GIDA MÜHENDİSLİĞİ ANABİLİM DALI

Transkript

1 ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ DOKTORA TEZİ Bülent ZORLUGENÇ ÇEŞİTLİ GIDA MADDELERİNDEN Flavobacterium aurantıacum İLE AFLATOKSİN B 1 MİKTARININAZALTILMASI ÜZERİNE BİR ARAŞTIRMA GIDA MÜHENDİSLİĞİ ANABİLİM DALI ADANA, 2009

2 ÖZ DOKTORA TEZİ ÇEŞİTLİ GIDA MADDELERİNDEN Flavobacterium aurantiacum İLE AFLATOKSİN B 1 MİKTARININ AZALTILMASI ÜZERİNE BİR ARAŞTIRMA Bülent ZORLUGENÇ ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ GIDA MÜHENDİSLİĞİ ANABİLİM DALI Danışman : Prof.Dr. Bülend EVLİYA Yıl : 2009, Sayfa: 141 Jüri : Prof.Dr. Bülend EVLİYA Prof. Dr. Halime PAKSOY Doç. Dr. Hüseyin ERTEN Yrd. Doç. Dr. Işıl VAR Yrd. Doç. Dr. Ahmet Doğan DUMAN Bu çalışmada, Flavobacterium aurantiacum NRRL B-184 suşunun potasyum fosfat tamponu (PFT) ortamında ve sıklıkla aflatoksin sorunu yaşanan kırmızı biber, mısır, zeytin, soya fasulyesi, kuru incir ve fındıkta aflatoksin B 1 (AFB 1 ) i ortamdan uzaklaştırma yeteneği araştırılmıştır. Aktifleştirilmiş F. aurantiacum NRRL B-184 suşunun triptik soy broth (TSB) besiyerinde ve 30 o C inkübasyon sıcaklığındaki gelişimine ait gelişme eğrisi elde edilmiş ve doğrusal olmayan regresyon analizi sonuçlarına göre gelişme eğrisini tanımlamada Modifiye Gompertz modelinin daha uygun olduğu sonucuna varılmıştır. Modelden elde edilen verilere göre, F. aurantiacum NRRL B-184 suşunun maksimum spesifik gelişme hızının saat -1, lag süresinin ise saat olduğu hesaplanmıştır. Ayrıca başlangıç hücre sayısı 1.32 x 10 7 kob ml -1 olan F. aurantiacum NRRL B-184 suşunun 45 saatte 2.7 log luk bir artışla durgun faza geçtiği ve 95. saat sonunda hala durgun fazda olduğu belirlenmiştir. İnkübasyon süresince, F. aurantiacum NRRL B-184 içermeyen kontrol örneklerinin AFB 1 içeriğinde önemli bir değişim görülmezken, bakteri hücrelerini içeren PFT ve gıda ortamlarında AFB 1 miktarında sürekli bir azalma gerçekleşmiştir. Bu durum, toksin miktarındaki azalmanın F. aurantiacum NRRL B-184 hücrelerinin bir faaliyeti sonucu meydana geldiğini göstermektedir. F. aurantiacum NRRL B-184 suşu aşılanmış PFT ve gıda ortamlarındaki azalmanın Birinci Dereceden Reaksiyon Kinetiğine uygun olduğu tespit edilmiştir. Bu modele göre birim zamanda konsantrasyonun oransal olarak azalış hızını gösteren k değeri en yüksek PFT ortamlarında bulunmuş ve bunu öğütülmüş ürünlerde genel itibariyle incir, bütün ürünlerde ise zeytin izlemiştir. Öğütülmüş ve bütün haldeki ürünlerde çalışılan tüm aflatoksin konsantrasyonlarında en düşük k değerlerine soya fasulyesi örnekleri sahip olmuştur. Konsantrasyon ve boyut önemsenmeksizin, inkübasyon süresi sonunda ürünlerin AFB 1 içeriğindeki azalma 1000 ng g -1 AFB 1 içeren bütün haldeki soya fasulyesinde %84.28 ile en düşük ve 500 ng g -1 AFB 1 içeren öğütülmüş fındıkta %99.84 ile en fazla olarak gerçekleşmiştir. 72 saatlik inkübasyon sonunda 500 ng g -1 AFB 1 içeren öğütülmüş kırmızı biber, 500 ng g -1 AFB 1 içeren öğütülmüş kuru incir ile 500 ve 1000 ng g -1 AFB 1 içeren öğütülmüş fındık örnekleri Türk Gıda Kodeksinde bu ürünlerin insan gıdası olarak kullanılması durumunda izin verilen AFB 1 düzeylerine inebilmiştir. Anahtar kelimeler: Flavobacterium aurantiacum, Aflatoksin B 1, Detoksifikasyon, Kinetik, Tahminsel Mikrobiyoloji I

3 ABSTRACT PhD THESIS A RESEARCH ON DEGRADATION OF AFLATOXIN B 1 FROM VARIOUS FOODS BY Flavobacterium aurantiacum Bülent ZORLUGENÇ DEPARTMENT OF FOOD ENGINEERING INSTITUTE OF NATURAL AND APPLIED SCIENCES UNIVERSITY OF ÇUKUROVA Supervisor :Prof.Dr. Bülend EVLİYA Year :2009, Pages: 141 Jury :Prof.Dr. Bülend EVLİYA Prof. Dr. Halime PAKSOY Doç. Dr. Hüseyin ERTEN Yrd. Doç. Dr. Işıl VAR Yrd. Doç. Dr. Ahmet Doğan DUMAN In this study, the ability of Flavobacterium aurantiacum NRRL B-184 strain to remove aflatoxin B 1 in potassium phosphate buffer (PPB) solution and dry red pepper, corn, olive, soy bean, dry fig and also hazelnut, was investigated. The activated F. aurantiacum NRRL B-184 strain was incubated in triptic soy broth (TSB) at 30 C and growing curve was obtained. According to non-linear regression analysis, Modified Gompertz model was fitted best with experimental data. The maximum specific growing rate (µ max ) and lag time (λ) were found as h -1 and h, respectively. It was observed that F. aurantiacum NRRL B-184 strain increased by 2.7 log and reached to the stationary phase within 45 h. The bacteria were still in that phase at 95 h. During incubation, aflatoxin B 1 contents of control samples were not changed significantly. However in PPB and food mediums, the level of aflatoxin B 1 was decreased continuously. This situation was indicated that, the reduction of aflatoxin B 1 content was relevant to the activity of F. aurantiacum NRRL B-184 cells. First order reaction kinetics was fitted best with the reduction kinetics. In PPB medium, the k value was found higher and followed by milled dry fig and whole olive. Also, the lower k value was found in soy bean samples. At the end of incubation, the reduction of aflatoxin B 1 content were resulted in the rate of % and % at whole soy bean (1000 ng g -1 AFB 1 ) and milled hazelnut (500 ng g -1 AFB 1 ), respectively. After incubation (72 h), aflatoxin content of milled red pepper, dry fig and hazelnut that contain 500 ng g -1 aflatoxin B 1 and also whole hazelnut (1000 ng g -1 aflatoxin B 1 ) decreased to permitted level of this toxin in Turkish Food Codex. Key words: Flavobacterium aurantiacum, Aflatoxin B 1, Detoxification, Kinetic, Predictive Microbiology II

4 TEŞEKKÜR Lisans ve lisansüstü eğitimim boyunca bana yol gösteren, araştırmamın düzenlenmesi, gerçekleştirilmesi ve değerlendirilmesi sırasında yardımlarını esirgemeyen danışman hocam Sayın Prof. Dr. Bülend EVLİYA ya teşekkürlerimi sunarım. Öğrenim hayatım boyunca ilgi ve yardımlarını esirgemeyen Sayın Prof. Dr. Hasan FENERCİOĞLU na ve Yrd.Doç.Dr Sertaç ÖZER e, Manevi desteğinden dolayı eşim Arş. Gör. Feyza KIROĞLU ZORLUGENÇ e, Bu araştırmanın gerçekleştirilmesi ve değerlendirilmesinde katkı ve desteklerini gördüğüm; Sayın Prof.Dr. Halime PAKSOY a, Doç.Dr. Hüseyin ERTEN e, Yrd.Doç.Dr. Işıl VAR a ve Yrd.Doç.Dr. Ahmet Doğan DUMAN a, F. aurantiacum NRRL B-184 suşunu sağlayan United States Department of Agriculture, Agricultural Research Service Midwest Area National Center for Agricultural Utilization Research Labaratuvarı na, Toksin analizlerini yapabilmeme olanak sağlayan ve bu konudaki deneyimlerini benden esirgemeyen Mersin İl Kontrol laboratuarından Gıda Yük. Müh. İbrahim KARAYEL e ve Ziraat Müh. Erhan DİNÇ ile Gaziantep İl Kontrol laboratuarından Ziraat Yüksek Müh. Murat Reis AKKAYA ya, İlgi ve manevi desteklerini esirgemeyen değerli aileme, Maddi ve manevi desteklerinden dolayı Ç.Ü. Araştırma Fonu ve Fen Bilimleri Enstitüsü ne, teşekkürlerimi sunarım. III

5 İÇİNDEKİLER SAYFA ÖZ... I ABSTRACT... II TEŞEKKÜR... III İÇİNDEKİLER... IV ÇİZELGELER DİZİNİ... VIII ŞEKİLLER DİZİNİ... XI KISALTMALAR... XVI 1. GİRİŞ ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Aflatoksin Aflatoksinlerin Genel Özellikleri Aflatoksinler ve Biyosentezi Aflatoksinlerin Toksisitesi, Metabolizması ve Limitleri Aflatoksinlerin Detoksifikasyonu Fiziksel Ayırma ve Temizleme Yöntemleri Fiziksel Degradasyon Yöntemleri Isı Işınlama Adsorbsiyon Solventlerle Özütleme Kimyasal Detoksifikasyon Yöntemleri Asit Uygulaması Hidroksit ile Alkali Uygulaması Bisülfit Uygulaması Hipoklorit Uygulaması Amonyak Uygulaması Ozon Uygulaması Biyolojik Detoksifikasyon MATERYAL VE YÖNTEM MATERYAL IV

6 F. aurantiacum NRRL B-184 Bakteri Kültürü PFT Çözeltisi İnce Tabaka Plakası Detoksifikasyonda Kullanılan Gıda Maddeleri Besiyerleri ve Kimyasal Maddeler YÖNTEM F. aurantiacum NRRL B-184 Suşunun Canlandırılması ve Stok Kültürlerin Hazırlanması F. aurantiacum NRRL B-184 Suşunun Gelişme Eğrisinin Elde Edilmesi F. aurantiacum NRRL B-184 Bakteri Suşunun Durgun Faz Hücre Süspansiyonunun Hazırlanması F. aurantiacum NRRL B-184 Bakteri Suşunun Durgun Faz Hücre Konsantrasyonunun Spektrofotometrik Olarak Belirlenmesi Durgun Faz da Bulunan F. aurantiacum NRRL B-184 Suşu ile Aşılanmış Ortamların AFB 1 Konsantrasyonundaki Değişimin Belirlenmesi PFT İçerisinde F. aurantiacum NRRL B-184 un AFB 1 in Miktarı Üzerine Etkisinin Belirlenmesi PFT İçerisinde Değişik Gıda Ürünlerinde F. aurantiacum NRRL B-184 ün AFB 1 in Miktarı Üzerine Etkisinin Belirlenmesi Aflatoksin Analizleri Gıda Örneklerinin Aflatoksin İçeriklerinin Kalitatif Olarak Belirlenmesi Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi (HPLC) ile AFB 1 Analizi (1). AFB 1 Standart Çözeltisinin Hazırlanması (2). PBS Çözeltisinin Hazırlanması (3). Ekstraksiyon ve Temizleme Aşamaları (4). AFB 1 in Belirlenmesi V

7 Geri Kazanım Oranının Belirlenmesi İstatistiksel Analizler F. aurantiacum NRRL B-184 Suşuna Ait Gelişme Eğrisinin Matematiksel Modellere Uygunluğunun Belirlenmesi F. aurantiacum NRRL B-184 Suşunun AFB 1 Degradasyon Kinetiğinin Belirlenmesi ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA F. aurantiacum NRRL B-184 Suşunun Gelişme Eğrisinin Belirlenmesi F. aurantiacum NRRL B-184 Suşuna Ait Gelişme Eğrisinin Matematiksel Modellere Uygunluğunun Belirlenmesi F. aurantiacum NRRL B-184 Suşunun Hücre Konsantrasyonunun Belirlenmesi F. aurantiacum NRRL B-184 Hücrelerinin PFT İçerisinde Aflatoksini Azaltmasının Belirlenmesi ve Kinetiği F. aurantiacum NRRL B-184 Hücrelerinin PFT İçerisinde Aflatoksini Azaltmasının Belirlenmesi F. aurantiacum NRRL B-184 Hücrelerinin PFT İçerisinde Aflatoksini Azaltmasının Kinetiği F. aurantiacum NRRL B-184 Hücrelerinin Değişik Gıda Ürünleri İçeren PFT İçerisinde Aflatoksini Azaltmasının Belirlenmesi ve Kinetiği F. aurantiacum NRRL B-184 Hücrelerinin Aflatoksini Azaltmasının Belirlenmesi ve Kinetiği AFB 1 in Değişik Gıda Ürünlerindeki Geri Kazanım Oranları F. aurantiacum NRRL B-184 Hücrelerinin Kuru Kırmızı Biberde Aflatoksini Azaltmasının Belirlenmesi F. aurantiacum NRRL B-184 Hücrelerinin Kırmızı Biberde Aflatoksini Azaltmasının Kinetiği F. aurantiacum NRRL B-184 Hücrelerinin Mısırda Aflatoksini Azaltmasının Belirlenmesi ve Kinetiği F. aurantiacum NRRL B-184 Hücrelerinin Mısırda Aflatoksini Azaltmasının Belirlenmesi VI

8 F. aurantiacum NRRL B-184 Hücrelerinin Mısırda Aflatoksini Azaltmasının Kinetiği F. aurantiacum NRRL B-184 Hücrelerinin Siyah Zeytinde Aflatoksini Azaltmasının Belirlenmesi ve Kinetiği F. aurantiacum NRRL B-184 Hücrelerinin Siyah Zeytinde Aflatoksini Azaltmasının Belirlenmesi F. aurantiacum NRRL B-184 Hücrelerinin Siyah Zeytinde Aflatoksini Azaltma Kinetiği F. aurantiacum NRRL B-184 Hücrelerinin Soya Fasulyesinde Aflatoksini Azaltmasının Belirlenmesi ve Kinetiği F. aurantiacum NRRL B-184 Hücrelerinin Soya Fasulyesinde Aflatoksini Azaltmasının Belirlenmesi F. aurantiacum NRRL B-184 Hücrelerinin Soya Fasulyesinde Aflatoksini Azaltma Kinetiği F. aurantiacum NRRL B-184 Hücrelerinin Kuru İncirde Aflatoksini Azaltmasının Belirlenmesi ve Kinetiği F. aurantiacum NRRL B-184 Hücrelerinin Kuru İncirde Aflatoksini Azaltmasının Belirlenmesi F. aurantiacum NRRL B-184 Hücrelerinin Kuru İncirde Aflatoksini Azaltma Kinetiği F. aurantiacum NRRL B-184 Hücrelerinin Fındıkta Aflatoksini Azaltmasının Belirlenmesi ve Kinetiği F. aurantiacum NRRL B-184 Hücrelerinin Fındıkta Aflatoksini Azaltmasının Belirlenmesi F. aurantiacum NRRL B-184 Hücrelerinin Fındıkta Aflatoksini Azaltma Kinetiği SONUÇ VE ÖNERİLER KAYNAKLAR ÖZGEÇMİŞ EKLER VII

9 ÇİZELGELER DİZİNİ SAYFA Çizelge 2.1. Aflatoksinlerin Kapalı Formülleri Erime Noktaları ve Ultroviyole Işığında Verdikleri Renkler (Johnson ve Peterson, 1974; Jay, 1992) Çizelge 2.2. Çizelge 2.3. Çizelge 4.1. Çizelge 4.2. Çizelge 4.3. Türkiye de Gıdalarda Bulunmasına İzin Verilen Aflatoksin Düzeyleri (µg kg -1 ) (TGK, 2009) Avrupa Birliği nde Gıdalarda Bulunmasına İzin Verilen Aflatoksin Düzeyleri (µg kg -1 ) (EC, 2008) F. aurantiacum NRRL B-184 Suşunun 30 o C de TSB Besiyerindeki Gelişimine Ait Kültürel Sayım Sonuçları F. aurantiacum NRRL B-184 Suşuna Ait Gelişme Verilerinin Modifiye Gompertz ve Modifiye Logistik Modellerine Göre Hesaplanan Parametre Değerleri Farklı Seyreltilerdeki F. aurantiacum NRRL B-184 Bakteri Süspansiyonunun 540 nm deki Absorbans Değerleri ve İçerdikleri Canlı Hücre Sayısı Çizelge 4.4. PFT Çözeltilerinin (Kontrol ve F. aurantiacum NRRL B-184 Çizelge 4.5. Çizelge 4.6. Çizelge 4.7. Hücresi İçeren Diğer Örneklerde) AFB 1 Konsantrasyonlarındaki (ng ml -1 ) Değişim ve % Azalma Oranları F. aurantiacum NRRL B-184 Suşu Tarafından PFT Ortamında AFB 1 in Degradasyon Kinetiğine Ait Regresyon Analizi Sonuçları PFT Çözeltisinde Farklı Düzeylerde AFB 1 İçeren Öğütülmüş ve Bütün Kırmızı Biber Örneklerinin Aflatoksin Konsantrasyonlarındaki (ng g -1 ) Değişim ve % Azalma Oranları F. aurantiacum NRRL B-184 Suşu Tarafından Kırmızı Biberde AFB 1 in Degradasyon Kinetiğine Ait Regresyon Analizi Sonuçları VIII

10 Çizelge 4.8. Çizelge 4.9. Kırmızı Biberlerin AFB 1 Düzeylerinin Kabul Edilebilir Limitlerin Altına İnme Süreleri PFT Çözeltisinde Farklı Düzeylerde AFB 1 İçeren Öğütülmüş ve Bütün Mısır Örneklerinin Aflatoksin Konsantrasyonlarındaki (ng g -1 ) Değişim ve % Azalma Oranları Çizelge F. aurantiacum NRRL B-184 Suşu Tarafından Mısırda AFB 1 in Degradasyon Kinetiğine Ait Regresyon Analizi Sonuçları Çizelge Mısır Örneklerinin AFB 1 Düzeylerinin Kabul Edilebilir Limitlerin Altına İnme Süreleri Çizelge PFT Çözeltisinde Farklı Düzeylerde AFB 1 İçeren Öğütülmüş ve Bütün Siyah Zeytin Örneklerinin Aflatoksin Konsantrasyonlarındaki (ng g -1 ) Değişim ve % Azalma Oranları Çizelge F. aurantiacum NRRL B-184 Suşu Tarafından Siyah Zeytinde AFB 1 in Degradasyon Kinetiğine Ait Regresyon Analizi Sonuçları Çizelge Siyah Zeytin Örneklerinin AFB 1 Düzeylerinin Kabul Edilebilir Limitlerin Altına İnme Süreleri Çizelge PFT Çözeltisinde Farklı Düzeylerde AFB 1 İçeren Öğütülmüş ve Bütün Soya Fasulyesi Örneklerinin Aflatoksin Konsantrasyonlarındaki (ng g -1 ) Değişim ve % Azalma Oranları Çizelge F. aurantiacum NRRL B-184 Suşu Tarafından Soya Fasulyesinde AFB 1 in Degradasyon Kinetiğine Ait Regresyon Analizi Sonuçları Çizelge Soya Fasulyelerinin AFB 1 Düzeylerinin Kabul Edilebilir Limitlerin Altına İnme Süreleri Çizelge PFT Çözeltisinde Farklı Düzeylerde AFB 1 İçeren Öğütülmüş ve Bütün Kuru İncir Örneklerinin Aflatoksin IX

11 Konsantrasyonlarındaki (ng g -1 ) Değişim ve % Azalma Oranları Çizelge F. aurantiacum NRRL B-184 Suşu Tarafından Kuru İncirde AFB 1 in Degradasyon Kinetiğine Ait Regresyon Analizi Sonuçları Çizelge Kuru İncirlerin AFB 1 Düzeylerinin Kabul Edilebilir Limitlerin Altına İnme Süreleri Çizelge PFT Çözeltisinde Farklı Düzeylerde AFB 1 İçeren Öğütülmüş Ve Bütün Fındık Örneklerinin Aflatoksin Konsantrasyonlarındaki (ng g -1 ) Değişim ve % Azalma Oranları Çizelge F. aurantiacum NRRL B-184 Suşu Tarafından Fındıkta AFB 1 in Degradasyon Kinetiğine Ait Regresyon Analizi Sonuçları Çizelge Fındık Örneklerinin AFB 1 Düzeylerinin Kabul Edilebilir Limitlerin Altına İnme Süreleri X

12 ŞEKİLLER DİZİNİ SAYFA Şekil 2.1. Aflatoksinlerin kimyasal yapısı (Banwart, 1989) Şekil 2.2. Şekil 2.3. Poliketit yolu içinde norsolorinik asit oluşumu (Watanabe ve Townsend, 2002) Aflatoksin biyosentez yolu ve biyosentezde rol oynayan genler (Sweeney ve Dobson, 1999) Şekil 2.4. AFB 1 in vücuttaki metabolizma yolları (Ueno, 1985) Şekil 2.5. AFB 1 -N 7 -Gua kompleksi (Ueno, 1985) Şekil 4.1. Şekil 4.2. F. aurantiacum NRRL B-184 suşunun 30 o C de TSB besiyerindeki gelişme eğrisi F. aurantiacum NRRL B-184 suşunun Modifiye Gompertz ve Modifiye Logistik modellerinden yararlanılarak elde edilen gelişme eğrileri Şekil 4.3. F. aurantiacum NRRL B-184 bakteri süspansiyonu Şekil 4.4. seyreltilerine ait absorbans değerleri (540 nm de) ile canlı hücre sayısı arasındaki ilişki ng ml -1 AFB 1 içeren PFT ortamında aflatoksinin sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere göre azalış eğrileri Şekil ng ml -1 AFB 1 içeren PFT ortamında aflatoksinin sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere göre azalış eğrileri Şekil ng ml -1 AFB 1 içeren PFT ortamında aflatoksinin sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere göre azalış eğrileri Şekil ng g -1 AFB 1 içeren öğütülmüş kırmızı biberde aflatoksinin sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere göre azalış eğrileri Şekil ng g -1 AFB 1 içeren öğütülmüş kırmızı biberde aflatoksinin sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere göre azalış eğrileri XI

13 Şekil ng g -1 AFB 1 içeren öğütülmüş kırmızı biberde Şekil aflatoksinin sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere göre azalış eğrileri ng g -1 AFB 1 içeren bütün kırmızı biberde aflatoksinin sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere göre azalış eğrileri Şekil ng g -1 AFB 1 içeren bütün kırmızı biberde aflatoksinin sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere göre azalış eğrileri Şekil ng g -1 AFB 1 içeren bütün kırmızı biberde aflatoksinin sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere göre azalış eğrileri Şekil ng g -1 AFB 1 içeren öğütülmüş mısırda aflatoksinin sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere göre azalış eğrileri Şekil ng g -1 AFB 1 içeren öğütülmüş mısırda aflatoksinin sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere göre azalış eğrileri Şekil ng g -1 AFB 1 içeren öğütülmüş mısırda aflatoksinin sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere göre azalış Şekil eğrileri ng g -1 AFB 1 içeren bütün mısırda aflatoksinin sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere göre azalış eğrileri Şekil ng g -1 AFB 1 içeren bütün mısırda aflatoksinin sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere göre azalış eğrileri Şekil ng g -1 AFB 1 içeren bütün mısırda aflatoksinin sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere göre azalış eğrileri Şekil ng g -1 AFB 1 içeren öğütülmüş siyah zeytinde aflatoksinin sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere göre azalış eğrileri XII

14 Şekil ng g -1 AFB 1 içeren öğütülmüş siyah zeytinde aflatoksinin sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere göre azalış eğrileri Şekil ng g -1 AFB 1 içeren öğütülmüş siyah zeytinde aflatoksinin sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere göre azalış eğrileri Şekil ng g -1 AFB 1 içeren bütün siyah zeytinde aflatoksinin sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere göre azalış eğrileri Şekil ng g -1 AFB 1 içeren bütün siyah zeytinde aflatoksinin sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere göre azalış eğrileri Şekil ng g -1 AFB 1 içeren bütün siyah zeytinde aflatoksinin sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere göre azalış eğrileri Şekil ng g -1 AFB 1 içeren öğütülmüş soya fasulyesinde aflatoksinin sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere göre azalış eğrileri Şekil ng g -1 AFB 1 içeren öğütülmüş soya fasulyesinde aflatoksinin sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere göre azalış eğrileri Şekil ng g -1 AFB 1 içeren öğütülmüş soya fasulyesinde Şekil Şekil aflatoksinin sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere göre azalış eğrileri ng g -1 AFB 1 içeren bütün soya fasulyesinde aflatoksinin sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere göre azalış eğrileri ng g -1 AFB 1 içeren bütün soya fasulyesinde aflatoksinin sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere göre azalış eğrileri XIII

15 Şekil Şekil Şekil Şekil ng g -1 AFB 1 içeren bütün soya fasulyesinde aflatoksinin sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere göre azalış eğrileri ng g -1 AFB 1 içeren öğütülmüş kuru incirde aflatoksinin sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere göre azalış eğrileri ng g -1 AFB 1 içeren öğütülmüş kuru incirde aflatoksinin sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere göre azalış eğrileri ng g -1 AFB 1 içeren öğütülmüş kuru incirde aflatoksinin sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere göre azalış eğrileri Şekil ng g -1 AFB 1 içeren bütün kuru incirde aflatoksinin sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere göre azalış eğrileri Şekil ng g -1 AFB 1 içeren bütün kuru incirde aflatoksinin sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere göre azalış eğrileri Şekil ng g -1 AFB 1 içeren bütün kuru incirde aflatoksinin sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere göre azalış eğrileri Şekil ng g -1 AFB 1 içeren öğütülmüş fındıkta aflatoksinin sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere göre azalış eğrileri Şekil ng g -1 AFB 1 içeren öğütülmüş fındıkta aflatoksinin sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere göre azalış eğrileri Şekil ng g -1 AFB 1 içeren öğütülmüş fındıkta aflatoksinin sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere göre azalış eğrileri XIV

16 Şekil Şekil Şekil ng g -1 AFB 1 içeren bütün fındıkta aflatoksinin sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere göre azalış eğrileri ng g -1 AFB 1 içeren bütün fındıkta aflatoksinin sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere göre azalış eğrileri ng g -1 AFB 1 içeren bütün fındıkta aflatoksinin sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere göre azalış eğrileri XV

17 KISALTMALAR AFB 1 : Aflatoksin B 1 AFB 1a : Aflatoksin B 1a AFB 2 : Aflatoksin B 2 AFB 2a : Aflatoksin B 2a AFG 1 : Aflatoksin G 1 AFG 2 : Aflatoksin G 1 AFM 1 : Aflatoksin M 1 AFM 2 : Aflatoksin M 2 PFT : Potasyum Fosfat Tamponu TSB : Triptic Soy Broth µ m : Maksimum Spesifik Gelişme Hızı λ A k F C o C t R 2 SEE RSS : Lag Süresi : Asimtot : Reaksiyon Hız Sabiti : Regresyon Önem Aralığı :Başlangıç Konsantrasyonu : t Zamanındaki Konsantrasyon : Belirtme Katsayısı : Tahminin Standart Hatası : Kalanların Kareler Toplamı MSE : Hata Kareler Ortalaması Exp : Üstel P : Önem Düzeyi Kob : Koloni Oluşturma Birimi XVI

18 1.GİRİŞ Bülent ZORLUGENÇ 1. GİRİŞ Küfler bir çok tarım ürününde; özellikle kırmızı biber, incir, fındık, mısır, buğday, arpa, çavdar ve bir çok yağlı tohumda tarlada, bahçede, hasat sonrasında, depolama süresince veya bu ürünlerin gıda ve hayvan yemi olarak işlenmeleri sırasında doğal olarak gelişmektedirler. Mikotoksinler; küflerin gelişimi sırasında normal metabolizması için önemli bir role sahip olmayan, ancak insan ve hayvanlarda kanserojen, mutajen, teratojen ve östrojenik etkiler gibi akut ve kronik etkilere neden olabilen ikincil metabolitlerdir. Genel olarak, poliketid (aflatoksinler), terpen (trikotesenler), amino asit (aflatoksin) ve trikarboksilik asit (rubratoksin) yolu gibi çeşitli biyokimyasal yollarla oluşan düşük molekül ağırlıklı ve antijenik olmayan metobolitlerdir (Jay, 1992; Smith, 2001). Bazı mikotoksinler yalnızca sınırlı sayıdaki küf türleri tarafından oluşurken diğerleri birçok cinse ait çeşitli türler tarafından üretilebilmektedir. Laboratuar koşullarında en az mikotoksin izole edilmiş ve bunların yaklaşık 20 tanesinin önemli düzeyde ve sıklıkta gıdalarda ve yemlerde oluştuğu belirlenmiştir. Bu mikotoksinlerin çoğunun hayvanlarda önemli toksisiteye neden olduğu görülmüştür. Mikotoksinler genelde insan ve hayvan besin sistemine doğrudan ve dolaylı olarak girmektedir. Doğrudan bulaşı, gıda veya yemin toksijenik küflerle enfekte olması ve sonradan toksin oluşmasıdır. Dolaylı bulaşı ise daha önce toksin üreten bir küf ile kontamine olmuş bir katkı maddesindeki küflerin kendiliğinden ölmesi veya işleme sırasında ortamdan uzaklaşmasına rağmen mikotoksinin çoğunlukla son üründe kalması durumudur (Smith, 2001). Mikotoksin içeren gıdaların tüketimi mikotoksikozis olarak adlandırılan toksik semptomların insanlarda ve hayvanlarda görülmesine neden olabilmektedir (Van Genderen, 1997). Çiftlik hayvanlarının oldukça fazla miktarda tahıl ve yağlı tohumları tüketmeleri nedeniyle mikotoksinli yemlerin hayvan sağlığı ve üretkenliği üzerindeki olumsuz etkilerinin bildirildiği çok sayıda çalışma mevcuttur. Ancak insanlarda görülen mikotoksikozis tam olarak anlaşılmamakla birlikte son yıllarda teşhisi 1

19 1.GİRİŞ Bülent ZORLUGENÇ giderek artmakta ve konu ile ilgili çalışmalar yapılmaktadır (Smith, 2001, Richard, 2007). Aflatoksinler; A. flavus, A. parasiticus türleri ve son yıllarda aflatoksikojenik olduğu belirlenen üçüncü bir tür A. nomius tarafından üretilen hepatoksik (karaciğere toksik) ve hepakarsinojenik (karaciğer kanseri etmeni) metabolitlerdir. Aynı zamanda mutajenik (genetik değişim) ve teratojenik (embriyo üzerine etkili) oldukları da bilinmektedir. (Banwart, 1989; İç ve Yavaş, 1993; Eley, 1996; Adams ve Moss, 1997; Martins ve Martins, 1999; Das ve Mishra, 2000; Jaimez ve ark., 2000; Preides ve ark., 2000). Aflatoksin sorunu, insan sağlığı açısından büyük bir tehlike oluşturmasının yanısıra, birçok ülke için ekonomik yönden de önem taşımaktadır. Aflatoksin oluşmuş gıdaları ihraç etmek mümkün olmamakta ve çoğu kez ürün imha edilmek zorunda kalınmakta veya denetim mekanizması yetersiz olan ülkelerde iç pazarda tüketime sunulmaktadır. Bu durum ya ağır ekonomik kayıplara yol açmakta ya da söz konusu ülkelerde insan sağlığı yönünden tehdit oluşturmaktadır. Ayrıca yemlerde bulunan toksin de, hayvanlarda ölüme kadar giden çok çeşitli etkilerin yanı sıra verim düşüklüğüne yol açarak ekonomik sorunlara neden olabilmektedir (Özkaya, 2001). Ayrıca hayvanlara ait ürünlerin tüketilmesi de insanlarda sağlık sorunlarına yol açabilmektedir. Dünyadaki tarımsal ürünlerin yaklaşık % 25 i her yıl mikotoksinlerden farklı düzeylerde etkilenmekte, bu durum çiftlik hayvanları ve tahıl üreticileri ile işleyiciler ve tüketiciler için büyük ekonomik sorunlara neden olmaktadır. ABD ve Kanada da yalnızca yemlerde ve çiftlik hayvanlarında mikotoksinlerin neden olduğu yıllık kaybın 5 milyar $ düzeyinde olduğu tahmin edilmektedir (Smith, 2001). Mikotoksinlerin yarattığı ekonomik ve sağlık sorunlarının farkına varılması, önlem alma ve kontrol için uygun programların gerçekleştirilebilmesinde ilk basamağı oluşturmaktadır. Bu programlar yalnızca tarım ürünlerinde mikotoksin oluşumunu önlememeli ayrıca mümkün olması durumunda toksinlerin detoksifikasyon veya yıkım yoluyla ortamdan uzaklaştırılmasını mümkün kılmalıdır (Smith, 2001). 2

20 1.GİRİŞ Bülent ZORLUGENÇ Aflatoksinlerin gıda maddesinden detoksifikasyonu için uygulanan fiziksel ve kimyasal yöntemlerin sonuç vermemesi ve insan sağlığına zararlı etkileri nedeniyle; biyolojik detoksifikasyon yöntemleri ve bunların ticari uygulamalarda kullanılabilirliği üzerinde durulmaktadır (El Nezami ve ark., 1998a, b; Özkaya ve ark., 1999; Peltonen ve ark., 2000). Biyolojik detoksifikasyon amacıyla çeşitli mikroorganizmalar kullnaılmasıyla ilgili gelişmeler mevcuttur. Bunlardan F. aurantiacum NRRL B-184 suşu ile AFB 1 in azaltılması ve toksik etkisinin giderilmesi konusunda yapılmış sınırlı sayıda araştırma olmakla birlikte; mevcut çalışmalarda bu bakteriden aflatoksinin biyolojik detoksifikasyonu amacıyla yararlanılabileceği ifade edilmiştir (Ciegler ve ark., 1966; Hao ve Brackett, 1988). Bu çalışmada, F. aurantiacum NRRL B-184 bakteri suşunun TSB besiyeri ortamında gelişme eğrisi belirlenmiş ve bakteriyel gelişimi ifade etmede matematiksel modellerden yararlanılarak gelişme hızı ve lag süresi hesaplanmıştır. Yüksek toksik ve kanserojenik aktiviteye sahip olan AFB 1 in PFT çözeltisinde ve model matriks olarak kuru kırmızı biber, mısır, siyah zeytin, soya fasulyesi, kuru incir ve fındık gibi ticari potansiyeli olan ürünlerde F. aurantiacum NRRL B-184 bakteri suşu ile biyolojik olarak detoksifikasyonu amaçlanmıştır. Ayrıca AFB 1 in degradasyon kinetiği incelenerek reaksiyon hızları hesaplanmıştır. 3

