KOLİN TAYİNİ İÇİN POLİPİROL-POLİVİNİLSÜLFONAT FİLME KOLİN OKSİDAZ ENZİMİNİN İMMOBİLİZASYONU İLE BİYOSENSÖR HAZIRLANMASI.

Transkript

1 KOLİN TAYİNİ İÇİN POLİPİROL-POLİVİNİLSÜLFONAT FİLME KOLİN OKSİDAZ ENZİMİNİN İMMOBİLİZASYONU İLE BİYOSENSÖR HAZIRLANMASI Merve ÖZDEMİR YÜKSEK LİSANS TEZİ KİMYA GAZİ ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ OCAK 2012 ANKARA

2 Merve ÖZDEMİR tarafından hazırlanan KOLİN TAYİNİ İÇİN POLİPİROL- POLİVİNİL SÜLFONAT FİLME KOLİN OKSİDAZ ENZİMİNİN İMMOBİLİZASYONU İLE BİYOSENSÖR HAZIRLANMASI adlı bu tezin Yüksek Lisans tezi olarak uygun olduğunu onaylarım. Doç. Dr. Fatma ARSLAN Tez Danışmanı, Kimya Anabilim Dalı. Bu çalışma, jürimiz tarafından oy birliği ile Kimya Anabilim Dalında Yüksek Lisans tezi olarak kabul edilmiştir. Prof. Dr. Ahmet YAŞAR Kimya Anabilim Dalı, Gazi Üniversitesi. Doç. Dr. Fatma ARSLAN Kimya Anabilim Dalı, Gazi Üniversitesi. Doç. Dr. Emel EMREGÜL Kimya Anabilim Dalı, Ankara Üniversitesi. Tarih: 18/01/2012 Bu tez ile G.Ü. Fen Bilimleri Enstitüsü Yönetim Kurulu Yüksek Lisans derecesini onaylamıştır. Prof. Dr. Bilal TOKLU Fen Bilimleri Enstitüsü Müdürü.

3 TEZ BİLDİRİMİ Tez içindeki bütün bilgilerin etik davranış ve akademik kurallar çerçevesinde elde edilerek sunulduğunu, ayrıca tez yazım kurallarına uygun olarak hazırlanan bu çalışmada bana ait olmayan her türlü ifade ve bilginin kaynağına eksiksiz atıf yapıldığını bildiririm. Merve ÖZDEMİR

4 iv KOLİN TAYİNİ İÇİN POLİPİROL-POLİVİNİLSÜLFONAT FİLME KOLİN OKSİDAZ ENZİMİNİN İMMOBİLİZASYONU İLE BİYOSENSÖR HAZIRLANMASI (Yüksek Lisans Tezi) Merve ÖZDEMİR GAZİ ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ Ocak 2012 ÖZET Bu çalışmada kolin tayini için yeni bir enzim elektrot geliştirildi. Enzim elektrot Pt yüzeyde pirolün polivinilsülfonat varlığında elektrokimyasal olarak polimerleşmesi sırasında kolin oksidaz enziminin tutuklanarak immobilize edilmesiyle hazırlandı. Kolin oksijenli ortamda kolin oksidaz enzimi aracılığıyla betaine yükseltgenir. Reaksiyon sonucunda betain yanında hidrojen peroksit oluşur. Kolin tayini, oluşan hidrojen peroksidin 0,30 V da elektrot yüzeyinde yükseltgenmesine dayanılarak yapıldı. Hazırlanan biyosensörün kolin tayini için çalışma aralığı belirlendi. Biyosensör cevabına ph nın ve sıcaklığın etkisi araştırıldı. Biyosensörün tekrar kullanılabilirliği ve raf ömrü tayin edildi. Biyolojik ortamlarda olabilecek girişimlerin biyosensör cevabı üzerine etkileri incelendi. Bilim Kodu : Anahtar Kelimeler : Kolin, Kolin oksidaz, biyosensör, polipirol polivinilsülfonat Sayfa adedi : 90 Tez yöneticisi : Doç. Dr. Fatma ARSLAN

5 v PREPARING A BIOSENSOR FOR CHOLİNE DETERMINATION BY IMMOBILIZATION OF CHOLİNE OXIDASE IN POLYPYROL-POLYVINYLSULPHONATE FILM (M. Sc. Thesis) Merve ÖZDEMİR GAZI UNIVERSITY INSTUTE OF SCIENCE AND TECHNOLOGY January 2012 ABSTRACT İn this study; new enzyme electrode was developed on the purpose of quantitative analysis of choline. The enzyme electrode was prepared by entrapping choline oxidase in polypyrole meanwhile pyrol was being polimerised electrochemically in the presence of polyvinylsulphonate on the platine surface. Choline is oxidased to betain and hydrogen peroxide by choline oxidase in the presence of oxygen. An anodic current related to choline concentration is obtained as a result of electrochemical oxidation of hydrogen peroxide produced on the electrode at 0,30 V. This is the working principle of the electrode. The linear working range for choline determinetion of biosensor was identified. The effects of ph and temperature on the response of the biosensor were examined. Reusability and storage stability of the biosensor were determined. Interference effects of interferants which might be in biologic media on the response of the biosensor were also studied. Science Code : Key Words : Choline, Choline oxidase, biosensor, polypyrol, polyvinylsulphonate Page Number : 90 Adviser : Assoc. Prof. Dr. Fatma ARSLAN

6 vi TEŞEKKÜR Çalışmalarım süresince bilgi birikimi ve tecrübesi ile beni yönlendiren, desteğini esirgemeyen ve sürekli cesaretlendiren değerli hocam Sayın Doç. Dr. Fatma ARSLAN a en içten teşekkürlerimi sunarım. Çalışmamın en başından itibaren yanımda olan, deneyimlerini paylaşan Sayın Yrd. Doç. Dr. Halit ARSLAN a, Sayın Prof. Dr. Ahmet YAŞAR a ve Sayın Yrd. Doç. Dr. Servet ÇETE ye, çok değerli çabaları, yol göstericiliği ve samimiyeti için teşekkür ederim. Arkadaşlarım, Arş. Gör. Özlem ÇOLAK, Mustafa GÖRGÜLÜ, Arş. Gör. Demet UZUN, ve Selvin USTABAŞ a deneysel çalışmalar sırasındaki yardımları ve daha da önemlisi değerli dostlukları için; annesiyle geçirebileceği kısacık zaman dilimini şikayet etmeden benimle paylaşan sevgili Alper ARSLAN a teşekkür ederim. Tüm yaşamım boyunca maddi ve manevi desteklerini hiçbir zaman esirgemeyen çok sevdiğim canım anneme, kardeşime, babama; beni sabırla dinleyen, her anımda yanımda olan değerli hocam Arş. Gör. Şaban KESKİN e ve gizli kahramanlara teşekkürlerimi sunarım.

7 vii İÇİNDEKİLER Sayfa ÖZET... iv ABSTRACT... v TEŞEKKÜR... vi İÇİNDEKİLER... vii ÇİZELGELERİN LİSTESİ... xi ŞEKİLLERİN LİSTESİ... xii 1. GİRİŞ GENEL BİLGİLER Enzimler Kolin Oksidaz Enziminin Özellikleri Biyosensörler Biyobileşenler Biyosensörlerin Çalışma Mekanizması Algılayıcılar (Transduserler) Biyosensör dizaynında dikkat edilmesi gerekenler Biyosensörlerde biyoaktif bileşen immobilizasyon Yöntemleri Enzim immobilizasyon metodları Elektrokimyasal esaslı biyosensörler İletken polimerler Pirol... 33

8 viii Sayfa Pirolün elektrokimyasal polimerizasyonu Enzim sensörleri Genel çalışma ilkesi Performans Faktörleri Seçicilik Kullanım ömrü Kalibrasyon gereksinmesi Tekrarlanabilirlik Kararlılık Yüksek duyarlılık Yeterli düzeyde tayin sınırı Geniş ölçüm aralığı Hızlı cevap zamanı Basitlik ve ucuzluk Kaynak araştırması DENEYSEL KISIM Cihazlar ve Malzemeler Elektrokimyasal analiz cihazı Hücre ve elektrotlar ph metre Su banyosu Mikro pipet... 49

9 ix Sayfa Argon gazı Saf su cihazı Kullanılan Reaktifler ve Özellikleri Kullanılan çözeltiler Platin Yüzeye Polipirol-polivinilsülfonat Kaplanması Enzim elektrodun hazırlanması Hapsetme Yöntemiyle İmmobilizasyon Çapraz Bağlama Yöntemiyle immobilizasyon Platin/Polipirol-polivinilsülfonat elektrodun Hidrojen Perokside duyarlılığının belirlenmesi Platin/Polipirol-polivinilsülfonat elektrodun serbest enzimin bulunduğu çözeltide koline duyarlılığının belirlenmesi ve enzim elektrodun koline duyarlılığının belirlenmesi Platin/Polipirol-polivinilsülfonat elektrodun serbest enzimin bulunduğu çözeltide karıştırma süresinin amperometrik cevaba etkisi Platin/Polipirol-Polivinilsülfonat elektrodunun serbest enzimin bulunduğu Çözeltide en iyi çalışma koşullarının ve enzim elektrodun en iyi Çalışma koşullarının belirlenmesi ph etkisi Sıcaklığın etkisi Substrat derişiminin etkisi Raf ömrünün belirlenmesi Tekrar kullanılabilirliğin belirlenmesi Biyosensör üzerine girişim yapan maddeler... 60

10 x Sayfa Biyolojik sıvıda (kanda) ve sentetik numunede kolin tayini SONUÇLAR ve TARTIŞMA Platin/Polipirol-polivinilsülfonat elektrodun H 2 O 2 duyarlılığının belirlenmesi Platin/Polipirol-polivinilsülfonat elektrodun serbest enzimin bulunduğu çözeltide koline duyarlılığının ve enzim elektrodun koline duyarlılığının belirlenmesi Platin/polipirol-polivinilsülfonat elektrodunun serbest enzimin bulunduğu çözeltide karıştırma süresinin amperometrik cevaba etkisinin belirlenmesi Platin/Polipirol-Polivinilsülfonat film üzerine Kolin Oksidazın çapraz bağlama ve tutuklama yöntemi ile immobilize edilmesiyle elde edilen sonuçların karşılaştırılması Platin/Polipirol-Polivinilsülfonat elektrodun serbest enzimin çözeltisinde ve enzim elektrodunun en iyi çalışma koşullarının belirlenmesi ph etkisi Sıcaklık etkisi Substrat derişiminin etkisi Platin/Polipirol-Polivinilsülfonat-Chox elektrodu için kalibrasyon grafiği çizilmesi Serbest kolin oksidaz ve enzim elektrodun raf ömrünün belirlenmesi Platin/Polipirol-Polivinilsülfonat-Chox elektrodunun tekrar kullanılabilirliğinin belirlenmesi Tasarlanan biyosensör üzerine girişim yapan maddeler Biyolojik sıvıda (kanda) ve sentetik numunede kolin tayini Sonuç... 82

11 xi Sayfa KAYNAKLAR ÖZGEÇMİŞ... 90

12 xii Çizelge ÇİZELGELERİN LİSTESİ Sayfa Çizelge 1.1. Kolin içeren bazı besinler... 2 Çizelge 2.1. Biyosensör algılayıcıları Çizelge 2.2. Enzim immobilizasyon yöntemleri Çizelge 2.3. Enzimin bağlanmasını sağlayan fonksiyonel gruplar Çizelge 2.4. İletken polimerler ve iletkenlikleri Çizelge 3.1. Çalışmada kullanılan kimyasal maddelerin adları, saflık dereceleri ve temin edildikleri firmalar Çizelge 4.1. Biyosensör üzerine (1x10 4 M kolin derişiminde) girişim yapan türler ve etkileri Çizelge 4.2. Sentetik numune değerleri Çizelge 4.3. Kan numunesi değerleri... 81

