ANKARA ÜNĐVERSĐTESĐ BĐYOTEKNOLOJĐ ENSTĐTÜSÜ YÜKSEK LĐSANS TEZĐ

Transkript

1 ANKARA ÜNĐVERSĐTESĐ BĐYOTEKNOLOJĐ ENSTĐTÜSÜ YÜKSEK LĐSANS TEZĐ KOCA ENGEREK, Macrovipera lebetina (LINNAEUS, 1758) NIN GÜNEYDOĞU ANADOLU VE KIBRIS ALT TÜRLERĐNĐN ZEHĐRLERĐNĐN PROTEOMĐK VE SPEKTROSKOPĐK YÖNTEMLERLE KARŞILAŞTIRILMASI Naşit ĐĞCĐ Danışman Öğretim Üyesi Yrd. Doç. Dr. F. Duygu ÖZEL DEMĐRALP ANKARA 2010

2 Yrd. Doç. Dr. F. Duygu ÖZEL-DEMĐRALP danışmanlığında, Naşit ĐĞCĐ tarafından hazırlanan bu çalışma 19/08/2010 tarihinde aşağıdaki jüri tarafından Biyoteknoloji Anabilim Dalı nda yüksek lisans tezi olarak kabul edilmiştir. Başkan : Prof. Dr. Bayram GÖÇMEN Đmza : Üye : Yrd. Doç. Dr. F. Duygu ÖZEL-DEMĐRALP Đmza : Üye : Yrd. Doç. Dr. E. Doruk ENGĐN Đmza : Yukarıdaki sonucu onaylarım. Prof. Dr. Mustafa AKÇELĐK Enstitü Müdürü ii

3 Koca Engerek, Macrovipera lebetina (Linnaeus, 1758) nın Güneydoğu Anadolu ve Kıbrıs Alt Türlerinin Zehirlerinin Proteomik ve Spektroskopik Yöntemlerle Karşılaştırılması ÖZET Bu çalışmada Koca Engerek, Macrovipera lebetina (Linnaeus, 1758) türünün Güneydoğu Anadolu da yayılış gösteren M. l. obtusa (Dwigubsky, 1832) ve Kıbrıs ta yayılış gösteren M. l. lebetina (Linnaeus, 1758) alt türlerinin zehirleri arasındaki farklılıkların proteomik ve spektroskopik yöntemlerle saptanması amaçlanmıştır. Terraryum ortamında beslenmekte olan ergin iki M. l. obtusa ve iki M. l. lebetina örneğinden zehir sağılmış ve aynı alt türe ait bireylerden sağılan zehirler birleştirilerek liyofilize edilmiştir. Daha sonra toz örnekler çözülüp iki boyutlu jel elektroforezi ile zehir protein profilleri iki tekrarlı olarak elde edilmiştir. Birinci boyut için 17 cm uzunluğunda ve ph 3-10 aralığında IPG şeritler kullanılmıştır. Jeller Sypro Ruby ile boyanmış ve VersaDoc görüntüleme sisteminde görüntülenmiştir. Jel fotoğraflarının analizi PDQuest programı kullanılarak yapılmıştır. Peptit kütle parmakizi yaklaşımıyla, MALDI-TOF kütle spektrometresinden elde edilen peptit m/z değerleri kullanılarak yapılan biyoinformatik analizler sonucunda proteinler belli oranlarda tanımlanmıştır. Ayrıca zehrin proteinler dışındaki içeriği hakkında da bilgi edinmek için Fourier Dönüşüm Kızılötesi Spektroskopisi (FT-IR) yöntemiyle liyofilize zehir örneklerinden orta kızılötesi bölgede çekim yapılmıştır ve kümeleme analizi ile zehir karakterizasyonu gerçekleştirilmiştir. Đki boyutlu jel elektroforezi sonucunda iki alt türün zehrinde ortak olarak bulunan proteinler tespit edilmekle birlikte, önemli ölçüde farklılıklar da görülmüştür. Đki grup arasında logaritmik düzeltmeli ve düzeltmesiz t-testine göre anlamlı farklılık gösteren toplam 15 protein kümesi bulunmuştur. Özellikle ~20 kda ve ~ ph 6 bölgesindeki protein profilleri önemli ölçüde değişkenlik göstermiştir. FT-IR çekimleri sonucunda; M. l. obtusa ve M. l. lebetina zehrinde 13 belirgin bant görülmüştür. Đkincil türev spektrumlarında Amid II bölgesinde görülen farklılıklar proteinlerin ikincil yapı farklılıklarına işaret etmektedir. Ayrıca M. lebetina alt türlerinin ve Montivipera xanthina türünün zehir FT-IR spektrumları kümeleme analizi ile gruplandırılmıştır. MALDI-TOF kütle spektrometresinden elde edilen m/z değerlerinin biyoinformatik analizi sonucunda çeşitli engerek ve çıngıraklı yılan zehirlerinden fosfolipaz A 2, metalloproteaz, metalloproteaz/disintegrin, serin proteaz, disintegrin, sisteince zengin salgı proteini, C-tipi lektin, vasküler endotelyal büyüme faktörü, sinir büyüme faktörü, L-amino asit oksidaz, hyaluronidaz, tripsin inhibitörü ailelerine ait proteinler tanımlanmıştır. Ayrıca Elapid, Hydophid, Colubrid ve kertenkele zehirlerinden de proteinler tanımlanmıştır. Macrovipera lebetina türünün zehri 2 boyutlu jel elektroforezi ile ve ham yılan zehri FT-IR teknikleriyle ilk kez incelenip kümeleme analizi yapılarak literatüre bu anlamda katkıda bulunulmuştur. Anahtar kelimeler: Macrovipera lebetina lebetina, Macrovipera lebetina obtusa, Montivipera xanthina, Koca Engerek, Şeritli Engerek, iki boyutlu jel elektroforezi, MALDI- TOF, FT-IR, zehir, yılan. iii

4 Venom Comparisons of the Two Subspecies of Blunt-Nosed Viper, Macrovipera lebetina (Linnaeus, 1758) from South-Eastern Anatolia and Cyprus by Proteomic and Spectroscopic Methods ABSTRACT The aim of this study is to compare the venoms of the subspecies of Blunt-nosed Viper, Macrovipera lebetina (Linnaeus, 1758) from South-Eastern Anatolia [M. l. obtusa (Dwigubsky, 1832)] and Cyprus [M. l. lebetina (Linnaeus, 1758)] by proteomic and spectroscopic methods. Venom was milked from two adult M. l. obtusa and M. l. lebetina specimens which were have been fed in terrarium. Venom samples were pooled in one tube for each subspecies and lyophilized. After that, lyophilized venom samples were reconstituted and venom protein profiles were obtained in duplicates by two dimensional gel electrophoresis. For the first dimension, 17 cm. immobilized ph gradient (IPG) strips with a ph 3-10 gradient were used. Gels were stained with Sypro Ruby and scanned by VersaDoc gel imaging system. Gel analysis were carried out using PDQuest gel analyze program. Protein identification was achieved with peptide mass fingerprinting approach, by the bioinformatic analyses of the peptide m/z values obtained from MALDI-TOF mass spectrometer. Additionally, lyophilized venom samples were measured by FT-IR in the mid-infrared region in order to obtain information about not only the proteins, but the all molecular contents of venom and also venom characterization was made with the cluster analysis. As a result of two dimensional gel electrophoresis, number of shared protein spots were found between two subspecies. However, some significant differences were also seen. 15 protein spots were found statistically different between the replicate gels from two groups according to Student t-test both with and without logarithmic transformation. Important differences were found especially at ~20 kda and ~ ph 6 region. As a result of the FT-IR measurements, 13 significant peaks were found on the spectrum of M. l. obtusa and M. l. lebetina venom. Differences on the second derivative spectrums at Amid II region indicate protein secondary structure differences. Additionally, venom FT-IR spectrums were obtained from Montivipera xanthina and two subspecies of M. lebetina were classified with cluster analysis. As a result of the bioinformatic analysis of the m/z values were obtained from the MALDI-TOF mass spectrometer, proteins belonging to the following families were identified from various true and pit viper venoms: phospholipase A 2, metalloprotease, metalloprotease/disintegrin, serin protease, disintegrin, cysteine-rich secretory protein, C-type lectin, vascular endothelial growth factor, nerve growth factor, hyaluronidase, L-amino acid oxidase, trypsin inhibitor. Also, proteins from the venom of Elapids, Colubrids, Hydrophids, and lizards were identified. Venom of M. lebetina was studied with two dimensional gel electrophoresis for the first time. Also this is the first report of the whole snake venom mid-infrared FT-IR spectrum and the venom characterization with cluster analysis. Key words: Macrovipera lebetina lebetina, Macrovipera lebetina obtusa, Montivipera xanthina, Blunt-Nosed Viper, Ottoman Viper, two dimensional gel electrophoresis, MALDI- TOF, FT-IR, venom, snake. iv

5 TEŞEKKÜR Bu konu hakkında çalışma yapmama olanak tanıyan ve çalışmalarım boyunca bana her türlü desteği sağlayan, hiçbir konuda kısıtlama getirmeyen, duyduğu güvenle beni yüreklendiren ve laboratuvar imkanlarından en verimli şekilde faydalanmamı sağlayan danışmanım Yrd. Doç. Dr. F. Duygu ÖZEL DEMĐRALP e, zehir örneklerini temin eden, çalışmalara sistematik alanında katkı sağlayan ve lisans öğrenimimde önemli katkıları olan Prof. Dr. Bayram GÖÇMEN e (Ege Üniversitesi), arazi çalışmalarında ve zehir sağımında yardımcı olan ve çalışmalarımda beni her zaman destekleyen Arş. Gör. Dr. M. Zülfü YILDIZ a (Harran Üniversitesi), laboratuvar çalışmalarımda yardımlarını esirgemeyen ve arkadaşlıklarıyla iyi vakit geçirmemi sağlayan Selen PEKER, Başak MARUL, Beycan AYHAN, Avshar ABBASI, Ayça YILMAZ ve FT-IR konusunda görüşlerine başvurduğum Şebnem GARĐP e (ODTÜ), tüm çalışmalarımı en yüksek verimde yürütmemi sağlayan motivasyon kaynağım Bahar KAPTANER e ve her zaman yanımda olup beni her anlamda destekleyen anne ve babama, dayılarıma ve amcalarıma teşekkür ederim. Ayrıca lisans döneminde bu konuya ilgi duymama vesile olan ve desteğini her zaman hissettiren Prof. Dr. Hüseyin ARIKAN a (Ege Üniversitesi), değerli önerilerine başvurduğum Dr. A. Tarık BAYKAL (TÜBĐTAK MAM, GMBE) ve Dr. Bryan Grieg FRY a (University of Melbourne) ve tüm Ankara Üniversitesi Biyoteknoloji Enstitüsü Merkez Laboratuvarı personel ve öğrencilerine teşekkürü borç bilirim. Naşit ĐĞCĐ Ağustos 2010, ANKARA v

6 ĐÇĐNDEKĐLER ÖZET...iii ABSTRACT... iv TEŞEKKÜR... v ĐÇĐNDEKĐLER... vi ŞEKĐLLER DĐZĐNĐ...viii ÇĐZELGELER DĐZĐNĐ...xiv SĐMGELER ve KISALTMALAR DĐZĐNĐ...xvii 1. GĐRĐŞ Amaç KAYNAK ÖZETLERĐ Yılan Zehrinin Genel Özellikleri Viperid zehirlerinin özellikleri Macrovipera lebetina Zehri ile Yapılan Çalışmalar Yılan Zehirleriyle Đlgili FT-IR Spektroskopisi Çalışmaları Türkiye deki Çalışmalar Macrovipera lebetina (Linnaeus, 1758) Sistematik Morfoloji Ekoloji ve dağılış Populasyonlar Arasındaki Zehir Farklılıklarının Belirlenmesinin Önemi Yılan Zehrinin Sistematikte Kullanım Potansiyeli Proteomik Venomiks Đki boyutlu jel elektroforezi tekniğinin venomiks alanında kullanımı ve önemi Kütle spektrometrelerinin venomiks alanında kullanımı ve önemi Yılan Zehirlerinin Tanı ve Bilimsel Amaçlı Kullanımı Yılan Zehrinin Biyoteknolojik Kullanımı MATERYAL ve YÖNTEM Materyal Zehir sağılan yılan örnekleri vi

7 Kullanılan kimyasal maddeler ve cihazlar Yöntem Zehir sağımı ve saklanması Protein miktar tayini Đki boyutlu jel elektroforezi Jellerin boyanması, görüntülenmesi ve analizi Đstatistiksel analiz Protein kümelerinin kesimi ve jel içinde tripsin sindirimi (tripsinizasyon) MALDI-TOF kütle spektrometresi için örnek hazırlama ve ölçüm Peptit kütle verilerinin biyoinformatik analizi ve protein tanımlama FT-IR analizleri ARAŞTIRMA BULGULARI Protein Miktar Tayini Đki Boyutlu Jel Elektroforezi ile Protein Profillerinin Çıkarılması ve Jellerin Đstatistiksel Analizi Peptit Kütle Parmak Đzi Yöntemi ile Protein Tanımlanması FT-IR Spektroskopisi Sonuçları Zehrin genel moleküler içeriği Kümeleme analiziyle zehir karakterizasyonu TARTIŞMA ve SONUÇ KAYNAKLAR EKLER EK 1 Deneylerde kullanılan kimyasal maddeler EK 2 Deneylerde kullanılan cihazlar ve programlar EK 3 Aldente sonuçlarına göre Elapid, Colubrid, Hydrophid ve kertenkele zehirlerinden tanımlanan proteinlerin adları, erişim numaraları, teorik ve deneysel Mw ve pi ları, skorları, dizi kapsama yüzdeleri, peptit eşleşme sayıları ve bulunduğu organizma EK 4 Đfadesi iki alt tür arasında anlamlı farklılık gösteren bazı protein kümelerinden MALDI-TOF ile elde edilen peptit kütle m/z değerleri ÖZGEÇMĐŞ vii

8 ŞEKĐLLER DĐZĐNĐ Şekil Bazı zehirli hayvan grupları (Lewis and Garcia 2003) Şekil Yılan zehirlerinin içeriğinde bulunan başlıca maddeler Şekil M. lebetina obtusa (Fotoğraf: Bayram GÖÇMEN) Şekil Venomiks alanını destekleyen teknolojiler Şekil GP IIb/IIIa antagonistlerinden eptifibatide ve tirofibanın moleküler yapıları ve ticari ürünleri olan Integrilin ve Aggrastat ( Şekil ACE inhibitörü olan captopril in ticari formu ve moleküler yapısı Şekil Zehir sağım işlemi (orijinal) Şekil Zehir içeriklerinde coğrafik farklılıkların tespiti için uygulanan havuz yaklaşımının şematik gösterimi Şekil Çalışma basamaklarının şematik gösterimi Şekil Bradford yönteminde standart proteinlerle elde edilen kalibrasyon doğrusu (R 2 =0,969) Şekil Macrovipera lebetina obtusa (A) ve Macrovipera lebetina lebetina (B) zehirlerinin iki boyutlu jel elektroforezi ile elde edilmiş protein profilleri Şekil Logaritmik düzeltme yapılmadan (A) ve yapılarak (B) gerçekleştirilen t-testine göre ve PLS analizine (C) göre ifadesindeki farklılık anlamlı bulunan protein kümelerinin PDQuest programından alınmış ifade yoğunluk çubuk grafikleri Şekil M. l. obtusa (A) ve M. l. lebetina (B) zehirlerinin 2 boyutlu jel elektroforezi ile elde edilmiş protein profilleri ve bazı önemli protein ifade farklılıklarının 3 boyutlu gösterimleri Şekil numaralı protein kümesinin tekrar jellerindeki büyütülmüş görünümleri, üç boyutlu gösterimleri ve yoğunluk bar grafikleri Şekil numaralı protein kümesinin tekrar jellerindeki büyütülmüş görünümleri, üç boyutlu gösterimleri ve yoğunluk bar grafikleri Şekil numaralı protein kümesinin tekrar jellerindeki büyütülmüş görünümleri, üç boyutlu gösterimleri ve yoğunluk bar grafikleri Şekil numaralı protein kümesinin tekrar jellerindeki büyütülmüş görünümleri, üç boyutlu gösterimleri ve yoğunluk bar grafikleri Şekil numaralı protein kümesinin tekrar jellerindeki büyütülmüş görünümleri, üç boyutlu gösterimleri ve yoğunluk bar grafikleri viii

9 Şekil numaralı protein kümesinin tekrar jellerindeki büyütülmüş görünümleri, üç boyutlu gösterimleri ve yoğunluk bar grafikleri Şekil numaralı protein kümesinin tekrar jellerindeki büyütülmüş görünümleri, üç boyutlu gösterimleri ve yoğunluk bar grafikleri Şekil numaralı protein kümesinin tekrar jellerindeki büyütülmüş görünümleri, üç boyutlu gösterimleri ve yoğunluk bar grafikleri Şekil numaralı protein kümesinin tekrar jellerindeki büyütülmüş görünümleri, üç boyutlu gösterimleri ve yoğunluk bar grafikleri Şekil numaralı protein kümesinin tekrar jellerindeki büyütülmüş görünümleri, üç boyutlu gösterimleri ve yoğunluk bar grafikleri Şekil numaralı protein kümesinin tekrar jellerindeki büyütülmüş görünümleri, üç boyutlu gösterimleri ve yoğunluk bar grafikleri Şekil numaralı protein kümesinin tekrar jellerindeki büyütülmüş görünümleri, üç boyutlu gösterimleri ve yoğunluk bar grafikleri Şekil numaralı protein kümesinin tekrar jellerindeki büyütülmüş görünümleri, üç boyutlu gösterimleri ve yoğunluk bar grafikleri Şekil numaralı protein kümesinin tekrar jellerindeki büyütülmüş görünümleri, üç boyutlu gösterimleri ve yoğunluk bar grafikleri Şekil numaralı protein kümesinin tekrar jellerindeki büyütülmüş görünümleri, üç boyutlu gösterimleri ve yoğunluk bar grafikleri Şekil MALDI-TOF kütle spektrometresinin beş peptit karışımı ile kalibrasyonundan sonra elde edilen beş peptit m/z değerleri Şekil M. l. obtusa zehrinden elde edilen iki boyutlu jel görüntüsü üzerinde protein kümelerinin numaralandırılması (kırmızıyla işaretlenenler ifade farklılıkları istatistiksel olarak anlamlı bulunan protein kümeleridir) Şekil Viperid zehirlerinden tanımlanan proteinlerin yüzdelerine göre pasta dağılım grafikleri (ADAM: disintegrin/metalloproteaz, PLA2: fosfolipaz A 2, CRISP: sisteince zengin salgı proteini, VEGF: vasküler endotelyal büyüme faktörü, NGF: sinir büyüme faktörü, LAO: L-amino asit oksidaz) Şekil Zinc metalloproteinase leucurolysin-b proteini için eşleştirilen peptit kütlelerinin tüm amino asit dizisi üzerinde gösterimi (eşleşen bölgeler büyük ve mavi olarak gösterilmiştir) Şekil Metalloproteinase proteini için eşleştirilen peptit kütlelerinin tüm amino asit dizisi üzerinde gösterimi (eşleşen bölgeler büyük ve mavi olarak gösterilmiştir) ix

