ANYONİK POLİELEKTROLİTLERİN SIĞIR SERUM ALBUMİNLE ETKİLEŞİMİNİN FLORESANS YÖNTEMİ İLE İNCELENMESİ

Transkript

1 YILDIZ TEKNİK ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ANYONİK POLİELEKTROLİTLERİN SIĞIR SERUM ALBUMİNLE ETKİLEŞİMİNİN FLORESANS YÖNTEMİ İLE İNCELENMESİ Fizikçi Yasemin BUDAMA BATTAL FBE Biyomühendislik Anabilim Dalından Hazırlanan YÜKSEK LİSANS TEZİ Tez Danışmanı : Yrd. Doç. Dr. Zeynep AKDESTE (YTÜ) İSTANBUL, 2006 i

2 İÇİNDEKİLER ii Sayfa SİMGE LİSTESİ...iv KISALTMA LİSTESİ... v ŞEKİL LİSTESİ...vi ÖNSÖZ...ix ÖZET... x ABSTRACT...xi 1. GİRİŞ GENEL BİLGİ Işın ( Elektromagnetik Dalga) Absorpsiyon (Soğurma) Emisyon (Yayma) Lüminesans Jablonski Diyagramı Floresans Emisyonunda Ayna Görüntüsü Stokes Kanunu Floresans Ömrü ve Kuantum Verimi Floresansı Etkileyen Etkileyen Faktörler Floresansın Sönümü Floresans Spektroskopisi Floresans Spektrometre Floresans Spektrometre Sistemini Oluşturan Birimler Monokromatör Floresans Spektrometrenin Uygulama Alanları İdeal Spektroflorimetreler Işık Kaynakları Amino Asitler Proteinlerin Üç Boyutlu Yapısı Protein Floresansı Protein Floresansının Yaşam Süresi Polimer Polielektrolitler Homopolielektrolitler Poliamfolitler Albuminin Genel Özellikleri BSA nın Üç Boyutlu Yapısı UV-VIS Spektroskopisi Moleküler Eleme Kromatografisi DENEYSEL KISIM Kullanılan Cihazlar ve Kimyasal Malzemeler Kullanılan Cihazlar Kullanılan Kimyasal Maddeler... 41

3 3.2 PAA Titrasyonu BSA/PAA Kompleksleri Kullanılan Çözeltiler Komplekslerin Hazırlanışı Hesaplamalar UV-VIS Spektrofotometresi Ölçümleri Komplekslerin ph a Bağlı Türbidimetrik Titrasyonu Moleküler Eleme Kromatografisi Ölçümleri DENEY SONUÇLARI SONUÇLAR VE TARTIŞMA KAYNAKLAR ÖZGEÇMİŞ iii

4 SİMGE LİSTESİ m/s metre/saniye pm pikometre nm nanometre mm milimetre cm santimetre km kilometre ns nanosaniye W watt g gram M Molar mg miligram ml mililitre M w ağırlıkça-ortalama molekül ağırlığı n mol C Santigrat derece µl mikrolitre Hz hertz Å angström λ Dalga boyu λ max Maksimum dalga boyu I max Maksimum floresans şiddeti E 0 Elektronik enerji E υ Titreşimsel enerji E T Dönme enerjisi S 0 Temel hal S 1 Uyarılmış singlet hal pi İzoelektrik nokta P Işık şiddeti P 0 Gönderilen ışık şiddeti ε Molar soğurganlık C Konsantrasyon iv

5 KISALTMA LİSTESİ BSA Bovin serum albumin HSA Human serum albumin CH 3 COOH Asetik Asit HCl Hidroklorik Asit Na 2 HPO 4.7H 2 O Disodyum hidrojen fosfat heptahidrate NaCl Sodyum klorür NaH 2 PO 4.2H 2 O Sodyum dihidrojen fosfat dihidrate NaN 3 Sodyum azid PAA Poliakrilik Asit PSSNa Poli(sodyum stiren sülfonat) PMA Polimetakrilik asit PE Polielektrolit PMT Fotoçoğaltıcı UV Ultra Violet v

6 ŞEKİL LİSTESİ Şekil 2.1 Üç boyutlu uzayda elektromagnetik dalganın gösterimi... 3 Şekil 2.2 Işının sinüsoidal dalga olarak gösterimi... 4 Şekil 2.3 Elektromagnetik spektrum ve spektrum bölgelerinin sınıflandırılması. (Atkins P.W., 1998)... 4 Şekil 2.4 Temel halden uyarılmış hale geçişin ve uyarılmış halden temel dönüşlerin gösterimi.5 Şekil 2.5 Jablonski Diyagramı. (Lakowicz, J. R., 1999 )... 6 Şekil 2.6 Floresans emisyonunun ayna görüntüsü. (Lakowicz, J. R., 1999 )... 7 Şekil 2.7 Floresans spektrometre cihazı Şekil 2.8 (A) Lambanın güç kaynağı. (B) Sistemin güç kaynağı ve brytebox Şekil 2.9 Monokromatörün iç yapısındaki optik bileşenlerin şematik gösterimi Şekil 2.10 Uyarma monokromatörünün iç yapısının farklı açılardan görüntüleri Şekil 2.11 Floresans spektrometrenin örnek kompartmanın iç görüntüsü Şekil 2.12 Floresans spektrometre cihazının optik krokisi ve fiziksel boyutları. (1)lamba yuvası, (2)ayarlanabilir slitler, (3)uyarma monokromatörü, (4)örnek kompartmanı, (5)saptırıcı, (6)flitre tutucular, (7)uyarma/emisyon optikleri, (8)küvet tutucu, (9)emisyon shutter, (10)uyarma düzeltme, (11)emisyon monokromatörü, (12)PMT dedektörü. [1] Şekil 2.13 Floresans spektrometre cihazını oluşturan birimlerin ışık şiddeti ve dalgaboyuna bağlı kıyaslaması. (Lakowicz, J. R., 1999) Şekil 2.14 Amino asitlerin yapısının şematik gösterimi. [2] Atomları ve molekülleri birarada tutan çeşitli kimyasal bağlar vardır. Bu bağlar iyonik, kovalent ve zayıf bağlar olarak üçe ayrılır. Bunlardan kovalent bağlar, proteinlerin yapı taşı olan amino asitlerdeki atomları birarada tutarlar. Zayıf bağlar ise amino asit zincirini, katlanarak aldığı özel üç boyutlu biçimde sabit tutarlar Şekil 2.15 Hidrofobik moleküller arasındaki etkileşimin şematik gösterimi. [3] Şekil 2.16 Hidrofilik moleküllün şematik gösterimi. [3] Şekil 2.17 Atomları ve molekülleri bir arada tutan kimyasal bağların şematik gösterimi. (Gözükara, 1997) Şekil 2.18 Peptid bağınının şematik gösterimi. [3] Şekil 2.19 Proteinin üç boyutlu yapısının şematik gösterimi. (Barnes, 1985) Şekil 2.20 Birincil yapı Şekil 2.21 İkincil yapı Şekil 2.22 Üçülcül yapı Şekil 2.23 Miyoglobin proteininin üç boyutlu yapısı ve atomları arasındaki peptid grupları. (Watson, 1976) Şekil 2.24 Bir proteinin üç boyutlu yapısı. [3] Şekil 2.25 Aromatik aminoasitlerin floresans emisyon spektrumları Şekil 2.26 Aromatik aminoasitlerin floresans emisyon spektrumları Şekil 2.27 Polimer molekülünün monomer birimlerinin kovalent bağlarla bağlanması sonucu oluşumu Şekil 2.28 Poliakrilik asit Şekil 2.29 (a) poli(vinilpiridinyum), (b) sodyum polistiren sülfonat, (c)poli(diallildimetilamonyum klorür) (Dautzenberg vd., 1994) Şekil 2.30 Poli(akrilik asit)in sulu çözeltideki dissosiyasyonu Şekil 2.31 İki sentetik polielektrolitin kimyasal yapısı. Soldaki yapı poli(sodyum stiren sülfonat) (PSS) ve sağdaki ise poli(akrilik asit)tir (PAA). Her ikisi de negatif yüklü polielektrolitlerdir. PSS kuvvetli bir polielektrolitken PAA zayıf bir polielektrolittir [5] Şekil 2.32 (a) İntegral tipe örnek olarak lineer poli(etilen imin) ve (b) asılı tipe örnek olarak vi

7 poli(vinilamin) Şekil 2.33 Çözeltiye tuz ilavesi sonucu polielektrolit zincirinin yumak konformasyonunu alması [6] Şekil 2.34 Yüzsüz polimer ve polielektrolit için viskozite ve konsantrasyon ilişkisi Şekil 2.35 Proteinlerin ph a bağlı yük durumları Şekil 2.36 Albüminin polielektrolitler ile kompleks oluşturmasının şematik gösterimi. PMA (polimetakrilik asit), PSS (polisodyum sitrensülfonat). (Abe vd.,1994). 31 Şekil 2.37 BSA nın ph a bağlı yük değişimi Şekil 2.38 HSA-warfrain kompleksi ile genistein bağlanmasının moleküler gösterimi. (Evans SV, 1993) Şekil 2.39 S-Nitrosocysteine (Cys-NO) ve S-Nitrosoglutathione (GS-NO) nin yapısı. [7] Şekil 2.40 S-Nitroso Serum Albumin (BSA-NO) (Cys-34, Tyrosine, Tryptophan) [7] Şekil 2.41 Serum albumin molekülünün uzaydaki şeklinde bazik rezüdüler mavi, asidik rezüdüler kırımızı, nötral rezüdüler sarı gösterilmiştir. (A) önden görüntüsü, (B) arkadan görüntüsü, (C) soldan görüntüsü, and (D) sağdan görüntüsü (Carter and Ho, 1994) Şekil 2.42 Farklı ph değerlerinde (ph 4, ph 5, ph 7) PAA ve BSA nın sahip olduğu yüklerin şematik gösterimi Şekil 2.43 Çözeltideki Cu +2 iyonlarının değişik konsantrasyonlarında saf BSA nın (A) ve PE+BSA ([P50]/[BSA]=3,52) (B) karışımın içindeki BSA nın floresans spektrumu. BSA konsantrasyonu 0,71mg/mL, fosfat tamponu (ph=7). CuSO 4 konsantrasyonu (mm da) : 1,0.2; 2,0.15; 3,0.3; 4,0.45; 5,0.6; 6,0.9; 7,1.2; 8,1.536 Şekil 2.44 (A) Saf BSA nın ve (B) çözeltideki [Cu 2+ ] iyonlarının farklı konsantrasyonlarındaki poly(nipaam-aa)-bsa (P50/BSA=3,52) karışımları içindeki BSA nın floresans spektrumu. BSA konsantrasyonları 0,71mg/ml., fosfat tamponu (ph=7). CuSO 4 konsantrasyonları (mm da): 0(1),0.15(2), 0.3(3), 0.45(4), 0.6(5), 0.9(6), 1.2(7), 1.5(8). (Mustafaev, 2004) Şekil 2.45 Işık, c konsantrasyonunda, b cm kalınlığında bir ortamdan geçerken, absorbsiyon nedeniyle şiddeti I 0 dan I ya düşmüştür. (Çimen, 2006) Şekil 2.46 Kolon kromatografisinde molekül büyüklüğüne göre ayrılma ve alıkonma zamanına göre oluşan kromatogram. (Çimen, 2006) Şekil 4.1 ph=4.0 de hazırlanan BSA/PAA çözeltilerinin orana bağlı türbidimetrik titrasyonu. (Çimen, 2006) Şekil 4.2 ph=4.3 de hazırlanan BSA/PAA çözeltilerinin orana bağlı türbidimetrik titrasyonu. (Çimen, 2006) Şekil 4.3 ph=5.0 de hazırlanan BSA/PAA çözeltilerinin orana bağlı türbidimetrik titrasyonu. (Çimen, 2006) Şekil 4.4 ph=6.0 da hazırlanan BSA/PAA çözeltilerinin orana bağlı türbidimetrik titrasyonu. (Çimen, 2006) Şekil 4.5 ph=7.0 de hazırlanan BSA/PAA çözeltilerinin orana bağlı türbidimetrik titrasyonları. (Çimen, 2006) Şekil 4.6 ph=4.0, ph=4.3, ph=5.0, ph=6.0 ve ph=7.0 de hazırlanan BSA/PAA çözeltilerinin orana bağlı türbidimetrik titrasyonları. (Çimen, 2006) Şekil 4.7 ph 5.0 de değişik oranlarda hazırlanmış BSA, PAA ve BSA-PAA karışımlarının HPLC kromatogramları. nbsa/npaa= 0.1(1); 0.25(2); 0.4(3); 0.5(4); 0.75(5); 1.0(6) (Bölge I); nbsa/npaa= 2(1); 3(2); 5(3); 7.5(4); 10(5) (Bölge II); nbsa/npaa= 15(1); 20(2); 25(3); 35(4); 40(5) (Bölge III). (Akkılıç, 2006).. 49 Şekil 4.8 ph=4.0 de BSA-PAA karışımındaki artan BSA konsantrasyonu ile floresans şiddetinin (I max ) değişimi. n BSA /n PAA =0,05(1): 0,25(2): 0,5(3): 1(4): 2(5): ph=4.0 de BSA (6) Şekil 4.9 ph=4.3 de BSA-PAA karışımındaki artan BSA konsantrasyonu ile floresans vii

