KANTARON OTUNDAN (HYPERİCUM PERFORATUM L.) ELDE EDİLEN HYPERİSİN MADDESİNİN İNSAN LENFOSİT KÜLTÜRLERİNDE KARDEŞ KROMATİD DEĞİŞİMİ (KKD) ÜZERİNE ETKİSİ

Transkript

1 T.C. SÜLEYMAN DEMİREL ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ KANTARON OTUNDAN (HYPERİCUM PERFORATUM L.) ELDE EDİLEN HYPERİSİN MADDESİNİN İNSAN LENFOSİT KÜLTÜRLERİNDE KARDEŞ KROMATİD DEĞİŞİMİ (KKD) ÜZERİNE ETKİSİ Nezahat KAŞTAN YÜCEL TIBBİ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI YÜKSEK LİSANS TEZİ DANIŞMAN Doç. Dr. H. Ramazan YILMAZ Bu Tez Süleyman Demirel Üniversitesi Araştırma Fonu tarafından 746 no lu proje ile desteklenmiştir. TEZ NO: ISPARTA

2 KABUL VE ONAY Sağlık Bilimleri Enstitüsü Müdürlüğüne; Süleyman Demirel Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü Tıbbi Biyoloji Anabilim Dalı Yüksek Lisans Programı Çerçevesinde yürütülmüş olan bu çalışma, aşağıdaki jüri üyeleri tarafından yüksek lisans tezi olarak kabul edilmiştir. Tez savunma tarihi: 25/01/2006 Tez Danışmanı: Doç Dr. H. Ramazan YILMAZ Üye :Doç. Dr. H.Ramazan YILMAZ Süleyman Demirel Üniversitesi Tıbbi Biyoloji Anabilim Dalı Üye :Prof. Dr. Nurten ÖZÇELİK Süleyman Demirel Üniversitesi Tıbbi Biyoloji Anabilim Dalı Üye :Yrd.Doç.Dr.Ekrem ÇİÇEK Süleymen Demirel üniversitesi Farmakoloji Anabilim Dalı ONAY: Bu tez Enstitü Yönetim Kurulunca belirlenen yukarıdaki jüri üyeleri tarafından uygun görülmüş ve enstitü yönetim kurulu kararıyla kabul edilmiştir. Prof. Dr. Halis KÖYLÜ Enstitü Müdürü i

3 TEŞEKKÜR Tıbbi Biyoloji Anabilim Dalında bana Yüksek lisans çalışmalarımı yapma olanağı sağladığı için değerli hocam sayın Prof. Dr. Nurten ÖZÇELİK e, Tez çalışmalarım sırasında yardımları ve eleştirileri ile bana katkıda bulunan tez danışman hocam sayın Doç. Dr. H. Ramazan YILMAZ a, Araştırmalarımda kullandığım yöntemleri öğrenmemde, laboratuar çalışmalarımda ve tezimi yazmamda yardımlarını esirgemeyen Tıbbi Biyoloji A.D. Öğretim Üyeleri Yrd. Doç.Dr. Efkan UZ a, Yrd. Doç. Dr. Nilüfer CALAPOĞLU na, Araştırma Görevlileri: Arş. Gör. Pınar KOŞAR a, Arş. Gör. Mustafa SOYÖZ e, Arş.Gör. Esin ÇETİN e, Arş. Gör. Ayşe ALTUBAŞAK a ve Arş. Gör. Barış YAŞAR a, Her zaman destek olan iş arkadaşlarım Isparta Devlet Hastanesi Kan Merkezi çalışanlarına, Çalışmalarımda anlayışını ve desteğini esirgemeyen değerli eşim Bilal Serdar YÜCEL e, sevgili kızım R. Ahsen YÜCEL e sonsuz teşekkür ediyorum. Bu çalışmayı destekleyen Süleyman Demirel Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Yönetim Birimi (SDÜBAP) ne teşekkür ederim. ii