13 xiii ŞEKİLLERİN LİSTESİ Şekil Sayfa Şekil 1.1. İnsan vücudunda kolinin temel görevleri... 1 Şekil 1.2. Kolinin molekül yapısı... 2 Şekil 1.3. Kolin metabolizması... 3 Şekil 1.4. Kolinin betaine dönüşümü... 3 Şekil 2.1. Enzim aktifliğinin sıcaklığa bağlı değişimi... 8 Şekil 2.2. Enzim substrat ilişkisi (anahtar kilit modeli)... 9 Şekil 2.3. Uyumlu etkileşim modeli Şekil 2.4. Kolin oksidazın üç boyutlu yapısı Şekil 2.5. Biyosensörlerin bileşenleri Şekil 2.6. Biyosensörlerin çalışma mekanizması Şekil 2.7. Kovalent bağlama Şekil 2.8. Adsorpsiyon Şekil 2.9. İyonik bağlama Şekil Çapraz bağlama Şekil Polimer matrikste tutuklama Şekil Mikrokapsülleme Şekil Pirolün yükseltgenmesi Şekil Pirolün aktif noktaları Şekil Pirolün polimerizasyonuna ait mekanizma Şekil Biyosensör teknolojisinde kullanılan biyoaktif materyal sıralamasında enzimlerin yeri... 36

14 xiv Şekil Sayfa Şekil Enzim sensörlerinin genel şematik gösterimi Şekil 3.1. Kaplama ve ölçümde kullanılan hücre sistemi Şekil 4.1. Kolinin betaine yükseltgenmesi sırasında elektrot yüzeyinde gerçekleşen elektron aktarımları Şekil 4.2. Pt / Ppy PVS elektrodun H 2 O 2 ye duyarlılığı Şekil 4.3. Pt / Ppy PVS elektrodun koline duyarlılığı Şekil 4.4. Pt / Ppy PVS ChOx elektrodun koline karşı duyarlılığı Şekil 4.5. Karıştırma süresinin amperometrik tayine etkisi Şekil 4.6. Tutuklama (a), Çapraz bağlama (b) immobilizasyon tekniklerinin artan kolin derişimine karşı verdikleri amperometrik cevapların karşılaştırılması Şekil 4.7. Tutuklama yöntemi tekrarlanabilirliği Şekil 4.8. Glutaraldehit ile çapraz bağlama yöntemi tekralanabilirliği Şekil 4.9. Serbest kolin oksidaz aktivitesine ph etkisi Şekil İmmobilize kolin oksidaz aktivitesine ph etkisi Şekil Serbest kolin oksidaz aktivitesine sıcaklık etkisi Şekil İmmobilize kolin oksidaz aktivitesine sıcaklık etkisi Şekil Serbest kolin oksidaz için Arrhenius bağıntısına göre çizilen 1/T değerine karşı ln i grafiği Şekil İmmobilize kolin oksidaz için Arrhenius bağıntısına göre çizilen 1/T değerine karşı ln i grafiği Şekil Serbest kolin oksidaz için Michaelis Menten grafiği (0,1M ph 8,0 fosfat tamponu, 25 C) Şekil Pt/Ppy PVS ChOx için Michaelis Menten grafiği (0,1M ph 9,0 fosfat tamponu, 25 C)... 75

15 xv Şekil Sayfa Şekil Serbest kolin oksidaz için Lineweaver Burk grafiği (0,1M ph 9,0 fosfat tamponu, 25 C) Şekil Pt/Ppy PVS ChOx için Lineweaver Burk grafiği (0,1M ph 9,0 fosfat tamponu, 25 C) Şekil Kolin biyosensörü kalibrasyon grafiği (0,1M ph 9,0 fosfat tamponu, 25 C) Şekil Kolin biyosensörü kalibrasyon grafiği (0,1M ph 9,0 fosfat tamponu, 25 C) Şekil Serbest enzim raf ömrü Şekil Enzim elektrodun raf ömrünün incelenmesi Şekil Pt/Ppy PVS ChOx elektrodun tekrar kullanılabilirliğinin incelenmesi (0,1M ph 9,0 fosfat tamponu, 25 C) Şekil Kolin biyosensörü kalibrasyon grafiği (0,1M ph 9,0 fosfat tamponu, 25 C )... 81

16 1. GİRİŞ 1 Kolin (C 5 H 15 NO 2, MA: 121g/mol), hücre zarının önemli bileşenleri olan fosfoditilkolin ve sifingomiyelinin sentezinde öncü bir moleküldür. Kan ve karaciğerde trigliserit dönüşümünde önemli bir faktördür. Kolin metiyonin sentezinde önemli bir metil grubu vericisi olan ve plazma homosistein derişimini kontrol eden betaine metabolize olur. Ayrıca kolin bir nörotansmitter olan asetilkolin sentezinde öncü bir maddedir. Asetilkolin kolinerjik nöronların beyinde uygun fonksiyon göstermelerinde görev alır. Karaciğer ve kanda fosfolipit derişimi kontrolu KOLİN (Şekil 1.2) Fosfoditilkolin ve sifingomiyelin sentezi Asetilkolin sentezi Metil grubu vericisi Hücre mesajcılarının sentezi Şekil 1.1. İnsan vücudunda kolinin temel görevleri Kolin 1862 yılında keşfedilmesine rağmen 1998 yılında insanlar için temel gıda olarak sınıflandırıldı. Karaciğer, tavuk, yumurta, balık, süt, soya fasülyesi (Çizelge 1.1) gibi besinler kolin açısından oldukça zengindir. Food and Nutrition Board of the Institute of Medicine of the National Academy of Science ın verilerine göre günlük kolin alım miktarı erkekler için 550mg, bayanlar için 425mg, hamileler içinse 450mg olarak gösterilmiştir [1].

17 2 Şekil 1.2. Kolinin molekül yapısı Çizelge 1.1. Kolin içeren bazı besinler İnsanlarda kolince eksik beslenme, miyositlerde (kas hücresi) dirençsizliğin artışı [2] ve plazma homosistein derişiminin yükselmesinden dolayı [3] serumda kreatin fosfokinaz artışıyla ilişkilendirilir. Ayrıca, hayvanlar üzerinde yapılan çalışmalarda kolinin asetilkolin sentezinde görev aldığı ve kolince eksik beslenmenin beyinin hazıfa kısmınında fizyolojik ve psikolojik önemli sorunlar oluşumuna neden olduğu saptanmıştır [4-8]. Altmış yaşın üzerinde ilerleyici zihinsel işlev bozukluğunun en sık nedeni olan Alzheimer hastalığı (AH), kolinerjik eksiklik ile zihinsel işlev bozukluğunun başlangıcı, seyri ve derinliği arasında net ilişkinin kurulabildiği nörodejeneratif bir hastalıktır. Hastalığın kesin nedeni bilinmemektedir. Kolinerjik eksikliğin klinik tablo ile olan yakın ilişkisi nedeniyle asetilkolinin sinaptik aralıkta daha uzun kalmasını sağlamak, günümüzde hastalığın semptomatik tedavisinde en sık uygulanan yöntemdir [9]. Alzheimer hastalığının üzerinde yapılan

18 3 çalışmalar kolin eksikliğinde hastalığın oluşma riskinin oldukça yüksek olduğunu göstermektedir [10]. Şekil 1.3 membran fosfolipitlerinin, nörotransmitter asetilkolinin, metil grubu vericisi olarak betainin sentezinin ve fosfolipit sinyallerinin içerdiği kolin yan uçlarını göstermektedir. Şekil 1.3. Kolin metabolizması Kolin, kolin oksidaz enzimi ile betaine yükseltgenir. Bu reaksiyon sonucu oksijen harcanırken iki mol hidrojen peroksit açığa çıkar (Şekil 1.3). Şekil 1.4. Kolinin betaine dönüşümü Çalışmamızda koline duyarlı yeni bir amperometrik biyosensör hazırlandı. Bu amaçla Platin/Polipirol-polivinilsülfonat (Pt/Ppy - PVS) elektrodu pirolün elektropolimerleşmesiyle hazırlandı. Daha sonra kolin oksidazın hapsetme yöntemiyle immobilizasyonu sağlanarak Pt/Ppy - PVS-ChOx enzim elektrodu

19 4 elde edildi. Kolin tayini, enzimatik reaksiyon sonucu oluşan H 2 O 2 in 0,3 V elektrot potansiyelinde yükseltgenmesi esasına dayanılarak yapıldı. Enzim elektrodun en iyi çalışma koşulları belirlendi ve performansını etkileyen faktörler incelendi. Daha sonra biyolojik sıvılardaki indirgen türlerin tayin üzerine bozucu etkisi araştırılarak, elektrodun biyolojik sıvı ve sentetik numunedeki ölçüm performansı değerlendirildi.

20 5 2. GENEL BİLGİLER 2.1. Enzimler Enzimler, canlı organizmalardaki kimyasal reaksiyonları hızlandıran ve hiçbir yan ürün olmasına fırsat vermeden %100 lük bir ürün verimi sağlayan biyolojik katalizörlerdir. Katalitik RNA moleküllerinin (ribozimler) küçük bir grubu hariç olmak üzere bütün enzimler protein yapısındadır. Proteinlerin en büyük ve en çok özelleşmiş grubunu teşkil ederler. Canlıları oluşturan moleküller, yani, biyomoleküller kinetik yönden oldukça kararlı olup, kendiliğinden kolayca reaksiyon vermezler. Bir hücredeki tüm kimyasal olaylar enzimler vasıtasıyla gerçekleştirilir. Biyomoleküllerin kararlılığı şu önemli sonucu sağlamaktadır; hücre içinde enzimi olmayan bir reaksiyon hemen hemen vuku bulmaz, kendiliğinden reaksiyonlar meydana gelmez. Bunun anlamı, enzimler protein yapısında olduğu ve DNA tarafından şifrelendiği için, bir hücredeki tüm olaylar DNA seviyesinde düzenlenip, kontrol edilmektedir demektir. Buradan, enzimleri sadece katalizör özelliği ile nitelemenin eksik bir tanımlama olacağı anlaşılmaktadır. Gerçekten, bu moleküller, bir hücreyi diğerinden farklı kılan özelliklerine ait bilgilerin DNA dan aktarılmasının en önemli araçlarıdır. Biyokimya tarihinde araştırmaların büyük çoğunluğunu enzimler üzerindeki çalışmalar oluşturmuştur. Kataliz olayı ile ilgili ilk önemli denemeler yılları arasında midedeki enzimatik sindirim üzerinde yapılmıştır. Belirli bir enzim üzerindeki ilk çalışmayı 1835 yılında İsveçli bir kimyager olan S.S. Berzelius gerçekleştirmiş, diastazın nişastayı in vivo olarak sülfirik asitten daha yüksek verimde hidrolizlendiğini göstermiştir yılında L. Pasteur fermantasyon olayının enzimlerce yürütüldüğünü deneylerle ispat etmiş, bu yüzden enzimler için ferment terimi kullanılmaya başlanmıştır. Fakat, Pasteur enzimlerin yalnız canlı hücre yapısı içinde görev yapabildiklerini zannetmiştir.