10 Şekil numaralı protein kümesinden elde edilen triptik peptitlerin m/z değerleri arasındaki MALDI-TOF spektrumu Şekil numaralı protein kümesinden elde edilen triptik peptitlerin m/z değerleri arasındaki MALDI-TOF spektrumu Şekil Zinc metalloproteinase atrolysin-c proteini için eşleştirilen peptit kütlelerinin tüm amino asit dizisi üzerinde gösterimi (eşleşen bölgeler büyük ve mavi olarak gösterilmiştir) Şekil numaralı protein kümesinden elde edilen triptik peptitlerin m/z değerleri arasındaki MALDI-TOF spektrumu Şekil numaralı protein kümesinden elde edilen triptik peptitlerin m/z değerleri arasındaki MALDI-TOF spektrumu Şekil Zinc metalloproteinase atroxase proteini için eşleştirilen peptit kütlelerinin tüm amino asit dizisi üzerinde gösterimi (eşleşen bölgeler büyük ve mavi olarak gösterilmiştir) Şekil Coagulation factor X-activating enzyme heavy chain proteini için eşleştirilen peptit kütlelerinin tüm amino asit dizisi üzerinde gösterimi (eşleşen bölgeler büyük ve mavi olarak gösterilmiştir) Şekil numaralı protein kümesinden elde edilen triptik peptitlerin m/z değerleri arasındaki MALDI-TOF spektrumu Şekil numaralı protein kümesinden elde edilen triptik peptitlerin m/z değerleri arasındaki MALDI-TOF spektrumu Şekil Zinc metalloproteinase/disintegrin bitisgabonin proteini için eşleştirilen peptit kütlelerinin tüm amino asit dizisi üzerinde gösterimi (eşleşen bölgeler büyük ve mavi olarak gösterilmiştir) Şekil numaralı protein kümesinden elde edilen triptik peptitlerin m/z değerleri arasındaki MALDI-TOF spektrumu Şekil Snake venom serine protease homolog proteini için eşleştirilen peptit kütlelerinin tüm amino asit dizisi üzerinde gösterimi (eşleşen bölgeler büyük ve mavi olarak gösterilmiştir) Şekil Venom serine proteinase-like protein 1 proteini için eşleştirilen peptit kütlelerinin tüm amino asit dizisi üzerinde gösterimi (eşleşen bölgeler büyük ve mavi olarak gösterilmiştir) Şekil numaralı protein kümesinden elde edilen triptik peptitlerin m/z değerleri arasındaki MALDI-TOF spektrumu x

11 Şekil numaralı protein kümesinden elde edilen triptik peptitlerin m/z değerleri arasındaki MALDI-TOF spektrumu Şekil Ancrod proteini için eşleştirilen peptit kütlelerinin tüm amino asit dizisi üzerinde gösterimi (eşleşen bölgeler büyük ve mavi olarak gösterilmiştir) Şekil numaralı protein kümesinden elde edilen triptik peptitlerin m/z değerleri arasındaki MALDI-TOF spektrumu Şekil numaralı protein kümesinden elde edilen triptik peptitlerin m/z değerleri arasındaki MALDI-TOF spektrumu Şekil Cysteine-rich secretory protein proteini için eşleştirilen peptit kütlelerinin tüm amino asit dizisi üzerinde gösterimi (eşleşen bölgeler büyük ve mavi olarak gösterilmiştir) Şekil L-amino-acid oxidase proteini için eşleştirilen peptit kütlelerinin tüm amino asit dizisi üzerinde gösterimi (eşleşen bölgeler büyük ve mavi olarak gösterilmiştir) Şekil numaralı protein kümesinden elde edilen triptik peptitlerin m/z değerleri arasındaki MALDI-TOF spektrumu Şekil numaralı protein kümesinden elde edilen triptik peptitlerin m/z değerleri arasındaki MALDI-TOF spektrumu Şekil Phospholipase A2 proteini için eşleştirilen peptit kütlelerinin tüm amino asit dizisi üzerinde gösterimi (eşleşen bölgeler büyük ve mavi olarak gösterilmiştir) Şekil numaralı protein kümesinden elde edilen triptik peptitlerin m/z değerleri arasındaki MALDI-TOF spektrumu Şekil numaralı protein kümesinden elde edilen triptik peptitlerin tekrar kuyucuğundan m/z değerleri arasında elde edilen MALDI-TOF spektrumu Şekil Phospholipase A2 homolog VP8 proteini için eşleştirilen peptit kütlelerinin tüm amino asit dizisi üzerinde gösterimi (eşleşen bölgeler büyük ve mavi olarak gösterilmiştir) Şekil numaralı protein kümesinden elde edilen triptik peptitlerin m/z değerleri arasındaki MALDI-TOF spektrumu Şekil numaralı protein kümesinden elde edilen triptik peptitlerin m/z değerleri arasındaki MALDI-TOF spektrumu Şekil numaralı protein kümesinden elde edilen triptik peptitlerin tekrar kuyucuğundan m/z değerleri arasınde elde edilen MALDI-TOF spektrumu Şekil numaralı protein kümesinden elde edilen triptik peptitlerin tekrar kuyucuğundan m/z değerleri arasında elde edilen MALDI-TOF spektrumu Şekil Ammodytin I1 C variant proteini için eşleştirilen peptit kütlelerinin tüm amino asit dizisi üzerinde gösterimi (eşleşen bölgeler büyük ve mavi olarak gösterilmiştir) xi

12 Şekil numaralı protein kümesinden elde edilen triptik peptitlerin m/z değerleri arasındaki MALDI-TOF spektrumu Şekil numaralı protein kümesinden elde edilen triptik peptitlerin m/z değerleri arasındaki MALDI-TOF spektrumu Şekil Disintegrin echistatin proteini için eşleştirilen peptit kütlelerinin tüm amino asit dizisi üzerinde gösterimi (eşleşen bölgeler büyük ve mavi olarak gösterilmiştir) Şekil Leberagin-C proteini için eşleştirilen peptit kütlelerinin tüm amino asit dizisi üzerinde gösterimi (eşleşen bölgeler büyük ve mavi olarak gösterilmiştir) Şekil numaralı protein kümesinden elde edilen triptik peptitlerin m/z değerleri arasındaki MALDI-TOF spektrumu Şekil numaralı protein kümesinden elde edilen triptik peptitlerin m/z değerleri arasındaki MALDI-TOF spektrumu Şekil Disintegrin lebein-1-alpha proteini için eşleştirilen peptit kütlelerinin tüm amino asit dizisi üzerinde gösterimi (eşleşen bölgeler büyük ve mavi olarak gösterilmiştir) Şekil numaralı protein kümesinden elde edilen triptik peptitlerin m/z değerleri arasındaki MALDI-TOF spektrumu Şekil numaralı protein kümesinden elde edilen triptik peptitlerin m/z değerleri arasındaki MALDI-TOF spektrumu Şekil Mamushigin subunit alpha proteini için eşleştirilen peptit kütlelerinin tüm amino asit dizisi üzerinde gösterimi (eşleşen bölgeler büyük ve mavi olarak gösterilmiştir) Şekil C-type lectin A14 proteini için eşleştirilen peptit kütlelerinin tüm amino asit dizisi üzerinde gösterimi (eşleşen bölgeler büyük ve mavi olarak gösterilmiştir) Şekil numaralı protein kümesinden elde edilen triptik peptitlerin m/z değerleri arasındaki MALDI-TOF spektrumu Şekil numaralı protein kümesinden elde edilen triptik peptitlerin m/z değerleri arasındaki MALDI-TOF spektrumu Şekil Venom nerve growth factor proteini için eşleştirilen peptit kütlelerinin tüm amino asit dizisi üzerinde gösterimi (eşleşen bölgeler büyük ve mavi olarak gösterilmiştir) Şekil Vascular endothelial growth factor toxin proteini için eşleştirilen peptit kütlelerinin tüm amino asit dizisi üzerinde gösterimi (eşleşen bölgeler büyük ve mavi olarak gösterilmiştir) Şekil numaralı protein kümesinden elde edilen triptik peptitlerin m/z değerleri arasındaki MALDI-TOF spektrumu xii

13 Şekil numaralı protein kümesinden elde edilen triptik peptitlerin m/z değerleri arasındaki MALDI-TOF spektrumu Şekil Truncated hyaluronidase proteini için eşleştirilen peptit kütlelerinin tüm amino asit dizisi üzerinde gösterimi (eşleşen bölgeler büyük ve mavi olarak gösterilmiştir) Şekil Trypsin inhibitor proteini için eşleştirilen peptit kütlelerinin tüm amino asit dizisi üzerinde gösterimi (eşleşen bölgeler büyük ve mavi olarak gösterilmiştir) Şekil M. l. obtusa ve M. l. lebetina zehirlerinin cm -1 dalga sayıları arasındaki FT-IR abzorbans spektrumlarının üst üste çakıştırılmış görüntüsü ( cm -1 arasındaki Amid I bandına göre normalize edilmiştir) Şekil M. l. obtusa ve M. l. lebetina zehirlerinin cm -1 dalga sayıları arasındaki ikinci türev FT-IR spektrumunun üst üste çakıştırılmış görüntüsü ( cm -1 arasındaki Amid I bandına göre normalize edilmiştir) (türev seviyesi: 2, düzleştirme noktaları: 25) Şekil M. l. obtusa ve M. l. lebetina zehirlerinin cm -1 dalga sayıları arasındaki FTIR absorbans spektrumlarının kümeleme analizine sokulmasıyla elde edilen dendrogram Şekil Macrovipera lebetina obtusa, Macrovipera lebetina lebetina ve Montivipera xanthina zehirlerinden elde edilen cm -1 dalga sayıları arasındaki FTIR absorbans spektrumlarının vektör normalizasyonu yapılarak Ward algoritmasına göre kümeleme analiziyle elde dilen dendrogram Şekil Macrovipera lebetina obtusa, Macrovipera lebetina lebetina ve Montivipera xanthina zehirlerinden elde edilen cm -1 dalga sayıları arasındaki FTIR absorbans spektrumlarının ortalamalarının vektör normalizasyonu yapılarak Ward algoritmasına göre kümeleme analiziyle elde edilen dendrogram xiii

14 ÇĐZELGELER DĐZĐNĐ Çizelge Sanz et al. (2008) ve Bazaa et al. (2005) tarafından sırasıyla M. l. obtusa ve M. l. transmediterranea zehirlerinden N-terminal Edman dizileme, MALDI-TOF MS veya nesi- CID MS/MS kütle spektrometreleri ile tanımlanmış protein aileleri Çizelge Zehir elde edilen bireylerin ZDEU demirbaş numaraları, yakalandıkları lokaliteler, tarihleri ve toplayanların adları Çizelge MALDI-TOF kütle spektrometresinin kalibrasyonunda kullanılan peptitlerin kütleleri Çizelge Bradford miktar tayini sonucunda elde edilen OD ve konsantrasyon değerleri Çizelge Jellerde PDQuest programıyla tespit edilen spot sayıları ve referans jel ile eşleşme oranları Çizelge Đstatistiksel testler sonucunda tespit edilen protein kümeleri Çizelge PDQuest programında yapılan üç istatistiksel analize göre anlamlı bulunan 15 protein kümesinin programdan alınan yoğunluk değerlerinin SPSS programına girilip tekrar t- testi ve Levene testi yapılmasıyla elde edilen p değerleri (%95 güven aralığında anlamlı çıkan p değerleri koyu olarak gösterilmiştir) Çizelge PDQuest programında yapılan üç istatistiksel analize göre anlamlı bulunan 15 protein kümesinin programdan alınan yoğunluk değerlerinin SPSS programına girilip logaritmik düzeltmenin ardından tekrar t-testi ve Levene testi yapılmasıyla elde edilen p değerleri (%95 güven aralığında anlamlı çıkan p değerleri koyu olarak gösterilmiştir) Çizelge Viperid zehirlerinden tanımlanan proteinlerin dâhil olduğu aileler ve toplam protein sayısına göre yüzdeleri Çizelge Aldente sonuçlarına göre Viperid (gerçek engerekler ve çıngıraklı yılanlar) tanımlanan proteinlerin adları, erişim numaraları, teorik ve deneysel Mw ve pi ları, skorları, dizi kapsama yüzdeleri, peptit eşleşme sayıları ve bulunduğu organizma (teorik ve deneysel pi ve/veya moleküler ağırlıkları yaklaşık olanlar kalın olarak gösterilmiştir, Mw ve pi değerleri Aldente sonuçlarından alınmıştır) Çizelge Zinc metalloproteinase leucurolysin-b proteini için eşleşen peptit kütleleri ve amino asit dizileri (Den: deneysel, Teo: teorik, Dev:, MC:, Da: Dalton, CAM: sistein karbamidometillenmesi, MSO: metionin oksidasyonu, P(ST): serin ve treonin fosforilasyonu, P(Y): tirozin fosforilasyonu) Çizelge Metalloproteinase proteini için eşleşen peptit kütleleri ve amino asit dizileri (Kısaltmaların açıklamaları için Çizelge e bakınız) xiv

15 Çizelge Zinc metalloproteinase atrolysin-c proteini için eşleşen peptit kütleleri ve amino asit dizileri (Kısaltmaların açıklamaları için Çizelge e bakınız) Çizelge Zinc metalloproteinase atroxase proteini için eşleşen peptit kütleleri ve amino asit dizileri (Kısaltmaların açıklamaları için Çizelge e bakınız) Çizelge Coagulation factor X-activating enzyme heavy chain proteini için eşleşen peptit kütleleri ve amino asit dizileri (Kısaltmaların açıklamaları için Çizelge e bakınız) Çizelge Zinc metalloproteinase/disintegrin bitisgabonin proteini için eşleşen peptit kütleleri ve amino asit dizileri (Kısaltmaların açıklamaları için Çizelge e bakınız) Çizelge Snake venom serine protease homolog proteini için eşleşen peptit kütleleri ve amino asit dizileri (Kısaltmaların açıklamaları için Çizelge e bakınız) Çizelge Venom serine proteinase-like protein 1 proteini için eşleşen peptit kütleleri ve amino asit dizileri (Kısaltmaların açıklamaları için Çizelge e bakınız) Çizelge Ancrod proteini için eşleşen peptit kütleleri ve amino asit dizileri (Kısaltmaların açıklamaları için Çizelge e bakınız) Çizelge Cysteine-rich secretory protein proteini için eşleşen peptit kütleleri ve amino asit dizileri (Kısaltmaların açıklamaları için Çizelge e bakınız) Çizelge L-amino-acid oxidase proteini için eşleşen peptit kütleleri ve amino asit dizileri (Kısaltmaların açıklamaları için Çizelge e bakınız) Çizelge Phospholipase A2 proteini için eşleşen peptit kütleleri ve amino asit dizileri (Kısaltmaların açıklamaları için Çizelge e bakınız) Çizelge Phospholipase A2 homolog VP8 proteini için eşleşen peptit kütleleri ve amino asit dizileri (Kısaltmaların açıklamaları için Çizelge e bakınız) Çizelge Ammodytin I1 C variant proteini için eşleşen peptit kütleleri ve amino asit dizileri (Kısaltmaların açıklamaları için Çizelge e bakınız) Çizelge Disintegrin echistatin proteini için eşleşen peptit kütleleri ve amino asit dizileri (Kısaltmaların açıklamaları için Çizelge e bakınız) Çizelge Leberagin-C proteini için eşleşen peptit kütleleri ve amino asit dizileri (Kısaltmaların açıklamaları için Çizelge e bakınız) Çizelge Disintegrin lebein-1-alpha proteini için eşleşen peptit kütleleri ve amino asit dizileri (Kısaltmaların açıklamaları için Çizelge e bakınız) Çizelge Mamushigin subunit alpha proteini için eşleşen peptit kütleleri ve amino asit dizileri (Kısaltmaların açıklamaları için Çizelge e bakınız) Çizelge C-type lectin A14 proteini için eşleşen peptit kütleleri ve amino asit dizileri (Kısaltmaların açıklamaları için Çizelge e bakınız) xv

16 Çizelge Venom nerve growth factor proteini için eşleşen peptit kütleleri ve amino asit dizileri (Kısaltmaların açıklamaları için Çizelge e bakınız) Çizelge Vascular endothelial growth factor toxin proteini için eşleşen peptit kütleleri ve amino asit dizileri (Kısaltmaların açıklamaları için Çizelge e bakınız) Çizelge Truncated hyaluronidase proteini için eşleşen peptit kütleleri ve amino asit dizileri (Kısaltmaların açıklamaları için Çizelge e bakınız) Çizelge Trypsin inhibitor proteini için eşleşen peptit kütleleri ve amino asit dizileri (Kısaltmaların açıklamaları için Çizelge e bakınız) Çizelge M. l. obtusa ve M. l. lebetina zehirlerinde bulunan piklerin altında kalan alan değerleri Çizelge Viperid zehirlerinden elde edilip biyoteknolojk ürüne dönüştürülen bazı proteinler xvi

17 SĐMGELER ve KISALTMALAR DĐZĐNĐ 1D SDS-PAGE Bir boyutlu sodyum dodesil sülfat-poliakrilamit jel elektroforezi 2D-PAGE Đki boyutlu poliakrilamit jel elektroforezi µg. Mikrogram µl. Mikrolitre ADAM Disintegrin/metalloproteaz protein ailesi ADP Adenozin di fosfat ADPaz Adenozin di fosfataz ACE Anjiyotensin dönüştürücü enzim AChR Asetilkolin reseptörü ACTH Adrenokortikotropik hormon ALF Alfimepraz ATP Adenozin tri fofat ATPaz Adenozin tri fosfataz ATR Attenuated total reflectance BSA Sığır serum albümini C Santigrat derece CHAPS 3-(3-Cholanidopropyl)Dimethylammonio-1-Propanesulfonate CHCA alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid CLP C-tipi lektin cdna Komplementer DNA cm. Santimetre CRISP Sisteince zengin salgı proteini Da Dalton dk. Dakika DNA Deoksiribo nükleik asit DPT Devlet Planlama Teşkilatı DTT Dithiothreitol ESI-CID MS/MS Elektron spreyi iyonlaştırıcı ile peptit fragmentasyonu yapan tandem kütle spektrometresi FDA Amerikan Gıda ve Đlaç Dairesi FT-IR Fourier Dönüşümsel Kızılötesi Spektroskopisi GP Glikoprotein xvii

18 IPG Đmmobilize ph gradiyent kg. kilogram kda Kilodalton kv Kilovolt K. K. T. C. Kuzey Kıbrıs Türk Cumhuriyeti LAO L-amino asit oksidaz LD 50 MALDI-TOF MS MG m/z mg. ml. M mm mm. MS Mw ng. NGF nm. OD p PCR pi Bir grubun en az %50 sini öldüren doz Matriks eşliğinde lazer iyonlaştırıcılı ve uçuş zamanıyla ölçüm yapan kütle spektrometresi Myasthenia gravis (miyasteni hastalığı) Kütle/yük Miligram Mililitre Molar Milimolar Milimetre Kütle spektrometresi Moleküler ağırlık Nanogram Sinir büyüme faktörü Nanometre Optik yoğunluk Đstatistiksel anlamlılık değeri Polimeraz zincir reaksiyonu Đzoelektrik nokta PLA 2 Fosfolipaz A 2 PLGS ProteinLynx Global Server PLS Kısmi en küçük kareler PMF Peptit kütle parmak izi pmol Pikamol RP-HPLC Ters-faz yüksek basınçlı/performans sıvı kromatografisi sa. Saat SDS Sodyum dodesil sülfat SDS-PAGE Sodyum dodesil sülfat-poliakrilamit jel elektroforezi xviii

19 SSP SVMP UV V VEGF VLAIP VLFVA VLFXA vwf ZDEU Sample spot protein Yılan zehri metalloproteazları Ultraviyole Volt Vasküler endotelyal büyüme faktörü Vipera lebetina apoptoz uyarıcı proteini Vipera lebetina Faktör V etkinleştiricisi Vipera lebetina Faktör X etkinleştiricisi von Willebrand faktör Zoology Department Ege University xix