4 İÇİNDEKİLER KABUL VE ONAY... i TEŞEKKÜR...ii İÇİNDEKİLER...iii SİMGELER VE KISALTMALAR... iv ŞEKİL, TABLO, GRAFİK ve RESİM LİSTESİ... v 1. GİRİŞ GENEL BİLGİLER Hypericum Perforatum L. Hakkında Genel Bilgiler Hypericum perforatum L. nin Sistematiği Hypericum L. nin Genel Özellikleri Hypericum L. Genusunun Taşıdığı Maddeler Hyperisin Hyperforin Kardeş Kromatid Değişimi (KKD) KKD nin Tarihçesi KKD nin Kullanım Alanları KKD Mekanizmaları KKD Oluş Mekanizması ile İlgili İleri Sürülen Modeller KKD Yöntemini Etkileyen Faktörler MATERYAL VE METOD Materyal Kimyasallar Diğer Malzemeler Deney Gruplarının Oluşturulması Metod Hücre Kültürlerinin Kurulması Kromozom Eldesi KKD Boyama Tekniği KKD nin Değerlendirilmesi İstatistiksel İşlemler Fotografik İşlemler BULGULAR TARTIŞMA VE SONUÇ ÖZET SUMMARY KAYNAKLAR iii

5 SİMGELER VE KISALTMALAR KKD : Kardeş Kromatid Değişimi KA : Kromozom Aberasyonu PDT : Fotodinamik Tedavi MAP kinaz : Mitoz Aktive Edici Protein Kinaz PUFA : Poliansatüre Yağ Asidi PKC : Protein Kinaz C CDK : Siklin Depended Kinaz ROS : Reaktif Oksijen Radikalleri RT : Revers Transkriptaz ATP : Adenozin Trifosfat MHO : Monoamin Oksidaz COMT : Katekolamin Metil Tranferaz GABA : Gama Amino Bütirik Asit FPG : Floresans ve Giemsa Yöntemi 3 HdTh : 3H-deoksi-timidin, Radyoaktif Timidin BrdU : 5-Bromo-2 deoxyüridin TNFR : Tümör Nekroz Faktör Reseptörü TRAIL : TNF-releated apopitozis indused ligand iv

6 ŞEKİL, TABLO, GRAFİK VE RESİM LİSTESİ Şekil 1: Hypericum perforatum L. nin genel görünümü.. 4 Şekil 2: Hyperisin in aromatik formülü 9 Şekil 3: Hyperforini n aromatik görünümü Şekil 4: Kromozomlarda oluşabilecek KKD lerin şematik gösterimi 23 Şekil 5: KKD oluşum mekanizması. 24 Şekil 6: Timinin ve BrdU in halkasal yapısı.. 25 Şekil 7: BrdU varlığına bağlı spirilizasyon gecikmesi Şekil 8: Evens isimli araştırıcının ileri sürdüğü KKD oluş mekanizması Şekil 9: KKD oluş mekanizması Tablo 1: Hypericum perforatum metanol ekstraktının taşıdığı bileşikler... 7 Tablo 2: Hypericum perforatum um antidepresan etkisi kanıtlanmış extraktları Tablo 3: Gruplar arasındaki KKD değerleri.. 38 Tablo 4: Kadın ve erkek KKD değerleri Grafik 1: Grup I ve II nin KKD değerlerinin karşılaştırılması Grafik 2: Grup I ve III ün KKD değerlerinin karşılaştırılması.. 40 Grafik 3: Grup II ve III ün KKD değerlerinin karşılaştırması. 40 Resim 1: Grup I e ait bir metafaz örneği Resim 2: Grup II e ait metafaz örneği Resim 3: Grup III e ait bir metafaz örneği v