21 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Bülent ZORLUGENÇ 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Tarımsal ürünler, işlenmiş gıdalar ve yemler için önemli bir bulaşı olan küfler, toprakta ve havada yaygın olarak bulunmaktadır. Bazı küflerin, gıdaların ve ilaçların üretiminde insanlara olumlu olarak hizmet etmelerinin yanısıra tarımsal ürünlerin üretimlerinden hasat, depolama ve tüketimlerine kadar olan her evrede bozulmalara sebep olmaları da söz konusudur. Küfler metabolik etkinlikleri sırasında birincil ve ikincil metabolitler olarak adlandırılan çeşitli ürünler üretmektedirler. Birincil metabolitler, organizmanın gelişimi için gerekli olup; bunlar arasında yağ asitleri, steroller, proteinler ve aromatik aminoasitler yer almaktadır. İkincil metabolizma ürünlerinin, küflerin normal metabolik faaliyetleri açısından bir öneme sahip olmadığı ve logaritmik gelişme fazının sonlarında sentezlendiği ifade edilmektedir (Heathcote ve Hibbert, 1978; Jay, 1992; Moss, 1992; Deacon, 1997; Pitt, 2000). Küflerin ikincil metabolitleri olan mikotoksinler, insanlarda ve hayvanlarda akut ve kronik toksik (karsinojenite, mutajenite, teratojenite ve östrojenik) etkilere neden olabilmektedirler. Mikotoksin içeren ürünlerin, insanlar ve hayvanlar tarafından tüketilmesi mikotoksikozis olarak bilinen toksik sendromla sonuçlanmaktadır (Van Genderen, 1997). Küf bulaşısı, gelişimi ve mikotoksin üretimi çevre koşullarına (hava ve nem) bağlı olarak tarlada, hasat, işleme, depolama ve nakliye sırasında oluşabilmektedir. Isı ve yüksek nem içeriği küf gelişiminde ani artışlara neden olabilmektedir. Küfler, hasar görmüş tohumu istila ederek orada çoğalabilmekte ayrıca kuraklık veya başka çevresel stresler de bitkilerde küf ve böcek zararını teşvik edici etki göstermektedir (Omaye, 2004) Aflatoksin Aflatoksinler, A. flavus, A. parasiticus ve A. nomius un bazı suşları tarafından üretilen ikincil metabolizma ürünleri olup en önemli mikotoksinlerdendir (Moss, 1992; Doyle ve ark., 1997; Jaimez ve ark., 2000). 4

22 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Bülent ZORLUGENÇ Aspergillus flavus ve Aspergillus parasiticus un aksine Aspergillus nomius un doğada yaygın olarak bulunmaması nedeniyle, bu küf üzerine az sayıda çalışma yapılmış ve izolatlarının toksijenitesi tam olarak belirlenememiştir (Doyle ve ark., 1997). Aflatoksinler hakkında ilk bilginin elde edilmesi 1960 lara kadar uzanmaktadır. İngiltere de, Güney Amerika ve Afrika dan ithal edilen yerfıstığı küspesi ile beslenen hindi palazının ölmesi üzerine yapılan çalışmalarda yemlerden Aspergillus flavus izole edilmiş ve bu organizma tarafından oluşturulan toksin ise aflatoksin (Aspergillus flavus Toxin A-fla-toxin) olarak adlandırılmıştır. Oluşan toksik bileşiklerin yapısı üzerine yapılan çalışmalar sonunda 4 bileşik (AFB 1, AFB 2, AFG 1, AFG 2 ) belirlenmiştir (Detroy ve ark., 1971; Jay, 1992; Karadeniz ve Ekşi, 2002). Aflatoksinlerin keşfinden sonra mikotoksinler üzerine yapılan araştırmalar hız kazanmış ve günümüze kadar yapılan çalışmalarda, toksik etki gösteren pek çok küf metaboliti tanımlanmıştır. Bu mikotoksinlerden bazıları mutajenik, bazıları kanserojenik iken bazıları belirli organlar üzerine toksik etkiye sahiptir. En azından 14 mikotoksinin kanserojen olduğu bilinmekte ve mikotoksinler arasında kanserojen etkisi en fazla olanın da aflatoksin olduğu bildirilmektedir (Jay, 1992; FAO, 1993; Karadeniz ve Ekşi, 2002). AFB 1, insan gıdalarında ve hayvan yemlerinde sıklıkla rastlanan bir mikotoksindir. Yüksek dozları akut toksik etki göstererek, önemli sağlık sorunlarına ve ekonomik kayıplara neden olmaktadır. Düşük dozları ise güçlü bir hepatokarsinojen, mutajen ve teratojen olup ayrıca bağışıklık sistemini de baskılamaktadır. Memelilerin, kuşların ve balıkların birçok türü aflatoksinin olumsuz etkilerine karşı hassastırlar (Stark, 2001). Oluşumu ve toksisitesi göz önüne alındığında AFB 1 en önemlilerinden biri olup bunu sırasıyla AFG 1, AFB 2 ve AFG 2 izlemektedir. Aflatoksinlerin kendileri karsinojenik özellikte olmayıp bunların bazı metabolitleri bu etkiye sahiptirler (Van Genderen, 1997). 5

23 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Bülent ZORLUGENÇ 2.2. Aflatoksinlerin Genel Özellikleri Aflatoksinler kimyasal yapı olarak lakton bağı ve bifuran halkası içeren difurano kumarin türevleridir (Altuğ, 1991; Papp ve ark., 2002; Özkarslı, 2003). Aflatoksinlerin belirlenmiş önemli 4 tipi AFB 1, AFB 2, AFG 1 ve AFG 2 dir. Ultraviyole ışığı altında mavi veya yeşil floresans vermelerine dayandırılarak bu şekilde adlandırılmışlardır (Omaye, 2004). AFB 1 ve AFG 1 difuran halkası içerirken AFB 2 ve AFG 2 ise tetra bifuran halkası içermektedir (Sweeney ve Dobson, 1999). Aflatoksinlerin kimyasal yapısı Şekil 2.1 de verilmiştir. G serisi aflatoksinler de üçüncü lakton halkası, siklopentan halkasının yerine geçmiştir. AFB 1 ve AFG 1 de merkezdeki furan halkasının 8. ve 9. karbon atomları arasında çift bağ bulunmaktadır (Jaimez ve ark., 2000). AFM 1 ve AFM 2 ise AFB 1 ve AFB 2 nin hidroksil formları olup bir adet hidroksil grubu içerirler (Tunail, 2000). Aflatoksinlerin kapalı formülleri, erime noktaları ve ultroviyole ışığı altında verdikleri renkler Çizelge 2.1. de verilmiştir. Çizelge 2.1. Aflatoksinlerin Kapalı Formülleri Erime Noktaları ve Ultroviyole Işığında Verdikleri Renkler (Johnson ve Peterson, 1974; Jay, 1992). AFLATOKSİN KİMYASAL FORMÜL ERİME NOKTASI ( o C) RENK B 1 C 17 H 12 O Mavi B 2 C 17 H 14 O Mavi G 1 C 17 H 12 O Yeşil G 2 C 17 H 17 O Yeşil-Mavi M 1 C 17 H 12 O Mavi-Menekşe M 2 C 17 H 14 O Menekşe 6

24 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Bülent ZORLUGENÇ O O O Furan Halkası Kumarin O O O O O O O O OCH 3 O O OCH 3 Aflatoksin B 1 (AFB 1 ) Aflatoksin B 2 (AFB 2 ) O O O O O O O O O O OCH 3 O O OCH 3 Aflatoksin G 1 (AFG 1 ) Aflatoksin G 2 (AFG 2 ) O O O O O O O HO O O OCH 3 HO O O OCH 3 Aflatoksin B 2a (AFB 2a ) Aflatoksin G 2a (AFG 2a ) O O O O OH O OH O O O OCH 3 O O OCH 3 Aflatoksin M 1 (AFM 1 ) Aflatoksin M 2 (AFM 2 ) Şekil 2.1. Aflatoksinlerin kimyasal yapısı (Banwart, 1989). 7

25 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Bülent ZORLUGENÇ Aflatoksinler, kloroform ve metanol gibi polar çözücüler ve özellikle dimetilsülfoksitte çözünebilmektedir. Aflatoksinler yüksek sıcaklıklara karşı oldukça dayanıklı olup, normal pişirme sıcaklıklarında ve pastörizasyon sıcaklıklarına karşı oldukça dayanıklıdır. Ayrıca aflatoksinin yapısında bulunan lakton halkası bu molekülün alkali hidrolizine karşı hassas olmasını sağlamaktadır (McLean ve Dutton, 1995) Aflatoksinler ve Biyosentezi Aflatoksinler poliketit yolu içinde sentezlenirler. Bir asetil ünitesi (Asetil CoA) ile malonil (Malonil CoA) ünitesi karbondioksit kaybederek kısalır ve yağ asidi sentez yolu ile hekzonat a dönüşür. Hekzonat birbirini izleyen 7 malonoat ünitesi ile tepkimeye girer ve poliketit sentezi sonucu norsolorinik asit oluşur (Hocking, 1997). Şekil 2.2 de Poliketit yolu içinde norsolorinik ait oluşumu verilmiştir. Şekil 2.2. Poliketit yolu içinde norsolorinik asit oluşumu (Watanabe ve Townsend, 2002). 8

26 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Bülent ZORLUGENÇ Bu poliketit, yaklaşık kadar enzimatik değişimden geçer ve Versicolorin B oluşur. Versicolorin B oluşumunu takiben enzimatik yol ikiye ayrılır. 1. kolda Versicolorin A oluşumunu takiben dimetil sterigmatosistinden AFB 1 ve AFG 1 sentezlenir. Diğer kolda ise dihidro dimetil sterigmatosistinden AFB 2 ve AFG 2 sentezlenir (Swedney ve Dobson, 1999). Aflatoksin biyosentezinde düzenleyici gen AfζR genidir. AfζR geni aflatoksin biyosentezini harekete geçirir ve aflatoksin üretimini artırır (Papp ve ark., 2002). Aflastoksin biyosentez yolu ve biyosentezde rol oynayan genler Şekil 2.3 de verilmiştir. Şekil 2.3. Aflatoksin biyosentez yolu ve biyosentezde rol oynayan genler (Sweeney ve Dobson, 1999). 9

27 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Bülent ZORLUGENÇ 2.4. Aflatoksinlerin Toksisitesi, Metabolizması ve Limitleri Aflatoksinler, Aspergillus ve Penicillium cinslerinin ürünleri olup insanlarda ve hayvanlarda oldukça güçlü akut toksik etki göstermektedirler. Sindirim sistemi yoluyla vücuda alınan aflatoksinler bir çok canlıda akut toksisite ve karsinojeniteye neden olmakla birlikte, etkilenen başlıca organ karaciğer olmaktadır. Diyetle alınan aflatoksin karaciğerden kurtularak kolayca diğer organlara dağılabilir ve orada metabolize olarak toksik veya karsinojenik etki gösterebilmektedir. Bazı türlerin AFB 1 in neden olduğu karsinojeniteye dayanıklı olması, genellikle AFB 1 i detoksifiye etme yeteneği ile ilişkilendirilmektedir ki, bu durum glutatyon ile birleşmesine dayandırılmaktadır (Stark, 2001). Akut toksisite, tüketimi takip eden 3 hafta içerisinde oluşabilmektedir (Omaye, 2004). Uganda ve Tayland da ortaya çıkan akut aflotoksikozis sonucunda insanlarda kusma, karın ağrısı, akciğer ödemi, karaciğerde nekroz ve yağlanma gibi semptomplar görülmüştür. Yaklaşık 200 kadar Hindistan köyünde 6-16 mg L -1 aflatoksin içeren mısırların tüketilmesi ile özellikle gastrointestinal kanamaya bağlı %25 in üzerinde ölüm vakası görülmüştür (Shank, 1977; Van Rensburg, 1977; Shank, 1981). Akut aflatoksikozisin semptomları; karaciğer, böbrek ve kalpte gelişen yağlanma ve beyin ödemiyle ilişkili olan kusma, çırpınma, koma ve ölüm olup Reye s sendromundan ayırt edilememektedir. Tayland (Shank, 1971) ve Amerika Birleşik Devletleri nde (Nelson, 1980) Reye s sendromundan kaynaklandığı öne sürülen 23 ölüm vakasının 22 sinde karaciğer, böbrek, beyin, safra ve gastrointestinal sistemde AFB 1 tespit edilmiştir (Stark, 2001). Gıdalarda ve yemlerde yaygın olarak bulunmalarına ilave olarak aflatoksinler havada da bulunabilmektedir. Örneğin, aflatoksinli tahılların tozlarına maruz kalan yerfıstığı işleyen fabrikaların işçilerinde akciğer veya diğer organlarda görülen kanser sebebiyle ölüm vakalarında önemli artış gözlenmiştir (Van Nieawenhaize, 1973; Sorenson, 1981; Hayes, 1984; Dvorackava, 1986). Akciğerler, aflatoksinlerin diyetle alınması durumunda da risk altındadır (Stark, 2001). Karaciğer kanseri gelişmekte olan ülkelerde çok yaygın olarak görülmekte ve diyetle alınan aflatoksin ile karaciğer kanseri arasında doğrusal bir ilişkinin mevcut olduğu bildirilmektedir (Van Genderen, 1997; Omaye, 2004). Küflü tahılların 10

28 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Bülent ZORLUGENÇ tüketilmesi sonucu Hindistan da ve Afrika da karaciğer kanseri görülme oranının yüksek olduğu bildirilmiştir (Omaye, 2004). Yapılan son çalışmalar, aflatoksine maruz kalan insanlarda karaciğer kanseri görülme oranının yüksek olmasına kronik enfeksiyonların da neden olabileceğini ortaya koymuştur. AFB 1 in deney hayvanlarında hücre bağışıklığını baskıladığı görülmüştür (Van Genderen, 1997). Bağışıklık sisteminin baskılanması akut aflatoksin intoksikasyonunun (zehirlenme) bir diğer belirleyici özelliğidir (Stark, 2001). Aflatoksinin LD 50 si 0.5 mg kg -1 (vücut ağırlığı) dır ve 72 saat içinde karaciğer hasarı, bağırsak sisteminde ve karın boşluğunda kanama nedenleriyle ölüm gerçekleşmektedir (Omaye, 2004). Birkaç günle birkaç hafta arasında subletal (yarı öldürücü) konsantrasyonda aflatoksin tüketimi orta ya da şiddetli karaciğer hasarına yol açmaktadır. Karaciğerde görülen hasarlar veya karaciğerin safra kanalı bölgesinde aşırı hücre gelişimi (biliary hyperplasia) dir. Ayrıca yaygın olarak yağ birikimi ve karaciğerin renginin morkırmızıdan sarı-kırmızıya dönüştüğü görülür. Epidemiyolojik çalışmalar, dünyanın çeşitli bölgelerinde diyetle alınan aflatoksin miktarı arasında doğrudan bir ilişki olduğunu göstermektedir. Ayrıca, hepatit B virüsü ile karaciğer kanseri arasında ilişki olduğu ortaya koyulmuştur (Omaye, 2004). Aflatoksinler, akut toksik ve karsinojenik etki gösterebilmeleri için oksidatif metabolizmaya uğramalıdırlar (Stark, 2001). Aflatoksin metabolizması, esas olarak karaciğer hücrelerinin endoplazmik retikulumunda bulunan sitokroma bağlı enzimler ile O 2 ve NADPH a bağımlı enzimlerin karmaşık bir organizasyonu sonucu oluşmaktadır (Groopman ve ark., 1988). Aktivasyon düzeyi, DNA ya bağlanma, mutasyona uğrama sıklığı ve belirli hücre tiplerinde akut toksik etkilere karşı hassasiyet, sitokrom P-450 nin tipine ve bunların bu hücrelerdeki düzeyine bağlı olarak değişmektedir (Mace, 1997; Stark, 2001). Aflatoksin molekülünün 8, 9 konumu oksidasyon sonucu Aflatoksin-8, 9- oksite dönüşür, sonra da kovalent bağla; DNA, RNA ve proteine bağlanır. Aflatoksinin hidroksillenmesiyle ayrıca AFM 1, AFP 1, AFQ 1, AFB 2a ve aflatoksikol oluşur. Bunlar Aflatoksin-8, 9- oksit den daha az toksik ve karsinojenik olup 11

29 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Bülent ZORLUGENÇ aflatoksinin detoksifikasyon metabolitleridirler. Aflatoksin-8, 9- oksit, detoksifikasyon enzimi olan epoksit hidrolaz tarafından 8, 9-dihidrodiol e dönüştürülmektedir. 8, 9-dihidrodiol ve hidroksillenmiş aflatoksinler glutatyon (GSH) transferaz tarafından glutatyon konjugatlarına dönüşür ve merkapturik asit olarak idrarla atılırlar. Ayrıca, AFB 1-8, 9-diol ve AFB 2a enzimatik olmayan yolla fenolat iyonu formuna dönüşerek kovalent bağla proteinlere de bağlanabilmektedir (Stark, 2001). Bu sistemlerde AFB 1 in metabolizma yolları ve biyotransformasyonu Şekil 2.4 de verilmiştir. O O O Sitoplazmik Redüktaz Sistemi İndirgeme O O OCH 3 O O O OH O O O O O OCH 3 Karaciğer Mikrosomasında Meydana Gelen Oksitleyici Sistemler P450 Hidroksillenme P448 O O OCH 3 Aflatoksin Q O O O OH O O OCH 3 Epoksidasyon Demetilasyon Aflatoksin M 1 O O O O O O O O O OCH 3 Afkatoksin B 1 - epoxide O O Aflatoksin P 1 OH Şekil 2.4. AFB 1 in vücuttaki metabolizma yolları (Ueno, 1985). AFB 1 in oksidatif metabolizması sonucu stabil olmayan, oldukça reaktif epoksid metabolitler oluşmaktadır. Hidroksillenmiş metabolitlerin sülfat veya glukuronik asit ile enzimatik konjugasyonu sonucu suda çözünür sülfat veya glukuronid esterler oluşur ve bunlar idrar veya safra ile dışarı atılırlar. Böylece 12

30 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Bülent ZORLUGENÇ AFB 1 in detoksifikasyonu gerçekleşmiş olur. AFB 1 in organizmadan uzaklaştırılmasındaki diğer bir yol ise epoksid metabolitin glutatyon ile enzimatik olarak reaksiyona girmesi ve safra ile dışarı atılmasıdır (Groopman ve ark., 1988). Sitokrom P450 vasıtasıyla aflatoksinin 8, 9-epoksid formuna dönüşmesi ile bazı metabolitler etkinleşir ve ana bileşikten farklı olarak kanser etmeni özellik kazanırlar (Van Genderen, 1997; Omaye, 2004). AFB 1 in metabolizması sırasında reaktif elektrofilik epoksid, DNA, RNA ve protein gibi hücresel makro moleküllerin çeşitli nükleofilik merkezleri ile örneğin DNA nın N 7 konumundaki guanine kovalent bağ ile bağlanabilmektedir (Şekil 2.5). Bu aktivasyon reaksiyonu sonucu, hücre veya organizma için potansiyel bir biyolojik tehlike olarak görülen toksik, karsinojenik ve genotoksik etkiler ortaya çıkmaktadır (Groopman ve ark., 1988). O O HO O HN O N O O OCH 2 H 2 N N N Şekil 2.5. AFB 1 -N 7 -Gua kompleksi (Ueno, 1985). Yüksek miktarda AFB 1 e maruz kalan insanlarda görülen karaciğer kanserlerinde p53 geninin 249 kodonunda mutasyon görülmüştür. Ancak AFB 1 den hiç etkilenmeyen veya düşük dozda etkilenen kişilerde bu mutasyonun gerçekleşmediği tespit edilmiştir (Stark, 2001). AFB 1 in ayrıca enzimleri inhibe ederek ATP üretimini azalttığı ve buna ek olarak DNA sentezini, DNA ya bağlı RNA polimeraz aktivitesini, mrna ve protein sentezini inhibe ettiği bildirilmiştir (Doyle ve ark., 1997; Wang ve Groopman, 1999). Aflatoksin, 1993 yılında Dünya Sağlık Örgütü ile Uluslararası Kanser Araştırma Kurumu (WHO-IARC) tarafından kanserojenik madde olarak kabul 13

31 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Bülent ZORLUGENÇ edilmiş ve AFB 1 yapılan sınıflandırmada insan kanserojeni olarak 1A grubunda yeralmıştır (El-Nezami ve ark., 1998a; El-Nezami ve ark., 2000; Hussein ve Brasel, 2001). Bugün dünyada hemen hemen bütün ülkeler, bu tehlikelerden korunmak ve ihraç ettikleri ürünlerin geri dönüşünü azaltmak amacı ile yasal bazı sınırlamalar getirmektedirler. Ülkemizde Türk Gıda Kodeksi nde (TGK, 2009) gıdalar, için aflatoksin limitleri belirlenmiştir. Çizelge 2.2 de Türkiye de gıdalarda bulunmasına izin verilen aflatoksin düzeyleri ve Çizelge 2.3 de ise Avrupa Birliği nde gıda maddelerinde bulunmasına izin verilen en yüksek aflatoksin düzeyleri (EC, 2008) verilmiştir. 14

32 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Bülent ZORLUGENÇ Çizelge 2.2.Türkiye de Gıdalarda Bulunmasına İzin Verilen Aflatoksin Düzeyleri (µg kg -1 ) (TGK, 2009) No GIDA MADDELERİ B 1 1 Yerfıstığı (Doğrudan tüketime sunulmadan veya gıda bileşeni olarak kullanılmadan önce sınıflandırma, ayıklama gibi fiziksel işlemlere tabi tutulacak olan) 2 Fındık, antep fıstığı gibi sert kabuklu meyveler, yerfıstığı, yağlı tohumlar, kuru meyveler ve bunlardan üretilen işlenmiş gıdalar 3 Tahıllar (Karabuğday (Fagopyrum sp.) dahil ve bunlardan üretilen işlenmiş gıdalar (Doğrudan tüketilen veya gıda bileşeni olarak kullanılan) 4 Mısır (Doğrudan tüketime sunulmadan veya gıda bileşeni olarak kullanılmadan önce sınıflandırma, ayıklama gibi fiziksel işlemlere tabi tutulacak olan) 5 Çiğ süt, ısıl işlem görmüş süt, süt bazlı ürünlerin üretiminde kullanılan süt 6 Baharatların aşağıdaki türleri için ; - Kırmızıbiber (Capsicum spp.) (Bunların kurutulmuş meyveleri, kırmızı biberin bütün ve toz hali dahil) - Karabiber (Piper spp.) (Bunların meyveleri, akbiber ve karabiber dahil) - Hindistan cevizi / Muskat (Myristica fragrans) - Zencefil (Zingiber officinale) - Zerdeçal (Curcuma longa) 7 Tahıl bazlı işlenmiş gıdalar, bebek ve küçük çocuk gıdaları 9 Bebekler formülleri ve devam formülleri (bebek sütleri ve devam sütleri dahil) Toplam (B 1 +B 2 +G 1 +G 2 ) M Bebekler için özel tıbbi amaçlı diyet gıdalar Diğer gıda maddeleri (bulunması muhtemel riskli gıdalar)

33 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Bülent ZORLUGENÇ Çizelge 2.3. Avrupa Birliği nde Gıdalarda Bulunmasına İzin Verilen Aflatoksin Düzeyleri (µg kg -1 ) (EC, 2008) No GIDA MADDELERİ B 1 Toplam (B 1 +B 2 +G 1 +G 2 ) 1 Yerfıstığı (Doğrudan tüketime sunulmadan veya gıda bileşeni olarak kullanılmadan önce sınıflandırma, ayıklama gibi fiziksel işlemlere tabi tutulacak olan) 2 Fındık, antep fıstığı gibi sert kabuklu meyveler, yerfıstığı (Doğrudan tüketime sunulmadan veya gıda bileşeni olarak kullanılmadan önce sınıflandırma, ayıklama gibi fiziksel işlemlere tabi tutulacak olan) 3 Fındık, antep fıstığı gibi sert kabuklu meyveler (Doğrudan insan tüketimine sunulan veya gıda bileşeni olarak kullanılan ve bunların işlenmiş ürünleri) 4 Kuru meyveler (Doğrudan tüketime sunulmadan veya gıda bileşeni olarak kullanılmadan önce sınıflandırma, ayıklama gibi fiziksel işlemlere tabi tutulacak olan) Kuru meyveler ve bunların işlenmiş ürünleri (Doğrudan insan tüketimine veya gıda bileşeni olarak kullanılması düşünülen ve bunların işlenmiş ürünleri) 6 Tüm tahıllar ve bunlardan üretilen ürünler (7,10, de listelenen gıdalar hariç) 7 Mısır (Doğrudan tüketime sunulmadan veya gıda bileşeni olarak kullanılmadan önce sınıflandırma, ayıklama gibi fiziksel işlemlere tabi tutulacak olan) 8 Çiğ süt, ısıl işlem görmüş süt, süt bazlı ürünlerin üretiminde kullanılan süt 9 Baharatların aşağıdaki türleri için ; Kırmızıbiber (Capsicum spp.) (Bunların kurutulmuş meyveleri, kırmızı biberin bütün ve toz hali dahil) - Karabiber (Piper spp.) (Bunların meyveleri, akbiber ve karabiber dahil) - Hindistan cevizi (Myristica fragrans) - Zencefil (Zingiber officinale) - Zerdeçal (Curcuma longa) 10 Tahıl bazlı işlenmiş gıdalar, bebek ve küçük çocuk gıdaları 11 Bebekler formülleri ve devam formülleri (bebek sütleri ve devam sütleri dahil) 12 Bebekler için özel tıbbi amaçlı diyet gıdalar M 1 16

34 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Bülent ZORLUGENÇ 2.5. Aflatoksinlerin Detoksifikasyonu Toksik ve kanserojen özellikte olmaları nedeniyle aflatoksin oluşmuş ürünlerin, insan ve hayvanlar tarafından tüketilmesi önemli sağlık sorunları ve ekonomik kayıplara yol açabilmektedir. Bu nedenle, aflatoksin kontrol ve izleme programlarına ihtiyaç duyulmaktadır. Aflatoksin sorununu çözmede temel ve öncelikli prensip aflatoksin oluşumunu önleyici tedbirleri almaktır. Ancak, toksin oluşmuş olan bir üründe aflatoksini uzaklaştırmaya, parçalamaya, azaltmaya ve bağlamaya yönelik çalışmalar da aflatoksinlerin keşfinden bu yana yapılmaktadır. Detoksifikasyon işlemlerinde, 1. Toksin tamamen uzaklaştırılmalı, inaktive edilmeli veya parçalanmalı, 2. Üründe hiçbir toksik, karsenojenik ve mutajenik kalıntı kalmamalı ve herhangi bir yeni toksik madde oluşmamalı, 3. Ürünün fiziksel ve duyusal özellikleri ile besin değerinde olumsuz değişimler oluşmamalı, 4. Küf sporlarının ve misellerinin yok edilerek mikotoksin oluşumu önlenebilmeli, 5. Teknik ve ekonomik olarak uygulanabilir olmalıdır (Rustom, 1997; Piva ve ark., 1995; Scott, 1998; Bata ve Lasztity, 1999; Galvano ve ark., 2001). Ancak, bugüne kadar bütün bu özellikleri karşılayan bir detoksifikasyon yöntemi bulunamamıştır. Çoğu yöntemin sonuçları henüz toksikolojik yönden incelenmemiştir (Özkaya ve ark., 1999) Fiziksel Ayırma ve Temizleme Yöntemleri Mikotoksin oluşmuş bir üründe, bozuk, kırık, zedeli tanelerin ayıklanmasının, kabuk, kepek ve yabancı maddelerin temizlenmesinin mikotoksin düzeyini önemli ölçüde azaltığı görülmüştür. Gelişmiş ülkelerde bu ayıklama işlemlerinde elektronik göz ve optik cihazlar kullanılmaktadır (Goldblatt ve Dollear, 1977; Heatcote ve Hibbert, 1978; Özay, 1988; Scott, 1998; Özkaya ve ark., 1999; Yılmaz ve Özay, 2001; Karadeniz ve Ekşi, 2002). Antep ve yerfıstığı gibi iri taneli ürünlerde bozuk 17

35 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Bülent ZORLUGENÇ olan koyu renkli tanelerin el ile veya fotoelektrik hücrelerden geçirilmesiyle aflatoksinli taneler ayrılabilmektedir (Özay, 1988; Anonim, 2002). Mikotoksin oluşmuş ürünün çoğu kez mikotoksin oluşmamış ürüne göre farklı fiziksel özellik göstermesi nedeniyle, küçük taneli ürünlerde ve özellikle mısırda yoğunluğa göre ayrım uygulanabilmektedir (Huff ve Hagler, 1982; Özay, 1988; Özkaya ve ark., 1999; Bata ve Lasztity, 1999; Placinta ve ark., 1999) Ayrıca; mısır, pamuk tohumu ve kuru incir gibi bazı ürünlerde aflatoksin nedeniyle UV (365 nm) ışığı altında parlak yeşilimsi sarı (BGY) bir floresans meydana gelmektedir. Bu floresans ile ürünün aflatoksin içeriği arasında sıkı bir ilişki bulunmuş olup, floresans veren tanelerin ayıklanması ile etkili bir dekontaminasyon sağlanabilmektedir. Bu yöntem, ülkemizde kuru incir ihracatındaki dar boğazın aşılmasını sağlamıştır (Çoksöyler, 1994; Hocking, 1997; Scott, 1998; Özkaya ve ark., 1999) Fiziksel Degradasyon Yöntemleri Isı, ışınlama ve adsorbsiyon, mikotoksinler üzerindeki etkilerinin araştırıldığı üç fiziksel faktördür (Doyle ve ark., 1982; Özkaya ve ark., 1999) Isı Aflatoksinler, 237 ile 306 C arasında değişen yüksek dekompozisyon sıcaklıklarına sahip olmaları nedeniyle ısıya oldukça dayanıklıdırlar. Aflatoksinlerin kısmen parçalanabilmeleri için sıcaklığın 150 o C nin üzerinde olması gereklidir. Aflatoksinin ısı ile degradasyonunda kritik faktör ürünün nem içeriğidir. Nem içeriğinin fazla olması aflatoksinin ısı ile inaktivasyonunu oldukça kolaylaştırmaktadır. Nemin varlığı, AFB 1 in lakton halkasının açılarak terminal karboksilik asit oluşmasına neden olmaktadır. Daha sonra karboksilik asit ısının etkisiyle dekarboksilasyona uğramaktadır (Doyle ve ark., 1982; Samarajeewa ve ark., 1990). Bu konuda yapılan bir çalışmada; yağlı tohum küspesinde ki nem artışının, sıcaklık ve ısıtma süresinin sabit tutulması halinde aflatoksin miktarındaki azalışı artırdığı görülmüştür. %30 nem içeren küspenin 100 o C'de 2.5 saat tutulması, mevcut 18

36 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Bülent ZORLUGENÇ toksinin yaklaşık %85 inin azalmasıyla sonuçlanmıştır. Aynı koşullarda %6.6 nem içeren küspede ise aflatoksinin %50 oranında azaldığı bildirilmiştir (Doyle ve ark., 1982; Özkaya ve ark., 1999) Işınlama AFB 1, ph nın 3 ten küçük ya da 10 dan büyük olması durumunda UV ışığına karşı oldukça hassastır (Samarajeewa ve ark., 1990). Samarajeewa ve Gamage (1988), UV ışığına maruz kalan AFB 1 in 12 yeni toksik bileşiğe dönüştüğünü bildirmişlerdir. Yapılan başka bir çalışmada, 10 cm kalınlığındaki yerfıstığı küspesi 8 saat UV ışığına tutulmuş ve toksinin floresansında görünür bir değişiklik olmamıştır. UV ile muamele edilen bu yerfıstığı ekstraktları, ördek yavrularına yedirildiğinde, hayvanlar birkaç gün içerisinde ölmüş ve karaciğerlerinde aflatoksinin neden olduğu karakteristik lezyonlar görülmüştür (Doyle ve ark., 1982; Özkaya ve ark., 1999). Benzer sonuçlar 2,5 Mrad dozunda gama ışını verilen aflatoksin içeren yerfıstığı küspesinde de elde edilmiştir. Bu işlemin etkisiz kalmasına, aflatoksin gibi karmaşık organik maddelerin gama ışınlarından doğrudan etkilenmemelerinin neden olabileceği belirtilmiştir. Oysaki, suyun ve başka basit bileşiklerin radyolizi sonucu meydana gelen serbest radikallerin daha sonra organik moleküllerle reaksiyona girmesi ışınlamanın dolaylı etkisini ortaya çıkarmaktadır. Suyun varlığı bu prosesin etkinliğini belirleyen önemli bir faktördür (Doyle ve ark., 1982; Samarajeewa ve ark., 1990; Rustom, 1997). X-ışınları ve elektron ışınlamanın aflatoksinler üzerine etkileri de araştırılmış ve aflatoksini etkili bir şekilde parçalamak için gerekli dozun ışınlanmış ürünü de harap ettiği bildirilmiştir (Doyle ve ark., 1982; Özkaya ve ark., 1999) Adsorbsiyon AFB 1 in bir sıvı içerisinde bentonit tarafından adsorbe edilebildiği ve daha sonra bentonitin uzaklaştırılması ile aflatoksinin tamamına yakınının uzaklaştırılabildiği belirlenmiştir. Parçacık büyüklüğü ve ısıl işlem bentonitin adsorblama yeteneğini etkilemektedir (Özkaya ve ark., 1999). Yapılan bir çalışmada, 19

37 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Bülent ZORLUGENÇ bentonitin sütün içerisindeki aflatoksini %65-79 oranında azalttığı ve bentonit miktarının artmasıyla adsorbsiyonun da arttığı belirtilmiştir (Doyle ve ark., 1982). Bahar ve Altuğ (1997) yaptıkları bir çalışmada, kontamine kuru incirlerden iki farklı teknikle elde edilen incir pekmezlerine aflatoksin geçiş düzeylerini araştırmışlardır. Pekmez toprağı kullandıkları birinci teknikle elde edilen bütün incir pekmezinde başlangıçtaki incirlere göre ortalama %62; öğütülmüş incir pekmezinde ise ortalama %29 oranında azalma olduğunu belirtmişlerdir. Jelatin kullandıkları ikinci teknikte ise elde edilen bütün incir pekmezinin toplam aflatoksin düzeyinde %38 lik bir azalma görülmüştür Solventlerle Özütleme Yağlı tohumların işlenmesinde uygulanan proses, aflatoksinlerin tamamına yakın kısmının uzaklaşmasını sağlamaktadır (Goldblat ve Dollear, 1977). İşlem sırasında tohumda mevcut olan aflatoksinin bir kısmı ham yağa geçmektedir. Yağa geçen aflatoksin oranı genellikle işleme şekli, koşulları ve hammadde kalitesine bağlıdır. Rafinasyon sırasında bitkisel yağlarda bulunan aflatoksinin uzaklaştırıldığı, büyük bir kısmının ham yağın alkali ile muamelesinde "soapstock" ta kaldığı belirtilmiştir (Parker ve Melnick, 1966). Konvensiyonel rafinasyon ve ağartma proseslerinin uygulandığı ABD de yağlarda aflatoksin problemi bulunmamaktadır. Çünkü zeytinyağı dışında yenilebilir ham yağ tüketilmemektedir. Fakat yağın, ham yağ olarak kullanıldığı yerlerde özellikle yerfıstığının çok üretildiği ülkelerde örneğin Hindistan da, rafine edilmemiş ham yerfıstığı yağı ucuz oluşu, hoş aroma ve lezzeti ile geniş bir halk kesimi tarafından tercih olunmaktadır. Ham yerfıstığı yağından aflatoksinin giderilmesi için yağ koalin ile işleme sokulmuş, %1.0, 1.5, 3.0 oranında koalin dakika 80 o C'de denemeler sonucu, %3'lük koalin ile 15 dakikalık süren işlemde en iyi sonuç alınmıştır (Miller ve ark., 1985). Solventlerle özütleme işlemi için sayısız solvent kombinasyonları denenmiştir. Özellikle yağlı tohumlara uygulanabilen en etkin solvent sistemi su, aseton, hekzan içermektedir (Gardner ve ark., 1968). Aseton+su (90:10 v/v) ikili 20