20 1. GĐRĐŞ Hayvansal zehirler eski tarihlerden beri doğa bilimcilerin ve araştırmacıların ilgisini çekmiştir. Daha önceleri zehirli olma, hayvanlar âleminde bir istisna olarak kabul edilirken, günümüzde farklı hayvan gruplarından çok sayıda hayvansal zehir tanımlanması bu durumun düşünülenden daha yaygın olduğunu göstermiştir. (Şekil 1. 1). Şekil Bazı zehirli hayvan grupları (Lewis and Garcia 2003) Moleküler biyoloji yöntemlerindeki gelişmelere paralel olarak, yılan zehirleriyle yapılan çalışmaların ön plana çıktığı genel toksinoloji alanındaki çalışmalar da son yıllarda hız kazanmıştır. Günümüzde kullanılan ileri moleküler biyoloji sistemlerinin çok düşük miktardaki örneklerden dahi birçok analizi yapmaya imkân sağlaması, özellikle az miktarda zehir elde edilebilen Colubroidea üst ailesine dâhil bazı zehirli yılanların zehirlerinin de son yıllarda incelenebilmesini sağlamıştır (Fry vd 2003a). 1

21 Günümüzde yılan zehirleri üzerinde yapılan çalışmalar temelde dört nedenden dolayı önem kazanmaktadır: (1) Đlaç geliştirme alanındaki kullanım potansiyeli (Calvete vd 2007b, Escoubas and King 2009, Vetter vd 2010), (2) yılan ısırığı kaynaklı zehirlenme patogenezinin daha iyi anlaşılması ve daha etkin tedavi yöntemlerinin geliştirilmesi (Chippaux 2006, Calvete 2009a, Gibbs vd 2009, Boldrini-França vd 2010), (3) bölgesel zehir farklılıklarının belirlenerek daha etkili anti-serumların üretilmesi (Fry vd 2003b, Gutiérrez vd 2009, Stümpel and Joger 2009, Calvete vd 2009b), (4) sistematik alanındaki kullanım potansiyeli (Sanz vd 2008). Başlıklara bakıldığında bu alanda bölgesel olarak yapılan çalışmaların çok önemli olduğu görülmektedir. Bu nedenle de türlerin farklı coğrafik bölgelerdeki populasyonlarının zehirlerinin incelenip farklılıkların belirlendiği çalışmaların sayısı son yıllarda artmıştır (Calvete 2007a, Boldrini-França vd 2010). Günümüz omiks çağında zehir araştırmalarına olan yoğun ilgi, venomiks ( venomics ) terimiyle adlandırılan yeni bir alanın doğmasıyla sonuçlanmıştır (Menéz vd 2006, Calvete vd 2009b). Venomiks terimi, elde edilen zehrin bütün moleküler çeşitliliğinin ileri moleküler biyoloji yöntemleriyle analizini, önemli toksinleri kodlayan genlerin belirlenmesini, özellikle de protein içeriklerinin tespitini ve potansiyel biyolojik kullanımlarının araştırılmasını kapsamaktadır (Menéz vd 2006). Konuyla ilişkili olarak, ileri moleküler biyoloji tekniklerinin anti-serum üretimini en verimli hale getirilmesi için kullanılmasıyla ilgili çalışmalar da son yıllarda antivenomiks ( antivenomics ) terimiyle adlandırılmaktadır (Calvete vd 2009b). Özellikle peptitlerin ilaç etken maddeleri olarak kullanılmasıyla ilgili araştırmalar zehir çalışmalarını hızlandırmıştır ve günümüze kadar çeşitli hayvanların zehirlerinden Amerikan Gıda ve Đlaç Dairesi (FDA) onaylı ilaçlar ve patentli tanı ürünleri elde edilmiştir. Bazı patentli proteinlerin ise ilaç adayı olarak faz aşamaları devam etmektedir (Vetter vd 2010). Tüm bu çalışmaların farklı ülkelerde kendi sınırlarında yayılış gösteren türler üzerinden yapılması ve ayrıca zehirlerdeki tür içi coğrafik farklılıkların belirlenmesi çok önemlidir. Bu şekilde yapılan çalışmalar, o bölgede yapılacak anti-serum üretimi çalışmalarını ve ısırılma vakalarının yönetimini en iyi seviyeye getirecektir (Núñez vd 2009, Boldrini-França vd 2010). Ayrıca zehirlerdeki türler arası ve tür içi farklılıkları belirlemek zehir proteinlerinin 2

22 moleküler evriminin anlaşılmasına katkı sağlayarak peptit tabanlı ilaç araştırmalarını hızlandıracaktır Amaç Bu çalışmada, Koca Engerek, Macrovipera lebetina (Linnaeus, 1758) türünün Güneydoğu Anadolu da dağılış gösteren Macrovipera lebetina obtusa (Dwigubsky, 1832) ve Kıbrıs ta dağılış gösteren Macrovipera lebetina lebetina (Linnaeus, 1758) alt türlerinin zehirleri arasındaki farklılıkların proteomik ve spektroskopik yöntemlerle saptanması amaçlanmıştır. Bu kapsamda yapılan proteomik çalışmalarda zehir örneklerinin iki boyutlu poliakrilamit jel elektroforezi (2D-PAGE) ile protein profillerinin elde edilmesinin ardından, matriks eşliğinde lazer iyonlaştırıcılı ve uçuş zamanıyla ölçüm yapan (MALDI-TOF) kütle spektrometresi ile protein kümelerinin peptit kütle parmak izi yöntemiyle (PMF) tanımlanması ve genel protein profiline dair tanımlanabilen proteinlere ait peptit kütüphanesi oluşturulması amaçlanmıştır. Spektroskopik çalışmalar kapsamında ise; zehir örneklerinin Fourier Dönüşümsel Kızılötesi (FT-IR) spektroskopisi tekniği ile incelenerek literatürde ilk kez zehirlerin sadece protein içeriklerinin değil tüm moleküler içeriğinin karşılaştırılması ve elde edilen spektrumlardan yapılacak kümeleme analizi ile zehirlerin türlere/alt türlere göre sınıflandırılması amaçlanmıştır. Koca Engerek, Türkiye ve Kuzey Kıbrıs Türk Cumhuriyeti (K. K. T. C.) nin en büyük engerek türüdür ve vaka üretmesi nedeniyle sağlık açısından da önemlidir (Göçmen vd 2006a, Budak ve Göçmen 2008). Đki alt türün zehirlerindeki coğrafik farklılıkların belirlenmesi ve alt türe özgü biyo-belirteçlerin bulunması hem sistematik olarak, hem zehirlenmelerin olası patogenez farklılıklarıyla ilgili önemli bilgiler sunabilecek olması açısından, hem de daha etkin anti-serumların üretilmesi için önemlidir. Ayrıca, M. lebetina türünün zehri 2D-PAGE ile ilk defa çalışılarak ve bir yılan zehrinin tüm içeriği FT-IR spektroskopisi tekniği ile ilk kez incelenip kümeleme analizine tâbi tutularak literatüre bu anlamda katkıda bulunulması da amaçlanmıştır. 3

23 2. KAYNAK ÖZETLERĐ Yılan Zehrinin Genel Özellikleri Yılanlarda zehir, özelleşmiş zehir bezlerinde üretilir. Zehir bezlerinin, tükürük bezlerinin farklılaşmasıyla oluştuğu kabul edilir. Türlere göre değişken şekilde sarımsı, beyazımsı veya renksiz bir salgı sıvısı olup belli bir viskoziteye sahiptir (Budak ve Göçmen 2008). Açık havada oda sıcaklığında yapısı bozulur, fakat kurutulduğunda (liyofilizasyon) uzun süre saklanabilir. Zehrin içeriği türe/alt türe (Mackessy 2002, Arıkan vd 2003, Arıkan vd 2005, Calvete vd 2007a), yaşa (Arıkan vd 2006), cinsiyete (Furtado vd 2006, Menezes vd 2006), beslenme koşullarına/tercihine (Daltry vd 1996, Li vd 2005) ve diğer ekolojik koşullara (Daltry vd 1997) bağlı olarak bazı farklılıklar gösterebilir. Yılan zehirlerinin, temel olarak peptit/protein yapısında olmak üzere çok zengin bir içeriği vardır. Zehrin yapısında kabaca, zehirli etki gösteren toksinler (ör: nörotoksinler, kardiyotoksinler), zehirli etki göstermeyen proteinler (ör: kobra zehir faktörü, sinir büyüme faktörü) ve enzim inhibitörleri [ör: anjiyotensin dönüştürücü enzim (ACE) inhibitörü], enzimler, biyojenik aminler ve iyonlar bulunur (Şekil 2. 1) (Edstrom 1992, Tu 1996, Ramos and Selistre-de-Araujo 2006). Yılan zehri özellikle enzimler bakımından çok zengindir. Asetilkolinesteraz, amino asit transferazlar, adenozin di fosfataz (ADPaz) ve adenozin tri fosfatazlar (ATPaz), katalazlar, hiyaluronidazlar, fosfolipazlar [özellikle fosfolipaz A 2 (PLA 2 )], fosfoesterazlar, proteazlar (ör: serinproteaz, metalloproteaz), ve L-amino asit oksidaz (LAO) yılan zehirlerinde bulunan enzimlerden bazılarıdır (Edstrom 1992, Tu 1996, Mackessy 2002, Ramos and Selistre-de- Araujo 2006). Zehir bileşenlerinin, özellikle enzimler gibi bir kısmı besinin sindirilmesine katkı sağlarken, bir kısmı da (toksik etkili proteinler/toksinler) zehirli etkinin gösterilmesinden sorumludur. Toksik zehir proteinleri avı hareketsiz hale getirmek, paralize etmek, sindirmek ve avcılara karşı savunma sağlamak gibi çeşitli adaptif roller üstlenirler (Bazaa vd 2005). 4

24 Şekil Yılan zehirlerinin içeriğinde bulunan başlıca maddeler (Edstrom 1992, Tu 1996, Mackessy 2002, Ramos and Selistre-de-Araujo 2006) Zehrin etki mekanizması çok genel olarak iki şekildedir: Hemolitik ve/veya nörotoksik. Hemolitik etki gösteren zehirler kanama yapıcı ve dokuları parçalayıcı özelliktedir (özellikle engerekler ve çıngıraklı yılanlar). Nörotoksik zehirler ise sinir sistemi üzerinde etkilidir (özellikle kobralar, mercan yılanları, deniz yılanları ve bazı Colubrid ler) (Budak ve Göçmen 2008). Ancak zehirler hakkında daha fazla bilgi edindikçe, bu şekildeki genel bir ayrımın her zaman geçerli olmadığı görülmektedir. Günümüzde bazı türlerin zehrinin iki etkiyi birden gösterebildiği bilinmektedir (Budak ve Göçmen 2008). Bu nedenle yılan zehrinin etki mekanizmasını tarif ederken baskın olarak nörotoksik veya baskın olarak hemolitik denilmesi daha uygun olabilir. 5

25 Viperid 1 zehirlerinin özellikleri Viperidae ailesindeki (gerçek engerekler, Viperinae alt ailesi ve çıngıraklı yılanlar, Crotalinae alt ailesi) türlerin zehirleri koagülasyon kaskadıyla, normal hemostatik sistemle ve doku onarımıyla etkileşen proteinlere sahiptir ve bu türlerden kaynaklanan insan zehirlenmeleri genellikle pıhtılaşma bozuklukları, hipofibrinojenemi ve bölgesel doku nekrozu ile karakterize olurlar (Sanz vd 2008 e göre Fox and Serrano 2005). Bu aileye ait yılanların zehirleri kanda koagülasyon kaskadında etkili olan birçok proteaz içerir. Bu zehirlerin bileşenlerinin hem koagülan hem de anti-koagülan etki gösterebildikleri bilinmektedir (Siigur vd 2001a, Siigur vd 2001b). Kan koagülasyon faktörlerindeki bazı bağları kıran bu yüksek özgünlükteki proteazlar genellikle iki grupta ele alınır: (1) Serin proteazlar (faktör V etkinleştiricisi, protein C etkinleştiricisi, plazminojen etkinleştiricisi, kinin-salıcı ve trombin-benzeri enzimler, L- fibrinojenazlar); (2) Hidrolitik aktiviteleri için Ca 2+ veya Zn 2+ (veya her ikisine) ihtiyaç duyan metalloproteazlar (faktor X etkinleştiricisi, protrombin etkinleştiricisi, K (L)-fibrinojenazlar). Morita (1998) ya göre bazı yılan zehirleri ayrıca serin proteaz özellikte olan faktör X etkinleştiricileri ve protrombin etkinleştiricileri de içermektedirler (Siigur vd 2001b). Viperid zehirlerinin çok fazla protein bileşeni olmasına rağmen (Serrano vd 2005), bu türlerin zehirlerinden tanımlanmış proteinler birkaç ana protein ailesine aittir: Enzimler (serin proteazlar, Zn 2+ -metalloproteazlar, L-amino asit oksidaz, grup II PLA 2 ), enzimatik aktivite göstermeyen proteinler [disintegrinler, C-tipi lektinler (CLP), natriüretik peptitler, myotoksinler, sisteince zengin salgı proteini (CRISP) toksinleri, sinir ve vasküler endotel büyüme faktörleri, sistatin ve Kunitz-tipi proteaz inhibitörleri] (Sanz vd 2008). Bununla beraber, toksinlerin miktarı ve içerik bakımından bazı farklılıklar da görülebilir (Calvete vd 2007b). 1 Tez boyunca Viperid ler olarak belirtilen grup (Viperidae) hem gerçek engerekleri (Viperinae) hem de çıngıraklı yılanları (Crotalinae) kapsamaktadır. 6

26 Zn 2+ -metalloproteazlar vasküler subendotelin ekstraselüler matriks proteinlerini degrade eder ve bunun birincil sonucu olarak bölgesel kanamaya neden olurlar (Bazaa vd 2005, Sanz vd 2008). Yılan zehri metalloproteazları (SVMP) Viperinae ve Crotalinae alt ailelerinde oldukça yaygındır ve toplam zehir proteininin %20-40 ını oluşturmaktadır (Bazaa vd 2005 e göre, Junqueira-de-Azavedo and Ho 2002, Juárez vd 2004, Francischetti vd 2004) Macrovipera lebetina Zehri ile Yapılan Çalışmalar Sanz vd (2008) ve Bazaa vd (2005) tarafından sırasıyla Ermenistan (M. l. obtusa) ve Tunus (yayılışı göz önünde bulundurulduğunda, M. l. transmediterranea) tan yakalanan Macrovipera lebetina örneklerinin zehri ile ilgili bazı proteomik çalışmalar yapılmıştır. Sanz vd (2008) nin yaptığı çalışmada M. l. obtusa zehrinden tanımlanan proteinler 9 aileye ait olarak bulunmuştur. Bu çalışmalarda M. lebetina zehrinden tanımlanan proteinlerin listesi Çizelge 2. 1 de verilmiştir. Sanz vd (2008) tarafından yapılan bu çalışma sonucunda M. l. obtusa ve Montivipera raddei zehirlerinin hemostatik sistemi etkileyen şu proteinleri içerdiği bulunmuştır: Kan pıhtılaşmasını/platelet agregasyonunu önleyen disintegrin, CLP-benzeri proteinler ve LAO, Vasküler subendotelin ekstraselüler matriksini parçalayan Zn 2+ -metalloproteazlar, Fibrinojeni degrade eden serin fibrinojenazlar, Hipotansiyonu tetikleyen natriüretik peptitler ve Hemolitik ve myotoksik etkiler gösteren PLA 2. RP-HPLC sonuçlarına göre M. lebetina zehrinin %67 sini Zn 2+ -metalloproteazlar oluşturmaktadır (Bazaa vd 2005). M. l. obtusa ve Montivipera raddei zehir proteinlerinde görülen çeşitlilik türlerin kayalık-dağlık ekosistemlere adaptasyonuyla ilişkili olabileceği düşünülmektedir (Sanz vd 2008). 7

27 Çizelge Sanz vd (2008) ve Bazaa vd (2005) tarafından sırasıyla M. l. obtusa ve M. l. transmediterranea zehirlerinden N-terminal Edman dizileme, MALDI-TOF MS veya nesi- CID MS/MS kütle spektrometreleri ile tanımlanmış protein aileleri Protein M. l. obtusa (Sanz vd 2008) M. l. transmediterranea (Bazaa vd 2005) Bradikinin-etkinleştirici peptit X C-natriüretik peptit A X Natriüretik peptit X L-amino asit oksidaz X Disintegrin fragmenti X Kısa disintegrin, obtustatin X Kısa disintegrin X Dimerik disintegrin VLO4 X Dimerik disintegrin VLO5 X Dimerik disintegrin Le3 X Dimerik disintegrin X Sisteince zengin disintegrin X Disintegrin-benzeri protein X PLA 2 X X CRISP X PI-Metalloproteaz X PIII-Metalloproteinaz X Dimerik PIII-metalloproteaz X PIV-Metalloproteinaz X Zn2+ -metalloproteinaz X Serin proteinaz-2 X Faktör V aktifleştirici serin proteinaz X Trombin-benzeri serin proteinaz X Serin proteinaz X Serin α-fibrinojenaz X Tetramerik (αβ)4 C-tipi lektin benzeri protein X Dimerik (αβ)4 C-tipi lektin benzeri protein C-tipi lektin α-zinciri C-tipi lektin β-zinciri C-tipi lektin benzeri protein VLAIP-A VLFXA ağır zincir VLFXA hafif zincir-1 VLFXA hafif zincir-2 svvegf X X X X X X X X X 8

28 Siigur vd (2001a) tarafından M. lebetina zehrindeki koagülasyon ve fibrinoliz üzerinde etkili olan proteazlar ile ilgili yapılan çalışmalarda aynı zehirde hem koagülan hem de antikoagülan etkili proteinlerin bulunabileceği gösterilmiştir. Çalışma sonucunda zehirde; (1) fibrinojeni degrade edip fibrini etmeyen proteazların; (2) fibrinolitik bir enzim olan lebetaz ın; (3) faktör X etkinleştiricisinin (VLFXA) ve (4) faktör V etkinleştiricisinin (VLFVA) bulunduğu görülmüştür. Bunlardan lebetaz ve VLFXA metalloproteinaz, çalışılan diğer enzimler ise serin proteaz sınıfına aittirler. Şimdiye kadar M. lebetina zehrinden farklı biyokimyasal ve farmakolojik özelliklere sahip çeşitli proteinler tanımlanmış ve farklı etkileri gösterilmiştir. Bunlardan bazıları aşağıdaki gibidir: Bir metalloproteaz olan, fibrin ve fibrinojeni hidrolize ederek parçalayan lebetase (Siigur and Siigur 1991), Đnsanda endotel hücre apoptozunu uyaran diğer bir metalloproteaz (VLAIP) (Trummal vd 2005), LAO (Tõnismaägi vd 2006), Anti-platelet özellikte bir CLP olan lebecetin (Sarray vd 2001, Sarray vd 2003) ve yine anti-platelet özellikte olan polipeptitler (Barbouche vd 1996), Heterodimerik bir disintegrin olan Lebein (Gasmi vd 2001), Tanımlanan ilk α 1 β 1 integrini antagonisti olan ve özgül olarak α 1 β 1 integrininin kolajen tip IV ve I ile etkileşimini in vitro olarak baskılayan ve ayrıca in vivo olarak da anjiyogenezi bloke eden kısa RTS-disintegrin, obtustatin (Marcinkiewics vd 2003), Sisteince zengin bir disintegrin-benzeri protein olan ve alfavbeta-3 integrin tarafından aracılık edilen hücre adezyonunu inhibe eden leberagin-c (Limam vd 2010), Farklı özelliklerdeki disintegrinler (Eble vd 2003, Sanz vd 2006), VLFXA (Siigur vd 2001b), VLFVA (Siigur vd 1998a, Siigur vd 2001a), Farklı özelliklerdeki PLA 2 ler (Lynch 2007, Vija vd 2009), Sinir büyüme faktörü (NGF) (Paalme vd 2009), Kapiller geçirgenliği arttıran bir protein (Gasmi vd 2002). 9