7 1. GİRİŞ Bitkilerin tedavide kullanımları insanlık tarihi kadar eskiye dayanmaktadır. İnsanoğlu ilk çağlarda, hastalıkları iyileştirebilmek için tabiata ve hayvanlara özellikle de bitkilere yönelmiştir. Sınama yanılma yöntemi ile bazen etkili ilaçlar bulup onlardan istifade etmiştir. Afyon bitkisinden saflaştırılmış olan morfin, kodein gibi ilaçlarla, digoksin ve digitoksin gibi kalp glikozitleri de halkın ilaç olarak kullandığı bitkilerden elde edilmiştir (1,2). Tez konusu olarak seçtiğimiz halk arasında sarı kantoran, binbirdelik otu olarak bilinen Hypericum perforatum, Türkiye de ve Avrupa da yaygın yetişen yabani bir bitkidir. H. perforatum Hypericaceae (Guttiferae) familyasından olup bu familyanın Türkiye de 89 türü yetişmektedir. Bunların 43 ü ise endemiktir (3). H. perforatum geleneksel folklorik ilaç olarak dahilen ağrı giderici, yatıştırıcı, parazit düşürücü, ülser tedavi edici ve haricen de yara iyileştirici olarak ülkemizde kullanılmaktadır (4). Yapılan araştırmalarla bu tıbbi bitkinin antitümör (5), antiviral (6), antidepresan (7), antibakteriyal (8), antiinflamatuar (9), analjezik (10) ve hepatoprotektif (11) etkilerinin olduğu belirlenmiştir. Avrupada St. John Wort olarak tanınan bu bitkinin en zengin hyperisin (Hy) ve türevleri (pseudohyperisin) kaynağı olduğu bulunmuştur (12). Hy bilinen en güçlü doğal fotosensitizerdir (13). Son yıllarda bu bileşikler tümöral ve viral hastalık tedavisinde, ayrıca ılımlı depresyon yatıştırmada önem kazanmıştır den beri antiviral etkisi araştırılmakta olup etki mekanizması henüz açıklanamamıştır (14). Işığa duyarlaştırıcı olan ve lipitte çözünen Hy nin tümör hücreleri ve zarflı virüsler üzerine güçlü fotodinamik etkisi olduğu rapor edilmiş fakat Hy in tümör hücresi ölüm mekanizmasını nasıl teşvik ettiği çeşitli teoriler ileri sürülmesine rağmen henüz tam olarak açığa kavuşturulamamıştır. Hy nin bu antitümör ve antiviral etkisinin fotosensitizer özelliğinden kaynaklandığı bilinmektedir. Hy nin düşük dozlarda antiproliferatif etki gösterdiği, yüksek dozlarda ise hem apopitozis hem de nekroz yoluyla tümör hücrelerini yok ettiği düşünülmektedir (15). 1

8 Hücre ve organellerin yıkımını ışık aracılığı ile katalize eden fotosensitizer ajanların kullanılmasına fotodinamik terapi (FDT) denilmektedir. FDT kanser tedavisi için kullanılan yeni ve umut verici yöntemlerden biridir. Antitümoral PDT bir fotosensitizerin sistemik uygulamasını ve tümöral lezyona oksijen varlığında görülebilir ışığın dağıtılmasını hedefler (16). Bu sağlandığı zaman tip I veya tip II reaksiyonu vasıtasıyla reaktif oksijen radikallerinin lokal üretimi lipit membranlarda zincirleme reaksiyonları gerçekleştirerek tümör harabiyetine sebep olur (17). FDT virüslere uygulanırsa zarf yapısının bozulmasını sağlayarak virüsün infekte etme özelliğinin kaybına neden olur (18). Son yapılan araştırmalarda ışıkla aktive edilen Hy nin intrinsik veya ekstrinsik apopitozis yollarından her ikisini de aktifleyebileceği ileri sürülmüş kesin bir açıklama getirilememiştir (19). Tarih boyunca insanlar H. perforatum u ruhsal sıkıntı, hafif depresyon, yorgunluk, bitkinlik tedavisi için kullanmışlardır. Günümüzde ise H. perforatum eksraktları, depresyon yatıştırmada doğal teropatik ajanların en faydalı olanlarındandır (20). Ayrıca diğer antidepresanların etki mekanizmalarından farklı bir etki mekanizmasına sahip olduğu düşünülmektedir. Nörokimyasal etkisinin santral sinir sisteminde H. perforatum a ya bir çok düzenleyicinin cevap vermesi ya da enzimatik aktivite mekanizmasının inhibisyonu şeklinde olduğu ileri sürülmüştür. Antidepresan etkinin, H. perforatum un içerdiği hyperisinler, hyperforinler, pikosiyanidinler ve flavanoidlerin farklı etki şekilleriyle olduğu varsayılmaktadır (21). Çeşitli Hypericum türlerinin yapraklarından hazırlanan metanol ekstrakları çeşitli tiplerdeki yaralara uygulanmış, standart yara iyileştirici merhemlerle karşılaştırılabilir seviyede iyi sonuçlar elde edilmiştir (22). Türkiye de geleneksel olarak halk arasında zeytinyağı içerisine bu bitkinin çiçeklerinin katılarak güneşte bekletilip elde edilen karışımın yara iyileştirici olarak haricen uygulandığı bilinmektedir (23). Kardeş Kromatid Değişimi (KKD) analizi, genotoksik ajanların deoksiribonükleik asitte (DNA) oluşturduğu hasarın kromozom düzeyinde tespit edilmesini sağlayan doğrudan metodlardan birisidir (24). KKD, DNA replikasyonu 2

