuştur. St 447 hariç suşların hiçbirisi test edilen fajlara kendi konakçılarının dışında tür içi veya cinsler arası heterolog konakçı olarak davranmamıştır. Yerel Lb. bulgaricus suşları kendi türünün yerel fajlarına karşı tam duyarlı bulunurken, endüstriyel Ch-Lb12 suşu ise denenen fajlara kısmen dirençli bulunmuştur. Denenen tüm yerel Lb. bulgaricus suşları ise beklenildiği gibi S. thermophilus fajlarına karşı ağırlıklı olarak dirençli bulunmuştur. S. thermophilus ve Lb. bulgaricus temperent fajlarının izolasyonu amacıyla suşlarda MC, UV ışını ve sıcaklık yükseltilmesi (45 C) uygulamaları profaj indüksiyonu için kullanılmıştır. S. thermophilus suşları için temperent faj içeren referans lizogen suş olan S. thermophilus CNRZ 1205 ile belirlenen etkili indüksiyon dozları tüm S. thermophilus suşlarına uygulanmış, ne yerel ne de starter kökenli suşlar lizogenik karakterde bulunamamıştır. Profaj indüksiyonunda Lb. bulgaricus için referans lizogen suş temin edilemediğinden tüm suşlara geniş indüksiyon doz aralığı uygulanmış, ancak bu suşların da hiçbirinde lizogeni belirlenememiştir. 2006, 99 sayfa Anahtar Kelimeler: Streptococcus salivarius subsp. thermophilus, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, lizogeni, faja direnç i

3 ABSTRACT Master Thesis INVESTIGATION OF LYSOGENY OF Streptococcus salivarius subsp. thermophilus AND Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus STRAINS Emel KAHRAMAN Ankara University Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Food Engineering Supervisor: Prof. Dr. Nezihe TUNAİL In this study, totally 123 strains were studied, i.e. 83 strains S. thermophilus (30 isolated from raw milk, 43 isolated from pasteurized milk, 10 strains originated starter culture) and 40 strains of Lb. bulgaricus (22 isolated from raw milk, 12 isolated from pasteurized milk, 5 of industrial starter origin and Lb. bulgaricus ATCC 11842). Lysogeny positions were investigated by addition of mytomycine C (MC), application of ultraviolet (UV) irradiation and increasing temperature. Additionally, phage resistance positions of the strains were determined by using 53 strains of S. thermophilus and 12 strains of Lb. bulgaricus that were isolated from pasteurized milk. Also, two Lb. bulgaricus strains, Lb (reference strain) and Ch-Lb12 (industrial strain), were included to resistance experiments. All of the 43 native Lb. bulgaricus strains did not display lysis plaque with 13 phages of their own species. These strains, except St 447, also showed entire resistance against 12 Lb. bulgaricus phages those were not belonged to their own species. None of these strains, except St 447, behaved as heterologous host among genera or in species, excluding their own host. Native Lb. bulgaricus strains were entire resistant against native phages of their own species whereas the industrial strain Ch-Lb12 was partially resistant to tested phages. All tested native Lb bulgaricus strains displayed a general resistance to S. thermophilus phages as expected. By the aim of isolation of S. thermophilus and Lb. bulgaricus temperate phages; MC, UV irradiation and increasing temperature (45 o C) applications were used for prophage induction in strains. Effective induction doses determined by S. thermophilus CNRZ 1205, which is a reference lysogenic strain that contains temperate phages for S. thermophilus strains, were applied to all S. thermophilus strains. Neither native strains nor those of starter origin displayed a lysogenic character. A wide induction range was applied to all strains due to the lack of reference lysogenic strain for Lb. bulgaricus for prophage induction; however, no lysogeny could have been determined in any of these strains. 2006, 99 pages Key Words: Streptococcus salivarius subsp. thermophilus, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, lysogeny, phage resistance ii

4 TEŞEKKÜR Bana bu alanda kendisiyle birlikte çalışma şansını tanıyan ve çalışmamın her aşamasında yakın ilgi ve desteğini esirgemeyen sevgili Hocam Sayın Prof. Dr. Nezihe TUNAİL e, Tezim sırasında desteklerini esirgemeyen değerli hocalarım Prof. Dr. Kadir HALKMAN, Prof. Dr. Kamuran AYHAN ve Doç. Dr. İbrahim ÇAKIR a Anlayışlarını, desteklerini ve yardımlarını esirgemeyen sevgili laboratuvar arkadaşlarım Şeyda ÖZYURT ve Esra ACAR a Çalışmalarımda bana yardımcı olan sevgili Mustafa GAYRETLİ ye ve Dr. Serap COŞANSU ya En içten teşekkürlerimi sunarım. Ayrıca maddi manevi desteklerini hiçbir zaman esirgemeyen ve bugüne gelmemi sağlayan canım aileme sevgi ve saygılarımı sunmayı bir borç bilirim. Emel KAHRAMAN Ankara, Mart 2006 iii

5 İÇİNDEKİLER ÖZET.i ABSTRACT.ii TEŞEKKÜR iii ŞEKİLLER DİZİNİ iv ÇİZELGELER DİZİNİ.. v 1. GİRİŞ...i 2. KAYNAK ÖZETLERİ Yoğurt Üretimi ve Yoğurt Bakterilerinin Genel Özellikleri S. thermophilus un özellikleri Lb. bulgaricus un özellikleri Starter kültürlerin fajlarla ilişkisi Faj Kontaminasyon Kaynakları ve Termofilik Fajların Orijini Termofilik Fajların Morfolojik Özellikleri ve Sınıflandırılması Termofilik Bakteriyofajların Konakçı İlişkileri Litik yaşam çemberi Lizogenik yaşam çemberi Pseudolizogenik ilişki Faj direnç mekanizmaları MATERYAL VE YÖNTEM Materyal Bakteriler Bakteriyofajlar Yöntem Faj dirençliliğinin belirlenmesi S. thermophilus suşlarının faja dirençliliği Lb. bulgaricus suşlarının faja dirençliliği Faj titresinin yükseltilmesi ve belirlenmesi S. thermophilus suşlarının ve fajlarının korunması Lb. bulgaricus suşlarının ve fajlarının korunması Faj indüksiyon (Lizogeni) çalışmaları Uygun MC konsantrasyonunun belirlenmesi S. thermophilus suşlarında MC ile profaj indüksiyonu Lb. bulgaricus suşlarında MC ile profaj indüksiyonu S. thermophilus suşlarında UV ile profaj indüksiyonu Lb. bulgaricus suşlarında UV ile profaj indüksiyonu S. thermophilus suşlarının sıcaklık yükseltilmesiyle profaj indüksiyonu Lb. bulgaricus suşlarının sıcaklık yükseltilmesiyle profaj indüksiyonu BULGULAR VE TARTIŞMA Suşların Fajlara Dirençleri Profaj İndüksiyon (Lizogeni) Çalışmaları Uygun mitomisin C (MC) konsantrasyonunun belirlenmesi S. thermophilus ve Lb. bulgaricus suşlarında MC ile profaj indüksiyonu Uygun UV indüksiyon dozunun belirlenmesi S. thermophilus ve Lb. bulgaricus suşlarının UV ile profaj indüksiyonu iv

6 S. thermophilus ve Lb. bulgaricus suşlarının sıcaklık yükseltilmesi ile profaj indüksiyonu SONUÇ KAYNAKLAR EK ÖZGEÇMİŞ v

7 ŞEKİLLER DİZİNİ Şekil 2. 1 S. thermophilus a ait fst X18-B3 fajının elektron mikroskobunda çekilmiş görüntüsü Şekil 2. 2 Lambda faj DNA sının replikatif forma dönüşümü Şekil 2. 3 Lambda faj genomu Şekil 2. 4 İnfeksiyondan sonra lizogeni oluşumu Şekil 2. 5 Faj DNA sının bakteri DNA sına dönüşümlü entegrasyonu ve insersiyonu Şekil 2. 6 Repressör sentezinin regülasyonuna bağlı olarak litik veya lizogenik döngüye geçiş Şekil 3. 1 CNRZ 1205 lizogen suşu ile uygun MC konsantrasyonun belirlenmesi Şekil 3. 2 UV uygulaması ile profaj indüksiyonu Şekil 4. 2 Farklı MC konsantrasyonlarının pastörize sütten izole edilmiş St 216 S. thermophilus suşunun gelişimine etkisi Şekil 4. 3 Farklı MC konsantrasyonlarının pastörize sütten izole edilmiş St 239 S. thermophilus suşunun gelişimine etkisi Şekil 4. 4 Farklı MC konsantrasyonlarının pastörize sütten izole edilmiş St 436 S. thermophilus suşunun gelişimine etkisi Şekil 4. 5 Farklı MC konsantrasyonlarının doğal St 23.1 S. thermophilus suşunun gelişimine etkisi Şekil 4. 6 Farklı MC konsantrasyonlarının doğal St 20.3 S. thermophilus suşunun gelişimine etkisi Şekil 4. 7 Farklı MC konsantrasyonlarının Lb Lb. bulgaricus suşunun gelişimine etkisi Şekil 4. 8 Farklı MC konsantrasyonlarının Ch Lb-12 Lb. bulgaricus suşunun gelişimine etkisi Şekil 4. 9 UV ışınlarının referans lizogen suş S. thermophilus CNRZ 1205 in gelişimine etkisi Şekil Farklı dozlarda UV ışınına maruz bırakılan doğal St 3.3 S. thermophilus suşunun gelişim eğrisi Şekil Farklı dozlarda UV ışınına maruz bırakılan doğal St 7.6 S. thermophilus suşunun gelişim eğrisi Şekil Farklı dozlarda UV ışınına maruz bırakılan pastörize süt kökenli St 440 S. thermophilus suşunun gelişim eğrisi Şekil Farklı dozlarda UV ışınına maruz bırakılan pastörize süt kökenli St 217 S. thermophilus suşunun gelişim eğrisi Şekil Farklı dozlarda UV ışınına maruz bırakılan pastörize süt kökenli Lb 2001 Lb. bulgaricus suşunun gelişim eğrisi Şekil 4.15 Farklı dozlarda UV ışınına maruz bırakılan pastörize süt kökenli Lb 1319 Lb. bulgaricus suşunun gelişim eğrisi Şekil Sıcaklık yükseltilmesinin, çiğ süt kökenli yerel S. thermophilus suşlarının gelişimine etkisi Şekil Sıcaklık yükseltilmesinin pastörize sütlerden izole edilen yerel S. thermophilus suşlarının gelişimine etkisi Şekil Sıcaklık yükseltilmesinin çiğ sütlerden ve pastörize sütlerden izole edilmiş yerel Lb. bulgaricus suşlarının gelişimine etkisi vi