8 şiddetinin (I max ) değişimi. n BSA /n PAA =0,05(1): 0,25(2): 0,5(3): 1(4): 2(5): ph=4.3 de BSA (6) Şekil 4.10 ph=5.0 de BSA-PAA karışımındaki artan BSA konsantrasyonu ile floresans şiddetinin (I max ) değişimi. n BSA /n PAA =0,05(1): 0,25(2): 0,5(3): 1(4): 2(5): ph=5.0 de BSA (6) Şekil 4.11 ph=6.0 de BSA-PAA karışımındaki artan BSA konsantrasyonu ile floresans şiddetinin (I max ) değişimi. n BSA /n PAA =0,05(1): 0,25(2): 0,5(3): 1(4): 2(5): ph=6.0 de BSA (6) Şekil 4.12 ph=7.0 de BSA-PAA karışımındaki artan BSA konsantrasyonu ile floresans şiddetinin (I max ) değişimi. n BSA /n PAA =0,05(1): 0,25(2): 0,5(3): 1(4): 2(5): ph=7.0 de BSA (6) Şekil 4.13 BSA-PAA karışımlarının orana bağlı floresansının değişen ph lardaki grafiği. ph=4 (1): ph=5 (2): ph=6 (3): ph=7 (4) Şekil 4.14 BSA-PAA karışımlarının orana bağlı maksimum dalga boyunun değişen ph lardaki grafiği. ph=4 (1): ph=5 (2): ph=6 (3): ph=7 (4) Şekil 4.15 BSA-PAA karışımlarının orana bağlı dalga boyu farkının değişen ph lardaki grafiği. ph=4 (1): ph=5 (2): ph=6 (3): ph=7 (4) Şekil 4.16 BSA-PAA karışımlarının ph değerlerine bağlı dalga boyu farkının değişen BSA- PAA karışımları oranlarındaki grafiği. Oran=0,5 (1): Oran=1 (2): Oran=2 (3): Oran=4 (4): Oran=20 (5) Şekil 4.17 ph=4.0 de değişik oranlarda hazırlanan PAA ve BSA-PAA karışımlarının HPLC kromatogramları. n BSA /n PAA = 0.5(1); 1(2); 3(3); 5(4) at ph 4.0. (A); n BSA /n PAA = 25(1); 30(2); 35(3); 50(4) ph 4.0 de (B). (Akkılıç, 2006) Şekil 4.18 n BSA /n PAA =40 kompleksinin ph=4.0 deki fraksiyonlarının ve süpernatantının HPLC kromotogramları (A) (Akkılıç, 2006) ve 280nm dalgaboyundaki floresans ölçümleri; a: fraksiyon I, b: fraksiyon II ve c: n BSA /n PAA = 40 kompleksinin ph 4.0 deki supernatantı(b) Şekil 4.19 ph=4 de n BSA /n PAA =30,35,40,50 Pik I e ait alan değişimi. (Akkılıç, 2006) Şekil 4.20 ph=4.0 da saf BSA nın floresans spektrumu Şekil 4.21 n BSA /n PAA =40 kompleksinin ph=4.0 deki çöküntüsünün fraksiyonlarının dalgaboyuna bağlı floresans grafiği. Fraksiyon I (1), nbsa/npaa=40 (2), fraksiyon II (3), ph=4.0 de BSA (4) Şekil 5.1 ph 4 ve 4.3 te hazırlanan komplekslerin orana bağlı oluşumunda düşünülen model (Çimen, 2006) Şekil 5.2 ph 5 te oluşan polimer-protein kompleksi için düşünülen model. (Çimen, 2006) Şekil 5.3 ph=4 için BSA-PAA kompleksleşmesinin modeli viii

9 ÖNSÖZ Tez çalışmamın yapılmasının her aşamasında bilgisi ve becerisi ile beni yönlendiren, eşsiz desteği ile bana her konuda yardımcı olan, akademik kariyerimde bugüne gelmemde emeği mevcut değerli hocam ve danışmanım Biyomühendislik Bölümü Başkan Yardımcısı Yrd. Doç. Dr. Zeynep Akdeste ye, Engin bilgisi ve yapmış olduğu değerlendirmeleri ile çalışmamızın her yönde önünü açan, ileri laboratuar olanaklarını kullanabilme fırsatını bizlere sağlayan, çalışmalarımda bana her konuda destek olan, beni yönlendiren, geliştiren, bilgi, beceri ve tecrübelerini aktaran, tezimin hazırlanmasında değerli katkılarıyla bana yol gösteren ve akademik kariyerime adım atmamı sağlayan, bir ömür minnettar olacağım Yıldız Teknik Üniversitesi Biyomühendislik Bölümü Başkanı değerli hocam Prof. Dr. Mehmet Mustafa Akdeste ye, Biyomühendislik Bölüm Başkan Yardımcısı değerli hocam Prof. Dr. Huriye Kuzu ya, Fen Edebiyat Fakültesi Fizik Bölümü nde başladığım yüksek lisans eğitimimde bana destek olan, beni yönlendiren ve Biyomühendislik Bölümü ne geçmemde bana yol gösteren değerli hocam Doç. Dr. Hikmet Yükselici ye, Yıldız Teknik Üniversitesi Biyomühendislik Bölümü Laboratuvarları ndaki tez çalışmalarım sırasında işbirliği ve desteklerinden dolayı arkadaşlarım Nermin Saliha Çimen e, Murat Topuzoğulları na ve diğer çalışma arkadaşlarıma, Tezimi hazırlanmasında gösterdikleri yardım, ilgi, destek ve dostluktan dolayı sevgili arkadaşlarım Azade Attar a ve Başak İşcanı ya, Beni bugünlere getiren ve tüm hayatım boyunca her türlü desteğinden dolayı sevgili anneciğim Cihan Budama ve babacığım Halil İbrahim Budama ya, kardeşlerim Yasin Budama ve Kübra Budama ya ve eşim Orkun Battal a sonsuz teşekkürlerimi sunarım. ix

10 ÖZET Polielektrolitler ve proteinler arasında suda çözünen ve çözünmeyen kompleks oluşumu prosesi, oluşan polikompleks partiküllerinin yapısı ve morfolojisi ile bu sistemlerde fazlar arası geçişlerin varlığı, farklı fizikokimyasal yöntemler ile incelenmiştir. Floresans spektrometre yöntemi ile floresans, fosforesans, düşük konsantrasyonda miktar tayini, biyolüminesans, protein miktar tayini, proteinlerin üç boyutlu yapıları hakkında vb. bilgi veren analizler yapılmaktadır. Protein ile polielektrolitlerin etkileşimlerinin araştırılmasında floresans yönteminin çok önemli bilgiler verebilmesine rağmen polielektrolitprotein karışımlarında olabilecek etkileşimlerin floresans yöntemiyle incelenmesi çok az sayıda sistemde gerçekleştirilebilmiştir. Bu çalışmada Sığır Serum Albuminin anyonik yapılı poliakrilik asit (PAA) ile etkileşimi floresans yöntemi ile incelenmiş ve protein molekülünde var olan Triptofan amino asitinin floresans özelliklerinin değişimine dayalı olarak interpolimer-protein kompleksinin oluşumu araştırılmıştır. Bileşenlerin oranına ve ortamın ph değerine bağlı olarak suda çözünen ve çözünmeyen polimer-protein komplekslerinin oluştuğu, sistemde faz geçişinin meydana geldiği ve bu sırada kararlı yapılı polikompleks partiküllerinde protein moleküllerinin üç boyutlu yapılarının şartlara uygun olarak önemli değişiklikler gösterdiği saptanmıştır. İntrapolimer komplekslerinin orana ve ph a bağlı olarak interpolimer komplekslere agregasyonu bulunmuştur. Protein molekülünün yapısındaki Triptofan ın λ max ve I max değerleri orana ve ph a bağlı olarak değişmektedir. Bu değişimlerin gerek proteinin gerekse polikomplekslerin yapılarına bağlı olduğu tartışılmaktadır. Floresans yöntemi suda çözünen PAA-protein karışımlarına uygulandığından dolayı polimer/protein oranına ve karışımın ph değerlerine bağlı olarak sistemin suda çözünürlüğü öncelikle türbidimetrik yöntemle araştırılmış ve suda çözünmemiş sistemler belirlenmiştir. Nötral ph ortamlarında tümüyle suda çözünen polimer-protein karışımı, ph değeri azaldıkça suda çözünmeyen hale geçmekte ve ph ın değerinin izoelektrik noktasına yakın değerlerinden başlayarak düşük değerlerinde suda çözünmeyen bir karışım oluşmakta olduğu belirlenmiştir. Bu sistemler detaylı olarak floresans yöntemi ile araştırılmış ve literatürde bulunmayan yeni bilgiler elde edilmiştir. Polikompleksin yapısında bileşenlerin (polimer ve protein) oranı, aralarındaki kimyasal bağlar veya etkileşimin doğasının yanısıra, gerek tüm polikompleks partiküllerinin ve gerekse de içerdikleri protein molekülünün üç boyutlu yapısı hakkında günümüzde detaylı bilgi varolmamaktadır. Anahtar kelimeler: polielektrolit, poliakrilik asit, bovin serum albumin, floresans x

11 ABSTRACT The process of forming water soluble and insoluble complexes from polyelectrolytes and proteins, the structure of the forming polycomplex particles and their morphology, and the presence of interphasal transformation within these systems, have been examined by different physcochemical methods. The information about fluorescence, phosphorescence, quantity specification in low concentrations, bioluminescence, protein quantity specification, and analysis of three dimensional structure of proteins, etc. are analyzed by fluorescence spectrometer method. Despite the fact that fluorescence method can give spectacular information concerning the examination of interactions between proteins and polyelectrolytes, examination of the interactions possible between polyelectrolyte-protein mixtures using the fluorescence method have been successfully realized on a few number of systems. In this study, the interaction of Bovine Serum Albumin (BSA) with anionic polyacrylic acid (PAA) has been examined and the formation of interpolymer-protein complex based on the variation of the fluorescence aspects of the tryptophan amino acid present in protein molecule has been researched. It has been determined that, water soluble and insoluble polymer-protein complexes have been formed depending on the ratio of the components and the ph value of the environment. As the phase transformation has been occuring and meanwhile important changes have taken place in three dimensional structures of stable polycomplex particles according to the conditions. Aggregation of intrapolymer complexes has been found depending on the ratio and ph value. λ max and I max values of tryptophan in the structure of protein molecule change according to the ratio and ph. It is still a subject of dispute whether these changes arise from the structure of protein or from the formed polycomplex. Since the fluorescence method is applied to the water soluble PAA-protein mixtures, the water solubility of the system has been researched primarily by turbidimetric method depending on the polymer/protein ratio and the ph value of the mixture, and insoluble systems have been determined. As the ph decreases, completely water soluble polymerprotein mixture becomes insoluble in neutral ph environment as in ph values close to isoelectric point and in lower ph values. These systems have been researched in detail using fluorescence method and new information which is not present in the literature has been gathered. For the time being, there are no detailed information about the ratio of compounds (polymer and protein) in the structure of polycomplex, the chemical bonds within the polycomplex and the nature of their interaction, the three dimensional structures of the whole polycomplex particles and the protein molecule they embody. Key words: polyelectrolyte, poliacrylic acid, bovine serum albumin, fluorescence. xi

12 1 1. GİRİŞ Fonksiyonel biyopolimer sistemler gibi suda çözünen ve çözünmeyen protein-polielektrolit kompleksler, farklı alanlarda önemli uygulamalara sahip polimer-protein karışımlarının özel sınıfını temsil eder. Proteinler ve peptidlerin PE polikomplekslerine dayanan yüksek verimli polimerik immunojenler ve sentetik aşılar için son zamanlarda çok daha yaratıcı çalışmalar yapılmıştır. Polianyonların sığır serum albüminin asidik ortamda etkileşimi ilk kez Morawetz (1952) tarafından incelenerek suda çözünmeyen kompleksler oluşturduğu tespit edilmiştir. Bu çalışmada polimer-protein sisteminin ve ph ın 5 ten yüksek değerlerinde sistemin suda çözünür olduğu tespit edilmiştir. Bu karışımın ph ın 5 ten yüksek değerlerinde suda çözünür hali ilk kez Mustafaev ve arkadaşları (1978) tarafından sedimentasyon yöntemi ile araştırılmış ve suda çözünebilen polimer-protein komplekslerinin var olduğu tespit edilmiştir. Bu çalışmalar sistematik karakter taşımadığından dolayı yeterli derecede detaylı bilgiler var olamamaktadır. Sulu çözeltilerdeki protein-polielektrolit (PE) etkileşimli değerlerine bağlı proteinlerin izoelektrik noktalarına, iyonik kuvvete ve ph değerlerine bağlı olduğu bulundu. Proteine PE bağlanması, onların bileşenlerin oranlarına bağlı olduğu ve suda çözünen polikompleksler, kompleks oluşumu yada amorf çökeltilerin oluşumu ile sonuçlanabileceği bulundu. Sedimentasyon ve dinamik ışık saçılması çalışmaları göstermiştirki, suda çözünen proteinpoliiyon kompleksler reaksiyon kompozisyonu ile düzenlenen faz ayrımı ve faz geçişinin habercisidir. Karışımdaki protein konsantrasyonuna bağlı, faz ayrımının kısmi veya tamamen engellenmesi meydana gelir. Proteinler ile PE arasındaki kompleks oluşumu konusunda çeşitli araştırmalar yapılmıştır. Suda çözünen polimer-protein kompleksleri kolloid ve polimer kimyasının metodları olan, türbidimetri, viskozite ölçümleri, analitik ultrasentrifügasyon, boyut-ayırma kromotografisi, elektroforez, statik ve dinamik ışık saçılması, elektron-spin rezonans ve dairesel dikroizm yöntemleri ile incelenmiştir. Bu metodların çoğu polikompleks parçacıklardaki proteinlerin üç boyutlu yapısı ve PE lerin protein moleküllerinin lokal etkileşimleri hakkında bilgi vermezken, polikompleksin genel yapısı hakkında bilgi sağlar. Farklı fizikokimyasal yöntemler kompleksin genel yapısı hakkında bilgi vermekle birlikte, kompleksin içinde olan proteinin üç boyutlu yapısı hakkında az bilgi vermektedir. Son zamanlarda bu sorunların çözümlenmesi için floresans teknikleri kullanılmaktadır.

13 2 Substratların bağlanması, assosiasyon reaksiyonları, denatürasyon ve diğer makromoleküller ile etkileşimler proteinin floresans spektrumunda değişikliklerle sonuçlanabilir. Floresans teknikleri son zamanlarda protein-polimer kompleks oluşumu incelenmesi için kullanıldı. Proteinlerdeki Triptofan rezidülerinin floresans emisyon kaymasından, proteinlerin belirli domainlerinde polielektrolitler ile proteinlerin etkileşimlerini lokalize etmek mümkündür. BSA molekülü iki tane Trp rezidüsü içerdiği bilinir. Bunlardan biri molekülün yüzeyinde bulunan birinci ve üçüncü domainler arasındaki hidrofobik ucun tabanında yerleşmiştir. Cu(II) iyonlarının etkili floresans quencerları (söndürücüleri) olduğu düşünülerek, sıvı çözeltilerde BSA ile aniyonik polielektrolitlerin Cu ile indüklenmiş kompleks oluşturması bir floresans tekniği ile incelenmiştir.