21 6 Enzimoloji alanında şüphesiz en önemli gelişme, 1926 yılında, J.B Sumner in üreaz enzimini Jack bean bitkisinden elde edip, kristallendirdikten sonra protein yapısında bir bileşik olduğunu ortaya koymasıdır. Önceleri şüphe ile karşılanan bu sonuç, yılları arasında J. Northrop un pepsin, tripsin ve kimotripsin enzimlerini kristallendirmesi ve protein yapısında olduklarını kesin olarak ortaya koymasıyla doğrulanmıştır. Bugün yaklaşık 2000 kadar enzim tanımlanmış, birçoğu saf halde elde edilip kinetikleri incelenmiş ve 200 den fazlası da kristallendirilmiştir. Ancak yapılan genetik çalışmalar daha tespit edilmemiş birçok enzimin varlığını göstermektedir. Diğer proteinler gibi bazı enzimler de basit ve bileşik olarak sınıflandırılabilirler. Bazı enzimler katalizlenme fonksiyonlarını yalnız protein yapılarıyla yerine getirebilirken, bazıları da protein yapısında olmayan kofaktör denilen gruplara ihtiyaç duyarlar. Kofaktör bir metal iyonu olabileceği gibi, koenzim denilen kompleks bir organik bileşik de olabilir. Bazen aktivite için her ikisi de gerekebilir. Enzimler sıcaklıkla denatüre olurken, kofaktörler ısıya dayanıklıdırlar. Katalitik olarak aktif olan enzim kofaktör kompleksine holoenzim denilir. Kofaktörsüz proteine apoprotein, enzime ise apoenzim denir. Apoenzim, katalitik olarak inaktiftir. Kofaktörlü enzimlerin, bu bileşik veya metal iyonlarına karşı farklı derecelerde afiniteleri vardır. Çoğu zaman bu kofaktörler diyalizle uzaklaştırılabilir. Fakat bazı enzim kofaktör bağlanmaları kovalent yapıda veya diyalizle uzaklaştırılamayacak kadar sıkıdır. Bu kofaktörlere prostetik grup adı verilir. Örneğin sitokrom c deki hem grubu enzimin peptid zincirlerine kovalent bir bağla bağlıdır. Enzime gevşek olarak bağlanmış koenzimlerle enzim arasındaki etkileşmeler enzim substrat etkileşmelerine benzer. Reaksiyonlardan sonra enzimlerden ayrılarak bir başka metabolizma olayında yer alabilirler. Enzim aktivitesine etki eden faktörler substrat konsantrasyonu, enzim miktarı, ph, sıcaklık, iyonik şiddet, varsa kofaktör derişimi, inhibitör ve aktivatör

22 7 derişimleri olarak sıralanabilir. Her enzim için aktivitenin maksimum olduğu ph değerleri vardır. Bu değerlerin altında ve üstünde aktivite düşer. Bununla birlikte bütün enzimlerin ph aktivite eğrileri aynı şekilde değildir. ph aktivite ilişkisinde etkili olan bazı faktörler vardır bunlar: Substratı bağlanmada görev alan ve enzimin aktif bölgesinde bulunan iyonlaşabilen grupların pk sı, enzime bağlanma olayında görev gören substrat gruplarının pk sı, enzim üzerindeki katalitik göreve sahip grupların pk sı, enzimin biyolojik olarak aktif konformasyonunu belirleyen grupların pk sıdır. ph aktivite eğrileri, her bir ph için substratla doyurulmuş enzim çözeltileri ile yapılan deneyler sonucu elde edilir. Çünkü birçok enzimin K m sabiti ph ile değişir. Bütün kimyasal reaksiyonların hızı sıcaklıkla artar. Enzimli reaksiyonlar bu genel kuraldan farklı bir davranış göstermez. Artan sıcaklıkla enzimatik reaksiyon hızı artar, fakat C üzerine çıkıldığında aktivitede düşüş gözlenir. Bu durum yüksek sıcaklıkla enzim yapısında meydana gelen denatürasyondan kaynaklanır. Bir enzim için, 10 C lık sıcaklık değişiminin meydana getirdiği aktivite farklılığı Q10 değeriyle ifade edilir. Mesela 20 C ve 30 C sıcaklıklarda belirli miktarda enzim için ölçülen aktivitelerden yüksek olanın, düşük olana bölünmesiyle elde edilen sayı o enzim için Q10 değerini oluşturur. Bütün enzimler için Q10 değeri 1,7 ile 2,5 arasında değişir. Bundan dolayı, belirli sıcaklıkta gerçekleştirilen laboratuar ölçümlerinde 0,1 C lık hassasiyetin korunması gerekir.

23 8 Şekil 2.1. Enzim aktifliğinin sıcaklığa bağlı değişimi Bir enzimin aktif bölgesi, substratları bağlayan ve bağ yapım ile yıkımında görev alan aminoasit kalıntılarını kapsar. Bunlara katalitik grup adı da verilir. Enzimlerin yapı, spesifiklik ve kataliz özellikleri farklı farklı olmasına rağmen, aktif bölgelerinin ortak özelliklerini aşağıdaki gibi sıralayabiliriz. a) Aktif bölge, enzimin toplam hacmine oranla küçük bir kısmını oluşturur. Enzimdeki aminoasitlerin birçoğu substratla temas halinde değildir. Bu durum enzim moleküllerinde aktif bölge dışında kalan aminoasitlerinin de işe yaradığı sonucunu ortaya çıkarır. b) Aktif bölge bir nokta, bir çizgi ve hatta bir yüzey olmayıp, üç boyutlu bir yapıdır. Enzimin lineer yapısının değişik noktalarında bulunan grupların bir araya gelerek oluşturdukları üç boyutlu karmaşık bir bölgedir. Birbirinden çok uzakta bulunan aminoasitler bile katlanma ve bükülmeler sonucu katalitik grupta görev alabilirler. Mesela lizozim enziminin aktif bölgesi, 129 aminoasitlik lineer sıralamalarda 35, 52, 62, 63 ve 101 nolu kalıntılardan oluşmuştur.

24 9 c) Substratlar enzimlere nispeten zayıf kuvvetle bağlanır. ES kompleksinin denge sabitleri M arasında değişir. Bu da -3 ile 12 kcal / mol arasında değişen bağ enerjilerine karşılık gelir. Halbuki kovalent bağların kuvveti -50 ile 110 kcal / mol arasındadır. d) Aktif bölgeler bir yarık ve girinti içinde yer alırlar. Yapısı incelenmiş olan bütün enzimler de substrat molekülleri suyun girmediği çukur bölgelere bağlanır. Girinti içinde bağlanma ve kataliz için gerekli polar gruplar da vardır. Girintinin apolar karakteri substratın bağlanma gücünü de artırır. Bunun yanı sıra girintiler, katalizde esas olan bazı özellikleri polar yan gruplara kazandıracak bir mikro çevre oluşturur. e) Spesifik bir bağlanma, atomların aktif bölgede belirli tarzda düzenlenmeleri sonucu mümkün olur. Substrat bu bölgeye tam oturabilecek şekle sahip olmalıdır. Enzimle substrat arasındaki bu anahtar kilit modeli kataliz olayının sterospesifikliğini çok iyi açıklamaktadır. Bununla birlikte, son zamanlarda yapılan çalışmalar bazı enzimlerin aktif bölgelerinin rijit bir yapıda olmadığını göstermiştir. Bu tip enzimlerde aktif bölgenin şekli substratın bağlanmasıyla değişikliğe uğramaktadır. Bölge yalnız bağlanmadan sonra substrata komplementer hale gelmektedir. Bu ikinci çeşit bağlanma modeline etkileşme sonucu uygunluk modeli ( induced fit ) adı verilir (Şekil 2.3). Şekil 2.2. Enzim substrat ilişkisi (anahtar kilit modeli)

25 10 Şekil 2.3. Uyumlu etkileşim modeli Enzim reaksiyonlarının hızı kimyasal kinetikten farklılık göstererek, sıcaklıkla önce artar; sonra azalır. Enzim aktivitesi belirli bir optimum sıcaklığa kadar artar sonra ısısal deaktivasyon nedeniyle düşer. Enzimatik reaksiyonlar, kimyasal reaksiyonlarda olduğu gibi bu optimum sıcaklığa kadar Arrhenius kanununa uyar. Bu bölgede reaksiyon hız sabiti ve maksimum hız için; k = A.e -Ea/RT r m = k 3.[E] 0 yazılabilir. Eğer bu iki eşitlik birleştirilip gerekli hesaplamalar yapılıp grafiğe geçirilirse elde edilen doğrunun eğiminden enzimin aktivasyon enerjisi hesaplanır [12] Kolin oksidaz enziminin özellikleri E.C olan kolin oksidaz ( kolin oksijen 1 oksidoredüktaz ) FAD ın kofaktör olarak kullanıldığı iki yarı reaksiyon sonucu kolinin betain ve hidrojen peroksite dönüşümünü katalizleyen enzimdir [13]. İlk yarı reaksiyon kolinin hidroksil protonunun hızlı bir şekilde yakalanmasıyla gerçekleşir ve bunun sonucunda alkoksit ara ürünü oluşur. Bu reaksiyonu alkoksitin α karbonundan flavinin N( 5 ) atomuna hidrid iyonu transferi takip eder. Bunun sonucunda kolin betain aldehite dönüşür ve flavin yükseltgenmiş olur [14]. Akabinde betain aldehit enzimin aktif bölgesinde hidratlanarak gem diol kolin oluşumu sağlanır [15,16]. İkinci yarı basamakta ise gem diol kolin esas ürün olan glisin betaine yükseltgenir. Bu yarı reaksiyonlarda,

26 11 yükseltgenmiş flavin oksijene iki elektron transfer eder [17]. Bu reaksiyonlar enzimatik reaksiyon sonucu oluşan organik ürünler aktif bölgeye bağlı iken meydana gelir ve bu çözelti içerisinde gerçekleşene göre daha çok tercih edilir [14-17]. His99 enzimin aktif bölgesinde bulunan fonksiyonel gruplardan biridir. Bu grup enzim alkoksit kompleksinde FAD ın optimum konumlanmasında görev alır [18]. Glu312 ise substratın bağlandığı ana gruptur. Trimetilamonyum gruplarıyla elektrostatik etkileşime girerek substratın optimum konumlanmasını sağlar [19, 20]. His351 önemli bir bağlanma noktasıdır. Hidrid iyon transferinde substratın konumlanmasını sağlar ve kolinin yükseltgenmesi esnasında kararlılığı sağlar [21]. Val464 kalıntıları temel olarak flavinin oksijen tarafından yükseltgendiğinde kolin reaksiyonunda minimum etkinin oluşmasında görev alır [22, 23]. Son olarak His 466 enzim bağlı flavinin aktif bölgenin polaritesinin ve kolinin gilisin betaine dönüşümünde kararlılığın sağlanmasında görev alır [24, 25]. İlginçtir ki kolin oksidazdaki bu aktif üç histidin bölgesinin hiç biri ne süperoksit anyonlarının elektrostatik kararlılığını ne de oksijen tarafından indirgenmiş flavinin kararlılığında görev alır [18, 21, 24, 26]. Şekil 2.4. Kolin oksidazın üç boyutlu yapısı

27 Biyosensörler Biyosensörler (biyoalgılayıcılar), bünyesinde biyolojik bir duyargacı bulunan ve bir fizikokimyasal çeviriciyle birleştirilmiş analitik cihazlar olarak tanımlanmaktadır. Bir biyosensörün amacı, bir veya bir grup analitin ( analiz edilecek madde ) miktarıyla orantılı olarak sürekli sayısal elektrik sinyali üretmektir [27]. Bir sensör fiziksel boyuttaki değişmeleri elektriksel boyuttaki değişimler olarak ölçer. Bu değişimler akım, gerilim, sıcaklık vb. olabilir. Biyosensörler, diğer adıyla biyospesifik elektrotlar, biyoajanları immobilize halde kullanan, çeşitli gaz, iyon ve biyolojik maddelerin teşhisi, kantitatif tayini ve orijinal sistemlerde izlenmesi amacıyla geliştirilmiş problardır [28]. Biyosensörler klinik tıpta teşhis ve tayin amacıyla, fermantasyon analizi ve kontrolünde biyoloji, kimya, gıda endüstrisi, ziraat ve veterinerlikteki çeşitli analizlerde, endüstriyel gaz ve sıvıların analizinde, çevre kirlenmesinin izlenmesinde, patlayıcılar ve diğer askeri alanda kullanılmaktadır. En basit tanımıyla biyolojik katalizör taşıyan sensörler olarak tanımlanır. Biyosensörler canlılardaki çeşitli maddelerin algılanmasını mümkün kılan biyolojik maddelerin birleştirilmesiyle ortaya çıkmıştır. Bu sistemler bir yandan biyolojik sistemin yüksek seçimliliğini diğer yandan sensörlerin tayin duyarlılığını birleştirmiş ve çok geniş uygulama alanı bulmuştur. Ucuz oluşları ve hızlı cevap süresiyle sürekli sinyalleri algılamaları biyosensörlerin avantajları arasındadır [29]. Orijinal karakteristikleri biyosensör teknolojisini numune tayinlerinde popüler hale getirmektedir. Yüksek seçicilik ve spesifiklik, uzun süreli raf ömrü, otomasyon kolaylığı, vs. biyosensörlerin kullanımlarında artışa neden olur [ 28, 29]. Biyosensör sistemleri üç temel bileşenden oluşmaktadır. Bunlar; seçici tanıma mekanizmasına sahip "biyomolekül / biyoajan ", bu biyoajanın incelenen maddeyle etkileşmesi sonucu oluşan fizikokimyasal sinyalleri