8 ÇİZELGELER DİZİNİ Çizelge 2. 1 S. thermophilus fajlarının endüstriyel S. thermophilus suşlarına karşı gösterdikleri litik aktivite 23 Çizelge 4. 1 Pastörize sütlerden izole edilmiş 43 adet S. thermophilus suşunun değişik süt ürünlerinden izole edilmiş 13 adet S. thermophilus fajına karşı dirençleri 49 Çizelge 4. 2 Pastörize sütlerden izole edilmiş 43 adet S. thermophilus suşunun değişik süt ürünlerinden izole edilmiş 12 adet Lb. bulgaricus fajına karşı dirençleri 53 Çizelge 4. 3 Pastörize sütlerden izole edilmiş 12 adet Lb. bulgaricus suşunun değişik süt ürünlerinden izole edilmiş 12 adet Lb. bulgaricus fajına karşı dirençleri 57 Çizelge 4. 4 Pastörize sütlerden izole edilmiş 12 adet Lb. bulgaricus suşunun değişik süt ürünlerinden izole edilmiş 13 adet S. thermophilus fajına karşı dirençleri 59 Çizelge 4. 5 MC ile indüklenen lizogen S. thermophilus CNRZ 1205 kültüründe inkübasyon süresince izlenen optik yoğunluk (absorbans) değerleri.62 Çizelge 4. 6 Dört farklı MC konsantrasyonu ile indüklenen pastörize sütten izole edilmiş St 216 S. thermophilus suşunun inkübasyon süresince izlenen optik yoğunluk (absorbans) değerleri.64 Çizelge 4. 7 Dört farklı MC konsantrasyonu ile indüklenen pastörize sütten izole edilmiş St 239 S. thermophilus suşunun inkübasyon süresince izlenen optik yoğunluk (absorbans) değerleri.65 Çizelge 4. 8 Dört farklı MC konsantrasyonu ile indüklenen pastörize sütten izole edilmiş St 436 S. thermophilus suşunun inkübasyon süresince izlenen optik yoğunluk (absorbans) değerleri.66 Çizelge 4. 9 Dört farklı MC konsantrasyonu ile indüklenen doğal St 23.1 S. thermophilus suşunun inkübasyon süresince izlenen optik yoğunluk değerleri.67 Çizelge Dört farklı MC konsantrasyonu ile indüklenen doğal St 20.3 S. thermophilus suşunun inkübasyon süresince izlenen optik yoğunluk değerleri.68 Çizelge Altı farklı MC konsantrasyonu ile indüklenen Lb Lb. bulgaricus suşunun inkübasyon süresince izlenen optik yoğunluk (absorbans) değerleri..70 Çizelge Altı farklı MC konsantrasyonu ile indüklenen Ch Lb12 Lb. bulgaricus suşunun inkübasyon süresince izlenen optik yoğunluk değerleri..71 Çizelge UV ile indüklenen lizogen S. thermophilus CNRZ 1205 kültürlerinde inkübasyon süresince izlenen optik yoğunluk değerleri...74 Çizelge Beş farklı UV dozu ile indüklenen doğal St 3.3 S. thermophilus suşunun inkübasyon süresince izlenen optik yoğunluk değerleri...76 Çizelge Beş farklı UV dozu ile indüklenen doğal St 7.6 S. thermophilus suşunun inkübasyon süresince izlenen optik yoğunluk değerleri...77 vii

9 Çizelge Beş farklı UV dozu ile indüklenen pastörize süt kökenli St 440 S. thermophilus suşunun inkübasyon süresince izlenen optik yoğunluk değerleri..78 Çizelge Beş farklı UV dozu ile indüklenen pastörize süt kökenli St 217 S. thermophilus suşunun inkübasyon süresince izlenen optik yoğunluk (absorbans) değerleri..79 Çizelge Altı farklı UV dozu ile indüklenen pastörize süt kökenli Lb 2001 Lb. bulgaricus suşunun inkübasyon süresince izlenen optik yoğunluk değerleri..81 Çizelge Altı farklı UV dozu ile indüklenen pastörize süt kökenli Lb 1319 Lb. bulgaricus suşunun inkübasyon süresince izlenen optik yoğunluk değerleri.82 Çizelge Çiğ süt kökenli yerel S. thermophilus suşlarının sıcaklık yükseltilmesi ile indüksiyon çalışması sırasında izlenen optik yoğunluk değerleri..84 Çizelge Pastörize sütlerden izole edilen yerel S. thermophilus suşlarının sıcaklık yükseltilmesi ile indüksiyon çalışması sırasında izlenen optik yoğunluk değerleri.85 Çizelge Pastörize sütlerden izole edilen (Lb 1415, Lb 1471, Lb 1472) ve çiğ süt kökenli yerel (Lb 6502, Lb 6604) Lb. bulgaricus suşlarının sıcaklık yükseltilmesi ile indüksiyon çalışması sırasında izlenen optik yoğunluk değerleri..86 viii

10 1. GİRİŞ Süt endüstrisinde kaliteli, istenen özelliklere sahip, standart ürün elde etmek için starter kültürlerin kullanımına gerek duyulmaktadır. Seçilecek olan kültürler teknolojik proses parametreleri ile birlikte üretilecek olan yoğurt, peynir, tereyağı vb. ürünlerin kalitesini önemli ölçüde etkilemektedir. Ülkemizde ve birçok ülkede yaygın olarak kullanılan yoğurt, Streptococcus thermophilus (S. thermophilus) ve Lactobacillus bulgaricus (Lb. bulgaricus) Laktik asit bakterilerinin sütte bulunan laktozu fermente etmesiyle oluşan bir süt ürünüdür. Büyük ölçekli ve ileri teknoloji kullanan işletmeler yoğurt üretimi sırasında yurt dışı kaynaklı ticari yoğurt kültürlerini starter olarak kullanmaktadır. S. thermophilus ve Lb. bulgaricus kültürleri arasında simbiyotik ilişki bulunmaktadır. Yoğurt üretiminde çubuk : kok oranı 1:1 ya da 1:2 olacak şekilde süte ilave edilmektedir. Bu oran başlangıçta sabit olsa da fermentasyon sürecinde ilk önce S. thermophilus lehine daha sonra da düşük asitlik seviyelerinde gelişebilen Lb. bulgaricus lehine dönerek son üründe dengelenmektedir. Bu iki bakteri yoğurt oluşumu sırasında birbirlerinin fizyolojik gelişimlerini destekleyerek laktozun kısa sürede laktik aside dönüşmesini sağlamaktadır. Oluşan laktik asit, kazein misellerinin izoelektrik noktasında presipitasyonunu sağlayarak yoğurdun arzulanan kıvamda olmasını sağlamaktadır. Laktik asit ile birlikte, yoğurt aromasının ana bileşeni olan asetaldehit yanında yağ asitlerinin, aminoasitlerin, asetonun, ketohidroksiasitlerin de oluştuğu bilinmektedir. Yoğurt, peynir gibi süt ürünlerinin yapımında kullanılan laktik starter kültürlerin gelişimi ve aktivitesi bakteriyofaj (f) olarak adlandırılan ajanlar tarafından engellenebilmekte ve fermentasyonlarda laktik asit üretiminin yavaşlamasına, hatta durmasına neden olmaktadır. Bunun sonucu olarak işletmeler önemli ekonomik kayıplara uğramaktadır. Bu nedenle endüstriyel öneme sahip starterlerin fajlara karşı direnç durumlarının belirlenmesi önemlidir. Starter üreten firmalar her ne kadar işletmelerde starter kültür olarak kullanılacak faj akrabalığı olmayan dirençli suşları 1

11 önerseler de kültürlerin yerleşik yerel fajlarla infekte olmaları engellenememektedir. Bunun başlıca nedenlerinden biri yabancı kökenli kültürlerin faj dirençlilik testlerinin kendi coğrafik kökenli fajlarına karşı tespit edilmiş olması ve yerel orijinli fajlara karşı dirençli olmamaları gösterilebilir. Bu nedenle yoğurt üretiminde kullanılacak kültürlerin, yerleşik dominant ve yerel fajlarına karşı periyodik olarak test edilmesi, fajkonakçı spektrumunun belirlenmesi ve rotasyonda kullanılacak kültürün işletme koşullarına bağlı olarak seçilmesi gerekmektedir. Genel olarak Laktik asit bakterilerinde lizogeni oldukça yaygındır ve endüstride lizogenik suşların starter olarak kullanılması sakıncalıdır. Çünkü işletmelerde kütle (bulk) starterlerin lizizine neden olan virülent fajların çiğ sütten mi yoksa lizogenik suşlardan mı kaynaklandığına ilişkin tartışmalar henüz sonlanmamıştır. DNA homoloji çalışmaları virülent ve temperent fajların homolog olduklarına işaret etmektedir. Dolayısıyla lizogen bakterilerin içinde profaj olarak varlığını sürdüren temperent fajların ortaya çıkışında önemli bir risk kaynağı olduğu düşünülmekte ve böyle bakterilerin starter olarak kullanılmalarından kaçınılmaktadır. S. thermophilus suşlarında lizogeniye Laktokok ve Laktobasillere oranla daha ender rastlanmaktadır. Bakteriye özgül virülent faj, konakçısına adsorbe olduktan sonra faj DNA sı hücre içine injekte olur (penetrasyon) ve latent dönem süresince içeride replikasyonunu tamamlar ve sonuçta çok sayıda faj kopyaları ( adet) hücreyi patlatarak (lize ederek) ortama salınırlar. Serbest fajlar yeni konakçıları infekte ederek tekrar tekrar bu litik döngüyü gerçekleştirirler. Sonuçta işletmelerde bulunan kütle (bulk) starter tanklarındaki starterler gelişemediklerinden işlevlerini yapamazlar. Lizogenik yaşam döngüsünde ise faj yine konakçı hücreye adsorbe olmakta, penetrasyon gerçekleşmekte ancak hücre içine giren faj DNA sı konakçı hücre DNA sına entegre olmakta ve çoğalmamaktadır. Yalnızca bakteri çoğalırken onun DNA sı ile birlikte (eş zamanlı) replike olmakta ve yavru (kardeş) hücreye aktarılarak varlığını sürdürmektedir. Ancak konakçı hücre içinde faj üremesi gerçekleşmediğinden liziz görülmemektedir. Bakteri genomuna entegre olabilen bu tip fajlara temperent (ılımlı) faj, bakteri genomuna entegre olmuş formuna profaj denilmektedir. Profaj içeren bakteri ise lizogen bakteri olarak adlandırılmaktadır. Profajlar bazı özel koşullar altında (mitomisin C, MC) 2

12 uygulaması, UV ışınlarına maruz kalma, sıcaklık yükseltilmesi) veya spontan olarak üzerinde bulunduğu bakteri genomundan koparak virülent form kazanabilmektedirler (profaj indüksiyonu) ve liziz ile sonuçlanan bakteri ölümlerine sebep olmaktadırlar. Yüksek Lisans Tezi olarak sunulan bu çalışma Ankara Üniversitesi Biyoteknoloji Enstitüsü 67 nolu Yerel S. thermophilus ve Lb. bulgaricus suşları ile özgül fajlarının endüstriyel öneme sahip özellikler açısından tanımlanarak alternatif starterlerin belirlenmesi konulu projenin bir bölümüdür. Bu çalışmada; 30 u çiğ, 43 ü pastörize sütlerden izole edilmiş, 10 u endüstriyel starter kökenli 83 adet S. thermophilus ve yine 22 si çiğ süt, 12 si pastörize sütlerden izole edilmiş, 5 i endüstriyel starter kökenli ve 1 adet Lb. bulgaricus ATCC suşunun da dahil olduğu 40 adet Lb. bulgaricus olmak üzere toplam 123 suş ile çalışılmıştır. S. thermophilus ve Lb. bulgaricus suşlarında mitomisin C (MC) ilavesi, UV uygulaması ve sıcaklık yükseltilmesi ile lizogeni durumları araştırılmıştır. Ayrıca suşların faja direnç durumları pastörize sütlerden izole edilmiş 53 S. thermophilus suşu ile 12 Lb. bulgaricus suşunda belirlenmiştir. Direnç çalışmalarına Lb (referans suş) ve Ch-Lb12 (endüstriyel suş) olmak üzere 2 adet Lb. bulgaricus suşu da dahil edilmiştir. Çiğ sütlerden izole edilmiş yerel suşlar ile endüstriyel suşların faj direnç durumları bir başka projede daha önce belirlendiğinden burada tekrarlanmamıştır. 3

13 2. KAYNAK ÖZETLERİ 2. 1 Yoğurt Üretimi ve Yoğurt Bakterilerinin Genel Özellikleri Fermente süt ürünleri arasında uzun yıllardan beri en çok bilinen ve yaygın olarak kullanılan yoğurt, Lactobacillus bulgaricus (Lb. bulgaricus) ile Streptococcus thermophilus (S. thermophilus) Laktik asit bakterilerinin (LAB) simbiyotik faaliyeti sonucu sütü fermente etmesiyle meydana gelir. Süt endüstrisinde starter kültür olarak kullanılan Laktik asit bakterileri sütte bulunan laktozu fermente ederek laktik asit oluştururlar. Süt ürünlerinde yaklaşık 100 yıldan bu yana endüstriyel boyutta üretilmiş starter kültürler kullanılmaktadır. Her ne kadar yoğurt ile ilgili arkeolojik bulgular günümüzden 6000 yıl öncesine gitmekte ise de bilinçli starter kullanımı 19. yüzyılın sonlarında başlamıştır. Bu gün başta laktik asit üretimi, proteolitik aktivite, faj dirençliliği, aroma oluşturma yeteneği vb. özelliklere göre seçilmiş starter kültürler süt ürünleri endüstrisinde yaygın bir şekilde kullanılmaktadır (Ray 1996, Aslım vd. 2000). Yoğurt bakterileri laktozu homofermentatif yolla hidrolize ederek temel olarak laktik asit (%90) oluşturmaları ile karakterize edilirler. Gram pozitif, katalaz negatif, spor oluşturmayan, hareketsiz, optimum gelişme sıcaklığı C olan termofilik bakterilerdir. Yoğurt üretimi için hammadde olarak genellikle taze inek sütü kullanılmasına rağmen koyun, deve, manda gibi memelilerin sütü de fermentasyon için uygundur. Yoğurt yapımında kullanılacak sütün yağ içeriği piyasadaki talebe göre % arasında değişmesinin yanında asıl önemli olan unsur sütün yağsız kuru madde (YKM) içeriğidir. İnek sütünde yağsız kuru madde miktarı % değerleri arasındadır. Yağsız kuru maddenin % 4.5 i laktoz, % 3.3 ü protein (% 2.6 kazein ve % 0.7 peynir altı suyu (PAS) proteinleri) ve % 0.7 si mineral maddelerden oluşmuştur. Bu unsurların her biri, iyi bir yoğurt üretimi için elzemdir. Laktoz, termofilik starter bakteriler için bir enerji kaynağı olurken mineraller (kalsiyum, fosfor vs.) proteinlerle birlikte jel yapının 4