14 3 2. GENEL BİLGİ 2.1 Işın ( Elektromagnetik Dalga) Elektromagnetik dalgayı ilk kez Fizik Profesörü Hertz üretti ve dedekte etti. Işın veya elektromagnetik dalga boşlukta 3x10 8 m/sn hızla hareket eden bir enerji şeklidir. Işın, elektrik ve magnetik alan olmak üzere iki vektörle gösterilir. Boşlukta yayılabilen, elektrik ve manyetik alan bileşenlerinin hem birbirine hem de ilerleme doğrultusuna dik olarak titreşen sinüsoidal dalgalar elektromagnetik dalgalar olarak adlandırılır. Işın bir elektromagnetik dalgadır. Şekil 2.1 Üç boyutlu uzayda elektromagnetik dalganın gösterimi. Işının dalga hareketindeki ard arda gelen iki maksimumu veya iki minimumu arasındaki mesafeye dalga boyu denir. λ ile gösterilir. Işının dalga hareketinin tekrarlanması için gereken zaman ise periyottur ve T ile gösterilir. Genlik ise ışının dalga hareketinin maksimum noktasının yatay eksene olan uzaklığıdır ve A ile gösterilir. Bir noktadan birim zamanda geçen dalga sayısına ise frekans denir ve ν ile gösterilir.

15 4 Şekil 2.2 Işının sinüsoidal dalga olarak gösterimi cm Hz Şekil 2.3 Elektromagnetik spektrum ve spektrum bölgelerinin sınıflandırılması. (Atkins P.W., 1998) 2.2 Absorpsiyon (Soğurma) Çeşitli dalga boylarında ışın içeren bir demet, şeffaf bir ortamdan geçirilirse, içinden bazı dalga boylarının kaybolduğu görülür. Bu olaya absorbsiyon (soğurma) denir. (Lakowicz, J. R., 1999 )

16 5 2.3 Emisyon (Yayma) Bir molekül yüksek enerji düzeyinden daha düşük enerji düzeyine geçiş yaparken, sahip olduğu fazla enerjiyi foton olarak yayar. Bu olaya emisyon(yayma) denir. (Lakowicz, J. R., 1999 ) ABSORPSİYON EMİSYON FLORESANS FOSFORESANS Şekil 2.4 Temel halden uyarılmış hale geçişin ve uyarılmış halden temel dönüşlerin gösterimi. 2.4 Lüminesans Üzerine gelen ışını absorplayan ve daha sonra emisyon yapan maddelere lüminesans madde adı verilir. Oluşan olaya ise lüminesans olayı denir. Lüminesans iki şekilde oluşur. Birincisinde, uyarılma enerjisi bir kimyasal reaksiyon sonucu ortaya çıkar, buna kemilüminesans denir. İkincisinde ise, bu kimyasal reaksiyon bir canlı içerisinde gerçekleşir ( örneğin; ateş böceği), buna da biyolüminesans denir. Lüminesans olayı gerçekleştiği süreye göre floresans ve fosforesans diye iki şekilde ele alınır. Floresans, lüminesans olayının çok kısa sürede gerçekleştiği duruma denir. Uyarılmış singletten temel hale olan ışımadır. Uyarıcı ışın kesildiğinde floresans olayı hemen durur. Absorplanan ışın anında yeni bir ışına dönüşür. Kimyasal analizlerde daha çok floresans kullanılır. Fosforesans ise lüminesans olayının daha uzun sürede meydana geldiği duruma denir. Uyarılmış tripletten temel hale olan ışımadır. Uyarıcı ışın kesildiğinde kendiliğinden ışıma uzun zaman (dakikalarca) sürebilir. Fakat tipik olarak saniye veya saniyenin kesirleri kadar sürer. Bu da bize fosforesans olayında gelen enerjinin bir şekilde depolandığını, sonra yavaş yavaş ışın halinde harcandığını gösterir.

17 6 2.5 Jablonski Diyagramı Işığın absorbsiyonu ve emisyonu iyi bir biçimde Alexander Jablonski tarafından enerji düzeyleri diyagramı ile belirtilerek örneklerle açıklanmıştır. Temel, birinci ve ikinci eletronik durumlar sırasıyla S 0, S 1 ve S 2 ile gösterilir. Bu elektronik enerji seviyelerinin her birinde floroforlar 0,1,2 vb ile gösterilen titreşimsel enerji seviyelerinin sayısı içinde bulunur. Bu diyagramda sönüm, çözücü etkileşimleri ve enerji transferi gibi etkileşimleri hariç tutulmuştur. (Lakowicz, J. R., 1999 ) Şekil 2.5 Jablonski Diyagramı. (Lakowicz, J. R., 1999 ) Bir molekülün, yüksek elektronik seviyenin düşük titreşimsel seviyesinden, düşük elektronik seviyenin üst titreşimsel seviyelerine geçişe iç dönüşüm (iç geçiş) denir. 2.6 Floresans Emisyonunda Ayna Görüntüsü Bir molekülün absorpsiyon spektrumu elektronik olarak uyarılmış halin titreşim seviyelerini yansıtmaktadır. Çoğunlukla elektronik uyarma titreşim seviyelerinin yerlerini değiştirmez. Bu nedenle, emisyon spektrumu molekülün absorpsiyon spektrumunun ayna görüntüsüne çok yakındır. (Lakowicz, J. R., 1999 )

18 7 Şekil 2.6 Floresans emisyonunun ayna görüntüsü. (Lakowicz, J. R., 1999 ) 2.7 Stokes Kanunu Enerjide meydana gelen kayıp nedeniyle, floresansın dalga boyu, uyaran ışığın dalga boyundan daima daha büyüktür. Çünkü emisyonu sağlayan geçiş, bir kısım titreşim enerjisinin çevreye atılmasından sonra meydana gelir. Absorpsiyona göre emisyonda daima daha büyük dalga boylarına doğru bir kayma (Stokes Shift) izlenir. (Lakowicz, J. R., 1999 ) 2.8 Floresans Ömrü ve Kuantum Verimi Floresans özellikli maddenin uyarılmış halde kalma süresi floresans ömrü olarak adlandırılır. Emisyonun yüksek hızla gerçekleştiği floresans ömrü 10-8 s-10ns kadardır. Kuantum verimi birim zamanda, steady-state sistemde yayınlanan foton sayısının, absorplanan foton sayısına oranına denir. Başka deyişle, çözeltideki floresans gösteren moleküllerin sayısının, toplam uyarılmış molekül sayısına oranıdır. Örneğin floresans boya olan Fluorescein in kuantum verimi yaklaşık olarak 1 e yakındır. Kuvvetli bir floresanttır. Bunun aksine floresant olmayan türlerin kuantum verimi ise sıfırdır. (Lakowicz, J. R., 1999 ) 2.9 Floresansı Etkileyen Etkileyen Faktörler YAPI: En şiddetli floresans, içinde aromatik halkalar bulunan sistemlerdir. YAPISAL RİJİTLİK: Molekül yapısı rijit ise, floresansı artar. ph: Asit veya baz grubu içeriğine göre ph ile birlikte floresans değişir.

19 8 SICAKLIK ve ÇÖZELTİ: Sıcaklığın yükselmesi çarpışmayı dolayısıyla floresans ışımasını azaltır. Çözücünün polarlığının artması da floresansı arttırır. ÇÖZÜNMÜŞ OKSİJEN: Genellikle floresans şiddetini azaltır. GELEN IŞIĞIN DALGA BOYU ve ŞİDDETİ: Floresansı oluşturan ışığın dalga boyunun alt sınırı 250 nm dir. Gelen ışığın şiddetinin artması, floresansı arttırır. KONSANTRASYON: Floresans şiddeti, çözelti içindeki floresant maddenin konsantrasyonuyla orantılıdır. LAMBERT-BEER KANUNU na göre: P=P 0 e -ε/c (Denklem 2.1) Burada P 0 floresant maddeyi içeren çözeltinin üzerine gönderilen ışığın şiddetidir. P ise P 0 ın çözelti içinde d kadar yol aldıktan sonraki şiddetini ifade etmektedir. ε, çözeltinin molar soğurganlığını ifade etmektedir. C ise çözeltinin konsantrasyonudur Floresansın Sönümü Floresans sönümü, floresans şiddetinde azalmanın gözlenmesi demektir. Sonucunda floresans sönümü olan olaylar şöyle sıralanabilir; uyarılmış hal reaksiyonları, enerji transferi, kompleks oluşumu vb. Temel olarak sönüm iki şekilde olur. Birincisi dinamik sönümdür ve florofor ile söndürücü molekülleri arasındaki çarpışmadan kaynaklanır. İkincisi ise statik sönümdür ve kompleks oluşumundan kaynaklanmaktadır. Statik sönümde söndürücü ile florofor arasında kompleks oluşur ve bu oluşan kompleks floresans özelliğe sahip değildir. Statik ve dinamik sönüm için florofor ile söndürücü temas halinde olmalıdır. Bu iki sönüme ek olarak sönüm, bir de numunenin optik özelliklerinden de oluşabilmektedir. Örneğin; yüksek optik yoğunluk ve bulanıklık floresans şiddetinin azalması ile sonuçlanır. Bu sönümlenme tipi çok az moleküler bilgi içerdiğinden önemsizdir. Florofor ile söndürücü arasında temas oluşmasıyla dinamik veya statik sönüm meydana gelir. Çarpışma sonucu sönüm olabilmesi için de söndürücünün, uyarılmış halin yaşam süresi içinde florofora ulaşmış olması gerekir. Söndürücü ile florofor

20 9 arasında temas oluşmasıyla, foton yayınlanmadan florofor temel hale geri döner. Sönüm ölçümleri, söndürücünün florofora ulaşıp ulaşmadığını anlamamıza yarar. Eğer çözücü çok viskoz ise, difüzyon hızı yavaş olacağından sönüm engellenir. Bununla beraber sönüm; söndürücünün difüzyon hızını ortaya koyar. Ayrıca, floroforun proteine mi yoksa membrana mı bağlandığını açığa çıkartır. Floroforun makromolekülün içinde yerleşik olduğu ve söndürücünün protein veya membranın içine girmediği durumlarda ne statik ne de dinamik sönüm gerçekleşir. Floroforun protein yada membran içindeki yerleşim yerini ve söndürücünün bunların içine difüzyonu sönüm incelemeleri ile ortaya konulur Floresans Spektroskopisi Bir molekülün enerjisi elektronik (E 0 ), titreşimsel (E υ ), dönme (E T ) enerjileri toplamından oluşmaktadır. E 0 = E υ + E T (Denklem 2.2) Her elektronik enerji seviyesi bir seri alt titreşimsel seviye içermektedir. Titreşimsel seviyeler de birbirine oldukça yakın olarak yer alan dönme seviyelerinden oluşmaktadır. Genel bir kural olarak, oda sıcaklığında moleküllerin çoğunun temel elektronik halin en düşük titreşimsel seviyesinde bulunduğu kabul edilir. Moleküler yörüngede dönüşleri antiparalel olacak şekilde yerleşmiş elektron çiftinin durumu singlet hal olarak adlandırılır. Bu elektronların paralel olduğu hal ise triplet hal olarak ifade edilir. Işık enerjisi soğurulduğunda temel hal S 0 dan üst enerji seviyelerine geçişler (uyarılma) olur. Uyarılmış singlet hal S 1 in (molekülün en düşük enerjili uyarılmış halindeki seviyesi) en düşük titreşim seviyesinden temel hal S 0 ın her hangi titreşim-dönme seviyesinde geçişte yayınımına floresans denir. Floresans spektroskopisi, moleküller biyofizik ve biyokimya alanlarında çok yaygın bir şekilde kullanılan spektroskopik tekniklerden birisidir. Floresans ölçümleri ayrıntılı yapısal bilgi vermemesine rağmen biyomoleküllerin ve biyomoleküler komplekslerin yapısal ve dinamik özelliklerindeki değişiklikleri çok keskin hassasiyet ile ortaya koymasından dolayı çok popüler bir teknik haline gelmiştir. Çoğu biyofiziksel tekniklere benzeyen, floresans spektroskopik çalışmaları, steady-state emisyon şiddetinin basit ölçümünden, çok kapsamlı time-resolved çalışmalara kadar birçok seviyede ortaya konulabilmektedir. Bilgi içeriği ilgilenilen olayın ayrıntılı analizinde time-resolved gibi çeşitli floresans eldelerini çarpıcı bir

21 10 şekilde artarır. Bununla beraber, bilginin önemli kısmına ulaşmak için steady-state ölçümleri kullanılır. Sonuç olarak, steady-state floresans spektrometreler biyolojik moleküllerin konformasyonel ve kompleksleşme olaylarının ölçümünde rutin olarak kullanılır Floresans Spektrometre Floresans spektrometre ile birçok edilebilir. Bu cihazın selektifliği yüksektir.[1] madde milyonda birin altındaki hassaslıkla tayin Şekil 2.7 Floresans spektrometre cihazı A B Şekil 2.8 (A) Lambanın güç kaynağı. (B) Sistemin güç kaynağı ve brytebox.

22 11 Floresans spektrometre cihazının yararlarını şöyle sıralayabiliriz; para kaybını önleyen bir sistemdir. En düşük örnek konsantrasyonlarını ölçebilen bir sistemdir. Çok değerli örnekleri çok az miktarda kullanarak ölçüm yapmaya olanak sağlar. Sistemin kullanımı kolaydır.[1] 2.13 Floresans Spektrometre Sistemini Oluşturan Birimler Arc lamba yuvası (75W lık Xenon lamba) Ayarlanabilir slitler Uyarma monokromatörü Örnek kompartmanı Filitre tutucusu Uyarma ve emisyon optik düzenekleri Küvet tutucusu Emisyon panjuru Emisyon monokromatörü PMT dedektörü Kuartz küvet Katı numune tutucusu Monokromatör Giriş slitine gelen geniş spektrumlu ışığı spektrumuna ayırarak, çıkış slitine istenen tek dalgaboylu ışığı sağlayan bir optik cihaza monokromatör denir. Spektrum taranmasını gerçekleştirir. Dört ana kısımdan oluşur; giriş sliti, aynalar, kırınım ağı ve çıkış sliti.