28 13 elektronik sinyallere dönüştürebilen " çevirici " ve " elektronik " bölümler. Bu bileşenlerden en önemlisi, tayin edilecek maddeye karşı son derece seçimli fakat tersinir bir şekilde etkileşime giren, duyarlı biyolojik ajandır. Genel olarak biyoajanlar, biyoafinite ajanları ve biyokatalitik ajanlar olarak iki alt gruba ayrılırlar. Biyoafinite ajanları olan antikorlar, hormon almaçları, DNA, lektin gibi moleküller antijenlerin, hormonların, DNA parçacıklarının ve glikoproteinlerin moleküler tanımlanmasında kullanılırlar. Kompleks oluşumu sonucunda, tabaka kalınlığı, kırınım indisi, ışık emilmesi ve elektriksel yük gibi fizikokimyasal parametrelerin değişimine neden olurlar. Biyokatalitik ajanlarsa, analit üzerinde moleküler değişime neden olmakta ve bu dönüşüm sonucu ortamda azalan ya da artan madde miktarı takip edilerek sonuca gidilmektedir. Bu amaçla saf enzim, mikroorganizmalar ve bitkisel ya da hayvansal doku parçaları kullanılmaktadır. Şekil 2.5. Biyosensörlerin bileşenleri

29 14 Bir biyosensörde, biyokatalizör ile tayin edilecek maddenin teması sonucu ortaya çıkan biyokimyasal sinyal uygun bir mekanizmayla kantitatif olarak elektrik sinyaline dönüştürülür [30]. Biyosensörlerin tarihi 1950 li yılların ortalarında L. C. Clark ın Cincinnati Hastanesinde (Ohio, ABD) ameliyat sırasında kanın O 2 miktarını bir elektrot ile izlemesiyle başladı yılında Clark ve Lyons glukoz oksidaz enzimini O 2 elektrodu ile kombine ederek kanın glukoz düzeyini ölçmeye başladılar. Böylece yeni bir analitik sistem oluşturdular. Bu sistem bir yandan biyolojik sistemin ( enzim ) yüksek spesifikliğini diğer taraftan ise fiziksel sistemin (elektrot) tayin duyarlılığını birleştirmiş ve geniş spektrumlu bir uygulama olanağı bulmuştur. GOD: Glukoz oksidaz Glukoz + O 2 Glukonik asit + H 2 O 2 Bir biyolojik sıvıdaki glukoz ve çözünmüş oksijen elektrot etrafındaki membranı geçerek elektrot yüzeyine ulaştığında glukoz oksitlenerek glukonik aside dönüşür ve bu sırada O 2 harcanır. Ortamdaki glukoz bittiğinde O 2 tüketimi durur. O 2 elektrodu ile başlangıçtaki ve reaksiyon sonundaki çözünmüş O 2 ölçülür, aradaki fark ortamdaki glukozun oksidasyonu için harcanan O 2 olup buradan biyolojik sıvıdaki glukoz miktarı hesaplanır. Klasik elektrokimya ile sadece anyon ve katyonları belirleyen sensörler hazırlanırken sisteme biyomateryalin de katılması ile diğer birçok maddenin tayini mümkündür. Böylece hazırlanan analiz sistemlerine biyosensör adı verilir. Clark ve Lyons un geliştirdiği ilk biyosensörde elektron alıcısı olarak oksijen kullanılırken, ikinci generasyon biyosensörlerde O 2 yerine elektronları enzimin redoks merkezinden elektron yüzeyine taşıyabilen bir redoks medyatörü kullanılmaya başlandı [31].

30 15 GOD - FADH 2 + Mox GOD-FAD + Mred + 2H 2 Mred = Mox = redoks medyatörü Biyobileşenler Enzimler, mikroorganizmalar, organeller, doku kesitleri, antikorlar, nükleik asitler ve biyolojik zarlar içine yerleştirilmiş kimyasal reseptörler, sensörlerde biyobileşen olarak kullanılırlar [31]. Biyoreseptörler analiz edilecek maddeyi dönüşüme uğratır ve bu dönüşüme eşlik eden değişimler dönüştürücü tarafından algılanır. Yüksek spesifikliklerinden dolayı enzimler en yaygın kullanılan biyomateryallerdir Biyosensörlerin çalışma mekanizması Biyosensörlerin çalışması sırasında ilk önce substratın çözelti içerisinden biyosensör yüzeyine taşınması gerçekleşir. Substratın taşınması difüzyon, karıştırma vb. gibi çeşitli şekillerde olabilir. Substrat biyobileşenin aktif bölgesine difüzlenir. Biyobileşen polimerik gözenekli membrana (selülozik diyaliz membranı gibi) emdirilmiş veya algılayıcı ile polimerik membran (selofan, selüloz, asetat/nitrat, polivinil alkol, poliüretan vb. ) arasına sandviç edilmiş veya polimerik bir jel içinde hapsedilmiş olabilir. Bu hapsetme işlemi için akrilamid, jelatin, agaroz vb. gibi doğal veya sentetik polimerler kullanılabilir. Biyobileşen ve substrat arasında reaksiyon meydana gelir. Bu etkileşme sonucu gaz molekülleri (O 2, CO 2, NH 3, vb. ) salınabilir veya kullanılabilir, seçimli iyonlar oluşabilir (H +, NH + 4, diğer tek değerlikli anyon ve katyonlar), ısı ortaya çıkar veya kaybolur, optik yoğunluk değişebilir, elektron salınabilir veya kullanılabilir [32]. Biyobileşenler ve substrat reaksiyonu sonucu oluşan ürün algılayıcı yüzeyine taşınır. Algılayıcı yüzeyinde yukarıda bahsedilen değişimler algılanıp elektriksel devrelerle ölçülebilecek bir boyuta dönüştürülür. Ölçülen elektriksel sinyal analit derişimiyle orantılıdır [30].

31 16 Analit ( enzim,antibadi, antijen, mikrobiyal hücreler, gazlar, iyonlar, metabolitler, mikroorganizmalar, proteinler, oligonükleotitler ) Tanınan Element ( Hücreler, reseptörler, antibadiler, antijenler, membranlar, enzimler, organeller, organizmalar, dokular, oligonükleotitler ) Elektron geçişi, iyon mobilitesi, elektroaktif türlerin difüzyonu Sıcaklık değişimi veya ısı salınımı Elektromanyetik radyasyonun absorpsiyonu veya emisyonu Dalga dağılımının kütle ve/veya mikroviskosite değişikliği Elektrokimyasal amperometrik, potansiyometrik, FET veya kondüktometrik Termal Optik Piezoelektrik İkili veya çoklu oranların kalibrasyon grafiği ile karşılaştırılması Şekil 2.6. Biyosensörlerin çalışma mekanizması

32 Algılayıcılar (Transduserler) Algılayıcı biyokimyasal sinyali elektronik sinyale dönüştürür. Ölçülen elektriksel sinyal analit derişimiyle orantılıdır. İlgili türlerin biyokimyasal etkileşimine uygun bir algılayıcı sistem seçilmelidir. Fiziksel algılayıcılar elektrokimyasal, spektroskopik, termal, piezoelektronik ve yüzey akustik dalga teknolojisi olarak çeşitlendirilebilir. Algılayıcılar dört grupta toplanabilir; 1) Elektrokimyasal algılayıcılar - Amperometrik esaslı - Potansiyometrik esaslı - Konduktometrik esaslı 2) Optik algılayıcılar - Absorbans ölçümünü temel alanlar - Floresans veya fosforesans ölçümünü temel alanlar - Kırılma indisini temel alanlar 3) Kütle değişimini temel alan algılayıcılar 4) Isı değişimini temel alan algılayıcılar - Termistörler

33 18 Çizelge 2.1. Biyosensör algılayıcıları Biyosensör dizaynında dikkat edilmesi gerekenler Biyosensör tasarımlarında önce biyosensörün hangi analiti tanıyacağı tespit edilmelidir. Sonrasında ise aşağıdaki maddeler dikkate alınarak biyosensöler dizayn edilmelidir. Bunlar sırasıyla; i) Analite uygun biyoreseptörün seçimi, ii) Biyoreseptörü dönüştürücüye sabitlemede kullanılacak uygun ve verimli immobilizasyon metodunun seçimi, iii) Biyoreseptörün analiti tanımasıyla oluşan kimyasal veya fiziksel sinyali anlaşılabilir sinyal formuna dönüşütürecek olan dönüştüürcünün seçimi ve dizaynı, olarak sıralanabilir [33] Biyosensörlerde biyoaktif bileşen immobilizasyon yöntemleri Biyoaktif bileşen ile iletici unsurun birleştirilmesinde oldukça farklı immobilizasyon yöntemlerinden yararlanılabilir. Biyoaktif bileşen sensör olarak da adlandırabileceğimiz temel unsur üzerinde fiziksel olarak, jel içinde

34 19 veya polimer matrikste tutuklanabilir, elektrot yüzeyinde biriktirilebilir, kovalent veya çapraz bağlanarak immobilize edilebilir [34] Enzim immobilizasyon metotları Enzimin elektrot yüzeyine yüksek aktivite ile ince tabaka içerisine fiziksel olarak yerleştirilmesi kovalent ve kovalent olmayan metotlarla gerçekleştirilir. Basitçe immobilizasyon, serbest haldeki enzimi elektrot yüzeyinde yarı geçirgen bir membran kullanarak tutmak suretiyle gerçekleştirilir. Elde edilen prob, çoğunlukla kötü kararlılık gösterir ve fazla miktarda enzime gereksinim duyar. İmmobilize enzimlerin serbest enzimlere üstünlükleri şöyle sıralanabilir; Reaksiyon sonunda ortamdan kolayca uzaklaştırılabilir (süzme, santrifüjleme vb.) ve ürünlerin enzim tarafından kirletilmesi gibi bir problem yaratmaz. Çevre koşullarında (ph, sıcaklık vb.) karşı daha dayanıklıdır. Birçok kez ve uzun süre kullanılabilir Sürekli işlemlere uygulanabilir Serbest enzime kıyasla daha kararlıdır. Ürün oluşumu kontrol altında tutulabilir Birbirini izleyen çok adımlı reaksiyonlar için uygundur Bazı durumlarda, serbest enzimden daha yüksek bir aktivite gösterebilir. Enzimin kendi kendini parçalaması olasılığı azalır. Mekanistik çalışmalar için uygundur. Çizelge 2.2 de enzim immobilizasyon yöntemleri şematik olarak gösterilmiştir.