29 Bu proteinlerin saflaştırılmalarına ve tanımlanmalarına paralel olarak zehir proteinleriyle ilgili farklı devam çalışmaları da yapılmıştır (Siigur vd 1996, Siigur vd 1998b, Siigur vd 2001c, Trummal vd 2000, Sarray vd 2004). Ayrıca M. l. transmediterranea zehrindeki disintegrin genleri için cdna kütüphaneleri oluşturularak moleküler klonlamaları gerçekleştirilmiştir (Sanz vd 2006, Bazaa vd 2007). Aynı şekilde M. lebetina zehrinden elde edilen ve koagülan bir protein olan VLFVA enzimi için de cdna, moleküler klonlama ve dizileme analizleri gerçekleştirilmiştir (Siigur vd 1999). Farklı bir çalışmada da M. lebetina zehir bezi cdna kütüphanesinden dört serin proteaz homoloğu klonu saflaştırılmıştır ve ilgili dizilerin farklılıkları ve bunların olası nedenleri üzerinde durulmuştur (Siigur vd 2001c). M. lebetina nın zehir miktarı diğer gerçek engereklere (Viperinae) göre nispeten fazladır. Bir birey için maksimum 105 mg. olabilir ve ortalama olarak da 47 mg. dir (Đran da yayılış gösteren populasyonlarda). M. lebetina zehrinin insanlar, atlar, sığırlar ve develer üzerinde öldürücü etkisi olduğu bilinmektedir. Intravenöz fare öldürücü doz 50 (LD 50 ) değerleri 0.64 mg/kg (Hassan and El-Hawary 1975) dan 7.7 mg/kg (Latifi vd 1973) a kadar değişmektedir. Latifi (1984) ye göre intravenöz fare LD 50 değerleri 1 mg/kg nin altındadır. M. lebetina zehrinin oldukça yüksek bir LAO aktivitesi vardır (Latifi 1991) Yılan Zehirleriyle Đlgili FT-IR Spektroskopisi Çalışmaları FT-IR spektroskopisi yöntemiyle, incelenen örnekte bulunan maddelerin atomik bağlarının kızılötesi ışığa maruz kaldığında oluşturdukları özgün titreşimler tespit edilerek örneğin bir bakıma moleküler parmak izi çıkarılabilmektedir (Toyran 2008). Yılan zehrinden saflaştırılan bazı proteinlerin çeşitli etkilerini biyofiziksel olarak incelemek ve yapısal özelliklerini belirlemek amacıyla yapılan çalışmaların bazılarında diğer yöntemlerle beraber FT-IR spektroskopisi tekniği de kullanılmıştır (Aird vd 1989, Lamthanh 10

30 vd 1993, Lin vd 2000, Cecchini vd 2004, Mohammadpourdounighi vd 2010) ancak yılan zehrini bütün olarak inceleyen bir FT-IR çalışması ve elde edilen spektrumlardan yapılan bir kümeleme analizi literatürde mevcut değildir Türkiye deki Çalışmalar Türkiye de yılan zehirleriyle ilgili yapılmış ileri moleküler seviyede bir çalışma bulunmamakla beraber, zehir örneklerinin elektroforetik karşılaştırmalarını içeren sistematik ve ekolojik amaçlı bazı önemli çalışmalar yapılmıştır (Arıkan vd 2003, Arıkan vd 2005, Arıkan vd 2006, Göçmen vd 2006b, Arıkan vd 2008). Türkiye de yayılış gösteren engerek türlerinin zehirleriyle ilgili yapılan literatürde ilk denebilecek çalışmada Montivipera xanthina, M. wagneri, Vipera ammodytes, V. kaznakovi ve Macrovipera lebetina (M. l. obtusa) türlerinden elde edilen zehir ekstraktları poliakrilamit disk elektroforez yöntemiyle incelenmiştir (Arıkan vd 2003). Bu çalışmanın ardından, Arıkan vd (2005) tarafından önceki türlere ek olarak, engereklerden V. eriwanensis, V. barani, Macrovipera lebetina lebetina ve Colubrid olarak da Malpolon monspessulanus dâhil edilerek başka bir çalışma yapılmıştır. Arıkan vd (2008) tarafından önceki türlere Türkiye deki tek Elapid olan Walterinnesia morgani de eklenerek benzer bir çalışma daha yapılmıştır. Göçmen vd (2006), Kıbrıs ve Güneydoğu Anadolu da yaşayan Koca Engerek örneklerini karşılaştırmalı olarak inceledikleri çalışmada morfolojik ve hemipenis karşılaştırmalarına ek olarak Güneydoğu Anadolu ve Kıbrıs tan birer örneğin zehirlerinin protein elektroforezi sonuçlarını da karşılaştırmışlardır. Bu çalışmalara ek olarak, Arıkan vd (2006) tarafından Montivipera xanthina nın zehir proteinlerinin yaşa bağlı değişimleri hakkında da elektroforetik bir çalışma yapılmıştır. Zehir proteinleriyle ilgili elektroforetik çalışmaların haricinde, Montivipera xanthina zehrinin farklı dokularındaki histopatolojik etkilerini inceleyen fare çalışmaları da yapılmıştır (Topyıldız vd 2010). 11

31 2. 5. Macrovipera lebetina (Linnaeus, 1758) Sistematik Koca Engerek, Macrovipera lebetina ilk olarak 1758 de Linnaeus tarafından lokalitesi bilinmeyen bir örnekten tanımlanmıştır. Tip lokalitesi daha sonra Mertens ve Müller (1928) tarafından Kıbrıs olarak belirlenmiştir (Mallow vd 2003). Anadolu daki örnekler ilk defa Werner (1903) tarafından Vipera lebetina mauritanica ve daha sonra Bird (1936) tarafından Vipera lebetina xanthina olarak tanımlanmıştır. Daha sonra Mertens (1952) bunları obtusa alt türüne dâhil etmiştir ve bu durum diğer yazarlar tarafından da kabul edilmiştir (Göçmen vd 2006b). M. lebetina nın taksonomik konumuyla ilgili yazarlar arasında tartışma vardır. Aynı şekilde tür ve alt tür ayrımları da çok tartışmalı olmuştur. M. lebetina nın Linnaeus tarafından yapılan ilk tür tanımının ardından, tartışmalar olsa da günümüzde hala geçerli olan bazı alt türler tanımlanmıştır: M. l. lebetina, M. l. obtusa, M. l. transmediterranea, M. l. turanica ve M. l. chernovi (M. schweizeri gibi bazı türler de önce alt tür olarak tanımlanıp daha sonra tür kategorisine çıkarılmışlardır). Tanımlanan bazı alt türler de günümüzde geçerlilikleri hala tartışmalıdır (M. l. euphratica ve M. l. peilei gibi) (Nilson and Andrén 1988a, Mallow vd 2003, Göçmen vd 2006b). Yapılan çalışmalar ışığında, Macrovipera lebetina (Linnaeus, 1758), Türkiye de M. l. obtusa (Dwigubsky, 1832) ve Kıbrıs ta M. l. lebetina (Linnaeus, 1758) alt türleri ile dağılış göstermektedir. M. lebetina alt türü Kıbrıs a endemik gibi görünmektedir ve nominat alt türdür (Göçmen vd 2006, Göçmen vs 2007a, Göçmen ve Budak 2008). Doğuda, güneydoğuda ve Anamur civarında farklı populasyonlar keşfedilmiştir (Böhme 1987). Bazı araştırmacılar bunların alt tür olabileceğini düşünmektedir. 12

32 Morfoloji Boyu genellikle 1 metrenin üzerinde olup 1,8 metreye kadar erişebilen Koca Engerek, bu özelliğiyle Türkiye ve Kıbrıs ın en büyük engerek türüdür ve vaka üretmesi nedeniyle sağlık açısından da önemlidir. Sırt tarafı kahverengidir ve üzerinde, bazen belirsiz, iri koyu lekeler vardır (Şekil 2. 2). Karın tarafı pembemsi-beyazdır ve üzerinde dağınık siyah lekeler bulunur. Başın üst tarafında sadece karinalı küçük pullar bulunur, supraocular plak küçük parçalara ayrılmış durumdadır, büyük bir plak yoktur. Kuyruk oldukça kısa olup, uca doğru aniden sivrileşir (Budak ve Göçmen 2008). Şekil M. lebetina obtusa (Fotoğraf: Bayram GÖÇMEN) Ekoloji ve dağılış Ovalık yerlerde, ormansız ve taşlık dağ yamaçlarında, tarla ve bazen de bahçelerde rastlanabilir. Vertikal dağılışı 1500 m. yüksekliğe kadar çıkabilir (Budak ve Göçmen 2008). Türün Batı ve Orta Asya dan Kuzey Afrika ya kadar farklı alt türlerle geniş bir yayılışı vardır. 13

33 Ülkemizde Anamur dan itibaren doğuya doğru, Doğu, Güneydoğu ve Kuzeydoğu Anadolu da ve K. K. T. C. de bulunmaktadır (Böhme 1987, Göçmen vd 2006b, Budak ve Göçmen 2008). Hareketleri çok yavaştır ve rahatsız edilmedikçe saldırgan değildir. Zehri insan için öldürücü olabilir. Diğer Viperid ler gibi yavrularını canlı halde doğurur (ovovivipari). Bazı bölgelerde (örneğin Kıbrıs ta) ovipar olduğu bilinir (Göçmen ve Budak 2008) Populasyonlar Arasındaki Zehir Farklılıklarının Belirlenmesinin Önemi Zehir içerikleri coğrafik olarak farklılık gösterebildiğinden yapılan çalışmaların bölgesel olarak gerçekleştirilmesi çok önemlidir. Bu nedenle türler arası karşılaştırmaların yanı sıra aynı türün farklı coğrafik populasyonlarının zehirleri arasındaki farklılıklara da önem verilmektedir ve son yıllarda bu konuyla ilgili çalışmalar yoğunlaşmıştır (Creer vd 2003, Calvete vd 2007a, Boldrini-França 2010). Bu çalışmaların başlıca amaçları üç madde olarak belirtilebilir: Isırılmanın patogenezini daha iyi anlamak ve daha etkin tedaviler geliştirmek (Calvete 2009a, Gibbs vd 2009, Boldrini-França vd 2010), Daha etkili anti-serum üretimi yapmak (Fry vd 2003, Chippaux 2006, Calvete 2009, Gibbs vd 2009, Gutierrez vd 2009), Türlerin sınıflandırılmasında faydalı olabilecek belirteçler bulmak (Sanz vd 2008). Bu kapsamda yapılan çalışmalarda 2D-PAGE ve kütle spektrometreleri kullanılan yöntemlerin başında gelmektedirler Yılan Zehrinin Sistematikte Kullanım Potansiyeli Sistematikte geleneksel olarak kullanılan morfolojik karakterlerin büyük kısmı günümüzde de geçerliliğini korumaktadır. Ancak farklı yöntem ve materyaller kullanılarak gerçekleştirilen 14

34 moleküler sistematik çalışmaları da gelişmiş ve son yıllarda sistematik çalışmalarda kullanılan başlıca yöntemler haline gelmişlerdir. Bu amaçla yapılan moleküler filogeni çalışmalarında kullanılan başlıca karakterler genomik veya mitokondriyal DNA dizileridir (Lenk vd 2001, Vidal and Hedges 2005, Wiens vd 2008). Yılan zehirlerinin sistematikte destekleyici olarak kullanımıyla ilgili yapılan çalışmalar da moleküler sistematiğin kapsamında ele alınabilir. Bu konuda daha önce de belli bir tür için elde edilen antikorların türler arasında verdiği çapraz-reaksiyonlara göre yakınlık çalışmaları yapılmıştır (Chippaux vd 1991) ve bir boyutlu poliakrimalit jel elektroforezinden (1D-PAGE) faydalanılmıştır (Arıkan vd 2003, Arıkan vd 2005, Göçmen vd 2006b, Arıkan vd 2008). Son yıllarda ise ileri moleküler analiz yöntemlerinin gelişmesiyle bu çalışmalar hız kazanmıştır. Özellikle 2D-PAGE ve kütle spektrometreleri bu amaç için sıklıkla kullanılmaktadır ve türe veya alt türe özgü belirteçler saptanması için çeşitli çalışmalar yapılmaktadır. Örnek olarak verilebilecek bir çalışmada, 2D-PAGE sonuçlarından elde edilen verilerle yapılan analizler sonucunda M. l. obtusa ve M. l. transmediterranea nın zehir proteinlerinin benzerliklerinin %4 ten az olduğunu hesaplanmıştır. Bu sonuç bunların farklı türler olabileceğini desteklemektedir. Buna benzer yaklaşımlarla zehir proteinlerinin dağılımı sistematikte destekleyici bulgu olarak kullanılabilir ancak genomik analizlerin de yapılmasında fayda olacağı belirtilmiştir (Sanz vd 2008) Proteomik Đnsan Genom Projesi nin tamamlanmasının ardından, genlerin fonksiyonel ürünü olan proteinlere ait bilgi birikimi artmadığı sürece genetik bilginin tek başına yeterli olamayacağı görülmüş ve proteinlerle ilgili çalışmalara ağırlık verilerek proteomik ( proteomics ) alanı doğmuştur. Bunun nedeni, proteinlerin hücrenin, dokunun ya da organizmanın dinamik durumu hakkında daha kesin bilgi vermesidir. Genom projesinin ardından insan genomundaki gen sayısı ± 5000 olarak hesaplanırken bu genler tarafından üretilen proteinlerin nispeten az bir kısmı bilinmektedir ve sayısının 1,5 milyon civarında olabileceği tahmin 15

35 edilmektedir (Hachey and Chaurand 2004) lara genetik çağı denilecek olursa, yeni yüz yılın ilk on yılına da proteomik çağı denilebilir (Anderson vd 2000). Proteom kelimesi, ilk defa 1994 te Siena iki boyutlu elektroforez toplantısında Marc Wilkins tarafından önerilmiştir. Bu terimin ilk baştaki tanımı basit olarak bir organizma veya doku tarafından sentezlenen bütün proteinlerin tanımlanması ve karakterizasyonu şeklinde yapılmıştır. Daha sonra alanda çalışan kişiler tarafından tanım geliştirilmiştir. Örneğin karakterizasyon terimi protein fonksiyonlarının belirlenmesi, konumlanmaları, translasyon sonrası modifikasyonları da kapsamıştır. Daha sonraki çalışmalar bu tanımın bile yetersiz olduğunu göstermiştir ve konu kapsamındaki proteinleri etkileyen çevresel, farmakolojik, genetik ve patolojik etmenlerin araştırılması da dâhil edilmiştir (Hamdan and Righetti 2005). Proteomik alanında yapılan çalışmaların aşamaları dört ana başlıkta toplanabilir: (1) Protein izolasyonu, (2) proteinlerin ayrımı (elektroforetik, kromatografik vs.) ve ifade analizleri, (3) protein tanımlaması (kütle spektrometreleri, Edman), (4) protein etkileşimleri ve yapısal analizler. Günümüzde bu çalışmaların temelini 2D-PAGE ve kütle spektrometrelerinin oluşturduğu görülmektedir (Anderson vd 2000, Hamdan and Righetti 2005). Proteomik yöntemlerin kullanım alanının büyük kısmını klinik proteomik olarak da adlandırılan tıpta kullanım oluşturmaktadır ve klinik proteomik alanındaki çalışmaların da çoğu hastalıklara özgü yeni biyo-belirteç tanımlanmasıyla ilgili çalışmalardır (Colantino and Chan 2005). Bunun haricinde ilaç geliştirmeden toksikolojiye kadar birçok farklı alanda da proteomik yöntemler kullanılmaktadır (Anderson vd 2000, Calzolai vd 2007). Her yöntemin ve yaklaşımın olduğu gibi proteomik alanının da kendine özgü zorlukları ve kısıtlamaları vardır. Ancak günümüzde hızlı bir şekilde gelişen bu alan gelecekte birçok farklı konuda önemli bilgiler sağlayacaktır. Özellikle protein tanımlanmasında ve dizilenmesindeki gelişmeler bu işlemleri hızlı ve güvenilir hale getirebilecek ve gerçek yapı fonksiyonu ortaya koyan proteinlere dair bilgi birikimimiz hızla artacaktır. 16

36 Venomiks Son yıllarda peptit tabanlı ilaç geliştirme konusunun gelişmesiyle hayvansal zehirlere olan ilgi oldukça artmıştır (Vetter vd 2010). Zehirlerin içeriğindeki toksinler ve diğer bileşenler evrimsel süreç içinde en uygun ve işlevsel yapıya doğru gittiklerinden, belki laboratuvar koşullarında uzun yıllarda üretilebilecek bir molekül zehirde her şeyiyle hazır bir şekilde karşımıza çıkabilir. Bu özellikleri hayvansal zehirlere duyulan ilginin ve verilen değerin en önemli nedenidir. Bu konuya olan yoğun ilgi Venomiks ( Venomics ) terimiyle adlandırılan yeni bir alanın doğmasıyla sonuçlanmıştır (Ménez vd 2006). Bu terim, zehrin bütün moleküler çeşitliliğinin ileri analiz yöntemleriyle (proteomik, metabolomik ve diğer yöntemler) açığa çıkarılması ve proteinleri (özellikle de toksinleri) kodlayan genlerin belirlenmesi (genomik) şeklinde tanımlanabilir (Ménez vd 2006) (Şekil 2. 3). Bu alanda kullanılan en önemli teknoloji olan proteomik çerçevesinde farklı türlerden zehirlerin protein profillerinin çıkarılması, farklılıkların belirlenmesi, elde edilen önemli proteinlerin yapısal analizi ve işlevlerinin belirlenmesi gerçekleştirilmektedir ve protein dizilerinden yola çıkarak önemli toksinlerin moleküler evrimlerinin anlaşılması sağlanmaktadır (Creer vd 2003, Li vd 2004, Bazaa vd 2005, Fry 2005, Birrell vd 2006, Calvete vd 2007a, Georgieva vd 2008, Sanz vd 2008, Fox and Serrano 2008, Fry vd 2009). Genomik ve transkriptomik teknolojileri kullanılarak zehirdeki proteinleri kodlayan genlerin ve transkriptlerinin belirlenmesi ve önemli toksin tiplerini kodlayan genlerin bulunması sağlanmaktadır ve venomiks alanının çıkış noktasıdır (Ménez vd 2006, Cidade vd 2006, Bazaa vd 2007, Casewell vd 2009). Metabolomik gibi diğer teknolojilerle de zehrin proteinlerle beraber, protein dışındaki tüm moleküler çeşitliliği de belirlenmekte ve farklı maddelerin zehrin etkisindeki rolleri araştırılmaktadır. Proteomiks alanındaki önemli dergilerden biri olan Journal of Proteomics dergisinin 72. cildinin (2009) 2. sayısı Venomics ana başlığıyla çıkmıştır ve konunun önemi vurgulanmıştır (Calvete 2009a). 17