9 sırasında kardeş kromatidler arasında özdeş segmentlerin karşılıklı simetrik yer değiştirmesidir. Bu olay kromozomun her iki kromatidinin birden kırılması ile ortaya çıkmaktadır. KKD de yeni duplike olmuş kromatid ve eski kendi kardeş kromatidi arasında, kromozom morfolojisi değişmeden simetrik olarak özdeş segmentlerin değişimi söz konusudur (25). KKD, çoğalmakta olan hücrelerde spontan olarak meydana gelir. Özellikle kromozom hasarı, instabilitesi ve DNA tamir bozukluğu sendromlarında duyarlı bir parametre olarak kullanılmaktadır. KKD, DNA daki çok küçük harabiyetlerin bile hassas göstergesi olarak kabul edilir (25, 26). Bu çalışmada, tümör hücrelerinde apopitozisi indüklediği bilimsel çevrelerce kabul edilmiş fakat genotoksit etkisinden bahsedilmemiş olan Hy nin insan lenfosit hücrelerinde genotoksik etkisinin olup olmadığının araştırılması amaçlanmaktadır. 3

10 2. GENEL BİLGİLER 2.1. Hypericum Perforatum L. Hakkında Genel Bilgiler Hypericum perforatum L. nin Sistematiği Divisio : Spermatophyta Subdivisio: Angiospermae Clasis : Dicotyledoneae Subclasis : Magnolipsida Ordo : Theales Familya : Cluciaceae ( Hypericaceae, Guttiferae) Genus : Hypericum perforatum (Kantaron otu, Binbirdelik otu) (3) Şekil 1: Hypericum perforatum L. nin genel görünümü (20) Türkçe: Binbirdelik otu, Sarı kantaron, kan otu, yara otu, koyun kıran, kılıç otu, püren (4,20,27,28). İngilizce : St. John s wort (4,20) Almanca : Johanniskraut (4,20) Fransızca : Millepertius (4,20) Hypericum L. nin Genel Özellikleri Hypericum L. (Hypericaceae): Çok yıllık otsu çalımsıdır. Yapraklar perfoliat (sarıcı) veya değil, nadiren aurikulat (kulaklı) olup sepaller ve petallar 5, 4