35 20 Çizelge 2.2. Enzim immobilizasyon yöntemleri Fiziksel ya da kimyasal olarak immobilize edilen enzimler, daha iyi bir kararlılık gösterir ve diğer maddelerle etkileşimi daha azdır. Tercih edilen immobilizasyon metotları aşağıdaki gibidir: Taşıyıcıya bağlama yöntemleri Taşıyıcıya bağlamada bir protein olan enzim molekülünün yapısından yararlanılır. Molekül yüzeyindeki fonksiyonel gruplar, iyonik gruplar ve hidrofobik bölgeler bu bağlamada rol alırlar. Enzim immobilizasyonunda kullanılacak taşıyıcılar reaktif değillerse yardımcı bir reaktif ile aktivite edilmeleri gerekir. İmmobilizasyon, çok yumuşak koşullarda (oda sıcaklığı, nötral ph vb.) gerçekleştirilmelidir. Taşıyıcı suda çözünmemeli ancak büyük ölçüde hidrofobik karakterli de olmamalı, suda ıslanabilmeli, ayrıca mekanik kararlı olmalıdır. Bu tür taşıyıcıların seçiminde, enzim-taşıyıcı bağının aktivite için zorunlu gruplar üzerinden olmaması yanında, taşıyıcının enzim tarafından parçalanmaması, mikroorganizma

36 21 üremesine olanak vermemesi, ph ve çözücülere karşı dayanıklı olması gibi özellikler taşımasına dikkat edilir. Kovalent bağlama Enzimlerin reaktif taşıyıcılara kovalent bağlanması genelde sulu ortamda gerçekleştirilir. Reaktif taşıyıcıda ve enzimde bulunup enzimin bağlanmasını sağlayan fonksiyonel gruplar aşağıdaki gibidir: Çizelge Enzimin bağlanmasını sağlayan fonksiyonel gruplar Enzimin taşıyıcıya kovalent bağlanmasında dikkat edilecek önemli nokta, bağlanmanın enzim aktivitesi için zorunlu gruplar üzerinden olmaması ve bağlanma sırasındaki sterik engellemeler nedeni ile bu grupların rahatsız edilmemesidir. Taşıyıcıya kovalent bağlanma enzimin zincirindeki aminoasitlerin taşıdığı fonksiyonel gruplar üzerinden gerçekleşir. Şekil 2.7. Kovalent bağlama

37 22 Adsorpsiyon Enzim immobilizasyonunda kullanılan en eski ve en basit yöntemdir. Proteinler ve özellikle enzimlerin katı yüzeylerde adsorpsiyonu detaylıca araştırılmıştır. Adsorpsiyonun asıl amacı enzim immobilizasyonu olmayıp, enzim saflaştırmaktı. Fakat suda çözünmeyen taşıyıcılarda adsorpsiyon yönteminin enzim immobilizasyonunda oldukça sık kullanıldığını görmekteyiz. Yöntem, yüzey aktif suda çözünmeyen bir adsorbanın enzim çözeltisi ile karıştırılması ve enzimin aşırısının iyice yıkanarak uzaklaştırılması temeline dayanır. Taşıyıcıya bağlanmada etkin olan Van der Walls kuvvetleridir [35]. Adsorbanlar çok değişik türde olmakla birlikte iyi bir adsorpsiyon sağlayabilmek için genellikle adsorbanın bir ön işlemden geçirilmesi gerekir. Enzim immobilizasyonunda en sık kullanılan adsorbanlar; aktif karbon, gözenekli cam, diatome toprağı, CaCO 3, kül, silikajel, bentonit, hidroksiapatit, nişasta, gluten ve kalsiyum fosfattır. Bir enzimin suda çözünmeyen taşıyıcıda adsorpsiyonu ph, çözücü, iyon şiddeti, enzim-adsorban oranı ve sıcaklık gibi faktörlere bağımlıdır. Bu faktörlerin araştırılması, adsorpsiyon ve aktivitenin önemli ölçüde geri kazanılması için optimal koşulların saptanması çok önemlidir. Adsorpsiyon mekanizması genellikle çok karışık olup, birçok olasılıktan hangisinin gerçekleşeceğinin önceden saptanması güçtür. Prensip olarak, bir proteinin aktif yüzeylerde adsorpsiyonu tersinir bir işlem olmalıdır. Ancak bazı durumlarda (örneğin; kolenitte adsorplanmış üreaz) tersinir olmayan adsorpsiyon söz konusu olabilmektedir. Eğer aktivite sabit kalıyor ve immobilize enzim sürekli işlemlerde kullanılabiliyorsa, bu tür adsorpsiyon enzim immobilizasyonu için idealdir. Desorpsiyon, reaksiyon ürünlerinin kirlenmesine ve aktivitede sürekli bir değişmeye neden olur. Tersinir adsorpsiyonlar enzim immobilizasyonu için pek uygun değildir.

38 23 Bazı adsorbanlar bir enzimin farklı biçimlerini, aktif veya inaktif biçimlerinden birini adsorbe ederken, diğerini desorbe etmektedir. Eğer enzimin aktif şekli desorbe edilirse bazı durumlarda immobilize enzimin bağıl aktivitesi yüzde 100 den büyük değerler alır, tersi durumda bağıl aktivite sıfır olur, yani immobilizasyon ürünü hiç aktivite göstermemektedir. Yöntemin yararları; enzimin immobilizasyon işleminin basit oluşu, değişik biçim ve yükteki taşıyıcıları seçme olanağı vermesi ve bir yandan immobilizasyonu gerçekleştirirken diğer yandan enzim saflaştırılmasına olanak sağlamasıdır. Yöntemin sakıncaları; her ne kadar immobilizasyon işlemi kolaysa da optimal koşulların saptanması çok güçtür. Eğer enzimle taşıyıcı arasında kuvvetli bir bağlanma yoksa, bu durumda desorpsiyon sonucu enzim serbest halde reaksiyon ortamına geçer ve ürünlerin kirlenmesine neden olur. Şekil 2.8. Adsorpsiyon İyonik bağlama Bu yöntem, iyon değiştirme yeteneğine sahip suda çözünmeyen taşıyıcılara enzimin iyonik bağlanması temeline dayanır. Bazı durumlarda iyonik bağlama yanında fiziksel adsorpsiyon da etkili olmaktadır. İyonik bağlama çok yumuşak koşullarda gerçekleştiğinden, enzimin konformasyonunda ve aktif merkezde değişikliğe neden olmaz. Ancak; enzim

39 24 ile taşıyıcı arasındaki bağ kovalent bağ kadar güçlü olmadığından enzim kaçışı söz konusudur. Şekil 2.9. İyonik bağlama Şelat bağlama Bazı transisyon metallerinin şelat yapma özellikleri sayesinde enzimlerin organik ve inorganik taşıyıcılara bağlanması mümkündür. Yöntem ilk kez 1971 yılında uygulanmış olup, daha sonra da kullanılmaya devam edilmiştir. Biyospesifik bağlama Enzimler ile antikorlar ve lektinler arasındaki biyospesifik etkileşimden yararlanılarak enzim immobilize edilebilir. Lektinler, spesifik karbohidrat atıklarını içeren enzimlere kuvvetlice bağlanırlar. Örneğin bu yöntemle immobilize edilen invertaz, sakkarozun kesiksiz inversiyonunda kullanılmıştır. Spesifik monoklonal antikorları suda çözünmeyen materyale bağlayarak hazırlanan taşıyıcılar enzim immobilizasyonunda başarılı biçimde kullanılmaktadır. Çapraz bağlama yöntemleri Küçük moleküllü, bi veya multi fonksiyonel reaktifler enzim molekülleri arasında kovalent bağlar yaparak sonuçta suda çözünmeyen komplekslerin oluşmasını sağlarlar. Çapraz bağlanma derecesi ve immobilizasyon, protein ve reaktif derişimine, ph ya da immobilize edilecek enzime çok bağımlıdır.

40 25 İntermoleküler bağlanmalar yanında, intramoleküler bağlanmalar da söz konusudur. Bu yöntem ile enzim immobilizasyonu 4 farklı şekilde gerçekleşir: - Enzimin yalnız bifonksiyonel reaktif ile reaksiyonu - Enzimin ikinci bir protein varlığında bifonksiyonel reaktif ile reaksiyonu - Enzimin suda çözünen bir taşıyıcıda adsorpsiyonundan sonra bifonksiyonel reaktif ile reaksiyonu - Enzimin bifonksiyonel reaktif tarafından aktive edilmiş polimer taşıyıcı ile reaksiyonu En çok kullanılan çapraz bağlama reaktifleri; gluteraldehit, kloroformat ve karbonildiimidazol, heterosiklik halojenürler, bioksiranlar, divinilsülfonlar, p- benzokinon, transizyon metal iyonları ve epiklorhidrinlerdir. Çapraz bağlama reaksiyonu çok yumuşak koşullarda gerçekleşmediğinden bazı durumlarda önemli ölçüde aktivite kaybı söz konusudur. Enzimler bu şekilde birbirlerine bağlandıklarında jelatinimsi bir yapı oluştururlar, bu nedenle mekanik bakımdan çok kararsızlardır. Çok sayıda enzimin diğer enzimler için matriks olarak davranmasından dolayı bu metot iyi bir immobilizasyon metodu değildir. En çok kullanılan çağraz bağlama reaktifi gluteraldehitdir. Şekil Çapraz bağlama

41 26 Kopolimerizasyon yöntemleri Enzimler bir kopolimerizasyon reaksiyonunda monomerlerden biri gibi davranır ve böylelikle polimer matrikse bağlanmış olur. Yöntem, polimer matrikse tutuklamaya benzemekle birlikte enzim kaçışının önlenmiş olması gibi üstünlüğü vardır. Tutuklama yöntemleri Prensip olarak tutuklama enzim molekülünü belirli bir mekanda durmaya zorlamaktır. Enzim bulunduğu çevreden dışarıya çıkamaz. Bu işlem, polimer matriks içindeki kafeslerde gerçekleştirilebileceği gibi yarı geçirgen membranlar içinde mikrokapsülleme ile de gerçekleştirilebilir. Bu yöntemi kovalent bağlama ve çapraz bağlama ile immobilizasyondan ayıran en önemli özellik; enzim molekülünün fiziksel veya kimyasal olarak herhangi bir taşıyıcıya bağlanmamış olmasıdır. Polimer matrikste tutuklama Polimerizasyon ve çapraz bağlamanın oluştuğu ortamda enzim de bulunduğu takdirde enzim, çapraz bağlanma sonucu oluşan odacıklarda (kafes) tutuklanmaktadır. Bu amaçla en çok kullanılan polimer; N,N - metilenbisakrilamid ile çapraz bağlanmış poliakrilamiddir. Yöntem, yüksek derece çapraz bağlı bir polimerin enzim çözeltisi içinde oluşturulması temeline dayanır. Polimerleşme sonucu enzim molekülleri çapraz bağ ağları arasında tutuklanmakta ve böylece ana çözeltiye geçmeleri engellenmektedir. Çapraz bağ yüzdesi öyle ayarlanmalıdır ki, enzim molekülleri tutuklanabilsin ama substratın enzimlere ulaşmasına engel olunmasın. Çapraz bağ yüzdesinin aşırı olması substratın enzim aktif merkezlerine ulaşmasını

42 27 engellemekle kalmayıp enzimin zincir yapısını da zorlayıp aktivite kaybına veya tamamen inaktif olmasına neden olabilir. Bu nedenle optimal bir çapraz bağ yüzdesi saptanması önemlidir. Bu oran, enzime ve taşıyıcıya bağlı olarak değişir. Uygun çaplı substrat molekülleri polimer kafes içinde tutuklanmış enzim moleküllerine ulaşır ve reaksiyon ürünleri de dışarı çıkar. Bu yöntemde kullanılacak substratın küçük moleküllü olması gerekir. Bu tip immobilizasyon, ilk kez 1963 yılında tripsin, kimotripsin ve diğer enzimlerin immobilizasyonunda kullanılmıştır. Molekül kütlesi den fazla olan enzimlerin bu yöntemle immobilizasyonları oldukça kolaydır. Bu tür immobilizasyon işleminde en çok kullanılan taşıyıcılar; hidrofilik temele dayalı poliakrilamid jeli ve jel oluşturan polisakkaritlerdir. Ayrıca silikon lastiği ve silikajel de kullanılmaktadır. Tutuklama yanında özellikle yüklü polimerlerde fiziksel adsorpsiyonun da etkin olduğu saptanmıştır. Polimer zincirleri arasındaki çapraz bağlama değişik bifonksiyonel veya multifonksiyonel reaktiflerle sağlanmaktadır. Örneğin, bu yöntemle enzim immobilizasyonunda en çok kullanılan taşıyıcı olan poliakrilamidin çapraşık bağlanması N,N -metilenbisakrilamid ile gerçekleştirilir. Çapraz bağlı taşıyıcıların hazırlanmasında, monomer ve çapraz bağlayıcı reaktiflerin mol oranları çok önemlidir. Bu durum bir yandan enzim moleküllerinin tutuklanacağı hücrelerin çapına etki ederken, diğer yandan taşıyıcının fiziksel özelliklerinde önemli değişmelere de neden olacaktır. Bu yöntemle immobilize edilen enzimin asıl özelliklerinde bir değişme beklenmez. Ancak taşıyıcının tipi ve enzimatik reaksiyonlar bölgesel mikro çevre etkilerinin oluşmasına neden olurlar. Örneğin, taşıyıcının yüklü olması önemli bir etkendir. Taşıyıcının yüklü olması immobilize enzimin özelliklerinde doğal enzime kıyasla çok önemli değişmelere neden olmaktadır.