37 Şekil Venomiks alanını destekleyen teknolojiler Proteomik alanında en sık kullanılan ve en önemli veritabanlarından biri olan UniProtKB/Swiss-Prot veritabanı bünyesinde hayvansal zehir kaynaklı toksinler için Tox- Prot adı altında ayrı bir kısım oluşturulmuştur (Jungo and Bairoch 2005, Bu özel veritabanında 24 Mart 2009 verilerine göre 430 türden 2656 protein girdisi bulunmaktayken, 20 Nisan 2010 verilerine göre bu sayı 471 türden 3232 girdiye çıkmıştır; bu da veritabanındaki toplam proteinlerin %0.63 ünü oluşturmaktadır ( 20 Nisan 2010 verileri) Đki boyutlu jel elektroforezi tekniğinin venomiks alanında kullanımı ve önemi Yılan zehri çalışmalarında protein elektroforezinin yeri çok önemlidir. Zehir proteinleri hakkındaki ilk bilgilere ulaşılmasını sağlayan yöntemler kromatografi ve 1D-PAGE olmuştur (Fox and Serrano 2008) lara kadar, zehir çalışmaları proteinlerin biyokimyasal izolasyon ve karakterizasyonunu ve zehirdeki proteinlerin ayrı ayrı biyokimyasal analizlerini kapsamıştır (Fox and Serrano 2008). Her ne kadar günümüzde 1D-PAGE hala yaygın olarak kullanılsa da, 2D-PAGE tekniğinin geliştirilmesi jel tabanlı proteomik çalışmalara farklı bir boyut kazandırmış ve proteinlerin ayrımında bir basamak daha ileri gidilmesini sağlamıştır. Daha yüksek çözünürlükte protein ayrımı sağlaması ve buna paralel olarak da ifade 18

38 farklılıklarının ortaya çıkarılmasında güçlü bir yöntem olması nedeniyle bu yöntemle zehri incelenen yılan türlerinin sayısı son yıllarda artış göstermiştir. 2D-PAGE tekniği günümüzde proteomik alanında kullanılan temel yöntemlerden biridir ve kullanımının yaygınlaşmasıyla birlikte zehir çalışmalarında da kullanılan başlıca yöntemlerden biri haline gelmiştir (Fox and Serrano 2008). Rioux vd (1998) a göre zehri 2-D PAGE ile incelenen ilk iki yılan Laticauda colubrina (bir deniz yılanı) ve Daboia russelli dir (Fox and Serrano 2008). Đki boyutlu jel elektroforezi tekniği çok yeni olmamasına rağmen zehir araştırmalarında yoğun olarak 2000 in başlarından itibaren kullanılmaya başlanmıştır. Son yıllardaki artan çalışmalarla beraber hala zehirlerinin iki boyutlu protein profili çıkarılmamış birçok tür ve alt tür vardır. Zehir çalışmalarında 2D-PAGE in kullanılması hem jelden geri kazanılan proteinlerin tanımlanmasında hem de tür/alt tür karşılaştırmalarında daha verimli ve güvenilir sonuçlar alınmasını sağlamaktadır Kütle spektrometrelerinin venomiks alanında kullanımı ve önemi Kütle spektrometresi tabanlı yöntemler (özellikle 2-D PAGE veya kromatografik ayrımla birlikte) günümüzde zehir bileşenlerinin açığa çıkarılmasında kullanılan yöntemlerin en önemlilerindendir (Escoubas vd 1999, Pimenta vd 2001, Escoubas vd 2006, Calvete vd 2007b, Yanes vd 2007, Escoubas vd 2008). Kütle spektrometreleri kullanılarak bazı örümcek zehirlerden (ör: Hadronyche versuta) 1000 den fazla bileşen tespit edilebilmiştir (Escoubas vd 2006). Ayrıca kütle spektrometresi ham zehrin direkt olarak incelenmesine de izin vermektedir (Escoubas vd 1999). Son yıllarda peptit tabanlı ilaç geliştirme konusuna büyük ilgi vardır. Bahsedildiği gibi bu konuyla ilgili çeşitli veritabanları oluşturulmakta ve uluslararası kongreler düzenlenmektedir (ör: Natural Peptides to Drugs). Konunun gelişmesiyle biyo-etkin peptitlerin en önemli 19

39 kaynağı olan hayvansal zehirlere olan ilgi de artmıştır (Escoubas and King 2009, Vetter vd 2010). Zehrin içindeki proteinlerin/peptitlerin kütle spektrometreleriyle incelenerek peptit kütle kütüphanelerinin oluşturulması, peptit tabanlı ilaç araştırmaları için çok önemlidir ve bazı merkezler bu konuda kütüphane oluşturmaya başlamıştır. Oluşturulan peptit kütüphaneleri büyük ilaç firmalarının da ilgisini çekmektedir ve çalışmalar bu tip firmalarca desteklenmektedir (Birrell vd 2006). Yakın bir zamanda oluşan birikim ilaç tasarımı çalışmalarında verimli bir şekilde kullanılabilecektir Yılan Zehirlerinin Tanı ve Bilimsel Amaçlı Kullanımı Hayvansal zehirler eski tarihlerden beri doğa bilimcilerin ve araştırmacıların ilgisini çekmiştir. Bunlar arasında en fazla ilgi gören ve araştırılan ise yılan zehri olmuştur. Geçmişten günümüze kadar yılan zehirleri temel araştırma, tanı ve tedavide çeşitli şekillerde kullanılmıştır ve günümüzde de kullanılmaya devam etmektedir (Chippaux 2006, Sanz vd 2008). Özellikle engerek zehirlerinin kanın pıhtılaşması üzerindeki etkileri yıllar öncesinden beri araştırma konusu olmuştur lü yılların başında Kobra zehrinde bulunan faktörlere vücutta verilen cevap üzerine yapılan araştırmalarla alerji biliminin temelleri atılmıştır. Yine aynı yıllarda eş zamanlı olarak o zamanki teknikler ve birikim çerçevesinde farklı araştırmacılar tarafından çeşitli çalışmalar yapılmıştır. Kan pıhtılaşmasında önemli olan bradikininlerin keşfi de 1949 da Rocha e Silva nın çıngıraklı yılan zehirlenmesi sonucunda vücutta salgılanan bu molekülleri saflaştırmasıyla gerçekleşmiştir. Vücutta çok önemli bir yeri olan renin-anjiyotensin sisteminin aydınlatılmasına da yine yılan zehrinin katkısı olmuştur de Sasaki tarafından Naja siamensis zehrinden nörotoksin saflaştırmıştır ve bunun yardımıyla postsinaptik memranların kolinerjik reseptörlerinin saflaştırılması ve moleküler yapılarının aydınlatılması mümkün olmuştur. Watson ve Crick DNA molekülünün yapısının belirlenmesi için yaptıkları çalışmalarda Naja sp. zehrinden elde edilen nükleotidazları (özellikle 5 nükleotidaz) kullanmışlardır (Chippaux 2006). 20

40 Yılan zehri çeşitli hastalıkların çalışılmasında da kullanılmaktadır. Radyoaktif iyodin ile işaretlenmiş α-bungarotoksin in kullanımı bir kas hastalığı olan myasthenia gravis in (MG, Miyasteni) oto-immun etyolojisinin anlaşılmasını sağlamıştır ve ayrıca bu hastalığın tanısında kullanımıyla ilgili de çalışmalar yapılmaktadır. Asetilkolin reseptörlerinin fonksiyonlarının bozukluğu ile ilişkilendirilen birçok patoloji (ör: Parkinson, Alzheimer, depresyon, şizofreni) yılan zehirlerinden izole edilen nörotoksinler yardımıyla çalışılabilir ve hastalıkların tanısı için faydalı olabilir. Yılan zehri fosfolipazları trombositlerin fizyolojilerini ve tromboembolik olaylara neden olan patolojik bozuklukları çalışmak için de kullanılmaktadır. Yılan zehrinden elde edilen PLA 2 enzimleri intra-membran proteinlerinin çözünmelerini sağlamak ve hücre zarı fizyolojisinde yer alan farklı fosfolipidlerin fonksiyonlarını keşfetmek için kullanılmaktadır. Kan pıhtılaşmasıyla ilgili diğer enzimler de karmaşık bir olay olan pıhıtlaşmanın çalışılması için ve bu konuyla ilgili hastalıkların tanısında kullanılmaktadır (Chippaux 2006). Temel bilimlerde kullanımlarının yanında, yılan zehirlerinin tanı amaçlı kullanımlarıyla ilgili de eski tarihlerden beri çalışmalar yapılmaktadır. Belli metabolik ve enfeksiyöz bozukluklar sonucu oluşan lipit bozukluklarını yılan zehirlerinin verdiği reaksiyonlarla açıklamak mümkün olmuştur. Bunların ilki 20. yüzyılın başlarında yaygın olarak kullanılan Weil reaksiyonudur ve frenginin erken tanısında kullanılmıştır (Chippaux 2006). Yılan zehri postsinaptik nörotoksinleri kullanılarak hedef bir sinir-kas kavşağındaki asetil kolin reseptörlerinin (AChR) sayısı tespit edilebilir. Bu yöntem kullanılarak MG hastalarında normalden daha az AChR olduğu görülmüştür (Tu 1996). Ayrıca farklı pıtılaşma bozukluklarının tanısında özellikle engerek zehirlerinden elde edilen proteinlerden faydalanılmaktadır ve günümüzde bu alanla ilgili biyoteknolojik pazarın önemli kısmını oluşturmaktadır (Schöni 2005) Yılan Zehrinin Biyoteknolojik Kullanımı Moleküler biyolojide kullanılan tekniklerin gelişmesiyle hayvansal zehirlerle ilgili çalışmaların sayısı son yıllarda önemli artış göstermiştir. Bu çalışmalara paralel olarak peptit 21

41 tabanlı ilaç tasarımı konusu önem kazanmıştır ve farklı ülkelerde geniş çaplı araştırmalar yürütülmektedir. Yılan zehirlerinin biyoteknolojik kullanımı genel olarak üç başlık altında toplanabilir: 1) peptit tabanlı ilaç tasarımı, 2) tanısal amaçlı kullanım, 3) bilimsel amaçlı kullanım. Peptit tabanlı ilaç tasarımı konusu yılan zehirlerinin biyoteknolojik kullanımıyla ilgili yapılan çalışmaların büyük bir kısmını oluşturmaktadır. Yılan zehirlerinin tanısal amaçlı kullanımında özellikle engerek zehirlerinin kan pıhtılaşması üzerindeki farklı etkilerinden yararlanılmaktadır (Schöni 2005). Bilimsel amaçlı kullanımda ajan olarak yine kan pıhtılaşması üzerinde etkili moleküllerden ve nörotoksinlerden sıklıkla faydalanılmaktadır. Yılan zehirleri üzerinde yapılan araştırmalar sonucunda patenti alınan ürünlerin çoğunluğunu engerek zehirlerinden elde edilen ve kan pıhtılaşması üzerinde etkili olan çeşitli moleküller oluşturmaktadır. Bu ürünlerden bazıları ilaç adayı olarak deneme aşamasındadır, bazıları da onaylı olarak kullanılmaktadır. Bunlara verilebilecek en önemli iki örnek günümüzde özellikle akut koroner sendromunun tedavisinde yaygın olarak kullanılan ve engerek zehirlerinden elde edilen iki anti-agregan ilaç olan Aggrastat (tirofiban, Sisturus miliaris barbouri zehrinden) ve Integrilin (eptifibatide Echis carinatus zehrinden) dir (Şekil 2. 4) (Batchelor vd 2002, Zeymer and Wienbergen 2007). Bu iki ilaç FDA tarafından 1998 yılında onaylanmıştır. Aggrastat (peptit yapısında olmayan bir tirozin türevi) ve Integrilin (siklik heptapeptit yapısında), plateletlerin yüzeyinde bulunan ve glikoprotein (GP) yapısında olan IIb/IIIa reseptörlerinin antagonisti olarak çalışarak kümeleşmeyi önler (Batchelor vd 2002). Millenium Corp. verilerine göre (Anonymous 2003) Integrilin, GP IIb/IIIa antagonistleri arasında 2003 yılı için kullanım ve satış olarak Amerika da birinci sıradadır ve kullanımı %62 den %73 e çıkmıştır. Desicion Resources verilerine göre ise (Anonymous 2008) Aggrastat ın 2005 yılında Avrupa da toplam satışı yaklaşık olarak 88 milyon dolardır yılında Amerika, Fransa, Almanya, Đtalya, Đspanya, Đngiltere ve Japonya da Aggrastat satışının yaklaşık olarak 28 milyon dolar olacağı, Integrilin in ise 129 milyon doların üzerine çıkacağı öngörülmektedir. 22

42 Şekil GP IIb/IIIa antagonistlerinden eptifibatide ve tirofibanın moleküler yapıları ve ticari ürünleri olan Integrilin ve Aggrastat ( lerin başında Bothrops jararaca zehrinden saflaştırılan ve anjiyotensin dönüştürücü enzimin (ACE) inhibitörü olan peptitten yola çıkılıp çeşitli modifikasyonlar yapılarak antihipertansif ilaç olarak günümüzde de hala kullanılan captopril geliştirilmiştir (Şekil 2. 5) (Vetter vd 2010 a göre Cushman and Ondetti 1991). Bunların dışında yine patentli olarak pıhtılaşma tanı testlerinde kullanılan ve tedavide kullanılabilecek çeşitli proteinler engerek zehirlerinden saflaştırılmıştır (ör: Vipoxin, Reptilase, Protac, Botrocetin ). Ayrıca yılan zehirlerinden saflaştırılan ve damar gevşetici etkisi olan bradikinin etkinlik arttırıcıları ve natriüretik peptitler, yılan zehirlerinin damar üzerindeki kasıcı/gevşetici etkileriyle ilgili çalışmaları da arttırmıştır (Higuchi vd 1999). 23

43 Şekil ACE inhibitörü olan captopril in moleküler yapısı ve ticari formu Bothrops atrox zehrinden geliştirilen Reptilase (proteolitik bir enzim), Reptilase zamanı olarak kan pıhtılaşmasıyla ilgili bozuklukların tanılarında kullanılmaktadır (Koh vd 2006). Calloselasma rhodostoma zehrinden geliştirilen sentetik bir peptit türevi olan Viprinex (Ancrod) in pıhtının yapısındaki fibrinojeni uzaklaştırıp yapının kararlılığını bozması özelliği inme olgularında önem kazanmakta ve faz III deneme aşamasındadır (Kelle 2006, Vetter vd 2010). Pseudonaja textilis zehrinden elde edilen textilinin, bir antifibrinolitik serin proteaz inhibitörüdür ve açık kalp cerrahisinde kanama komplikasyonlarına karşı denenmektedir (Lewis and Garcia 2003). Bunların haricinde, nörodejeneratif ve kanser gibi çeşitli hastalıklarda ilgili çalışmalar da yapılmaktadır. Yılan zehri dışında, özellikle akrep, örümcek ve deniz salyangozu zehirleri de yoğun olarak çalışılmaktadır. Bir deniz salyangozu türünün (Conus magus) zehrinden elde edilen Prialt (Ziconotide), 2004 yılında FDA ve 2005 yılında Avrupa Komisyonu tarafından onaylanmıştır ve intrahekal ağrı kesici olarak kullanılmaktadır (Vetter vd 2010). Yılan zehri postsinaptik nörotoksinleri kullanılarak hedef bir sinir-kas kavşağındaki AChR sayısı tespit edilebilir. Bu yöntem kullanılarak myasthenia gravis (MG, Miyasteni) hastalarında normalden daha az AChR olduğu görülmüştür ve hastalığın tanısında kullanımı için çalışmalar yapılmaktadır (Chippaux 2006). 24

44 Agkistrodon contortrix contortrix zehrinden elde edilen ve direkt fibrinolitik özellikte bir metalloproteaz olan fibrolaz ın rekombinant şekli olan alfimepraz (ALF), fibrin(ojen)in Aα zinciri üzerinde direkt proteolitik aktiviteye sahiptir. Preklinik farmakolojik çalışmalar ALF ile sağlanan trombolizin plazminojen aktivatörleri tarafından sağlanana göre 6 kat daha hızlı olduğunu göstermiştir. Faz 1 ve faz 2 çalışmaları ALF nin aktif ve genellikle iyi tolere edildiğini göstermiştir. Farklı arteriyal ve venöz trombotik hastalıklar ALF nin klinikteki hedefi olabilir (Deitcher and Toombs 2005). Yukarıda bahsedilen örnekler gibi ürüne yönelik çalışmalar günümüzde de hala devam etmektedir ve farklı etkilerdeki yeni moleküller yılan zehirlerinden tanımlanmaktadır. 25

45 3. MATERYAL ve YÖNTEM Materyal Bu tez çalışması Ankara Üniversitesi Biyoteknoloji Enstitüsü Merkez Laboratuvarı Proteombilim Birimi nde gerçekleştirilmiştir. Tüm zehir örnekleri (Montivipera xanthina dışında) Ege Üniversitesi Fen Fakültesi Biyoloji Bölümü Zooloji Anabilim Dalı Reptilia Biyolojisi ve Ekoloji Araştırma Laboratuvarı ndan temin edilmiştir Zehir sağılan yılan örnekleri Zehir elde edilen Macrovipera lebetina bireyleri yılları arasında Şanlıurfa, Diyarbakır ve Kıbrıs a gerçekleştirilen arazi çalışmalarında sistematik olarak tanımlanmış ve Ege Üniversitesi Fen Fakültesi Biyoloji Bölümü Zooloji Anabilim Dalı nda bulunan Reptilia Biyolojisi ve Ekoloji Araştırma Laboratuvarı nda canlı fareyle beslenerek muhafaza altına alınmıştır. Yılanların Zoology Department Ege University (ZDEU) demirbaş numaraları, lokaliteleri, araziden toplandıkları tarih ve arazi çalışmasını gerçekleştirenler Çizelge 3. 1 de verilmiştir. Zehri sadece FT-IR spektrumları ile kümeleme analizinde kullanılan Montivipera xanthina, 2009 yılında Mert ELVERĐCĐ tarafından Muğla dan yakalanmış zehri sağıldıktan sonra yakalndığı yerde doğaya salınmıştır. Zehir sağılan tüm bireyler ergindir. Çizelge Zehir elde edilen bireylerin ZDEU demirbaş numaraları, yakalandıkları lokaliteler, tarihleri ve toplayanların adları Alt tür ZDEU No. Lokalite Tarih Toplayanlar M. l. obtusa M. l. obtusa ZDEU 34/2009 ZDEU 207/2006 Eğil/Diyarbakır B. Göçmen, M. Z. Yıldız, B. Akman, D. Yalçınkaya Suruç/Şanlıurfa Nisan 2006 E. A. Yağmur 26

46 Çizelge Devam M. l. lebetina ZDEU 20/2007 Selvilitepe/Kıbrıs B. Göçmen, M. Z. Yıldız, B. Akman, D. Yalçınkaya, N. Kaşot M. l. lebetina ZDEU 39/2004 Dikmen/Kıbrıs B. Göçmen Kullanılan kimyasal maddeler ve cihazlar Kullanılan bütün kimyasallar moleküler biyoloji ve/veya proteomik çalışmalarında kullanılmaya uygundur. Deneylerde kullanılan kimyasalların listesi Ek 1 de verilmiştir. Kullanılan cihazlar üreticilerinin talimatlarına uygun olarak kullanılmıştır. Cihazların listesi ve hangi amaçlarla kullanıldığı Ek 2 de verilmiştir. Tüm deneylerde Millipore (Milli-Q ve Elix filtreleri) saf su sisteminden elde edilen ddh 2 O kullanılmıştır Yöntem Zehir sağımı ve saklanması Terraryum ortamında canlı olarak beslenmekte olan ergin iki M. l. obtusa ve iki M. l. lebetina örneğinden iki gün ara ile ikişer kere zehir sağılmıştır. Zehir sağımı, yılanın parafin gerilmiş bir beheri ısırması sağlanarak gerçekleştirilmiştir (Şekil 3.1). Zehirler soğuk zincir ile yaklaşık olarak 0 C de Ankara Üniversitesi Biyoteknoloji Enstitüsü Merkez Laboratuvarı Proteombilim Birimi ne getirilmiştir. 27

