KROMATOGRAFİ. Bir parça kağıt şeridin aşağı hizasından 1 cm kadar yukarısına bir damla siyah mürekkep damlatınız.

Transkript

1 KROMATOGRAFİ Kromatografi, bir karışımda bulunan maddelerin, biri sabit diğeri hareketli faz olmak üzere birbirleriyle karışmayan iki fazlı bir sistemde ayrılması ve saflaştırılması yöntemidir.

2 KROMATOGRAFİ İlk kez Rus botanikçi Mikhail Tsvett (1903) tarafından geliştirilen bir yöntemdir. Tsvett bu yöntemi bitki pigmentlerinin renkli bileşenlerini ayırmakta kullanılmıştır. Kullandığı kolonda renkli bandlar oluştuğundan, bu ayırma yöntemine kromatografi adını vermişti

3 KROMATOGRAFİ Bir parça kağıt şeridin aşağı hizasından 1 cm kadar yukarısına bir damla siyah mürekkep damlatınız. Kağıt şeridi, mürekkep damlattığınız kısım su hizasının üstünde kalacak şekilde su tankına batırınız ve dik bir şekilde tutunuz. Su,kapiler etkisiyle kağıt üzerinde yukarı doğru yürürken mürekkebi çözer ve sürüklemeye başlar. Mürekkebin içindeki bileşenler kağıt üzerinde farklı hızlarda ilerleyerek ayrılmış olur.

4 KROMATOGRAFİ

5 KROMATOGRAFİ Kromatografi, bir karışımda bulunan maddelerin, biri sabit diğeri hareketli faz olmak üzere birbirleriyle karışmayan iki fazlı bir sistemde ayrılması ve saflaştırılması yöntemidir. Çeşitli maddelerin hareketli faz yardımıyla, sabit faz üzerinde, değişik hızlarla hareket etmeleri veya sürüklenmeleri esasına dayanır.

6 Kromatografi nin Sınıflandırılması Ayrılma Mekanizmalarına Göre Uygulama Biçimine Göre Faz Tiplerine Göre

7 Kromatografi nin Sınıflandırılması Ayrılma Mekanizmalarına Göre Adsorpsiyon kromatografisi Partisyon kromatografisi İyon değiştirme kromatografisi Jel filtrasyon (Moleküler eleme) kromatografisi İyon çifti kromatografisi Afinite kromatografisi

8 Kromatografi nin Sınıflandırılması Uygulama Biçimine Göre - Düzlemsel kromatografi Kağıt kromatografisi İnce tabaka kromatografisi (TLC) - Kolon kromatografisi Gaz kromatografisi (GC) Yüksek basınçlı sıvı kromatografisi (HPLC)

9 Kromatografi nin Sınıflandırılması Faz Tiplerine Göre -Sıvı kromatografisi Sıvı-Katı kromatografisi Sıvı-Sıvı kromatografisi - Gaz kromatografisi Gaz-Katı kromatografisi Gaz-Sıvı kromatografisi

10 Kromatografi nin Sınıflandırılması Ayrılma Mekanizmalarına Göre Adsorpsiyon kromatografisi Partisyon kromatografisi İyon değiştirme kromatografisi Jel filtrasyon (Moleküler eleme) kromatografisi İyon çifti kromatografisi Afinite kromatografisi

11 Ayrılma Mekanizmasına na GöreG Adsorpsiyon Kromatografisi Adsorpsiyon, bir karışımda bulunan sıvı veya gaz halindeki maddelerin katı faz üzerine tutunmasıdır. Adsorpsiyon kromatografisi ise örnek bileşenlerinin dolgu maddesinin yüzeyinde farklı olarak tutunmaları sonucu meydana gelen bir ayırma işlemidir. Adsorpsiyon kromatografisinde; maddeler katı olan sabit faz ile sıvı veya gaz olan hareketli faz arasında etkileşir. Faz tiplerine göre adsorpsiyon kromatografisi sıvı-katı gaz-katı kromatografisidir. Sabit faz : Durgun veya hareketsiz fazdır Hareketli faz : Sabit faz üzerinde hareket ederek numune bileşenlerinin ayrılmasını sağlayan fazdır