38 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Bülent ZORLUGENÇ sistemi ile özütlemenin yerfıstığı, pamuk tohumu üzerinde %96-98 etkili olduğu belirtilmiştir (Gardner ve ark., 1971). Solventle özütleme işlemlerinin avantajları: 1. Aflatoksinin tamamına yakın kısmının üründen uzaklaştırılabilmesi, 2. Üründe yeni bozunma ürünlerinin oluşmaması, 3. Ürün proteinlerinin fazla tahrip olmaması, 4. Besin değerinin korunmasıdır (Özay, 1988) Kimyasal Detoksifikasyon Yöntemleri Gıdalardaki aflatoksinlerin kimyasal detoksifikasyonu uygulanabilir bir hasat sonrası yaklaşımıdır. Yapılan araştırmalar aflatoksinlerin degradasyonunda asitler, bazlar, bisülfitler, klorlu bileşikler ve okside edici maddelerin kullanılabileceğini göstermiştir Asit Uygulaması Kuvvetli asitler, hidrasyon süresince aflatoksini hemiasetal formlarına dönüştürerek degrade olmasına neden olmaktadırlar (Van Nieawenhuize, 1973). Başka bir ifadeyle, AFB 1 e suyun eklenmesiyle AFB 2 nin hidroksi analoğu olan AFB 2a oluşmakta aynı şekilde AFG 2a da AFG 1 in asidülasyonu ile meydana gelmektedir. Pons ve ark. (1972) AFB 1 ve AFG 1 i daha az toksik olan formlarına yani sırasıyla AFB 2a ve AFG 2a ya asitlerle dönüştürme üzerine çalışmışlardır. Araştırıcılar, ph nın azalması veya sıcaklığın artışıyla dönüşüm oranının arttığını bildirmişlerdir. Çalışmada, ph sı 3.0 olan sulu çözeltideki AFB 1 i hidroksi anoloğuna %95 oranında dönüştürmek için 100 o C de 6 saate ihtiyaç duyulduğu belirtilmektedir. Ayrıca, AFB 2 ve AFG 2 nin AFB 1 ve AFG 1 ile kıyaslandığında asit degradasyonuna daha az duyarlı olduğu da ifade edilmiştir. Williams ve Dutton (1988) asitlerin, doğal olarak kontamine olmuş yerfıstığı ununda aflatoksinleri degrade etme üzerine etkilerini araştırmışlardır. Bir reaktör içinde (129 C de 160kPa basınçta) hidrolize sebze proteini üretimi sırasında 3M hidroklorik asit ilavesinin aflatoksinlerin toksik veya mutajenik bileşik oluşturmadan 21

39 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Bülent ZORLUGENÇ tamamen degrade olmasına neden olmuştur. Başka bir çalışmada ise, 100 C deki yağ banyosuna yerleştirilmiş ağzı kapalı deney tüplerindeki yerfıstığı unundaki AFB 1, 5 N hidroklorik asit ilavesiyle tamamen parçalanmıştır (Wattanapat ve ark., 1995). Her iki çalışmada, aflatoksinli yerfıstıklarından uygun şartlar altında aflatoksin içermeyen hidrolize sebze proteini elde edilebileceğini göstermektedir. Ağzı pamukla kapatılan erlen içerisine konulan sorguma (süpürge darısı) ilave edilen 3 N lik salisilik, sülfamik ve sülfosalisilik asit, 1 mg L -1 düzeyindeki AFB 1 in %90 oranında azalmasına neden olmuştur. Çalışmada ayrıca, 5 N anthranilik, benzoik, borik, okzalik ve propionik asit ilavesiyle aynı konsantrasyondaki AFB 1 in %90 ve daha fazla oranda azalmasıyla sonuçlanmıştır. Güçlü asitlerle muamele AFB 1 in degrade edilmesinde etkili bulunurken, AFB 2 ve AFG 2 üzerinde az etkili ya da etkisiz bulunmuş ve AFB 2a nın toksik etkisinin devam ettiği görülmüştür (Hasan, 1996) Hidroksit ile Alkali Uygulaması Çeşitli araştırmalar, inorganik veya organik bazlı alkali uygulamalarının aflatoksinlerin degradasyonunda etkili ve ekonomik olarak uygulanabilir bir metot olduğunu göstermektedir. Alkaliler, AFB 1 in lakton halkasının hidrolizine neden olmaktadır. Bununla birlikte, yapılan çalışmalar hidrolize olan lakton halkalarının asidik koşullar altında tekrar kapanabileceğini ve AFB 1 in yeniden oluşabileceğini göstermektedir (King ve Prudente, 2005). Price ve Jorgensen (1985) alkali uygulamaların, mısırdan tortilla üretimi sırasındaki koşullar nedeniyle aflatoksinlerin parçalanması üzerine etkilerini araştırmışlardır. Mısırın %0.5 ten daha az kalsiyum hidroksit ile muamele edilmesiyle aflatoksin içeriği %43 oranında azalmıştır. Asit uygulaması başlangıç konsantrasyona dönüş ile sonuçlanmıştır. Yapılan başka bir çalışmada; yüksek düzeylerdeki kalsiyum hidroksit aflatoksin degradasyon oranını artırmamış ve çok güçlü alkali tat ile kokuya sahip olması nedeniyle duyusal açıdan daha az kabul edilebilir bir ürün elde edilmiştir (Arriola ve ark., 1988). 22

40 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Bülent ZORLUGENÇ Kalsiyum hidroksit ile muamele şartları, mısır ürünlerinin yalnızca ph düzeylerinin yaklaşık olarak 7 ye yükselmesine neden olmuştur. Bu ph derecelerinde aflatoksinin detoksifikasyon işlemi, asit uygulaması ile tersine çevrilebilmiş ve bu durum orijinal aflatoksin yapısının yeniden oluşmasıyla sonuçlanmıştır (Torres ve ark., 2001). Arriola ve ark. (1988) nın yaptıkları bir çalışmada doğal olarak 1600 ng g -1 toksinle kontamine olmuş mısır, 100 C de 4 dk süreyle %3 lük sodyum hidroksit ile kaynatılmış ve toplam AFB 1 ve AFB 2 düzeyleri %93 oranında azalmıştır. Aynı mısırlar asitle muamele edildikten sonra orijinal AFB 1 yapısına %18 oranında geri dönüşüm gerçekleşmiştir. Ayrıca mısır çerezi yapmak için gerekli olan 196 C de 15 dk kızartma işlemi ile otoklavlama ile yapılan ısıl işlem, ürünün aflatoksin içeriğinin insan gıdası olarak kullanımını mümkün kılan bir düzeye (20 ng g -1 den daha az) inmesine neden olmuş ve mutajenite gözlenmemiştir (Park, 1993). Yapılan bir çalışmada örnek ağırlığına bağlı olarak %2 kalsiyum hidroksit ve %0.5 metilamin kullanımının 400 ng g -1 aflatoksin içeren yerfıstığı ununda geri dönüşüm olmaksızın toksin içeriğinin kabul edilebilir standartlar içerisine düştüğü belirtilmiştir (Park ve ark., 1981). Epsoy (1972), patentli bir çalışmada Ca(OH) 2 yi su ile çamurlaştırarak yağlı tohumları detoksifiye etmek için kullanmıştır. Bu işlem pratikte ABD de kurutulmuş hindistan cevizinin detoksifikasyonunda uygulanmaktadır. Mikotoksin oluşmuş ürünlerde mikotoksinlerin kimyasal detoksifikasyonunda en etkin ve uygulamalarına başlanmış bir yöntemdir Bisülfit Uygulaması Bisülfit; enzimatik ve enzimatik olmayan esmerleşme reaksiyonları ile bir çok mikroorganizmanın gelişimini engellemesi nedeniyle bazı gıdalarda yaygın olarak kullanılan bir kimyasaldır (King ve Prudente, 2005). Sodyum bisülfitin, terminal furan halkasının 8, 9 konumundaki çift bağ ile reaksiyona girdiği ve toksinin suda daha çok çözünür hale geldiği varsayılmaktadır. AFB 2 de bu çift bağın olmayışı bisülfit ile degradasyonunu mümkün kılmamaktadır. Sodyum sülfonat (B 1 S) oluşumu aflatoksin ile sülfonik asidin en önemli reaksiyon 23

41 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Bülent ZORLUGENÇ ürünlerinden biri olduğunun kanıtı olarak görülmektedir (Hagler ve ark., 1983; Yagen ve ark., 1989). Nem içeriği, sodyum bisülfit miktarı, süre ve sıcaklık derecesi AFB 1 in degradasyonu üzerinde önemli etkiye sahip olup bu faktörler AFB 2 üzerine etki göstermemektedirler (King ve Prudente, 2005). Doyle ve Marth (1978) ph nın 5.5 olduğu bir tampon sistemde sitrik asit veya metanol varlığında sodyum bisülfitin aflatoksinleri parçalama oranının düştüğünü gözlemlemişlerdir. Yaklaşık 235 ng g -1 aflatoksin içeren mısırda %0.5 ve %1 den daha düşük konsantrasyondaki sodyum bisülfitin AFB 1 in parçalanmasında aynı düzeydeki sodyum hidroksit veya amonyak çözeltisinden daha etkili bulunmuştur (Moerck ve ark., 1980). Altuğ ve ark. (1990) 250 ng g -1 AFB 1 ile kontamine olan incirler, %1 lik bisülfit uygulamasından önce %0.2 hidrojen peroksit ile muamele edilmiş ve tek başına bisülfit uygulaması ile kıyaslandığında 25 C de 72 saat içinde AFB 1 in %57 den fazlası parçalanmıştır. Doğal olarak toksinle kontamine olmuş yerfıstığı ezmesi sodyum bisülfit ve sodyum hidroksit ile ayrı olarak muamele edilmiş ve 24 saatlik depolama sonunda aflatoksin düzeyinde azalma görülmüştür. Ancak oda koşullarında 10 ve 20 gün depolandıktan sonra örneklerin toplam aflatoksin miktarında artış gözlenmiştir. Bu durum küflerin yeniden gelişim göstermesine bağlanmıştır. Aspergillus flavus aşılanan yerfıstığı ezmeleri %10 nem içerecek şekilde %1 lik sodyum bisülfit ile muamele edilmiş ve oda sıcaklığında küf gelişimi ile aflatoksin üretimi tamamen engellenmiştir (Ghosh ve Chhabra, 1995) Hipoklorit Uygulaması Klorlu su, gıda işleme ekipmanlarının dezenfeksiyonu ile çeşitli hammaddelerin işleme öncesinde yıkanmasında ve ayrıca bazı ülkelerde ağartıcı ve okside edici madde olarak un endüstrisinde kullanılmaktadır (Wei ve ark., 1985; Samarajeewa ve ark., 1990). Sodyum hipokloritin, sodyum hidroksit veya amonyum hidroksit için gerekli olan konsantrasyondan daha düşük miktarlarının bile florasanla belirlenen AFB 1 in düzeyinde oldukça etkili azalmaya neden olduğu belirtilmiştir. Sodyum hipokloritin 24

42 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Bülent ZORLUGENÇ organizmalar üzerinde toksik etki göstermesi nedeniyle Ames analizi ile toksisitesinin belirlenmesi mümkün olmamıştır (Draughon ve Childs, 1982). Bandara ve ark. (1991) su içerisine daldırılan yarı pişmiş pirinçlerin AFB 1 düzeylerinin arttığını gözlenmiş ancak 10 µg g -1 kalsiyum hipoklorit ilavesinin ise AFB 1 miktarında önemli derecede azalmaya neden olduğunu bildirmişlerdir. AFB 1 in degradasyonu ve OH radikalinin oksidasyonuna bağlı olarak mutajen özelliğinde azalma açısından değerlendirildiğinde, hipoklorik asidin sodyum hipokloritten daha çok etkili olduğu görülmüştür (Suzuki ve ark., 2002) Amonyak Uygulaması Amonyak uygulaması, mısır işleme endüstrisince kabul gören ve geniş çapta kullanılan bir yöntemdir (Park ve Njapau, 1989; Weng ve ark., 1994). Amonyum hidroksit veya amonyak gazı kullanılmasıyla mısır, yerfıstığı küspesi, pamuk tohumu ve ürünlerinde aflatoksinin %99 dan fazla azalması sağlanmıştır (Özay, 1988). Bu reaksiyon sonucu oluşan ürünler, AFB 1 den çok daha az toksiktir. Ancak, amonyaklanan üründen havalandırma ile amonyağın uçurulması gerekmektedir. ABD de Food and Drug Administration (USFDA) tarafından, amonyak işlemi görmüş yem hammaddesinin (pamuk tohumu için) %20'den fazla katılmaması ve uyarıların etikette bulunması gibi koşullarla geviş getiren hayvanlarda yem olarak kullanımına izin verilmiştir (Özkaya ve ark., 1999). Amonyaklama diğer detoksifikasyon yöntemlerine nazaran daha ekonomik olup büyük miktarda ürüne uygulanabilmektedir. Toksisite denemeleri ile amonyaklanmış ürünün emniyetli olduğu saptanmıştır (Özay, 1988). Lee ve ark. (1984) %4 amonyak uygulanmış AFB 1 içeren silika jelleri, 100 C de 30 dk süreyle 40 psi basınç altında tutmuşlar ve uygulama sonunda AFB 1 in %99 unun degrade olduğunu bildirmişlerdir. Ancak, molekül ağırlıkları 286 ve 206 olan iki yeni bileşik oluşmuştur. Çözücü fraksiyonlar, amonyaklanmamış AFB 1 den 2000 ile kez daha az toksik etki göstermiştir (Haworth ve ark. 1989). Amonyaklanmamış pamuk tohumu ununun metilen klorit fraksiyonunda radyoaktif olarak işaretlenen ürünün %90 ı, amonyaklanan unda ise yalnızca %25 i 25

43 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Bülent ZORLUGENÇ bulunmuştur (Park ve ark. 1984). Lawlor ve ark. (1985) yaptıkları çalışmada radyoaktif olarak işaretlenen ürünlere protein bağlandığını bildirmişlerdir. 500 ng g -1 AFB 1 ile kontamine olmuş kuru hindistancevizi, %20 nem içerecek şekilde %1.5 amonyum hidroksit ile muamele edilmiş ve 5 gün sonunda ana bileşiğe dönüş olmadan toksin miktarı 20 ng g -1 nin altına düşmüştür (Mercado ve ark., 1991). Yapılan başka bir çalışmada; toksinin dekontamine edilmesindeki en önemli faktörlerin, ürünün nem içeriği ile amonyaklama işleminin yapıldığı sıcaklık derecesinin olduğu belirtilmiştir (Weng ve ark., 1994). Yüksek sıcaklık (121 C) ve nem içeriğinin (%16) oldukça etkili olduğu, bu şartlar altındaki mısırlardaki toksinin %99 unun giderildiği bildirilmiştir. Ayrıca, bu ürünlerin mide asidine karşı dayanıklı oldukları ve % 0.05 ten azının aflatoksine geri dönüştüğü ifade edilmiştir (King ve Prudente, 2005). Ticari ölçekli bir çalışmada, aflatoksin içeren öğütülmüş pamuk tohumuna 99 C de ve 0.7 bar buhar basıncında % 1 amonyak uygulanmış, kalitede bir değişim olmaksızın %97 oranında detoksifikasyon sağlanmıştır (Ahmed ve ark., 1996). Başka bir çalışmada ise, %2 lik amonyum persülfatın mısırlarda AFB 1 in degradasyonunda etkili olduğu ve bu durumun etanol üretimini etkilemediği ifade edilmiştir (Burgos- Hernandes ve ark., 2002). Burgos-Hernandes ve ark. (1996), fermentasyon işlemiyle etanol üretiminde 3 farklı pestisit ile amonyum persülfat kullanımının aflatoksinle kontamine mısırlarda detoksifikasyona etkisini araştırmışlardır. Fermentasyon sırasında %2 ve üzerindeki miktarlarda amonyum persülfat, ayrıca farklı aşamalarda H 2 O 2, ozodicarbonamide ya da benzyl peroxide ilave etmişlerdir. Aflatoksinin en çok %2 amonyum persülfat kullanılması durumunda parçalandığı bildirilmiştir. Mercado ve ark. (1991), aflatoksinle kontamine olmuş kurutulmuş hindistan cevizinin amonyak ile kimyasal detoksifikasyonu üzerinde çalışmışlar ve %7-24 arasında nem içeren ürünlere ilave edilen %1.5 lik amonyum hidroksitin, 5 inci gün sonunda toksin miktarında %67 oranında bir azalmaya neden olduğunu belirtmişlerdir. 26

44 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Bülent ZORLUGENÇ Ozon Uygulaması Ozon, klor bazlı kimyasallar yerine geçerek özellikle et ve su endüstrilerinde olmak üzere, gıda işlemede sanitasyon amaçlı olarak geniş çapta kullanılmaya başlanmıştır (McKenzie ve ark., 1997). Aflatoksinli pamuk tohumu ve yerfıstığı ununun %30 nemde ve 100 C de 2 saat süreyle ozonlanmasıyla AFB 1 tamamen degrade olurken, başlangıçtaki %9 oranındaki AFB 2 nin aynen kaldığı bildirilmiştir (Dwarakanath ve ark., 1968). Ozonlanmış yerfıstığı unu, yavru ördeklerin yemlerine %60 oranında karıştırılmış ve bu ördeklerin vücut ağırlıklarının aflatoksinli yem yiyen ördeklere göre daha düşük bulunduğu belirtilmiştir (Dollear ve ark., 1968). Aflatoksinli mısırla karşılaştırıldığında, ozonla muamele edilen unlarda protein etkinlik oranının azaldığı bulunmuştur. Bu sonuca, ya temel besin öğelerinin yıkımının ya da yeni toksinlerin oluşumunun neden olduğu düşünülmektedir (King ve Prudente, 2005). Maeba ve ark. (1988) saf AFB 1, AFB 2, AFG 1 ve AFG 2 nin ayrı ayrı %5 lik çözeltilerini ozonla muamele etmişlerdir. AFB 2 ve AFG 2 nin ozonla oksidasyona AFB 1 ve AFG 1 den daha dayanıklı olduğu ve oksidasyonları için daha yüksek konsantrasyonlara ve uzun sürelere ihtiyaç duyulduğu belirtilmiştir. Ozonlanan aflatoksinlerin civciv embriyo analiziyle toksik olmadığı tespit edilmiştir. Ames testi ile de ozonlanan AFB 1 ve AFG 1 in mutajenik olmadığı bulunmuştur. Ozonlama ile AFB 1 in bağışıklığı azaltan aktivitesi de ortadan kaldırılmıştır (Chatterjee ve Mukherjee, 1993). Aflatoksinli tahılların dekontaminasyonunda daha sonra hayvan yemleri için de kullanılabilecek yeni bir ozonlama işlemi geliştirilmiştir. Bu yöntem, oksijen ve elektrik akımı kullanılan geleneksel metotlardan farklıdır çünkü ozon, su ve elektroliz hücresi kullanılarak üretilmektedir. Bu ozonlama yöntemi kullanılarak 30 kg mısır tanesi ile yapılan çalışmada 92 saatte örneklerin aflatoksin içeriği %95 oranında azalmıştır. Ozonla muamele edilen mısır, yerfıstığı ve bunların soya unu ile karışımlarını tüketen hindi palazlarının ağırlık kazanımları, karaciğer ağırlıkları ve kan kimyaları kontrol örneklerle aynı bulunmuş, aflatoksinli yemlerle beslenen hayvanlarda ise olumsuz farklar görülmüştür (McKenzie ve ark., 1998). Bu sonuçlar ozonlama öncesinde kontamine olan veya olmayan mısırlar için de benzer bulunmuş 27

45 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Bülent ZORLUGENÇ olup, ozonlama işlemi ile zararlı bileşiklerin oluşmadığının bir göstergesidir (King ve Prudente, 2005). Aflatoksinsiz ve doğal olarak aflatoksin içeren mısır örnekleri ozonlanmadan önce ve sonra AFB 1 içeriklerinin belirlenmesi amacıyla analiz edilmiştir. Ozonlanmış ve ozonlanmamış toksinsiz mısırların 2 ng g -1 den daha az AFB 1 içerdikleri, ozonlanmış ve ozonlanmamış toksinli mısırların ise sırasıyla 48 ng g -1 ve 587 ng g -1 AFB 1 içerdiği tespit edilmiştir. Çalışmada inaktif hale geçen aflatoksinin ana bileşiğe geri dönmediğini göstermiştir (Prudente ve King, 2002). Asidik bir ortama maruz kalan 47 ng g -1 AFB 1 içeren ozonlanmış örneklerin toksin içerikleri 29 ng g -1 ye düşmüştür. Asit uygulaması, AFB 1 in furan halkasının 8, 9-olefinik bağının hidrasyonuna öncülük ederek AFB 1 in 1/200 ü kadar az toksik olan AFB 2a nın oluşmasına neden olmuştur (Samarajeewa ve ark., 1990). Hekzan ekstraktları sürekli olarak saf AFB 1 in potansiyel mutajenik etkisini azaltmaktadır (Prudente ve King, 2002). Bu sonuç, mısırın kaba (crude) ekstraktları içindeki mevcut maddelerin aflatoksinin mutajenik aktivitesini engellediğini desteklemektedir. Ayrıca ozonlanmış aflatoksin içeren mısır ekstraktlarının diğer ekstraktlarla karşılaştırıldığında daha az engelleyici etkisinin olduğu görülmüştür. Elde edilen bulgular, ozonlama işlemi ile mutajenik etkiye sahip yeni reaksiyon ürünlerinin oluşmuş ya da ozonlamanın toksinli mısırlardaki doğal mutajen inhibitörlerini tahrip etmiş olabileceğini göstermektedir (Prudente ve King, 2002; King ve Prudente, 2005). Yapılan bazı çalışmalarda, linoleik asidin antimutajenik aktivite gösterirken otooksidasyona uğrayan linoleik ve oleik asitlerin ise mutajenik aktivite gösterdiği bildirilmiştir (Aikawa ve Komatsu, 1987; Aikawa, 1988; Ho ve ark., 1995). Prudente ve King (2002) ozonla muamele edilen ve doğal olarak aflatoksin içeren mısırların palmitik asit miktarlarının %15.8 den %18.2 ye çıktığını ve linoleik asitin %58.7 den %56.2 ye düştüğünü belirtmişlerdir. Zorlugenç ve ark. (2008) yaptıkları çalışmada, ozonlama öncesi kuru incirlerde mikotoksin oluşumuna neden olan A. flavus ve A. parasiticus un bulunduğunu ve 15 dakika süreyle ozon gazı ve ozonlu su ile muamele edilen incir örneklerinde küflerin tamamen yok edildiklerini bildirmişlerdir. Araştırıcılar ayrıca, 28

46 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Bülent ZORLUGENÇ incirlerin AFB 1 içeriklerinin 180 dakikalık ozon gazı ve ozonlu su uygulaması sonrasında ng g -1 dan sırasıyla 1.01 ve 2.39 ng g -1 a düştüğünü belirtmişlerdir Biyolojik Detoksifikasyon Mikotoksinler ile kontamine olmuş tarımsal ürünlerin detoksifikasyonunda mevcut fiziksel ve kimyasal metotların kullanımı, besin içeriğindeki kayıplar, sınırlı etki ve maliyet gibi sorunlar nedeniyle kısıtlanmaktadır. Bu durum mikotoksin sorununa karşı biyolojik yaklaşımı cazip hale getirmektedir (Bata ve Lasztity, 1999; Shapira ve Paster, 2004). Biyolojik degradasyonla ilgili ilk bulgular, aflatoksinin keşfedildiği 1960 lı yıllarda, aralarında küf, maya, aktinomiset, bakteri ve alglerin bulunduğu yaklaşık 1000 mikroorganizmanın, AFB 1 ve AFG 1 i parçalama veya biyo-dönüşüme uğratması yönünde etkilerinin olup olmadığının test edildiği çalışma ile elde edilmiştir. Çalışmada, aflatoksin üzerine hiçbir maya, aktinomiset ve algin etkili olmadığı belirlenmiştir. Bazı Pseudomanas türlerinin aflatoksini azalttığı görülmüşse de, bunun ortam ph sındaki yükselmeye bağlı olduğu belirtilmiştir. Küf ve küf sporları ile yapılan denemelerde, Aspergillus niger suşlarının AFB 1 i belli ölçüde azalttığı, ancak bunun uzun bir inkübasyon süresince gerçekleştiği; Penicillium raistrickii ve bazı küf sporlarının da, AFB 1 in bir kısmını ince tabaka kromotografisinde farklı R f lerde floresans veren maddelere dönüştürdüğü bildirilmiştir. Ayrıca çalışmada Flavobacterium un 7 farklı türü de dahil olmak üzere test edilen bütün bakterilerin aflatoksin üzerinde etkisiz olduğu görülürken, yalnız F. aurantiacum NRRL B-184 suşunun aflatoksini ortamdan uzaklaştırılabildiği belirlenmiştir (Ciegler ve ark., 1966). Mikotoksinlerin biyolojik detoksifikasyonu çoğunlukla, sorpsiyon veya enzimatik degradasyon yolu ile gerçekleşmektedir. Canlı mikroorganizmalar mikotoksini ya hücre duvarı bileşenlerine bağlamakta ya da aktif internalizasyon (özümseme) ve akümülasyon ile absorbe etmektedirler. Ölü mikroorganizmalar da mikotoksinleri absorbe edebilmekte ve bu durumdan akışkanların dekontaminasyonu için biyofiltre oluşturmada veya probiyotiklerin bağlanarak bağırsaktan mikotoksini uzaklaştırmalarında yararlanılabileceği belirtilmiştir (Shapira ve Paster, 2004). 29

47 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Bülent ZORLUGENÇ Enzimatik degradasyon ise hücre dışı veya hücre içi enzimler tarafından gerçekleşebilmektedir. Enzimatik degradasyon tamamlandığında son ürün CO 2 ve su olur. Diğer bir seçenek ise enzimatik modifikasyon ile toksinin başka bir forma dönüşmesi, azalması veya tamamen yok olmasıdır (Shapira ve Paster, 2004). Mikroorganizmaların AFB 1 i bağlama yeteneklerinin araştırıldığı çeşitli çalışmalarda, laktik asit bakterilerinin, bifidobakterlerin ve propionibacterium ların bazı suşlarının AFB 1 i bağlayabildikleri tespit edilmiştir (El-Nezami ve ark., 1998a; El-Nezami ve ark., 1998b; El-Nezami ve ark., 2000; Oatley ve ark., 2000; Haskard ve ark., 2001). F. aurantiacum NRRL B-184 dışında AFB 1 i detoksifiye eden mikroorganizmaların; Corynebacterium rubrum, Candida lipolytica, Aspergillus niger, Trichoderma viride ve Mucor ambiguous ile bazı Rhizopus, Neurospora ve Phoma türlerinin olduğu bazı araştırıcılar tarafından bildirilmiştir (Mann ve Rehn, 1976; Nout, 1989; Shantha, 1989). Flavobacterium, agarlı kültür besiyerinde sarı-kırmızı renkli kolonileri ile karakterize olan ve karbonhidratlardan zayıf asit oluşturabilen, gram negatif, fakültatif anaerob, çubuk şeklinde bir bakteri cinsidir (Holmes ve ark., 1984). Flavobacterium cinsine giren türler genelde 30 o C ve hemen altındaki sıcaklıklarda gelişebilmektedir. Bu bakterinin çok az sayıdaki türünün 37 o C de üreyebildiği belirtilmiştir (Weeks, 1974). Bergey s Manual in sekizinci baskısında (Weeks, 1974) tür sayısı 12 olarak belirtilmekle birlikte, 1984 yılında yayınlanan baskısında (Holmes ve ark., 1984) Flavobacterium cinsi içine F. aquatile, F. breve, F. balustinum, F. meningosepticum, F. odoratum, F. multivorum, F. spiritivorum olmak üzere 7 tür dahil edilmektedir. Sözü edilen Bergey s Manual baskılarında F. aurantiacum NRRL B-184 türüne ise rastlanılmamıştır. F. aurantiacum NRRL B-184 suşu Amerika Birleşik Devletleri Kuzey Bölgesi Araştırma Laboratuarınca (Northern Regional Research Laboratory- NRRL) tanımlanan ve isimlendirilen bir bakteridir (Özkaya, 2001). Ciegler ve ark. (1966) yaptıkları bir araştırmada, Flavobacterium aurantiacum olarak izole edilen ve F. aurantiacum NRRL B-184 olarak tanımlanan bu bakterinin Bergey s Manual in altıncı baskısında yer alan F. 30

48 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Bülent ZORLUGENÇ aurantiacum un ve diğer Flavobacterium türlerinin özelliklerine tam uyum göstermediğine değinmişlerdir. Araştırıcılar F. aurantiacum NRRL B-184 olarak isimlendirilen bu bakterinin, aerobik, gram negatif, çubuk şekilli, hareketsiz bir bakteri olduğunu ve tryptone-glucose-yeast extract (TGY) agarlı besiyerinde, yuvarlak, parlak turuncu renkte, kubbeli, pürüzsüz ve sınırları belirgin koloniler oluşturduğunu belirtmiştir. Ayrıca çalışmada, bakterinin jelatini sıvılaştırmadığı, litmuslu süt besiyerinde 48 saatte 5mm nin üzerinde alkali reaksiyon verdiği, nitrattan nitrit oluşturmadığı, sitratta gelişmediği ve indol, nişasta hidrolizi, glukoz, sukroz ve laktoz negatif özellik gösterdiği belirtilmiştir. F. aurantiacum NRRL B-184 suşunun sınıflandırılmasıyla ilgili yapılan çalışmalarda bakterinin sınıflandırılmasında hata yapıldığı belirlenmiş ve bakteri Nocardia corynebacteriodes olarak yeniden adlandırılmıştır (Yassin ve Schaal, 2005). Ciegler ve ark. (1966) tarafından yapılan çalışmada, kob ml -1 konsatrasyonda F. aurantiacum NRRL B-184 bakteri hücresi tarafından, modifiye TGY sıvı besiyerinde bulunan değişik konsantrasyondaki ( µg 50ml -1 ) AFB 1 in 44 saat içinde %38-74 arasında değişen oranlarda uzaklaştırıldığı görülmüştür. Aflatoksinli ve aflatoksinsiz TGY sıvı besiyerinde geliştirilen durgun faz hücreleri, aflatoksin içeren fosfat tamponunda inkübe edilmiş; her iki durumda da toksinin ortamdan uzaklaştığı görülmüş ve toksinli besiyerinde geliştirilen hücrelerle, toksinsiz olanlarda geliştirilen hücrelerin aflatoksini uzaklaştırma oranları benzer bulunmuştur. Toksindeki azalma, hücre sayısı ve inkübasyon süresinin artırılmasıyla orantılı olarak artmıştır. Çalışmada, otoklavlanmamış F. aurantiacum NRRL B-184 kültüründeki ölü hücrelerin, hücre sayısı ile orantılı olarak AFB 1 i çözeltiden uzaklaştırdığı tespit edilmiştir. Bu çalışmada, 3x10 12 kob 50 ml -1 hücreyle inkübe edilen AFB 1 in yaklaşık olarak %70 i uzaklaştırılmıştır. Ancak, ölü hücreler çözeltiden uzaklaştırılıp, hücre peleti suyla yıkandığında toksinin tamamı geri alınmıştır. Ayrıca, hücre sayısının ve inkübasyon süresinin artırılmasının toksinin %70 inden daha fazlasının uzaklaştırılması üzerine etkili olmadığı görülmüştür. Buna karşılık canlı durgun faz hücreleri (2x10 13 kob 50ml -1 ), 1 er mg AFB 1 ve G 1 içeren sudaki toksinlerin tamamını 3-4 saat içerisinde uzaklaştırmışlardır. Canlı 31

49 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Bülent ZORLUGENÇ hücrelerin ortamdan uzaklaştırdığı toksin, su ya da kloroformla yıkamayla veya sonik işlemle dahi geri alınamamıştır. Canlı hücrelerin inkübasyondan sonra otoklavlanması da toksinin geri dönüşünü sağlamamıştır. Bu nedenle araştırıcılar, aflatoksinin geri dönüşümsüz olarak bağlanıp ortamdan uzaklaştırılabilmesi için F. aurantiacum NRRL B-184 ün canlı hücrelerine gereksinim duyulduğu sonucuna varmışlardır. Aynı çalışmada aflatoksinin tamamının uzaklaştırıldığının ve degradasyon ürünlerinin toksik olup olmadığının belirlenmesi amacıyla, AFB 1 ve AFG 1 ile inkübe edilen F. aurantiacum NRRL B-184 hücrelerinin sulu süspansiyonları yavru ördeklere verilmiştir. Tek başına 8 µg AFB 1 ve 7 µg AFG 1 verilen ördeklerde Bile Duct Hyperplasia görülürken, canlı hücrelerle işlem görmüş 52.5 µg AFB 1 veya 30 µg AFG 1 verilen ördeklerde ise bu hastalık görülmediği gibi herhangi bir histolojik değişiklik de gözlenmemiştir. Araştırıcılar, canlı F. aurantiacum NRRL B-184 hücrelerinin çözeltideki aflatoksini detoksifiye ettiğini ve yeni toksik parçalanma ürünlerinin oluşmadığını belirtmişlerdir (Ciegler ve ark., 1966). Ciegler ve ark. (1966), F. aurantiacum NRRL B-184 ü çeşitli gıdalar üzerinde de denemişlerdir. Bu denemelerde, toksijenik bir A. flavus suşu geliştirilerek aflatoksin oluşumu sağlanan ürünlerde çalışılmıştır kob ml -1 canlı F. aurantiacum NRRL B-184 hücresi ile 28 o C de 12 saatlik inkübasyon sonunda soya fasulyesindeki 8 µg g -1 düzeyindeki AFB 1 2 µg g -1 e düşmüş, inkübasyon süresi uzatıldığında soya fasulyesinde kalan aflatoksininde giderildiği belirlenmiştir. Mısır ve yerfıstığında, sırasıyla 16 ve 13 µg g -1 düzeyindeki AFB 1 in %100 oranında ortamdan uzaklaştığı belirtilmiştir. Süt, bitkisel yağ ve fıstık ezmesi gibi sıvı ve yarı katı ürünlerde ise 2x10 13 kob ml -1 bakteri hücresi ile mg L -1 düzeyindeki AFB 1 in 2-3 saat gibi kısa sürelerde sıfıra veya iz miktarlara düştüğü ortaya konulmuştur. Lillehoj ve ark. (1967) AFB 1 in F. aurantiacum NRRL B-184 hücreleri üzerine etkisini ve toksinin organizmaya bağlanma miktarı ile bağlanma mekanizmasını incelemişlerdir. Bu çalışmada, 5µg ml -1 ve daha yüksek konsantrasyonda aflatoksin bulunan ortamda gelişen F. aurantiacum NRRL B-184 hücrelerinin morfolojisinin değiştiği; hücre boyunun belirgin şekilde uzadığı, ipliksi 32