11 serbest, petallar genellikle sarı, stamenler 5 grup halinde ve petallerin önündedir. Ovaryum 3-5 veya tek lokuluslu, 2-çok ovüllü. Meyvesi pestisid kapsula veya nadiren bakka. Kapsulanın üzerinde boyuna çizgiler (vittae) veya enine kabartılar (vesicle) bulunur. Avrupa ve Anadolu da yaygın bir türdür. Dünyada sıcak ve ılıman bölgelerde yayılış gösteren 400 ün üzerinde türü olup Avrupa da 10, Türkiye de 89 türü bulunur. Bunlardan 43 ü endemiktir. Hypericum L. nin türkiyede en yaygın temsil edilen türleri, Hypericum perforatum L., H. Trigqetrifolium, Hypericum calycinum (Büyük çiçekli binbirdelik otu), H. empetrifolium Willd. (püren, sarı püren), H. scabrum L (mayasıl otu, kepirotu), H. tedrapetum Fries dir (3,4). Hypericum perforatum L: Tarla yol orman kıyılarında, tepelerde ve çayırlarda temmuzdan eylül ayına kadar çiçeklenen ve ülkemizde, sarı kantaron, kanotu, kılıç otu mayasıl otu, kuzukıran, koyunkıran ve yara otu gibi yöresel adlara da sahip olan şifalı bir bitkidir. Bitki cm boyunda, çok senelik ve otsudur. Yapraklar mm uzunlukta, elips biçiminde ve hemen hemen sapsızdır. Yapraklar ışığa karşı tutulduğunda yağ guddeleri, çok miktarda parlak noktacıklar halinde kolaylıkla görülür. Bu özelliğinden dolayı binbirdelik otu denmiştir. Çiçek beş parçalı petaller altın sarısı renkli, kenarları siyah benekli gudde tüyleri ile çevrilidir. Stamenler çok adette ve 3 demet halinde toplanmış. Bütün Türkiye ve Avrupada yabani olarak yetişir. Ülkemizde yetişen üç varyetesi vardır: H. perforatum var. perforatum, H. Perforatum var. Angustifolium, H. perforatum var. microfhyllum (3). Hypericum türleri farklı salgısal yapı tiplerinin varlığı ile karakterize edilir: Saydam bezler ya da oyuklar, siyah nodüller ve salgı kanalları (29). Hıristiyan mistiziminde bu bitkinin önemli bir yeri vardır. Yaklaşık 1300 yıldan beri Hristiyan geleneğinin sembolik bir bitkisi olarak kabul görmektedir. Bitki Avrupa Ülkelerinde çoğunlukla St. John Wort olarak bilinmektedir. Rivayetlere göre bitkinin ismi Yahya (Johannas) peygamberden gelmektedir. İncil de geçen bir olaydan ötürü Yahya Peygamber, Hıristiyanlar için mucizevi bir bitki getirmiştir. Bu bitki H. Perforatum dur. Diğer bir rivayet ise haçlı seferleri sırasında yaralanan St. John şövalyelerinin yaralarının tedavisi bu bitki ile yapıldığından bu ismi aldığı şeklindedir (20). 5

12 Hazırlanan tentürleri orta şiddetteki depresif durumlarda, özellikle menepoz sıkıntılarını giderici olarak kullanılır. Haricen bitkisel yağlar içinde hazırlanıp yara ve yanık tedavi edici olarak kullanılır (9). H. trigqetrifolium: Akdeniz Doğu Avrupa da doğal olarak yetişir. Türkiyenin hemen hemen bütün bölgelerinde yaygındır. Antalya; Akseki, Manavgat, Muğla, Mersin, Tarsus da bulunmaktadır. Geleneksel sedatif, antihelmintik antiinflematuar ve antiseptik etkileri için kullanılır. Gastrointestinal hastalıklar ve yanık tedavisinde kullanılır (3). Hypericum calycinum (Büyük çiçekli binbirdelik otu): 20-60cm boyunda büyük çiçekli bir türdür. Bilhassa Kuzey Anadolu da yaygındır (22). H. empetrifolium Willd. ( püren, sarı püren): cm boyunda, dik, dallı ve küçük çiçekli bir türdür. Bilhassa Batı Anadolu da kumaşları sarıya boyamak için kullanılır (22). H. scabrum L (mayasıl otu, kepirotu): cm yükseklikte gövdesi genellikle pürtüklü olan bir türdür. Çiçekler genellikle gövdenin ucunda, birçoğu bir arada bulunur. Anadoluda yaygın bir türdür. Kayseri-Yozgat yörelerinde çiçekli dallarından hazırlanan infüzyon (%1), dahilen basura ve kabıza karşı kullanılmaktadır (22). H. tedrapetum Fries: cm yükseklikte, gövdesi dört kanatlı ve küçük çiçekli bir türdür. Kuzey ve Güney Anadolu da yaygındır (22) Hypericum L. Genusunun Taşıdığı Maddeler H. perforatum bitkisinde naftodiantoronlar (hyperisin, pseudohypersin, izohyperisin), flovonlar (hyperosit rutin, quarsetol, quersitin, Biflovanoit), uçucu yağlar (carophyllene, α- pinene, seskiterpenler), protein, tanen, karoten, vitamin C, resin, hyperforin bileşikler bulunmaktadır (Tablo 1). 6