14 iyileşmesini sağlamaktadır. Ancak sütteki protein miktarı tatminkar bir son ürün elde etmede yeterince yüksek olmadığından yoğurt üretiminde ilk adım yağsız kuru madde miktarını arttırmak olmaktadır. İsteğe bağlı olarak uygulanan homojenizasyon işleminden sonra süt, ısıl işleme tabi tutulur. Isıl işlem normal pastörizasyon sıcaklığının üzerinde gerçekleşmektedir. Süt C de dakika süresince kalabilecek holder tipi plakalı ısı değiştiricilerde ya da üretim tanklarında C de 30 dakikalık ısıl işlem gerektirmektedir. Bu işlem sonucunda hem patojen ve bozulma etmeni mikroorganizmalar inhibe olmaktadır hem de b-laktoglobulin, k-kazeine bağlanabilmekte ve dolayısıyla set tipi (pıhtısı parçalanmamış) yoğurdun tekstürünün ya da stirred tipi (pıhtısı parçalanmış) yoğurdun viskozitesinin gelişimi sağlanmaktadır. Uygulanan ısıl işlem ayrıca oksijenin çıkmasına ve diğer peyniraltı suyu proteinlerinin kısmi denatürasyonuna da olanak sağladığından mikroaerofilik yoğurt kültürlerinin gelişimini de stimüle eden serbest aminoasitlerin oluşumuna sebep olmaktadır (Robinson 1999). Isıl işlemden sonra süt, Lb. bulgaricus : S. thermophilus oranı 1:1 veya 1:2 olacak şekilde 43 C ye soğutulmuş süte %2 3 oranında inoküle edilir ve C de inkübe edilir. 3 4 saat içinde fermentasyon tamamlanıp sütün asitliği ph dan ph ya (% laktik aside) ulaştığında inkübasyona son verilir ve yoğurtlar asitliğin daha fazla gelişmemesi için 2 4 C ye soğutularak bu sıcaklıkta muhafaza edilirler. Birçok tüketici tarafından tercih edilen bu asitlik düzeyi sütte bulunan kazein ve serum proteinlerinin koagüle olmasını ve sıkı bir pıhtı oluşumunu sağlarken, patojen mikroorganizmaların gelişimini de inhibe etmektedir (Tekinşen 1997, Robinson 1999). İnkübasyon süresinin aşılması ph nın 4.0 ün altına düşmesine sebep olur. Genellikle Lb. bulgaricus un neden olduğu bu istenmeyen durum keskin ve ekşi bir tat gelişimine ve pıhtının su salmasına neden olmaktadır ( Robinson 1999, Leroy and de Vuyst 2004). S. thermophilus ve Lb. bulgaricus arasında simbiyotik bir ilişki vardır. Fermentasyonun başlangıcında S. thermophilus ortamda daha baskın durumdadır ve Lb. bulgaricus tan daha hızlı gelişerek laktozun fermentasyonu sonucunda meydana getirdiği laktik asit sayesinde ortam ph sını 5.5 e kadar düşürür. Sütün proteince zengin habitatına rağmen, S. thermophilus sınırlı düzeyde proteolitik aktivite göstermektedir. Nitrojen 5

15 kaynağı olarak öncelikle sütte doğal olarak bulunan veya ısıl işlem sırasında ortama salınan serbest aminoasitleri kullanır. Ancak glutamik asit, histidin, sistein, metiyonin, valin ve lösin serbest aminoasitleri sütte S. thermophilus un gelişimini destekleyecek düzeyde bulunmamaktadır. Oluşan asitlik ile ortam koşulları Lb. bulgaricus için uygun hale geldiğinden gelişmeye başlar ve proteolitik aktivitesi yüksek olduğundan salgıladığı proteolitik enzimlerle sütteki kazeinden peptit ve aminoasitleri oluşturur. Oluşan aminoasitler S. thermophilus un gelişimini uyarır. S. thermophilus da hem sütteki oksijeni kullanarak Lb. bulgaricus üzerindeki toksik etkiyi azaltır, hem de laktik asidin yanında oluşturduğu formik asit (40 g/ml) ve üreden üreaz ile meydana getirdiği az miktardaki CO 2 ile Lb. bulgaricus un gelişimini stimüle eder. (Oberg et al. 1993, Aslım 1994, Robinson 1999, Giraffa et al. 2001, Courtin et al. 2002, Tunail 2002). Her iki tür birlikte çalışarak laktozu laktik aside dönüştürür ve suşların aktivitesine ve asit üretim yeteneğine bağlı olarak fermentasyon 3 4 saat içinde tamamlanır. Yoğurt pıhtısı, gelişen asitlik ile serum proteinlerinin ve sütteki kazeinin izoelektrik noktası olan ph de presipitasyonu yani pıhtılaşması sonucunda oluşur. (Tekinşen 1997, Tunail 2002). Yoğurt sütü inokülasyondan hemen sonra mikroskobik olarak incelendiğinde iki tür arasındaki dengenin genellikle 1/1 olduğu görülür. Anacak fermentasyon başladıktan sonra ortam koşulları S. thermophilus açısından daha uygun durumda olduğundan bu bakteri sayıca üstün duruma geçer. Koloni sayımları S. thermophilus sayısının bazen % kob (koloni oluşturan birim)değerine kadar çıktığını gösterir. Fermentasyon başlangıcından 2 saat sonra Streptokokların sinerjetik etkisi ile ortamda biriken laktik asit Laktobasillerin metabolizmasını ve hızlı çoğalmasını tetikleyerek S. thermophilus un ortamda sayıca azalmasına ve Lb. bulgaricus un artmasına neden olur. Dört saat sonunda popülasyonlar arasındaki denge, tekrar yeni inoküle edilmiş süttekine eşdeğer (1:1) olur. Starter kültür içindeki her bir türün popülasyonu 2x10 7 hücre/ml nin üzerindedir. (Robinson 1999). Yoğurt bakterileri bir taraftan meydana getirdikleri laktik asit sayesinde yoğurdu oluştururken diğer yandan da bu ürüne başka herhangi bir fermente süt ürününde rastlanmayacak özgün tadı kazandırırlar. 40 mg/kg düzeyine kadar oluşan asetaldehit 6

16 aromanın ana bileşenidir ve yaygın olarak Lb. bulgaricus tarafından üretilmektedir (Beshkova et al. 1998). Yoğurt aromasının oluşumuna yardımcı olan diğer komponentler ise diasetil, asetik asit ile etanoldür. Ayrıca kaprik, kaprilik vb gibi serbest uçucu yağ asitleri ile aminoasitleri temel aroma maddesi olmamalarına karşın, aroma maddelerinin dengelenmesinde etkilidirler (Aslım 1994). Her iki türün bazı suşları glukoz, galaktoz, ramnoz içeren glukan veya polimerler gibi ekstaselüler polisakkaritleri (ekzopolisakkarit) üreterek son ürünün viskozitesini önemli derecede arttırırlar. S. thermophilus mukoz madde olarak glukan benzeri polimer üretirken Lb. bulgaricus, gum benzeri bir madde sentezler (Oberg and Broadbent 1993, Tekinşen 1997, Robinson 1999, Broadbent et al. 2003). Yoğurt üretiminde Lb. bulgaricus ve S. thermophilus un miks halde bulunduğu özel ticari starter kültürler kullanılmaktadır. Türkiye de starter kültür kullanımına 1970 li yıllarda başlanmıştır. Starter kültürler, Chr. Hansen, Wiesby gibi özel laboratuvarlarda üretilen değişik formlardaki (liyofilize, DVS, konsantre vs.) ticari olarak ve bazı ülkelerde olduğu gibi ulusal sütçülük araştırma enstitülerinden sağlanmaktadır (Acar 2001). Ancak üretimlerde yetersiz hijyenik koşullara bağlı olarak starter kültürler fajlarla kontamine olabilmekte ve bu durum da işletmeleri ekonomik darboğazlara sokmaktadır (Tunail ve Aşkın 1991) S. thermophilus un özellikleri S. thermophilus, Gram pozitif, katalaz negatif, fakültatif anaerob, hareketsiz, spor oluşturmayan, µm çapında, yuvarlak (kok) ya da oval formlu çiftler veya hücrelik uzun zincirler halinde sütün doğal habitatında bulunur. Besin gereksinimi kompleks ve değişkendir. Optimum gelişme sıcaklığı C, maksimum ve minimum gelişme sıcaklıkları ise sırasıyla 52 C ve 20 C dir. (Mercenier and Lemoine 1989, Robinson 1999, Kılıç 2001, Klaenhammer et al. 2002). Düşük ph değerlerine toleransı zayıftır, optimum gelişme ph sı tir ve en son gelişme ph sı tir. Sütte bulunan laktozu b-galaktozidaz enzimi vasıtasıyla homofermentatif olarak 7

17 fermente ederek ana ürün olarak L(+) laktik asit oluşturur. Glukoz, fruktoz, ve mannozu da metabolize edebilen bakterinin galaktoz, maltoz ve sükrozu fermente etmesi suşa özgül olduğundan değişebilir. Bu bakteriler sitokrom-oksidaz ve katalaz enzimlerine sahip değildirler (Robinson 1999, Giraffa et al. 2001, Yılmaz 2002). S. thermophilus un proteolitik ve lipolitik aktivitesi oldukça zayıftır (Rajagopal and Sandine 1990, Kılıç 2001, Courtin et al. 2002). DNA sındaki G+C içeriği % mol dür. S. thermophilus bütün LAB içinde Mb (Mega baz = 1 milyon baz) ile en küçük genoma sahiptir ve suşlar arasında farklılık olmakla beraber plazmit varlığı açısından diğer LAB ile kıyaslandığında çok daha sınırlıdır (Klaenhammer et al. 2002). Birçok S. thermophilus suşunda plazmit varlığı saptanmazken, plazmit varlığı saptananlarda da bunların çok küçük olduğu belirlenmiştir (Mercenier and Lemoine 1989, Klaenhammer et al. 2002). Bergey s Manual of Systematic Bacteriology kitabında Streptococcus cinsi, Piyogenik, Oral, Enterokok, Laktokok ve Diğer Streptokoklar gruplandırmasında sonuncusuna dahil edilmiştir. Spesifik antijen içermemesi nedeniyle herhangi bir serolojik gruplandırması yapılamayan Streptokoklardandır (Kaleli 2001, Acar 2002). S. thermophilus yoğurt dışında Mozarella, Cheddar, Gruyère-tipi, Emmental, Grana-tipi, Provalone ve Gorgonzola gibi İsviçre, Fransız ve İtalyan tipi peynirlerin üretiminde de starter olarak kullanılmaktadır (Rajagopal and Sandine 1990, Bruttin et al. 1997a, Giraffa et al. 2001) Lb. bulgaricus un özellikleri Lb. bulgaricus, ( ) - ( ) µm düz ya da hafif kıvrık çubuk şekilli bir morfolojiye sahip olup sütün doğal florasında 3 4 hücreden oluşmuş kısa zincirler halinde bulunur. Gram pozitif, hareketsiz, katalaz negatif, anaerob bakterilerdir. Beslenme isteği açısından oldukça komplekstir. Optimum gelişme sıcaklığı C olup, maksimum 62 C ve minimum 22 C de gelişebilir. Lb. bulgaricus, sütteki laktozu homofermentatif olarak metabolize ederek % düzeyinde D(-) laktik asit oluşturur. % 1.0 düzeyinde laktik asit (ph ) gelişimi ile inhibe olan S. thermophilus ile kıyaslandığında bu bakterinin asit toleransının oldukça fazla olduğu 8