50 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Bülent ZORLUGENÇ bir görünüm alan bu hücrelerde daha sonra da şişkinlik ve dallanmalar meydana geldiği görülmüştür. Penisilin bulunan ortamda gelişen F. aurantiacum NRRL B-184 hücrelerinde de benzer morfolojik değişimlerin görüldüğü belirtilmiştir. Çalışmada, test çözeltilerine eklenen %1 glikoz, 0,01M azid ve 1000 ünite ml -1 penisilinin, AFB 1 in uzaklaştırılması üzerine etkili olmadığı ifade edilmiştir. Aflatoksinin durgun fazdaki hücreler tarafından uzaklaştırılmasının inkübasyon ortamının sıcaklığına ve ph sına karşı oldukça duyarlı olduğu ve en fazla azalmanın 35 o C de ve ph 6,75 de gerçekleştiği belirtilmiştir. Aynı çalışmada, kob ml -1 düzeyinde durgun faz hücresi içeren bir sıvı ortama 7µg ml -1 AFB 1 ilave edilmiş ve 4 saat lik inkübasyonun sonunda toksinin tam olarak uzaklaştığı belirtilmiştir. Toksinin canlı hücreden suyla yıkama ve sonik uygulama ile geri alınamadığı da bildirilmiştir. Aynı deneme otoklavlanmış hücrelerle yapıldığında AFB 1 in yaklaşık olarak aynı oranda ortamdan uzaklaştırıldığı, yıkama işlemi ile toksinin geri alınabildiği ve inkübasyon süresinin uzaması durumunda toksin azalışının devam etmediği ifade edilmiştir. Ayrıca, hücre duvarı öğütülmüş bakteri ve hücre duvarı preparatları da toksini uzaklaştırmada kısmen başarılı bulunmuş, ancak bu preparatlar suyla yıkandığında toksin geri alınabilmiştir. Bu durumun, aflatoksinin başlangıçta hücre dış yüzeyine muhtemelen Hidrojen veya Van Der Waals bağlarıyla zayıf olarak bağlanması ile açıklanmıştır. Araştırıcılar, toksinin canlı hücreler tarafından metabolik olarak kullanıldığı ve geri dönüşümsüz olarak giderilmesi için sağlam ve tam hücre yapısına ihtiyaç olduğu sonucuna varmışlardır. Lillehoj ve ark. (1967), AFG 1 in gelişme dönemindeki F. aurantiacum NRRL B-184 hücreleri üzerine etkisi ile toksinin durgun faz ve otoklavlanmış hücrelerden uzaklaştırılmasını inceledikleri çalışmada; 2.5 mg L -1 AFG 1, F. aurantiacum NRRL B-184 ün gelişmesi üzerine etki etmezken, 48 saatlik inkübasyon sonunda 7.5 ve 37.5 µg g -1 toksin, bakteri gelişiminin sırasıyla %55 ve %90 oranında azalmasına neden olmuştur. Gelişme ortamındaki AFG 1 konsantrasyonunun artması lag fazı süresinin de artmasına neden olmuş ancak 96 saat sonrasında tüm kültürler için toplam gelişme süresi benzer bulunmuştur. AFG 1 ile karşılaştırıldığında AFB 1 in test 33

51 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Bülent ZORLUGENÇ mikroorganizmasının gelişimini engelleyici etkisinin 2-3 kat fazla olduğu belirtilmiştir. Araştırıcılar, AFB 1 ve AFG 1 in hücrenin aynı bölgesine bağlanıp bağlanmadığını test etmek için hücreleri AFG 1 ortamına ilave etmeden önce AFB 1 ile muamele etmişlerdir. Deneme sonucunda hücrelerin AFB 1 i bağladıktan sonra AFG 1 i de ortamdan uzaklaştırabildiği bu durumun her iki toksinin hücrenin farklı bölgelerinde tutulduğunu gösterebileceğini belirtmişlerdir. Lillehoj ve ark. (1971), F. aurantiacum NRRL-184 ün gelişme ve durgun fazdaki hücrelerinin AFM 1 in giderilmesi üzerine etkilerini inceledikleri çalışmada 8 μg ml -1 AFM 1 içeren sıvı ortama 5x10 10 kob ml -1 olacak şekilde durgun fazda hücre inkübe edilmiş ve dört saat sonra AFM 1 tamamen uzaklaştırılmıştır. AFM 1 in gelişme dönemindeki hücreler üzerindeki olumsuz etkisinin ise AFG 1 ve AFB 1 den daha az olduğu belirtilmiştir. Hao ve Brackett (1988) 10 9 kob ml -1 durgun faz hücresini içeren fosfat tamponu ile yağlı ve yağı kısmen uzaklaştırılmış yerfıstığı sütünden F. aurantiacum NRRL B-184 ün AFB 1 i uzaklaştırma yeteneğini araştırmışlardır. 24 saat lik inkübasyon sonunda, aflatoksin miktarının fosfat tamponunda %40, yağı alınmamış ve yağı %50 azaltılmış olan yerfıstığı sütünde sırasıyla %23 ve %74 oranında azaldığını belirtmişlerdir. Hao ve Brackett (1989) tarafından yapılan diğer bir çalışmada ise, F. aurantiacum NRRL B-184 ün, durgun faz hücrelerinin elde edilmesi için uygun olan besiyeri belirlenmiş ve bu bakterinin yerfıstığı sütündeki gelişme karakteristikleri incelenmiştir. Durgun faz hücrelerinin elde edilmesinde en uygun besiyerinin, ticari olarak bulunabilen bir ürün olması, kullanımı sırasında özel bir hazırlık gerektirmemesi ve en iyi gelişimin bu besiyerinde gerçekleşmesi nedeniyle TSB olduğu belirtilmiştir. F. aurantiacum NRRL B-184 ün yağlı yerfıstığı sütünde, yağ miktarı yaklaşık %50 oranında azaltılmış olana göre daha yavaş durgun faza ulaştığı ve bakterinin stabilitesinin en iyi ph 7.0 de korunduğu ifade edilmiştir. Line ve ark. (1994) nın F. aurantiacum NRRL B-184 tarafından gerçekleştirilen aflatoksin degradasyonunun mekanizmasını belirlemeye yönelik yaptıkları çalışmada, radyoaktif olarak işaretlenmiş olan AFB 1, canlı ve ölü bakteri 34

52 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Bülent ZORLUGENÇ hücreleri ile 72 saat süreyle inkübe edilmiştir. Örnekler kloroformla ekstrakte edilmiş ve belirli periyotlarla sulu ve polar olmayan fazlar 14 C içeriği yönünden analiz edilmiştir. Kloroformda çözünen [ 14 C] AFB 1 in canlı F. aurantiacum NRRL B-184 hücreleri tarafından hızla suda çözünür ürünlere dönüştürüldüğü görülmüştür. Canlı hücrelerin varlığında 6 saat sonunda kloroform fazında radyoaktivitenin yalnızca %24.1 i kalmıştır. F. aurantiacum NRRL B-184 hücresi içermeyen kontrol örneklerinde ise 72 saat sonunda kloroform fazında radyoaktivitenin %99.7 si kalmıştır. Denemenin sürdürüldüğü zaman içerisinde radyoaktividedeki azalma ile suda çözünür degradasyon ürünlerinin oluşum hızlarının benzer olduğu görülmüştür. Sabit biyokütlede ve sürekli olarak azalan substrat düzeylerinde hız, kalan substratın konsantrasyonu ile doğru orantılıdır. Bu durum, topraktaki ve sudaki birçok bileşiğin dekompozisyonunda da görülen birinci derece kinetiğe uygun bulunmuştur. Araştırıcılar ayrıca, bir miktar aflatoksinin ölü F. aurantiacum NRRL B-184 hücreleri tarafından bağlandığını ancak suda çözünür bileşiklere ya da karbon dioksite dönüştürülemediğini ifade etmişlerdir. Line ve Brackett (1995a) AFB 1 in F. aurantiacum NRRL B-184 tarafından uzaklaştırılmasını etkileyen faktörleri inceledikleri çalışmada kültür yaşı ve hücre sayısının aflatoksinin degradasyonunda etkili olduğu ifade edilmiştir. 24 saatlik kültürün aflatoksini uzaklaştırmada tamamen etkisiz bulunduğu, 48 saatlik durgun faz kültürünün ise toksin üzerinde etkili olarak AFB 1 i 24 saat içerisinde %19 oranında azalttığı bildirilmiştir. Ayrıca, 72 saatlik geç durgun faz kültürünün toksini ortamdan %33 oranında uzaklaştırdığı da belirtilmiştir. Araştırıcılar bu durumun tam olarak anlaşılamadığını ancak, yaşlanmaya bağlı olarak hücrenin bazı konformasyonal veya metabolik değişiklik geçiriyor olmasına bağlanabileceğini belirtmişlerdir. 1x10 10 kob ml -1 hücrenin, 1x10 9 kob ml -1 hücre ile kıyaslandığında aflatoksini ortamdan daha hızlı olarak uzaklaştırdığı ancak uzaklaştırılan toplam toksin miktarında bir değişiklik görülmediği de ifade edilmiştir. Line ve Brackett (1995b) tarafından yapılan başka bir araştırmada, F. aurantiacum NRRL B-184 tarafından AFB 1 in mikrobiyel dönüşümü üzerine toksin konsantrasyonunun ve ikinci karbon kaynağının etkisi incelenmiştir. Bu amaçla bakteri hücresi içeren fosfat tamponu veya TSB test çözeltilerinin bir kısmına 35

53 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Bülent ZORLUGENÇ radyoaktif olarak işaretlenmiş AFB 1, diğer bir kısmına da hem işaretlenmiş hem de işaretlenmemiş AFB 1 eklenmiş ve 28 o C de 72 saat inkübe edilmiştir. Radyoaktif karbondioksitin ve hücre süpernatantının suda ve kloroformda çözünen kısımlarının analiz edilmesiyle, ilave olunan besin öğelerinin ve işaretlenmemiş toksinin AFB 1 in mikrobiyel dönüşümü üzerine önemli bir etkisinin bulunmadığı ortaya koyulmuştur. Araştırıcılar çalışmadan elde edilen sonuçları, AFB 1 in F. aurantiacum NRRL B-184 tarafından degradasyonunun ko-metabolizma ile ilişkili olmadığı ancak, organizmaların hem karbon hem de enerji kaynağı olarak tek bir bileşikten yararlandığı metabolizma şekli olan mineralizasyon sonucu meydana gelebileceği şeklinde yorumlamışlardır. Bu çalışmayla ileri sürülen degradasyonun bir mineralizasyon prosesi içerisinde gerçekleştiği ve dışarıdan bir enerji kaynağına ihtiyaç göstermediği hipotezinin doğrulanmasının bu yöntemle detoksifiye edilen gıdalarda ve yemlerde besin kalitesinin olumsuz etkilenmeyeceğini düşündürmüştür. D souza ve Brackett (1998) degradasyon prosesleri ile ilişkili olduğu düşünülen enzim sistemlerinde yer alan bazı metal ko-faktörlerin (Cu +2, Mn +2, Zn +2 ve Co +2 ), F. aurantiacum NRRL B-184 tarafından AFB 1 in degradasyonunda etkili olup olmadığını ve bu etkinin Etilendiamintetraasetikasit (EDTA) ve 1,10 fenantrolin (OPT) varlığında da sürüp sürmediğini araştırmışlardır. 1 ve 10 mm konsantrasyonlarda iki değerlikli bakır içeren ortamlarda; 4, 24 ve 48 saatlik, 0.1 mm konsantrasyonda ise 24 ve 48 saatlik inkübasyondan sonra AFB 1 in degradasyonunun kontrollerden önemli ölçüde düşük olduğu görülmüştür. 1mM EDTA veya 1mM OPT ilavesi, Cu +2 nin AFB 1 in degradasyonu üzerindeki inhibe edici etkisini önleyememiştir. Araştırıcılar Cu +2 nin bakteriler üzerine toksik etki gösterebileceğini, yaptıkları ön denemelerde 0.1, 1 ve 10 mm Cu +2 içeren ortamlarda 48 saat inkübe edilen hücrelerin sayısında log düzeyinde bir azalma gördüklerini bildirmişlerdir. Ancak bu toksik etkinin bir enzim veya enzim sistemi üzerinde de olabileceği ve AFB 1 degradasyonuyla ilişkili bir redüktaz sistemini inhibe etme olasılığı üzerinde de durulmuştur. 0.1 mm Mn +2 ilavesinin toksin degradasyonu üzerine etkisi önemli bulunmazken, 1 ve 10 mm konsantrasyonda ise 4 ve 24 saatlik inkübasyondan sonra degradasyonda önemli bir azalma olduğu görülmüştür. Ön çalışmalarda Mn +2 36

54 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Bülent ZORLUGENÇ bulunan ortamlarda hücre sayısında azalma gözlendiğinden yüksek konsantrasyonlardaki iki değerlikli manganın, AFB 1 degradasyon sisteminin genlerini baskılayabileceği veya enzimin degradasyon için inaktif veya daha düşük affiniteye sahip bir hale dönüşmesine neden olabileceği belirtilmiştir. Yalnızca Mn +2 ilavesi ile karşılaştırıldığında 1mM Mn +2 nin 1mM EDTA veya OPT tarafından bağlanması, 4 ve 24 saat sonra AFB 1 in degradasyonunu önemli ölçüde artırırken, 1 mm OPT nin 10 mm Mn +2 içeren ortama eklenmesi ise artırmamıştır. Bu bulgu araştırıcılar tarafından, Mn +2 nin AFB 1 degradasyonu üzerine inhibisyon etkisinin yalnız yüksek konsantrasyonlarda olduğu şeklinde değerlendirilmiştir. İki değerlikli çinko eklenen örneklerde de degradasyon, 1 ve 10 mm konsantrasyonlarda; 4, 24 ve 48 saat sonra önemli ölçüde azalırken, 0.1 mm Zn +2 varlığında önemli bir değişiklik görülmemiştir. 1 mm EDTA, 1 ve 10 mm Zn +2 nin bu inhibitör etkisini önleyemezken, OPT Zn +2 ye bağlanmış ve degradasyonun inhibisyonunu önlemiştir. Ancak, 10 mm konsantrasyondaki Zn +2 varlığında OPT yalnız Zn +2 bulunanlara göre daha yüksek bir degradasyon sağlanmıştır. Buna rağmen, yalnız AFB 1 bulunan ortamdaki kontrol hücrelerinin degradasyon oranından daha az degradasyon gerçekleşmiştir. Zn +2 nin degradasyon ile ilişkili olan enzim veya enzim sisteminde konformasyonal bir değişikliğe neden olarak aktiviteyi etkileyebileceği üzerinde de durulmuştur. Çalışmada Co +2 nin degradasyonda hiçbir değişikliğe neden olmadığı görülerek başka denemeler yapılmamıştır. Araştırıcılar sonuç olarak, Cu +2, Mn +2 ve Zn +2 nin degradasyonda gösterdiği inhibisyonun, AFB 1 degradasyonu ile ilişkili özel bir enzim veya enzim sisteminin kesin kanıtlarını sağlamadığını; ancak bir redüktaz sisteminin bu organizma tarafından aflatoksinin degradasyonunda rol oynadığını öne sürebileceklerini ifade etmişlerdir. Ayrıca bu katyonların ham (crude) enzim preparatları üzerine etkisini belirlemede hücresel fraksiyonların kullanıldığı ilave araştırmalara gerek görüldüğü de belirtilmiştir. D souza ve Brackett (2000) yaptıkları çalışmada, F. aurantiacum NRRL B- 184 tarafından AFB 1 in degradasyonunda kalsiyum ve magnezyumun rolü ile şelatlar ve ayrıca şelatların varlığında iki değerlikli katyonların etkilerinin belirlenmesi 37

55 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Bülent ZORLUGENÇ amaçlanmıştır. Araştırmada Ca +2 ve Mg +2 nin kullanılma nedeni olarak, bu elementlerin enzimlerin büyük bir bölümünde doğal aktivatörler olmaları gösterilmiştir. F. aurantiacum NRRL B-184 ün 72 saatlik kültürü üzerine 10 µg ml -1 AFB 1 ilave edildikten sonra 0.1, 1 ve 10 mm Ca +2 eklenip 48 saat süreyle inkübe edilmiştir. Süre sonunda Ca +2 ilave edilmemiş hücrelerle kıyaslandığında toksin miktarında sırasıyla %11.8, 13.5 ve 14.0 oranında azalma görülmüştür. Aynı konsantrasyonlardaki Mg +2 ilavesi ise sırasıyla %13.8, 13.3 ve 13.1 lik bir azalmaya neden olmuştur. Her iki katyon için 16 ve 24 saatlik inkübasyon süresi aflatoksinin degradasyonunda önemli bir etkiye sahip bulunmamıştır. 0.1, 1 ve 10 mm EDTA ile 0.1 ve 1 mm OPT ilavesinin 24 saat sonunda AFB 1 in degradasyonunda önemli bir artışa neden olduğu bildirilmiştir. 10 mm OPT kullanılması durumunda ise daha az toksin degrade edilebilmiştir. AFB 1 ile inkübe edilmiş kontrol örnekler ile Ca +2 ya da Mg +2 içeren kontrol örneklerde önemli bir toksin degradasyonu gerçekleşmemiştir. Aflatoksin degradasyonundaki artışın, ilave edilen bu divalent katyonların glikoliz ve trikloroasetik asit döngüsündeki çeşitli dehidrogenazlar ve dekarboksilazların önemli kofaktörleri olmalarına bağlı olabileceği ifade edilmiştir. Divalent katyonlar (Ca +2 ve Mg +2 ) olmaksızın EDTA (0.1, 1 ve 10 mm) ilavesi ile 24. saatteki degradasyon önemli ölçüde artmış, 16. ve 48. saatlerdeki artışlar ise önemli bulunmamıştır. Aynı şekilde 0.1 ve 1 mm OPT ilavesi de 24 saat inkübasyondan sonra önemli ölçüde yüksek degradasyon sağlamıştır. Ancak 10 mm OPT ilave edilen örnekte 16 ve 24 saatlik inkübasyondan sonra bir azalma görülmüştür. 1 mm EDTA bulunan ortama ilave edilen Ca +2 toksin degradasyonunda önemli bir değişikliğe neden olmamıştır. Buna karşın 1 mm OPT ile Ca +2 nin birlikte bulunması durumunda degradasyonda azalma görülmüştür. En yüksek degradasyon 1 mm OPT varlığında 10 mm Ca +2 ilavesi ile gerçekleşirken yine 1 mm OPT varlığında 0.1 ve 1 mm Ca +2 ilavesi degradasyonda azalma ile sonuçlanmıştır. Kontrol örneklerle karşılaştırıldığında, 1 mm EDTA veya 1 mm OPT varlığında Mg +2 ilavesi AFB 1 in degradasyonunda önemli derecede azalmayla sonuçlanmıştır. Elde edilen bu sonuçlar, Ca +2 ve Mg +2 un AFB 1 in F. aurantiacum tarafından degradasyonunu teşvik ettiğini, bu katyonların şelatörlerle bağlanması durumunda F. aurantiacum NRRL B-184 hücreleri tarafından kullanılamadığını ve böylelikle 38

56 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Bülent ZORLUGENÇ toksinin degradasyonunda azalma meydana geldiğini göstermiştir. Araştırıcılar AFB 1 in degradasyon mekanizması üzerine; bir redüktaz-dehidrogenaz enzim sistemi yoluyla furan halkası oluşumunda meydana gelen azalmanın, dekarboksilazlar aracılığı ile AFB 1 in kumarin halkasının dekarboksilasyona uğramasının ve ayrıca birden fazla enzimin etkili olabileceğini belirtmişlerdir. Araştırıcılar, degradasyon mekanizması ve meydana gelen degradasyon ürünlerinin tam olarak anlaşılamaması durumunda, bu yöntemin uygulamaya sokulmasının mümkün olmadığı sonucuna varmışlardır. Ancak degradasyon ile ilişkili enzim veya enzim sistemleri belirlendikten sonra; enzimlerin gen kodlamasının yapılarak, plazmidlerin içine yerleştirilebileceği ve dekontaminasyon işlemlerinde kullanılmak üzere başka bir organizmaya transfer edilebileceği ya da dirençli ürünler elde etmek amacıyla genetik materyalin doğrudan bitkide kullanılmasına olanak sağlayacak çalışmaların yapılabileceği belirtilmektedir. Smiley ve Draughon (2000), F. aurantiacum NRRL B-184 ün ham protein ekstraktlarının sulu çözeltide AFB 1 i degrade etme yeteneğini belirlemeyi amaçladıkları çalışmada proteinaz K, DNase I ve ph nın degradasyon üzerindeki etkileri de incelenmiştir. Protein ekstraktları (800 μg toplam protein/ml) sulu çözeltilerdeki AFB 1 i % 75 oranında ortamdan uzaklaştırmıştır. Isıl işlem görmüş ham protein ekstraktı ise AFB 1 i yalnızca % 5.5 oranında degrade edebilmiş ve bu oran kontrol ile benzer bulunmuştur. Araştırıcılar bu bulgunun, diğer hücre bileşenlerinin ve yapılarının da sıcaklığa dayanıklı olmaması nedeniyle, degradasyonun bir enzime bağlı olduğunun kesin kanıtı olamayacağı görüşüne varmışlardır. Proteinaz K ile işlem görmüş protein ekstraktlarının AFB 1 i %34.5 oranında azalttığı görülmüştür. Proteinaz K spesifik olmayan bir proteazdır ve protein ektraktında bulunan bütün proteinler ile reaksiyona girmektedir. Protein ekstraktındaki diğer proteinlerde proteinaz K için substrat olabileceğinden, AFB 1 in degradasyonun tamamen inaktive olması beklenilmemiştir. Araştırıcılar proteinaz K ile işlem görmüş protein ekstraktlarının degradasyon aktivitesinin azalmasının, degradasyonun bir proteine ve belki de bir enzime bağlı olduğunu gösterdiğini ifade etmişlerdir. Toksin degradasyonun, bakterinin genomik DNA sına spesifik olmayan bir bağlanmayla ilişkili olup olmadığını anlamak amacıyla ham protein ekstraktı 39

57 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Bülent ZORLUGENÇ DNase I ile muamele edilmiştir. İşlem sonucunda degradasyon %80.5 oranında gerçekleşmiştir. DNase I, 3'- hidroksil oligonükleotidleri üreten tek ve çift heliksli DNA yı parçalayan bir enzimdir. DNase I ile muamele sonrasında degradasyonda azalmanın olmaması aflatoksinin F. aurantiacum NRRL B-184 tarafından uzaklaştırılmasının bakterinin kromozal DNA sına bağlanmayla ilgisi olmadığını açıkça ortaya koymuştur. AFB 1 in DNA ya bağlanmadan önce epoksi forma dönüşmesi gerekmektedir, ancak bakterinin mikrosomal enzimleri olmadığı için epoksidasyon da beklenmemekte ve böylelikle DNA ya bağlanma gerçekleşmemektedir. Degrade edilen AFB 1 miktarı üzerine ph nın etkisini belirlemek amacıyla çözelti ph sı 5, 6, 7 ve 8 ayarlanarak denemeler yapılmış ve degradasyonun en fazla ph 7 de gerçekleştiği ifade edilmiştir. Araştırıcılar, AFB 1 degradasyonu ile ph arasında bulunan ilişkiyi tipik bir enzimatik reaksiyon olarak değerlendirmişlerdir. D souza ve Brackkett (2001), yaptıkları başka bir araştırmada indirgenme koşulları ile seril ve sülfidril grubu inhibitörlerin AFB 1 degradasyonu üzerine etkisini araştırmışlardır. Araştırmada, redüksiyon koşullarının etkisini incelemek amacıyla 0.1, 1 ve 10 mm L-sistein kullanılmış ancak degradasyon üzerine bir etkisi görülmemiştir. Bu sonuç, L-sisteinin, F. aurantiacum NRRL B-184 tarafından gerçekleştirilen AFB 1 degradasyonunda etkili bir redüksiyon ajanı olmadığı ya da redüksiyon koşullarının degradasyonda önemli olmadığı şeklinde değerlendirilmiştir. Seril ve sülfidril gruplarının degradasyondaki önemini anlayabilmek amacıyla da, bu grupların inhibitörleri olan, sırasıyla fenilmetilsulfonil florür (PMSF) ve Cd +2 kullanılmıştır. 1 ve 10 mm Cd +2 varlığında inhibisyon meydana gelmiş; 1mM EDTA ve 1 mm OPT eklenmesi de inhibisyonu önleyememiştir. PMSF ile inkübe edilen hücrelerde de 1 mm konsantrasyonda önemli inhibisyon görülmüştür. Araştırıcılar inhibisyona; degradasyonla ilişkili enzim sistemindeki seril ve sülfidril gruplarının inaktif hale gelmesinin ya da metabolizması için ihtiyaç duyduğu seril ve sülfidril gruplarını inaktif hale getirerek mikroorganizmanın kendisine de toksik etki gösteriyor olmasının neden olabileceğini belirtmişlerdir. Sonuç olarak, seril ve sülfidril gruplarının önemli olduğu belirlenmiş, bunların degradasyonla ilişkisini ortaya koyacak başka çalışmaların yapılması gerektiği ifade edilmiştir. 40

58 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Bülent ZORLUGENÇ Özkaya (2001), tarafından yapılan Türkiye de aflatoksin sorunu yaşanan yerfıstığı ve kırmızı biberlerde AFB 1 in F. aurantiacum NRRL B-184 ile giderilmesi konulu araştırmada; F. aurantiacum NRRL B-184 suşu AFB 1 i 48 saat içinde fosfat tamponu çözeltisinde % oranında, yerfıstığı ortamında % oranında, kırmızı biber ortamında ise % oranlarında azaltmıştır. Regresyon analizleri, AFB 1 in F. aurantiacum NRRL B-184 suşu bulunan her üç ortamdaki azalışın birinci derece reaksiyon kinetiğine uygunluk gösterdiğine işaret etmektedir. F. aurantiacum NRRL B-184 suşunun AFB 1 içeren bu ortamlarda canlılığını inkübasyon süresince başlangıç düzeylerindekine yakın olarak koruduğu bildirilmiştir. Üreme eğrisi ile ilgili yapılan çalışmalarda ise F. aurantiacum NRRL B-184 suşunun durgun faza saatte ulaştığı ve generasyon süresinin gıdalarda gelişen birçok bakteriye göre uzun ( saat) olduğu bildirilmiştir. Bütün bu sonuçlar değerlendirildiğinde; F. aurantiacum NRRL B-184 suşundan kırmızı biber ve yerfıstıklarında bulunan AFB 1 i uzaklaştırmada yararlanılabileceği ve bu konuda yapılacak daha ayrıntılı araştırmalarla da olumlu sonuç alınması durumunda F. aurantiacum NRRL B-184 kullanılarak biyodegradasyona uğratılmış kırmızı biber ve yerfıstıkları, gıda katkısı veya salça, sos ve ezme gibi gıdalar şeklinde değerlendirilebileceği; ancak öncelikle söz konusu gıdalarda oluşan yeni metabolitlerin toksik olmadığının ortaya konulması gerektiği vurgulanmıştır. AFB 1 in Rhodococcus erythropolis ile biyolojik degradasyonu hücre içermeyen ekstraktlarla sıvı ortamda gerçekleştirilmiştir. R. erythropolis hücrelerinin varlığında 48 saat sonunda aflatoksinin %17 si ve 72 saat sonunda ise %3-6 sı kalmıştır. Dört bakteri suşunun R. erythropolis (DSM 14303), Nocardia corynebacteriodes (DSM 12676), N. corynebacteriodes (DSM 20151) ve Mycobacterium fluarantherivarans sp nov. (DSM 44556T) ın hücre içermeyen ekstraktları, bakteri hücrelerinin french basınç hücresinde parçalanması ile üretilmiştir. AFB 1, dört bakteri suşunun hücre içermeyen suşları ile de etkili bir şekilde degrade olmuştur. N. corynebacteriodes (DSM 12676) (-ki daha önceden yanlışlıkla F. aurantiacum NRRL B-184 olarak sınıflandırılmıştır) ile 24 saat sonunda AFB 1 degradasyonu %60 düzeylerinde görülürken N. corynebacteriodes 41

59 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Bülent ZORLUGENÇ (DSM 20151) ile aynı sürede %90 ın üzerinde degradasyon gözlenmiştir. R. erythropolis ve M. fluarantherivarans, 30 o C de 4 saatte AFB 1 in %90 ından fazlasını degrade etmiş ve 8 saat sonunda ise AFB 1 tespit edilememiştir. Yüksek degradasyon oranı ve geniş bir sıcaklık aralığında degrade edebilmeleri nedeniyle R. erythropolis ve M. fluarantherivarans gıda ve yem işleme uygulamaları için bir potansiyele sahip bulunmuştur (Teniola ve ark., 2005). 42

60 3. MATERYAL VE YÖNTEM Bülent ZORLUGENÇ 3. MATERYAL VE YÖNTEM 3.1. MATERYAL F. aurantiacum NRRL B-184 Bakteri Kültürü F. aurantiacum NRRL B-184 bakteri kültürü Amerika Birleşik Devletleri Tarım Bakanlığı, National Center for Agricultural Utilization Research, Microbial Genomics & Bioprocessing Research Unit Laboratuarından liyofilize formda temin edilmiştir PFT Çözeltisi PFT çözeltisi M ve ph 6.7 olacak şekilde hazırlanmıştır (Lurie, 1975) İnce Tabaka Plakası Çalışmada 20x20 cm ebatlarında silica jel 60 kaplı ince tabaka plakaları (TLC, Merck 5553) kullanılmıştır Detoksifikasyonda Kullanılan Gıda Maddeleri Araştırmada kullanılan mısır, soya, siyah zeytin, fındık ve kuru incir Adana dan, kuru kırmızıbiber ise Kahramanmaraş tan temin edilmiştir Besiyerleri ve Kimyasal Maddeler Çalışmada kullanılan AFB 1 standardı Sigma (Almanya), TSB, TSA, agar agar Merck (Almanya), methanol, hekzan, diklorometan, fosforik asit, kloroform, asetonitril, dietileter Merck (HPLC grade, Almanya), sodyum klorür, susuz sodyum sülfat, Merck (Almanya); immnooaffinite kolonlar Aflaprep (R-Biopharm Rhone, Glasgow, Scotland), Yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) kolonları Ace (ABD) firmalarından sağlanmıştır. 43

61 3. MATERYAL VE YÖNTEM Bülent ZORLUGENÇ 3.2. YÖNTEM F. aurantiacum NRRL B-184 Suşunun Canlandırılması ve Stok Kültürlerin Hazırlanması Liyofilize formdaki F. aurantiacum NRRL B-184 suşu, 50 ml TSB bulunan erlenmayerde aşılanmış ve 30 o C de 48 saat süreyle inkübe edilmiştir. Bu süre sonunda gelişen kültürlerden bir öze dolusu alınarak, 50 ml steril TSB bulunan erlenmayere aşılanmış ve aynı koşullarda inkübe edilmiştir. TSB kültüründen stok kültür hazırlamak üzere, tüpteki yatık TSA besiyerine aktarımlar yapılmış ve yine aynı koşullarda inkübasyonları sağlanmıştır. Stok kültürler kullanım öncesinde, TSB den yararlanılarak üç kez transfer edilmiş ve canlandırılmaları sağlanmıştır. Stok kültürün muhafazası ve aktifleştirilmesinde Hao ve Bracklett (1988) den yararlanılmıştır F. aurantiacum NRRL B-184 Suşunun Gelişme Eğrisinin Elde Edilmesi TSB de aktifleştirilmiş F. aurantiacum NRRL B-184 kültüründen erlenmayer içindeki 100 ml steril TSB besiyerine 1ml ekim yapılmış ve erlenmayer 30 o C de 50 rpm de çalkalamalı su banyosunda inkübasyona bırakılmıştır. Ekimin yapıldığı andan başlayarak (0. saat) inkübasyonun 96. saatine kadar belirli periyotlarla birer ml örnek alınarak kültürel sayımlar gerçekleştirilmiştir (Temiz, 1994). Bu amaçla, ilk önce örneklerin seri dilüsyonları hazırlanmış ve her bir dilüsyondan içerisinde TSA besiyeri bulunan 2 petri kutusuna drigalski özesi kullanılarak yüzeye yayma yöntemiyle ekimler yapılmış ve 30 o C de 48 saat inkübasyonları sağlanmıştır. İnkübasyon sonunda sayım için en uygun dilüsyona ait petriler sayılmış ve iki paralel petrideki sayımların ortalaması dilüsyon faktörü de dikkate alınıp hesaplanarak sayım sonuçları kob ml -1 olarak belirlenmiştir F. aurantiacum NRRL B-184 Bakteri Suşunun Durgun Faz Hücre Süspansiyonunun Hazırlanması Bu amaçla içinde 50 ml TSB bulunan erlenmayerlere aktifleştirilmiş F. aurantiacum NRRL B-184 kültüründen 1 ml aşılanmış ve erlenmayer 30 o C deki çalkalamalı su banyosunda (Memmert) 72 saat inkübe edilmiştir. İnkübasyon 44

62 3. MATERYAL VE YÖNTEM Bülent ZORLUGENÇ sonunda kültür sıvısı 3500 rpm de 20 dakika santrüfüj edilmiş ve üstteki sıvı faz (süpernatant) kısmı atılmıştır. Bakteri hücre peleti steril potasyum fosfat tamponu (0.067M; ph 6.7) ile yıkanmış, ardından santrüfüjleme ve yıkama işlemi tekrarlanmıştır. Bunu takiben elde edilen son hücre peleti PFT ile yeniden süspanse edilmiştir F. aurantiacum NRRL B-184 Bakteri Suşunun Durgun Faz Hücre Konsantrasyonunun Spektrofotometrik Olarak Belirlenmesi Bölüm de belirtildiği şekilde hazırlanan F. aurantiacum NRRL B-184 suşunun durgun faz hücre süspansiyonu PFT çözeltisi (0.067 M; ph 6.7) ile 1/5, 2/5, 3/5, 4/5 ve 1/10 oranlarında seyreltilmiş ve UV-visible spektrofotometrede (Shimadzu) 540 nm dalga boyunda absorbans değerleri ölçülmüştür (Lillehoj ve ark., 1967). Bunun yanısıra hücre süspansiyonu seyreltilerinin her birinden, ayrıca uygun seri dilüsyonlar hazırlanarak petri kutusundaki TSA besiyerinde yüzeye yayma yöntemiyle kültürel sayımlar gerçekleştirilmiştir. Kültürel sayım sonuçları (kob ml -1 ), absorbans değerlerine karşı grafiğe geçirilerek regresyon eğrisi ve eşitliği elde edilmiştir. Bu regresyon eğrisinden belirli bir absorbans değerine karşılık gelen hücre sayısının belirlenmesinde yararlanılmıştır Durgun Faz da Bulunan F. aurantiacum NRRL B-184 Suşu ile Aşılanmış Ortamların AFB 1 Konsantrasyonundaki Değişimin Belirlenmesi PFT İçerisinde F. aurantiacum NRRL B-184 un AFB 1 in Miktarı Üzerine Etkisinin Belirlenmesi Üç farklı konsantrasyonda (500, 1000 ve 2000 ng ml -1 ) AFB 1 çözeltisi ilave edilen erlenler, toksin standardında bulunan çözücünün uzaklaştırılabilmesi için 30 o C de azot gazı (N 2 ) altında tamamen kurutulmuştur. Kalıntılar üzerine 50 şer ml steril PFT çözeltisi eklenerek toksin çözündürülmüştür. Toksin içeren erlenlerden kontrol grubu dışında kalanlarına bölüm ve e göre hazırlanan F. aurantiacum NRRL B-184 durgun faz hücre süspansiyonlarından yaklaşık 10 7 kob ml -1 hücre içerecek şekilde aşılama yapılmıştır. Bütün denemeler 3 tekkerrür ve 45