13 Tablo 1: Hypericum perforatum metanol ekstraktının taşıdığı bileşikler (4,11). Bileşik Türü Miktar Bulunduğu yer hypericin kök,gövde, Naftodiantron (% 0,1-0,3) Flovanlar (%4-5) Uçucu yağlar (%0,1) Tanen (%10) pseudohypericine izohypericine ppm yaprak,çicek tohum hyperosit rutin quarsetol ppm çiçekte biflovanoit quercitin carophyllene yaprak α- pinene çiçek seskiterpenler kök çiçek Karoten 165 ppm tohum Vitamin C 395 ppm kök, tohum Hyperforin Protein ppm kök, tohum Resin Hyperisin Hypericum perforatum da hyperisin adı verilen bir diantron bulunmaktadır. Hy, hegzahidroksi dimetil naftodiantron dur (2). Hy hypericum genusunun en önemli metabolitlerinden ikincisidir (30). Hy ve pseudohyperisin bitkiyi böcek ve zararlı hayvanlara karşı koruyan allokimyasal fotosensitizer bileşiklerdir. Hyperisin ve onun protoformu pseudhyperisin, bitkinin kökü, yaprakları, sepal, petal, stamen ve taze ovüllerinde ışığa tutulunca görülen küçük koyu bezlerde lokalize granüller olarak bulunur (31). Bitkide pseudohyperisin (protonaftodiontoron) / hyperisin (naftodiantoron) oranının yüksek tutulması veya içinde bulundukları veziküllerin geçirgen olmaması sayesinde bitki ışığa bağlı fotoharabiyetten korunmaktadır (15). 7

14 Hy fotosensibilizasyon meydana getiren bir maddedir. Bu bitkiyi yiyen hayvanlardan, yalnız beyaz tüylü olanlarda, güneş ışığı tesiri ile, deri ve mukozada yaralar ve genel metabolizma bozuklukları ile beliren özel bir hastalık (hypericismus) meydana gelir. Hy küçük dozlarda mental depresyona karşı tonik ve stimülan olarak kullanılmaktadır (2,4) Hy nin tümor hücreleri ve viruslar üzerine güçlü bir fotodinamik etkiye sahip olduğu tespit edilmiş fakat bu bileşiğin tümör ölüm mekanizmasını nasıl teşvik ettiği henüz açığa kavuşturulamamıştır. Hy nin zarflı virüsleri inaktif hale getirdiği fakat zarfsız virüslere bir etkisinin olmadığı rapor edilmiştir. Bu kabiliyetinin ışığa bağlı arttığı da belirtilmiştir (6). Hy nin apopitozisi uyardığı birkaç tümör: Glioma, hipofiz adenomu, retinal pigment epitel hücreleri maling T lenfositler. Hyperisinin protein kinaz C nin potansiyel inhibitörü olduğu gösterilmiştir. Hy MAP kinaz ve EGF reseptör trozin kinaz inhibitörü olarak ve usülüne uygun ışık ve uygun konsantrasyonda uygulanınca HeLa hücreleri içinde mitokondriyal hekzokinaz inhibisyonuna da etkili olduğu belirtilmiştir (32, 33). A) Hyperisin Molekülünün Genel Özellikleri Hyperisin molekülünün 54 atom ve 260 elektronu olan polisiklik naftodiontorondur. 7 ve 14 pozisyonundaki karbonil grupları ile çok sağlam bir yapı oluşturur (34). Kimyasal formülü: C 30 H 16 O 8 Çözünürlüğü: DMSO, %100 etenol, metanol, aseton, etilmetilketon, pridin ve diğer organik çözücüler. Molekül ağırlığı: 504,4 Aromatik formülü (Şekil 2). 8