43 28 Bu yöntemin yararları; çok kolay uygulanması, gerçek bir fiziksel yöntem olması ve çok az miktarlarda enzim kullanılarak gerçekleştirilmesidir. Nötral, suda çözünmeyen taşıyıcılarla da immobilizasyon gerçekleştirilmekte ve kimyasal bir bağlanma olmadığından yüklü taşıyıcıya gerek duyulmamaktadır. Yöntemin sakıncaları ise; immobilizasyon işlemi sırasında inaktivasyonun deney koşullarına çok sıkı bağımlı oluşu ve immobilize enzimin ancak küçük moleküllü substratlara karşı iyi bir aktivite göstermesidir. Şekil Polimer matrikste tutuklama Mikrokapsülleme Bu yöntem enzim moleküllerinin yarı geçirgen bir membran içinde tutuklanmasından ibarettir. Mikrokapsüllerin büyüklüğü µm arasında değişir. Enzimler daha çok kimyasal mikrokapsüllemede immobilize edilir. Bu yöntem ile enzim immobilizasyonu; sürekli ve sürekli olmayan yarı geçirgen membran mikrokapsüllerde tutuklama olmak üzere iki grupta incelenebilir. Sürekli mikrokapsüllerde çerçeve membran katı, süreksiz mikrokapsüllerde lipozomlar ise bir sıvı tabakadır. İmmobilizasyonda kullanılan çerçeve maddesinin (membran) yarı geçirgen olması zorunludur. Ayrıca bu yarı geçirgen membranın gözenek çapları; substrat moleküllerinin kapsül içine

44 29 girişine ve ürün moleküllerinin dışarı çıkışına olanak verecek büyüklükte olmalıdır. Substrat molekülleri ne kadar küçükse bu yöntemle immobilize edilmiş enzimin verimliliği o ölçüde yüksek olacaktır [32]. Şekil Mikrokapsülleme Elektrokimyasal esaslı biyosensörler -Amperometri esaslı biyosensörler: Amperometri genel anlamda belli bir potansiyeldeki akım şiddetinin ölçümünü esas alır. Söz konusu akım yoğunluğu çalışma elektrodunda yükseltgenen ya da indirgenen elektroaktif türlerin konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak tanımlanır. İkinci elektrot referans elektrot olarak iş görür. Kalibrasyondan sonra akım yoğunluklarından ilgili türlerin konsantrasyonlarının belirlenmesinde yararlanılır. İletici sistem olarak bir amperometrik sensörün kullanılması durumunda potansiyometrik sensörlerden en büyük fark, ürünlerden sinyal oluşturan türün elektrot yüzeyinde tüketilmesidir. Oksijen tüketimine ilişkin reaksiyonlar aşağıda verilmiştir: Katodik reaksiyon: O 2 + 2H 2 O + 2 e - H 2 O 2 + 2HO - H 2 O 2 + 2e - 2HO - Anodik reaksiyon: Ag + + Cl - AgCl + e - Toplam reaksiyon: 4Ag + + O 2 + 2H 2 O + 4Cl - 4AgCl 4OH -

45 30 Bir biyosensörün biyoaktif tabakasındaki reaksiyonlar oldukça kompleks bir kinetiğe sahiptirler. -Potansiyometri esaslı biyosensörler: Potansiyometri bilindiği gibi en genel anlamda bir çalışma ve referans elektrot arasındaki potansiyel farkının ölçümünü esas alır. Elektrot potansiyelinin belirlenmesi doğrudan analit konsantrasyonunu tanımlar. Potansiyometrik biyosensörlerde kullanılan temel sensörler ph ya da tek değerlikli iyonlara duyar cam elektrotlar; anyon ya da katyonlara duyar iyon seçimli elektrotlar ve karbondioksit ya da amonyağa yönelik gaz duyar elektrotlardır. Bunların dışında, yarı iletken esaslı, optik esaslı, kalorimetri esaslı, piazoelektrik esaslı, kuru rektif kimyası esaslı biyosensörler de hazırlanıp kullanılmaktadır [36] İletken polimerler Polimerik malzemeleri metallerden ayıran en önemli özellik yalıtkan olmalarıdır. Bu özellik polimerik malzemelerin kullanımında birçok üstünlükler sağlar. Fakat son yıllarda, elektrik akımını iletebilen yeni bir organik polimer sınıfı geliştirildi. Asetilen, pirol, tiyofen gibi çeşitli benzen türevlerinden sentezlenen ve organik metaller olarak da bilinen bu polimer korozyon önleyci kaplama olarak, pillerde ve kararlılıklarına bağlı olarak mikroelektronikte önemli bir potansiyele sahiptirler. Bu polimerler arasında polipirol ve türevleri, elektriksel özelliği, çevresel kararlılığı, kimyasal ve elektrokimyasal sentezinin kolaylığı nedeniyle en yoğun şekilde incelenmeye alınmış grubu oluşturmaktadır. Polipirol ve türevleri genellikle pirolün kimyasal ve elektrokimyasal oksidasyonu ile hazırlanırlar.

46 31 Şekil Pirolün yükseltgenmesi Pirolün kimyasal sentezi yanı sıra elektrokimyasal sentezi de uzun yıllardan beri bilinen bir yöntemdir. Sulu ya da susuz ortamda elektrokimyasal çalışma olasılığı kimyasal olarak sentezlenen polipirolden daha yüksek iletkenlik gösteren filmler sentezlenebilmesi ve elde edilen polimer filmin yarı iletkenlerin korozyonunu azaltma avantajı elektrokimyasal senteze ilgiyi artırmıştır. Yalnız elde edilen polipirol sert ve kırılgandır ve bu zayıf mekanik özellikler onun uygulama alanlarında kullanım potansiyelini de düşürür. Polimerlerin iletkenliği Çizelge 2. 4 de toplanmıştır. Poliasetilen yüksek iletkenliğe sahip olmasına rağmen hava ve nem içerebilmesinden dolayı ticari bir iletken polimer değildir. Polipirol ve politiofen poliasetilene göre hava ortamında oldukça kararlıdır.

47 32 Çizelge 2.4. İletken polimerler ve iletkenlikleri İletken polimerlerin en önemli problemlerinden biri herhangi bir çözücüde çözünebilme problemleridir. Son yıllarda bu çözünme problemi de bilinerek yapısal modifikasyon olmadan polipirolün çözünebilme problemini çözmek için sulu demirklorür, çözeltisi, suda çözünebilen polimerizasyon sistemleri

48 33 araştırılmıştır. Fakat bu sistemlerde, metilselüloz, polivinilalkol, polivinil pirolidon veya poliakrilamit gibi nötral polimerler kullanılarak polipirolün koloidal çözeltileri elde edilmiştir. İletken polimerlerin çözünme zorluğu onların antielektrostatik filmler, elektronik pencereler, kimyasal sensörler, şarj edilebilen piller gibi uygulamalar için gerekli elektronik ve optik özelliklerini veren moleküler karakteristikleri olan π-elektronik yapılarının delokalize π-elektronik yapı onların yüksek elektronik polimerizasyonuna dolayısıyla zincir içinde yüksek π-π etkileşmesine yol açar. Bu da polimerin çözünme yerine agregasyonuna neden olur. Polipirolün çözünmeme probleminin temeli bilindiğinden hemen akla gelen çözüm, polimerinin elektronik polarizebilitesini azaltmaktır. Bunu yapısal modifikasyonla yaparsak polimer çözünebilir ama aynı zamanda tüm yararlı optik ve elektronik özelliklerini kaybedebilir. Bu yüzden son zamanlarda üzerinde çalışılan çözüm, polimerin başka bir polimer ile interpolimer kompleksini oluşturmaktadır. Lineer polimerlerin intermoleküler kompleksleri zıt yüklerin etkileşmesi hidrojen ve hidrofobik bağların oluşumu ya da metal iyonlar yoluyla etkileşerek çözünen veya çözünmeyen polikompleks oluşturmak üzere sentez edilebilirler Pirol Pirol kaynama noktası 130 o C, yoğunluğu 0,948 g/ml olan kokulu renksiz bir sıvıdır. Mineral asitleri ile çabucak polimerleşir. Pirol aromatik bileşiktir ve deneysel rezonans enerjisi kcal/mol dür.

49 34 Şekil Pirolün aktif noktaları Pirol 2 veya 5 pozisyonuna gruplar atak yapabilir. Pirolün heterosiklik azot grubu zayıf bazik özelliktedir. Pirol suda az çözünür. Fakat organik çözücülerde çok miktarda çözünür. Pirol alkali iyonlarla çözünmez polimerizasyonla birlikte asit içinde yavaş çözünür Pirolün elektrokimyasal polimerizasyonu Elektronik iletken polipirol filmlerinin oluşumu anodik olarak asetonitrilin yükseltgenmesiyle ilk olarak Diaz tarafından yapılmıştır. Çözücü, elektrolit, fonksiyonel gruplar, elektrot potansiyeli, ve diğer özelliklerin değiştirilmesiyle literatürde oldukça fazla miktarda çalışma bilinmektedir. Fakat polimerizasyon mekanizmasını anlamak uzun sürmüştür [37].

50 35 1. N N+. + e - H H 2a. 2 N + H. N + H H H H N + 2b. N + H. + H N N H H H H +N -e - N + H H H H N + 3. H H N + H H N + 2 H + +N H H N H H 4. N n Şekil Pirolün polimerizasyonuna ait mekanizma H Elektrokimyasal sentez, basitliği ve yeniden üretilebilirliğinden dolayı, elektrik iletken polimerlerin sentezi için hızla genel bir metot olarak kabul görmeye başlamıştır. Elektrokimyasal sentezin oda sıcaklığında gerçekleşebilmesi de onun önemli bir avantajıdır. Hem potansiyel hem de akım zamanla değiştirilerek film kalınlığı da kontrol edilebilir. İletken polimerlerin elektrokimyasal polimerizasyonu genellikle şu metotlarla yapılır: (1) Akıma karşı (galvanostatik), (2) Potansiyele karşı (potansiyostatik) ya da (3) potansiyel taraması. Standart elektrokimyasal teknikte (hücre içerisinde çalışma elektrodu, referans elektrot ve karşıt elektrotdan oluşan üçlü elektrod sistemi) genellikle en iyi filmler elde edilmektedir. Elektrokimyasal sentez homojen bir monomerle yapılabildiği gibi, kopolimerizasyonla da yapılabilmektedir. Poliazulen, politiyofen, polianilin, polipirol gibi bazı filmler bu yolla senetezenebilmiştir [38].