63 3. MATERYAL VE YÖNTEM Bülent ZORLUGENÇ 2 paralel olarak gerçekleştirilmiştir. Bu işlemler her bir inkübasyon süresi için ayrı ayrı uygulanmıştır. Erlenlerin tamamı 30 o C deki çalkalamalı su banyosunda 50 rpm de inkübasyona alınmış ve 0, 6, 12, 24, 36, 48 ve 72. saatlerde aflatoksin konsantrasyonları yönünden bölüm ye göre aflatoksin analizine tabi tutulmuşlardır PFT İçerisinde Değişik Gıda Ürünlerinde F. aurantiacum NRRL B- 184 ün AFB 1 in Miktarı Üzerine Etkisinin Belirlenmesi F. aurantiacum NRRL B-184 ün PFT içerisinde bulunan gıda ürünlerinin AFB 1 içeriklerinin belirlenmesi amacıyla; öncelikle içerisinde öğütülmüş (50 g) ve bütün halde (50 g) gıda ürünleri içeren 250 ml hacimli alüminyum folyoya sarılı rodajlı erlenler 121 o C de 15 dk süre ile sterilize edilmiştir. Gıda örneklerinin her biri için örnekler üzerine; 500, 1000 ve 2000 ng g -1 düzeyinde olacak şekilde AFB 1 çözeltisi ilave edilmiştir. Dairesel hareketlerle karıştırma işlemi yapılarak toksinin örneklerin tüm yüzeyleri ile teması sağlanmaya çalışılmıştır. Daha sonra karanlık ve serin bir ortamda yaklaşık 2 saat boyunca toksinin örneklere homojen olarak nüfuz etmesi için beklenilmiştir (Das ve Mishra 2000). Toksin konsantrasyonları ayarlanan steril kırmızı biber, soya fasulyesi, fındık, incir, mısır ve siyah zeytin besi ortamlarının kontrol örneği dışındakilerine F. aurantiacum NRRL B-184 suşunun durgun faz hücre süspansiyonundan yaklaşık 10 7 kob ml -1 hücre içerecek şekilde aşılama yapılmış ve örneklere akışkanlık sağlayacak 1/1 oranında steril PFT çözeltisi eklenmiştir. Bütün denemeler 3 tekkerrür ve 2 paralel olarak gerçekleştirilmiştir. Bu işlemler her bir inkübasyon süresi için ayrı ayrı uygulanmıştır. Erlenmayerler 30 o C deki çalkalamalı su banyosunda 50 rpm de inkübasyona alınmış ve inkübasyonun 0, 6, 12, 24, 36, 48 ve 72. saatlerinde aflatoksin analizi için örnekler alınmış ve bölüm ye göre aflatoksin analizine tabi tutulmuşlardır. 46

64 3. MATERYAL VE YÖNTEM Bülent ZORLUGENÇ Aflatoksin Analizleri Gıda Örneklerinin Aflatoksin İçeriklerinin Kalitatif Olarak Belirlenmesi Gıda ürünlerinin denemelerde kullanılmadan önce AFB 1 içeriklerinin kalitatif olarak belirlenmesinde alternatif metot yöntemi ile ekstraktlar elde edilmiş (Anonim, 1998) ve sonra İnce Tabaka Kromatografisi ile aflatoksin analizi yapılmıştır (Takahashi, 1993; Lin ve ark., 1998). Analiz sonucunda, aflatoksin içermeyen örnekler denemelerde kullanılmıştır Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi (HPLC) ile AFB 1 Analizi (1). AFB 1 Standart Çözeltisinin Hazırlanması AFB 1 kristaleri toluen-asetonitril (98:2, v/v) karışımında çözündürülerek stok çözelti hazırlanmıştır. AFB 1 kalibrasyon standartlarının konsantrasyonları 0.08 ng g -1 ile 4 ng g -1 arasında olacak şekilde hazırlanmıştır. Toluen-asetonitril çözeltileri oda sıcaklığında azot gazı (N 2 ) altında tamamen kurutulmuştur. Her şişeye, 4 ml MeOH ilave edilerek karıştırılmış ve ultra saf su ile 10 ml ye seyreltilerek yeniden karıştırılmıştır. Çözeltiler; koruyucu giysi, eldiven ve gaz maskesi kullanılarak çeker ocak altında hazırlanmıştır. Çalışma alanı ve aflatoksinle temas eden cam malzemeler %5 lik sodyum hipoklorit çözeltisi ile yıkanmıştır. Atık çözeltiler ise çamaşır suyu içerisinde etkisiz hale getirilmiştir (2). PBS Çözeltisinin Hazırlanması 900 ml ultra saf su içerisine 0.2 g potasyum klorit, 0.2 g potasyum dihidrojen fosfat, 1.16 g susuz disodyum hidrojen fosfat ve 8 g sodyum klorit ilave edilerek çözündürülmüştür. 0.1 M HCl veya 0.1 M NaOH kullanılarak ph 7.4 e ayarlanmış ve ultra saf su ilavesi ile çözelti hacmi 1000 ml ye tamamlanmıştır (AOAC, 2000). 47

65 3. MATERYAL VE YÖNTEM Bülent ZORLUGENÇ (3). Ekstraksiyon ve Temizleme Aşamaları AFB 1 in gıda örneklerinden ekstrakte edilmesinde ekstraksiyon çözeltisinin su içeriği örneğin içerisinde bulunduğu fosfat tamponu miktarına göre yeniden ayarlanarak AOAC (2000) yöntemi kullanılmıştır. Temizleme aşaması immünoaffinite kolonlar için verilen talimatlara uygun olarak gerçekleştirilmiştir. 5 ml PBS immünoaffinite kolonundan akış hızı dakikada 3 ml olacak şekilde geçirilmiştir. Kolon 10 ml lik ultra saf su ile 2 kez yıkandıktan sonra kalan su vakum ile uzaklaştırılmıştır. 1 ml metanol akış hızı dakikada 1 ml olacak şekilde kolondan geçirilerek AFB 1 kolondan uzaklaştırılmış ve amber renkli bir şişede toplanmıştır. Kolondan 1 ml ultra saf su geçirilmiş ve aynı şişede toplanmıştır. Eluat, direkt olarak HPLC de analiz edilmiştir (4). AFB 1 in Belirlenmesi AFB 1, AOAC (2000) metodu kullanılarak belirlenmiştir. 100 µl örnek HPLC ye enjekte edilerek AFB 1 düzeyi Hewlett Packard HPLC sistemi (Hewlett Packard, Agilent 1100, Palo Alto, USA) kullanılarak tahrik dalga boyu 360 nm ve emisyon dalga boyu ise 440 nm olacak şekilde floresans dedektör kullanılarak tespit edilmiştir. Ayırım, Ace 5 C18 (25cm-4.6mm i.d.) (Advanced Chromatography Technologies, Aberdeen, Scotland) kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Mobil faz, 120 mg L -1 potasyum bromid ve 350 µl nitrik asit ilave edilen asetonitril-metanol-su (2:3:6, v/v/v) karışımı olup ve akış hızı dakikada 1 ml dir. Kolon sonrası türevlendirme Kobra Cell (Rhone Diagnostics, Glasgow, UK) kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Bazı örneklerin AFB 1 analizine ait HPLC kromatogramları EK-1 de verilmiştir Geri Kazanım Oranının Belirlenmesi Geri kazanım oranının belirlenmesi için, analizi yapılmış ve aflatoksinsiz olduğundan emin olunan gıda ürünleri parçalanarak 50 er gramlık analiz örnekleri hazırlanmıştır. Öğütülen örneklerin üzerine 10 ve 50 ng g -1 aflatoksin olacak şekilde AFB 1 standardından ilave edilmiştir. Örneklere uygulanan ekstraksiyon ve temizleme 48

66 3. MATERYAL VE YÖNTEM Bülent ZORLUGENÇ işlemleri aynen uygulanarak AFB 1 içeriği HPLC kullanılarak belirlenmiş ve ilave edilen aflatoksinin geri kazanım oranı hesaplanarak bulunmuştur İstatistiksel Analizler Üç tekerrürlü olarak yürütülen araştırma bulguları SPSS (10.0) istatistik yazılım programı kullanılarak değerlendirilmiştir. Faktörlerin etkisini belirlemek amacıyla varyans analizi uygulanmış ve önemli çıkan gruplar arasındaki farklılıklar Duncan çoklu karşılaştırma testi ile %95 önem düzeyinde belirlenmiştir.(watts ve ark., 1989) F. aurantiacum NRRL B-184 Suşuna Ait Gelişme Eğrisinin Matematiksel Modellere Uygunluğunun Belirlenmesi Modifiye Gompertz ve Modifiye Logistik eşitliklerinin gelişme verilerine uyumu Sigma Plot (10.0) programı kullanılarak doğrusal olmayan regresyon analizi sonuçlarına göre belirlenmiştir F. aurantiacum NRRL B-184 Suşunun AFB 1 Degradasyon Kinetiğinin Belirlenmesi F. aurantiacum NRRL B-184 suşunun AFB 1 i değişik gıda maddelerinde azaltma kinetiği Sigma Plot (10.0) programı kullanılarak belirlenmiştir. 49

67 4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bülent ZORLUGENÇ 4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA 4.1. F. aurantiacum NRRL B-184 Suşunun Gelişme Eğrisinin Belirlenmesi Aktifleştirilmiş F. aurantiacum NRRL B-184 suşunun TSB besiyerinde ve 30 o C deki gelişimine ait üreme eğrisinin elde edilmesinde yararlanılan kültürel sayım sonuçları Çizelge 4.1 de verilmiştir. Çizelge 4.1. F. aurantiacum NRRL B-184 Suşunun 30 o C de TSB Besiyerindeki Gelişimine Ait Kültürel Sayım Sonuçları Süre (Saat) Sayım Sonucu kob ml x Sayım Sonucu Log kob ml x x x x x x x x x x x x x x x x Bir bakterinin gelişme eğrisi; lag (gecikme), log (logaritmik), durgun (sabit) ve ölüm olmak üzere dört ana faz sergilemektedir. Bakterilerin gelişme eğrileri, üs cinsinden üreme gösterdikleri dikkate alınarak, çoğunlukla üremenin (log N/No) zamana karşı grafiğe geçilmesiyle elde edilmektedir (No: İnkübasyonun başlangıcındaki canlı bakteri sayısı, N: İnkübasyonun belirli bir periyodundaki canlı bakteri sayısı) (Şahin, 1990). 50

68 4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bülent ZORLUGENÇ F. aurantiacum NRRL B-184 suşunun 30 o C de TSB besiyerindeki gelişme eğrisi Şekil 4.1 de verilmiştir. 3,00 2,50 2,00 Log (N/No) 1,50 1,00 0,50 0, Süre (Saat) Şekil 4.1. F. aurantiacum NRRL B-184 suşunun 30 o C de TSB besiyerindeki gelişme eğrisi 4.2. F. aurantiacum NRRL B-184 Suşuna Ait Gelişme Eğrisinin Matematiksel Modellere Uygunluğunun Belirlenmesi Belirli fiziksel veya kimyasal koşullar altında mikroorganizmaların gelişimlerinin tanımlanmasında matematiksel modellerden yararlanılmaktadır. Bu modeller, ürünlerin mikrobiyal güvenliğinin veya raf ömrünün tahmin edilmesi ile üretimin kritik kısımlarının ve prosesteki dağılımının tespitini mümkün kılmaktadır (Zwietering ve ark., 1990; Giannuzzi ve ark., 1997). Simülasyon çalışmaları, pahalı ve zaman alan deneylerin sayısında azalmaya neden olması nedeniyle proses tasarımı ve optimizasyonunda oldukça yarar sağlamaktadır (Van Impe ve ark., 1992). F. aurantiacum NRRL B-184 suşuna ait gelişme eğrisini tanımlamada sigmoidal fonksiyonlardan Modifiye Gompertz ve Modifiye Logistik modellerinden yararlanılmış ve elde edilen gelişme eğrileri Şekil 4.2 de verilmiştir. Zwietering ve ark. (1990) tarafından tanımlanan 3 parametreli Modifiye Gompertz ve Modifiye Logistik modellerine ait eşitlikler aşağıdaki gibidir. 51

69 4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bülent ZORLUGENÇ µ = m e λ + 1 A Modifiye Gompertz Model; y Aexp exp ( t) ( 4.1 ) Modifiye Logistik Model; y = A 4µ 1 + exp m λ t A ( ) + 2 ( 4.2 ) Gelişme eğrisi, popülasyon büyüklüğünün (y = LogN t /N o ) logaritmasının zamana karşı bir fonksiyonu olarak tanımlanmaktadır. Gelişme eğrisinin lag, log ve durgun fazı üç parametre ile açıklanmaktadır. Bunlar, 1. Maksimum spesifik gelişme hızı (µ m ): Bükülme noktasının tanjantı, 2. Lag süresi (λ): Bu tanjantın x eksenini kestiği nokta, 3. Asimptot (A): Ulaşılan en yüksek değer dir (Zwietering ve ark.,1990). 3,00 2,50 2,00 Deneysel Gompertz Logistic Log (N/No) 1,50 1,00 0,50 0, Süre (Saat) Şekil 4.2. F. aurantiacum NRRL B-184 suşunun Modifiye Gompertz ve Modifiye Logistik modellerinden yararlanılarak elde edilen gelişme eğrileri Bu eşitliklerin gelişme verilerine uyumunu belirlemede doğrusal olmayan regresyon analizinden yararlanılmıştır. 52

70 4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bülent ZORLUGENÇ Deneysel olarak elde edilen gelişme verilerini ifade etmede kullanılacak en uygun modelin belirlenmesinde tahminin standart hatası (SEE), kalanların kareleri toplamı (RSS), hata kareler ortalaması (MSE) ve belirtme katsayısı (R 2 ) değerlerinden yararlanılmıştır. Çizelge 4.2. F. aurantiacum NRRL B-184 Suşuna Ait Gelişme Verilerinin Modifiye Gompertz ve Modifiye Logistik Modellerine Göre Hesaplanan Parametre Değerleri. Model A µ m (saat -1 ) λ (saat) SEE RSS MSE R 2 Modifiye Gompertz Modifiye Logistik Çizelge 4.2 de, her iki modele ait A değeri ile maksimum spesifik gelişme hızı değerlerinin benzer olduğu, lag süresinin ise Gompertz modelinde saat, Logistik modelinde ise saat olduğu görülmektedir. Tahminin standart hatası, kalanların kareleri toplamı ile hata kareler ortalaması değerlerinin en küçük ve belirtme katsayısı en büyük olan modelin deneysel verileri daha iyi ifade ettiği göz önüne alındığında F. aurantiacum NRRL B-184 suşuna ait gelişme eğrisini tanımlamada Modifiye Gompertz modelinin daha uygun olduğu sonucuna varılmıştır. Modifiye Gompertz modelinden elde edilen sonuçlara göre, başlangıç hücre sayısı 1.32 x 10 7 kob ml -1 olan F. aurantiacum NRRL B-184 suşu bir saatlik periyotlar içerisinde bir önceki popülasyonu %7.3 oranında aşacak şekilde gelişerek 45 saatte 2.7 log luk bir artışla durgun faza geçmiştir. F. aurantiacum NRRL B-184 hücrelerinin 95. saat sonunda hala durgun fazda oldukları belirlenmiştir. Hao ve Brackett (1989) tarafından yapılan çalışmada F. aurantiacum NRRL B-184 suşunun aynı besiyeri ve koşullardaki inkübasyonu sonucunda da benzer bir üreme eğrisi elde edilmiştir. Araştırıcılar, durgun faza 36. saatten sonra geçildiğini ve ölçümün sonlandırıldığı 72. saatte de durgun fazda olduğunu ifade etmişlerdir. Aynı bakteri suşu ile çalışılan başka bir araştırmada ise maksimum spesifik gelişme hızı saat -1 olarak bulunmuş ve saatlik bir sürede 2 log luk bir artış göstererek 53

71 4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bülent ZORLUGENÇ durgun faza ulaşıldığı belirtilmiştir. Ayrıca çalışmada lag süresinin güvenli olarak tespit edilemediği bildirilmiştir F. aurantiacum NRRL B-184 Suşunun Hücre Konsantrasyonunun Belirlenmesi Mikrobiyolojide spektrofotometrik sayım yöntemi, direkt sayım yöntemleri arasında yer almakta ve bu yöntemden özellikle saf mikroorganizma kültürlerinin konsantrasyonu hakkında hızlı bilgi edinebilmek amacıyla yararlanılmaktadır (Temiz, 1994). Bu çalışmada, denemelerde kullanılacak olan bakteri süspansiyonunun hücre yoğunluğunu hesaplayabilmek amacıyla değişik oranlarda seyreltilmiş olan F. aurantiacum NRRL B-184 hücre süspansiyonlarının hem spektrofotometrede absorbansları ölçülmüş, hem de bu seyreltilerden kültürel sayımlar yapılmıştır. Farklı oranlarda seyreltilmiş olan tampon çözelti içerisindeki F. aurantiacum NRRL B-184 hücre süspansiyonlarına ait absorbans değerleri ve kültürel sayım sonuçları Çizelge 4.3 de verilmiştir. Çizelge 4.3. Farklı Seyreltilerdeki F. aurantiacum NRRL B-184 Bakteri Süspansiyonunun 540 nm deki Absorbans Değerleri ve İçerdikleri Canlı Hücre Sayısı. Seyreltme Oranı Absorbans Bakteri Sayısı (kob ml -1 ) 4/ x / x / x / x / x 10 7 Çizelge 4.3 de verilmiş olan absorbans değerleri ve canlı hücre sayısı arasındaki ilişki Şekil 4.3 de görülmektedir. 54

72 4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bülent ZORLUGENÇ 6,0E+07 5,0E+07 4,0E+07 kob/ml 3,0E+07 2,0E+07 y = 1E+08x + 3E+06 R 2 = 0,978 1,0E+07 0,0E+00 0,000 0,050 0,100 0,150 0,200 0,250 0,300 0,350 0,400 0,450 Absorbans Şekil 4.3. F. aurantiacum NRRL B-184 bakteri süspansiyonu seyreltilerine ait absorbans değerleri (540 nm de) ile canlı hücre sayısı arasındaki ilişki Çizelge 4.3 ve Şekil 4.3 de görüldüğü gibi, 540 nm deki absorbans değeri ile canlı hücre arasındaki ilişkiye ait R 2 değeri yüksek (0.978) bulunmuştur. Bu nedenle, denemelerde kullanılmak üzere hazırlanan bakteri süspansiyonlarının hücre konsantrasyonu elde edilen; 8 6 y = 10 χ ( 4.3 ) regresyon denklemine göre hesaplanmıştır F. aurantiacum NRRL B-184 Hücrelerinin PFT İçerisinde Aflatoksini Azaltmasının Belirlenmesi ve Kinetiği F. aurantiacum NRRL B-184 Hücrelerinin PFT İçerisinde Aflatoksini Azaltmasının Belirlenmesi 500, 1000 ve 2000 ng ml -1 düzeylerinde aflatoksin içeren PFT çözeltilerinde; bakteri kültürü aşılanmayan kontrol örnekleri ile bakteri kültürü aşılanmış diğer 55

73 4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bülent ZORLUGENÇ örneklerin saatler arasındaki AFB 1 konsantrasyonlarındaki değişim Çizelge 4.4 de verilmiştir. Çizelge 4.4. PFT Çözeltilerinin (Kontrol ve F. aurantiacum NRRL B-184 Hücresi İçeren Diğer Örneklerde) AFB 1 Konsantrasyonlarındaki (ng ml -1 ) Değişim ve % Azalma Oranları Süre (Saat) Kontrol AFB % Azalma Kontrol AFB 1 % Azalma Kontrol AFB 1 % Azalma Çizelge 4.4 de görüldüğü gibi, F. aurantiacum NRRL B-184 suşu aşılanmamış üç farklı konsantrasyonda AFB 1 içeren kontrol örneklerinin inkübasyon süresince aflatoksin miktarlarında önemli bir değişim olmazken, F. aurantiacum NRRL B-184 suşu aşılanmış olan PFT çözeltilerinin aflatoksin içeriğinde sürekli bir azalma gerçekleşmiştir. Kontrol grubu dışındaki bütün örneklerin AFB 1 içeriklerinde 8. saat sonunda % lük, 36. saat sonunda % luk ve 72. saatin sonunda ise %99 dan fazla azalma meydana gelmiştir. F. aurantiacum NRRL B-184 hücrelerinin PFT çözeltisi içinde AFB 1 miktarını azaltması üzerine aflatoksin konsantrasyonunun ve inkübasyon süresinin etkisi istatistiksel olarak önemli bulunmuştur (p<0.05). AFB 1 in ortamdaki F. aurantiacum NRRL B-184 hücrelerine ait enzim veya enzim komplekslerinin substratı olduğu düşünüldüğünde, araştırmadan elde edilen bulgulara göre toksin miktarının enzimler için doygunluk düzeyine ulaşmadığını söylemek mümkündür. Bu durum yüksek toksin düzeylerinde neden daha çok 56

74 4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bülent ZORLUGENÇ toksinin degrade olduğunu açıklar niteliktedir. Buna göre, ortama bakterilerin aşılandığı ilk anda toksin en yüksek düzeyde olduğu için en fazla parçalanma ilk zaman dilimlerinde olmuştur. Daha sonraki zaman dilimlerinde ise ortamda daha az toksin kaldığından ve degradasyon da o anda var olan toksin konsantrasyonu ile orantılı olduğundan daha az azalma meydana gelmektedir F. aurantiacum NRRL B-184 Hücrelerinin PFT İçerisinde Aflatoksini Azaltmasının Kinetiği F. aurantiacum NRRL B-184 içermeyen kontrol örneklerinin AFB 1 içeriğinde önemli bir değişimin görülmemesi, bakteri hücrelerini içeren PFT ortamında oluşan aflatoksin azalmasının F. aurantiacum NRRL B-184 hücrelerinin bir faaliyeti sonucu meydana geldiğini göstermektedir. Aflatoksinin, canlı F. aurantiacum NRRL B-184 hücreleri tarafından hücre duvarına zayıf bağlarla bağlanıp daha sonra da biyotransformasyon için hücre içine taşındığı ya da hücre duvarına bağlanmadan doğrudan hücre içine aktarıldığı konusunda tartışmalar mevcuttur (Özkaya, 2001). Bu bakteri ile yapılan sınırlı sayıdaki çalışmada aflatoksin degradasyonu üzerine enzim veya enzim sistemlerinin etkili olabileceği ileri sürülmüştür. İleri sürülen düşünceye göre; aflatoksin, bu enzim ya da enzim sistemleri tarafından substrat olarak kullanmaktadır (D souza ve Brackett, 1998; D souza ve Brackett, 2000; Smiley and Draugon, 2000; D souza ve Brackett, 2001). Enzimatik reaksiyonlar doygunluk kinetiği gösteren reaksiyonlardır. Diğer bir ifadeyle, bu reaksiyonların hızları belli bir düzeye kadar substrat konsantrasyonu ile birlikte artar, ancak daha yüksek konsantrasyonlarda reaksiyon hızları daha fazla artmayarak bir doygunluğa ulaşır ve hız sabit kalır. Enzimatik reaksiyonlar genel olarak Michealis-Menten denkliği olarak anılan aşağıdaki eşitliğe uygun olarak gerçekleşir. V = V K max m + [ S] [ S] ( 4.4 ) 57

75 4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bülent ZORLUGENÇ Bu eşitlikte V reaksiyon hızını, [S] ise substrat konsantrasyonunu ifade etmektedir. Michealis-Menten sabiti olarak tanımlanan K m ve maksimum reaksiyon hızı olan V max reaksiyon koşularında sabit değerlerdir. Bu eşitlik [S] nin paydada K m nin yanında ihmal edilmesine imkan verecek kadar düşük değerleri için; V V = K max m [ S] ( 4.5 ) şeklinde yaklaşır ve reaksiyon hızının substrat konsantrasyonuna bağlı olarak arttığı birinci derece kinetiğine uygun hareket eder. Bu küçük değerlerde substrat miktarı ile enzim hızı arasında doğrusal bir ilişki vardır ve substrat konsantrasyonundaki artışlar, hızda orantısal artışlara neden olur. Buna karşılık; eşitlik substrat konsantrasyonunun paydada K m nin ihmal edilmesine imkan verecek kadar büyük değerleri için; V = V max ( 4.6 ) olarak sabit bir değerde kalarak sıfırıncı dereceden reaksiyon kinetiğine benzerlik gösterir (Gözükara, 1997; Kalaycıoğlu ve ark., 1998). Farklı reaksiyon derecelerini tanımlayan çeşitli matematiksel modellerin tümünün temelini genel hız yasası oluşturmaktadır. Bu yasaya göre, bir reaksiyon sonucu ortamdaki bir bileşiğin miktarının azalması aşağıdaki eşitlikle 4.7 tanımlanmaktadır. dc V = dt n = k n C ( 4.7 ) Eğer reaksiyonun hızı, reaksiyona giren ya da oluşan ürünlerden birinin konsantrasyonunun sıfırıncı kuvvetine bağlı ise bu tip reaksiyonlara sıfırıncı dereceden reaksiyon denilmektedir. 4.7 no lu diferansiyel eşitliğin sıfırıncı derece 58

76 4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bülent ZORLUGENÇ reaksiyon için integrali alınırsa, zamana göre sıfırıncı derece reaksiyonu tanımlayan 4.8 no lu eşitlik elde edilmektedir. C C = k t ( 4.8 ) o t. Eğer reaksiyonun hızı, reaksiyona giren ya da oluşan ürünlerden birinin konsantrasyonunun birinci kuvvetine bağlı ise bu tip reaksiyonlara birinci dereceden reaksiyon denilmektedir. 4.8 no lu diferansiyel eşitliğin birinci derece reaksiyon için integrali alınırsa, zamana göre birinci derece reaksiyonu tanımlayan 4.9 no lu eşitlik elde edilmektedir. ln C ln C = k t veya ( C C ) k t o t. ln = ( 4.9 ) O t. Bu eşitliklerde C o başlangıç AFB 1 konsantrasyonunu, C t belli bir süre sonunda AFB 1 konsantrasyonunu, k reaksiyon hız sabitini, t ise süreyi ifade etmektedir (Tebbutt,1995). AFB 1 konsantrasyonunun zamana karşı değişimini değerlendirmede en küçük kareler yöntemine dayanan regresyon analizinden yararlanılmıştır. Verilerin doğrusal bir eğriye ne kadar iyi uyduğunun ölçütü, regresyon işlemi ile hesaplanmış olan belirtme katsayısı yani R 2 değeridir. R 2 değerinin 1 e eşit olması, deneysel verilerin kusursuz bir doğrusal eğri sağladığının kanıtıdır. Her iki regresyon analizinde de, başlangıç konsantrasyonu (C o ), hız sabiti (k), k nın güven aralığı, regresyonun önem aralığını gösteren F değeri ve verilerin modele uygunluğunu gösteren R 2 değeri hesaplanmış olup, sonuçlar Çizelge 4.5 te verilmiştir. 59

77 4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bülent ZORLUGENÇ Çizelge 4.5. F. aurantiacum NRRL B-184 Suşu Tarafından PFT Ortamında AFB 1 in Degradasyon Kinetiğine Ait Regresyon Analizi Sonuçları. Konsantrasyon Reaksiyon C 0 k için güven k* F Değeri** R 2 Değeri*** (ng ml -1 ) Derecesi (ng ml -1 ) aralığı Sıfırıncı Birinci Sıfırıncı Birinci Sıfırıncı Birinci * k zamana bağlı değişim katsayısıdır. k nın birimi sıfırıncı derece reaksiyon kinetiği için ng ml -1 saat -1 olup konsantrasyon azalmasının saatteki hızını ifade etmektedir; birinci derece reaksiyon kinetiği için ise k nın birimi saat -1 olup birim zamanda konsantrasyonun oransal olarak azalış hızını göstermektedir. ** F değeri regresyon kareler ortalaması / hata kareler ortalaması ile hesaplanmıştır. *** R 2 değeri verilerin modele uygunluk oranını göstermektedir. 60

78 4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bülent ZORLUGENÇ Deneysel olarak elde edilen verilerin modele uygunluğunu gösteren R 2 değeri sıfırıncı derece reaksiyon kinetiği modelinde AFB 1 in her üç konsansantrasyonu için oldukça düşük bulunmuştur. Birinci derece reaksiyon kinetiği modelinde ise R 2 değerleri arasında değişmiştir. Regresyonun tesadüfilikten uzaklığını gösteren F değeri, birinci derece reaksiyon kinetiği modeline göre yapılan değerlendirmede daha yüksek bulunmuştur. Şekil 4.4, 4.5 ve 4.6 da 500, 1000 ve 2000 ng ml -1 AFB 1 içeren PFT ortamlarında aflatoksinin sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere göre azalış eğrileri görülmektedir. AFB1 Kontrol AFB1 Birinci derece Sıfırıncı derece Aflatoksin Miktarı (ng ml-1) y = -6,106x + 329,893 R 2 = 0,700 y = 486,853e -0,093x R 2 = 0, Süre (Saat) Şekil ng ml -1 AFB 1 içeren PFT ortamında aflatoksinin sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere göre azalış eğrileri 61

79 4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bülent ZORLUGENÇ AFB1 Kontrol AFB1 Birinci derece Sıfırıncı derece 1200 Aflatoksin Miktarı (ng ml-1) y = -12,343x + 673,696 R 2 = 0,727 y = 961,820e -0,085x R 2 = 0, Süre (Saat) Şekil ng ml -1 AFB 1 içeren PFT ortamında aflatoksinin sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere göre azalış eğrileri 2100 AFB1 Kontrol AFB1 Birinci derece Sıfırıncı derece Aflatoksin Miktarı (ng ml-1) y = -25,977x ,511 R 2 = 0,704 y = 2049,465e -0,091x R 2 = 0, Süre (Saat) Şekil ng ml -1 AFB 1 içeren PFT ortamında aflatoksinin sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere göre azalış eğrileri 62

80 4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bülent ZORLUGENÇ R 2 ve F değerlerinin birinci derece reaksiyon kinetiği modelinde daha yüksek bulunmasının yanısıra şekil 4.4, 4.5 ve 4.6 daki kinetik modellere ait azalış eğrilerinden de görüldüğü üzere; PFT ortamında F. aurantiacum NRRL B-184 hücrelerinin neden olduğu AFB 1 azalışının birinci derece reaksiyon kinetiğine daha uygun olduğu sonucuna varılmıştır. Line ve Brackett (1995a) bir çalışmalarında, radyoaktivite ile izledikleri suda çözünebilir degradasyon ürünlerinin artış hızı ve oranı ile, kloroform fazında çözünenlerin azalma hızı ve oranının hemen hemen aynı olduğunu ve azalışı tipik Birinci Derece Reaksiyon kinetiğine uygun bulduklarını belirtmişlerdir. Özkaya (2001) da PFT içerisinde 8.4x10 9 ile 6.6x10 12 kob ml -1 bakteri içeren denemelerinde aflatoksin miktarındaki azalışın Birinci Derece Reaksiyon kinetiğine uygun olduğunu bildirmiştir. Birim zamanda konsantrasyonun oransal olarak azalış hızını gösteren k değeri birinci derece reaksiyon kinetiği modeline göre yapılan değerlendirmede istatistiksel olarak güvenli bulunmuş (p<0.05) ve 500, 1000 ve 2000 ng ml -1 AFB 1 ile yapılan denemelerde sırasıyla 0.093, ve saat -1 olarak hesaplanmıştır F. aurantiacum NRRL B-184 Hücrelerinin Değişik Gıda Ürünleri İçeren PFT İçerisinde Aflatoksini Azaltmasının Belirlenmesi ve Kinetiği F. aurantiacum NRRL B-184 Hücrelerinin Aflatoksini Azaltmasının Belirlenmesi ve Kinetiği AFB 1 in Değişik Gıda Ürünlerindeki Geri Kazanım Oranları AFB 1 in standart eğrisinin belirtme katsayısı olarak bulunmuştur. Örnekler yapay olarak AFB 1 ile iki farklı konsantrasyonda (10 ve 50 ng g -1 ) kontamine edilmiştir. Ortalama geri kazanım (n=12) oranları kuru kırmızı biber için %87±4.33, mısır için %92±3.52, siyah zeytin için %93±3.66, soya fasulyesi için %90±3.26 ve fındık için %95±4.12 olarak hesaplanmıştır. 63

81 4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bülent ZORLUGENÇ F. aurantiacum NRRL B-184 Hücrelerinin Kuru Kırmızı Biberde Aflatoksini Azaltmasının Belirlenmesi Bakteri kültürü aşılanmayan kontrol örnekleri ile F. aurantiacum NRRL B- 184 suşu aşılanan öğütülmüş ve bütün halde kırmızı biber içeren PFT çözeltilerine 500, 1000 ve 2000 ng g -1 düzeylerinde AFB 1 ilave edilmiştir. Toksin içeriğinin inkübasyon sırasındaki değişimi ve azalma oranları Çizelge 4.6 da verilmiştir. İnkübasyon süresince kontrol örneklerinin AFB 1 düzeylerinde istatistiksel olarak önemli bir değişim olmamıştır. F. aurantiacum NRRL B-184 suşu aşılanmış olan gerek öğütülmüş gerekse bütün haldeki kırmızı biber örneklerinin toksin içeriklerinde ise sürekli bir azalma görülmüştür. 72 saat sonunda kontrol grubu dışındaki örneklerdeki azalma, başlangıç aflatoksin miktarı artıkça oransal olarak azalmıştır. 500, 1000 ve 2000 ng g -1 aflatoksin içeren öğütülmüş kırmızı biber örneklerinde 72. saat sonunda sırasıyla %99.17, %98.65 ve %96.52 düzeylerinde azalma olmuştur. Bütün olarak denemeye alınan örneklerde ise sırasıyla %96.78, %95.99 ve %95.00 oranında azalma gerçekleşmiştir. Aflatoksin konsantrasyonunun ve inkübasyon süresinin F. aurantiacum NRRL B-184 hücrelerinin kırmızı biberde AFB 1 miktarının azalması üzerine etkisi istatistiksel olarak önemli bulunurken (p<0.05), ürün boyutunun etkisi önemli bulunmamıştır. AFB 1 miktarının azalmasında konsantrasyon ve sürenin birlikte ortak etkisi önemli bulunmuş (p<0.05); ancak konsantrasyon-boyut ve süre-boyut ilişkisi istatistiksel açıdan önemsizdir. 64

82 4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bülent ZORLUGENÇ Çizelge 4.6. PFT Çözeltisinde Farklı Düzeylerde AFB 1 İçeren Öğütülmüş ve Bütün Kırmızı Biber Örneklerinin Aflatoksin Konsantrasyonlarındaki (ng g -1 ) Değişim ve % Azalma Oranları Konsantrasyon (ng g -1 ) Süre (Saat) Öğütülmüş Kontrol AFB 1 % Azalma Bütün Kontrol AFB 1 % Azalma F. aurantiacum NRRL B-184 hücrelerinin, kırmızı biberlerin AFB 1 içeriklerini azaltma yeteneğine sahip olduğu görülmüştür. Benzer bulgular, F. aurantiacum NRRL B-184 ün kırmızı biberdeki aflatoksini azaltma yeteneği üzerine Özkaya (2001) nın çalışmasında da mevcuttur. Araştırmacı, yaklaşık 300, 500 ve 1500 ng g -1 doğal AFB 1 içeren steril bulamaç halindeki kırmızı biber örneklerinde 48 saat sonunda sırasıyla %92.8, %99.9 ve %98.3 lük bir azalma meydana geldiğini ifade etmiştir. Bu çalışmada elde edilen azalma oranlarının Özkaya (2001) nın yapmış 65

83 4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bülent ZORLUGENÇ olduğu çalışmadan elde edilen oranlardan daha düşük bulunmasına örneğe aşılanan F. aurantiacum NRRL B-184 hücre sayılarındaki farklılığın neden olabileceği düşünülmektedir F. aurantiacum NRRL B-184 Hücrelerinin Kırmızı Biberde Aflatoksini Azaltmasının Kinetiği Öğütülmüş ve bütün haldeki kırmızı biberlerde AFB 1 in azalma kinetiğini inceleyebilmek amacıyla regresyon analizleri yapılmıştır. Regresyon analizlerinde, C o, k, k nın güven aralığı, F ve R 2 değerleri hesaplanmış olup sonuçlar Çizelge 4.7 de verilmiştir. 66