47 Şekil Zehir sağım işlemi (orijinal) Zehrin içeriği türe/alt türe (Arıkan vd 2003, Arıkan vd 2005), yaşa (Arıkan vd 2006), cinsiyete (Menezes vd 2006), beslenme koşullarına/tercihine (Li vd 2005) bağlı olarak farklılık gösterebilir. Farklı populasyonların karşılaştırıldığı çalışmalarda havuz yaklaşımının benimsenmesi faydalı ve daha güvenilir olmaktadır (Chippaux vd 1991). Bu tez çalışmasında da bireysel farklılıkları en aza indirgemek amacıyla, aynı alt türe ait bireylerden elde edilen zehir örnekleri protein havuzu oluşturularak çalışılmıştır (Şekil 3. 2). Şekil Zehir içeriklerinde coğrafik farklılıkların tespiti için uygulanan havuz yaklaşımının şematik gösterimi 28

48 Yılanlardan sağılan zehir örnekleri, istenmeyen ve proteomik yöntemlerde inhibitör olabilecek kalıntılardan arındırılması amacıyla 2000 x g ve 4 C de 10 dk. santrifüj edilmiştir. Bu işlemin ardından üst faz alınarak önce -80 C de dondurulmuş, daha sonra liyofilize edilerek (dondurarak kurutma işlemi ile) toz halinde 4 C de saklanmıştır Protein miktar tayini Eşit miktarda toz zehir örnekleri rehidrasyon tamponunda (7 M üre, 2 M tiyoüre, %4 CHAPS, %1 amfolit, ph 3-10, 10 mm DTT, bromo fenol mavisi) çözüldükten sonra 1:10 oranında seyreltilerek protein miktar tayini 96 kuyucuklu mikro-plakalarda Bradford (mikro-bradford) yöntemi ile yapılmıştır. Ticari olarak 5X stok halinde alınan Bradford protein boyası ultra saf su ile 1X e seyreltilmiştir ve kuyucuklara 200 µl boya, 10 µl. örnek uygulanmıştır. Örneklerin boyayla reaksiyona girmesi için 15 dk. oda sıcaklığında inkübasyondan sonra mikroplaka okuyucuda (Molecular Devices) 595 nm. de ölçüm yapılmıştır. Standart olarak 250, 500, 750 ve 1000 µg/ml konsantrasyonlarında sığır serum albümini (BSA) kullanılmıştır. Örnekler üç tekrarlı olarak ölçülüp ortalamaları alınmıştır Đki boyutlu jel elektroforezi Aktif rehidrasyon tepsilerinde (tray) 17 cm. uzunluğunda ve ph 3 10 aralığındaki lineer immobilize ph gradiyent (IPG) şeritlere (Bio-Rad) rehidrasyon tamponuyla beraber 175 µg. protein yüklenmiştir ve 50 V de 16 saat aktif rehidrasyon yapılmıştır. Daha sonra IPG şeritler temiz ve elektrotlu tepsilere alınarak izoelektrik odaklama işlemi gerçekleştirilmiş ve birinci boyut ayrım (izoelektrik noktalarına göre) sağlanmıştır (15 dk. 250 V, 3 sa. 10 kv, toplamda 60 kv/sa değerine ulaşana kadar 10 kv). Bu işlemin ardından şeritler, ikinci boyut ayrıma (moleküler ağırlıklarına göre) hazır hale gelmeleri için, çalkalayıcı üzerinde 15 dk. dengeleme tamponu I (6 M üre, 1.5 M Tris-HCl ph 8.8, %2 SDS, %20 gliserol, %2 DTT) ve 15 dk. dengeleme tamponu II (dengeleme tamponu 29

49 I de %2 DTT yerine %2.5 iyodoasetamid ve ek olarak bromo fenol mavisi) ile muamele edilmiştir. Ardından şeritler %4 lük toplama ve %12,5 luk ayırma jellerinden oluşan 1 mm. kalınlığındaki SDS poliakrilamit jellere yüklenmiştir. SDS tamponu (%3.03 Tris-base, %1.44 glisin, %1 SDS) eşliğinde 30 dk. 100 V ve izleme boyası jelin altına ulaşıncaya kadar 150 V sabit voltajda ikinci boyut ayrım gerçekleştirilmiştir. Jeller her bir alt tür için iki teknik tekrarlı olarak yapılmıştır Jellerin boyanması, görüntülenmesi ve analizi Jeller floresans özellikte bir boya olan Sypro Ruby (Bio-Rad) ile üreticinin talimatlarına göre boyanmıştır. Bu amaçla, fiksatif çözeltisine (%10 metanol, %7 asetik asit) koyulup çalkalayıcıda 1,5 saat bekletilen jeller daha sonra boya içinde gece boyu çalkalayıcıda bırakılmıştır. Son olarak 1,5 saat tekrar fiksatif içinde bekletilerek VersaDoc görüntüleme sisteminde ultraviyole (UV) ışık altında görüntülenmiştir. Jel fotoğraflarının analizi PDQuest programı kullanılarak yapılmıştır. Program yardımıyla protein kümelerinin üç boyutlu ve çubuk grafikleri elde edilmiştir ve deneysel gözlenen ph ve moleküler ağırlık değerleri hesaplanmıştır Đstatistiksel analiz Jel tekrarları programa tanıtılıp grup oluşturulmuş ve %95 güven aralığında logaritmik düzeltme yapılmadan ve yapılarak student-t testi PDQuest programı ile yapılmıştır. Ayrıca kısmi en küçük kareler (PLS) analizi de yine aynı programda gerçekleştirilmiştir. Programın anlamlı farklılık belirlediği eşleşen protein kümelerinin sayısal yoğunluk değerleri programdan alınmış ve SPSS 9.0 programında student-t testleri tekrarlanarak p değerleri hesaplanmıştır. 30

50 Protein kümelerinin kesimi ve jel içinde tripsin sindirimi (tripsinizasyon) Đlgilenilen protein kümeleri robotik bir sistem olan SpotCutter cihazında 1 mm. çaplı daire parçaları şeklinde kesilmiştir. Bu amaçla önce jel görüntülenmiş ve kesimi yapılacak protein kümeleri PDQuest programı aracılığıyla belirlenmiştir. Kesimi yapılan parçalar, her bir kuyucuğuna daha önce 200 er µl. ddh 2 O koyulan V tabanlı plaka kuyucuklarına robotik kol tarafından aktarılmıştır. Kesim işleminin ardından jel içinde sindirim işlemi (tripsinizasyon) gerçekleştirilmiştir. Öncelikle amonyum bikarbonat ve asetonitril ile jel parçalarının boyası uzaklaştırılmıştır. Daha sonra DTT ile redükleme, iyodoasetamid ile alkilleme yapılmıştır. Bu işlemlerin ardından her bir kuyucuğa 30 µl. 50 mm amonyum bikarbonat içinde 150 ng. tripsin enzimi koyularak enzimin kendi kendini sindirmeden jele geçmesi için 1 sa. 4 C de bekletilmiş ve enzimin sindirim işlemini gerçekleştirebilmesi için de gece boyu 37 C de inkübe edilmiştir. Daha sonra ekstraksiyon tamponu (%1 formik asit, %2 asetonitril) ile jel içinde sindirilmiş olan peptitler elde edilip temiz bir polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) plakasına alınarak kurumaya bırakılmıştır. Tripsinizasyon işleminin bütün basamakları laminar akışlı kabinde yapılmıştır MALDI-TOF kütle spektrometresi için örnek hazırlama ve ölçüm Uygun bir şekilde yıkanmış olan temiz MALDI-TOF örnek yükleme plakasının (Waters) kuyucukları önce saf su, daha sonra asetonitril ile temizlenmiş ve kuruması beklenmiştir. Đyonlaşmayı sağlayacak matriks olarak kullanılmak üzere rekristalize edilmiş alpha-cyano-4- hydroxycinnamic acid (CHCA), mg. başına 50 µl. olacak şekilde matriks çözücü tamponunda (%75 asetonitril, %0.1 trifloro asetik asit) çözülmüştür. Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) plakasında kuru bir şekilde bulunan yüklenecek peptit örneklerinin üzerine eşit hacimlerde önce örnek çözücü tamponu (%50 asetonitril, %0.1 TFA) eklenerek pipetleme ile peptitler tampona geçirilmiş, sonra da matriks tamponu eklenerek MALDI-TOF örnek yükleme plakasının kuyucuklarına 1,5 µl. yükleme yapılmıştır. 31

51 MALDI-TOF kütle spektrometresinin kalibrasyonu örnek plakasında bulunan Lock Mass kalibrasyon kuyucuklarına yüklenen ve moleküler ağırlıkları bilinen beş peptit karışımı ile yapılmıştır (dış kalibrasyon). Bu amaçla, adrenokortikotropik hormon (ACTH) 18-19, (Glu1)- fibrinopeptit B (Glu-Fib), substance P, renin-14 ve anjiyotensin 1 peptitleri son konsantrasyonları pmol olacak şekilde stok çözeltilerden örnek çözücü tamponuyla seyreltilmiştir. Kalibrasyonda kullanılan peptitlerin moleküler ağırlıkları Çizelge 3. 2 de verilmiştir. Yapılan canlı kalibrasyon sonrası peptit karışımı tekrar okunarak ölçümün doğruluğu test edilmiştir. Çizelge MALDI-TOF kütle spektrometresinin kalibrasyonunda kullanılan peptitlerin kütleleri Peptidin adı Kütlesi (Da) ACTH Glu-Fib Substance P Renin Anjiyotensin Tüm ölçümler Waters Micromass MALDI-TOF kütle spektrometresinde m/z arasında ve reflektron pozitif iyon modunda gerçekleştirilmiştir. Anlamlı farklılık gösteren ve zehirde yoğun olarak bulunduğu için önemli görülen bazı protein kümeleri iki tekrarlı olarak okunmuştur Peptit kütle verilerinin biyoinformatik analizi ve protein tanımlama Her bir kuyucuk için elde edilen çekimlerin MassLynx 4.0 programında ortalaması alınmış ve yine aynı programda arkaplan çıkarımı işlemine tâbi tutulmuştur. 700 Da altında matriksten gelen kirlilik yoğun olarak her kuyucukta aynı şekilde görülmüş ve bu bölge analizlere dâhil 32

52 edilmemiştir. Ayrıca her bir kuyucuktan elde edilen spektrumlar incelenmiş ve 700 Da üzerinde de hemen hemen bütün spektrumlarında bulunan bazı pikler tespit edilerek kirlilik olduğu düşünülmüş ve bunlar da biyoinformatik analizlere dâhil edilmemiştir. Yukarıda belirtilen ön işlemlere tâbi tutulan spektrumlarda kirlilikten gelen piklerin de bulunması sebebiyle belirli yoğunluğun üstünde olan peptit m/z değerlerinin monoizotopik değerleri elle yazılmıştır. Tekrarlı olarak okuanan kuyucuklardan elde edilen değerler birleştirilerek analizlere dâhil edilmiştir. Peptit kütle değerlerinin analizinde Mascot ve Aldente (Tuloup vd 2003, Gasteiger vd 2005, arama motorları kullanılarak SwissProt, MSDB ve NCBI protein veritabanları taranmıştır. Ayrıca UniProtKB/SwissProt veritabanında kayıtlı olan engerek zehir proteinlerinden ayrı bir veritabanı oluşturulmuş ve ProteinLynx Global Server (PLGS) (Waters) programı kullanılarak sadece bu veritabanında arama yapılmıştır. Veri analizlerinde, peptit örneklerine iyodoasetamit ile alkilleme yapıldığı için sistein karbamidometillenmesi sabit modifikasyon olarak işaretlenmiştir. Değişken modifikasyon olarak da metiyonin oksidasyonu ve fosforilasyonlar seçilmiştir. Peptit toleransı 0.4 Da olarak seçilmiş, en fazla 1 kaçırılan kesime izin verilmiştir. Arama Mascot arama motorunda Bony Vertebrates, Aldente de ise Other Vertebrates olarak kısıtlanmıştır. Aldente de en az üç peptit eşleştirildiğinde sıralanan ilk yirmi protein için sonuç alınmıştır FT-IR analizleri FT-IR spektroskopisi çekimleri liyofilize zehir örneklerinden orta kızılötesi bölgede, 22ºC de ATR (Pike Miracle ATR Cell) aparatı ile Tensor 27 cihazında yapılmıştır. Örnekler 3 kere çekilmiş ve ortalamaları alınmıştır. Her bir bandın dalga numaraları belirlenmiş ve integrasyon ile altlarında kalan alanlar hesaplanmıştır. Karşılaştırma ve proteinlerin ikincil yapıları hakkında bilgi edinmek amacıyla ikincil türev spektrumları da kullanılmıştır. Ayrıca spektrumlar kullanılarak OPUS 6.5 programında kümeleme analizi yapılmıştır. Spektrumların diğer analizleri ise OPUS 5.5 programı ile yapılmıştır. 33

53 Şekil Çalışma basamaklarının şematik gösterimi 34

54 4. ARAŞTIRMA BULGULARI Protein Miktar Tayini Aynı alt türe ait ikişer örneğin tek bir tüpte birleştirilmesiyle elde edilen örneklerin miktar tayini sonucunda M. lebetina obtusa nın protein konsantrasyonu 2,4 µg/µl, M. lebetina lebetina nın ise 2,5 µg/µl olarak bulunmuştur (Çizelge 4. 1) (Liyofilize örneklerden eşit miktarda çözülmüştür). Çizelge Bradford miktar tayini sonucunda elde edilen OD ve konsantrasyon değerleri BSA standartları [OD/kons. (µg/ml)] 250 µg/ml 500 µg/ml 750 µg/ml 1000 µg/ml Zehir örnekleri [OD/kons. (µg/ml)] M. l. M. l.obtusa lebetina 1. tekrar 0,41/195,29 0,72/574,86 0,87/765,40 1,04/965,44 0,45/246,28 0,45/251,17 2. tekrar ,46/261,81 0,44/233,07 3. tekrar ,46/261,44 0,45/242,24 Ortalama 0,41/195,29 0,72/574,86 0,87/765,40 1,04/965,44 0,46/256,51 0,45/242,16 Şekil Bradford yönteminde standart proteinlerle elde edilen kalibrasyon doğrusu (R 2 =0,969) 35

55 4. 2. Đki Boyutlu Jel Elektroforezi ile Protein Profillerinin Çıkarılması ve Jellerin Đstatistiksel Analizi Her iki alt türün zehir proteinleri iki tekrarlı olarak 2D-PAGE ile protein profillenmesine tabi tutulmuştur. ph 3-10 aralıklı IPG şeritler kullanılmış ve protein dağılım yoğunluğunun ph 4 8 arasında olduğu görülmüştür (Şekil 4. 2). Moleküler ağırlık bakımından kda arasında proteinler görülmüştür ve proteinler 50 kda altında yoğunlaşmıştır. Özellikle 50 kda civarı ve yukarısında yatay sıra/zincir oluşturan protein kümeleri görülmüştür. Đki boyutlu protein profillerinde yatay zincir halinde proteinlerin görülmesi izoformların ya da translasyon sonrası modifikasyonların varlığını göstermektedir. Yılan zehrinde bu şekilde izoformların bulunduğu daha önce de bildirilmiştir (Birrell vd 2006). PDQuest jel analiz programında M. l. obtusa jellerinde ortalama 123, M. l. lebetina da ise 86 protein kümesi tespit edilmiştir (Çizelge 4. 2). Şekil Macrovipera lebetina obtusa (A) ve Macrovipera lebetina lebetina (B) zehirlerinin iki boyutlu jel elektroforezi ile elde edilmiş protein profilleri Analizler sonucunda iki alt türün zehrinde birçok ortak protein tespit edilmekle birlikte, önemli ölçüde farklılıklar da görülmüştür. Farklılıklar, hem bir alt türde bulunup diğerinde bulunmayan protein kümeleri, hem de ifade artış azalışları şeklindedir (Şekil 4. 3). Đki alt türün tekrarlı jelleri arasında logaritmik düzeltme yapılmadan (9) ve yapılarak (11) gerçekleştirilen t-testine göre istatistiksel olarak %95 güven aralığında (p < 0.05) toplam 15 protein kümesinin ifadesi anlamlı olarak farklılık göstermiştir (Çizelge 4. 3). 36

56 Çizelge Jellerde PDQuest programıyla tespit edilen spot sayıları ve referans jel ile eşleşme oranları M. l. obtusa M. l. lebetina 1. tekrar 2. tekrar 1. tekrar 2. tekrar Toplam spot sayısı Referans jel ile eşleşen spot sayısı Eşleşme oranı (%) Bunlardan 5 tanesi her iki testte de bulunmuştur, 4 tanesi sadece düzeltmesiz, 6 tanesi ise sadece logaritmik düzeltmeli t-testinde bulunmuştur (Çizelge 4. 3). Ayrıca PLS analizi sonucunda da 5 tane protein kümesi farklı olarak tespit edilmiştir (3 ü diğer iki testte, 2 si sadece logaritmik düzeltmeli t-testinde de bulunmuştur). Farklılığı açıkça görülen bazı protein kümeleri düzeltme yapılmadan önce istatistiksel olarak anlamlı tespit edilememişken, logaritmik düzeltme sonrası ifade farklılıkları anlamlı bulunmuştur. Đfadesi anlamlı farklılık gösteren 78, 79, 80 ve 82 numaralı protein kümelerinin yoğunluğu M. l. lebetina zehrinde fazlayken, diğerlerin yoğunluğu M. l. obtusa da M. l. lebetina ya göre daha fazladır. Çizelge Đstatistiksel testler sonucunda tespit edilen protein kümeleri Spot No.* SSP No. Student t-testi Logaritmik düzeltme sonrası student t-testi Kısmi en küçük kareler (PLS) testi

57 Çizelge Devam * Spot numaraları için Şekil e bakınız. Şekil Logaritmik düzeltme yapılmadan (A) ve yapılarak (B) gerçekleştirilen t-testine göre ve PLS analizine (C) göre iafdesindeki farklılık anlamlı bulunan protein kümelerinin PDQuest programından alınmış ifade yoğunluk çubuk grafikleri PDQuest programında her üç istatistiksel teste göre ifadesi anlamlı farklılık gösteren 15 protein kümesinin yoğunluk değerleri alınıp p değerlerini elde etmek ve testleri doğrulamak için SPSS programında logaritmik düzeltme olmadan (Çizelge 4. 4) ve değerlerin 10 tabanına göre logaritmaları alınarak (Çizelge 4. 5) tekrar t-testi yapılmıştır. Aynı zamanda yapılan Levene testinde tüm p değerlerinin 0.05 in altında olduğu görülmüştür (bazı değişkenler için 38