18 anlaşılır. Optimum gelişme ph sı ise tir (Robinson 1999, Kılıç 2001). Lb. bulgaricus nispeten kısıtlı sayıda karbonhidratı kullanabilmekle ve genellikle pantotenik asit ve niasine gereksinim duymaktadır (Klaenhammer et al. 2002). Laktoz, fruktoz, glukozu katabolize eder ve suşlara bağlı olarak galaktozu da fermente edebilir. S. thermophilus tan farklı olarak Lb. bulgaricus un proteolitik aktivitesi daha fazladır ve kazeini, özellikle de b-kazeini hücre duvarı proteinazları ile hidrolize ederek polipeptit oluşturabilir (Rajagopal and Sandine 1990, Robinson 1999). DNA daki G+C içeriği % mol arasındadır. Genom büyüklüğü Mb arasındadır (Kılıç 2001, Klaenhammer et al. 2002). Serolojik grubu E olarak belirlenmiştir. Çiğ süt ve sert peynirlerde doğal olarak bulunurken Grana (Fransız tipi), Emmental (İsviçre tipi) ve Mozarella, Taioggo (İtalyan tipi) gibi sert, pıhtısı pişirilen peynirlerde kültür olarak kullanılır ( Cluzel et al. 1987a, Oberg and Broadbent 1993, Kılıç 2001, Klaenhammer et al. 2002) Starter kültürlerin fajlarla ilişkisi Yoğurt, peynir gibi süt ürünlerinin yapımında kullanılan laktik starter kültürlerin gelişiminin inhibisyonuna viral olmayan ajanlar (sütte antibiyotik kalıntısı vb inhibitör maddeler) sebep olarak gösterilebildiği gibi, starter aktivitesini engelleyen ve fermentasyonlarda laktik asit üretiminin yavaşlamasına, hatta durmasına neden olan fajlar en yaygın kaynak olarak gösterilmektedir (Benbadis et al. 1990, Arendt et al. 1993, Bruttin et al. 1997a). Fajlarla kontamine olan starter kültürler hızlı bir şekilde lize olmakta, buna paralel olarak asitlik gelişimi yavaşlamakta, hatta durabilmekte ve sonuçta ürünün yapısal ve aromatik özellikleri bozulmaktadır (Bruttin et al. 1997a). Faj kontaminasyonları, fermentasyon ortamlarında % oranına varan ürün kayıplarına neden olabilmektedir (Akçelik 1996). Bu durum, fajlar ve Laktik asit bakterilerinin faj direnç mekanizmaları üzerinde yoğun çalışmalar yürütülmesine neden olmuştur (Coffey and Ross 2002). Süt işletmelerinde hijyene verilen öneme rağmen, starter kültürlerin bakteriyofajlar ile kontaminasyon riski her zaman vardır. Bunun başlıca nedenleri fermentasyonun steril 9

19 olmayan ortamlarda gerçekleştirilmesi (pastörize süt), fermentasyonlarda sürekli olarak aynı kültürle çalışılması, piyasada bulunan faja dirençli özel kültür sayılarının kısıtlı olması, kesikli kültür fermentasyonlarının gittikçe zorlaşan üretim programları altında yürütülmesidir (Arendt et al. 1993). Son zamanlarda birçok yoğurt işletmecisi direkt-vat kültürlerinin kullanımına yönelmiştir. Konsantre halde bulunan starter kültürler doğrudan (direkt olarak) prosesteki süte ilave edilmekte ve böylece aşamalı inokülasyonların neden olduğu kontaminasyonlar minimuma indirgenmektedir. Ayrıca hem S. thermophilus hem de Lb. bulgaricus termofilik fajlarının yaratığı sorunlar, mezofilik kültür fermentasyonlardaki kadar ciddi değildir. Bunun başlıca iki nedeni vardır; birincisi peynir sütü asidifikasyon aşaması boyunca sürekli olarak karıştırılmakta ve böylelikle liziz sonucu ortama salınan serbest fajlar bütün sütün içine dağılmaktadır. İkincisi ise üretim aşamasında karıştırılmayan ve hızlı bir şekilde koagüle olan yoğurt sütünde ortama salınan faj, oluşan ağ yapının içinde tutulmakta ve starterin daha fazla infekte olma olasılığını azaltmaktadır (Robinson 1999). Ayrıca peynir ve yoğurda işlenecek çiğ süte uygulanan ısıl işlem normlarının farklı olması, yoğurt üretiminin peynire göre daha kapalı bir sistem içinde yapılması çevreden kaynaklanan faj kontaminasyonlarının daha az olmasını sağlamaktadır (Bruttin et al. 1997a). Yoğurtta Lb. bulgaricus fajlarına göre S. thermophilus fajlarının olumsuz etkileri daha fazladır. Çünkü S. thermophilus fajları ph, ısı değişimi ve kimyasal maddelere daha dayanıklıdır (Reinbolt et al. 1974, Benbadis et al. 1990, Kılıç 2001) Faj Kontaminasyon Kaynakları ve Termofilik Fajların Orijini Süt endüstrisinde kullanılan starter kültürlerin lizizine neden olan virülent fajların kontaminasyon nedenleri halen tartışma konusu olmaya devam etmektedir (Neve 1996). Bu olumsuz etmenlerin çiğ sütten mi yoksa lizogenik suşlardan mı kaynaklandığına dair tartışmalar ve araştırmalar güncelliğini korumaktadır. 10

20 Fajların yaygınlıkları ve kökenlerine ilişkin araştırmalar başlatan bilim adamları yaptıkları çalışmalarda; faj kontaminasyonunda çiğ süt ve orijinal starter kültürlerin zayıf birer kaynak olduğunu veya hiçbir faj kontaminasyonu oluşturmadığını, buna karşılık işletmede hazırlanan starter kültürlerin, peyniraltı suyunun, salamuranın ve süt ürünlerinin sürekli olarak yoğun faj kontaminasyonlarının kaynağını oluşturduğunu belirlemişlerdir. Ayrıca peynir baskılama bezlerinde ve salamura sularında 10 3 pfu/ml ve havada da 10 3 pfu/m 3 ten fazla faja rastlanması, işletmede çalışan işçilerin önlük ve yıkanmayan ellerinde faj miktarının pfu/ml olarak saptanması üretim esnasında hammadde ile temasa geçildiğinde personel, ekipman ve havanın da primer kontaminasyon kaynakları olabileceğine işaret etmiştir (Lembke and Teuber 1981). Reinbolt and Reddy (1973) yoğurt, İsviçre peyniri, yumuşak peynir ve Gorgonzola peynirlerinin yapımı sırasında aldıkları peyniraltı suyu örneklerinden faj izole etmişlerdir. Neve (1996) de çiğ sütün önemli bir faj kontaminasyon kaynağı olmadığını, buna karşılık peyniraltı sularında faj titresinin pfu/ml den yüksek olduğunu belirtmiştir. Quiberoni et al. (2003) yoğurtlardan aldıkları örneklerde faj titresini pfu/ml olarak saptamışlar ve faj konsantrasyonunun 10 5 pfu/ml den yüksek olması halinde süt asidi gelişiminin geciktiğini ve buna bağlı olarak da yoğurtlaşma süresinin uzadığını gözlemlemişlerdir. Yoğurt yapımı sırasında, süt fermentasyon ortamlarında starter kültürleri infekte ederek önemli ölçüde ürün ve zaman kayıplarına yol açan termofilik fajların lizogenik suşlardan mı yoksa sütten mi kaynaklandığı sorusunun yanıtı, temperent ve virulent fajların moleküler düzeyde incelenerek aralarındaki genetik ilişkinin ortaya konulmasında yatmaktadır. Shimizu-Kadota et al. (1983) fermentasyon bozuklukları sırasında ortaya çıkan Lb. casei nin S 1 suşunu konakçı olarak kullanan virulent ffsv ile aynı suşta profaj halinde bulunan temperent ffsw faj DNA ları arasında tam bir homoloji olduğunu belirlemişlerdir. Bu fajlar üzerine yapılan geniş çaplı araştırmalar sonucunda virülent ffsv nin genetik değişimler (çoklu nokta mutasyonları veya ekzojen DNA sekanslarının insersiyonu ve/veya ffsw nin faj DNA sında meydana gelen yeniden düzenlemeler) sonucunda temperent ffsw den türediği anlaşılmıştır. Buna karşılık 11

21 Jarvis (1984) ise S. cremoris in 3 temperent fajının DNA sını 25 adet virülent faj DNA sı ile karşılaştırdığında aralarında hiçbir homoloji oluşmadığını ancak temperent fajlar arasında kısmi homoloji bulunduğunu bildirmiştir. Bu soruya yanıt aramak üzere yakın akraba olan Lb. bulgaricus ve Lb. lactis virülent ve temperent fajları DNA homologluğuna göre gruplandırılmış ve aynı grupta yer alan temperent ve virülent fajların birbiriyle yakın akraba oldukları saptanmıştır. Aynı grupta yer alan Lb. bulgaricus temperent fajlarından mv1 ve mv4 arasında ise % 100 DNA homolojisi elde edilmiştir (Mata et al. 1986, Sechaud et al. 1988). Mata et al. (1986) nin yaptığı araştırmaya paralel olarak Lahbib-Mansais et al. (1988) Lb. bulgaricus a ait B06 ve B29 lizogen suşlarının indüksiyonu sonucunda elde edilen sırasıyla f37 ve f38 temperent fajı ile 4 adet virülent fajın DNA ları karşılaştırıldığında aralarında yüksek ancak kısmi homoloji saptanmıştır. Bu araştırmalar sonucunda bazı temperent ve virülent fajlar arasında değişik oranlarda homoloji gözlenmesi, virulent fajların temperent fajların türevi olduğu veya bu iki tip faj arasında evrim sürecinde genler arasında rekombinasyonlar meydana geldiği görüşünün ileri sürülmesine neden olmuştur (Davidson et al. 1990). S. thermophilus a ait virülent (fsfi19) ve temperent fajın (fsfi21) karşılaştırmalı DNA dizi analizi sonuçlarından, S. thermophilus faj genomunun oluşmasında iki prosesin varlığı ağırlık kazanmıştır. Birincisi fajın temel genom yapısının rekombinasyon süreci ile meydana geldiğidir (Desiere et al. 1998). Yapılan araştırmalar sonucunda rekombinasyonun fajın yaşam döngüsünde; konakçı özgüllüğü, DNA paketleme mekanizması ve yapısal protein düzeninde meydana geldiği düşünülmektedir (Lucchini et al. 1999). İkincisi ise nokta mutasyonlar, küçük çaplı delesyonlar (kayıplar) ve insersiyonların (eklemeler) gerçekleşmesi yoluyla temel genom yapısında oluşan çeşitliliklerdir (Desiere et al. 1998). S. thermophilus fsfi19 (virülent) ve fsfi21 (temperent) faj DNA larının 17 Kb dan uzun parçalarının incelenmesi sonucunda, bu iki faja ait baz çiftleri arasında % 10 luk bir farklılık bulunmuştur. Bu farklılığın nokta 12