84 4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bülent ZORLUGENÇ Çizelge 4.7. F. aurantiacum NRRL B-184 Suşu Tarafından Kırmızı Biberde AFB 1 in Degradasyon Kinetiğine Ait Regresyon Analizi Sonuçları. Ürün Öğütülmüş Bütün Konsantrasyon (ng g -1 ) Reaksiyon Derecesi C 0 (ng g -1 ) k* k için güven aralığı F Değeri** R 2 Değeri*** Sıfırıncı Birinci Sıfırıncı Birinci Sıfırıncı Birinci Sıfırıncı Birinci Sıfırıncı Birinci Sıfırıncı Birinci * k zamana bağlı değişim katsayısıdır. k nın birimi sıfırıncı derece reaksiyon kinetiği için ng g -1 saat -1 olup konsantrasyon azalmasının saatteki hızını ifade etmektedir; birinci derece reaksiyon kinetiği için ise k nın birimi saat -1 olup birim zamanda konsantrasyonun oransal olarak azalış hızını göstermektedir. ** F değeri regresyon kareler ortalaması / hata kareler ortalaması ile hesaplanmıştır. *** R 2 değeri verilerin modele uygunluk oranını göstermektedir 67

85 4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bülent ZORLUGENÇ Sıfırıncı derece reaksiyon kinetiği modeline göre, üç farklı konsantrasyonda AFB 1 içeren öğütülmüş ve bütün kırmızı biberlere ait R 2 değerleri oldukça düşük bulunmuştur. Birinci derece reaksiyon kinetiği modelinde ise R 2 değerleri öğütülmüş kırmızı biberlerde , bütün haldeki biberlerde ise arasında değişmiştir. Regresyonun tesadüfilikten uzaklığını gösteren F değeri birinci derece reaksiyon kinetiği modelinde daha yüksek bulunmuştur. Şekil 4.7, 4.8, 4.9 da öğütülmüş, Şekil 4.10, 4.11 ve 4.12 de ise bütün kırmızı biberlerdeki AFB 1 in sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere göre azalış eğrileri görülmektedir. 600 AFB1 Kontrol AFB1 Birinci derece Sıfırıncı derece 500 Aflatoksin Miktarı (ng g-1) y = -5,881x + 330,524 R 2 = 0, y = 456,821e -0,062x R 2 = 0, Süre (Saat) Şekil ng g -1 AFB 1 içeren öğütülmüş kırmızı biberde aflatoksinin sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere göre azalış eğrileri 68

86 4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bülent ZORLUGENÇ AFB1 Kontrol AFB1 Birinci derece Sıfırıncı derece Aflatoksin Miktarı (ng g-1) y = 929,393e -0,051x R 2 = 0,973 y = -12,411x + 721,431 R 2 = 0, Süre (Saat) Şekil ng g -1 AFB 1 içeren öğütülmüş kırmızı biberde aflatoksinin sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere göre azalış eğrileri 2100 AFB1 Kontrol AFB1 Birinci derece Sıfırıncı derece Aflatoksin Miktarı (ng g-1) y = -24,133x ,513 R 2 = 0, y = 1839,425e -0,044x 300 R 2 = 0, Süre (Saat) Şekil ng g -1 AFB 1 içeren öğütülmüş kırmızı biberde aflatoksinin sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere göre azalış eğrileri 69

87 4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bülent ZORLUGENÇ AFB1 Kontrol AFB1 Birinci derece Sıfırıncı derece Aflatoksin Miktarı (ng g-1) y = -6,115x + 375, R 2 = 0, y = 462,734e -0,044x R 2 = 0, Süre (Saat) Şekil ng g -1 AFB 1 içeren bütün kırmızı biberde aflatoksinin sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere göre azalış eğrileri 1200 AFB1 Kontrol AFB1 Birinci derece Sıfırıncı derece 1000 Aflatoksin Miktarı (ng g-1) y = 929,242e -0,043x R 2 = 0,978 y = -12,156x + 756,539 R 2 = 0, Süre (Saat) Şekil ng g -1 AFB 1 içeren bütün kırmızı biberde aflatoksinin sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere göre azalış eğrileri 70

88 4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bülent ZORLUGENÇ AFB1 Kontrol AFB1 Birinci derece Sıfırıncı derece Aflatoksin Miktarı (ng g-1) y = -24,655x ,835 R 2 = 0, y = 1869,142e -0,038x 300 R 2 = 0, Süre (Saat) Şekil ng g -1 AFB 1 içeren bütün kırmızı biberde aflatoksinin sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere göre azalış eğrileri Birinci derece reaksiyon kinetiği modeline göre R 2 ve F değerleri daha yüksek bulunmuş olup şekillerdeki (Şekil 4.7, 4.8, 4.9, 4.10, 4.11 ve 4.12) kinetik modellere ait azalış eğrilerinden de görüldüğü üzere, kırmızı biber ortamında izlenen F. aurantiacum NRRL B-184 suşu tarafından AFB 1 azalışının birinci derece reaksiyon kinetiğine daha uygun olduğu sonucuna varılmıştır. k değeri birinci derece reaksiyon kinetiği modeline göre yapılan değerlendirmede istatistiksel olarak güvenli bulunmuş ve 500, 1000 ve 2000 ng g -1 AFB 1 içeren öğütülmüş kırmızı biber kullanılan ortamlar için sırasıyla 0.062, ve saat -1 ; bütün kırmızı biber kullanılan ortamlar için ise 0.044, ve saat -1 olarak hesaplanmıştır. 72 saatlik inkübasyon sonunda yalnızca 500 ng g -1 AFB 1 içeren öğütülmüş kırmızı biber örneğinde Türk Gıda Kodeksinde bu ürün için verilmiş olan limite ulaşılmıştır. Bu süre sonunda, 500 ve 1000 ng g -1 AFB 1 içeren öğütülmüş kırmızı biberler ile 500 ng g -1 AFB 1 içeren bütün haldeki kırmızı biber örneklerinin toksin içerikleri Yemlerde İstenmeyen Maddeler Hakkındaki Tebliğ de (Resmi Gazete, 2008) hayvan yemleri için belirtilen sınırlara ulaşmıştır. 71

89 4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bülent ZORLUGENÇ Birinci derece reaksiyon kinetiği modelinin parametrelerinden yararlanılarak 10 7 kob ml -1 F. aurantiacum NRRL B-184 kültürü kullanılması durumunda kırmızı biberlerin AFB 1 içeriklerinin Türk Gıda Kodeksi ve Yemlerde İstenmeyen Maddeler Hakkındaki Tebliğ de izin verilmiş olan değerlere düşürülebilmesi için gerekli olan süreler hesaplanmış ve Çizelge 4.8 de verilmiştir. Çizelge 4.8. Kırmızı Biberlerin AFB 1 Düzeylerinin Kabul Edilebilir Limitlerin Altına İnme Süreleri Kabul Süre (Saat) Tüketim Ürün Edilebilir 500 ng g ng g ng g -1 Amacı ng g -1 AFB 1 İçin) AFB 1 İçin) AFB 1 İçin) Öğütülmüş Kırmızı Bütün Kırmızı Biber Biber k=0.062 k=0.051 k=0.044 İnsan 2 87,60 120,42 155,09 Tüketimi İçin 5 72,82 102,45 134, ,82 102,45 134,27 Hayvan Yemi 10 61,64 88,86 118,51 İçin 20 50,46 75,27 102,76 k=0.044 k=0.043 k=0.038 İnsan 2 123,73 142,81 180,00 Tüketimi İçin 5 102,90 121,50 155, ,90 121,50 155,88 Hayvan Yemi 10 87,15 105,38 137,64 İçin 20 71,40 89,26 119,40 Çizelge 4.8 de görüldüğü üzere 500, 1000 ve 2000 ng g -1 AFB 1 içeren kırmızı biberde aflatoksin seviyesinin 2 ng g -1 a düşebilmesi için gereken süre, öğütülmüş kırmızı biberlerde ile saat; bütün kırmızı biber örneklerinde ise ile saat arasında değişmektedir. Kırmızı biberlerin hayvan yemi olarak kullanılabilmesi için gerekli olan inkübasyon sürelerinin ile saat arasında olacağı hesaplanmıştır 72

90 4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bülent ZORLUGENÇ F. aurantiacum NRRL B-184 Hücrelerinin Mısırda Aflatoksini Azaltmasının Belirlenmesi ve Kinetiği F. aurantiacum NRRL B-184 Hücrelerinin Mısırda Aflatoksini Azaltmasının Belirlenmesi Bakteri kültürü aşılanmayan kontrol örnekleri ile bakteri kültürü aşılanan öğütülmüş ve bütün halde mısır içeren PFT çözeltilerine 500, 1000 ve 2000 ng g -1 düzeylerinde AFB 1 ilave edilmiştir. Toksin içeriğinin inkübasyon sırasındaki değişimi ve % azalma oranları Çizelge 4.9 da verilmiştir. İnkübasyon süresince kontrol örneklerinin AFB 1 düzeylerinde önemli bir değişim olmazken, F. aurantiacum NRRL B-184 suşu aşılanmış olan gerek öğütülmüş gerekse bütün haldeki mısır örneklerinin toksin içeriklerinde sürekli bir azalma görülmüştür. 72 saat sonunda kontrol grubu dışındaki örneklerdeki azalma, başlangıç aflatoksin miktarı artıkça oransal olarak azalmıştır. 500, 1000 ve 2000 ng g -1 aflatoksin içeren öğütülmüş mısır örneklerinde 72. saat sonunda sırasıyla %97.44, %96.09 ve %95.96 düzeylerinde azalma olmuştur. Bütün olarak denemeye alınan örneklerde ise sırasıyla %95.25, %94.01 ve oranında azalma gerçekleşmiştir. Aflatoksin konsantrasyonunun ve inkübasyon süresinin F. aurantiacum NRRL B-184 hücrelerinin mısırda AFB 1 miktarının azalması üzerine etkisi istatistiksel olarak önemli bulunurken (p<0.05), ürün boyutunun etkisi önemli bulunmamıştır. AFB 1 miktarının azalmasında konsantrasyon ve sürenin birlikte ortak etkisi önemli bulunmuş (p<0.05); ancak konsantrasyon-boyut ve süre-boyut ilişkisi istatistiksel açıdan önemsiz (p>0.05) bulunmuştur. 73

91 4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bülent ZORLUGENÇ Çizelge 4.9. PFT Çözeltisinde Farklı Düzeylerde AFB 1 İçeren Öğütülmüş ve Bütün Mısır Örneklerinin Aflatoksin Konsantrasyonlarındaki (ng g -1 ) Değişim ve % Azalma Oranları Konsantrasyon (ng g -1 ) Süre (Saat) Öğütülmüş Kontrol AFB 1 % Azalma Uygulama Bütün Kontrol AFB 1 % Azalma F. aurantiacum NRRL B-184 hücrelerinin, mısır örneklerinin AFB 1 içeriklerini azaltma yeteneğine sahip olduğu görülmüştür. Ciegler ve ark. (1966) da F. aurantiacum NRRL B-184 suşunun mısırdaki aflatoksinin uzaklaştırılmasında etkili olduğunu bildirmişlerdir. Araştırıcılar, toksijenik bir A. flavus suşu geliştireerek aflatoksin oluşumu sağlanan mısırda kob ml -1 canlı F. aurantiacum 74

92 4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bülent ZORLUGENÇ NRRL B-184 hücresi ile 28 o C de 12 saatlik inkübasyon sonunda 16 ng g -1 düzeyindeki AFB 1 in %100 oranında ortamdan uzaklaştığını belirtmişlerdir F. aurantiacum NRRL B-184 Hücrelerinin Mısırda Aflatoksini Azaltmasının Kinetiği Öğütülmüş ve bütün haldeki mısırda AFB 1 in azalmasıyla ilgili kinetiği inceleyebilmek amacıyla regresyon analizleri yapılmıştır. Regresyon analizleri sonucunda elde edilen sıfırıncı ve birinci derece reaksiyon kinetiğine ait regresyon verileri (C o, k, k nın güven aralığı, F ve R 2 ) Çizelge 4.10 da verilmiştir. 75

93 4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bülent ZORLUGENÇ Çizelge F. aurantiacum NRRL B-184 Suşu Tarafından Mısırda AFB 1 in Degradasyon Kinetiğine Ait Regresyon Analizi Sonuçları Ürün Öğütülmüş Konsantrasyon (ng g -1 ) Reaksiyon Derecesi C 0 (ng g -1 ) k* k için güven aralığı F Değeri** R 2 Değeri*** 500 Sıfırıncı Birinci Sıfırıncı Birinci Sıfırıncı Birinci Sıfırıncı Birinci Sıfırıncı Birinci Sıfırıncı Birinci * k zamana bağlı değişim katsayısıdır. k nın birimi sıfırıncı derece reaksiyon kinetiği için ng g -1 saat -1 olup konsantrasyon azalmasının saatteki hızını ifade etmektedir; birinci derece reaksiyon kinetiği için ise k nın birimi saat -1 olup birim zamanda konsantrasyonun oransal olarak azalış hızını göstermektedir. ** F değeri regresyon kareler ortalaması / hata kareler ortalaması ile hesaplanmıştır. *** R 2 değeri verilerin modele uygunluk oranını göstermektedir Bütün 76

94 4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bülent ZORLUGENÇ Üç farklı konsantrasyonda AFB 1 içeren öğütülmüş ve bütün haldeki mısırların; sıfırıncı derece reaksiyon kinetiğine göre yapılan regresyon analizi sonucu elde edilen R 2 ve F değerleri, birinci derece reaksiyon kinetiğine göre daha düşük bulunmuştur. Birinci derece reaksiyon kinetiğine göre; hem öğütülmüş hem de bütün haldeki mısırların R 2 değerleri arasında değişmiştir. Şekil 4.13, 4.14, 4.15 de öğütülmüş mısırda, Şekil 4.16, 4.17 ve 4.18 de ise bütün mısırdaki AFB 1 in sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere göre azalış eğrileri görülmektedir. 600 AFB1 Kontrol AFB1 Birinci derece Sıfırıncı derece 500 Aflatoksin Miktarı (ng g-1) y = -6,006x + 361, R 2 = 0, y = 466,640e -0,050x R 2 = 0, Süre (Saat) Şekil ng g -1 AFB 1 içeren öğütülmüş mısırda aflatoksinin sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere göre azalış eğrileri 77

95 4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bülent ZORLUGENÇ AFB1 Kontrol AFB1 Birinci derece Sıfırıncı derece Aflatoksin Miktarı (ng g-1) y = -11,857x + 717, R 2 = 0, y = 933,641e -0,051x R 2 = 0, Süre (Saat) Şekil ng g -1 AFB 1 içeren öğütülmüş mısırda aflatoksinin sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere göre azalış eğrileri 2100 AFB1 Kontrol AFB1 Birinci derece Sıfırıncı derece 1800 Aflatoksin Miktarı (ng g-1) y = 1915,026e -0,046x R 2 = 0,986 y = -24,922x ,917 R 2 = 0, Süre (Saat) Şekil ng g -1 AFB 1 içeren öğütülmüş mısırda aflatoksinin sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere göre azalış eğrileri 78

96 4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bülent ZORLUGENÇ AFB1 Kontrol AFB1 Birinci derece Sıfırıncı derece Aflatoksin Miktarı (ng g-1) y = 479,777e -0,043x R 2 = 0,997 y = -6,196x + 388,989 R 2 = 0, Süre (Saat) Şekil ng g -1 AFB 1 içeren bütün mısırda aflatoksinin sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere göre azalış eğrileri 1200 AFB1 Kontrol AFB1 Birinci derece Sıfırıncı derece 1000 Aflatoksin Miktarı (ng g-1) y = 945,673e -0,044x R 2 = 0,992 y = -11,984x + 757,074 R 2 = 0, Süre (Saat) Şekil ng g -1 AFB 1 içeren bütün mısırda aflatoksinin sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere göre azalış eğrileri 79

97 4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bülent ZORLUGENÇ AFB1 Kontrol AFB1 Birinci derece Sıfırıncı derece Aflatoksin Miktarı (ng g-1) y = 1963,647e -0,040x R 2 = 0,986 y = -25,610x ,955 R 2 = 0, Süre (Saat) Şekil ng g -1 AFB 1 içeren bütün mısırda aflatoksinin sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere göre azalış eğrileri R 2 ve F değerlerinin birinci derece reaksiyon kinetiği modelinde daha yüksek bulunması sonucu F. aurantiacum NRRL B-184 suşu tarafından mısır ortamındaki AFB 1 azalışının birinci derece reaksiyon kinetiğine daha uygun olduğu sonucuna varılmıştır. Şekillerdeki (Şekil 4.13, 4.14, 4.15, 4.16, 4.17 ve 4.18) kinetik modellere ait azalış eğrileri de incelendiğinde deneysel verilerin birinci derece reaksiyon kinetiğine uyumu daha net görülebilmektedir. 500, 1000 ve 2000 ng g -1 AFB 1 içeren öğütülmüş mısır kullanılan ortamlarda k değeri sırasıyla 0.050, ve saat -1 ; bütün mısırlarda ise 0.043, ve saat -1 olarak hesaplanmıştır. Birinci derece reaksiyon kinetiği modeline göre yapılan değerlendirmede çalışılan tüm mısır örneklerine ait k değerleri istatistiksel olarak güvenli (p<0.05) bulunmuştur. Denemeye alınan mısır örneklerinin AFB 1 düzeyleri, 72 saatlik inkübasyon sonunda Türk Gıda Kodeksinde bu ürünün insan tüketimi için izin verilen sınır değere ulaşamamıştır. Bu süre sonunda 500 ng g -1 AFB 1 içeren öğütülmüş mısır örneklerninin toksin içerikleri Yemlerde İstenmeyen Maddeler Hakkındaki Tebliğ de (Resmi gazete, 2008) hayvan yemleri için belirtilen sınırlara ulaşmıştır. 80

98 4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bülent ZORLUGENÇ Birinci derece reaksiyon kinetiği modelinin parametrelerinden yararlanılarak 10 7 kob ml -1 F. aurantiacum NRRL B-184 kültürü kullanılması durumunda mısırların AFB 1 içeriklerinin Türk Gıda Kodeksi ve Yemlerde İstenmeyen Maddeler Hakkındaki Tebliğ de izin verilmiş olan değerlere düşürülebilmesi için gerekli olan süreler hesaplanmış ve Çizelge 4.11 de verilmiştir. Çizelge Mısır Örneklerinin AFB 1 Düzeylerinin Kabul Edilebilir Limitlerin Altına İnme Süreleri Kabul Tüketim Edilebilir Ürün Amacı Limit (ng g -1 ) Bütün Mısır Öğütülmüş Mısır Süre (Saat) 500 ng g -1 AFB 1 İçin 1000 ng g -1 AFB 1 İçin 2000 ng g -1 AFB 1 İçin k=0.050 k=0.051 k=0.046 İnsan 2 109,06 120,51 149,21 Tüketimi İçin 5 90,73 102,54 129, ,73 102,54 129,29 Hayvan Yemi 10 76,87 88,95 114,23 İçin 20 63,01 75,36 99,16 k=0.043 k=0.044 k=0.040 İnsan 2 127,44 139,97 172,25 Tüketimi İçin 5 106,13 119,15 149, ,13 119,15 149,34 Hayvan Yemi 10 90,01 103,40 132,01 İçin 20 73,89 87,64 114,68 Çizelge 4.11 de görüldüğü üzere 500, 1000 ve 2000 ng g -1 AFB 1 içeren mısırların aflatoksin içeriklerinin 2 ng g -1 a düşebilmesi için gereken süre, öğütülmüş mısırlarda ile saat; bütün mısır örneklerinde ise ile saat arasında değişmektedir. Mısırların hayvan yemi olarak kullanılabilmesi için gerekli olan inkübasyon sürelerinin ile saat arasında olacağı belirlenmiştir. 81

99 4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bülent ZORLUGENÇ F. aurantiacum NRRL B-184 Hücrelerinin Siyah Zeytinde Aflatoksini Azaltmasının Belirlenmesi ve Kinetiği F. aurantiacum NRRL B-184 Hücrelerinin Siyah Zeytinde Aflatoksini Azaltmasının Belirlenmesi Bakteri kültürü aşılanmayan kontrol örnekleri ile bakteri kültürü aşılanan öğütülmüş ve bütün halde siyah zeytin içeren PFT çözeltilerine 500, 1000 ve 2000 ng g -1 düzeylerinde AFB 1 ilave edilmiştir. Toksin içeriğinin inkübasyon sırasındaki değişimi ve % azalma oranları Çizelge 4.12 de verilmiştir. Kontrol örneklerinin AFB 1 düzeylerinde inkübasyon süresince önemli bir değişim görülmemiştir. F. aurantiacum NRRL B-184 suşu aşılanmış olan gerek öğütülmüş gerekse bütün haldeki zeytin örneklerinin toksin içeriklerinde ise sürekli bir azalma görülmüştür. 72 saat sonunda kontrol grubu dışındaki örneklerdeki azalma oranı, başlangıç aflatoksin miktarının artmasıyla oransal olarak azalmıştır. 500, 1000 ve 2000 ng g -1 aflatoksin içeren öğütülmüş zeytin örneklerinde 72. saat sonunda sırasıyla %98.69, %98.14 ve %99.14 düzeylerinde azalma olmuştur. Bütün olarak denemeye alınan örneklerde ise sırasıyla %98.06, %95.63 ve %96.01 oranında azalma gerçekleşmiştir. AFB 1 miktarının azalması üzerine aflatoksin konsantrasyonu ile inkübasyon süresinin etkisi istatistiksel olarak önemli bulunurken (p<0.05), ürün boyutunun etkisi önemli bulunmamıştır. Konsantrasyon ve sürenin birlikte ortak etkisi toksin miktarının azalmasında önemli (p<0.05) olup konsantrasyon-boyut ve süre-boyut ilişkisi istatistiksel açıdan önemsiz (p>0.05) bulunmuştur. 82

100 4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bülent ZORLUGENÇ Çizelge PFT Çözeltisinde Farklı Düzeylerde AFB 1 İçeren Öğütülmüş ve Bütün Siyah Zeytin Örneklerinin Aflatoksin Konsantrasyonlarındaki (ng g -1 ) Değişim ve % Azalma Oranları Konsantrasyon (ng g -1 ) Süre (Saat) Öğütülmüş Kontrol AFB 1 % Azalma Uygulama Bütün Kontrol AFB 1 % Azalma Zeytin üzerine yapılan çalışma sonucunda F. aurantiacum NRRL B-184 hücrelerinin ürüne aşılanan AFB 1 in miktarını azaltma yeteneğine sahip olduğunu göstermektedir. Zeytinle ilgili benzeri bir çalışma olmaması nedeniyle herhangi bir karşılaştırma yapmak mümkün olmamıştır. 83

101 4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bülent ZORLUGENÇ F. aurantiacum NRRL B-184 Hücrelerinin Siyah Zeytinde Aflatoksini Azaltma Kinetiği Öğütülmüş ve bütün haldeki siyah zeytinlerde AFB 1 in azalma kinetiğinin sıfırıncı ve birinci derece reaksiyon kinetiklerine uygunluğunu belirleyebilmek için regresyon analizleri yapılmıştır. Regresyon analizleri sonucu elde edilen C o, k, k nın güven aralığı, F ve R 2 değeri Çizelge 4.13 te verilmiştir. Birinci derece reaksiyon kinetiği modeline göre, üç farklı konsantrasyonda AFB 1 içeren öğütülmüş ve bütün zeytinlere ait R 2 değerleri, sıfırıncı derece reaksiyon kinetiği verilerine göre daha yüksek bulunmuştur. Birinci derece reaksiyon kinetiğinde R 2 değerlerinin öğütülmüş zeytinlerde , bütün haldeki zeytinlerde ise arasında değiştiği görülmüştür. Regresyonun tesadüfilikten uzaklığını gösteren ve kinetik modelinin deneysel verilere uygunluğunun belirlenmesinde yararlanılan F değeri de birinci derece reaksiyon kinetiği modelinde daha yüksek bulunmuştur. Şekil 4.19, 4.20, 4.21 de öğütülmüş zeytinlerde, Şekil 4.22, 4.23 ve 4.24 te ise bütün haldeki zeytinlerde AFB 1 in sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere göre azalış eğrileri görülmektedir. 84

102 4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bülent ZORLUGENÇ Çizelge F. aurantiacum NRRL B-184 Suşu Tarafından Siyah Zeytinde AFB 1 in Degradasyon Kinetiğine Ait Regresyon Analizi Sonuçları Ürün Öğütülmüş Konsantrasyon (ng g -1 ) Reaksiyon Derecesi C 0 (ng g -1 ) k* k için güven aralığı F Değeri** R 2 Değeri*** 500 Sıfırıncı Birinci Sıfırıncı Birinci Sıfırıncı Birinci Sıfırıncı Birinci Sıfırıncı Birinci Sıfırıncı Birinci * k zamana bağlı değişim katsayısıdır. k nın birimi sıfırıncı derece reaksiyon kinetiği için ng g -1 saat -1 olup konsantrasyon azalmasının saatteki hızını ifade etmektedir; birinci derece reaksiyon kinetiği için ise k nın birimi saat -1 olup birim zamanda konsantrasyonun oransal olarak azalış hızını göstermektedir. ** F değeri regresyon kareler ortalaması / hata kareler ortalaması ile hesaplanmıştır. *** R 2 değeri verilerin modele uygunluk oranını göstermektedir Bütün 85

103 4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bülent ZORLUGENÇ AFB1 Kontrol AFB1 Birinci derece Sıfırıncı derece Aflatoksin Miktarı (ng g-1) y = 476,678e -0,055x y = -6,136x + 358,687 R 2 = 0,788 R 2 = 0, Süre (Saat) Şekil ng g -1 AFB 1 içeren öğütülmüş siyah zeytinde aflatoksinin sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere göre azalış eğrileri 1200 AFB1 Kontrol AFB1 Birinci derece Sıfırıncı derece 1000 Aflatoksin Miktarı (ng g-1) y = 949,854e -0,052x R 2 = 0,983 y = -12,233x + 729,359 R 2 = 0, Süre (Saat) Şekil ng g -1 AFB 1 içeren öğütülmüş siyah zeytinde aflatoksinin sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere göre azalış eğrileri 86

104 4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bülent ZORLUGENÇ AFB1 Kontrol AFB1 Birinci derece Sıfırıncı derece Aflatoksin Miktarı (ng g-1) y = -25,015x ,542 R 2 = 0, y = 1913,998e -0,051x R 2 = 0, Süre (Saat) Şekil ng g -1 AFB 1 içeren öğütülmüş siyah zeytinde aflatoksinin sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere göre azalış eğrileri 600 AFB1 Kontrol AFB1 Birinci derece Sıfırıncı derece 500 Aflatoksin Miktarı (ng g-1) y = 484,068e -0,053x R 2 = 0,985 y = -6,202x + 368,890 R 2 = 0, Süre (Saat) Şekil ng g -1 AFB 1 içeren bütün siyah zeytinde aflatoksinin sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere göre azalış eğrileri 87

105 4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bülent ZORLUGENÇ AFB1 Kontrol AFB1 Birinci derece Sıfırıncı derece Aflatoksin Miktarı (ng g-1) y = 950,532e -0,047x R 2 = 0,979 y = -12,024x + 746,262 R 2 = 0, Süre (Saat) Şekil ng g -1 AFB 1 içeren bütün siyah zeytinde aflatoksinin sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere göre azalış eğrileri 2100 AFB1 Kontrol AFB1 Birinci derece Sıfırıncı derece 1800 Aflatoksin Miktarı (ng g-1) y = 1909,609e -0,045x R 2 = 0,981 y = -24,485x ,586 R 2 = 0, Süre (Saat) Şekil ng g -1 AFB 1 içeren bütün siyah zeytinde aflatoksinin sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere göre azalış eğrileri 88

106 4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bülent ZORLUGENÇ R 2 ve F değerlerinin birinci derece reaksiyon kinetiği modelinde daha yüksek bulunmasının yanısıra şekillerdeki (Şekil 4.19, 4.20, 4.21, 4.22, 4.23 ve 4.24) kinetik modellere ait azalış eğrilerinden de görüldüğü üzere zeytin örneklerinde AFB 1 azalışının birinci derece reaksiyon kinetiğine daha uygun olduğu sonucuna varılmıştır. k değeri birinci derece reaksiyon kinetiği modeline göre yapılan değerlendirmede istatistiksel olarak güvenli (p<0.05) bulunmuştur. 500, 1000 ve 2000 ng g -1 AFB 1 içeren öğütülmüş zeytin ortamında toksinin azalma hızı sırasıyla 0.055, ve saat -1 ; bütün haldeki zeytinlerde ise 0.053, ve saat -1 olarak hesaplanmıştır. Denemeye alınan zeytin örneklerinin AFB 1 düzeyleri 72 saatlik inkübasyon sonunda Türk Gıda Kodeksinde bu ürünün insan tüketimi için izin verilen düzeye ulaşmadığı belirlenmiştir. Bu süre sonunda, 1000 ve 2000 ng g -1 AFB 1 içeren bütün haldeki zeytinler haricindeki diğer örneklerin toksin içerikleri Yemlerde İstenmeyen Maddeler Hakkındaki Tebliğ de (Resmi gazete, 2008) hayvan yemleri için belirtilen sınırlara ulaşmıştır. Birinci derece reaksiyon kinetiği modelinin parametrelerinden yararlanılarak 10 7 kob ml -1 F. aurantiacum NRRL B-184 kültürü kullanılması durumunda zeytinlerin AFB 1 içeriklerinin Türk Gıda Kodeksi ve Yemlerde İstenmeyen Maddeler Hakkındaki Tebliğ de izin verilmiş olan değerlere düşürülebilmesi için gerekli olan süreler hesaplanmış ve Çizelge 4.14 de verilmiştir. 89

107 4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bülent ZORLUGENÇ Çizelge Siyah Zeytin Örneklerinin AFB 1 Düzeylerinin Kabul Edilebilir Limitlerin Altına İnme Süreleri Kabul Tüketim Edilebilir Ürün Amacı Limit (ng g -1 ) Bütün Zeytin Öğütülmüş Zeytin Süre (Saat) 500 ng g -1 AFB 1 İçin 1000 ng g -1 AFB 1 İçin 2000 ng g -1 AFB 1 İçin k=0.055 k=0.052 k=0.051 İnsan 2 99,34 118,52 134,59 Tüketimi İçin 5 82,68 100,90 116, ,68 100,90 116,62 Hayvan Yemi 10 70,08 87,57 103,03 İçin 20 57,48 74,24 89,44 k=0.053 k=0.047 k=0.045 İnsan 2 103,56 131,15 152,49 Tüketimi İçin 5 86,27 111,65 132, ,27 111,65 132,12 Hayvan Yemi 10 73,20 96,90 116,72 İçin 20 60,12 82,15 101,32 Çizelge 4.14 de görüldüğü üzere 500, 1000 ve 2000 ng g -1 AFB 1 içeren siyah zeytinlerin aflatoksin seviyelerinin 2 ng g -1 a düşebilmesi için gereken süre, öğütülmüş zeytinlerde ile saat; bütün haldeki zeytin örneklerinde ise ile saat arasında değişmektedir. Zeytinlerin hayvan yemi olarak kullanılabilmesi için gerekli olan inkübasyon sürelerinin ile saat arasında değiştiği tespit edilmiştir F. aurantiacum NRRL B-184 Hücrelerinin Soya Fasulyesinde Aflatoksini Azaltmasının Belirlenmesi ve Kinetiği F. aurantiacum NRRL B-184 Hücrelerinin Soya Fasulyesinde Aflatoksini Azaltmasının Belirlenmesi Kontrol örnekleri ile bakteri kültürü aşılanan öğütülmüş ve bütün halde soya fasulyesi içeren PFT çözeltilerine 500, 1000 ve 2000 ng g -1 düzeylerinde AFB 1 ilave 90

108 4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bülent ZORLUGENÇ edilmiştir. İnkübasyon sırasındaki aflatoksin içeriğindeki değişim ve % azalma oranları Çizelge 4.15 de verilmiştir. Çizelge PFT Çözeltisinde Farklı Düzeylerde AFB 1 İçeren Öğütülmüş ve Bütün Soya Fasulyesi Örneklerinin Aflatoksin Konsantrasyonlarındaki (ng g -1 ) Değişim ve % Azalma Oranları Konsantrasyon (ng g -1 ) Öğütülmüş Bütün Süre % % (Saat) Kontrol AFB 1 Kontrol AFB 1 Azalma Azalma İnkübasyon süresince, F. aurantiacum NRRL B-184 suşu aşılanmış olan gerek öğütülmüş gerekse bütün haldeki soya fasulyesi örneklerinin AFB 1 içeriklerinde sürekli bir azalma görülmüştür. Kontrol örneklerinin aflatoksin düzeylerinde ise önemli bir değişim belirlenmemiştir. 72 saat sonunda kontrol grubu 91

109 4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bülent ZORLUGENÇ dışındaki örneklerdeki azalma, başlangıç aflatoksin miktarı artıkça oransal olarak azalmıştır. 500, 1000 ve 2000 ng g -1 aflatoksin içeren öğütülmüş soya fasulyesi örneklerinde 72. saat sonunda sırasıyla %90.31, %86.10 ve %87.34 düzeylerinde azalma olmuştur. Bütün olarak denemeye alınan örneklerde ise sırasıyla %85.65, %84.28 ve %84.91 oranında azalma gerçekleşmiştir. Aflatoksin konsantrasyonunun ve inkübasyon süresinin F. aurantiacum NRRL B-184 hücrelerinin soya fasulyesinde AFB 1 miktarının azalması üzerine etkisi istatistiksel olarak önemli bulunurken (p<0.05), ürün boyutunun etkisi önemli bulunmamıştır. AFB 1 miktarının azalmasında konsantrasyon ve sürenin birlikteki etkisi önemli (p<0.05), konsantrasyon-boyut ve süre-boyut ilişkileri ise istatistiksel açıdan önemsiz bulunmuştur. Bu çalışmada, soya fasulyesinin AFB 1 miktarının azaltılması üzerine F. aurantiacum NRRL B-184 hücrelerinin etkili olduğu görülmüştür. Ciegler ve ark. (1966) nın yaptıkları çalışmada da aynı bakterinin soya fasulyesindeki aflatoksini azaltma yeteneğine sahip olduğu belirtilmiştir. Araştırıcı, toksijenik bir A. flavus suşu geliştirilerek aflatoksin oluşumu sağlanan soya fasulyesinde; kob ml -1 canlı F. aurantiacum NRRL B-184 hücresi ile 28 o C de 12 saatlik inkübasyon sonunda 8 mg g -1 düzeyindeki AFB 1 in 2 mg g -1 a düştüğünü, inkübasyon süresi uzatıldığında soya fasulyesinde kalan aflatoksinin de giderildiğini bildirmişlerdir F. aurantiacum NRRL B-184 Hücrelerinin Soya Fasulyesinde Aflatoksini Azaltma Kinetiği Öğütülmüş ve bütün haldeki soya fasulyesinin AFB 1 içeriğindeki azalmanın kaçıncı dereceden reaksiyon kinetiğine uyduğunu belirleyebilmek amacıyla regresyon analizleri yapılmıştır. Yapılan regresyon analizleri ile C o, k, k nın güven aralığı, F ve R 2 değeri hesaplanmış olup sonuçlar Çizelge 4.16 da verilmiştir. 92