58 Levene p değerinin hesaplanamamasının nedeni değerin çok düşük olmasından kaynaklanabilir). Elde edilen p değerlerine bakıldığında, tüm durumlarda varyansların eşit olduğu varsayımı kabul edilirse, anlamlı çıkan sonuçlar PDQuest programından alınan sonuçlarla (Çizelge 4. 3) uyumlu olmaktadır. Bazı durumlarda, p değerinin eşit varyans varsayımında 0.05 ten küçükken varyansın eşit olmadığı varsayımında 0.05 ten büyük olması göz önünde bulunduruldunda, PDQuest programının yaptığı analizlerde eşit varyans varsayımını kabul ettiği sonucu çıkmaktadır. SPSS verileriyle PDQuest programı arasında sadece SSP 4303 numaralı protein kümesinde bir uyumsuzluk görülmüştür. Bu protein kümesi PDQuest programında logaritmik düzeltmeli t-testinde anlamlı olarak bulunurken, SPSS programından alınan p değeri 0.05 ten büyük çıkmıştır (Çizelge 4. 5). Đstatistiksel olarak anlamlı bulunan protein kümeleri arasında, M. l. obtusa zehrinde ifade olup M. l. lebetina da ifadesi olmayan/çok az olan ph 6.2, 23 kda civarındaki bir ve ph 7, 17 kda civarındaki iki protein kümesi dikkati çekmektedir (Şekil 4. 4). Đstatistiksel testlerde anlamlı bulunan 15 protein kümesinin her biri için tekrarlı jellerde görünümleri, 3 boyutlu gösterimleri ve yoğunluk (PDQuest ham verisi) bar grafikleri Şekil da verilmiştir. Şekil M. l. obtusa (A) ve M. l. lebetina (B) zehirlerinin 2 boyutlu jel elektroforezi ile elde edilmiş protein profilleri ve bazı önemli protein ifade farklılıklarının 3 boyutlu gösterimleri 39

59 Çizelge PDQuest programında yapılan üç istatistiksel analize göre anlamlı bulunan 15 protein kümesinin programdan alınan yoğunluk değerlerinin SPSS programına girilip tekrar t- testi ve Levene testi yapılmasıyla elde edilen p değerleri (%95 güven aralığında anlamlı çıkan p değerleri koyu olarak gösterilmiştir) SSP No./ Spot No. Tekrarlı jellerdeki yoğunluk değerleri Levene testi p değeri T-testi p değeri (varyanslar eşit değil varsayımı) T-testi p değeri (varyanslar eşit varsayımı) M. l. obtusa M. l. lebetina 0604/ / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / /

60 Çizelge PDQuest programında yapılan üç istatistiksel analize göre anlamlı bulunan 15 protein kümesinin programdan alınan yoğunluk değerlerinin SPSS programına girilip logaritmik düzeltmenin ardından tekrar t-testi ve Levene testi yapılmasıyla elde edilen p değerleri (%95 güven aralığında anlamlı çıkan p değerleri koyu olarak gösterilmiştir) SSP No./ Spot No. Tekrarlı jellerdeki logaritmik düzeltmeli yoğunluk değerleri Levene testi p değeri T-testi p değeri (varyanslar eşit değil varsayımı) T-testi p değeri (varyanslar eşit varsayımı) M. l. obtusa M. l. lebetina 0604/ / / / / / / / / / / / / / /37 5,233633/ 4, ,02771/ 5, ,538921/ 6, ,272085/ 5, ,782271/ 5, ,256287/ 5, ,499082/ 5, ,690928/ 4, ,554814/ 4, ,851818/ 5, ,484353/ 5, ,414843/ 5, ,261632/ 5, ,272112/ 6, ,924319/ 5, / ,481459/ 5, ,780833/ 5, ,758599/ 5, ,93818/ 5, / / 4, / / ,585783/ 5, / 3, / / ,439283/ 5, ,274056/ 5,

61 Şekil numaralı protein kümesinin tekrar jellerindeki büyütülmüş görünümleri, üç boyutlu gösterimleri ve yoğunluk bar grafikleri Şekil numaralı protein kümesinin tekrar jellerindeki büyütülmüş görünümleri, üç boyutlu gösterimleri ve yoğunluk bar grafikleri 42

62 Şekil numaralı protein kümesinin tekrar jellerindeki büyütülmüş görünümleri, üç boyutlu gösterimleri ve yoğunluk bar grafikleri Şekil numaralı protein kümesinin tekrar jellerindeki büyütülmüş görünümleri, üç boyutlu gösterimleri ve yoğunluk bar grafikleri 43

63 Şekil numaralı protein kümesinin tekrar jellerindeki büyütülmüş görünümleri, üç boyutlu gösterimleri ve yoğunluk bar grafikleri Şekil numaralı protein kümesinin tekrar jellerindeki büyütülmüş görünümleri, üç boyutlu gösterimleri ve yoğunluk bar grafikleri 44

64 Şekil numaralı protein kümesinin tekrar jellerindeki büyütülmüş görünümleri, üç boyutlu gösterimleri ve yoğunluk bar grafikleri Şekil numaralı protein kümesinin tekrar jellerindeki büyütülmüş görünümleri, üç boyutlu gösterimleri ve yoğunluk bar grafikleri 45

65 Şekil numaralı protein kümesinin tekrar jellerindeki büyütülmüş görünümleri, üç boyutlu gösterimleri ve yoğunluk bar grafikleri Şekil numaralı protein kümesinin tekrar jellerindeki büyütülmüş görünümleri, üç boyutlu gösterimleri ve yoğunluk bar grafikleri 46

66 Şekil numaralı protein kümesinin tekrar jellerindeki büyütülmüş görünümleri, üç boyutlu gösterimleri ve yoğunluk bar grafikleri Şekil numaralı protein kümesinin tekrar jellerindeki büyütülmüş görünümleri, üç boyutlu gösterimleri ve yoğunluk bar grafikleri 47

67 Şekil numaralı protein kümesinin tekrar jellerindeki büyütülmüş görünümleri, üç boyutlu gösterimleri ve yoğunluk bar grafikleri Şekil numaralı protein kümesinin tekrar jellerindeki büyütülmüş görünümleri, üç boyutlu gösterimleri ve yoğunluk bar grafikleri 48

68 Şekil numaralı protein kümesinin tekrar jellerindeki büyütülmüş görünümleri, üç boyutlu gösterimleri ve yoğunluk bar grafikleri Peptit Kütle Parmak Đzi Yöntemi ile Protein Tanımlanması MALDI-TOF kütle spektrometresinde beş peptit karışımı ile dış kalibrasyon sağlanmış, daha sonra tekrar beş peptit okutularak ölçümün doğruluğu görülmüş (Şekil 4. 20) ve ardından örnek kuyucuklarından peptit m/z değerleri elde edilmiştir. Şekil MALDI-TOF kütle spektrometresinin beş peptit karışımı ile kalibrasyonundan sonra elde edilen beş peptit m/z değerleri 49

69 Protein tanımlaması için kullanılan Mascot arama motoruyla ve ayrıca oluşturulan zehir veri tabanında arama yapılan PLGS programıyla verimli bir tanımlama yapılamamıştır. Ancak Aldente arama motorunda Other Vertebrata şeklinde yapılan kısıtlama sonucunda anlamlı sonuçlar bulunmuştur, bu nedenle Aldente arama motoruyla yapılan PMF analizleri sonucunda tanımlanabilen proteinler verilmiştir. PMF ile tanımlanan proteinlerin jelde bulunduğu yere ait numaralar Şekil de gösterilmiştir. Şekil M. l. obtusa zehrinden elde edilen iki boyutlu jel görüntüsü üzerinde protein kümelerinin numaralandırılması (kırmızıyla işaretlenenler ifade farklılıkları istatistiksel olarak anlamlı bulunan protein kümeleridir) MALDI-TOF kütle spektrometresinden elde edilen, M. l. obtusa zehrine ait peptit kütle değerlerinin UniprotKB/Swiss-Prot ve NCBI veritabanlarında Aldente arama motoru ile taranması sonucunda engerek zehirlerinden metalloproteaz, disintegrin/metalloproteaz (ADAM), serinproteaz, PLA 2, LAO, CLP, CRISP, NGF, vasküler endotelyal büyüme faktörü 50

70 (VEGF), disintegrin, hyaluronidaz ve tripsin inhibitörü olmak üzere 12 protein ailesinden varyant ve izoformlarıyla beraber toplam 117 protein tanımlanmıştır (farklı spotlardan tanımlanan aynı erişim numaralı proteinler tek olarak sayılmıştır) (Çizelge 4. 5, Şekil 4. 22). PLA 2, %48.7 bir yüzde ile tanımlanan proteinlerin büyük kısmını oluşturmuştur. Bunu %14.5 ile metalloproteazlar, %8.5 ile disintegrinler, %5.9 ile CLP ler, %4.2 ile ADAM 1 ve serin proteazlar, %3.4 ile NGF, %2.5 ile CRISP ve VEGF proteinleri, %1.7 ile hyaluronidaz, LAO ve tripsin inhibitörü takip etmektedir. Viperid zehirlerinden tanımlanan tüm proteinlerin listesi, erişim numaraları, deneysel ve teorik izoelektrik nokta (pi) ve moleküler ağırlıkları (Mw), Aldente skorları, eşleşen peptit sayıları ve dizi kapsama yüzdeleriyle birlikte Çizelge te verilmiştir. Çizelge Viperid zehirlerinden tanımlanan proteinlerin dâhil olduğu aileler ve toplam protein sayısına göre yüzdeleri Protein ailesi Tanımlanan protein sayısı Toplam protein sayısına göre yüzdesi (%) Fosfolipaz A 2 57* 48.7 Metalloproteaz Disintegrin C-tipi lektin Metalloproteaz/disintegrin Serin proteaz Sinir büyüme faktörü Sisteince zengin salgı proteini Vasküler endotelyal büyüme faktörü Hyaluronidaz L-amino asit oksidaz Tripsin inhibitörü TOPLAM 117 *27 si ammodytin in izoform ve varyantlarıdır. 1 ADAM proteinleri de aslında metalloproteazların bir grubu olarak ele alınmaktadır ancak bulundurdukları disintegrin domainleri nedeniyle farklı bir yapı sergiledikleri için ayrı olarak değerlendirilmiştir. 51

71 Şekil Viperid zehirlerinden tanımlanan proteinlerin yüzdelerine göre pasta dağılım grafikleri (ADAM: disintegrin/metalloproteaz, PLA2: fosfolipaz A 2, CRISP: sisteince zengin salgı proteini, VEGF: vasküler endotelyal büyüme faktörü, NGF: sinir büyüme faktörü, LAO: L-amino asit oksidaz) Ayrıca Elapid zehirlerinden 82, Colubrid (Liophis poecilogyrus, Philodryas olfersii, Boiga dendrophila, Rhabdophis tigrinus, Telescopus dhara ve Dispholidus typus türlerinden) zehirlerinden 8, deniz yılanı (Hydrophiinae, Enhydrina schistosa türünden) zehirlerinden 1 ve kertenkele (Varanus komodoensis, Varanus varius ve Heloderma horridum türlerinden) zehirlerinden 3 protein tanımlanmıştır (varyant ve izoformlarıyla beraber). Colubrid, Elapid, Hydrophid ve kertenkele zehirlerinden tanımlanan tüm proteinlerin listesi, erişim numaraları, deneysel ve teorik pi ve Mw leri, Aldente skorları, eşleşen peptit sayıları ve dizi kapsama yüzdeleriyle birlikte Ek 3 te verilmiştir. 52

72 Çizelge Aldente sonuçlarına göre Viperid (gerçek engerekler ve çıngıraklı yılanlar) zehirlerinde tanımlanan proteinlerin adları, erişim numaraları, teorik ve deneysel Mw ve pi ları, skorları, dizi kapsama yüzdeleri, peptit eşleşme sayıları ve bulunduğu organizma (teorik ve deneysel pi ve/veya moleküler ağırlıkları yaklaşık olanlar kalın olarak gösterilmiştir, Mw ve pi değerleri Aldente sonuçlarından alınmıştır) Protein adı Spot No. Erişim No. Teorik Mw(kDa)/ pi (ph) Metalloproteazlar Deneysel Mw(kDa)/ pi (ph) Skor Kaps. (%) Pep. Organizma Crotalus durissus Metalloprotease PII 32 C0L2T8 54/ / collilineatus Zinc metalloproteinase atroxase 58 Q / / Crotalus atrox Metalloprotease 28 Q9YI19 53/ / Agkistrodon halys pallas Group III snake venom metalloproteinase 46 Q2UXQ0 70/ / Echis ocellatus Group III snake venom metalloproteinase 40 Q2UXQ2 70/ / Echis ocellatus Group III snake venom metalloproteinase 40 Q2UXQ6 70/ / Echis ocellatus Metalloproteinase VMP-III 47 C9E1R6 68/ / Crotalus atrox Zinc metalloproteinase Bap1 (Hemorrhagic metalloproteinase BaP1) 72 P / / Bothrops asper Zinc metalloproteinase HT-2 (Hemorrhagic metalloproteinase HT-2) 18 P / / Crotalus ruber ruber Zinc metalloproteinase leucurolysin-b 19 P / / Bothrops leucurus 19 P / / Bothrops leucurus Crotalus molossus molossus Metalloproteinase 19 Q8JJ50 23/ / Zinc metalloproteinase atrolysin-c (Hemorrhagic metalloproteinase atrolysin C) Coagulation factor X-activating enzyme heavy chain (chain alpha) 26 Q / / Crotalus atrox 58 Q7T046 47/ / Vipera lebetina 53

73 Çizelge Devam 58 Q7T046 47/ / Vipera lebetina Crotastatin-1 13 C5H5D1 46/ / Crotalus durissus cascavella Crotastatin 13 Q076D1 47/ / Crotalus durissus terrificus Lachestatin-2 69 C5H5D6 47/ / Lachesis muta rhombeata Adamalysin II 3 Q7LZP2 23/ / Crotalus adamanteus Aminopeptidase A 17 A5HUI5 110/ / Agkistrodon halys brevicaudus Atrolysin e 60 Q / / Trimeresurus mucrosquamatus Zinc metalloproteinase/disintegrin (metalloproteinase ve disintegrin) Metalloproteaz/Disintegrinler 68 Q1PBD1 9/ / Agkistrodon halys pallas Zinc metalloproteinase-disintegrin ACLD 69 O / / Zinc metalloproteinase-disintegrin brevilysin-h6 (p45k ve Disintegrin p29k) Zinc metalloproteinase/disintegrin (Metalloproteinase-4 ve Disintegrin bitisgabonin) Zinc metalloproteinase/disintegrin (Hemorrhagic metalloproteinase HR1a ve Disintegrin-like 1a) 47 P0C7B0 47/ / Agkistrodon contortrix laticinctus Agkistrodon halys brevicaudus 42 Q6T271 8/ / Bitis gabonica 66 Q8JIR2 23/ / Trimeresurus flavoviridis 54

74 Çizelge Devam Serin proteazlar Venom serine protease 1 homolog 67 Q8AY82 26/ / Trimeresurus stejnegeri Serine proteinase isoform 3 35 B0VXT5 28/ / Sistrurus catenatus edwardsii Snake venom serine protease homolog 29 B0ZT25 26/ / Trimeresurus jerdonii Venom serine proteinase-like protein 1 29 Q6T6S7 26/ / Bitis gabonica Kallikrein-Cau2 34 A7X4W0 13/ / Causus rhombeatus Ancrod (Venombin-A, Protein C Agkistrodon contortrix 31 P / / activator) contortrix Fosfolipaz A 2 Phospholipase A2 66 P / / Bothrops asper Phospholipase A2 11 B0LSF6 16/ / Sistrurus catenatus catenatus PLA Q4QT02 16/ / Bitis arietans Phospholipase A2, basic 2 68 P / / Trimeresurus stejnegeri Phospholipase A2 54 Q2PG83 15/ / Trimeresurus elegans K49 phospholipase A2-like 64 Q2YHJ4 16/ / Trimeresurus borneensis K49b phospholipase A2-like 26 Q2YHJ8 16/ / Trimeresurus puniceus Phospholipase A2 isozyme CTs-K49b 64 Q6H3D1 14/ / Trimeresurus stejnegeri Phospholipase A2 homolog PLA Q / / Trimeresurus okinavensis Basic phospholipase A2 72 A8CG89 16/ / Daboia russellii 19 A8CG82 16/ / Daboia russelli siamensis Phospholipase A2 isozyme PL-X 72 P / / Trimeresurus flavoviridis Phospholipase A2 isozyme PLA-A, basic 72 P / / Trimeresurus flavoviridis Phospholipase A2 isozyme PLA-B, basic 72 P / / Trimeresurus flavoviridis Phospholipase A2-II 72 Q2ES53 16/ / Daboia russelli russelli 25 Q2ES53 16/ / Daboia russelli russelli 55

75 Çizelge Devam 19 Q2ES53 16/ / Daboia russelli russelli Phospholipase A2 39 B6CQR5 15/ / Vipera lebetina Phospholipase A C3W4R6 16/ / Vipera lebetina Phospholipase A2 F6a (Crotoxin-B) 40 P0CAS2 14/ / Crotalus durissus collilineatus Phospholipase A2 isozyme VP7 40 Q9PWR6 14/ / Vipera palaestinae Phospholipase A2 homolog VP8 40 Q9YGJ7 14/ / Vipera palaestinae Phospholipase A2 Cdr-12 8 P0CAS3 14/ / Crotalus durissus ruruima Phospholipase A2 Cdr-13 8 P0CAS4 14/ / Crotalus durissus ruruima Phospholipase A2 VRV-PL-V 8 P / / Daboia russelli russelli Phospholipase A2 3 8 P / / Daboia russelli russelli Phospholipase A2 LmTX-I 50 P0C942 14/ / Lachesis muta muta Phospholipase A2 LmTX-II 50 P0C943 14/ / Lachesis muta muta Phospholipase A2 CB1 (Crotoxin basic Crotalus durissus 50 P / / chain 1) terrificus Phospholipase A2 Mtx-b (Mojave toxin Crotalus scutulatus 50 P / / basic chain) scutulatus Phospholipase A2 isozyme A (Crotoxin Crotalus durissus 50 P / / basic chain 1) ruruima Phospholipase A2 SpII RP4 50 P / / Bothrops alternatus Phospholipase A2 homolog Cax-K49 61 Q8UVZ7 14/ / Crotalus atrox Phospholipase A2 ammodytin I1 17 Q1RP80 14/ / Vipera nikolskii Ammodytin I1(B) isoform 17 Q6A3I8 14/ / Vipera ursinii 17 Q6A3I8 14/ / Vipera ursinii Ammodytin I1(B') variant 17 Q6A3K0 14/ / Vipera berus berus 17 Q6A3K0 14/ / Vipera berus berus 60 Q6A3K0 14/ / Vipera berus berus 60 Q6A3K0 14/ / Vipera berus berus 56

76 Çizelge Devam Ammodytin I1(A) variant 17 Q6A3M8 14/ / Vipera ammodytes ruffoi Ammodytin I1(B) isoform 17 Q6A3M9 14/ / Vipera ammodytes ruffoi 17 Q6A3M9 14/ / Vipera ammodytes ruffoi Ammodytin I1(A) isoform 17 Q6A3N0 14/ / Vipera ammodytes ruffoi Ammodytin L(2) variant 58 Q6A385 14/ / Vipera berus berus 58 Q6A385 14/ / Vipera berus berus Ammodytin I1 (C) variant 43 Q6A3F6 14/ / Vipera aspis aspis Ammodytin I1(C') isoform 43 Q6A3G1 14/ / Vipera aspis aspis Ammodytin I1(C) variant 43 Q6A3H2 14/ / Vipera aspis atra Ammodytin I1(C) isoform 43 Q6A3H4 14/ / Vipera aspis atra Ammodytin I1(C) isoform 43 Q6A3H6 14/ / Vipera aspis atra Ammodytin I1(F) isoform 43 Q6A3H7 14/ / Vipera aspis atra Ammodytin I1(C) variant 43 Q6A3H8 14/ / Vipera aspis aspis Ammodytin I1(C) variant 43 Q6A3I1 14/ / Vipera aspis aspis Ammodytin I1(C) isoform 43 Q6A3I3 14/ / Vipera aspis aspis Ammodytin I1(C) variant 43 Q6A3I4 14/ / Vipera aspis aspis Ammodytin I1(C) variant 43 Q6A3I6 14/ / Vipera aspis aspis Ammodytin I1(C) variant 43 Q6A3J0 14/ / Vipera berus berus Ammodytin I1(C) variant 43 Q6A3J2 14/ / Vipera berus berus Ammodytin I1(C) variant 43 Q6A3J3 14/ / Vipera berus berus Ammodytin I1(C) isoform 43 Q6A3J4 14/ / Vipera berus berus Ammodytin I1(E) variant 43 Q6A3K9 14/ / Vipera aspis aspis Ammodytin I1(E) variant 43 Q6A3L0 14/ / Vipera aspis aspis Ammodytin I1(E) isoform 43 Q6A3L1 14/ / Vipera aspis aspis Ammodytin L(1'') variant 39 Q6A373 14/ / Vipera ammodytes ammodytes 39 Q6A373 14/ / Vipera ammodytes ammodytes 57