22 mutasyonlar sonucunda meydana geldiği ileri sürülmüştür (Brüssow et al. 1994, Desiere et al. 1998). Bruttin et al. (1997) faj evriminin ve çeşitliliğinin çevresel kaynaklı mı yoksa yerleşik bakteriyofajların genetik değişiminden mi kaynaklandığını ortaya koymak için S. thermophilus fajlarına yönelik yaptıkları 2 yıl süren geniş çaplı bir araştırmada, peynir işletmelerinden izole ettikleri fajların yoğurt fermentasyonlarındakine göre oldukça çeşitlilik gösterdiğini ve faj titresinin pfu/ml arasında değiştiğini saptamışlardır. Faj çoğalması, ortamda uygun konakçının bulunup bulunmamasına bağlı olduğundan ve yoğurt işletmeleri peynir işletmelerine göre düşük sayıda ve iyi tanımlanmış starter kültür kullandıklarından faj çeşitliliği de buna paralel olarak daha düşük olarak saptanmıştır. Ayrıca peynir işletmelerinde meydana gelen kontaminasyonların, yerel fajlarda meydana gelen genetik değişimlerden olmayıp, çiğ sütten kaynaklandığı sonucuna varmışlardır. Fayard et al. (1993) laboratuvar ortamında yaptıkları bir araştırmada starter kültürlerin çifte infeksiyonundan (süperinfeksiyon) sonra fajlar arasında sık sık tekrarlanan rekombinasyonlar oluştuğunu bildirmesine karşın Bruttin et al. (1993), doğal koşullarda böyle bir genetik değişimin söz konusu olmadığını belirtmişlerdir. Brüssow ve arkadaşları süt işletmelerinde 30 yıla yakın yaptıkları çalışmalar sonucunda izole ettikleri fajların aynılarına rastlama olasılığının düşük olduğunu bildirmişlerdir. Ayrıca spesifik restriksiyon şablonuna sahip bir fajın kısa zaman sonra genomunda meydana gelen delesyon ve duplikasyonla veya yeni faj DNA modülü kazanma yoluyla değişime uğrayabildiğini göstermişlerdir. Bir örnekte kısa zamanda birden fazla faj çeşidinin ortaya çıkması; iki faj arasında rekombinasyonların meydana gelebileceği ve lizogenik starterlerin virülent fajlarla infeksiyonu sonucunda rekombinant fajların oluşabileceği görüşüne ağırlık kazandırmaktadır (Brüssow et al. 1998). Fayard et al. (1993) ne göre faj saldırılarına karşı gerektiği kadar önlem alınmayan süt işletmelerinde fajların görülmesi ve yayılmasında lizogenik suşların önemli bir rolü vardır. Brüssow et al. (1994) de lizogenik starterlerin potansiyel kaynak olduğu görüşünü desteklemektedir. 13

23 Faj sorununu çözebilmek amacıyla tüm dünyada Laktik asit bakterilerinin izolasyonu, tanımlanması ve faj-konakçı ilişkilerinin belirlenmesi üzerine yoğun çalışmalar halen devam etmektedir Termofilik Fajların Morfolojik Özellikleri ve Sınıflandırılması Bakteriyofajların ilk bakışta basit bir yapı içerdikleri düşünülebilir, ancak incelendiklerinde onların çok iyi bir morfolojik ve genetik organizasyona sahip oldukları görülmektedir. Genel olarak bakteriyofajlar, genetik şifreyi taşıyan bir nükleik asit ve onu çevreleyen bir protein kılıftan meydana gelmektedir. Termofilik fajlarda genetik materyal lineer formda çift zincirden oluşmuş DNA dır. Fajın baş kısmı polihedral özellikte hegzagonal profilde olup DNA yı bir manto gibi sarmaktadır. Baş kısım kapsomer adı verilen küçük protein alt ünitelerinden meydana gelmiş olup kapsit adını almaktadır. Kapsomerlerin kapsiti oluşturmaları termofilik fajlarda kübik simetri şeklinde olmaktadır. Kübik simetrinin en tipik geometrik şekli ikosahedrondur. İkosahedron, 20 eşkenar üçgen yüzü ve 12 köşesi olan bir polihedrondur. Bu simetriyi gösteren fajlara ikosahedral fajlar adı verilmektedir. Baş kısmına ince ve uzun bir kuyruk bağlıdır. Basit bir boru gibi olan kuyruk, fajın baş kısmında bulunan DNA nın bakteriye transferinde bir köprü görevi yapmaktadır. Ayrıca kuyruğun fajın konakçı bakteriye tutunmasında da önemli bir fonksiyona sahiptir. İnfeksiyon sırasında kuyruk ve kapsit dışarıda kalır, hücre içine sadece genetik materyal injekte edilir. Bazı fajlarda, kuyrukla başın birleşme bölgesinde çok küçük bir yaka ve kuyruğun uç kısmında, kuyruk plağı ve bakteriye tutunmada görev alan kuyruk fibilleri de bulunabilmektedir (Arda 2000). Termofilik fajlara ait bilgiler, Laktokok fajları ile kıyaslandığında hayli sınırlıdır (Sebastiani and Jäger 1993). Bunun başlıca nedeni Laktokok fajlarının uzun zamandan beri Avrupa Ülkeleri, ABD ve Yeni Zelanda da peynir işletmelerinde çok daha sıklıkla problem yaratmaları ve 1935 yılında Whitehead ve Cox tarafından keşfedildiklerinden beri bütün dünyada yoğun bir şekilde araştırılmalarıdır. Termofilik fajlara ait ilk bilgiler 14

24 ise; 1952 yılında ilk defa Pette ve Kay tarafından S. thermophilus fajının ve 1974 de de Reinbold ve Reddy tarafından Lb. bulgaricus fajının bulunmasından sonra toplanmaya başlanmış ve bu nedenle daha az veri elde edilmiştir. Diğer bir neden de özellikle Lactobacillus türüne ait fajların izolasyonunda, faj plaklarının gösterilmesindeki güçlüklerdir (Cluzel et al. 1987a, Benbadis et al. 1990, Bhimani and Freitas 1991, Tunail vd. 2000, Kılıç 2001, Acar 2002, Neve et al. 2003, Quiberoni et al. 2003) yılında Pete ve Kay tarafından izole edilen ilk S. thermophilus fajının mikrografları 1953 te Deane ve arkadaşları tarafından görüntülenmiş ve termofilik fajların morfolojileri hakkındaki ilk bilgiler elde edilmiştir (Reinbold et al. 1982). Yoğurt üretiminin bakteriyofajlar tarafından bozulduğunun fark edilmesinden sonra geniş bir coğrafyada termofilik Streptokok fajlarının yapıları hakkındaki araştırmalar önemli ölçüde artmıştır. Bu amaca yönelik İsviçre, Fransa ve Almanya daki süt işletmelerinden pek çok konakçı bakteri ve faj izole edilmiştir (Krusch et al. 1987). Değişik bakteri türlerine ait 3402 faj elektron mikroskobu ile incelenmiş ve genel olarak Bradley ve Ackermann sınıflamasına göre taksonomileri yapılmıştır. S. thermophilus ve Lb. bulgaricus a ait tüm virülent ve temperent fajlar Bradley in B grubunda ve Ackermann ın Siphoviridae familyasında kuyruklu fajlar grubunda yer almışlardır (Tunail vd. 2000). Bauer et al. (1970) de S. thermophilus a karşı hassas olan iki bakteriyofajın elektron mikrograflarını görüntülemiş. Bakteriyofajlardan bir tanesinin ince taban plağına bağlı esnek flamente sahip olduğunu ve bu kuyrukta enine bağımsız çizgiler bulduğunu; S. thermophilus a ait diğer bakteriyofajın kuyruğunun uç kısmında böyle bir flamentin bulunmadığını saptamıştır (Reinbold et al. 1982). Accolas and Spillman (1979) Lactobacillus türüne karşı aktif olan fajların morfolojilerini incelemişler ve Lb. bulgaricus ve Lb. lactis bakteriyofajlarının Bradley in B grubuna dahil ederken Lb. helveticus un fajını Bradley in A grubunda kategorize etmişlerdir (Fayard et al. 1993). 15

25 Lactobacillus lactis ve Lactobacillus helveticus a ait ilk bakteriyofajlar 1955 yılında Kiuru ve Tybeck (1955) tarafından izole edilmişlerdir, ancak morfolojileri üzerine araştırma yapılmamıştır. Yoğurt, İsviçre ve bazı İtalyan tipi peynirlerin yapımında kullanılan Lb. bulgaricus un sahip olduğu ticari öneme rağmen, Lb. bulgaricus u infekte eden bakteriyofajlar ile ilgili çok az bilgi mevcuttur (Sechaud et al. 1988). Lb. bulgaricus fajları üzerinde yapılan sınırlı sayıdaki araştırmayla birlikte Reinbolt et al. (1982) tarafından elektron mikroskobu ile incelenen Lb. bulgaricus LB 2 fajı 50 nm çapında bir başa, 5 nm genişliğinde, 175 nm uzunluğunda bir kuyruğa ve 138 nm uzunluğunda kontraktil bir kılıfa sahip olduğu bildirilmiştir. Kuyruğun kasıldığı zaman, normalde 5 nm olan çapının 17.5 nm ye kadar kalınlaştığı ve kuyruk boynunun 77 nm kadar kısaldığı ifade edilmiştir. LB 1 fajında ise diğer yapılar haricinde kuyruk kısmında kontraktil kılıf bulunmamaktadır. Araştırıcılar ayrıca Lb. bulgaricus fajlarının S. thermophilus fajlarına göre nispeten küçük ve daha ince oldukları bildirmişlerdir. Accolas and Spillman (1979) tarafından Gruyere PAS ve yoğurt örneklerinden izole edilmiş 6 adet S. thermophilus bakteriyofajın birçoğunda kuyruğun, sivri uçlu ya da fibröz parçalar içeren uç taban plağına sahip olduğu belirtilmiştir. Reinbold et al. (1982) S. thermophilus fajlarının baş çaplarının nm, kuyruk enlerinin nm, kuyruk uzunluklarının nm arasında olduğunu bildirmiş ve bu verilere dayanarak fajların Bradley in B grubuna dahil etmişlerdir. Bu araştırmada ayrıca S. thermophilus ST 2 suşuna etkili fajın kuyruk uzunluğunun nm arasında değiştiği görülmüştür. Yaklaşık olarak 4.5 kat daha uzun olan kuyruk, uzunluğu hariç normal diğer ST 2 fajlarınkiyle aynıdır. Daha önce yapılan araştırmalarda bu uzunluktaki kuyrukların oluşumuna fajın süspanse edildiği ortamın ph değeri ve depolama sıcaklığı ve süresi etkili olurken S. thermophilus fajının kuyruğunda meydana gelen uzama normal gelişme koşullarında da gözlemlenmiştir. Bunun sebebi daha çok depolama süresinin uzamasına dayandırılmıştır. Kivi et al. (1987) tarafından elektron mikroskopisi incelenen S. thermophilus a özgül 9 fajın temel yapılarında bir farklılık olmadığı, fajların benzer morfoloji ve boyuta sahip olduğu bildirilmiştir. Fajlar, hekzagonal profilli polihedral baş yapısına (54 60 nm 16

26 çapında) ve birbirine paralel enine çizgili, kontraktil olmayan bir kuyruğa ( nm uzunlukta ve 5 7 nm genişlikte) sahip bulunmuşlardır. Bu nedenle Bradley in B grubunda veya Ackermann ın Siphoviridae familyasının kuyruklu fajlar grubuna dahil edilmişlerdir. Tüm fajların, kuyruklarından daha kalın tabla benzeri bir yapıya sahip oldukları ve bu tablaya bağlı iğne benzeri kuyruk fibrilinin çok nadir olarak görüldüğü de bu çalışmada belirtilmiştir. Krusch et al. (1987) de İsviçre, Almanya ve Fransa daki işletmelerde üretilen yoğurt ve İsviçre tipi peynir örneklerinden izole ettikleri toplam 59 S. thermophilus bakteriyofajının elektron mikroskobu incelemelerinden, fajların aynı temel morfolojide olduklarını bildirmişlerdir. İncelemelerde izometrik baş (49 63 nm), kontraktil olmayan uzun, esnek, çeşitli uzunlukta ( nm) ve kalınlıkta (10 12 nm) bir kuyruk ve uç kısmında buna bağlı kuyruk plağına rastlanırken yaka benzeri bir yapı görülmemiştir. Neve et al. (1989); Krusch et al. (1987) tarafından izole edilen ve morfolojik olarak incelenen S. thermophilus bakteriyofajlarından 12 adedini, bu çalışmanın devamı olarak hem mikroskobik hem de moleküler düzeyde incelemiştir. Tüm fajlar izometrik baş, uzun kontraktil olmayan kuyruk ve uçlarında, üzerinde birbirine eşit uzaklıklarda en az üç nodül bulunan uzun bir kuyruk fibriline sıkça rastlanmıştır. Fibrilin bulunmayışı, bu kırılgan yapının kopması veya fibrilsiz faj mutantlarının çok hızlı bir şekilde ortaya çıkması ile açıklanmıştır. Benbadis et al. (1990), S. thermophilus fajları ile yaptığı araştırma sonuçlarını morfolojik bakımdan Krusch et al. (1987) nin ölçümleri ile kıyasladıklarında, fajların baş çaplarının (42 nm) daha küçük olduğunu, kuyruk uzunluklarının (215 nm) ise örtüştüğünü ve Bradley in B grubunda yer aldıklarını belirtmişlerdir. Fajların hepsinin çift iplikçikli DNA içerdiği, bazılarının ise yapışkan uçlara sahip olduğu bildirilmiş ve benzer gözlemler Neve et al. (1989) tarafından elde edilmiş ve bu yapışkan uçların, faj DNA sının konakçı bakteri içine girdikten sonra sirkülarize olmasında işlev yaptığı anlaşılmıştır. 17