23 12 Şekil 2.9 Monokromatörün iç yapısındaki optik bileşenlerin şematik gösterimi. Şekil 2.10 Uyarma monokromatörünün iç yapısının farklı açılardan görüntüleri.

24 13 Şekil 2.11 Floresans spektrometrenin örnek kompartmanın iç görüntüsü Şekil 2.12 Floresans spektrometre cihazının optik krokisi ve fiziksel boyutları. (1)lamba yuvası, (2)ayarlanabilir slitler, (3)uyarma monokromatörü, (4)örnek kompartmanı, (5)saptırıcı, (6)flitre tutucular, (7)uyarma/emisyon optikleri, (8)küvet tutucu, (9)emisyon shutter, (10)uyarma düzeltme, (11)emisyon monokromatörü, (12)PMT dedektörü. [1]

25 Floresans Spektrometrenin Uygulama Alanları Floresans, Fosforesans, Düşük konsantrasyonda miktar tayini, Biyolüminesans, Hücre içi konsantrasyon tayini, Protein miktar tayini, Üç boyutlu yapısı hakkında bilgi (açıldı veya yumaklandı), DNA bağlanmaları. Besin maddeleri, ilaçlar, klinik numuneler ve doğal maddelerin tayini. Floresans metodlarının başarılı bir şekilde uygulanması, cihazı kullanmayı iyi bilmeyi ve deneysel detaylara hatrı sayılır bir şekilde dikkat etmeyi gerektirir. Floresans yüksek derecede duyarlı bir metoddur. [1] 2.15 İdeal Spektroflorimetreler Her dalgaboyu aralığında relatif foton şiddetini gösteren emisyon ve uyarmayı kaydetmek isteriz. Elde edilen böyle düzeltilmiş emisyon spectrumu, elde edilen bileşenler aşağıdaki özelliklere sahip olmalıdır: 1. Işık kaynağı bütün dalgaboylarında sürekli foton çıkışı sağlamalıdır. 2. Monokromatör eşit verim ile bütün dalgaboylarını içeren fotonlarını geçirmelidir. 3. Monokromatör verimi polarizasyondan bağımsız olmalıdır. 4. Dedektör (fotoçoğaltıcı tüp) eşit verim ile bütün dalgaboylarını içeren fotonları dedekte etmelidir. İdeal optik bileşenler için bu karakteristikler Şekil 2.13 de gösterilmiştir. Maalesef, böyle ideal karakteristikler ile ışık kaynakları, monokromatörler ve fotoçoğaltıcı tüpler uygun değildir. Sonuç olarak, bileşenlerin seçiminde uzlaşma ve cihazın ideal olmayan cevabı için düzeltme zorunludur. (Lakowicz, J. R., 1999)

26 15 Aynı dalgaboyunda, aynı bileşenler ile bu kıyaslanabilir ölçümler gerçekleştirilir. Bundan dolayı karşılaştırmalı ölçümlerde bileşenlerin ideal olmayan davranışları iptal olur. Absorpsiyon ölçümlerine karşı, floresans şiddeti ölçümleri kesindir, göreli değildir. Bu, boşluk ile örneğin floresansının kıyaslaması yardımcı değildir. Çünkü boşluk prensipte hiç sinyal vermez. Aynı zamanda zayıf arka plan sinyali bilinmeyen spektral dağılıma sahiptir ve böylece optik bileşenlerin dalgaboyuna bağlılığının düzeltmesi için kullanılmaz. Böylece, iç geçiş için elverişli durum sınırlıdır. (Lakowicz, J. R., 1999) Şekil 2.13 Floresans spektrometre cihazını oluşturan birimlerin ışık şiddeti ve dalgaboyuna bağlı kıyaslaması. (Lakowicz, J. R., 1999) 2.16 Işık Kaynakları Kullanılan ışık kaynakları iki çeşit olabilir. Birincisi Arc lamba yani bizim cihazımızda bulunan cinsten, ikincisi ise akkor lambadır. Steady-state spektroflorimetreler için en kullanışlısı yüksek basınçlı xenon arc lambalarıdır. Bu lambalar sürekli olarak 250nm den 700nm ye kadar ışık çıkışı sağlar. Xenon lambalar genellikle bir lamba yuvası içinde bulunacak şekilde dizayn edilirler. Çünkü xenon lamba içindeki gaz yaklaşık 10 atmosferlik yüksek bir basınç altında olduğundan her zaman patlama tehlikesine sahiptirler. Böylece lamba yuvası kullanıcıyı tehlikeden korur. Diğer ışık kaynakları ise şunlardır; yüksek basınçlı civa lambası, civa-xenon arc lambası, quartz-tungsten halojen lamba ve düşük basınçlı civa lambasıdır. Yapılacak olan ölçüme göre amaca uygun lamba seçimi yapılmalıdır. (Lakowicz, J. R., 1999) 2.17 Amino Asitler Amino asitler, canlı hücreleri oluşturan proteinlerin yapıtaşı olan moleküllerdir. Amino asitler, amino grubu, karboksil grubu ve yan zincir grubu (ya da radikal grup) diye adlandırılan üç atom grubunun bir karbon grubuna bağlanmasıyla meydana gelirler. Bütün amino asitlerde amino ve karboksil grupları aynıdır. Bir amino asiti diğerlerinden farklı kılan

27 16 tek özellik, moleküle bir ucundan bağlanan yan zincir grubudur. Bu yan zincir gruplarının her amino asitte farklı olması sayesinde her amino asit birbirinden çok farklı özelliklere sahip olur. Doğada 200 çeşidin üzerinde amino asit bulunur. Ancak bunların arasından sadece 20 çeşit amino asit canlılardaki proteinleri oluşturur. Proteinler amino asitlerden oluşurlar. Amino asitler proteinlere göre çok daha küçük moleküller olmalarına rağmen, son derece kompleks yapıları vardır. Şekil 2.14 Amino asitlerin yapısının şematik gösterimi. [2] Atomları ve molekülleri birarada tutan çeşitli kimyasal bağlar vardır. Bu bağlar iyonik, kovalent ve zayıf bağlar olarak üçe ayrılır. Bunlardan kovalent bağlar, proteinlerin yapı taşı olan amino asitlerdeki atomları birarada tutarlar. Zayıf bağlar ise amino asit zincirini, katlanarak aldığı özel üç boyutlu biçimde sabit tutarlar.

28 17 Dipollü moleküller polar yada hidrofilik olarak bilinirler. Dipolsüz olanlar ise polar olmayan yada hidrofob moleküller olarak bilinirler. Brown hareketi ile veya karıştırıldığında hidrofob gruplar birbirine yaklaşırlar. Yani su molekülleri bunları iterler ve hidrofobik etkileşim oluşur. [3] Şekil 2.15 Hidrofobik moleküller arasındaki etkileşimin şematik gösterimi. [3] Şekil 2.16 Hidrofilik moleküllün şematik gösterimi. [3] Yani eğer zayıf bağlar olmasa, amino asitlerin biraraya gelmesiyle oluşan proteinlerin üç boyutlu fonksiyonel biçimlerini almaları imkansızdır. Proteinlerin yapısındaki amino asit yan zincirleri hidrofilik yada hidrofobik özellikte olabilmektetir. Proteinin yapısında ve bağlanmasında farklı yan gruplarının sulu ortamdaki etkileşimleri oldukça önemlidir. [4] Şekil 2.17 Atomları ve molekülleri bir arada tutan kimyasal bağların şematik gösterimi. (Gözükara, 1997)

29 18 Bir proteinin meydana gelebilmesi için gerekli olan amino asit çeşitlerinin, uygun sayı ve sıralamada ve gereken üç boyutlu yapıda dizilmeleri yetmez. Bunun için aynı zamanda, birden fazla kola sahip amino asit moleküllerinin yalnızca belirli kollarıyla birbirlerine bağlanmaları gerekmektedir. Bu şekilde yapılan bir bağa, "peptid bağı" adı verilir. Şekil 2.18 Peptid bağınının şematik gösterimi. [3]

30 Proteinlerin Üç Boyutlu Yapısı Şekil 2.19 Proteinin üç boyutlu yapısının şematik gösterimi. (Barnes, 1985) BİRİNCİL YAPI: Belirli sayı, şekil ve düzendeki amino asitler bir zincir oluştururlar. İKİNCİL YAPI: Amino asit zinciri bir sarmal şeklinde kıvrılır. Bunun nedeni her amino asitin yanındaki ile oluşturduğu hidrojen bağıdır. ÜÇÜNCÜL (TERSİYER) YAPI: Amino asit zinciri yün yumağını andırır şekilde katlanır, bükülür ve çeşitli bağlarla bağlanır. DÖRDÜNCÜL (KUATERNER) YAPI: Katlı protein zincirleri birkaç alt parçanın biraraya gelmesiyle tek bir protein oluşturur. Proteinlerin fiziksel, kimyasal ve biyolojik özelliklerini ve bu özellikler sayesinde yerine getirecekleri görevlerini, onları oluşturan amino asitlerin bu şemada gösterilen yapıları belirler.

31 20 Şekil 2.20 Birincil yapı Şekil 2.21 İkincil yapı Şekil 2.22 Üçülcül yapı

32 21 Şekil 2.23 Miyoglobin proteininin üç boyutlu yapısı ve atomları arasındaki peptid grupları. (Watson, 1976) Şekil 2.24 Bir proteinin üç boyutlu yapısı. [3] 2.19 Protein Floresansı Proteinlerin ve peptitlerin floresansı hakkında oldukça geniş çapta yayın yapılmıştır. Bu önem; hemen hemen bütün proteinlerde bulunan tirozin (tyrosine) ve triptofan (trytophan) gibi doğal florofor moleküllerinden kaynaklanmaktadır. Birçok proteinin floresansı triptofan tarafından yansıltılmaktadır ve bu aminoasitin indol çekirdeği oldukça hassas ve karmaşık bir florofordur. İndol, triptofan ve bunların türevleri çözücü polaritesine oldukça hassastır ve hem genel hemde spesifik çözücü etkisine maruz kaldığı görülmektedir. Sonuç olarak, triptofanın emisyon spektrumu; etrafını saran çevrenin polarlığına bağlıdır. Substratların bağlanması, assoiasyon reaksiyonları, denatürasyon ve diğer makromoleküllerle olan etkileşimler proteinlerin floresans spektrumlarında değişikliklere neden olur.

33 22 Triptofan floresansının çeşitli maddeler tarafında sönüme (quenching) duyarlı olduğu görülmektedir. İyot ve oksijen tarafından sönüme uğramasına ek olarak triptofan; akrilamid, süksinamid, hidrojen peroksit, diklorasetamid, sistein, klorlanmış hidrokarbonlar, nitrat, iyodat, Cs 2+, Cu 2+, Pb 2+, Cd 2+ ve Mn 2+ gibi maddeler tarafından sönüme uğrar. Çeşitli floresans söndürücülere olan bu hassasiyet, indol yapısının uyarıldığı durumda elektron sunmasının sonucu olarak görülmektedir. Söndürücülere karşı bu hassasiyet sönüm ölçümleri ile proteindeki triptofan konumunu belirlenmesine olanak tanır. Protein floresansı genellikle 280nm ve daha uzun dalga boylarında uyarılır. Bunun sonucunda da kuantım verimi çok düşük olduğundan fenilalanin böylesi deneysel bir durumda uyarılması söz konusu değildir. Öyle ki, bu amino asitden ışın yayınlama nadir olarak gözlenir. Proteinler mor ötesi floresansına katkıda bulunan üç tane amino asit içermektedirler. Bunlar; triptofan (Trp), tirozin (Try) ve fenilalanin (Phe) dir. Şekil 2.25 Aromatik aminoasitlerin floresans emisyon spektrumları.

34 23 Şekil 2.26 Aromatik aminoasitlerin floresans emisyon spektrumları. Bu amino asitler; proteinlerdeki konformasyon değişikliklerini belirleyen grup olarak kullanılır. Bu amino asitlerden kuantum verimi en yüksek olan triptofandır. Trp nin emisyonu, yerleşmiş olduğu çevreye önemli ölçüde bağlıdır. Trp nin emisyonda meydana gelen spektral kaymalar; makromoleküllerle olan bağlanmaların ve etkileşimlerin sonucu olarak gözlenir. Protein 280nm uyarıldığı zaman, hem tirozin hem de triptofan kalıntısının emisyonu gözlenir. Ancak 295nm ve daha büyük dalga boylarında uyardığımız zaman emisyon öncelikle triptofandan dolayı oluşur. Triptofan floresansının deneysel olarak bulunmuş; 295nm den 305nm ye kadar seçilebileceği önerilmektedir. Doğal proteinlerin birçoğunun floresans özellik göstermesinin yapısında bulunan Triptofan amino asitinden kaynaklanmaktadır Protein Floresansının Yaşam Süresi Proteinlerdeki triptofan floresansının yaşam süresi, proteine ve proteinin üç boyutlu yapısına bağlı olarak 1-7 nanosaniye aralığındadır. Proteinlerin (BSA) makromoleküller (PAA) ile birleşmesi birçok durumda emisyon spektrumlarının kaymasıyla ile sonuçlanır. Bu kaymalar Trp nin su ile temasının kesilmesinden ileri gelmektedir. Proteinin kendi kendine birleşmesi, proteinin membranla birleşmesi ve buna benzer diğer etkenler triptofanın spektral özelliklerini önemli ölçüde değiştirir.