110 4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bülent ZORLUGENÇ Çizelge F. aurantiacum NRRL B-184 Suşu Tarafından Soya Fasulyesinde AFB 1 in Degradasyon Kinetiğine Ait Regresyon Analizi Sonuçları Ürün Öğütülmüş Konsantrasyon (ng ml -1 ) Reaksiyon Derecesi C 0 (ng g-1) k* k için güven aralığı F Değeri** R 2 Değeri*** 500 Sıfırıncı Birinci Sıfırıncı Birinci Sıfırıncı Birinci Sıfırıncı Birinci Sıfırıncı Birinci Sıfırıncı Birinci * k zamana bağlı değişim katsayısıdır. k nın birimi sıfırıncı derece reaksiyon kinetiği için ng g -1 saat -1 olup konsantrasyon azalmasının saatteki hızını ifade etmektedir; birinci derece reaksiyon kinetiği için ise k nın birimi saat -1 olup birim zamanda konsantrasyonun oransal olarak azalış hızını göstermektedir. ** F değeri regresyon kareler ortalaması / hata kareler ortalaması ile hesaplanmıştır. *** R 2 değeri verilerin modele uygunluk oranını göstermektedir Bütün 93

111 4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bülent ZORLUGENÇ Sıfırıncı derece reaksiyon kinetiği modeline göre, üç farklı konsantrasyonda AFB 1 içeren öğütülmüş ve bütün soya fasulyelerine ait R 2 ve F değerleri birinci derece reaksiyon kinetiği modelinden oldukça düşük bulunmuştur. Birinci derece reaksiyon kinetiği modelinde R 2 değerleri öğütülmüş soya fasulyelerinde , bütün soya fasulyelerinde ise arasında değişmiştir. Şekil 4.25, 4.26, 4.27 de öğütülmüş, Şekil 4.28, 4.29 ve 4.30 da ise bütün halde bulunan soya fasulyelerindeki AFB 1 in sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere göre azalış eğrileri görülmektedir. 600 AFB1 Kontrol AFB1 Birinci derece Sıfırıncı derece 500 Aflatoksin Miktarı (ng g-1) y = 464,427e -0,030x R 2 = 0,995 y = -5,685x + 406,007 R 2 = 0, Süre (Saat) Şekil ng g -1 AFB 1 içeren öğütülmüş soya fasulyesinde aflatoksinin sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere göre azalış eğrileri 94

112 4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bülent ZORLUGENÇ AFB1 Kontrol AFB1 Birinci derece Sıfırıncı derece Aflatoksin Miktarı (ng g-1) y = -10,939x + 821,846 R 2 = 0, y = 927,412e -0,028x 200 R 2 = 0, Süre (Saat) Şekil ng g -1 AFB 1 içeren öğütülmüş soya fasulyesinde aflatoksinin sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere göre azalış eğrileri 2100 AFB1 Kontrol AFB1 Birinci derece Sıfırıncı derece 1800 Aflatoksin Miktarı (ng g-1) y = -22,433x ,957 R 2 = 0, y = 1870,481e -0,029x R 2 = 0, Süre (Saat) Şekil ng g -1 AFB 1 içeren öğütülmüş soya fasulyesinde aflatoksinin sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere göre azalış eğrileri 95

113 4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bülent ZORLUGENÇ AFB1 Kontrol AFB1 Birinci derece Sıfırıncı derece Aflatoksin Miktarı (ng g-1) y = -5,583x + 421,013 R 2 = 0,922 y = 473,922e -0,027x R 2 = 0, Süre (Saat) Şekil ng g -1 AFB 1 içeren bütün soya fasulyesinde aflatoksinin sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere göre azalış eğrileri 1200 AFB1 Kontrol AFB1 Birinci derece Sıfırıncı derece 1000 Aflatoksin Miktarı (ng g-1) y = -11,021x + 852,009 R 2 = 0, y = 947,549e -0,026x 200 R 2 = 0, Süre (Saat) Şekil ng g -1 AFB 1 içeren bütün soya fasulyesinde aflatoksinin sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere göre azalış eğrileri 96

114 4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bülent ZORLUGENÇ AFB1 Kontrol AFB1 Birinci derece Sıfırıncı derece Aflatoksin Miktarı (ng g-1) y = 1950,109e -0,028x R 2 = 0,994 y = -23,223x ,720 R 2 = 0, Süre (Saat) Şekil ng g -1 AFB 1 içeren bütün soya fasulyesinde aflatoksinin sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere göre azalış eğrileri R 2 ve F değerlerinin birinci derece reaksiyon kinetiği modelinde daha yüksek bulunması AFB 1 miktarındaki azalmanın bu kinetik modele daha uygun olduğunu göstermektedir. Kinetik modellere ait azalış eğrilerinin birinci derece reaksiyon kinetiğine daha uygun olduğu şekillerden de (Şekil 4.25, 4.26, 4.27, 4.28, 4.29 ve 4.30) görülebilmektedir. Birinci derece reaksiyon kinetiği modeline göre elde edilen k değerleri istatistiksel olarak güvenli bulunmuştur. 500, 1000 ve 2000 ng g -1 AFB 1 içeren öğütülmüş soya fasulyesi ortamında toksinin degradasyon hızı sırasıyla 0.055, ve saat -1 ; bütün halde soya fasulyesi içeren ortamda ise 0.053, ve saat -1 olarak bulunmuştur. Soya fasulyesi örneklerinin 72 saat sonunda içerdiği AFB 1 düzeyleri Türk Gıda Kodeksinde bu ürün için izin verilen sınır değerlere ulaşamamıştır. İnkübasyon süresi, soya fasulyelerinin hayvan yemi olarak ta kullanımı için de yeterli olmamıştır. Birinci derece reaksiyon kinetiği modelinin parametrelerinden yararlanılarak 10 7 kob ml -1 F. aurantiacum NRRL B-184 kültürü kullanılması durumunda soya fasulyelerinin AFB 1 içeriklerinin Türk Gıda Kodeksi ve Yemlerde İstenmeyen 97

115 4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bülent ZORLUGENÇ Maddeler Hakkındaki Tebliğ de izin verilmiş olan değerlere düşürülebilmesi için gerekli olan süreler hesaplanmış ve Çizelge 4.17 de verilmiştir. Çizelge Soya Fasulyelerinin AFB 1 Düzeylerinin Kabul Edilebilir Limitlerin Altına İnme Süreleri Kabul Tüketim Edilebilir Ürün Amacı Limit (ng g -1 ) Öğütülmüş Soya Fasulyesi Bütün Soya Fasulyesi Süre (Saat) 500 ng g -1 AFB 1 İçin 1000 ng g -1 AFB 1 İçin 2000 ng g -1 AFB 1 İçin k=0.030 k=0.028 k=0.029 İnsan 2 181,60 219,24 235,89 Tüketimi İçin 5 151,05 186,52 204, ,05 186,52 204,30 Hayvan Yemi ,95 161,76 180,39 İçin ,84 137,01 156,49 k=0.027 k=0.026 k=0.028 İnsan 2 202,51 236,96 210,10 Tüketimi İçin 5 168,58 201,71 177, ,58 201,71 177,38 Hayvan Yemi ,90 175,05 152,62 İçin ,23 148,39 127,87 Çizelge 4.17 de görüldüğü üzere 500, 1000 ve 2000 ng g -1 AFB 1 içeren soya fasulyesinin aflatoksin seviyesinin 2 ng g -1 a düşebilmesi için gereken süre, öğütülmüş soya fasulyesi örneklerinde ile saat; bütün haldeki soya fasulyesi örneklerinde ise ile saat arasında değişmektedir. Soya fasulyelerinin hayvan yemi olarak kullanılabilmesi için gerekli olan inkübasyon sürelerinin ile saat arasında değiştiği tespit edilmiştir. 98

116 4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bülent ZORLUGENÇ F. aurantiacum NRRL B-184 Hücrelerinin Kuru İncirde Aflatoksini Azaltmasının Belirlenmesi ve Kinetiği F. aurantiacum NRRL B-184 Hücrelerinin Kuru İncirde Aflatoksini Azaltmasının Belirlenmesi Bakteri kültürü aşılanmayan kontrol örnekleri ile bakteri kültürü aşılanan öğütülmüş ve bütün halde incir içeren PFT çözeltilerine 500, 1000 ve 2000 ng g -1 düzeylerinde AFB 1 ilave edilmiştir. İnkübasyon sırasında aflatoksin içeriğindeki değişim ve % azalma oranları Çizelge 4.18 de verilmiştir. İnkübasyon süresince kontrol örneklerinin AFB 1 düzeylerinde önemli bir değişim olmazken, F. aurantiacum NRRL B-184 suşu aşılanmış olan gerek öğütülmüş gerekse bütün haldeki incir örneklerinin toksin içeriklerinde sürekli bir azalma görülmüştür. 72 saat sonunda kontrol grubu dışındaki örneklerdeki azalma, başlangıç aflatoksin miktarı artıkça oransal olarak azalmıştır. 500, 1000 ve 2000 ng g -1 aflatoksin içeren öğütülmüş kuru incir örneklerinde 72. saat sonunda sırasıyla %99.34, %98.30 ve %97.83 düzeylerinde azalma olmuştur. Bütün olarak denemeye alınan örneklerde ise sırasıyla %98.17, %95.80 ve %95.25 oranında azalma gerçekleşmiştir. Aflatoksin konsantrasyonunun ve inkübasyon süresinin F. aurantiacum NRRL B-184 hücrelerinin incirde AFB 1 miktarının azalması üzerine etkisi istatistiksel olarak önemli bulunurken (p<0.05), ürün boyutunun etkisi önemli bulunmamıştır. AFB 1 miktarının azalmasında konsantrasyon ve sürenin birlikte ortak etkisi önemli bulunmuş (p<0.05); ancak konsantrasyon-boyut ve süre-boyut ilişkisi istatistiksel açıdan önemsiz bulunmuştur. 99

117 4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bülent ZORLUGENÇ Çizelge PFT Çözeltisinde Farklı Düzeylerde AFB 1 İçeren Öğütülmüş ve Bütün Kuru İncir Örneklerinin Aflatoksin Konsantrasyonlarındaki (ng g -1 ) Değişim ve % Azalma Oranları Konsantrasyon (ng g -1 ) Uygulama Süre Öğütülmüş Bütün (Saat) % % Kontrol AFB 1 Kontrol AFB 1 Azalma Azalma Kuru incir üzerine yapılan çalışma sonucunda F. aurantiacum NRRL B-184 hücrelerinin ürüne aşılanan AFB 1 in miktarını azaltma yeteneğine sahip olduğunu göstermektedir. Kuru incir ile ilgili benzeri bir çalışma olmaması nedeniyle herhangi bir karşılaştırma yapmak mümkün olamamıştır. 100

118 4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bülent ZORLUGENÇ F. aurantiacum NRRL B-184 Hücrelerinin Kuru İncirde Aflatoksini Azaltma Kinetiği Öğütülmüş ve bütün haldeki incirlerde AFB 1 in azalma kinetiğini inceleyebilmek amacıyla regresyon analizleri yapılmıştır. Her iki regresyon analizinde de, C o, k, k nın güven aralığı, F ve R 2 değeri hesaplanmış olup sonuçlar Çizelge 4.19 da verilmiştir. Sıfırıncı derece reaksiyon kinetiği modeline göre, üç farklı konsantrasyonda AFB 1 içeren öğütülmüş ve bütün incirlere ait R 2 değerleri oldukça düşük bulunmuştur. Birinci derece reaksiyon kinetiği modelinde ise R 2 değerleri öğütülmüş incirlerde bütün haldeki incirlerde ise arasında değişmiştir. Regresyonun tesadüfilikten uzaklığını gösteren F değeri birinci derece reaksiyon kinetiği modelinde daha yüksek bulunmuştur. Şekil 4.31, 4.32, 4.33 te öğütülmüş incirlerdeki, Şekil 4.34, 4.35 ve 4.36 da ise bütün haldeki incirlerdeki AFB 1 in, sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere göre azalış eğrileri görülmektedir. 101

119 4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bülent ZORLUGENÇ Çizelge F. aurantiacum NRRL B-184 Suşu Tarafından Kuru İncirde AFB 1 in Degradasyon Kinetiğine Ait Regresyon Analizi Sonuçları Ürün Öğütülmüş Konsantrasyon (ng g -1 ) Reaksiyon Derecesi C 0 (ng g -1 ) k* k için güven aralığı F Değeri** R 2 Değeri*** 500 Sıfırıncı Birinci Sıfırıncı Birinci Sıfırıncı Birinci Sıfırıncı Birinci Sıfırıncı Birinci Sıfırıncı Birinci * k zamana bağlı değişim katsayısıdır. k nın birimi sıfırıncı derece reaksiyon kinetiği için ng g -1 saat -1 olup konsantrasyon azalmasının saatteki hızını ifade etmektedir; birinci derece reaksiyon kinetiği için ise k nın birimi saat -1 olup birim zamanda konsantrasyonun oransal olarak azalış hızını göstermektedir. ** F değeri regresyon kareler ortalaması / hata kareler ortalaması ile hesaplanmıştır. *** R 2 değeri verilerin modele uygunluk oranını göstermektedir Bütün 102

120 4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bülent ZORLUGENÇ AFB1 Kontrol AFB1 Birinci derece Sıfırıncı derece Aflatoksin Miktarı (ng g-1) y = 456,316e -0,054x y = -5,969x + 346,595 R 2 = 0,810 R 2 = 0, Süre (Saat) Şekil ng g -1 AFB 1 içeren öğütülmüş kuru incirde aflatoksinin sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere göre azalış eğrileri 1200 AFB1 Kontrol AFB1 Birinci derece Sıfırıncı derece 1000 Aflatoksin Miktarı (ng g-1) y = -11,959x + 695, R 2 = 0, y = 916,646e -0,054x R 2 = 0, Süre (Saat) Şekil ng g -1 AFB 1 içeren öğütülmüş kuru incirde aflatoksinin sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere göre azalış eğrileri 103

121 4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bülent ZORLUGENÇ AFB1 Kontrol AFB1 Birinci derece Sıfırıncı derece Aflatoksin Miktarı (ng g-1) y = 1846,475e -0,054x R 2 = 0,990 y = -23,946x ,671 R 2 = 0, Süre (Saat) Şekil ng g -1 AFB 1 içeren öğütülmüş kuru incirde aflatoksinin sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere göre azalış eğrileri 600 AFB1 Kontrol AFB1 Birinci derece Sıfırıncı derece 500 Aflatoksin Miktarı (ng g-1) y = 461,821e -0,048x R 2 = 0,997 y = -6,033x + 363,827 R 2 = 0, Süre (Saat) Şekil ng g -1 AFB 1 içeren bütün kuru incirde aflatoksinin sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere göre azalış eğrileri 104

122 4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bülent ZORLUGENÇ AFB1 Kontrol AFB1 Birinci derece Sıfırıncı derece Aflatoksin Miktarı (ng g-1) y = 935,878e -0,046x R 2 = 0,996 y = -12,251x + 744,672 R 2 = 0, Süre (Saat) Şekil ng g -1 AFB 1 içeren bütün kuru incirde aflatoksinin sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere göre azalış eğrileri 2100 AFB1 Kontrol AFB1 Birinci derece Sıfırıncı derece 1800 Aflatoksin Miktarı (ng g-1) y = 1916,987e -0,042x R 2 = 0,988 y = -25,323x ,220 R 2 = 0, Süre (Saat) Şekil ng g -1 AFB 1 içeren bütün kuru incirde aflatoksinin sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere göre azalış eğrileri 105

123 4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bülent ZORLUGENÇ R 2 ve F değerlerinin birinci derece reaksiyon kinetiği modelinde daha yüksek bulunmasının yanısıra şekillerdeki (Şekil 4.31, 4.32, , 4.35 ve 4.36) kinetik modellere ait azalış eğrilerinden de görüldüğü üzere incir ortamındaki AFB 1 azalışının birinci derece reaksiyon kinetiğine daha uygun olduğu sonucuna varılmıştır. k değeri birinci derece reaksiyon kinetiği modeline göre yapılan değerlendirmede istatistiksel olarak güvenli bulunmuş ve 500, 1000 ve 2000 ng g -1 AFB 1 içeren öğütülmüş incirlerde sırasıyla 0.054, ve saat -1 ; bütün haldeki incirlerde ise 0.048, ve saat -1 olarak hesaplanmıştır. 72 saatlik inkübasyon sonunda yalnızca 500 ng g -1 AFB 1 içeren öğütülmüş kuru incir örneğinde Türk Gıda Kodeksinde bu ürün için verilmiş olan limite ulaşılmıştır. 500 ve 1000 ng g -1 AFB 1 içeren öğütülmüş ve 500 ng g -1 AFB 1 içeren bütün haldeki kuru incirlerin toksin içerikleri Yemlerde İstenmeyen Maddeler Hakkındaki Tebliğ de (Resmi gazete, 2008) hayvan yemleri için belirtilen sınırlara ulaşmıştır. Birinci derece reaksiyon kinetiği modelinin parametrelerinden yararlanılarak 10 7 kob ml -1 F. aurantiacum NRRL B-184 kültürü kullanılması durumunda kuru incirlerin AFB 1 içeriklerinin Türk Gıda Kodeksi ve Yemlerde İstenmeyen Maddeler Hakkındaki Tebliğ de izin verilmiş olan değerlere düşürülebilmesi için gerekli olan süreler hesaplanmış ve Çizelge 4.20 de verilmiştir. 106

124 4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bülent ZORLUGENÇ Çizelge Kuru İncirlerin AFB 1 Düzeylerinin Kabul Edilebilir Limitlerin Altına İnme Süreleri Kabul Tüketim Edilebilir Ürün Amacı Limit (ng g -1 ) Bütün İncir Öğütülmüş İncir Süre(Saat) 500 ng g -1 AFB 1 İçin 1000 ng g -1 AFB 1 İçin 2000 ng g -1 AFB 1 İçin k=0.054 k=0.054 k=0.054 İnsan 2 100,55 113,48 126,44 Tüketimi İçin 5 83,58 96,51 109, ,58 96,51 109,47 Hayvan Yemi 10 70,75 83,67 96,64 İçin 20 57,91 70,84 83,80 k=0.048 k=0.046 k=0.042 İnsan 2 113,37 133,65 163,47 Tüketimi İçin 5 94,28 113,73 141, ,28 113,73 141,66 Hayvan Yemi 10 79,84 98,66 125,15 İçin 20 65,40 83,59 108,65 Çizelge 4.20 de görüldüğü üzere 500, 1000 ve 2000 ng g -1 AFB 1 içeren kuru incirlerin aflatoksin seviyesinin 2 ng g -1 a düşebilmesi için gereken süre, öğütülmüş kuru incirlerde ile saat; bütün haldeki kuru incirlerde ise ile saat arasında değişmektedir. Kuru incirlerin hayvan yemi olarak kullanılabilmesi için gerekli olan inkübasyon sürelerinin ile saat arasında değiştiği belirlenmiştir F. aurantiacum NRRL B-184 Hücrelerinin Fındıkta Aflatoksini Azaltmasının Belirlenmesi ve Kinetiği F. aurantiacum NRRL B-184 Hücrelerinin Fındıkta Aflatoksini Azaltmasının Belirlenmesi Bakteri kültürü aşılanmayan kontrol örnekleri ile bakteri kültürü aşılanan öğütülmüş ve bütün halde fındık içeren PFT çözeltilerine 500, 1000 ve 2000 ng g -1 düzeylerinde AFB 1 ilave edilmiştir. İnkübasyon sırasındaki aflatoksin içeriğindeki değişim ve % azalma oranları Çizelge 4.21 de verilmiştir. 107

125 4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bülent ZORLUGENÇ Çizelge PFT Çözeltisinde Farklı Düzeylerde AFB 1 İçeren Öğütülmüş Ve Bütün Fındık Örneklerinin Aflatoksin Konsantrasyonlarındaki (ng g -1 ) Değişim ve % Azalma Oranları Konsantrasyon (ng g -1 ) Süre (Saat) Öğütülmüş Kontrol AFB 1 % Azalma Uygulama Bütün Kontrol AFB 1 % Azalma Kontrol örneklerinin AFB 1 düzeylerinde inkübasyon süresince önemli bir değişim gerçekleşmemiştir. F. aurantiacum NRRL B-184 suşu aşılanmış olan gerek öğütülmüş gerekse bütün haldeki fındık örneklerinin toksin içeriklerinde sürekli bir azalma görülmüştür. 72 saat sonunda kontrol grubu dışındaki örneklerdeki azalma oranı, başlangıç aflatoksin miktarının artmasıyla oransal olarak azalmıştır. 500, 1000 ve 2000 ng g -1 aflatoksin içeren öğütülmüş fındık örneklerinde 72. saat sonunda 108

126 4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bülent ZORLUGENÇ sırasıyla %99.84, %99.47 ve %99.04 düzeylerinde azalma olmuştur. Bütün olarak denemeye alınan örneklerde ise sırasıyla %97.69, %98.11 ve %96.48 oranında azalma gerçekleşmiştir. F. aurantiacum NRRL B-184 hücreleri tarafından fındık örneklerinin AFB 1 miktarının azaltılması üzerine aflatoksin konsantrasyonu ve inkübasyon süresinin etkisi istatistiksel olarak önemli bulunmuştur (p<0.05). Fındık boyutunun etkisi ise istatistiksel olarak önemli bulunmamıştır. Konsantrasyon ve sürenin birlikte ortak etkisi toksin miktarının azalmasında önemli (p<0.05) olup konsantrasyon-boyut ve süre-boyut ilişkisi istatistiksel açıdan önemsiz bulunmuştur. Fındıklarla yapılan çalışma sonucunda F. aurantiacum NRRL B-184 hücrelerinin ürüne aşılanan AFB 1 in miktarını azaltma yeteneğine sahip olduğu görülmüştür. Bu bakterinin fındıkta bulunan aflatoksin üzerine etkisinin araştırıldığı başka bir çalışmanın olmaması; bu çalışmadan elde edilen verilerin karşılaştırılmasını mümkün kılmamıştır F. aurantiacum NRRL B-184 Hücrelerinin Fındıkta Aflatoksini Azaltma Kinetiği Öğütülmüş ve bütün haldeki fındıklarda AFB 1 in azalma kinetiğinin sıfırıncı ve birinci derece reaksiyon kinetiklerine uygunluğunu belirleyebilmek amacıyla regresyon analizleri yapılmıştır. Regresyon analizleri sonucu elde edilen C o, k, k nın güven aralığı, F ve R 2 değeri Çizelge 4.22 de verilmiştir. 109

127 4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bülent ZORLUGENÇ Çizelge F. aurantiacum NRRL B-184 Suşu Tarafından Fındıkta AFB 1 in Degradasyon Kinetiğine Ait Regresyon Analizi Sonuçları. Ürün Öğütülmüş Bütün Konsantrasyon (ng ml -1 ) Reaksiyon Derecesi C 0 (ng g-1) k* k için güven aralığı F Değeri** R 2 Değeri*** Sıfırıncı Birinci Sıfırıncı Birinci Sıfırıncı Birinci Sıfırıncı Birinci Sıfırıncı Birinci Sıfırıncı Birinci * k zamana bağlı değişim katsayısıdır. k nın birimi sıfırıncı derece reaksiyon kinetiği için ng g -1 saat -1 olup konsantrasyon azalmasının saatteki hızını ifade etmektedir; birinci derece reaksiyon kinetiği için ise k nın birimi saat -1 olup birim zamanda konsantrasyonun oransal olarak azalış hızını göstermektedir. ** F değeri regresyon kareler ortalaması / hata kareler ortalaması ile hesaplanmıştır. *** R 2 değeri verilerin modele uygunluk oranını göstermektedir 110

128 4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bülent ZORLUGENÇ Sıfırıncı derece reaksiyon kinetiği modeline göre, üç farklı konsantrasyonda AFB 1 içeren öğütülmüş ve bütün fındıklara ait R 2 değerleri oldukça düşük bulunmuştur. Birinci derece reaksiyon kinetiği modelinde ise R 2 değerleri öğütülmüş fındıklarda , bütün haldeki fındıklarda ise arasında değişmiştir. Regresyonun tesadüfilikten uzaklığını gösteren ve kinetik modelin deneysel verilere uygunluğunun belirlenmesinde yararlanılan F değeri de birinci derece reaksiyon kinetiği modelinde daha yüksek bulunmuştur. Şekil 4.37, 4.38, 4.39 da öğütülmüş fındıklardaki, Şekil 4.40, 4.41 ve 4.42 de ise bütün halindeki fındıklarda AFB 1 in sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere göre azalış eğrileri görülmektedir. 600 AFB1 Kontrol AFB1 Birinci derece Sıfırıncı derece 500 Aflatoksin Miktarı (ng g-1) y = -6,066x + 342, R 2 = 0, y = 484,527e -0,067x R 2 = 0, Süre (Saat) Şekil ng g -1 AFB 1 içeren öğütülmüş fındıkta aflatoksinin sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere göre azalış eğrileri 111

129 4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bülent ZORLUGENÇ AFB1 Kontrol AFB1 Birinci derece Sıfırıncı derece Aflatoksin Miktarı (ng g-1) y = 1006,536e -0,053x R 2 = 0,980 y = -13,416x + 775,047 R 2 = 0, Süre (Saat) Şekil ng g -1 AFB 1 içeren öğütülmüş fındıkta aflatoksinin sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere göre azalış eğrileri 2100 AFB1 Kontrol AFB1 Birinci derece Sıfırıncı derece 1800 Aflatoksin Miktarı (ng g-1) y = 2017,716e -0,048x R 2 = 0,982 y = -27,156x ,952 R 2 = 0, Süre (Saat) Şekil ng g -1 AFB 1 içeren öğütülmüş fındıkta aflatoksinin sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere göre azalış eğrileri 112

130 4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bülent ZORLUGENÇ AFB1 Kontrol AFB1 Birinci derece Sıfırıncı derece Aflatoksin Miktarı (ng g-1) y = 504,967e -0,052x R 2 = 0,986 y = -6,623x + 387,652 R 2 = 0, Süre (Saat) Şekil ng g -1 AFB 1 içeren bütün fındıkta aflatoksinin sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere göre azalış eğrileri 1200 AFB1 Kontrol AFB1 Birinci derece Sıfırıncı derece 1000 Aflatoksin Miktarı (ng g-1) y = 1023,625e -0,044x R 2 = 0,984 y = -13,664x + 830,739 R 2 = 0, Süre (Saat) Şekil ng g -1 AFB 1 içeren bütün fındıkta aflatoksinin sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere göre azalış eğrileri 113

131 4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bülent ZORLUGENÇ AFB1 Kontrol AFB1 Birinci derece Sıfırıncı derece Aflatoksin Miktarı (ng g-1) y = 2046,973e -0,040x R 2 = 0,982 y = -27,202x ,112 R 2 = 0, Süre (Saat) Şekil ng g -1 AFB 1 içeren bütün fındıkta aflatoksinin sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere göre azalış eğrileri R 2 ve F değerlerinin birinci derece reaksiyon kinetiği modelinde daha yüksek bulunması sonucu F. aurantiacum NRRL B-184 suşu tarafından fındık ortamındaki AFB 1 azalışının birinci derece reaksiyon kinetiğine daha uygun olduğu sonucuna varılmıştır. Şekillerdeki (Şekil 4.37, 4.38, 4.39, 4.40, 4.41 ve 4.42) kinetik modellere ait azalış eğrileri de incelendiğinde deneysel verilerin birinci derece reaksiyon kinetiğine uyumu daha iyi görülebilmektedir. Birinci derece reaksiyon kinetiği modeline göre elde edilen k değerleri istatistiksel olarak güvenli bulunmuştur. 500, 1000 ve 2000 ng g -1 AFB 1 içeren öğütülmüş fındık kullanılan ortamlar için toksinin azalma hızı sırasıyla 0.067, ve saat -1 ; bütün haldeki fındıklarda ise 0.052, ve saat -1 olarak hesaplanmıştır. 72 saatlik inkübasyon sonunda yalnızca 500 ve 1000 ng g -1 AFB 1 içeren öğütülmüş fındık örneklerinde Türk Gıda Kodeksinde bu ürün için verilmiş olan limite ulaşılmıştır. 500, 1000 ve 2000 ng g -1 AFB 1 içeren öğütülmüş ve 500 ile 1000 ng g -1 AFB 1 içeren bütün haldeki fındıkların toksin içerikleri Yemlerde İstenmeyen 114

132 4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bülent ZORLUGENÇ Maddeler Hakkındaki Tebliğ de (Resmi gazete, 2008) hayvan yemleri için belirtilen sınırlara ulaşmıştır. Birinci derece reaksiyon kinetiği modelinin parametrelerinden yararlanılarak 10 7 kob ml -1 F. aurantiacum NRRL B-184 kültürü kullanılması durumunda fındıkların AFB 1 içeriklerinin Türk Gıda Kodeksi ve Yemlerde İstenmeyen Maddeler Hakkındaki Tebliğ de izin verilmiş olan değerlere düşürülebilmesi için gerekli olan süreler hesaplanmış ve Çizelge 4.23 de verilmiştir. Çizelge Fındık Örneklerinin AFB 1 Düzeylerinin Kabul Edilebilir Limitlerin Altına İnme Süreleri Kabul Tüketim Edilebilir Ürün Amacı Limit (ng g -1 ) Bütün Fındık Öğütülmüş Fındık Süre (Saat) 500 ng g -1 AFB 1 İçin 1000 ng g -1 AFB 1 İçin 2000 ng g -1 AFB 1 İçin k=0.674 k=0.053 k=0.048 İnsan 2 81,94 117,37 144,10 Tüketimi İçin 5 68,26 100,09 125, ,26 100,09 125,01 Hayvan Yemi 10 57,92 87,01 110,57 İçin 20 47,57 73,93 96,13 k=0.052 k=0.044 k=0.040 İnsan 2 106,36 141,77 173,27 Tüketimi İçin 5 88,74 120,94 150, ,74 120,94 150,36 Hayvan Yemi 10 75,41 105,19 133,04 İçin 20 62,08 89,44 115,71 Çizelge 4.23 de görüldüğü üzere 500, 1000 ve 2000 ng g -1 AFB 1 içeren fındıkların aflatoksin seviyesinin 2 ng g -1 a düşebilmesi için gereken süre, öğütülmüş fındıklarda ile saat; bütün fındıklarda ise ile saat arasında değişmektedir. Fındıkların hayvan yemi olarak kullanılabilmesi için gerekli olan inkübasyon sürelerinin ile saat arasında değiştiği tespit edilmiştir. 115

133 5. SONUÇ VE ÖNERİLER Bülent ZORLUGENÇ 5. SONUÇ VE ÖNERİLER Küfler bir çok tarımsal üründe; hasat öncesinde ve sonrasında, depolama süresince veya bu ürünlerin gıda ve hayvan yemi olarak işlenmeleri sırasında doğal olarak gelişmektedirler. Küflerin ikincil metabolitleri olan mikotoksinlerin yarattığı ekonomik ve sağlık sorunlarının farkına varılarak çeşitli önlemlerin alınmasının önemi büyüktür. Mikotoksin sorununun çözümünde ilk hedef bu toksinlerin oluşumunun önlenmesi olmalıdır. Nevarki, mikotoksin oluşumunun hasat öncesinde, depolama ve işleme sırasında önlenmesi her zaman mümkün olmamaktadır. Bu nedenle, mikotoksinlerin degradasyon ve detoksifikasyon yöntemleri ile miktarlarının azalması veya daha az tehlikeli ya da tehlikesiz ürünlere dönüşümünü sağlayacak yöntemlerin geliştirilmesi büyük öneme sahiptir. Bu amaçla çalışmada, F. aurantiacum NRRL B-184 bakteri suşunun PFT ortamında ve çeşitli gıda ürünlerinde AFB 1 in detoksifikasyonu üzerine etkisi araştırılmıştır. Çalışmadan elde edilen bulgulara göre; F. aurantiacum NRRL B-184 suşunun 30 o C de TSB besiyerindeki gelişme eğrisi elde edilmiş ayrıca doğrusal olmayan regresyon analizi sonuçlarına göre gelişme eğrisini tanımlamada Modifiye Gompertz modelinin daha uygun olduğu sonucuna varılmıştır. Modelden elde edilen verilere göre, F. aurantiacum NRRL B-184 suşunun maksimum spesifik gelişme hızının saat -1, lag süresinin ise saat olduğu hesaplanmıştır. Ayrıca başlangıç hücre sayısı 1.32 x 10 7 kob ml -1 olan F. aurantiacum NRRL B-184 suşunun bir saatlik periyotlar içerisinde bir önceki popülasyonu %7.3 oranında aşacak şekilde gelişerek 45 saatte 2.7 log luk bir artışla durgun faza geçtiği ve 95. saat sonunda hala durgun fazda olduğu belirlenmiştir. F. aurantiacum NRRL B-184 suşu aşılanmamış kontrol örneklerinin inkübasyon süresince aflatoksin miktarlarında önemli bir değişim belirlenmemiştir. Ancak durgun fazda 10 7 kob ml -1 F. aurantiacum NRRL B-184 suşu aşılanmış olan PFT çözeltisi ile kırmızı biber, mısır, siyah zeytin, soya fasulyesi, kuru incir ve fındık 116

134 5. SONUÇ VE ÖNERİLER Bülent ZORLUGENÇ ortamlarında, konsantrasyon ve boyut farkı olmaksızın aflatoksin miktarında sürekli bir azalma gerçekleşmiştir. Bu durum meydana gelen azalmanın F. aurantiacum NRRL B-184 hücrelerinin bir faaliyeti sonucu olduğunu göstermektedir. F. aurantiacum NRRL B-184 suşu aşılanmış PFT ve gıda ortamlarındaki azalmanın Birinci Dereceden Reaksiyon Kinetiğine uygun olduğu tespit edilmiştir. Birinci derece reaksiyon kinetiği modeline göre, birim zamanda konsantrasyonun oransal olarak azalış hızını gösteren k değeri en yüksek PFT ortamlarında bulunmuş ve bunu öğütülmüş ürünlerde genel itibariyle incir, bütün ürünlerde ise siyah zeytin izlemiştir. Öğütülmüş ve bütün haldeki ürünlerde çalışılan tüm aflatoksin konsantrasyonlarında en düşük k değerlerine soya fasulyesi örnekleri sahip olmuştur. Aflatoksin konsantrasyonunun artmasının ve ürünlerin bütün halde olmalarının k değerlerinde genel olarak azalmaya neden olduğu görülmüştür. 72 saatlik inkübasyon sonunda 500 ng g -1 AFB 1 içeren öğütülmüş kırmızı biber, 500 ng g -1 AFB 1 içeren öğütülmüş kuru incir ile 500 ve 1000 ng g -1 AFB 1 içeren öğütülmüş fındık örneklerinde Türk Gıda Kodeksinde bu ürünlerin insan gıdası olarak kullanılması durumunda izin verilen AFB 1 düzeylerine ulaşılabilmiştir. Bu süre sonunda; 500 ile 1000 ng g -1 AFB 1 içeren öğütülmüş ve 500 ng g -1 AFB 1 içeren bütün kırmızı biber örnekleri, 500 ng g -1 AFB 1 içeren öğütülmüş mısır örnekleri, 500, 1000 ve 2000 ng g -1 AFB 1 içeren öğütülmüş ve 500 ng g -1 AFB 1 içeren bütün haldeki zeytin örnekleri, 500 ve 1000 ng g -1 AFB 1 içeren öğütülmüş ve 500 ng g -1 AFB 1 içeren bütün haldeki kuru incirler ile 500, 1000 ve 2000 ng g -1 AFB 1 içeren öğütülmüş ve 500 ile 1000 ng g -1 AFB 1 içeren bütün haldeki fındıkların AFB 1 düzeyleri Yemlerde İstenmeyen Maddeler Hakkındaki Tebliğ de hayvan yemi için belirtilen limitlerin altına düşmüştür. Birinci dereceden reaksiyon kinetiğine ait model parametrelerinden yararlanılarak 10 7 kob ml -1 F. aurantiacum NRRL B-184 kültürü kullanılması durumunda örneklerin AFB 1 içeriklerinin Türk Gıda Kodeksinde bu ürünler için belirtilmiş olan 5 ng g -1 a düşürülebilmesi için ürün çeşidine bakılmaksızın öğütülmüş örneklerde saat, bütün haldeki örneklerde ise saatin gerekebileceği hesaplanmıştır. AFB 1 içeriklerinin 2 ng g -1 a düşürülebilmesi için öğütülmüş örneklerin saat ve bütün haldeki örneklerin ise saat 117