27 Acar (2002) yoğurt, ayran, PAS, bulk ve çiğ süt orijinli S. thermophilus ve Lb. bulgaricus a ait sırasıyla 23 ve 25, toplam 48 fajı elektron mikroskobu ile görüntülemiştir. S. thermophilus a ait fajların hegzagonal baş çaplarını nm, kuyruk uzunluklarını nm ve kuyruk enlerini 7 14 nm olarak belirlerken, fajların hiçbirinde yaka, kuyruk plağı ve fibrile rastlamamıştır. Lb. bulgaricus a ait fajların çapları nm arasında değişen izometrik, hegzagonal başlara ve uzunlukları ile enleri sırasıyla nm ve 7 13 nm arasında değişen kontraktil kılıfı olmayan kuyruklara sahip oldukları belirlenmiştir (Şekil 2. 1). Fajların 4 ünde kuyruk plağı, yaka ve fibril yapılarının hepsi görülürken, 9 fajda sadece kuyruk plağı tespit edilmiştir. Sahip oldukları morfolojik özellikleri nedeniyle Ackermann sınıflamasının kuyruklu fajlar grubunda Siphoviridae familyasına veya Bradley sınıflamasının B grubuna dahil edilmişlerdir. Şekil 2. 1 S. thermophilus a ait fst X18-B3 fajının elektron mikroskobunda çekilmiş görüntüsü (Acar 2001) Temperent fajlara ait elektron mikroskobu görüntüleri ise profajın mitomisin C, UV, sıcaklık gibi ajanlarla indüksiyonundan sonra elde edilebilmektedir. Fayard et al. (1993) 12 adet S. thermophilus temperent fajını MC ile indüksiyondan sonra direkt olarak veya indikatör yeni konakçısında çoğalttıktan sonra elektron mikroskobu ile incelemişlerdir. 18

28 Ortama salınan fajların nm çapında hegzagonal yapıda izometrik başa ve esnek, kontraktil olmayan nm uzunluğunda kuyruğa sahip oldukları bildirilmiştir. Ayrıca kuyruk plağı ile değişen uzunluklarda kuyruk fibriline sahip olan temperent fajlar da Bradley in B grubuna veya Ackermann sınıflamasının Siphoviridae familyasına dahil edilmişlerdir. Sebastiani and Jäger (1993), Neve (1996) de temperent bakteriyofajların virülent fajlarla aynı morfolojiye sahip olduğunu belirtmişlerdir. Cluzel et al. (1987), Lb. bulgaricus suşlarından MC ve UV ışın kullanarak elde ettikleri mv1 ve mv4 temperent fajlarını elektron mikroskobunda incelemiş ve faj partiküllerinin virülent fajlarla aynı yapıyı gösterdiklerini saptamışlardır. 50 nm çapında hegzagonal profilde izometrik baş, 180 nm uzunluğunda ve 8 nm genişliğinde kontraktil olmayan kuyruğa sahip fajları, bu verilere dayanarak Bradley in B grubuna dahil etmişlerdir. Auad et al. (1997) Lb. bulgaricus a ait lb539 temperent fajını elektron mikroskobu ile incelediğinde 47 nm büyüklüğünde hegzagonal baş yapısına ve 159 nm uzun kontraktil olmayan kuyruğa sahip olduğunu belirtmiştir. Bu özellikler Lb. bulgaricus temperent fajının diğer virülent fajlar gibi Bradley in B grubuna ve Ackermann ın Siphoviridae familyasına dahil olmasına neden olmuştur. Fajların morfolojileri, konakçı spektrumları ve serolojik özelliklerinin fajların klasifikasyonunda yetersiz kalması, onların moleküler düzeyde tanımlanmalarını gündeme getirmiştir. Bu amaçla faj genom analizleri (genom büyüklüğü, % G+C oranı, DNA nın sirküler ya da lineer oluşu, uçlardaki tekrar serileri ile yapışkan uç içerip içermemeleri), DNA nın restriksiyon enzimleriyle kesim şablonu, strüktür (baş ve kuyruk) proteinlerinin SDS-PAGE ile analizleri, DNA hibridizasyon çalışmaları bugün faj sınıflandırılmasında en güvenilir kriterler olarak kabul edilmektedir. Tüm bu analiz sonuçları morfoloji ve faj-konakçı özgüllüğü de dikkate alınarak incelenmektedir. Son yıllarda yapılan moleküler incelemeler sonucunda S. thermophilus virülent fajlarında genetik materyal olarak çift zincirli DNA ya sahip oldukları ve G+C oranının % arasında değiştiği gösterilmiştir (Kivi et al. 1987). S. thermophilus fajlarının genomları üzerine yapılan diğer araştırmalar sonucunda genom büyüklüklerinin

29 Kb arasında değiştiği ve ortalama 38 Kb olduğu bildirilmiştir. Faj genomunun lineer formda, çift zincirli DNA dan meydana geldiği ve tek taraflı yapışkan uçlara sahip olduğu saptanmıştır. Ayrıca S. thermophilus fajlarının farklı derecelerde de olsa aynı DNA homolojisine sahip oldukları bildirilmektedir (Krusch et al. 1987, Neve et al. 1989, Larbi et al. 1990, Benbadis et al. 1990, Arendt et al. 1993, Fayard et al. 1993, Brüssow et al. 1994, Brüssow and Bruttin 1995, Bruttin et al. 1997a, Le Marrec et al. 1997). Genel olarak faj-konakçı ilişkileri ile faj DNA larının restriksiyon enzimlerle kesimi sonucunda elde edilen fragment profilleri arasında iyi bir korelasyon bulunmuştur. Relano et al. (1987) nin 12 adet S. thermophilus fajı ile yaptıkları çalışmada da faj DNA ları arasında yüksek oranda homoloji belirlendiği ve çeşitli rekombinasyon olaylarının termofilik laktik Streptokok fajlarının evrimi süresince devam ettiği ileri sürülmüştür. Ayrıca S. thermophilus fajları ile sürdürülen biyokimyasal ve genetik analizlerin, bu fajların aynı atadan meydana geldiği şüphelerini doğurduğu bildirilmiştir (Neve et al. 1989, Benbadis et al. 1990, Sebastiani and Jäger 1993). Lb. bulgaricus fajları üzerine kısıtlı sayıdaki araştırmalardan G+C oranının % 50 ye yakın olduğu Mikkanen ve Alatossava tarafından 1994 de gösterilmiştir. Genom büyüklükleri Kb arasında belirlenmiştir (Mata et al. 1986, Trautwetter et al. 1986, Arendt et al. 1993). Lahbib-Mansais et al. (1992) tarafından da Lb. bulgaricus a ait mv4 temperent bakteriyofajın genomu 38.7 Kb büyüklüğünde ve lineer formda olduğunu saptanmıştır. Benzer DNA homolojisine sahip olan fajların, birbirlerinden tamamen farklı konakçı özgüllüğüne sahip oldukları bildirilmiştir. Konakçı özgüllüğünden yararlanarak fajlardan ziyade daha çok bakteri sınıflandırılması yapılmaktadır. DNA/DNA hibridizasyonu ve temel protein analizleri ile yapılan faj sınıflandırmaları arasında oldukça yakın bir korelasyon olduğu belirtilmiştir (Benbadis et al. 1990). Hibridizasyon analizleri sonucunda, mezofilik Streptokok ve Laktokok fajlarında olduğu gibi farklı faj grupları ortaya çıkmadığı için genel olarak S. thermophilus fajlarının aynı atadan geldiği kabul edilmektedir. Bununla birlikte S. thermophilus fajları arasındaki homoloji 20

30 derecesine ve diğer parametrelere bağlı olarak değişik sayıda alt gruplar belirlenmiştir (Le Marrec et al. 1997, Bruttin et al.1997). Kivi et al. (1987) Finlandiya peynir işletmelerinden 6 endüstriyel suş kullanarak izole ettikleri 9 adet S. thermophilus fajını homolog ve heterolog konakçılarına, adsorbsiyon oranlarına ve plak oluşturma etkinliklerine göre karakterize etmişlerdir. Fajlar genellikle farklı birçok suşa kolaylıkla adsorbe olabildikleri halde, birkaç faj kendi homolog konakçıları dışında bir iki heterolog konakçıya da spesifik bulunmuş ve hem homolog konakçıları hem de heterolog konakçılarında yüksek plak etkinliği göstermiştir. İsviçre, Almanya ve Fransa da çeşitli yoğurt ve peynir işletmelerinden izole edilmiş 97 adet virülent S. thermophilus fajına karşı, yine bu ülkelerden izole edilmiş 62 S. thermophilus suşunun duyarlılıklarını araştıran Krusch et al. (1987), bakteri ve fajların ülkeye göre spesifiklik gösterdiğini belirtmişlerdir. Aynı ülke orijinli faj ve bakteriler arasında yüksek konakçı özgüllüğü belirlenirken, bir ülkeden izole edilen fajlar diğer ülkeye ait bakterileri lize etmedikleri saptanmıştır. Larbi et al. (1990) ise buna karşın, farklı coğrafik orijine sahip ve anormal fermentasyonlardan izole edilmiş 9 adet S. thermophilus fajını, endüstriden ve çeşitli kültür koleksiyonlarından (ATCC, CNRZ, IP) sağladıkları 19 adet S. thermophilus suşunu karşılaştırmışlar ve tüm fajların aynı litik şablonu verdiğini belirtmişlerdir. Fajlar 19 suştan sadece endüstriyel kaynaklı olan iki adedini (NST3 ve NST5) lize etmiştir. Durlu-Özkaya vd yılında Türkiye de şiddetli faj problemi yaşayan bir yoğurt işletmesinden farklı zamanlarda izole ettikleri 16 adet S. thermophilus fajını 28 adet endüstriyel yoğurt kültürüne karşı denemişler ve üç adet suşun (709, B12 ve CH 1) fajların çoğuna karşı dirençli olduğunu, buna karşın birçoğunun (V1, V4, V2, 105, 632, B14, YC 380, FYE 41) geniş bir faj-konakçı spektrumunun bulunduğunu tespit etmişlerdir. Fajların konakçı spektrumları üzerine yapılan bir çalışmada değişik orijinli çeşitli yoğurt ve peynir örneklerinden izole edilmiş 27 adet S. thermophilus fajı, 32 C ve 43 C lerde ayrı ayrı 36 adet endüstriyel suşa karşı denenmiştir. Yedi suş denenen 27 faja karşı dirençli bulunurken 9 suş 1 veya 2 faja karşı duyarlı bulunmuştur. 11 adet 21