35 Polimer Polimerler çok sayıda monomerin (alt birimin) kovalent bağlar ile bağlanarak meydana getirdikleri makromoleküllerdir. Özellikleri, kendisini oluşturan monomerlerden farklıdır. Şekil 2.27 Polimer molekülünün monomer birimlerinin kovalent bağlarla bağlanması sonucu oluşumu. Şekil 2.28 Poliakrilik asit Polielektrolitler Yapısında artı ve eksi yükler bulunduran polimerlere polielektrolit (PE) denir. Polielektrolitler ortamın ph ına bağlı olarak artı veya eksi yüklü hale getirilebilir. Ortamın ph ına göre bu polielektrolitler amaca uygun olarak metal iyonları ile iyon koordinasyon bağıyla yada çeşitli makromoleküllerle elektrostatik etkileşimle bağlanıp suda çözünen yada çözünmeyen polikomplekslerin oluşumunu sağlarlar. Bütün monomerleri aynı cins yüklere sahip polielektrolitlere homopolielektrolit denir. Yapısında hem anyonik, hem de katyonik grupları kovalent olarak bağlı bulunduran makromoleküller ise poliamfolitler olarak isimlendirilmektedirler. Sentetik yöntemlerle elde edilebilen poliampolitler aynı zamanda protein yapılı olmak üzere doğada bol miktarda bulunmaktadır. Poliamfolitlerin izoelektrik noktalarında molekül üzerindeki net yük toplamı sıfıra eşittir.

36 25 H 2 C CH n H 2 C CH n SO 3 Na H 2 C CH CH 2 CH n N R Hal H 2 C N CH 2 Cl (a) (b) H 3 C CH 3 (c) Şekil 2.29 (a) poli(vinilpiridinyum), (b) sodyum polistiren sülfonat, (c)poli(diallildimetilamonyum klorür) (Dautzenberg vd., 1994) Prensipte, herhangi bir kimyasal yapının polimer zincirine uygun sayıda iyonik grup kovalent olarak bağlayıp yapıyı uygun bir ph da suda çözünür hale getirerek bir polielektrolit elde edilebilir. Polielektrolitler genelde bir katılma veya kondenzasyon polimerleşme reaksiyonlarıyla elde edilebilir. Ayrıca polielektrolit yapıdaki pektin gibi anyonik polisakkaritler ve çok sayıda proteinler doğadan edinilebilir. Nişasta ve selüloz gibi noniyonik doğal polimerler kimyasal modifikasyonla polielektrolite dönüştürülebilir. Polifosfatlar ve polisilikatlar da inorganik polielektrolitler olarak sayılabilir (Dautzenberg vd., 1994). Polielektrolitler ortamın ph ına bağlı olarak (+) veya (-) yüklü hale getirilip arzu edilen antijene bağlanabilirler Homopolielektrolitler Polielektrolitler, herbir monomeri bir elektrolit grup taşıyan polimerlerdir. Bu elektrolit gruplar sulu çözeltilerde dissosiye olup polimeri yüklü hale getirirler (Şekil 2.30). Polielektrolitlerin özellikleri hem elektrolitlere (tuzlar) hem de polimerlere benzemektedir ve bazen polituzlar olarak da isimlendirilmektedirler. Çözeltileri, tuzlar gibi, elektriği iletir ve, polimerler gibi, viskozdur. Polipeptidler, proteinler, DNA gibi çoğu biyolojik molekül polielektrolit formundadır [5]. COOH COO COO -H -H COOH +H COOH +H COO Şekil 2.30 Poli(akrilik asit)in sulu çözeltideki dissosiyasyonu

37 26 Polielektrolitin çözeltideki davranışlarından sorumlu iyonik grupların çeşidi yukarıda anlatılan polielektrolit zinciri yapılarının çeşidinden çok daha azdır. Polielektrolitlerin içindeki davranışlarını etkileyen başlıca dört faktörden söz edilebilir: 1. Polimere bağlı yüklü gruplar anyonik ve katyonik olarak sınıflandırılır. Bu gruplar da güçlü ve zayıf asitler ve bazlar olarak ikiye ayrılabilir. Kuvvetli bir polielektrolit çözeltide tüm iyonlarına ayrışabilir. Bunun aksine, zayıf bir polielektrolit tüm iyonlarına ayrışamaz. Bu sebeple, zayıf polielektrolitler çözelti içinde tamamen yüklü değildirler ve ph değiştirilerek üzerlerindeki yük dağılımı ayarlanabilir. Şekil 2.31 İki sentetik polielektrolitin kimyasal yapısı. Soldaki yapı poli(sodyum stiren sülfonat) (PSS) ve sağdaki ise poli(akrilik asit)tir (PAA). Her ikisi de negatif yüklü polielektrolitlerdir. PSS kuvvetli bir polielektrolitken PAA zayıf bir polielektrolittir [5]. 2. Bununla birlikte, iyonik grubun asit ve baz kuvvetlerinin yanında polimer zinciri boyunca uzanan bitişik anyonik ve katyonik yükler arasındaki ortalama uzaklık polielektrolit davranışının tayininde önemli bir parametredir. Bu yük yoğunluğu, iyonik kısımlar arasındaki ortalama uzaklık olarak tanımlanabilir. Bu ortalama yük yoğunluğunun yanında zincir boyunca uzanan iyonik grupların dağılımı da polielektrolit örneğin çözünebilirlik özelliklerini önemli ölçüde etkileyebilmektedir. Bir kural olarak, eğer bir kopolimerde her on monomerik birimin birden fazla iyonik kısmı varsa tipik polielektrolit davranışı beklenir. 3. Asit-baz kuvveti ve yük yoğunluğuna ek olarak, polielektrolit özelliklerinin saptanmasında, makro iyonun molekül geometrisinde yüklü kısımların yerleşimi üçüncü önemli noktadır. Şekil 2.32 e göre, iyonik gruplar ya polimerin ana zincirinin bir birimi olarak (integral tip) ya da bir spacer ile ana zincire asılı olarak (yan zincirlerde) bulunur. Yüklü grupların geometrik yeri özellikle polianyon-polikatyon kompleksi oluşumu ile ilgilidir.

38 27 H 2 C CH 2 NH H 2 C CH NH 2 (a) (b) Şekil 2.32 (a) İntegral tipe örnek olarak lineer poli(etilen imin) ve (b) asılı tipe örnek olarak poli(vinilamin) 4. Düşük molekül ağırlıklı counter iyonların türünün çözeltideki tüm sistemin özellikleri üzerinde güçlü bir etkisi vardır, özellikle çözünürlük ve yapı oluşumunda. Bu iyonların önemini anlamak için şu örneği verebiliriz: poli(diallildimetilamonyum) polikatyonunun klorürlü hali suda kolayca çözünürken, iyodürlü hali daha zor çözünür (Dautzenberg vd., 1994). Herhangi bir polimerin konformasyonu çeşitli etkenlere bağlıdır, özellikle polimerin yapısına ve çözeltiyle ilişkisine. Çözelti içindeki yüksüz bir lineer polimer zinciri rasgele yumak konformasyonu gösterirken, lineer polielektrolit üzerindeki yükler birbirini iter (Coulomb itmesi) ve eksi yüklerin birbirlerini itmesini azaltıcı en uygun konformasyon olan uzanmış halde bulunmaya eğilim gösterir (Şekil 2.33). Bu düzenleme, polielektrolit çözeltilerinin viskozitesinin yükselmesine yol açar. Polielektrolit çözeltilerinin özellikleri sulu ortamın iyonik şiddetine bağlıdır. İyonik şiddetin artmasıyla viskozitenin değişmesi makroiyondaki elektrik yükleri arasındaki itme kuvvetinin engellenmesinden dolayı gerçekleşir ve iyonik şiddet daha fazla arttığında yüksüz makromoleküllere benzer davranış göstermeye başlar [5]. Şekil 2.33 Çözeltiye tuz ilavesi sonucu polielektrolit zincirinin yumak konformasyonunu alması [6] İyonik şiddetin yanında, ortamın ph ı da zayıf polielektrolitlerin özelliklerini etkiler. Çünkü iyonik grupların dissosiyasyon derecesi ve polielektrolitin yük yoğunluğu değişir.

39 28 Polielektrolit çözeltilerinin diğer bir özelliği ise yüksek iyonik iletkenlikleridir. Elektrik alanı altında, küçük molekül ağırlıklı iyonlardan daha yavaş olmakla birlikte makroiyonlar göç etmektedirler (Dautzenberg vd., 1994). Polielektrolitlerin önemli özelliklerinden biri de, polimerlerde konsantrasyon arttıkça viskozite artar ancak polielektrolitlerde ise konsantrasyon düştükçe viskozite artar. Bunun sebebi, polielektrolitte bulunan (+) veya (-) yüklerin konsantrasyon düştükçe birbirini itmesidir ve böylelikle Şekil 2.34 den de görüldüğü üzere polielektrolit şişer ve viskozite artar. (Mustafaev vd., 1996) Şekil 2.34 Yüzsüz polimer ve polielektrolit için viskozite ve konsantrasyon ilişkisi Polielektrolitlerde molekül ağırlığı polimerleşme derecesi ile orantılıdır. Polimerleşme derecesinin artması istenilen kompleksin oluşumunu destekleyici yönde etki eder ve polimerin bağlanma miktarında artış gözlenir. Bunun yanı sıra polielektrolit çözeltilerinin elektrokimyasal özellikleri genellikle poliiyonun zincir boyuna bağlıdır; yani polikompleksin çökmesi vb. özellikler polimerin polimerleşme derecesine bağlıdır (Mustafaev, 1996) Poliamfolitler Polimer iskeletindeki ya da asılı olarak bulunan iyonik gruplar, polinükleotidler ve proteinler gibi makromoleküllerin sınıflandırılmasında oldukça önem taşımaktadır. Polimerler iyon içeriğine göre polielektrolitler ve poliamfolitler olarak iki gruba ayrılabilirler. Polielektrolitler

40 29 katyonik veya anyonik grupları içerirken, poliamfolitler katyonik ve anyonik grupların her ikisini bulundurur. Polielektrolitlerin karakteristik bir özelliği düşük konsantrasyonlarda deiyonize suda geniş bir hidrodinamik hacme ulaşabilmesidir. Bu etkiye polimer zinciri boyunca yer alan yüklü gruplar arasındaki Coulomb itme kuvveti neden olur ve zincirin çubuğa benzer bir konformasyonda bulunmasını sağlar. Elektrolit eklenmesiyle ya da ph değişimiyle, Coulomb itme kuvvetleri engellenir. Bunun sonucunda zincirin hidrodinamik hacmi azalır ve entropik olarak daha uygun konformasyona geçer. Polielektrolitlerin aksine, poliamfolitlerin yapı özellikleri anyonik ve katyonik monomer birimleri arasındaki Coulomb çekme kuvvetleri tarafından yönlendirilmektedir. Anyonik veya katyonik gruplar yeteri kadar fazla olduğunda ( mol%), yüklü grupların itme gücü, polielektrolitlerin tipik davranışlarında olduğu gibi zincir konformasyonunda gerilmelere neden olur. Anyonik ve katyonik grupların molar oranı birbirine yaklaşmaya başladıkça Coulomb etkileşimler globular konformasyona neden olurlar ve bir çok durumda deiyonize suda çözünmezler. Elektrolit eklenmesiyle ya da ph ın değiştirilmesiyle düzensiz bir yumak konformasyonu gözlemlenebilir ve çözünmesi kolaylaştırılabilir. Bu davranış çoğunlukla antipolielektrolit etkisi olarak adlandırılmaktadır ve elektrolitlerin varlığında viskozitede bir artışa neden olmaktadır. Bu davranışı açıklamak üzere çeşitli teoriler ortaya atılmıştır (Higgs, 1991; Merle, 1987). Proteinlerin yapısında asidik ve bazik amino asitler vardır. Bundan dolayı da amfoterik özellik göstermektedirler. Bu proteinler proton verecekler veya proton alacaklardır. Asidik ortamlarda proteinler ekstra protona sahip olduklarından net pozitif bir yüke, bazik ortam koşullarında ise net bir negatif yüke sahip olacaklardır. Amino asitlerin net elektrik yüklerinin sıfır olduğu ph derecesine ise izoelektrik nokta adı verilmektedir (Şekil 2.35). Şekil 2.35 Proteinlerin ph a bağlı yük durumları.

41 30 Eğer bir protein izoelektrik noktasının ph koşullarında bulunuyorsa en az çözünür haldedir ve en kolay çöktürülebilir durumdadır. Tabloda görüldüğü gibi proteinlerin izoelektrik noktaları birbirinden oldukça farklıdır. İzoelektrik noktası nötral ph civarında bulunan pek çok proteinde asidik ve bazik amino asit sayısı birbirine eşit durumda demektir. Proteinler de tek amino asitler gibi titre edilebilmektedir. Çünkü onlarda titre edilebilecek pek çok yan grup ihtiva etmektedir. Fakat titrasyon eğrileri oldukça kompleks bir durum göstermektedir. Proteinlerin genel titirasyon eğrilerini üç ph bölgesine ayırarak incelemek mümkündür. Örneğin ph=1.5-6 arası karboksil grubunun iyonize olduğu sınırları belirtmektedir. ph=6-8.5 arası ise histidin amino asitine ve α-amino grubuna atfedilmektedir. ph=8.5 dan yukarısı ise lizinin ε-amino grubunun, tirozinin fenolik hidroksil grubunun ve sisteinin sulfidril (-SH) grubunun iyonize olduğu ph sınırları olarak kabul edilmektedir.(gözükara, 1997) 2.23 Albuminin Genel Özellikleri Albumin plazmada en fazla bulunan proteindir. Birçok nakil ve düzenleme işlemlerine önemli şekilde katkıda bulunur Albuminin en önemli fizyolojik işlevi; yağ asitlerine bağlanmak ve onları taşımaktır. Albumin aynı zamanda lisolesitin (lysolecithin), bilirubin, triptofan (tryptophan), steroidler ve ilaçlar gibi diğer birçok hidrofobik ligandlara da bağlanarak metabolizmada gerekli yerlere taşımaktır. (Goldstein, 1949; Peter, 1975) Albuminlerin düşük seviyede triptofan, metiyonin ve yüksek seviyede sistein, yüklü aminoasidler olan aspartik ve glutamik asid, lizin ve arginin içerdikleri bilinmektedir. BSA nın glisin ve isolösin içeriği ortalama bir proteinden daha düşüktür. Serum albuminlerin yapısı incelenmiştir ve yapısında 580 tane amino asit içeren, 17 disülfit bağlarıyla çapraz bağlanmış tek bir peptid zinciri olduğu bulunmuştur. Sığır ve insan serum albuminin birincil yapısı detaylı olarak karşılaştırılmıştır. (Brown, 1977)