51 Enzim Sensörleri Biyosensör teknolojisindeki ilk örnekler özellikle amperometrik ve potansiyometrik temelli enzim elektrotları şeklinde ortaya çıkmışlardır. Bu durumun en önemli nedeni o tarihteki bilgi ve teknolojik birikimin, söz konusu çalışmalar için yeterli düzeye ulaşmış olmasıdır. Biyosensör teknolojisinde kullanılan biyoaktif materyal sıralamasında enzimlerin yeri Şekil 2.19 da verilmiştir [39]. Şekil Biyosensör teknolojisinde kullanılan biyoaktif materyal sıralamasında enzimlerin yeri Genel çalışma ilkesi Enzim sensörleri, biyobileşen olarak enzimin kullanıldığı iletici ve ölçme sisteminden oluşur. Diğer biyosensörlerde olduğu gibi enzim sensörlerinde

52 37 de aktif tabakanın iç ve dış yüzeylerinde zarlar, sinyali yükselticiler, mikro işlemciler, kaydedici veya bilgisayar sistemleri amaca yönelik olarak kullanılabilir. Bir enzim sensörünün genel gösterimi Şekil 2.20 de verilmiştir [40]. Şekil Enzim sensörlerinin genel şematik gösterimi Bir enzim elektrodunda enzimi içeren biyoaktif tabaka, enzimin katalizlediği tepkime uygun bir iletim ve ölçüm sisteminin uzantısı olan bir iletici ile birleştirilmektedir. İletim sistemi biyoaktif tabakada gerçekleşen enzimatik tepkime sonucu oluşan ürünün miktarındaki artışı tespit edebilecek şekilde seçilmelidir. Biyoaktif tabakadaki ve biyoaktif tabaka iletici ara yüzeyindeki derişimlerin hızlı bir şekilde dengeye ulaşabilmesi için difüzyon engelini en aza indirmek amacıyla biyoaktif tabaka kalınlığının mümkün olduğunca ince olması gerekmektedir. Bunun yanı sıra biyoaktif tabakada sabit bir substrat derişimi sağlayabilmek için ölçme çözeltisinin yeterli bir şekilde karıştırılması gerekmektedir. İletici sistemin ölçme sistemine gönderdiği sinyal, biyoaktif tabaka ile iletici ara yüzeyindeki derişimlerde meydana gelen değişikliğe bağlıdır. Ancak söz konusu derişimler, denge halinde ölçme çözeltisindeki derişimlerle orantılı olduğu için çoğu zaman kalibrasyon grafiği çizilerek sonuca varılır [40].

53 Performans Faktörleri Seçicilik Biyosensörün kompleks bir matriks içerisinde tek başına analitik bir ölçüm cihazı olarak kullanılabilmesini sağlar. Seçiciliğin yeterli olmadığı durumlarda çalışma prosedürüne bu eksiği giderecek ek işlemler eklenmesi gerekir. Seçiciliğin zayıf olmasından kaynaklanan sorunlar biyosensörün kullanımını zor hale getirmektedir Kullanım ömrü Biyolojik çevirici olarak enzim kullanıldığı durumlarda enzim aktivitesindeki azalma kullanım ömrünü kısıtlayan en önemli faktördür. Enzimin yaşam süresi, biyosensörün kullanım ömrü yanı sıra kalibrasyon sıklığı, stabilite, tekrarlanabilirlik gibi parametreleri de etkilemektedir Kalibrasyon gereksinmesi İdeal bir biyosensörün hiç kalibrasyona gerek duymaması ya da en az kalibrasyona gereksinmesi istenir. Ama teorikte planlanan bu özellik pratikte günümüzde gerçekleştirilememiştir. Biyosensörlerin kullanım ömürleri boyunca sıkça ya da belirli aralıklarla kalibre edilerek duyarlılıklarından bir şey kaybedip kaybetmedikleri araştırılır Tekrarlanabilirlik İdeal bir biyosensör elektrodunun aynı derişimde ya da aynı özelliklere sahip birden fazla örneğe daldırılmasıyla yapılan deneylerde aynı sonuçların

54 39 okunması gerekir. Tekrarlanabilirlik değeri ne denli iyi olursa o biyosensör uygulaması da o denli iyi olur Kararlılık Elektrot kararlılığının yüksek olduğu durumlar ideal biyosensörler için gereklidir. Kararlılık, kullanılan enzimin fiziksel dayanıklılığından etkilendiği gibi; ph, ısı, nem, ortam O 2 derişimi, enzimi immobilize etmede kullanılan polimerin kimyasal ve fiziksel karakteri gibi parametrelerden de etkilenmektedir Yüksek duyarlılık Hazırlanan elektroda immobilize edilmiş olan enzim; sadece belirli maddelere (substratlara) karşı duyarlı olmalıdır. Duyarlılık, akım-derişim eğrisinin eğimi ile orantılıdır. Eğim değeri büyüdükçe duyarlılıkta da artış gözlenir. Kullanılan enzimin substratları dışında biyosensörlerin girişim yapan maddelerden etkilenmemesi istenir Yeterli düzeyde tayin sınırı Tasarlanan biyosensörün ideal tanımına uyması için tayin sınırının belirli bir derişim değerinin altında olması gerekmektedir. Belirtilen bu tayin sınırı elektrot yüzeyinin büyüklüğü, enzimin tayin edilecek maddeye karşı olan afinitesi, immobilize edilen enzim miktarı, enzimin immobilizasyonunda kullanılan polimer tabakasının kalınlığı gibi faktörlerden etkilenir Geniş ölçüm aralığı Ölçüm aralığı denen bölge, biyosensörden alınan akım-derişim eğrilerinin lineer olduğu derişim aralığıdır. Tüm biyosensör uygulamalarında çalışma

55 40 ortamında belirli bir derişim değerine ulaşıldıktan sonra akım-derişim eğrilerinde lineerlikten sapma gözlenmeye başlar. Bu durum enzimatik eğrilerin en önemli ve de karakteristik özelliğidir. Lineerlikten sapmanın nedeni yanıt olarak okunan akım değerlerindeki değişimin azalmasından kaynaklanır. Bunun nedeniyse ortamda artan analizlenecek madde miktarının fazlasıyla reaksiyona girecek enzim olmamasıdır Hızlı cevap zamanı Amperometrik uygulamalarda analizlenecek bir madde örneğini çalışma ortamına enjekte etmeden önce elektrot yüzeyinde oluşan akımın sabit kalması istenir. Akım sabit kaldıktan sonra analizlenecek madde ortama enjekte edilir ve akımdaki değişim kaydedilir. İkinci bir enjeksiyondan önce akım değerinin yine sabit kalması beklenir. İşte ilk enjeksiyondan sonra akımın tekrar sabit kalmasına kadar geçen zamana cevap zamanı denir. Cevap zamanının kısa ya da hızlı olması ideal sensörlerin özelliklerindendir Basitlik ve ucuzluk Kullanımı, tasarımı basit ve ucuz biyosensörler hazırlamak biyosensör yapımında her zaman hedef alınmış bir düşüncedir. Biyosensör yapılarının basitleştirilmesine en iyi örnek ikinci kuşak biyosensörlerin yapılarında bulunan mediyatörlerin daha gelişmiş modeller olan üçüncü kuşak biyosensörlerde ortadan kaldırılmasıdır [41] Kaynak Araştırması Yang ve arkadaşları kolin tayin edebilmek amacıyla ikili enzim sistemi kullanarak amperometrik tayin yapmıştır. Kolin biyosensörü peroksidaz

56 41 enzimi immobilize edilmiş karbon pasta elektrodun üzerine kolin oksidaz enziminin çapraz bağlama ile immobilize edilmesiyle meydana getirilmiştir. Peroksidaz enzimi içeren karbon pastaya tiyonin monomeri ilave edilmiş, tiyonin monomorlerinin elektropolimerizasyonu gerçekleştirilmiş daha sonra çitosan film kullanılarak glutaraldehit ile çapraz bağlama gerçekleştirilmiştir. Elektropolimerizasyonla elde edilen poli (tiyonin) elektrot yüzeyi ve peroksidaz enzimi arasında elektron transferinde görev alır. Ayrıca polimer enzimin karbon pastaya immobilizasyonuna olanak tanır. Amperometrik tayin için sabit potansiyel -0,20 V olarak seçilmiş, ph 7,4 olan fosfat tamponu kullanılmıştır. Elektrodun doğrusal tayin aralığı 5.0 x x 10-4 M olarak, cevap süresi ise 15 s olarak bulunmuştur [42]. Yang ve arkadaşları kolin oksidaz enzimini geniş ph aralığına ve elektrik aktivitesi iyi olan poli (anilin-ko-o-aminofenol) filme immobilize ederek yeni bir biyosensör tasarlamışlardır. Amperometrik tayin hidrojen peroksidin yükseltgenmesini temel almıştır. Sabit potansiyel olarak 0,40 V seçilmiş, ph 8,0 olan fosfat tamponu tayinlerde kullanılmış ve cevap akımının 277,1-308 K arasında artan sıcaklıkla arttığı görülmüştür. Gözlenen aktivasyon enerjisi 30,8 kj mol -1 olarak hesaplanmıştır. Elektrodun doğrusal tayin aralığı 1,0 x ,0 x 10-4 M olarak, cevap süresi ise s olarak bulunmuştur [43]. Kok ve ekibi poli ( 2-hidroksietil metakrilat) üzerine asetilkolin esteraz ve kolin oksidazın ikili immobilize edildiği, karbamat insektisit tayinine yönelik bir biyosensör tasarlamışlardır. İmmobize edilen enzimlerin uzun raf ömrüne sahip olduğu, enzimlerin 2 ayda %15 aktivite kaybına uğradığı gözlemlenmiştir. Çalışma sıcaklığı 30 C, çalışma tamponu ph 7,0 fosfat tamponu olarak seçilmiştir. Doğrusal çalışma aralığı ve ppb (karbamat insektisit) olarak bulunmuştur [44]. Langer ve arkadaşları mikrometre veya nanometre seviyesindeki kalınlığı ve gözenekliliği kontrol edilen polianilin kolin oksidaz biyosensörü tasarlamışlardır. Enzim moleküllerini immobilize etmek ve kontrollü kalınlığı

57 42 sağlamak amacıyla voltametrik teknikler kullanılmıştır. Cevap akımları 0,40 V sabit potansiyelde alınmıştır. ph 8,0 olan fosfat tamponu kullanılmıştır. Doğrusal çalışma aralığı 0 35 mm olup, ölçümler 20 C da gerçekleştirilmiştir. Bir ay sonunda biyosensörün cevap akımlarında pek fazla değişiklilik olmaması memnun edici bir durum olarak rapor edilmiştir [45]. Razola ve ekibi, elektrot yüzeyine kolin oksidazı immobilize ederek hidrojen peroksitin yükseltgenmesini temel alan bir kolin biyosensörü tasarlamışlardır. Kolin oksidaz biyosensörü, sıvı karbon pasta elektrot yüzeyine immobilize olmuş peroksidazın üzerine kolin oksidazın biriktirilmesiyle oluşturulmuştur. Diyaliz membranı kullanılarak medyatör olan fenotiazin elektrot yüzeyine fiziksel olarak tutturulmuştur. Kolin ölçümleri sırasında ph 7,4 olan fosfat tamponu kullanılmıştır. Doğrusal çalışma aralığı 5,0 x ,0 x 10-5 M, tayin sınırı ise 1,0 x 10-7 M olarak bulunmuştur. Çalışma sıcaklığı ise 37 C dir [46]. Shi ve arkadaşları kolin oksidazın Pt elektrot yüzeyine Prussian Blue ile modifiye edilmiş, katmanlı bir şekilde biriktirilen bir filme immobilize ederek amperometrik kolin biyosensörü tasarlamışlardır. Katmanlı filmi hazırlamak için 6-o-etoksi-trimetilamoniçitosan klorit ( EACC ) kullanılmışlardır. Düşük tayin sınırı 5,0 x 10-7 M, kısa cevap süresi (10 s), yüksek duyarlılık ve iyi seçiciliği tasarlanan biyosensörün avantajlarıdır. ph ve sıcaklık etkileri çalışılmış, gözlenen Michaelis Menten sabiti 0,0083 ± 0,001 x 10-3 M olarak bulunmuştur. Ayrıca hazırlanan biyosensörün uzun süreli depolanma ömrü olduğu görülmüştür [47]. Guerrieri ve ekibi asetil kolin ve onun reaksiyon sonucu ürünü olan kolini tayin etmek amacıyla bir biyosensör tasarlamışlardır. Asetilkolin esteraz ve kolin oksidaz glutaraldehit ile çapraz bağlama yapılarak immobilize edilmiştir. Sentezlenen poli ( pirol ) ve poli ( 2-naftol ) kompozit film ile elektrokimyasal olarak aktif olan türlerin ( dopamin, askorbik asit, vs.) tasarlanan biyosensöre etkisi araştırılmıştır. Asetilkolin esteraz kolin oksidaz dan oluşan elektrot