135 5. SONUÇ VE ÖNERİLER Bülent ZORLUGENÇ süreyle F. aurantiacum NRRL B-184 suşu ile inkübe edilmesinin gerekebileceği belirlenmiştir. Bu çalışmadan elde edilen sonuçlara göre; Kırmızı biber, mısır, zeytin, soya fasulyesi, kuru incir ve fındıklarda bulunan AFB 1 i uzaklaştırmada F. aurantiacum NRRL B-184 suşundan yararlanılabileceğini göstermektedir. Bu yöntemin ticari olarak uygulanabilir bir yöntem olarak kabul edilebilmesi için öncelikle detoksifiye edilen ürünlerde yeni toksik bileşiklerin oluşup oluşmadığının daha ileri analiz teknikleri veya hayvan deneyleri ile açıklığa kavuşturulması gerekmektedir. Bu bakteri ile yapılmış daha önceki çalışmalar dikkate alındığında, detoksifikasyon süresinin kısaltılabilmesi için kullanılan bakteri sayısının artırılması önerilebilir. Aflatoksin içeren bir üründe; başka mikotoksinlerin de var olabileceği düşünülerek, bu bakterinin diğer mikotoksinler üzerine etkileri de araştırılmalıdır. Ayrıca, F. aurantiacum B-184 suşunun aflatoksini enzimatik olarak detoksifiye ettiği düşünülürse, ileri genetik çalışmalar ile bu enzim veya enzimlerin üretimi ile ilgili genlerin başka mikoorganizmalara (starter kültürler gibi) ya da toksin sorunu yaşanan bitkilere aktarılması durumunda aflatoksin sorununa çözüm olabileceği düşünülmektedir. 118

136 6. KAYNAKLAR ADAMS, M.R., MOSS, M.O., Food Microbiology. The Royal Society of Chemistry. Cambridge. p: AHMED, M.A., SHAMSUDDING, Z.A., KHAN, B.A., Elimination of Naturally Occurring Aflatoxins in Cottonseed Meal. Pak, J. Sci. Ind. Res., 39, AIKAWA K., KOMATSU Y., Antimutagenic Effects of Autoxidized Linoleic and Oleic Acids on UV-induced Mutagenesis in Escherichia coli. Agric. Biol. Chem., 51(10), AIKAWA K., Effect of s-9 Mmix on Antimutagenic Activity of Autoxidized Linoleic Acid, Agric. Biol. Chem., 52(8), ALTUG, T., YOUSEF, A.E., MARTIN, E.H., Degradation of Aflatoxin B 1 in Dried Figs by Sodium Bisulfite with or without Heat, Ultraviolet Energy or Hydrogen Peroxide. J. Food Prot., 53, , 628. ALTUĞ, G., Laboratuar Ortamında Aflatoksin Üretimi ve Aspergillus spp nin Plasmid Transferine Etkisinin Araştırılması. Ç.Ü. Fen Bilimleri Enstitüsü Yüksek Lisans Tezi. Adana. 39s. ANONİM, Laboratuvar Analiz Föyü. Tarım Orman ve Köyişleri Bakanlığı. İl Kontrol Laboratuvarı. Adana. ANONİM, Discussion Paper on Aflatoxins in Pistachios. Codex Alimentarius Commission. CX/FAC 02/22. Joint FAO/WHO Food Standards Programme Rotterdam, Netherlands. AOAC, AOAC Official Method Aflatoxin B 1 and Total Aflatoxins in Peanut Butter, Pistachio Paste, Fig Paste, and Paprika Powder. Immunoaffinity Column Liquid Chromatography with Post-Column Derivatization First Action

137 ARRIOLA, M.C., PORRES, E de, CABRERA, S de, ZEPEDA, M de, ROLZ, C., Aflatoxin Fate During Alkaline Cooking of Corn for Tortilla Preparation. J. Agr. Food Chem., 36: BAHAR, M.B., ALTUĞ, T., Kontamine Kuru İncirlerden İki Farklı Teknikle Elde Edilen İncir Pekmezlerine Aflatoksin Geçiş Düzeylerinin İncelenmesi. Gıda Mühendisliği III. Ulusal Sempozyumu Araştırmaları, s: Ankara. BANDARA, J.M.R.S., VİTHANEGE, A.K., BEAN, G.A., Effect of Parboiling and Bran Removal on Aflatoxin Levels in Sri Lankan Rice, Mycopathologia, 115, BANWART, G.J., Basic Food Microbiology. Second Edition, Published by Van Nostiond Reinhold, New York-Tokyo, BATA, A., LASZTITY, R., Detoxification of Mycotoxin-Contaminated Food and Feed By Microorganisms. Trends in Food Sci. & Tech. 10: BURGOS-HERNANDEZ, A., JORGENSEN KORNMAN, K., PRICE, R.L., Detoxification of Aflatoxin-Contaminated Corn by Ammonium Persulfate and The Effect of Three Peroxides on The Ethanol Production in a Fermentation Process IFT Annual Meeting, Book of Abstracts, p.27, ISSN BURGOS-HERNANDEZ, A., PRICE, R.L., JORGENSEN-KORNMAN, K., LOPEZ-GARCIA, R., NJAPAU, H., PARK, D.L., Decontamination of Aflatoxin B 1 Contaminated Corn by Ammoniation Persulphate During Fermentation. J. Sci. Food Agric., 82, CHATTERJEE, D., MUKHERJEE, S.K., Destruction of Phagocytosissuppressing Activity of Aflatoxin B 1 by Ozone. Lett. Appl. Microbiol., 17: CIEGLER, A., LILLEHOJ, E.B., PETERSON, R.E., HALL, H.H., Microbial Detoxification of Aflatoxin. Applied Microbiology. 4 (6):

138 ÇOKSÖYLER, N., Türkiye de Mikotoksin Problemi. II. Gıda Mühendisligi Kongresi Eylül 1994 Gaziantep. s: D SOUZA, D.H., BRACKETT, R.E., The Role of Metal Ions in Aflatoxin B 1 Degradation by Flavobacterium aurantiacum. J. of Food Prot. 61 (12) D SOUZA, D.H., BRACKETT, R.E., The Influence of Divalent Cations and Chelators on Aflatoxin B 1 Degradation by Flavobacterium aurantiacum. J. of Food Prot. 63 (1) D SOUZA, D.H., BRACKKETT, R.E., Aflatoxin B 1 degradation by F. aurantiacum in the Presence of Reducing Conditions and Seryl and Sulfhydryl Group Inhibitors. J. of Food Prot. 64(2), DAS, C., MISHRA, H.N., Effect of Aflatoxin B 1 Detoxification on Physicochemical Properties and Quality of Ground Nut Meal. Food Chemistry. (70): DEACON, J. W., Modern Mycology. Third Edition, Blackwell Science Ltd. 303 p. DETROY, R. W., LILLEHOJ, E. B., CIEGLER, A., Aflatoxin and Related Compounds. In: A. Ciegler, S. Kadis & S. J. Ajl, eds. Microbial Toxins 8, Academic Press, New York. DOLLEAR, F.B., MANN, G.E., CODIFER, L.P., GARDNER, Jr.H.K., KOLTUN, Jr.S.P., VIX, H.L.E, Elimination of Aflatoxins from Peanut Meal. J. Am. Oil Chem. Soc. 45: DOYLE, M.P., APPLEBAUM, R.S., BRACKETT, R.E., MARTH, E.M., Physical, Chemical and Biological Degradation of Mycotoxins in Foods and Agricultural Commodities. J. Food Prot., 45: DOYLE, M.P., BEUCHAT, L.R., MONTVILLE, T.J., Food Microbiology Fundementals and Frontiers. 768p. 121

139 DOYLE, M.P., MARTH, E.H., Bisulfite Degrades Aflatoxin: Effect of Temperature and Concentration of Bisulfite. J. Food Prot. 41: DRAUGHON, F.A., CHILDS, E.A., Chemical and Biological Evaluation of Aflatoxin After Treatment with Sodium Hypochlorite, Sodium Hydroxide and Ammonium Hydroxide. J.Food Prot. 45: DVORACKOVA, I., Aflatoxin Inhalation and Alveolar Cell Carcinoma. Br. Med. J., 1:691. DWARAKANTTH, C.T., RAYNER, E.T., MANN, G.E., DOLLER, F.G., Reduction of Aflatoxin Level in Cottonseed and Peanut Meals by Ozonation. J. Am. Oil. Chem. Soc. 45: EC, Commission Regulation (EC) No 2006R1881 of Setting Maximum Levels for Certain Contaminants in Foodstuffs. ELEY, R.A., Microbial Food Poising. Chapmen & Hall London. 211p. EL-NEZAMI, H., KANKAANPAA, P., SALMINEN, S., AHOKAS, J., 1998a. Physicochemical Alterations Enhance the Ability of Dairy Strains of Lactic Acid Bacteria to Remove Aflatoxin from Contaminated Media, J. Food Prot., 61(4), EL-NEZAMI, H., KANKAANPAA, P., SALMINEN, S., AHOKAS, J., 1998b. Ability of Lactic Acid Bacteria to Bind a Common Food Carcinogen, Aflatoxin B 1, Food Chem. Toxicol., 36(4), EL-NEZAMI, H., MYKKANEN, H., KANKAANPAA, P., SALMINEN, S., AHOKAS, J., Ability of Lactobacillus and Propionibacterium Strains to Remove Aflatoxin B 1 from the Chicken Duodenum. J. Food Prot.., 63(4), EPSOY, H.M., Detoxification of Corn Containing Aflatoxin by Teratment with Calcium Hydroxide (Alınmıştır, Özay,1988. Gıdalarda Mikotoksinler ve Detoksifikasyonu. Gıda (13) ). U.S. Patent, 3, 689,

140 FAO, Sampling Plans for Aflatoxin Analysis in Peanut and Corn. Food and Agriculture Organization of The United Nations.Report of an FAO Technical Consultation Rome, 3,6 May p. GALVANO, F., PIVA, A., GALVANO, G., Dietary Strategies to Counteract the Effects of Mycotoxins: A Review. J.Food Prot., 64: GARDNER, H.K. JR., KOLTUN, S.P., DOLLEAR, F.G., RAYNER, E.T., Inactivation of Aflatoxins in Peanut and Cottonseed Meals by Ammoniation J. Am. Oil Chem. Soc. 48, GARDNER, H.K. JR., KOLTUN, S.P., H.L.E. VIX, Solvent Extraction of Aflatoxins from Oilseed Meals. J. Agric. Food Chem., GHOSH, M.K., CHHABRA, A., Aflatoxin Detoxification in Naturally Contaminated Groundnut Cake. Indian J. Animal Nutr., 12, GIANNUZZI, L., PINOTTI, A., ZARITZKY, N., Modelling of Microbial Growth in Potato Homogenate. J.Sci.Food.Agric. 73, GOLDBLATT, L.A., DOLLEAR, F.G., Detoxification of Contaminated Crops: Mycotoxins in Human and Animal Health. Rodricks, J.V., Hesseltine, C.W., Mehlman, M.A. (Eds.), Pathotox Publishers, Inc., Park Forest South, Ilinois. p: GÖZÜKARA, E.M., Biyokimya, 2. Cilt, 3.Baskı, Nobel Tıp Kitapevleri, 1225s. GROOPMAN, J.D., CAIN, L.G., KENSLER, T.W., Aflatoxin Exposure in Human Populations: Measurements and Relationship to Cancer. Crit. Rev. Toxicol., 19: GÜRGÜN, V., HALKMAN, A.K., Mikrobiyolojide Sayım yöntemleri, Gıda Teknolojisi Derneği Yayın No:7. 2. Baskı. Basım&Grafik. 146s. Ankara. HAGLER, W.N., HUTCHINS, Jr.J.E., HAMILTON, P.B., Destruction of Aflatoxin B 1 with Sodium Bisulfite: Isolation of the Major Product Aflatoxin B 1 S. J.Food Prot. 46:

141 HAO, Y.Y., BRACKETT, R.E., Removal of Aflatoxin B 1 from Peanut Milk Inoculated with F. aurantiacum. J. Food Prot., 53(5), HAO, Y.Y., BRACKETT, R.E., Growth and Survival of F. aurantiacum in Peanut Milk. J. Food Prot. 52(3) HASAN, H.A.H., Destruction of Aflatoxin B 1 on Sorghum Grain with Acids, Salts and Ammonia Derivatives, Crypogamie Mycol., 17, HASKARD, C.A., EL-NAZEMI, H., KANKAANPAA, P., SALMINEN, S., AHOKAS, J.T., Surface Binding of Aflatoxin B 1 by Lactic Acid Bacteria, Appl. Environ. Microbiol., 67(7), HAWORTH, S.R., LAWLOR, T.E., ZEIGER, E., PARK, D.L., Mutagenic Potential of Ammonia-related Aflatoxin Reaction Products in a Model System. J.Am.Oil Chem.Soc., 66: HAYES, R.B., Aflatoxin Exposures in the Industrial Setting: an Epidemiological Study of Mortality. Food Chem. Toxicol., 22: HEATHCOTE, J.G., HIBBERT, J.R., Aflatoxin Chemical and Biological Aspects. Elsevier Scientific Publishing Company, Amsterdam, Netherlands, 212p. HO, K.I., SOOK, C.H., WHA, M.T., Constituents of Antimutagenic Factor from Brown Rice. Agric. Chem. Biotechnol., 38(5), HOCKING, A.D., Toxigenic Aspergillus Species. (Edited by Doyle, L.R.;Beuchat, T.J.) Montuille Food Microbiology Fundamentals and Frontiers. Chapter21. p: HOLMES, B., OWEN, R.J., Mc MEEKIN, T.A., Bergey s Manuel Systematic Bacteriology, Vol.1, Krieg, N.r.; Holt, J.G. (Eds), The Williams & Wilkins Company, Baltimore, p: HUFF, W.E., HAGLER, Jr.W.M., Evaluation of Density Segregation as a Means to Estimate the Degree of Aflatoxin Contamination of Corn. Cereal Chem., 59:

142 HUSSEIN, H.S., BRASEL, J.M., Toxicity, Metabolism and Impact of Mycotoxins on Humans and Animals. Toxicol., 167: İÇ, E., YAVAŞ, İ., Şaraplarda Aflatoksin Miktarı Üzerine Bir Araştırma. Gıda (5) JAIMEZ, J., FENTE, C.A., VAZQUEZ, B.I., FRANCO, C.M., CEPEDA, A., MAHUZIER, G., PROGNON, P., Application of the Assay of Aflatoxins by Liquid Chromatography with Floroscence Detection in Food Analysis. Journal of Chromatography a. 882:1-10. JAY, J.M., Modern Food Microbiology. Chapmen and Hall. London. 675p. JOHNSON, A.H., PETERSON, M.S., Encyclopedia of Food Technology. Vol. 2. The Avi Publishing Company Westport-Connecticut. p: KALAYCIOĞLU, L., SERPEK, B., NİZAMLIOĞLU, M., BAŞPINAR, N., TİFTİK, A.M., Biyokimya. Selçuk Üniversitesi, Veteriner Fakültesi Yayınevi, ISBN: , Konya, 781s. KARADENİZ, F., EKŞİ, A Gıdalarda Mikotoksin Oluşumu ve Azaltılması. Dünya Gıda. 7-8: KING, J.M., PRUDENTE, Jr.A.D., Chemical Detoxification of Aflatoxins in Food and Feeds (Edited by Hamed K. Abbas). Aflatoxin and Food Safety CRC Press, ISBN , p: LAWLOR, T.E., HAWORT, S.R., ZEIGLER,E., PARK, D.L., LEE, L.S., Mutagenic Potential of Ammonia-related Aflatoxin Reaction Products in Cottonseed Meal. J. Am. Oil Chem. Soc., 62: LEE, L.S. KOLTUN, S.P., STANLEY, J.B., Ammoniation of Aflatoxin B 1 in a Pressure Chamber Used to Decontaminate Toxin Containing Cottonseed Meal, J. AOCS, 61, LILLEHOJ, E.B., CIEGLER, A., HALL, H.H., Aflatoxin B 1 Uptake by F. aurantiacum. J. Bacteriology. 93(1),

143 LILLEHOJ, E. B., STUBBLEFIELD, R. D., SHANNON, G. M., SHOTWELL, O. L., Aflatoxin M 1 from aqueous solutions by Flavobacterium aurantiacum. Mycopathologia and Mycologia Applicata, 45, LIN, L., ZHANG, J., WANG, P., WANG, Y., CHEN, J., Thin-Layer Chromatography of Mycotoxins and Comparison with Other Chromatographic Methods. Journal of Chromatography A, 815 (1998) LINE, J. E., BRACKETT, R. E., 1995a. Factors Affecting Aflatoxin B 1 Removal by Flavobacterium aurantiacum. J. Food Prot. Vol:58, No:1 p: LINE, J. E., BRACKETT, R. E., 1995b. Role of Toxin Concentration and Second Carbon Source in Microbial Transformation of Aflatoxin B 1 by Flavobacterium aurantiacum. J. Food Prot. Vol:58, No:9 p: LINE, J.E., BRACKETT, R.E., WILKINSON R.E., Evidence for Degradation of Aflatoxin B 1 by F. aurantiacum, J. Food Prot., 57(1), LURIE, J., Handbook of Ansalytical Chemistry (translated from Russian by Nicholas Bobrow), MIR Publishers, Moscow, USSR, 488p. MACE, K., Aflatoxin B 1 -induced DNA Adduct Formation and p53 Mutations in CYP-450-expressing Human Liver Cell Lines. Carcinogenesis, 18: MAEBA, H., TAKAMOTO, Y., KAMIMURA, M., MIURA, T., Destruction and Detoxification of Aflatoxins with Ozone, J. Food Sci., 53, MANN, R., REHM, H.J., Degradation Products from Aflatoxin B 1 by Corynebacterium rubrum, Aspergillus niger, Trichoderma viride and Mucor ambiguous, Eur. J. Appl.Microbiol., 2, MARTINS, M.L., MARTINS, H.M., Naturel and In Vitro Co-pruduction of Cyclopiazionic Acid and Aflatoxins. J.Food Prot. Volume 62 No:3, p:

144 McKENZIE, K.S., SARR, A.B., MAYURA, K., BAILEY, R.H., MILLER, D.R., ROGERS, T.D., NORRED, W.P., VOSS, K.A., PLATTNER, R.D., KUBENA, L.F., PHILIPS, T.D., Oxidative Degradation and Detoxification Using a Novel Source of Ozone. Food Chem.Toxicol., 35: McKENZIE, K.S., KUBENA, L.F., DENVIR, A.J., ROGERS, T.D., HITCHENS, G.D., BAILEY, R.H., HARVEY, R.B., BUCKLEY, S.A., PHILLIPS, T.D., Aflatoxicosis in Turkey Poults is Prevented by Treatment of Naturally Contaminated Corn with Ozone Generated by Electrolysis, Poultry Sci., 77, McLEAN, M., DUTTON, M.F., Cellular Interactions and Metabolism of Aflatoxin: an Update. Pharmac Ther. Vol.65, p: MERCADO, C.J., REAL, M.P.N., ROSARIO, R.R. DEL, Chemical Detoxification of Aflatoxin Containing Copra. J. Food Science, 56 (3) MILLER, N., PRETORIOUS, H.E., TRINDER, D.W., Determination of Aflatoxins in Vegetable Oils. J. Assoc. Off. Ana. Chem. 68: MOERCK, K.E., McELFRESH, P.A., WOHLMAN, HILTON, B.W., Aflatoxin Destruction in Corn Using Sodium Bisulfite, Sodium Hydroxide and Aqueous Ammonia. J. Food Prot. 43: MOSS, M.O., Secondory Metabolism and Food Intoxification, Moulds. J.Applied Bact. Symposium Supplement. 73: NELSON, D.B., Aflatoxins and Reye s Syndrome: a Case Control Study. Pediatrics, 66: NOUT, M.J.R., Effect of Rhizopus and Neurospora spp. on Growth of Aspergillus flavus and A. parasiticus and Accumulation of Aflatoxin B 1 in Groundnut. Mycol. Res. 93,

145 OATLEY, J.T., RARICK, M.D., JI, G.E., LINZ, J. E., Binding of Aflatoxin B 1 to Bifidobacteria in Vitro, J. Food Prot. 63(8), OMAYE, S.T., Food and Nutritional Toxicology. CRC Press, ISBN , 308p. ÖZAY, G Gıdalarda Mikotoksinler ve Detoksifikasyonu. Gıda (13) ÖZKARSLI, M., Yer Fıstıklarında AFB 1 Üzerine Geleneksel Kavurma ve Mikrodalgada Kavurmanın Etkisi. Çukurova Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Gıda Mühendisliği Anabilim Dalı. Yüksek Lisans Tezi. 81s. ÖZKAYA, Ş., Ülkemizde Aflatoksin Sorunu Yaşanan Bazı Gıdalarda AFB 1 in Azaltılması veya Giderilmesinde Flavobacterium aurantiacum un Etkinliğinin Araştırılması. Hacettepe Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Gıda Mühendisliği Anabilim Dalı. Doktora Tezi. Ankara. 86s. ÖZKAYA, Ş., TAYDAŞ, E. E., BAŞARAN, A., AVCI, B., HIZLI, S., Mikotoksin Kurs Notları. Tarım Orman ve Köy İşleri Bakanlığı, Ankara İl Kontrol Labaratuvarı 7-14 Ağustos Mikotoksin Analiz Kursu. Ankara. PAPP, E., H-OTTA, K., ZAROY, G., MINSOVICS, E., Liquid Chromotografic Determination of Aflatoxins. Microchemical Journal. (73): PARK, D.L., Controlling Aflatoxin in Food and Feed. Food Tech.. 47: PARK, D.L., JEMMALI, M., FRAYSSINET, C., LA-FARGE- FRAYSSINET, C., YVON, M., Decontamination of Aflatoxin-contaminated Peanut Meal Using Monomethylamine-calcium Hydroxide. J. Am. Oil Chem. Soc. 58: PARK, D.L., LEE, L.S., KOLTUN, S.P., Distribution of Ammonia Treated Aflatoxin Reaction Products in Cottonseed Meal. J. Am. Oil Chem. Soc. 61: PARK, D.L., NJAPAU, H., Contamination Issues and Padding. J. Am. Oil Chem. Soc., 66:

146 PARKER, W.A., MELNICK, D., Absence of Aflatoxin from Refined Vegetable Oils. J. Am. Oil Chem. Soc., 43, PELTONEN, K., EL NEZAMI, H., SALMINEN, S., AHOKAS, J., Binding of Aflatoxin B 1 by Probiotic Bacteria. J.Food and Agric., 80: PITT, J.I., Toxigenic fungi: Which are Important? Medical Mycology, 38: PIVA, G., GALVANO, F., PIETRI, A., PIVA, A., Detoxification Methods of Aflatoxin. A Review. Nutr. Res., 15(5): PLACINTA, C.M., D MELLO, J.P.F., Mac DONALDS, A.M.C., A Review of Worldwide Contamination of Cereal Grains and Animal Feed with Fusarium Mycotoxins. Anim. Feed Sci. Technol., 78: PONS, Jr.W.A., CUCULLU, A.F., LEE, L.S., JANSSEN, H.J., GOLDBLATT, L.A., Kinetic Study of Acid Catalyzed Conversion of Aflatoxin B 1 and G 1 to B 2a and G 2a. J.Am.Oil Chem.Soc. 49: PREIDES, M., EL NEZAMI, H., PELTANEN, K., SALMINEN, S., AHOKAS, J., Ability of Dairy Strains of Lactic Acid Bacteria to Bind AFM 1 in a Food Model. J.Food Prot.. Vol. 63, No.65, p: PRICE, R.L., JORGERSEN, K.V., Effects of Processing on Aflatoxin Levels and on Mutagenic Potential of Tortillas Made from Naturaly Contamined Corn. J.Food Sci., 50: PRUDENTE, A.D., KING, J.M., Efficacy and Safety Evaluation of Ozonation to Degrade Aflatoxin in Corn. J. Food Sci., 67(8), RESMI GAZETE, Yemlerde İstenmeyen Maddeler Hakkında Tebliğ. Tebliğ No: 2008/34. Resmi Gazete RICHARD, J. L., Some Major Mycotoxins and their Mycotoxicoses-An Overview. International J.Food Microbiology, 119:

147 RUSTOM, I. Y. S., Aflatoxin in Food and Feed: Occurrence, Legislation and Inactivation by Physical methods. Food Chem., Vol. 59 No. 1, p: SAMARAJEEWA, U., GAMAGE, T.V., Combination of Solvent and Radiation Effects on Degradation of Aflatoxin B 1. Mircen J. Appll. Microbiol. Biotechnol. 4: SAMARAJEEWA, U., SEN, A.C., COHEN, M.D., WEI, C.I., Detoxification of Aflatoxins in Foods and Feeds by Physical and Chemical Methods. J.Food Prot., 53(6): SCOTT, P.M., Industrial and Farm Detoxification Methods of Aflatoxins. A Review. Nutr. Res., 15: SHANK, R.C., Aflatoxins in Autopsy of Specimens from Thai Children with an Acute Disease of Unknown Etiology. Food Cosmet. Toxicol., 9: SHANK, R.C., Epidemiology of Aflatoxin Carcino Genesis, in Environmental Cancer (Kraybill, H.F. and Mehlman, M.A., Eds.). John Wiley & Sons, New York, p: SHANK, R.C.,1981. Mycotoxins and N-Nitroso Compounds: Environmental Risks. Vol. I, Shank, R.C., Ed., CRC Press, Boca Raton, FL, pp SHANTHA, T., Fungal Degradation of Aflatoxin B 1, Nat. Toxins, 7(5), SHAPIRA, R.; PASTER, P., Control of Mycotoxins in Storage and Techniques for Their Decontamination (Edited by N. Magan and M. Olsen), Mycotoxins in Food: Detection and Control, CRC Press Boca Raton Boston New York Washington, DC, p: SMILEY, R.D., DRAUGHON, F.A., Preliminary Evidence that Degradation of Aflatoxin B 1 by Flavobacterium is Enzymatic. J.Food Prot. 63(3), SMITH, J.E., Mycotoxins, (Edited by David H. Watson) Food Chemical Safety, CRC Press ISBN , p:

148 SORENSON, W.G., Aflatoxin in Respirable Corn Dust Particles. J. Toxicol. Environ. Health, 7: , STARK, A.A., Mechanisms of Action of Aflatoxin B 1 at the Biochemical and Molecular Levels. (Edited by Charles L. Wilson and Samir Droby.), Microbial Food Contamination. CRC Press. ISBN , p: SUZUKI, T., NORO, T., KAWAMURA, Y., FUKUNAGA, K., WATANABE, M., OHTA, M., SUGIUE, H., SATO, Y., KOHNO, M., HOTTA, K., Decontamination of Aflatoxin Forming Fungus and Elimination of Aflatoxin Mutagenicity with Electrolyzed NaCl Anode Solution. J. Agric. Food Chem., 50, SWEENEY, M.J., DOBSON, A.D.W., Molecular Biology of Mycotoxin Biosynthesis. FEMS Microbiology Letters. 175: ŞAHİN, İ., Mikrobiyolojiye Giriş. Eser Matbaası. 237s TAKASHI, T., Aflatoxin Contamination in Nutmeg: Analysis of Interfering TLC Spots. J.Food Sci.Vol. 58 No:1 p:197. TEBBUTT, P., Basic Mathematics For Chemists. John Willey&Songs, Chichester, England, 244p. TEMİZ, A., Genel Mikrobiyoloji Uygulama Teknikleri. Şafak Matbaacılık Ltd. Şti. Birinci Baskı.266s. Ankara. TENIOLA, O.D., ADDO, P.A., BROST, I.M., FÄRBER, P., JANY, K.D., ALBERTS, J.F., VAN ZYL, W.H., STEYN, P.S., HOLZAPFEL, W.H., Degradation of Aflatoxin B 1 by Cell-Free Extracts of Rhodococcus erythropolis and Mycobacterium fluoranthenivorans sp. nov. DSM44556T. International Journal of Food Microbiology, 105: TGK, Türk Gıda Kodeksi Gıda Maddelerindeki Bulaşanların Maksimum Limitleri Hakkında Tebliğ (TEBLİĞ NO: 2008/26) Resmi Gazete Tarihi: 16 Şubat Sayı :

149 TORRES, P., GOMEZ-ORTIZ, M., RAMIREZ-WENG, B., Revising the Role of ph and Thermal Treatments in Aflatoxin Content Reduction During the Tortilla and Deep Frying Processes. J. Agric. Food Chem., 49, TUNAİL, N., Mikrobiyel Enfeksiyonlar ve İntoksikasyonlar. (Editör: A.Ü.Z.F. Gıda Müh. Öğretim Üyeleri) Gıda Mikrobiyolojisi ve Uygulamaları. Geliştirilmiş 2. Baskı. Sim Matbaacılık Ltd. Şti. Ankara s: UENO, Y The Toxicology of Mycotoxins. Critical Reviews in Toxicology. 14(2): VAN GENDEREN, H Adverse Effects of Naturally Occurring Nonnutritive Substances (Edited by John De Vries). Food Safety and Toxicity, CRC Press, ISBN , p: VAN IMPE, J.F., NICOLAI, B.M, MARTENS, T., DE BAERDEMAEKER, J., VANDEWALLE, J., Dynamic Mathematical Model to Predict Microbial Growth and Inactivation during Food Processing, Appl. Environ. Microbiol., 58(9): VAN NIEUWENHUIZE, J.P., Aflatoxinen: Epidemiologish Onderzoek Naar Carcino Geniteit bij Langdurige Low Level Exposite van eon Fabriekspopulatie. T. Soc. Geneesk, 51: VAN RENSBURG, S.J., Role of Epidemiology in Causation of Mycotoxin Health Risk, in Mycotoxins in Human and Animal Health, Rodricks (J.V., Hesseltine, C.W., and Mehlman, M.A., Eds.) Pathotox, Park Forest South, IL, pp WANG, J.S., GROOPMAN, J.D., DNA Damage by Mycotoxins. Mutation Researh. 424: WATANABE, C.M.H., TOWNSEND, C.A., Initial Characterization of a ttype I Fatty Acid Synthase and Polyketide Synthase Multienzyme Complex NorS in the Biosynthesis of Aflatoxin B 1. Chem Biol. ;9 (9):

150 WATTANAPAT, R., NAKAYAMA, T., BEUCHAT, L.R., Characteristics of Acid Hydrolysate from Defatted Peanut Flour. J. Food Sci., 60, WATTS, B.M., YLIMAKI, G.L., JEFFERY, L.E., ELIAS, L.G., Basic Sensory Methods for Food Evaluation. The International Development Research Center Ottowa, Canada, 160p. WEEKS, O.B., Flavobacterium: Bergey s Manuel of Determinative Bacteriology, Vol:1, (Edited by Buchanan, R.E. and Gibbons, N.E.) The Williams & Wilkins Company, Baltimore, p: WEI, C.I., COOK, D.L., KIRK, J.R., Use of Chlorine Compounds in the Food Industry. Food Technol. 39: WENG, C.Y., MARTINEZ, A.J., PARK, D.L., Efficacy and Permanency of Ammonia Treatment in Reducing Aflatoxin Levels in Corn. Food Addit. Contamin. 11, WILLIAMS, K.R., DUTTON, M.F., Destruction of Aflatoxin During the Production of Hydrolysed Vegetable Protein, J. Food Prot., 51, YAGEN, B., HUTCHINS, J.E., COX, R.H., HAGLER, W.M., HAMILTON, P.B., Aflatoxin B 1 S: revised Structure for the Sodium Sulfanate Formed by Destruction of Aflatoxin B 1 with Sodium Bisulfite. J. Food Prot. 52: YASSIN, A.F., SCHAAL, K.P., Reclassification of Nocardia corynebacterioides Serrano et al (Approved Lists 1980) as Rhodococcus corynebacterioides comb. nov. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology (2005), 55, YILMAZ, A., ÖZAY, G., Gıda ve Yemlerde Mikotoksin Detoksifikasyonu. Gıda Dergisi, 7: ZORLUGENÇ, B., KIROĞLU ZORLUGENÇ, F., ÖZTEKİN, S., EVLİYA, İ.B., The Influence of Gaseous Ozone and Ozonated Water on 133

151 Microbial Flora and Degradation of Aflatoxin B 1 in Dried Figs. Food and Chem. Toxicology. 46, DOI: /j.fct ZWIETERING, M.H., JONGENBUGER, I., ROMBOUTS, F.M., VAN T RIET, K., Modelling of the Bacterial Growth Curve. Appl. Environ. Microbiol. 56:

152 ÖZGEÇMİŞ 1971 yılında Adana da doğdum. İlk ve orta öğrenimimi aynı şehirde tamamladım yılında Çukurova Üniversitesi Gıda Mühendisliği Bölümünü kazandım ve 1994 yılında bu bölümden mezun oldum. Aynı yıl Çukurova Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Gıda Mühendisliği Anabilim Dalında yüksek lisans öğrenimime başladım yılında Ç.Ü. F.B.E. Gıda Müh. Anabilim Dalında araştırma görevlisi olarak göreve başladım yılında yüksek lisans öğrenimi tamamladım ve aynı yıl Ç.Ü. F.B.E. Gıda Müh. Anabilim Dalında Doktora öğrenimine hak kazandım yılında doktora öğrenimime ara vererek askerlik görevimi tamamladım yılında, Ç.Ü. Ziraat Fakültesine mühendis olarak atandım. Halen Ç.Ü. Biyoteknoloji Merkezinde, Gıda Yüksek Mühendisi olarak çalışmaktayım. 135

153 EK-1 EKLER 2000 ng g -1 aflatoksin B 1 içeren 0. saat kontrol (öğütülmüş fındık) örneğine ait kromatogram 500 ng g -1 aflatoksin B 1 içeren 6. saat PFT örneğine ait kromatogram 136

154 EK ng g -1 aflatoksin B 1 içeren 24.saat bütün kırmızı biber örneğine ait kromatogram 1000 ng g -1 aflatoksin B 1 içeren 24. saat öğütülmüş kırmızı biber örneğine ait kromatogram 137

155 EK ng g -1 aflatoksin B 1 içeren 48. saat bütün mısır örneklerine ait kromatogram 500 ng g -1 aflatoksin B 1 içeren 6. saat bütün siyah zeytin örneğine ait kromatogram 138

156 EK ng g -1 aflatoksin B 1 içeren 12. saat bütün soya fasulyesine ait kromatogram 1000 ng g -1 aflatoksin B 1 içeren 12. saat öğütülmüş soya fasulyesine ait kromatogram 139

157 EK ng g -1 aflatoksin B 1 içeren 0. saat öğütülmüş kuru incir örneğine ait kromatogram 1000 ng g -1 aflatoksin B 1 içeren 12. saat bütün kuru incir örneğine ait kromatogram 140