42 31 Şekil 2.36 Albüminin polielektrolitler ile kompleks oluşturmasının şematik gösterimi. PMA (polimetakrilik asit), PSS (polisodyum sitrensülfonat). (Abe vd.,1994) Polikatyonlar çoğunlukla ilaç bağlanma yerlerinden uzak durumdaki elektrostatik etkileşimler sayesinde, sadece izoelektrik noktasından (pi=4.3) daha büyük ph bölgesinde albümin ile etkileşebilirler. Albüminin Trp ı çevresindeki konformasyonel değişim küçüktür. (Abe vd.,1994) Polianyonlar çok geniş bir ph bölgesinde albümin ile etkileşebilirler. Nötralde alkalin ph bölgelerine doğru, polianyonlar, albüminin ilaç bağlanma yerlerine özellikle bağlanma Bölgesi II na belirli bir şekilde bağlanabilir. Bölge II ile PSS nin etkişelim gücü PMA nınkinden daha güçlüdür çünkü PSS iyonik belge ve benzen halkası gibi her iki sülfonik asit rezüdüsüne sahiptir. (Abe vd.,1994) Bu etkenler proteinlerin yapay makromoleküllerle etkileşiminde sadece in vitro çalışmalarda değil aynı zamanda in vivo çalışmalarda da çok önemlidir. (Abe vd., 1994)

43 32 Şekil 2.37 BSA nın ph a bağlı yük değişimi. Proteinler poliamfolittirler ve tamamen elektrostatik etkileşim ile polielektrolitler ile etkileşebilirler. Abe vd. floresans ölçümünü kullanarak sentetik polielektrolitler ile serum proteinlerinin ön önemli bileşeninin etkileşimini incelemişlerdir. Polikatyonlar albüminin sadece izoelektrik noktasının üstünde rastgele biçimde aniyonik amino asitler ile etkileşir. Diğer tarafta, polianyonlar albüminin temel amino asitlerin lokalize edildiği ilaç bağlama bölgesi II olan spesifik bölgesi ile seçici bir şekilde etkileşir. (Abe vd., 1994) BSA proteini de bir poliamfolittir ve şu özelliklere sahiptir: Albumin genelde serum albumini veya plazma albumini anlamında kullanılır. Albumin kan dolaşımında en çok bulunan proteindir ve kanın kolloid osmotik basıncının %80 ini oluşturmaktadır (Carter ve Ho, 1994). Serum albuminin kan ph ını ayarlayan başlıca sorumlu olduğu düşünülmektedir. Memelilerde albumin preproalbumin olarak karaciğerde sentezlenir (Figge vd., 1991). Sinyal peptidlerinin uzaklaştırılmasından sonra oluşan proalbuminin N-terminal ucundaki altı peptid uzaklaştırılır. Kan dolaşımına verilen albuminin yarılanma ömrü 19 gündür. Yapılan hidrodinamik deneyler ve düşük açılı X-ışını saçılması deneylerine dayalı sonuçlar albuminin 140x40 Å boyutlarında bir elips olduğunu göstermiştir. Daha sonraki çalışmalar da bu şekli desteklemiş ve albuminin bir puro şeklinde olduğunu ortaya koymuştur. Ama 1 H NMR ile yapılan çalışmalar yapının elips şeklinde olamayacağını, albuminin daha doğrusu kalp şeklinde bir yapı olduğunu göstermiştir. Albumin molekülünün birincil yapısında yükler tek dağılım göstermezler. Nötral ph de BSA nın I, II ve III numaralı domain leri sırasıyla 10, -8 ve 0 net yüke sahiptirler. Birincil yapıdaki asimetrik yük dağılımına karşın, üçüncül yapıdaki yükler uniform özellik gösterirler (Carter ve Ho, 1994).

44 33 Şekil 2.38 HSA-warfrain kompleksi ile genistein bağlanmasının moleküler gösterimi. (Evans SV, 1993) HSA-warfrain kompeksinin kristal yapısı HSA ile geinstein in bağlanma modunu anlayabilmek için kullanılmıştır. HSA-warfrain-geinstein üçlü kompleksinin modellenmiş yapısının bağlanma yerinin yakın çekim fotoğrafı. Mor şeritler HSA nın omurgasına karşılık gelmektedir. Kristal yapıdaki warfrain ve modellenmiş geinstein küre ve çubuk, sırasıyla mavi ve yeşil simgeler olarak gösterilmektedir. Net konumlanması ve oryantasyonuna bağlı olarak, genisteinle etkileşmeye uygun polar ve aromatik rezidülerin grup yan zincirleri de gösterilmiştir BSA nın Üç Boyutlu Yapısı BSA molekülünün, her ikisi de su için ulaşılabilir olan ve Burstein in sınıflandırmasına göre 2. sınıf (spektral maksimum λ max nm, yarı genişlik Δλ 53-55nm) ve 3. sınıfa (λ max nm, Δλ 59-61nm) ait olan karşılıklı iki triptofan içerdiği bilinmektedir. Bunlar Trp-134 ve Trp-212 dir. Trp-212 globular yapı içinde çok derinde yer almaktadır. Oysa diğeri yani Trp-134 yüzeye yakın yerleşmiştir ve çözücü molekülleri ile temas halindedir. BSA nın üç boyutlu yapısı henüz elde edilememiştir. Ancak farklı kaynaklara bakılırsa amino asit dizilişlerine, çeşitli yapısal özelliklerine ve biyokimyasal özelliklerine göre BSA ve HSA nın yapıları çok benzemektedir (Peters, 1996; Peters, 1985). Mustafaev ve arkadaşları

45 34 yaptıkları çalışmayla, HSA nın durumuna göre, BSA nın üç boyutlu yapısının, kenarları 80Å ve ortalama derinliği 30Å olan katı eşkenar üçgene benzediğinin farzedilebileceğini (Curry, S. ve arkadaşları, 1998; He, X.M., 1992) ve BSA nın baskın floresans triptofanı karakteristiklerine göre (sınıf 2, yüksek kuantum verimi) HSA nın tek triptofanına uymakta olduğunu ve buna göre yaklaşık olarak molekülün merkezinde olan ve molekülün iki tarafında suya ulaşabilir olan bir hidrofobik yarığın dibine yerleşik bulunmakta olduğunu ve ayrıca düşük kuantum verimli olan ikinci triptofanın ise molekülün yüzeyinde ve su için tamamen ulaşılabilir olduğunu göstermişlerdir. Bu triptofanın kuantum verimi sınıf 2 triptofana göre 5 kat daha düşüktür (Burstein ve arkadaşları, 1973). Şekil 2.39 S-Nitrosocysteine (Cys-NO) ve S-Nitrosoglutathione (GS-NO) nin yapısı. [7] Şekil 2.40 S-Nitroso Serum Albumin (BSA-NO) (Cys-34, Tyrosine, Tryptophan) [7]

46 35 Şekil 2.41 Serum albumin molekülünün uzaydaki şeklinde bazik rezüdüler mavi, asidik rezüdüler kırımızı, nötral rezüdüler sarı gösterilmiştir. (A) önden görüntüsü, (B) arkadan görüntüsü, (C) soldan görüntüsü, and (D) sağdan görüntüsü (Carter and Ho, 1994). PAA + BSA (-) (-) PAA + BSA (-) (0) PAA + BSA (-) (+) ph 7 ph 5 ph 4 Σδ = ( ) Σδ = 0 Σδ = (+) Şekil 2.42 Farklı ph değerlerinde (ph 4, ph 5, ph 7) PAA ve BSA nın sahip olduğu yüklerin şematik gösterimi.

47 36 BSA molekülünün iki tane triptofan (Trp) kalıntısı içerdiği bilinmektedir (He and Carter, 1993). Bunlardan biri molekülün yüzeyinde bulunurken, diğeri 1. ve 3. bölgeler arasındaki hidrofobik yarığın tabanında bulunmaktadır (Brown, 1976; Peters, 1996). Cu +2 iyonlarının etkili floresans söndürücüler (quencher) (Burstein vd., 1973) olduğu düşünülürse, Cu +2 iyonlarının varlığında polielektrolitin BSA'ya bağlanmasının floresans incelenmesinin çözünür üçlü komplekslerin yapısal özellikleri hakkında değerli bilgiler sağlayabileceğini düşünebiliriz. Bu çalışmadaki ana düşünce Cu +2 'yi hem önemli bir stabilizasyon bileşeni olarak hemde bir söndürücü olarak kullanmaktır. Karıştırma sırası, metal/polimer ve polimer/protein oranları ve polimerlerin hidrofobik-hidrofil oranları gibi kompleksleşmeye etki eden faktörler tartışılmıştır. Kontrol deneyleri, kullanılan polimerlerle kompleks oluşturmayan farklı söndürücüler (süksinimid, potasyum iodür ve sezyum klorür) kullanılarak gerçekleştirilmiştir.(filenko vd., 2001) Proteinlerin triptofan (Trp) floresansının emisyon maksimumu (λ max ), kuantum verimi, floresans ömrü ve bunlar gibi diğer floresans parametrelerinin değişmesine proteinlerin konformasyon değişimlerinin neden olduğu bilinmektedir (Miller, 1978; Demchenko, 1986). Şekil 2.43 Çözeltideki Cu +2 iyonlarının değişik konsantrasyonlarında saf BSA nın (A) ve PE+BSA ([P50]/[BSA]=3,52) (B) karışımın içindeki BSA nın floresans spektrumu. BSA konsantrasyonu 0,71mg/mL, fosfat tamponu (ph=7). CuSO 4 konsantrasyonu (mm da) : 1,0.2; 2,0.15; 3,0.3; 4,0.45; 5,0.6; 6,0.9; 7,1.2; 8,1.5 Şekil 2.43A da BSA nın floresans şiddeti Cu 2+ iyon konsantrasyonu arttıkça düşüyor. Bunun anlamı BSA ile Cu 2+ etkileşime girdiğidir. Ayrıca dalga boyu artıyor ve kırmızı bölgeye doğru kayıyor. Bu arada çok az etki altındaki sınıf 2 triptofan söndürülmesi arka plandadır. Asıl olan yarıkta bulunan sınıf 3 triptofan söndürülmektedir. Sonuç olarak sınıf 3 triptofan BSA içinde etkin olan triptofandır ve metal ilavesi ile BSA nın emisyon spektrumu uzun

48 37 dalga boyuna kayar. Şekil 2.43B de ise PE-BSA karışımına Cu 2+ iyon konsantrasyonu ilavesi arttıkça floresans şiddeti düşer ve dolayısıyla üçlü kompleks oluşumu sağlanmış olur. Dalga boyu ise azalır ve mavi bölgeye kayar. Buradan, polimerin proteini sarmaladığını ve suda çözünen kararlı üçlü PE-Metal +n -BSA kompleksi oluştuğu anlaşılır. (Filenko vd., 2001) Mustafaev in bir başka çalışmasında, farklı bileşen oranları ve polimer kompozisyonlarındaki homojen sistemlerde PE-Cu 2+ -BSA karışımları için BSA triptofan floresansı çalışmasının üçlü polikompleks oluşumunun bazı önemli karakterizasyon özelliklerini açıklanmasına izin verdiğini göstermiştir (Şekil 2.44). ph=7 deki saf BSA nın floresans şiddeti (I max ) azalır (sönümlenir) ve λ max Cu 2+ konsantrasyonu arttığında kırmızıya kayma gösterir. Üçlü kompleksteki BSA karşı [Cu 2+ ] ye karşılık I max ve λ max a bağlılığının analizi BSA floresansının bileşenlerin oranı ve polimerin kimyasal kompozisyonuna bağlı olduğunu gösterir. P0+BSA karışımı için bütün P0 konsantrasyonlarında [Cu 2+ ] ye karşı I max ve λ max değerleri saf BSA çözeltisiyle aynıdır. Bu durum Cu 2+ iyonları aracılığıyla P0 ve BSA arasında herhangibir etkileşim olmadığının göstergesidir. Maksimumunun mavi bölgeye doğru kayması, [Cu 2+ ] nın artması ile floresansın sönümlenmesi gibi, polimer P50 nin varlığı numune ile tamamen farklıdır. (Mustafaev, 2004) Şekil 2.44 (A) Saf BSA nın ve (B) çözeltideki [Cu 2+ ] iyonlarının farklı konsantrasyonlarındaki poly(nipaam-aa)-bsa (P50/BSA=3,52) karışımları içindeki BSA nın floresans spektrumu. BSA konsantrasyonları 0,71mg/ml., fosfat tamponu (ph=7). CuSO 4 konsantrasyonları (mm da): 0(1),0.15(2), 0.3(3), 0.45(4), 0.6(5), 0.9(6), 1.2(7), 1.5(8). (Mustafaev, 2004)

49 UV-VIS Spektroskopisi Protein ve nükleik asitlerin konsantrasyonlarının hesaplanmasında UV-VIS spektroskopisinin kullanımı oldukça bilinen bir yöntemdir. Bomberg (2001) insülinin poliakrilik asit ile etkileşiminden sonra artık konsantrasyonunu hesaplamada kullanmıştır. Jiang ve Zhu (2001), PMAA- ve PAA-jelatin kompleks jellerindeki miyoglobin, sitokrom c ve pepsin entrapment ını saptamada kullanmışlardır. (Dubin, 2005) Tek renkli ve I 0 şiddetindeki ışık demeti kalınlığı 1 cm olan bir tüpte bulunan çözeltideki moleküller tarafından absorplandığında şiddeti azalır ve tüpü I şiddetinde terk eder. Bu azalma Lambert-Beer eşitliği ile ifade edilir. log I o / I= εbc =A (2.3) Burada c mol/lt cinsinden derişimi, ε lt/mol.cm cinsinden molar sönümlenme katsayısını ve b de cm cinsinden örnek kabının kalınlığını temsil etmektedir. A ya ise absorbans ya da optik yoğunluk denir. I 0 I -b- Şekil 2.45 Işık, c konsantrasyonunda, b cm kalınlığında bir ortamdan geçerken, absorbsiyon nedeniyle şiddeti I 0 dan I ya düşmüştür. (Çimen, 2006) Geçirgenlik; T= I/I 0 (2.4) Absorbans; A= log I 0 /I (2.5) Absorbans ile derişim arasındaki bu ilişkiden analitik olarak yararlanılır. Ancak bu çalışmamızda proteinlerin belli dalga boyunda (280 nm) absorbans piki verdikleri gerçeğine dayanarak UV-VIS moleküler absorbsiyon spektroskopisi yöntemini tanıma amaçlı kullandık. Ayrıca türbidimetrik titrasyon çalışmaları sırasında görünür bölgede (500 nm) çözeltilerin absorbansını ölçmekte kullandık.