58 43 için tayin sınırı 100 nm, kolin oksidazdan oluşan kolin biyosensörü için kolin tayin sınırı 40 nm olarak bulunmuştur. Çalışmalarda ph 8,5 olan fosfat tamponu kullanılmıştır [48]. Patı ve ekibi çiğ sütte serbest ve fosfoditile bağlı kolini tayin etmek için amperometrik bir biyosensör tasarlamışlardır. Kolin ve fosfaditil kolin için doğrusal tayin aralığı 0,5 mm 1,0 mm, tayin sınırı ise sırasıyla 0,02 mm ve 0,03 mm olarak bulmuşlardır. Çalışmalarda ph 7,4 olan fosfat tamponu kullanılmış, enzim immobilizasyonunda ise glutaraldehit ile çapraz bağlama tekniği kullanılmıştır. Gözlenen Michaelis Menten sabiti 1,86 ± 0,04 mm olarak bulunmuştur [49]. Pati ve arkadaşları süt hidrolizatlarında kolin tayini yapabilmek amacıyla reaksiyon sonucu oluşan hidrojen peroksitin yükseltgenmesini temel alan amperometrik bir biyosensör tasarlamışlardır. Aminopropil ile modifiye edilmiş gözenekleri kontrollü cam kürelere kolin oksidaz glutaraldehit ile çapraz bağlanarak enzim reaktörleri hazırlanmıştır. Elektroaktif türlerin biyosensörün cevabına bozucu bir etki yapmadığı gözlenmiştir. 20 gün boyunca biyosensörün kararlılığını koruduğunu, 20 günden sonra iki ay içerisinde kararlılığında %70 azalma olduğu gözlemlenmiştir. Gözlenen Michaelis Menten sabiti 1,8 ± 0,2 mm olarak bulunmuştur [50]. Rahman ve arkadaşları poli 5,2 : 5,2 tertofen karboksili asit ( TTCA ) ile mofiye edilmiş elektrot yüzeyine kolin oksidaz enzimi ve kolin oksidaz peroksidaz ikili enzimlerini kovalent olarak immobilize ederek, kolin biyosensörü tasarlamışlardır. Kolin oksidaz immobilize edilmiş elektrot ile enzimatik reaksiyon sonucu oluşan hidrojen peroksitin 0,60 V da yükseltgenmesiyle kolin tayini yapılmıştır. Diğer biyosensörde ise enzimatik reaksiyon sonucu oluşan hidrojen peroksitin 0,20 V da indirgenmesi esas alınmıştır. Sensörlerin duyarlılığı araştırılmış; ph, çalışılması gereken potansiyel ve sıcaklık gibi parametreler çalışılmıştır. İkili enzim sisteminden oluşan biyosensör 1, , M doğrusal çalışma aralığına

59 44 sahiptir. Tayin sınırı ise her iki biyosensör için 1, M olarak bulunmuştur. Biyosensörlerin cevap süresi ise 5 s olarak kaydedilmiştir. İkili enzim sisteminden oluşan biyosensörün sadece kolin oksidazdan oluşan biyosensöre göre depo kararlılığının daha fazla olduğu görülmüştür [51]. Lo pez ve ekibi kolin tayini yapabilmek amacıyla kolin oksidazı poliakrilamit mikrojellerde tutuklamıştır. Çalışma elektrodu bir diyaliz membran sayesinde enzim yüklenmiş kürelerin platin elektrot yüzeyine alınmasıyla hazırlandı. Hazırlanan elektrodun en iyi çalışma koşulları araştırılmış ph 9,0, sıcaklık 20 C 30 C arasında, çalışma potansiyeli 0,60 V olarak bulunmuştur. Tayin sınırı 8,0 µm, doğrusal tayin aralığını 2,0 x 10-5 M 2,0 x 10-4 M olarak bulunmuştur. Ayrıca hazırlanan biyosensör kolin oksidazı inhibe eden nikotin tayini için de kullanılabilmektedir [52]. Shimomura ve arkadaşları 12 nm çapında gözenekleri olan bir hibrid membrana kolin oksidazın immobilize edilmesiyle bir kolin biyosensörü hazırlamışlardır. Tayinler enzimatik reaksiyon sonıucu oluşan hidrojen peroksidin tayinine yönelik yapılmıştır. Oluşturulan biyosensör diğer biyosensörlere göre oldukça kararlıdır. 80 günün sonunda dahi cevap akımları başlangıç akımlarını korumuştur. Tayin sınırı ve cevap süresi sırasıyla 5,0 800 µm ve 2 dk olarak kaydedilmiştir [53]. Song ve çalışma grubu kolin oksidazın platin modifiye carbon nanotüplere silika jel oluşturularak immobilize edilmesiyle kolin duyarlı biyosensör tasarlamışlardır. Yapılan araştırmalarfa karbon nanotüplerin düşük potansiyelde hidrojen peroksitin yükseltgenmesinde yüksek elektrokatalitik aktivite gösterdiği görülmüştür. Deneysel ph, sıcaklık ve çalışılması gereken potansiyel platin ve karbon nanotüp elektrotlar için araştırılmış olup değerler sırasıyla; ph 8,0 ve 7,4; sıcaklık 30 C ve 35 C; çalışma potansiyeli ise 0,16 V olarak bulunmuştur [54].

60 45 Doretti ve çalışma grubu asetilkolin tayini yapabilmek amacıyla ikili enzim sistemi kullanılarak bir biyosensör tasarlamışlardır. Bu amaçla asetilkolin esteraz ve polivinil alkol krojel membranlara hapsedilmiş polietil glikol modifiye kolin oksidazın fiziksel immobilizasyonu ile polimerler hazırlanmıştır. Enzim modifiye elektrot amperometrik sensör hazırlanabilmesi için platin elektrot yüzeyine alınmıştır. Bu çalışmada en uygun ph kolin sesnsörü için 8,0; en uygun sıcaklık 25 C; gözlenen Michaelis Menten sabiti 0,4 mm ve tasarlanan biyosensör için doğrusal çalışma aralığı µm olarak bulunmuştur [55]. Kok ve ekibi ikili pestisit karışımlarının tayini amacıyla asetilkolin esteraz ve kolin oksidazdan oluşan bir biyosensör tasarlamışlardır. Bu amaçla asetilkolin esteraz ve kolin oksidaz poli (2 hidroksietil metakrilat ) membrana immobilize edilerek asetilkolin esteraz inhibitörlerinin tayini yapılmıştır. phema membranlarda istenilen gözenekliliği sağlamak amacıyla SnCl 4 kullanılmıştır. Çeşitli pestisitler ve bunlardan oluşan ikili karışımların asetilkolin esteraz enzimini inhibisyonun tek tek kullanımlara göre daha düşük olduğu görülmüştür [56]. Qu ve çalışma grubu kolin tayini yapabilmek amacıyla polianilin film kullanarak karbon nanotüp ile amperometrik tayin yapmışlardır. Karbon nanotübün yüzeyi derişik sülfirik ve nitrik asit kullanılarak aktifleştirilmiştir. Katman katman biriktirme yöntemi kullanılarak hazırlanan karbon nanotüp elektrot ve polianilin modifiye camsı karbon elektrot 0,20 V da hidrojen peroksitin geniş derişim aralığında mükemmel sonuçlar vermiştir. Kolin oksidazın bağlanmasından sonra yapılan tayinlerde; doğrusal tayin aralığı 1,0 x ,0 x 10-3 M olarak bulunmuştur. Cevap süresi 3 s ve tayin sınırı 0,3 µm olarak bulunmuştur [57]. Marazuela ve ekibi serum numunelerinde kolin içeren fosfolipitlerin tayinine yönelik fiber optik biyosensör tasarlamışlardır. Fosfolipitler fosfolipaz-d enzimiyle koline dönüştürülür daha sonra kolin oksidaz ve oksijen vasıtasıyla

61 46 fiber optik biyosensör oluşturulmuştur. Biyosensör tabakası naylon membrana immobilize olmuş enzimden; Ru(II) kompleks ve tris(4,7-difenil- 1,10-fenantrolin) rutenyum (II) silikon membrana yayılmış oksijen duyarlı tabakadan oluşur. Biyosensörün en iyi çalışma koşulları flow injection tekniği kullanılarak araştırılmıştır. Biyosensörün doğrusal çalışma aralığı fosfoditilkolin için 0,08 ± 3,00 mg ml -1 olarak tanımlanmıştır [58]. Ren ve çalışma arkadaşları kolin tayini amacıyla altın nano parçacıklarından oluşan yüksek duyarlılığa sahip bir biyosensör tasarlamışlardır. Kolin oksidaz sol gel metaodu kullanılarak altın parçacıklarından ve polivinil alkoldan oluşan kompozite immobilize edilmiştir. Küresel kristaller kolin oksidazın altın nano parçacıklarıyla etkileştikten sonra ikincil yapısını koruduğunu göstermiştir. CV ve elektrokimyasal impedans spektroskisi tasarlanan elektrotta altın nano parçacıklarının kullanılması elektriksel iletkenliği arttırabildiğini göstermiştir. Amperometrik tayin için seçilen potansiyel elektroaktif türlerin bozucu etkisinin en aza indiği 0,40 V tercih edilmiştir. Çalışılan sıcaklılık 35 C olarak seçilmiş; enzimin en iyi aktivite gösterebildiği ph ise 8,0 olarak belirtilmiştir.[59] Zhang ve ekibi kolin tayini yapabilmek amacıyla kolin oksidaz ve peroksidaz enzimlerini β siklodekstrin ve platin nano parçacıklarıyla modifiye edilmiş altın elektrotta birleştirilerek yeni bir biyosensör tasarlamışlardır. Kare dalga voltagramları 0,38 mv da doğrusal bir çalışma aralığının elde edildiğini göstermiş; doğrusal çalışma aralığının M olduğu, tayin sınırının ise 0,1 nm olduğu gözlemlenmiştir. ph 7,0 fosfat tamponu çalışmalarda kullanılmıştır.[60] Yang ve grubu tütündeki nikotin inhibisyonunu araştırmak amacıyla bir biyosensör tasarlamışlardır. Sadece kolin oksidazın kullanıldığı bir biyosensörden ziyade 1,4 benzokinonun medyatör olarak kullanıldığı kolin biyosensörü tasarlanmıştır. Kolin oksidaz glutaraldehit ile çapraz bağlama tekniği kullanılarak karbon pasta elektroda immobilize edilmiştir. 450 mv

62 47 çalışılan potansiyeldir. 1, , mol l 1 doğrusal çalışma aralığı olarak bulunmuştur. İnhibisyon çalışmalarında ph 7,4 fosfat tamponu kullanılmıştır. Nikotin için doğrusal çalışma aralığı 2, , mol l 1 ve tayin sınırı 1, mol l 1 olarak bulunmuştur [61].

63 48 3. DENEYSEL KISIM 3.1 Cihazlar ve Malzemeler Elektrokimyasal analiz cihazı Amperometrik ölçme işlemlerinde Epsilon-EC-Ver NT elektrokimyasal analiz cihazı kullanıldı Hücre ve elektrotlar Amperometrik ölçme işlemlerinde Şekil 3.1 de verilen üç elektrotlu ölçme sistemi kullanıldı. Referans elektrot olarak BAS RE-5B no lu Ag/AgCl, karşıt elektrot olarak MW-1032 no lu platin tel ve çalışma elektrodu olarak 0,5 cm² yüzey alanlı ve polipirol-polivinilsülfonat ile kaplanmış platin levha elektrotlar kullanıldı. Şekil 3.1.Kaplama ve ölçümde kullanılan hücre sistemi