77 Çizelge Devam Ammodytin I1(C) variant 34 Q6A3F7 14/ / Vipera aspis aspis Disintegrinler Leberagin-C 4 C0LZJ5 23/ / Disintegrin lebein-1-alpha (Platelet aggregation activation inhibitor) Disintegrin echistatin-alpha-1 (Platelet aggregation activation inhibitor Carinatin) Disintegrin echistatin-alpha-2 (Platelet aggregation activation inhibitor Carinatin) Macrovipera lebetina transmediterranea 11 P / / Vipera lebetina 43 P / / Echis carinatus 43 P / / Echis carinatus 34 P / / Echis carinatus 34 P / / Echis carinatus Disintegrin eristostatin 67 P0C6S4 6/ / Eristocophis macmahoni Disintegrin halysin (Platelet aggregation activation inhibitor) 68 P / / Disintegrin adinbitor 68 Q698K8 8/ / Agkistrodon halys blomhoffi Agkistrodon halys brevicaudus Disintegrin trigramin-beta-2 69 P / / Trimeresurus gramineus Disintegrin trigramin-beta-1 69 P / / Trimeresurus gramineus Disintegrin multisquamatin 34 P0C6R5 6/ / Echis multisquamatus Disintegrin VB7A 61 P0C6A6 7/ / Vipera berus berus Prepro-halystatin 68 Q / / Agkistrodon halys pallas Sisteince zengin salgı proteinleri Cysteine-rich venom protein presursor 7 B7FDI0 25/ / Vipera nikolskii Cysteine-rich venom protein 7 B7FDI1 25/ / Vipera berus 58

78 Çizelge Devam Cysteine-rich secretory protein 29 P / / Trimeresurus stejnegeri C-tipi lektinler C-type lectin A14 64 B4XSY9 15/ / Vipera lebetina C-type lectin A15 64 B4XSZ0 15/ / Vipera lebetina Factor X activator light chain 2 9 A9UKE2 18/ / Daboia russellii CHH-B subunit alpha 17 P / / Crotalus horridus horridus Botrocetin subunit alpha (Platelet coagglutinin) 4 P / / Bothrops jararaca Mamushigin subunit alpha 29 Q9YGG9 16/ / Agkistrodon halys blomhoffi BJcuL 3 Q6TRS6 16/ / Bothrops jararacussu Vasküler endotelyal büyüme faktörleri Vascular endothelial growth factor toxin 57 Q90X24 14/ / Bothrops insularis Vascular endothelial growth factor toxin Vascular endothelial growth factor toxin 41 Q6J936 14/ / Bothrops erythromelas 41 Q90X23 14/ / Bothrops jararaca Sinir büyüme faktörleri Nerve growth factor 34 B1Q3K2 27/ / Trimeresurus flavoviridis Venom nerve growth factor 34 P / / Vipera lebetina Venom nerve growth factor 34 Q90W38 14/ / Bothrops jararacussu 10 Q90W38 14/ / Bothrops jararacussu Crotalus durissus terrificus Venom nerve growth factor 10 Q9DEZ9 14/ /

79 Çizelge Devam Hyaluronidazlar Truncated hyaluronidase 41 A3QVP1 22/ / Bitis arietans Truncated hyaluronidase 41 A3QVP4 22/ / Echis carinatus sochureki L-amino asit oksidazlar L-amino oxidase 34 B5U6Y8 57/ / Echis ocellatus L-amino-acid oxidase 34 Q4F867 46/ / Daboia russelli siamensis Tripsin inhibitörleri Trypsin inhibitor C1 64 A8Y7N4 7/ / Daboia russelli siamensis Trypsin inhibitor C5 64 A8Y7N8 7/ / Daboia russelli siamensis 60

80 Engerek zehirlerinden tanımlanan protein ailelerinden, veri tabanında M. lebetina zehrinden tanımlanan ve diğer engerek zehirlerin tanımlanıp moleküler ağırlık ve ph ları uyumlu olan proteinlere ait MALDI-TOF spektrumları, eşleşeşen peptitler (modifikasyonlu durumlarıyla birlikte) ve bunların tüm dizi üzerindeki gösterimleri aşağıda verilmiştir (veriler Aldente sonuçlarından alınmıştır): Metalloproteazlar Zinc metalloproteinase leucurolysin-b (Spot no. 19, erişim no. P86092) Çizelge Zinc metalloproteinase leucurolysin-b proteini için eşleşen peptit kütleleri ve amino asit dizileri (Den: deneysel, Teo: teorik, Dev:, MC:, Da: Dalton, CAM: sistein karbamidometillenmesi, MSO: metionin oksidasyonu, P(ST): serin ve treonin fosforilasyonu, P(Y): tirozin fosforilasyonu) Den. Teo. Şiddet Delta Dev. MC Modifikasyonlar Pozisyon Dizi Şekil Zinc metalloproteinase leucurolysin-b proteini için eşleştirilen peptit kütlelerinin tüm amino asit dizisi üzerinde gösterimi (eşleşen bölgeler büyük ve mavi olarak gösterilmiştir) 61

81 Metalloproteinase (Spot no. 19, erişim no. Q8JJ50) Çizelge Metalloproteinase proteini için eşleşen peptit kütleleri ve amino asit dizileri (Kısaltmaların açıklamaları için Çizelge e bakınız) Den. Teo. Şiddet Delta Dev. MC Modifikasyonlar Pozisyon Dizi Şekil Metalloproteinase proteini için eşleştirilen peptit kütlelerinin tüm amino asit dizisi üzerinde gösterimi (eşleşen bölgeler büyük ve mavi olarak gösterilmiştir) Şekil numaralı protein kümesinden elde edilen triptik peptitlerin m/z değerleri arasındaki MALDI-TOF spektrumu Şekil numaralı protein kümesinden elde edilen triptik peptitlerin m/z değerleri arasındaki MALDI-TOF spektrumu 62

82 Zinc metalloproteinase atrolysin-c (Hemorrhagic metalloproteinase atrolysin C) (Spot no. 26, erişim no. Q90392) Çizelge Zinc metalloproteinase atrolysin-c proteini için eşleşen peptit kütleleri ve amino asit dizileri (Kısaltmaların açıklamaları için Çizelge e bakınız) Den. Teo. Şiddet Delta Dev. MC Modifikasyonlar Pozisyon Dizi Şekil Zinc metalloproteinase atrolysin-c proteini için eşleştirilen peptit kütlelerinin tüm amino asit dizisi üzerinde gösterimi (eşleşen bölgeler büyük ve mavi olarak gösterilmiştir) Şekil numaralı protein kümesinden elde edilen triptik peptitlerin m/z değerleri arasındaki MALDI-TOF spektrumu Şekil numaralı protein kümesinden elde edilen triptik peptitlerin m/z değerleri arasındaki MALDI-TOF spektrumu 63

83 Zinc metalloproteinase atroxase (Spot no. 58, erişim no. Q91401) Çizelge Zinc metalloproteinase atroxase proteini için eşleşen peptit kütleleri ve amino asit dizileri (Kısaltmaların açıklamaları için Çizelge e bakınız) Den. Teo. Şiddet Delta Dev. MC Modifikasyonlar Pozisyon Dizi Şekil Zinc metalloproteinase atroxase proteini için eşleştirilen peptit kütlelerinin tüm amino asit dizisi üzerinde gösterimi (eşleşen bölgeler büyük ve mavi olarak gösterilmiştir) Coagulation factor X-activating enzyme heavy chain (chain alpha) (Spot no. 58, erişim no. Q7T046) Çizelge Coagulation factor X-activating enzyme heavy chain proteini için eşleşen peptit kütleleri ve amino asit dizileri (Kısaltmaların açıklamaları için Çizelge e bakınız) Den. Teo. Şiddet Delta Dev. MC Modifikasyonlar Pozisyon Dizi Şekil Coagulation factor X-activating enzyme heavy chain proteini için eşleştirilen peptit kütlelerinin tüm amino asit dizisi üzerinde gösterimi (eşleşen bölgeler büyük ve mavi olarak gösterilmiştir) 64

84 Şekil numaralı protein kümesinden elde edilen triptik peptitlerin m/z değerleri arasındaki MALDI-TOF spektrumu Şekil numaralı protein kümesinden elde edilen triptik peptitlerin m/z değerleri arasındaki MALDI-TOF spektrumu Metalloproteaz/Disintegrinler Zinc metalloproteinase/disintegrin bitisgabonin (Spot no. 42, erişim no. Q6T271) Çizelge Zinc metalloproteinase/disintegrin bitisgabonin proteini için eşleşen peptit kütleleri ve amino asit dizileri (Kısaltmaların açıklamaları için Çizelge e bakınız) Den. Teo. Şiddet Delta Dev. MC Modifikasyonlar Pozisyon Dizi 65

85 Şekil Zinc metalloproteinase/disintegrin bitisgabonin proteini için eşleştirilen peptit kütlelerinin tüm amino asit dizisi üzerinde gösterimi (eşleşen bölgeler büyük ve mavi olarak gösterilmiştir) Şekil numaralı protein kümesinden elde edilen triptik peptitlerin m/z değerleri arasındaki MALDI-TOF spektrumu Serin proteazlar Snake venom serine protease homolog (Spot No. 29, erişim no. B0ZT25) Çizelge Snake venom serine protease homolog proteini için eşleşen peptit kütleleri ve amino asit dizileri (Kısaltmaların açıklamaları için Çizelge e bakınız) Den. Teo. Şiddet Delta Dev. MC Modifikasyonlar Pozisyon Dizi Şekil Snake venom serine protease homolog proteini için eşleştirilen peptit kütlelerinin tüm amino asit dizisi üzerinde gösterimi (eşleşen bölgeler büyük ve mavi olarak gösterilmiştir) 66

86 Venom serine proteinase-like protein 1 (Spot No. 29, erişim no. Q6T6S7) Çizelge Venom serine proteinase-like protein 1 proteini için eşleşen peptit kütleleri ve amino asit dizileri (Kısaltmaların açıklamaları için Çizelge e bakınız) Den. Teo. Şiddet Delta Dev. MC Modifikasyonlar Pozisyon Dizi Şekil Venom serine proteinase-like protein 1 proteini için eşleştirilen peptit kütlelerinin tüm amino asit dizisi üzerinde gösterimi (eşleşen bölgeler büyük ve mavi olarak gösterilmiştir) Şekil numaralı protein kümesinden elde edilen triptik peptitlerin m/z değerleri arasındaki MALDI-TOF spektrumu Şekil numaralı protein kümesinden elde edilen triptik peptitlerin m/z değerleri arasındaki MALDI-TOF spektrumu 67

87 Ancrod (Spot no. 31, erişim no. P09872) Çizelge Ancrod proteini için eşleşen peptit kütleleri ve amino asit dizileri (Kısaltmaların açıklamaları için Çizelge e bakınız) Den. Teo. Şiddet Delta Dev. MC Modifikasyonlar Pozisyon Dizi Şekil Ancrod proteini için eşleştirilen peptit kütlelerinin tüm amino asit dizisi üzerinde gösterimi (eşleşen bölgeler büyük ve mavi olarak gösterilmiştir) Şekil numaralı protein kümesinden elde edilen triptik peptitlerin m/z değerleri arasındaki MALDI-TOF spektrumu Şekil numaralı protein kümesinden elde edilen triptik peptitlerin m/z değerleri arasındaki MALDI-TOF spektrumu 68

88 Sisteince zengin salgı proteinleri Cysteine-rich secretory protein (Spot No. 29, erişim no. P60623) Çizelge Cysteine-rich secretory protein proteini için eşleşen peptit kütleleri ve amino asit dizileri (Kısaltmaların açıklamaları için Çizelge e bakınız) Den. Teo. Şiddet Delta Dev. MC Modifikasyonlar Pozisyon Dizi Şekil Cysteine-rich secretory protein proteini için eşleştirilen peptit kütlelerinin tüm amino asit dizisi üzerinde gösterimi (eşleşen bölgeler büyük ve mavi olarak gösterilmiştir) Đlgili protein kümesinin MALDI-TOF spektrumu için Şekil ve a bakınız. L-amino asit oksidazlar L-amino-acid oxidase (Spot no. 34, erişim no. Q4F867) Çizelge L-amino-acid oxidase proteini için eşleşen peptit kütleleri ve amino asit dizileri (Kısaltmaların açıklamaları için Çizelge e bakınız) Den. Teo. Şiddet Delta Dev. MC Modifikasyonlar Pozisyon Dizi Şekil L-amino-acid oxidase proteini için eşleştirilen peptit kütlelerinin tüm amino asit dizisi üzerinde gösterimi (eşleşen bölgeler büyük ve mavi olarak gösterilmiştir) 69

89 Şekil numaralı protein kümesinden elde edilen triptik peptitlerin m/z değerleri arasındaki MALDI-TOF spektrumu Şekil numaralı protein kümesinden elde edilen triptik peptitlerin m/z değerleri arasındaki MALDI-TOF spektrumu Fosfolipaz A 2 ler Phospholipase A2 (Spot no. 39, erişim no. B6CQR5) Çizelge Phospholipase A2 proteini için eşleşen peptit kütleleri ve amino asit dizileri (Kısaltmaların açıklamaları için Çizelge e bakınız) Den. Teo. Şiddet Delta Dev. MC Modifikasyonlar Pozisyon Dizi 70

90 Şekil Phospholipase A2 proteini için eşleştirilen peptit kütlelerinin tüm amino asit dizisi üzerinde gösterimi (eşleşen bölgeler büyük ve mavi olarak gösterilmiştir) Şekil numaralı protein kümesinden elde edilen triptik peptitlerin m/z değerleri arasındaki MALDI-TOF spektrumu Şekil numaralı protein kümesinden elde edilen triptik peptitlerin tekrar kuyucuğundan m/z değerleri arasında elde edilen MALDI-TOF spektrumu 71

91 Phospholipase A2 homolog VP8 (Spot no. 40, erişim no. Q9YGJ7) Çizelge Phospholipase A2 homolog VP8 proteini için eşleşen peptit kütleleri ve amino asit dizileri (Kısaltmaların açıklamaları için Çizelge e bakınız) Den. Teo. Şiddet Delta Dev. MC Modifikasyonlar Pozisyon Dizi Şekil Phospholipase A2 homolog VP8 proteini için eşleştirilen peptit kütlelerinin tüm amino asit dizisi üzerinde gösterimi (eşleşen bölgeler büyük ve mavi olarak gösterilmiştir) Şekil numaralı protein kümesinden elde edilen triptik peptitlerin m/z değerleri arasındaki MALDI-TOF spektrumu Şekil numaralı protein kümesinden elde edilen triptik peptitlerin m/z değerleri arasındaki MALDI-TOF spektrumu 72

92 Şekil numaralı protein kümesinden elde edilen triptik peptitlerin tekrar kuyucuğundan m/z değerleri arasınde elde edilen MALDI-TOF spektrumu Şekil numaralı protein kümesinden elde edilen triptik peptitlerin tekrar kuyucuğundan m/z değerleri arasında elde edilen MALDI-TOF spektrumu Ammodytin I1 C variant (Spot no. 43, erişim no. Q6A3F6) Çizelge Ammodytin I1 C variant proteini için eşleşen peptit kütleleri ve amino asit dizileri (Kısaltmaların açıklamaları için Çizelge e bakınız) Den. Teo. Şiddet Delta Dev. MC Modifikasyonlar Pozisyon Dizi 73

93 Şekil Ammodytin I1 C variant proteini için eşleştirilen peptit kütlelerinin tüm amino asit dizisi üzerinde gösterimi (eşleşen bölgeler büyük ve mavi olarak gösterilmiştir) Şekil numaralı protein kümesinden elde edilen triptik peptitlerin m/z değerleri arasındaki MALDI-TOF spektrumu Şekil numaralı protein kümesinden elde edilen triptik peptitlerin m/z değerleri arasındaki MALDI-TOF spektrumu 74

94 Disintegrinler Disintegrin echistatin (Spot no. 43, erişim no. P17347) Çizelge Disintegrin echistatin proteini için eşleşen peptit kütleleri ve amino asit dizileri (Kısaltmaların açıklamaları için Çizelge e bakınız) Den. Teo. Şiddet Delta Dev. MC Modifikasyonlar Pozisyon Dizi Şekil Disintegrin echistatin proteini için eşleştirilen peptit kütlelerinin tüm amino asit dizisi üzerinde gösterimi (eşleşen bölgeler büyük ve mavi olarak gösterilmiştir) Đlgili protein kümesinin MALDI-TOF spektrumu için Şekil ve ye bakınız. Leberagin-C (Spot no. 4, erişim no. C0LZJ5) Çizelge Leberagin-C proteini için eşleşen peptit kütleleri ve amino asit dizileri (Kısaltmaların açıklamaları için Çizelge e bakınız) Den. Teo. Şiddet Delta Dev. MC Modifikasyonlar Pozisyon Dizi Şekil Leberagin-C proteini için eşleştirilen peptit kütlelerinin tüm amino asit dizisi üzerinde gösterimi (eşleşen bölgeler büyük ve mavi olarak gösterilmiştir) 75

95 Şekil numaralı protein kümesinden elde edilen triptik peptitlerin m/z değerleri arasındaki MALDI-TOF spektrumu Şekil numaralı protein kümesinden elde edilen triptik peptitlerin m/z değerleri arasındaki MALDI-TOF spektrumu Disintegrin lebein-1-alpha (Spot no. 11, erişim no. P83253) Çizelge Disintegrin lebein-1-alpha proteini için eşleşen peptit kütleleri ve amino asit dizileri (Kısaltmaların açıklamaları için Çizelge e bakınız) Den. Teo. Şiddet Delta Dev. MC Modifikasyonlar Pozisyon Dizi Şekil Disintegrin lebein-1-alpha proteini için eşleştirilen peptit kütlelerinin tüm amino asit dizisi üzerinde gösterimi (eşleşen bölgeler büyük ve mavi olarak gösterilmiştir) 76

96 Şekil numaralı protein kümesinden elde edilen triptik peptitlerin m/z değerleri arasındaki MALDI-TOF spektrumu Şekil numaralı protein kümesinden elde edilen triptik peptitlerin m/z değerleri arasındaki MALDI-TOF spektrumu C-tipi lektinler Mamushigin subunit alpha (Spot no. 29, erişim no. Q9YGG9) Çizelge Mamushigin subunit alpha proteini için eşleşen peptit kütleleri ve amino asit dizileri (Kısaltmaların açıklamaları için Çizelge e bakınız) Den. Teo. Şiddet Delta Dev. MC Modifikasyonlar Pozisyon Dizi 77