12 Ayrılma Mekanizmasına na GöreG Adsorpsiyon Kromatografisi Sabit faz Ayrılması gereken maddeleri parçalamamalı Ayrılması beklenen maddeler ile kimyasal reaksiyon vermemeli Adsorpsiyon kapasitesi yüksek olmalı Adsorpladıkları maddeleri kolaylıkla geri vermeli

13 Ayrılma Mekanizmasına na GöreG Dağılma (Partisyon) Kromatografisi Dağılma kromatografisinde; maddeler sıvı olan sabit faz ile sıvı veya gaz olan hareketli faz arasında dağılır. Birbiriyle karışmayan iki sıvıdan, yani iki fazdan oluşan bir faz sistemi içine konulan madde bu sıvılardaki çözünürlüğüne bağlı olarak iki faz arasında dağılır ve dengeye ulaşır. Böyle bir sistemde maddelerin dağılması sabit olup dağılma katsayısı ile ifade edilir ve K d ile gösterilir. Böylece K d değerleri birbirinden farklı olan maddeler kromatografik sistem içersinde farklı hızlarda ilerleyerek birbirlerinden ayrılırlar. K d = C1/C2 C1 : Maddenin 1. fazdaki derişimi C2 : Maddenin 2. fazdaki derişimi Faz tiplerine göre partisyon kromatografisi sıvı -sıvı sıvı -gaz kromatografisidir. Destek:Dağılma kromatografisinde, sıvı sabit fazın adsorplandığı materyaldir.

14 Ayrılma Mekanizmasına na GöreG İyon Değiştirme Kromatografisi Maddelerin iyonik grupları ile iyon değiştiricideki iyonik grupların eşdeğer miktarlarının karşılıklı yer değiştirmesi esasına dayanır. İyon değiştirme kromatografisi, kullanılan iyon değiştiricinin anyon veya katyon aktarmasına göre sırasıyla anyon değiştirme kromatografisi veya katyon değiştirme kromatografisi olarak adlandırılır. Anyon Değiştirici I - Cl - Cl - ve I - karışımının nitrat bağlanmış anyon değiştirici RNO 3 ile bileşenlerine ayrılmasında geçerli dengeler aşağıdaki biçimdedir: Cl - + RNO RCl + 3 NO - 3 I - + RNO 3 RI + NO - 3 R: Çözünmeyen Matriks RNO 3 : Anyon Değiştirici

15 Ayrılma Mekanizmasına na GöreG İyon Değiştirme Kromatografisi İnorganik iyon değiştiriciler : Na 2 Al 2 Si 4 O12 Ca Na 2 P Organik iyon değiştiriciler: Ca 2+ Fe 2+ Mn 2+ Mg 2+ Anyonik, Katyonik ve Amfoter Reçineler

16 Ayrılma Mekanizmasına na GöreG İyon Değiştirme Kromatografisi İyon değiştirmeyi etkileyen faktörler Hareketli faz derişimi Hareketli faz ph sı Kompleks oluşturucu etki İyon değiştirme kromatografisinin uygulanması Ayrılmalar lmaları güç olan bazı iyonları ve asitlerin Aminoasitler Seyreltik iyon çözeltileri deriştirmede Asit ve baz elde edilmesinde NaCl NaOH + Cl-

17 Ayrılma Mekanizmasına na GöreG Jel Filtrasyon (Moleküler Eleme) Kromatografisi Karışımdaki moleküllerin molekül büyüklüklerinde göre ayrılması esasına dayanır.

18 Ayrılma Mekanizmasına na GöreG İyon Çifti Kromatografisi Bu teknik, özellikle iyonlaşabilen asidik veya bazik maddelerin ayrılmasında kullanılır. Hareketli faza ilave edilen iyon çifti reaktif sabit faz tarafından adsorplanır ve iyonize olmuş maddeler bu iyon çiftleri ile iyonik etkileşime girerek birbirinden ayrılır.