31 suşun ise yarıdan daha fazla faja duyarlı olduğu saptanmıştır. Ayrıca faj dirençliliğin, bazı suşlar için gelişme sıcaklığına da bağlı olduğu gösterilmiştir. Bu da sıcaklığa duyarlı faj direnç mekanizmalarının var olabileceğini düşündürmektedir (Le Marrec et al. 1997). Kaleli (2001) Ankara da çeşitli yoğurt işletmelerinden alınan yoğurt, bulk, ayran ve PAS örneklerinden izole ettiği 23 adet S. thermophilus fajını 30 yerel ve 9 endüstriyel S. thermophilus suşu ile karşılaştırmış ve çiğ sütlerden izole edilen yerel suşların tüm fajlara karşı tam direnç sergilerken endüstriyel suşların dirençliliklerine göre 3 grupta (tam dirençli, tam duyarlı ve oldukça fazla duyarlı) toplandığını belirlemiştir (Çizelge 2. 1). Tükel vd. (2003) 24 adet yerel Lb. bulgaricus suşunu, değişik süt ürünlerinden izole edilmiş 24 Lb. bulgaricus fajına karşı denemişler ve 18 Lb. bulgaricus suşunda tam veya kısmi liziz oluşturduklarını tespit etmişlerdir. Yerel Lb. bulgaricus suşları fajlara karşı duyarlı bulunmuştur. Tüm S. thermophilus fajları DNA paketleme mekanizmasına göre 2 gruba ayrılmışlardır (Lucchini et al. 1999). Sadece lineer DNA içeren fajlar üç temel yapısal protein içerirken sirküler ve lineer DNA moleküllerini bir arada bulunduran fajlar iki temel yapısal protein içermektedir. Birinci grubun üyeleri pac-tipi (temperent O1205, virülent fsfi11,ftp-j34) fajları içerirken, ikinci grubun üyeleri cos-tipi (temperent fsfi21, virülent fsfi19) fajları kapsamaktadır ( Le Marrec et al. 1997, Neve et al. 2003). Bu bulgular Siphoviridae familyası içinde fsfi21-benzeri ve fsfi11-benzeri fajlar olmak üzere iki yeni grubun oluşması için model niteliğinde olup bu esasa dayalı taksonomik çalışmalar sürdürülmektedir (Proux et al. 2002). S. thermophilus cos-tipi temperent ve virülent fajları arasında genetik olarak yakın bir ilişki bulunmaktadır. Virülent fsfi19, DT1 ve 7201 fajı ile temperent fsfi21 fajı, lizogeni modülü haricinde aynı temel genetik haritaya sahiptir. Bununla birlikte S. thermophilus virülent fajlarında karşılık gelen bölgenin Lb. bulgaricus nın delesyon ve rekombinasyon işlemleri ile lizogeni modülünden türediği belirtilmektedir. fsfi21, fsfi19 ve DT1 fajları genel olarak birbirinden nokta mutasyonlar, küçük çaplı 22

32 insersiyon ve delesyonlar ve genler arası yer değiştirme bakımından farklılık göstermektedirler (Lucchini et al. 1999, Bruttin 1997b, Brüssow 2001). Çizelge 2. 1 S. thermophilus fajlarının endüstriyel S. thermophilus suşlarına karşı gösterdikleri litik aktivite (Kaleli 2001) Faj Kodu Suş Kodu St709 St231 StB3 StCH-1 St632 StY1 StY4 StV1 StV2 fst 709-X fst 709-X fst 709-X fst 709-X fst 709-X fst 231-X fst 231-X7 - a fst 231-X fst 231-X fst 231-X fst B3-X x fst B3-X x fst B3-X fst B3-X fst B3-X fst B3-X fst B3-X fst B3-X fst B3-X x fst B3-X fst 231-X fst 231-X fst 231-X x a : liziz görülmedi 23

33 Tekrarlanan araştırmalar sonucunda fsfi21 fajının seri pasajlanması ile temperent fajın virülent faj haline dönüşümünü sağlayan 2.4 Kb lık delesyonun meydana geldiği gözlenmiştir (Bruttin et al. 1997b). Virülent LL-H ve temperent mv4 pac-tipi Lb. bulgaricus. delbrueckii fajları arasında da yakın ilişki gözlenmiştir. İki fajın yapısal genler arasında % 92 nükleotidlik (nt) sekans benzerliği bulunmuştur (Brüssow 2001). Lactobacillus cinsine ait ve sekans analizleri yapılmış cos-tipi iki fajın (adh ve A2) cos-tipi S. thermophilus fajları ile aynı genom organizasyonuna sahip oldukları belirtilmektedir. Pek çok protein sekans benzerliği bu Lactobacillus ve Streptococcus fajlarını birbirine bağlamaktadır Termofilik Bakteriyofajların Konakçı İlişkileri Litik yaşam çemberi Fajların kendi konakçılarında veya kendilerine duyarlı olan bakterilerde infeksiyon oluşturmaları ve çoğalmaları başlıca 4 aşamada gerçekleşmektedir. Litik döngünün en önemli ilk aşaması; fajın, konakçı bakterinin hücre duvarında bulunan ve nadiren faj tipine bağlı olarak farklı bölgelerde yer alabilen faj almaç bölgelerine (reseptör bölgeler) kuyruk vasıtasıyla tutunmasıyla (adsorbsiyon) ile başlamaktadır. Fajın konakçı bakteriye olan özgüllüğünü bu aşama belirlemektedir (Sanders 1988, Neve 1996, Arda 2000, Şanlıbaba 2003). Laktobasillerde hücre duvarında yer alan faj reseptörlerinin ana monomerleri ramnoz (hücre duvarı) ve D-galaktozamin (sitoplazmik membran) olduğu, ancak bazı tür ve suşlarda oldukça kompleks karbonhidratlardan meydana geldiği saptanmıştır (Arendt et al. 1993). Fajların hücre duvarı polisakkaridleri ile geri dönüşümlü olarak bağlanmasını takiben hücre duvarında bulunan proteinlerle geri dönüşümsüz olarak bağlandığı saptanmıştır (Arendt et al. 1993). Quiberoni et al. (2000) yaptıkları bir araştırmada S. thermophilus faj reseptörlerinin glikozamin, ramnoz ve riboz olduğu saptanmıştır. Eksponansiyel fazda olan (hücre duvarı yeni sentezlenmiş) çoğu bakterinin, fajları daha kolay adsorbe ettiği bildirilmiştir (Ustaçelebi 1992, Arda 2000). Bir türe ait fajlar genellikle bakteri ailesinde bulunan bir türe (homolog konakçı) 24

34 özgüllük gösterirken nadir olarak da yakın akraba olan türleri (heterolog konakçı) de infekte edebilmektedirler. Bazı mutasyonlar fajlara özgül reseptörlerin kaybolmasına ve faja dirençli hale gelebilmesine neden olabilmektedir (Arda 2000). Fajın uygun (homolog) konakçıya adsorbsiyonundan sonra ikinci aşama, kapsit içinde bulunan faj DNA sının kuyruktan geçerek bakteriyel hücreye injekte olmasıdır (penetrasyon). Faj DNA sının adsorbsiyonu ve penetrasyonunda Ca +2 iyonlarına ve enerjiye gerek duyulduğu bildirilmiştir. Ancak intraselüler ATP nin DNA injeksiyonu için doğrudan kullanılıp kullanılmadığı kesinleşmemiştir. Düşük sıcaklıklarda (0 C) hücresel metabolizma inhibe olduğundan penetrasyon dönüşümlü olarak engellenebilmektedir (Huggins and Sandine 1977, Sanders 1988, Arendt et al. 1993). Faj DNA sı periplazmik boşluktan geçerek sitoplazmaya ulaşmakta ve hücre duvarında açılan delik bakteri tarafından hemen tamir edilmektedir. Boş kapsit içeri girmeyip bir süre hücre yüzeyinde kaldıktan sonra ayrılır (Pelczar et al. 1986). Faj DNA sının konakçı hücreye penetrasyonundan sonra, konakçı metabolizması bloke edilmekte ve üçüncü aşama olan latent dönem başlamaktadır. Latent evre, faj DNA sının bakteri sitoplazmasına girmesinden olgun fajların oluşumuna kadar geçen evreyi kapsamaktadır. Fajlara göre değişmekle beraber bu dönem başlıca iki evreden meydana gelmektedir. Birincisi hiçbir olgun faja rastlanmadığı, latent periyodun ilk aşaması olan eklips evresidir. Bu evrede yeni faj DNA moleküllerinin replikasyonu ve transkripsiyonu için gerekli enzimler ve yeni faj proteinleri (kapsit, kuyruk, levha, fibril) sentezlenmektedir (Pelczar et al. 1986, Prescott et al. 1993). İkinci evre ise fajın baş, kuyruk, taban plağı, fibril gibi yapılarının (geç proteinler) sentezinin tamamlanmasını takiben bunların montajı ve faj DNA sının baş yapısı içine sıkıştırılarak içeri alınmasını kapsayan olgunlaşma (montaj) dönemidir. Litik döngünün son aşaması, konakçı hücrenin lizizidir. Birçok bakteriyofajda bu aşama, faj genomunda kodlu olan iki protein aktivitesine gereksinim duymaktadır. Küçük bir transmembran proteini olan ve holin olarak adlandırılan birincisi sitoplazmik membranda lezyonlar oluşturmak için oligomerize olmaktadır. Bu lezyonlar peptidoglikan hidrolizsayon aktivitesine sahip lizin olarak adlandırılan ikinci proteinin 25

35 serbest kalmasına izin veren porlar olarak işlev görmektedir. Bu enzimler konakçı bakterinin peptidoglikan yapıdaki hücre duvarını lize ederek üretilen yeni faj partiküllerinin ortama salınmasına neden olmaktadır. (Teuber and Lembke 1983, Neve 1996, Sheehan et al. 1999, Arda 2000, ). Lb. delbrueckii LL-H fajında endo-lisin kodlayan genler moleküler ve biyokimyasal düzeyde karakterize edilmiştir (Trautwetter et al. 1986). Ayrıca Sheehan et al. (1999) S. thermophilus fo1205 fajında iki adet holin kodlayan gen bulduklarını ve bu holin genlerinin S. thermophilus a ait fsfi21, fsfi19 ve fsfi11 fajlarında da kodlu olduğunu belirtmişlerdir. Fajın litik üremesi, çevre koşullarından (ph veya sıcaklık) ve konakçı hücrenin gelişme şartlarından etkilenmektedir. Konakçının beslenme koşulları ve ortamda elektrolit kapasitesi faj replikasyonu ve hücre lizizini teşvik etmektedir. Faj replikasyonu için uygun olan optimum sıcaklık konakçı hücrenin gelişime sıcaklığı ile aynıdır. (Arendt et al. 1993, Neve 1996). Ayrıca konakçı hücrede restriksiyon - modifikasyon (R/M) sistemlerinin bulunması ve abortif infeksiyon (Abi) mekanizmalarının varlığı da faj gelişimini etkilemektedir (Neve 1996) Lizogenik yaşam çemberi Virülent fajların aksine, bazı durumlarda bakteriyi infekte eden fajın çoğalmadığı ve bakterinin lize olmadığı görülmektedir. Böyle fajlar temperent faj, lize olmayan bakteri lizogen bakteri, bu olgu da lizogeni olarak adlandırılmaktadır. Faj DNA sı konakçıya injekte olduktan sonra faj DNA sının bakteri genomuna entegrasyonu söz konusudur. Entegrasyon, fajda kodlu entegraz enzimleri tarafından katalize edilmekte ve faj DNA sı ile bakteriyel DNA arasında homoloji gösteren spesifik, attp (faj genomunda bulunan faj tutunma bölgesi) ve attb (bakteri genomunda bulunan bakteriyel tutunma bölgesi) bölgeleri arasında rekombinasyon ile gerçekleşmektedir. Profaj adını alan bu entegre DNA parçası artık konakçı DNA sı ile birlikte replike olmakta ve lizogenik hücrelerin devamını sağlamaktadır, sonuçta konakçı hücrede liziz görülmemektedir. Ancak temperent faj DNA sı bu entegrasyonu gerçekleştirmeyip bakteri içinde otonom kalabilmekte ve plazmit gibi davranabilmektedir. Genel olarak lizogen bakteri aynı 26