50 Moleküler Eleme Kromatografisi Polimerlerin HPLC de ayrılmasında kullanılmaktadır. Bu kromatografi türünde sabit faz olarak belli büyüklükte gözenekleri olan çapraz bağlı polimerler kullanılır. Polimerler farklı boylardaki moleküllerin bir karışımıdır. Polimer karışımı çözelti haline getirildiğinde herbir polimer molekülü boyutuna bağlı olarak farklı hidrodinamik çaplara sahip olacaktır. Ufak moleküller gözeneklerde daha uzun süre kalacakları için kolonu geç terk edeceklerdir. Molekül çapı büyüdükçe kolonda kalma süresi kısalacak ve sistemden daha çabuk ayrılacaklardır. Detektör de farklı zamanlarda çıkan molekülleri saptayıp kromatograma dönüştürecektir. Bu yöntemin en önemli özelliği ayırmanın tamamen fiziksel olarak yapılmasıdır. Diğer tüm HPLC tekniklerinde ayırma kimyasal etkileşimlere dayanmaktadır. Şekil 2.46 Kolon kromatografisinde molekül büyüklüğüne göre ayrılma ve alıkonma zamanına göre oluşan kromatogram. (Çimen, 2006) Moleküler eleme kromatografisinde UV, RI, ışık saçılması ve viskozite detektörleri kullanılabilmektedir.

51 40 3. DENEYSEL KISIM 3.1 Kullanılan Cihazlar ve Kimyasal Malzemeler Kullanılan Cihazlar WTW ph level 1 ph metre Jasco V-530 UV-VIS Spektrofotometre PTI QM-4/2003 Steady State Floresans Spektrometre Precisa XB 220A Hassas Terazi Heildolph MR 3001 Isıtıcılı Manyetik Karıştırıcı Binder Vakum Etüvü Finnpipette Micropipet (1-10 ml, μl, 5-50 μl) Hettich Eba20 Santrifüj Cihazı Shimadzu HPLC Sistemi IKAMAG Çoklu Karıştırıcı Milipore-Q Gradient Ultra Saf Su Cihazı

52 Kullanılan Kimyasal Maddeler Sodyum hidrojen fosfat (Na 2 HPO4) Sodyum klorür (NaCl) HCl Poliakrilik asit (PAA) Sodyum dihidrojen fosfat (NaH 2 PO4) Asetik Asit (CH 3 COOH) NaOH Bovin serum albumin (BSA) Sodyum azid (NaN 3 )

53 PAA Titrasyonu 2 mg/ml konsantrasyonda 25 ml PAA çözeltisi saf su ile hazırlandı. HCl ilave ederek ph 2 ye ayarlandı. 1N NaOH çözeltisindem 15 er µl eklenerek titre edildi. Her NaOH çözeltisi ilavesinden sonra çözeltinin ph değeri okundu. Okunan ph ile NaOH sarfiyatı arasında grafik çizildi. 3.3 BSA/PAA Kompleksleri Hesaplamalardaki gibi 19 farklı oranda ve ph=4.0, ph=4.3, ph=5.0, ph=6.0 ve ph=7.0 olmak üzere 5 farklı ph da 95 tane farklı kompleks çözeltisi hazırlanmıştır. Bu çözeltiler BSA ve PAA nın fiziksel karışımlarıdır Kullanılan Çözeltiler a) 0.01 mol/lt lik PBS Tamponu (ph=7, ph=6) g NaH 2 PO 4 (Mw= g/mol) tartılarak 500ml ultra saf suda çözülür. Aynı zamanda g (Mw= g/mol) tartılarak yine 500ml ultra saf suda çözülür. Bu iki çözeltiden NaH 2 PO 4 çözeltisi Na 2 HPO 4 çözeltisinin üzerine eklenir. Bu karışıma g NaCl eklenir ve tekrar karıştırılır. 1 M NaOH veya 1 M HCl ile ph ayarlanır. b) Asetat Tamponu (ph 5, ph 4, ph 4.3) 5.72 ml asetik asit, ultra saf su ile 2 lt ye tamamlanır. Bir süre manyetik karıştırıcıda karıştıktan sonra g NaCl eklenir ve tekrar karıştırılır. 1M NaOH ile ph ayarlanır Komplekslerin Hazırlanışı PAA stok çözeltisi 3mg/ml olacak şekilde ultra saf suda hazırlandı. Her bir çözeltideki PAA miktarı sabit olduğuna göre her bir çözelti için (19 adet farklı n BSA /n PAA oranında) hazırlanan stoktan 10 ml çözelti için 3335 μl PAA çekilerek ph 7 lik tamponda iyice karışması sağlandı. Gerekli miktarda BSA tartılarak ph 7 tamponunda çözünmesi sağlanarak BSA stoğu hazırlandı. Daha sonra PAA çözeltilerinin ph ı kontrol edilerek (ph 7 de olması gerekli)

54 43 hesaba göre gerekli miktarlardaki BSA stoktan çekilerek karışmakta olan çözeltiye yavaş yavaş ilave edildi. Çözeltinin istenilen ph da olup olmadığı kontrol edildi. Yaklaşık 30 dk kadar karıştırıldı. Bütün karıştırma işlemleri manyetik karıştırıcıda ve oda sıcaklığında gerçekleştirilmiştir. Çalışılan her ph değeri için aynı aşamalar gerçekleştirildi Hesaplamalar PAA konsantrasyonu sabit tutularak, farklı BSA konsantrasyonlarına 19 farklı oranda kompleks çözeltisi hazırlanmıştır. Bu hesaplamalar şu şekildedir: n BSA n PAA = c BSA.M PAA c PAA. M BSA = 0.05; 0.1; 0.25; 0.4; 0.5; 0.75; 1; 2; 3; 5; 7.5; 10; 15; 20; 25; 30; 35; 40; 50 PAA nın çözeltideki konsantrasyonu % 0.1 dir. M PAA = Da M BSA = Da 1) n BSA /n PAA = 0.05 olan 10ml BSA-PAA Kompleks Çözeltisi c BSA = g/100ml= 0.033mg/ml= 0.33mg/10 ml 2) n BSA /n PAA = 0.1 olan 10ml BSA-PAA Kompleks Çözeltisi c BSA = g/100ml= 0.066mg/ml= 0.66mg/10 ml 3) n BSA /n PAA = 0.25 olan 10ml BSA-PAA Kompleks Çözeltisi c BSA = g/100ml= 0.165mg/ml= 1.65mg/10 ml 4) n BSA /n PAA = 0.4 olan 10ml BSA-PAA Kompleks Çözeltisi c BSA = g/100ml= 0.264mg/ml= 2.64mg/10 ml 5) n BSA /n PAA = 0.5 olan 10ml BSA-PAA Kompleks Çözeltisi c BSA = 0.033g/100ml= 0.33mg/ml= 3.3mg/10 ml 6) n BSA /n PAA = 0.75 olan 10ml BSA-PAA Kompleks Çözeltisi c BSA = g/100ml= 0.495mg/ml= 4.95mg/10 ml 7) n BSA /n PAA = 1 olan 10ml BSA-PAA Kompleks Çözeltisi

55 44 c BSA = 0.066g/100ml= 0.66mg/ml= 6.6mg/10 ml 8) n BSA /n PAA = 2 olan 10ml BSA-PAA Kompleks Çözeltisi c BSA = 0.132g/100ml= 1.32mg/ml= 13.2mg/10 ml 9) n BSA /n PAA = 3 olan 10ml BSA-PAA Kompleks Çözeltisi c BSA = 0.198g/100ml= 1.98mg/ml= 19.8mg/10 ml 10) n BSA /n PAA = 5 olan 10ml BSA-PAA Kompleks Çözeltisi c BSA = 0.33g/100ml= 3.3mg/ml= 33mg/10 ml 11) n BSA /n PAA = 7.5 olan 10ml BSA-PAA Kompleks Çözeltisi c BSA = 0.495g/100ml= 4.95mg/ml= 495mg/10 ml 12) n BSA /n PAA = 10 olan 10ml BSA-PAA Kompleks Çözeltisi c BSA = 0.66g/100ml= 6.6mg/ml= 66mg/10 ml 13) n BSA /n PAA = 15 olan 10ml BSA-PAA Kompleks Çözeltisi c BSA = 0.99g/100ml= 9.9mg/ml= 99mg/10 ml 14) n BSA /n PAA = 20 olan 10ml BSA-PAA Kompleks Çözeltisi c BSA = 1.32g/100ml= 13.2mg/ml= 132mg/10 ml 15) n BSA /n PAA = 25 olan 10ml BSA-PAA Kompleks Çözeltisi c BSA = 1.65g/100ml= 16.5mg/ml= 165mg/10 ml 16) n BSA /n PAA = 30 olan 10ml BSA-PAA Kompleks Çözeltisi c BSA = 1.98g/100ml= 19.8mg/ml= 198mg/10 ml 17) n BSA /n PAA = 35 olan 10ml BSA-PAA Kompleks Çözeltisi c BSA = 2.31g/100ml= 23.1mg/ml= 231mg/10 ml 18) n BSA /n PAA = 40 olan 10ml BSA-PAA Kompleks Çözeltisi c BSA = 2.64g/100ml= 26.4mg/ml= 264mg/10 ml 19) n BSA /n PAA = 50 olan 10ml BSA-PAA Kompleks Çözeltisi c BSA = 3.3g/100ml= 33mg/ml= 330mg/10 ml

56 UV-VIS Spektrofotometresi Ölçümleri Kompleks çözeltileri hazırlandıktan sonra optik yoğunluklarına bakıldı. Bunun için santrifüj öncesi 500 nm deki absorbansları ölçüldü. Daha sonra bu çözeltiler santrifüj edilip çökelekleri ayrıldıktan sonra süpernatantların 280nm deki absorbanslarına bakıldı. 3.5 Komplekslerin ph a Bağlı Türbidimetrik Titrasyonu n BSA /n PAA =1 oranında ph 7.0 de kompleks hazırlandı. Hazırlanan çözelti 1 M HCl kullanılarak belli bir ph değerine düşürüldü, 30 dakika karıştırıldı ve 500 nm de absorbans değeri ölçüldü. ph 4 oluncaya dek bu işlem tekrarlandı. n BSA /n PAA =15 oranında ph 7 de kompleks hazırlandı. Hazırlanan çözelti 1 M HCl kullanılarak belli bir ph değerine düşürüldü, 30 dakika karıştırıldı ve 500 nm de absorbans değeri ölçüldü. ph 4 oluncaya dek bu işlem tekrarlandı. ph 4 değerinden sonra 1 M NaOH kullanılarak ph belli bir değere yükseltildi, 30 dakika karıştırıldı ve 500 nm de absorbans değeri ölçüldü. Bu işlem ph 7 oluncaya dek tekrarlandı. 3.6 Moleküler Eleme Kromatografisi Ölçümleri Kompleks çözeltileri santrifuj edildikten sonra 0.45 μm lik enjektör filtresiyle süzülerek bu cihaza verilmiştir. 25 ºC de, 1.0 ml/dk akış hızında, 20 μl enjeksiyon hacminde ve Shim-Pack Diol-300 kolonunda UV detektörüyle (280 nm de) çalışılmıştır. Her ph değerindeki moleküler eleme kromatografisi ölçümleri için o ph daki çözeltinin hazırlanmasında kullanılan tampon, mobil faz olarak kullanılmıştır. Bu sistemden komplekslerin karakteristiği hakkında bilgi elde edilmiştir.

57 46 4. DENEY SONUÇLARI 3,5 3 2,5 OD ,5 1 0, n BSA /n PAA Şekil 4.1 ph=4.0 de hazırlanan BSA/PAA çözeltilerinin orana bağlı türbidimetrik titrasyonu. (Çimen, 2006) OD n BSA /n PAA Şekil 4.2 ph=4.3 de hazırlanan BSA/PAA çözeltilerinin orana bağlı türbidimetrik titrasyonu. (Çimen, 2006)

58 47 OD n BSA /n PAA Şekil 4.3 ph=5.0 de hazırlanan BSA/PAA çözeltilerinin orana bağlı türbidimetrik titrasyonu. (Çimen, 2006) OD n BSA /n PAA Şekil 4.4 ph=6.0 da hazırlanan BSA/PAA çözeltilerinin orana bağlı türbidimetrik titrasyonu. (Çimen, 2006)

59 48 OD n BSA /n PAA Şekil 4.5 ph=7.0 de hazırlanan BSA/PAA çözeltilerinin orana bağlı türbidimetrik titrasyonları. (Çimen, 2006) 4 3,5 3 OD 500 2,5 2 1,5 1 0, n BSA /n PAA ph 4 ph 4,3 ph 5 ph 6 ph 7 Şekil 4.6 ph=4.0, ph=4.3, ph=5.0, ph=6.0 ve ph=7.0 de hazırlanan BSA/PAA çözeltilerinin orana bağlı türbidimetrik titrasyonları. (Çimen, 2006)

60 49 Şekil 4.7 ph 5.0 de değişik oranlarda hazırlanmış BSA, PAA ve BSA-PAA karışımlarının HPLC kromatogramları. nbsa/npaa= 0.1(1); 0.25(2); 0.4(3); 0.5(4); 0.75(5); 1.0(6) (Bölge I); nbsa/npaa= 2(1); 3(2); 5(3); 7.5(4); 10(5) (Bölge II); nbsa/npaa= 15(1); 20(2); 25(3); 35(4); 40(5) (Bölge III). (Akkılıç, 2006)

61 FLORESANS SIDDETI DALGABOYU (nm) Şekil 4.8 ph=4.0 de BSA-PAA karışımındaki artan BSA konsantrasyonu ile floresans şiddetinin (I max ) değişimi. n BSA /n PAA =0,05(1): 0,25(2): 0,5(3): 1(4): 2(5): ph=4.0 de BSA (6)