19 Ayrılma Mekanizmasına na GöreG Afinite Kromatografisi Seçiciliği fazla olan bu yöntem, kromatografi tekniklerinin en yenisidir. Antijen Antikor Enzim Substrat Reseptör İlaç gibi oldukça spesifik etkileşimlere dayanır.

20 Kromatografi nin Sınıflandırılması Uygulama Biçimine Göre - Düzlemsel kromatografi Kağıt kromatografisi İnce tabaka kromatografisi (TLC) - Kolon kromatografisi Gaz kromatografisi (GC) Yüksek basınçlı sıvı kromatografisi (HPLC)

21 Düzlemsel Kromatografi

22 Düzlemsel Kromatografi UV Lambası

23 Kolon Kromatografisi

24 Kolon Kromatografisi 1903 yılında Tsvet bitki pigmentleriyle çalışırken kolon dolgu maddesi olarak kireç kullanmıştı. Günümüzde ise çoğunlukla silika jel ve alumina kullanılmaktadır.

25 Kolon Kromatografisi

26 Kolon Kromatografisi Gaz Kromatografi (GC) Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografi (HPLC)

27 Kolon Kromatografisi Gaz Kromatografi (GC) Yüksek Basınçlı Sıvı Kromatografi (HPLC)

28 YÜKSEK PERFORMANSLI SIVI KROMATOGRAFİSİ HPLC Sıvı Kromatografisi: Sıvı kromatografisi düzlemsel yüzeylere ve kolonlara uygulanabilen bir kromatografi türüdür. Normal Faz Sıvı Kromatografisi: Polar sabit faz ve apolar veya düşük polariteye sahip hareketli faz Ters Faz Sıvı Kromatografisi: Sabit faz apolar, hareketli faz ise polardır

29 YÜKSEK PERFORMANSLI SIVI KROMATOGRAFİSİ HPLC - Polar molekül - Apolar molekül Tanecik Apolar faz Hareketli faz Kolon Sabit Faz Polaritesi Çözücü Polaritesi Örnek Çıkış Yeri Normal-faz Yüksekten ortaya Ortadan düşüğe Apolar önce Ters-faz Ortadan düşüğe Yüksekten ortaya Polar önce

30 YÜKSEK PERFORMANSLI SIVI KROMATOGRAFİSİ HPLC Ters faz Normal faz C 18 C 8 C 2

31 YÜKSEK PERFORMANSLI SIVI KROMATOGRAFİSİ Ters faz kromatografisinin avantajları 1. Normal faz kromatografide, sıvı fazın kontrolü çok önemli ve kritiktir. Hareketli faz bileşimindeki küçük değişiklikler kromatogramda belirgin farklılıklara neden olabilir. 2. Dengeye ulaşma normal faz kromatografide çok yavaştır. 3. Normal faz kromatografide polar maddelerin elüsyonu çok yavaştır ve yayvan piklere sebep olur. 4. Apolar çözücüler çok pahalıdır, ayrıca nemden uzak tutmak zordur.

32 YÜKSEK PERFORMANSLI SIVI KROMATOGRAFİSİ Sıvı kromatografisi yönteminin özel bir uygulaması olan yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) yönteminde, sabit faz olarak kullanılan dolgu maddelerinin tanecik boyutunun küçültülmesi sonucu hareketli faz ile etkileşen sabit faz yüzey alanı büyür ve böylece kolonun etkinliği arttırılmış olur. Çok sıkı olarak doldurulmuş kolondan hareketli fazın belirli bir hızla geçebilmesi için basınç uygulanması gerekir. 3 bar

33 YÜKSEK PERFORMANSLI SIVI KROMATOGRAFİSİ HPLC nin avantajları HPLC kolonu, rejenerasyon gerekmeksizin pek çok kez kullanılabilir. HPLC tekniği kullanıcının becerisine daha az bağımlıdır ve tekrarlanabilirlik daha yüksektir. Nicel analiz kullanılabilir. Analiz süresi kısadır. Duyarlık yüksektir.