36 karakterdeki faj (aynı faj) tarafından süperinfeksiyona karşı direnç kazanırken (homoimmün), heterolog fajlar için böyle bir durum söz konusu değildir. Lizogen bağışıklık olarak da adlandırılan bu durum faj direnç mekanizmalarından biri olarak da kabul edilmektedir (Sanders 1988, Lahbib-Mansais et al. 1992, Arendt et al. 1993, Dupont et al. 1995, Neve 1996, Snyder and Champness 1997, Birge 2000, Tunail vd. 2000). Fajın litik döngüye girip çok sayıda faj oluşturması ya da temperent özellik kazanması çevresel ve besinsel koşullara bağlı olarak değişmektedir. Bakterinin lizogen hale geçmesi çoğu zaman fajın lehine olan bir durumdur. Ortamda besin kısıtlamasına giren bir kültür yaşamının devamı için dormant (uyku) hale geçebilmektedir ve bu duruma geçmeden önce mrna ve protein sentezi seviyesini düşürmektedir. Dormant haldeki bakteride faj infeksiyonu sonucu fajın çoğalıp varlığının devamını sağlayabilmesi bakımından tehlikeye düşmektedir. Bunun başlıca nedenlerinden biri faj üretiminin aktif metabolizmaya sahip bir konakçıda meydana gelme zorunluluğu diğeri de mrna ve protein degradasyonu sonucunda faj üretiminin genellikle kalıcı olarak engellenmesidir. Bu durumdan kurtulmak ancak fajın bakteriyle eş zamanlı olarak dormant (lizogenik) hale geçmesiyle mümkündür. Gerçekte, besin kısıtlaması lizogeniyi teşvik etmektedir. İnfeksiyon çokluğu (MOI=multiplicity of infection) ve konakçı hücrenin fizyolojik durumu lizogenik ya da litik döngüyü belirlemede önemli diğer bir unsurdur. Konakçı hücre çoğalmasının düşük, MOI değerinin yüksek olması lizogeniyi teşvik etmektedir. Ortamda bulunan konakçı hücrelerin tümünün infeksiyona uğrayarak lize olması fajın konakçısız kalma riskini doğurmakta ve onun tekrar özgül konakçısıyla karşılaşana kadar çevresel tehlikelere karşı savunmasız kalmasına neden olmaktadır. Yüksek MOI değeri lizogeniyi teşvik ederek ortamdaki bir miktar bakterinin canlı kalmasına olanak tanır. Bu durum faj genomunun bakteri DNA sı ile birlikte her replikasyonda çoğalarak yeni faj kopyalarının sentezini mümkün kılar (Prescott et al. 1993). Fajlar lizogenik durumda iken serbest formda bulunmalarına oranla zorlu çevre koşularına karşı daha dirençli olurlar (Huggins and Sandine 1977). 27

37 Lizogeni Modülü Siphoviridae familyasında bulunan ve konakçı olarak E. coli nin K12 suşunu kullanan lambda (l) fajı, en iyi anlaşılmış temperent faj olduğundan klasik lizogeni modülünde örnek olarak gösterilmiştir. Lambda fajı çift iplikçikli DNA ya sahip olup ikosahedral baş yapısına ve kontraktil kılıf içermeyen bir kuyruğa sahiptir. Lambda DNA sı 12 nükleotid uzunluğunda, birbiriyle çift oluşturabilen komplementer (tamamlayıcı) baz dizilerine sahip yapışkan uçları bulunan linear bir moleküldür. Lambda fajı konakçısına girdikten sonra iki ucunda bulunan bu yapışkan uçlardan birleşerek sirkülarize olmakta ve replikatif forma (RF) geçmektedir. (Şekil 2. 2) (Pelczar et al. 1986, Prescott et al. 1993) Sirkülarizasyon Şekil 2. 2 Lambda faj DNA sının replikatif forma dönüşümü Lambda faj genomu özenle düzenlenmiş yaklaşık 40 genden meydana gelmiştir. Bu genler baş sentezi, kuyruk sentezi, lizogeni ve regülasyonu, DNA replikasyonu ve hücre lizizi görevlerini üstlenmişlerdir (Şekil 2. 3) (Prescott et al. 1993). 28

38 Geç kontrol Liziz Olgunlaşma Baş sentezi DNA sentezi Represyon Erken kontrol Represyon Kuyruk sentezi Rekombinasyon Egzisyon ve integrasyon Şekil 2. 3 Lambda faj genomu Lizogeninin oluşmasını sağlayan cii gen ürünü ile DNA nın replike olup çok sayıda fajın oluşmasına neden olan litik döngü proteinleri arasında rekabet söz konusudur. Bu rekabet genellikle litik döngü lehinde sonuçlanmasına rağmen % 1 oranında cii gen ürünü yarışı kazanabilmektedir (Prescott et al. 1993, Arda 2000). cii ve ciii genleri sırasıyla P R ve P L promotorlarından ters yönlü olarak transkribe olmaktadır (Şekil 2. 4). CII proteini (repressör), diğer zamanlarda inaktif olan iki promotordan (P RE ve P I ) transkripsiyonun başlaması için RNA polimerazın aktifleşmesini sağlayarak lizogeniyi teşvik etmektedir. CII proteini tarafından aktive edilen promotordan bir tanesi olan P RE (Repressor Establishment-repressör oluşumunu sağlayan promotor) ci geninin transkripsiyonunu başlatmaktadır. CII proteini tarafından aktive olan diğer promotor integraz (int) geninin transkripsiyonunu sağlayan P I promotorudur. int gen ürünü olan integraz enzimi lizogeni meydana getirmek için faj DNA sı ile bakteri DNA sını spesifik bölgelerden birleştirmektedir (Şekil 2. 5). ciii gen ürünü lizogeni ile dolaylı olarak ilişkilidir. CIII proteini konakçı hücre proteinazlarının aktivitesini engelleyerek CII proteinini korumaktadır. Bu nedenle CIII 29

39 proteininin ortamda bulunmaması sonucu CII proteini hızlı bir şekilde parçalanmakta ve lizogeni meydana gelememektedir (Snyder and Champness 1997). a ciii P L cii P R b int ci P I P RE CII CII c KAPALI P L O L O P Q R CI KAPALI P R O R Şekil 2. 4 İnfeksiyondan sonra lizogeni oluşumu. a. cii ve ciii genleri sırasıyla P R ve P L promotorlarından transkribe olmaktadır. b. CII, P RE ve P I promotorlarının aktifleşmesini sağlayarak sırasıyla CI repressör ve integraz (int) ın sentezlenmesini teşvik etmektedir. c. CI repressörü O R ve O L ye bağlanarak P R ve P L den transkripsiyonu engellemektedir. CI repressörü, operatör olarak adlandırılan bölgelere bağlanmaktadır. O R ve O L operatörleri P R ve P L promotorlarını kapatmakta ve fajın birçok geninin transkripsiyonunu engelleyerek konakçının lizogenik forma geçmesine neden olmaktadır. Profaj evresinde ci geni, infeksiyondan hemen sonra kullanılan P RE promotoruna göre yukarı bölge olan P RM (Repressor Maintenance-repressör oluşumunu sürekli kılan promotor) promotorundan transkribe olmaktadır. P RM promotorunun 30

40 aktivasyonu için CI repressörüne ihtiyaç duyulduğundan infeksiyondan hemen sonra kullanılamamaktadır (Prescott et al. 1993, Snyder and Champness 1997). λ kromozomu Sirkülarizsayon Bakteriyel kromozom Profaj int xis Lizogenik kromozom Şekil 2. 5 Faj DNA sının bakteri DNA sına dönüşümlü entegrasyonu ve insersiyonu CI repressörü lizogeninin devamı için gerekli temel proteindir. Eğer repressör miktarı gereken seviyenin altına düşerse litik genlerin transkripsiyonu başlayacak ve profaj, faj üretmek için indüklenmiş olacaktır. Ancak repressör miktarı optimal seviyeye yükselirse hücre enerjisini fazla miktarda repressör üretmek için harcayacaktır. O R operatörü üç adet repressör bağlanma bölgesi içermektedir (O 1 R, O 2 R, O 3 R ). Repressör miktarı düşük ise sadece O 1 R operatörü işgal edilir ve P R promotorundan transkripsiyon engellenir. Ancak repressör miktarı arttıkça O 2 R operatörü de işgal edilmiş olmakta ve 31

41 hücrenin lizogenik forma geçmesini sağlayan tek repressör genin transkripsiyonun sağlayan P RM promotorunun aktifleşmesini sağlanmış olmaktadır. Çok yüksek repressör konsantrasyonlarında O 3 R yine işgal edilmiş olmakta ancak P RM promotoru bloke olmaktadır (Şekil 2. 6) (Snyder and Champness 1997). Lizogen bakteride bulunan CI repressörü O L ve O R operatörlerine bağlanarak sadece diğer profaj genlerinin transkripsiyonunu engellemekle kalmayıp, lizogenik bakteriyi infekte eden ve fajın operatörüne bağlanan diğer lambda fajların gen ürünlerinin transkripsiyonunu da engellemektedir. Bundan dolayı Lambda fajı tarafından lizogenik özellik kazanan bakteri süperinfeksiyona karşı bağışıktır. Ancak bu lizogen bakteri farklı operatör sekansa sahip yakın akraba olan başka bir faj tarafından infekte olursa sadece lambda fajına etkili CI repressörü bu sekansa bağlanamaz. Operatör sekansları bakımından farklı olan iki faja heteroimmün denilmektedir (Snyder and Champness 1997). Lambda fajı profaj durumunu konakçı hücre DNA sının hasara uğramasına kadar korumaktadır. Konakçı hücre DNA sındaki hasarı onarmak için girişimde bulunduğunda kısa DNA parçacıkları ortamda birikmekte ve konakçıdaki RecA proteinine bağlanmaktadır. Bu kompleks ise CI repressörüne bağlanarak repressörün işlevini yitirmesine neden olmaktadır. Operatörlerdeki repressör miktarı azalınca litik genlerin transkripsiyonu P R ve P L promotorlarından başlamaktadır. P L promotorundan transkribe edilen genlerden iki tanesi de int ve xis dir (Şekil 2. 2 ). İnfeksiyondan sonra sadece int geni sentezlenirken indüksiyondan sonra hem integraz (int) hem de eksisyon (xis) proteinleri sentezlenir. Bu iki protein lambda DNA sını kromozomdan ayrılmasını sağlar ve profajın virülent form kazanmasına neden olur (Şekil 2. 5) (Prescott et al. 1993). Lambda fajı ile LAB fajlarının lizogeni modülü arasında benzerlikler bulunmasına rağmen farklılıklar da mevcuttur. Bugüne kadar en iyi karakterize edilmiş lizogeni modülü düşük G+C içeriğine sahip gram-pozitif S. thermophilus fajı olan fsfi21 dir (Lucchini et al. 1999). fsfi21 fajının sekans analizleri sonucunda 3400 ve 7200 nt arasında integraz, ci benzeri repressör, Cro benzeri protein ve bir antirepressörün 32

42 kodlandığı genlerin bulunduğu belirtilmiştir. Ayrıca orf (open reading frame-açık okuma çerçevesi) lerin dağılımı ve oryantasyonları BK5-T laktokok fajı ile oldukça benzerlik göstermektedir (Bruttin et al. 1997b). Lambda fajından farklı olarak LAB fajları, profaj integrasyonu için tirozin integrazlarını kullanmaktadır. fsf21 fajında, int geninde eksisyonaz genine ait yukarı bölge saptanamamıştır. Yukarı bölge orf 203, lizogen bakteriyi birçok virülent S. thermophilus fajına karşı koruyan süperinfeksiyon bağışıklık fonksiyonunu kodlamaktadır (Bruttin et al. 1997, Brüssow 2001). Neve et al. (1998) tarafından izole edilen ftp-j34 temperent fajı fsfi21 lizogeni modülü bakımından birçok benzerlik içermektedir. PCR analizleri sonucunda ftp-j34 fajı da fsfi21 fajı gibi genomunu trna Arg genine dahil etmektedir. Lb. bulgaricus mv4 fajı ise genomunu trna Ser genine entegre etmektedir (Auvray et al. 1999). Repressör yok Düşük repressör konsantrasyonu KAPALI Yüksek repressör konsantrasyonu KAPALI Şekil 2. 6 Repressör sentezinin regülasyonuna bağlı olarak litik veya lizogenik döngüye geçiş Laktik asit bakterilerinde lizogenik türler ilk kez 1949 yılında Reiter tarafından gösterilmiştir (Teuber and Lembke 1983, Davidson et al. 1990). Lizogeni hem ticari miks kültürlerden hem de çiğ sütten izole edilen LAB inde gösterilmiştir (Jarvis 1989). Bu konuda yapılan birçok araştırma sonucunda lizogeninin LAB arasında oldukça yaygın bir özellik olduğu anlaşılmıştır. S. thermophilus türlerinde lizogeniye Laktokok ve Laktobasillere oranla daha ender rastlanmaktadır (Cluzel et al. 1987, Sechaud et al. 1988, Davidson et al. 1990, Brüssow et al. 1994, Neve 1996, Le Marrec et al. 1997). 33