62 FLORESANS SIDDETI DALGABOYU (nm) Şekil 4.9 ph=4.3 de BSA-PAA karışımındaki artan BSA konsantrasyonu ile floresans şiddetinin (I max ) değişimi. n BSA /n PAA =0,05(1): 0,25(2): 0,5(3): 1(4): 2(5): ph=4.3 de BSA (6)

63 FLORESANS SIDDETI DALGABOYU (nm) Şekil 4.10 ph=5.0 de BSA-PAA karışımındaki artan BSA konsantrasyonu ile floresans şiddetinin (I max ) değişimi. n BSA /n PAA =0,05(1): 0,25(2): 0,5(3): 1(4): 2(5): ph=5.0 de BSA (6)

64 53 FLORESANS SIDDETI DALGABOYU (nm) Şekil 4.11 ph=6.0 de BSA-PAA karışımındaki artan BSA konsantrasyonu ile floresans şiddetinin (I max ) değişimi. n BSA /n PAA =0,05(1): 0,25(2): 0,5(3): 1(4): 2(5): ph=6.0 de BSA (6)

65 54 FLORESANS SIDDETI DALGABOYU (nm) Şekil 4.12 ph=7.0 de BSA-PAA karışımındaki artan BSA konsantrasyonu ile floresans şiddetinin (I max ) değişimi. n BSA /n PAA =0,05(1): 0,25(2): 0,5(3): 1(4): 2(5): ph=7.0 de BSA (6)

66 FLUORESCENCE ARB. UNITS /(n BSA /n PAA ) Şekil 4.13 BSA-PAA karışımlarının orana bağlı floresansının değişen ph lardaki grafiği. ph=4 (1): ph=5 (2): ph=6 (3): ph=7 (4)

67 56 MAKSIMUM DALGABOYU (nm) /(n BSA /n PAA ) Şekil 4.14 BSA-PAA karışımlarının orana bağlı maksimum dalga boyunun değişen ph lardaki grafiği. ph=4 (1): ph=5 (2): ph=6 (3): ph=7 (4)

68 DELTA LAMDA /(n BSA /n PAA ) Şekil 4.15 BSA-PAA karışımlarının orana bağlı dalga boyu farkının değişen ph lardaki grafiği. ph=4 (1): ph=5 (2): ph=6 (3): ph=7 (4)

69 58 DELTA LAMDA ,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 ph DEGERLERI Şekil 4.16 BSA-PAA karışımlarının ph değerlerine bağlı dalga boyu farkının değişen BSA- PAA karışımları oranlarındaki grafiği. Oran=0,5 (1): Oran=1 (2): Oran=2 (3): Oran=4 (4): Oran=20 (5)

70 59 Şekil 4.17 ph=4.0 de değişik oranlarda hazırlanan PAA ve BSA-PAA karışımlarının HPLC kromatogramları. n BSA /n PAA = 0.5(1); 1(2); 3(3); 5(4) at ph 4.0. (A); n BSA /n PAA = 25(1); 30(2); 35(3); 50(4) ph 4.0 de (B). (Akkılıç, 2006)

71 60 Şekil 4.18 n BSA /n PAA =40 kompleksinin ph=4.0 deki fraksiyonlarının ve süpernatantının HPLC kromotogramları (A) (Akkılıç, 2006) ve 280nm dalgaboyundaki floresans ölçümleri; a: fraksiyon I, b: fraksiyon II ve c: n BSA /n PAA = 40 kompleksinin ph 4.0 deki supernatantı(b) Alan n BSA /n PAA Şekil 4.19 ph=4 de n BSA /n PAA =30,35,40,50 Pik I e ait alan değişimi. (Akkılıç, 2006)

72 nm FLORESANS SIDDETI DALGABOYU (nm) Şekil 4.20 ph=4.0 da saf BSA nın floresans spektrumu FLORESANS SIDDETI DALGABOYU (nm) Şekil 4.21 n BSA /n PAA =40 kompleksinin ph=4.0 deki çöküntüsünün fraksiyonlarının dalgaboyuna bağlı floresans grafiği. Fraksiyon I (1), nbsa/npaa=40 (2), fraksiyon II (3), ph=4.0 de BSA (4).

73 62 5. SONUÇLAR VE TARTIŞMA Bu tez çalışmasında öncelikle PAA in BSA ile etkileşimi türbidimetrik titrasyon yöntemi ile incelenmiştir. Şekil 4.1 de, C BSA =1g/L sabit olmak üzere, farklı n BSA /n PAA oranlarına göre BSA-PAA fiziksel karışımlarının 500nm deki optik yoğunlukları verilmektedir. Çözünürlüğün orana ve ph ye bağlı olarak değiştiği görülmektedir. PH=4,0 da, çok düşük oranlarda BSA-PAA karışımlarında bir faz ayrılması olduğu görülmektedir. 500nm deki optik yoğunluk değerleri, protein miktarının artmasıyla birlikte artış göstermekte, sonra bir maksimumdan geçmektedir. Oranın daha da artmasıyla birlikte belirgin bir değişim görülür. Karışımdaki protein miktarına bağlı olarak, kısmi veya tam faz ayrılması önlenir. Buna göre, ph 4,0 da, protein miktarına bağlı olarak çözünmez protein-polimer karışımlarımdan çözünür duruma geçiş olmaktadır. BSA-PAA karışımlarının ph 5,0-7,0 arasındaki analizlerine göre ise, PAA nın proteinle olan çözeltilerinde ph 4,9 (BSA nın izoelektrik noktası pi=4,9) olduğunda karışımlar geniş bir n BSA /n PAA aralığında çözünür kalmakta, 500nm deki optik yoğunluk değerleri sistemdeki protein miktarının geniş bir aralığında değişmemektedir. (Çimen, 2006) Şekil 5.1 ph 4 ve 4.3 te hazırlanan komplekslerin orana bağlı oluşumunda düşünülen model (Çimen, 2006)

74 63 Şekil 5.2 ph 5 te oluşan polimer-protein kompleksi için düşünülen model. (Çimen, 2006) Bu araştırmada, BSA ve PAA arasındaki etkileşimler değişik protein/polimer oranlarında fraksiyon kompozisyonlarının çalışmasına olanak sağlayan HPLC ile de analiz edildi. BSA nın kendisi ve farklı oranlardaki PAA ile çözünür karışımlarının HPLC sonuçları göstermiştir ki, ph 6,0-7,0 arasında BSA-PAA etkileşmesi ya yoktur ya da çok azdır (Akkılıç, 2006). Genel olarak, bu karışımların çözeltileri HPLC kromotagramlarında serbest BSA ve PAA ya karşılık gelen iki ayrı pikle karakterize olur. PAA ve BSA arasındaki elektrostatik itme kuvvetinden dolayı, kararlı polimer-protein kompleksleri oluşamamaktadır. Şekil 4.7 de ph=5.0 de BSA moleküllerinin farklı konsantrasyonları ile PAA çözeltilerinin titrasyonunun HPLC sonuçlarını görülmektedir. ph değerinin daha azalması ile ph=5,0 te PAA-BSA arasında neredeyse ölçümlerde nicel olarak belirlenebilen kompleks oluşumu gözlenir. ph=5.0 de BSA moleküllerinin farklı konsantrasyonları ile PAA çözeltilerinin titrasyonunun HPLC sonuçlarını görülmektedir. Bu sonuçlarda karışım kompozisyonunda reaksiyonun üç bölgesi ayırt edilebilir (Şekil 4.7). Birinci bölgede BSA-PAA çözeltisi, kromatogramda suda çözünen protein/polimer komplekslerine ait olan sadece tek pik ile karakterize edilir. n BSA /n PAA = arasında elde edilen çözeltilerin kromatogramlarında iki pik elde edilmiştir (Bölge II). Bu bize iki tür suda çözünür polikompleks olduğunu gösterir. nbsa/npaa=15-40 arasında (Bölge III) suda çözünen BSA-PAA kompleksleri serbest BSA molekülleri ile bir arada bulunur. HPLC metotları ile suda çözünmeyen BSA-PAA karışımlarının süpernatantlarının analizi, Bölge I de (n BSA /n PAA =0,1; 0,25; 0,4; 0,5; 0,75 ph=5.0 de) suda çözünen polikompleks suda çözünmeyen BSA-PAA kompleks parçacıkları ile bir arada bulunduğunu gösterir. n BSA /n PAA =0,1; 0,25; 0,4; 0,5; 0,75 oranlarında Bölge II de, çökeltinin çıkarılmasından sonra çözeltide hiç polimerik bileşen (protein, polianyon ya da suda çözünen BSA-PAA

75 64 kompleksleri) yoktur (Şekil 4.7). Bu bölgede bütün protein ve polimer molekülleri suda çözünmeyen komplekslerin fraksiyonunda alı konulur. Ayrıca bu oranlardan daha büyük bir oranda protein eklendiğinde çözeltinin türbitidesinde azalma gözlenir (Bölge III). n BSA /n PAA oranında sistem tekrar homojen hale gelir ve çözeltilerin (süpernatantların) kromatogramlarında iki pik elde edilir. n BSA /n PAA oranında serbest proteinle, yeni suda çözünen (Pik I) ve çözünmeyen BSA-PAA kompleks partiküllerinin birlikte bulunduğu gözlenir. BSA nın ardaşık olarak eklenmesinden sonra çözeltinin çökmesinin tamamlanması ile yavaş pik alanı büyürken, hızlı pik alanında herhangi bir değişmeye yol açmaz. Serbest BSA molekülleri sadece suda çözünen BSA-PAA kompleksleri ile birlikte bulunur. Şekil 4.8, Şekil 4.9, Şekil 4.10, Şekil 4.11 ve Şekil 4.12 de değişik molar BSA/PAA oranlarında PAA-BSA karışımlarında BSA ve saf BSA nın tipik floresans spektrumu verilmiştir. Proteinlerin triptofan (Trp) floresanslarının, emisyon maksimumu (λ max ), kuantum verimi, lifetime gibi floresans parametrelerinin değişikliğinin sonucu olarak değiştiği iyi bilinir. Şekil 4.8, Şekil 4.9, Şekil 4.10, Şekil 4.11 ve Şekil 4.12 de gösterilen BSA nın floresans şiddeti (I max ) ph=4.0, 4.3, 5.0, 6.0, 7.0 de BSA-PAA karışımlarında BSA konsantrasyonu artmasında değiştiği gösterilir. Çözeltinin değişik bileşen oranlarında ve ph değerlerindeki homojen sistemlerdeki BSA-PAA karışımları için BSA triptofan floresans incelemesi, bazı önemli özellikleri tanımlayan polikomplekslerin oluşumunun açıklamasına izin verir. Şekil 4.13 PAA nın sabit konsantrasyonunda çözeltinin farklı ph ları ile I max ın n BSA /n PAA a bağlılığını gösterir. Şekil 4.13 den görüleceği gibi PAA nın varlığında BSA nın floresansı ph=4.0, 5.0, 6.0 ve 7.0 nin bütün incelenmiş alanında BSA-PAA karışımlarında artan polimer konsantrasyonu ile sönümlenir. Aynı zamanda sönümlenmenin derecesi çözeltinin ph ının azalmasıyla artmaktadır. Bu etki karışımda kısmen çökeltinin var olmasından dolayı ph=4.0 de aslında daha yüksektir. Dalgaboyu spektral kayması aslında çözeltinin bileşenlerinin ve ph ının farklı oranlarda BSA-PAA karışımları için söylenir. Şekil 4.15 da karışımların farklı ph larda molar protein/pe oranlarına bağlılığı verilmiştir. Gerçekten, polimer miktarının artması önemli mavi spektral kaymaya götürür. ph=4.0 de ve daha yüksek polimer konsantrasyonlarında bu kayma maksimum değere ulaşır. Buradan BSA triptofanlarının, protein ile polimerin giderek daha sıkı bağlanmasının sonucunda sulu çözelti için daha az ulaşılabilir olduğu anlaşılır. Böylece alınan piklerde maviye kaymalar gözlenir. Bu maviye kaymalar, kompleksleşen PAA

76 65 zincirleri tarafından sulu ortamdan triptofan rezidülerinin korunmasının sonucu olarak yorumlanır. PAA ph=6.0 ve 7.0 de protein ile bazı etkileşimler gösterir. Gerçekte BSA nın polimere maksimum oranı, BSA nın floresansının maviye bölgeye kayması ph=6.0 ve ph=7.0 de sırasıyla 340nm den 338nm ve 333nm ye ulaşır. Bu da protein polimer etkileşimiyle ortaya çıkan su ortamındaki BSA nın triptofanlarının gözlenmesine olanak sağlar. Fakat ph=5,0 de PAA, n PAA /n BSA =20 oranındaki BSA nın floresansı daha küçük polimer-protein oranına göre daha büyük maviye kayma göstermiştir. Bu onun proteinle yakın etkileşimini gösterir. ph=4.0 de bu kayma maksimum değerine ulaşır ve n PAA /n BSA =20 oranında BSA floresans spektrumu içteki triptofanların su ortamından tamamen ulaşılamaz olduğu λ max =313nm ve spektrum genişliğinin yarısı olan 313nm ile aynı olur.bu bize oluşan BSA-PAA kompleksinin içindeki BSA triptofanlarının, bütün BSA yüzeyini görünüşte örten polimer tarafından sulu çözeltiden tamamen izole edildiğini gösterir (Şekil 5.3). Polimer konsantrasyonlarındaki artışlarda bu kayma birinci sınıf triptofanlar için karakteristik değere ulaşır. Aynı zamanda diğer ph lar ile karşılaştırıldığında maksimum değere ulaşan ph=4.0 de sistem için floresansın sönümlenmesi önemsizdir. Bu bize şunu gösterir; ph=4.0 da BSA ve PAA molekülü arasında koordinasyon bağında çalışmada kullanılan çözeltilerin diğer ph ları ile karşılaştırıldığında yüklerin en geniş miktarı kullanılır. Sistemin böyle davranışı, protein ve polimer arasındaki bağlar tuz oluşumuna öncülük eden, düşük ph da BSA amin grupları ve PAA polar yan grupları (-COOH) ın protonlanmasıyla hesaplanılabilir. Şekil 5.3 ph=4 için BSA-PAA kompleksleşmesinin modeli.