34 YÜKSEK PERFORMANSLI SIVI KROMATOGRAFİSİ HPLC Cihazı Hareketli faz rezervuarı Pompa Enjektör Kolon Dedektör

35 YÜKSEK PERFORMANSLI SIVI KROMATOGRAFİSİ Kromatografide Temel Parametreler Alıkonma Zamanı ve Alıkonma Hacmi

36 YÜKSEK PERFORMANSLI SIVI KROMATOGRAFİSİ Kromatografide Temel Parametreler Alıkonma Zamanı ve Alıkonma Hacmi t r1 Dedektör cevabı t 0 Zaman veya Hacim t 0 = Hareketli fazın alıkonma zamanı t r = Alıkonma zamanı

37 YÜKSEK PERFORMANSLI SIVI KROMATOGRAFİSİ Kromatografide Temel Parametreler Kapasite Faktörü Alıkonma hacmi = V R = V m + KV s k' = (V R V 0 ) / V 0 Akış hızı sabitse k = t r t 0 t 0 k' = K V s / V m 1 < k < 10

38 YÜKSEK PERFORMANSLI SIVI KROMATOGRAFİSİ Kromatografide Temel Parametreler Etkinlik N t = σ 2 2 r 2 16t r N = = 2 w 5.55 w 1 2 tr 2 2 1/2h w w 1/2 h t 0 t r

39 YÜKSEK PERFORMANSLI SIVI KROMATOGRAFİSİ Kromatografide Temel Parametreler Seçicilik İki maddeye ait kapasite faktörü oranına α = k' 2 / k' 1 = (t R2 t 0 ) / (t R1 t 0 ) Seçicilik, esas olarak sabit faz özelliklerine bağlıdır ancak hareketli faz bileşimi de seçiciliği etkiler.

40 YÜKSEK PERFORMANSLI SIVI KROMATOGRAFİSİ Kromatografide Temel Parametreler Ayırıcılık R=0.50 R=0.75 t 0 zaman t 0 zaman R 1 R=1.00 R=1.50 t 0 zaman t 0 zaman

41 YÜKSEK PERFORMANSLI SIVI KROMATOGRAFİSİ Kromatografide Temel Parametreler Ayırıcılık R = 2 (t R2 t R1 ) / (w 1 + w 2 )

42 YÜKSEK PERFORMANSLI SIVI KROMATOGRAFİSİ Nicel Analiz İçin HPLC de Kullanılan Kalibrasyon Teknikleri: Doğrudan Kalibrasyon Tekniği: Alan veya Pik Yüksekliği Derişim im (ppm( ppm) Alan S 1 S 2 S 3 S Cx Derişim

43 YÜKSEK PERFORMANSLI SIVI KROMATOGRAFİSİ Nicel Analiz İçin HPLC de Kullanılan Kalibrasyon Teknikleri: İç Standart Tekniği: IS N Concentration time Yüksek kesinlik elde edilir; çünkü bu metot ile numune enjeksiyonu, akış hızı ve kolon şartlarındaki değişmelerle oluşan belirsizlikler en aza indirilir.

44 YÜKSEK PERFORMANSLI SIVI KROMATOGRAFİSİ Nicel Analiz İçin HPLC de Kullanılan Kalibrasyon Teknikleri: İç Standart Tekniği: Derişim Alan Derşim IS Derişim oranı Numune IS Alan oranı 5 25,00 0, , ,00 0, , ,00 1, , ,00 2, , ,00 4, ,03 Bu metotta, standart ve numune çözeltilerinin her birisine dikkatle ölçülmüş miktarda bir iç standart (IS) katılır.

45 YÜKSEK PERFORMANSLI SIVI KROMATOGRAFİSİ Nicel Analiz İçin HPLC de Kullanılan Kalibrasyon Teknikleri: İç Standart Tekniği: Alan oranı y = 0,0307x - 0,0515 R 2 = 0, Derişim Alan oranı y = 0,7681x - 0,0515 R 2 = 0, Derişim oranı

46 YÜKSEK PERFORMANSLI SIVI KROMATOGRAFİSİ Nicel Analiz İçin HPLC de Kullanılan Kalibrasyon Teknikleri: Standart Ekleme Tekniği: Alan y = 980x R 2 = 0, ,1 0,2 0,3 0,4 0,5 Derişim (M)