15 Şekil 2: Hyperisin in aromatik formülü (35). Hy molekülünün son derece dinamik bir yapısı vardır. Hy hücre membranı lipid bileyerleri arasına girebilir. Çoğunlukla lipofilik özelliktedir. Sulu çözeltilerinde nötral, anyonik ve katyonik halde bulunabilir (5). Yanlarda bulunan iki hidroksi ve iki metil grup Hy nin sekizli halkasal yapısının her iki yanında kanat gibi durur ve Hy molekülü aynı düzlemde uzanmaz. Hidroksi ve metil gruplar birbirini iter. Bunlar hyperisin molekülünün sabit durmayıp burkulma hareketi yapmasını sağlar (36). Hy bir yanı hidrofobik bir yanı hidrofilik olan eşsiz bir moleküler yapıya sahiptir. Hidrofobik metil grupları içeren hyperisin molekülünün tepe alt ve yan tarafı nonpolardır. Tahminen hidrofobik kısım yağ içine gömülür. Triplet oksijenden daha az reaktif olan tekil oksijen iki elektronu çiftli bağ içeren hedeflere bağlar (PUFA da olduğu gibi). Hidrofilik kısım sulu ortamda hidrojen bağlayabilir (37). Hy nin antiviral ve antitumoral özellikleri tamamıyla olmasa da büyük oranda onun hyperisin nin fotodinamik özelliklerine bağlıdır. Hy nin fotodinamik reaksiyonlarının altında yatan mekanizma tam olarak anlaşılamamıştır. Onun hücre membranına bağlanan sensitize bir pigment olarak ışık ve oksijen arasında interaksiyonlar sağladığı bilinmektedir. Hy ile yapılan fotodinamik reaksiyonlarda ana oksidant olarak tekil oksijen hizmet verir (37 ). 9

16 Hy absorbsiyon spectromu nm arasındadır (36). Bu da kırmızı ve yeşil ışığa tekabül eder. Teorik olarak ışık quantasını absorbe eder ve oksijen bulunan ortamda tekil oksijen formuna çevirir nm ışığa maruz bırakılırsa tekil oksijenin üretildiği tip II fotosensitizasyonuna uğrar (38). Hy eritrositlerin fotohemolizi gibi hücresel komponentlerin fotooksidasyonunu tetikler (39 ). Tekil oksijenin polisiklik dionlarda bulunan pi-elektron sistemine karşı güçlü bir affinitesi vardır. Pi elektronlar hyperisin nin fotoaktif özelliklerinden sorumludur (37). Hipotez olarak bu yapı pi elektronların enerji seviyesini düşürür ve tekil oksijenin geçici olarak bağlanmasına neden olur. Daha sonraki bir noktada viral replikasyon mekanizmasını bozmak için tekil oksijenleri salıverebilir (37). B) Hyperisinin Fotodinamik Özellikleri Son 10 yıl içersinde yapılan bir çok çalışma ile Hy fotodinamik aktiviteleri açıklanmıştır. Bunlar: 1) Işıkla uyarılan Hy nin protein kinaz C (PKC) ve diğer büyüme faktörleri ile uyarılan protein kinazları inhibe ettiği (40), 2) Membran lipid peroksidasyonuna neden olduğu (41), 3) Hücresel glutatyon seviyelerinin düşürülmesine ve süperoksit dismutaz yükselmesi (42,43), 4) Mitokondriyal fonksiyonun bozulmasına (43), 5) Asetil kolinesterazın erimiş globül formunda çapraz bağlanmaların oluşmasına (44), 6) α-kristalin merceğin fotooksidasyonuna sebep olduğu gösterilmiştir (45). C) Hyperisinin Hücre İçinde Bulunduğu Yerler ve Hücresel Hedefleri Fizyolojik şartlarda monobazik bir tuz olarak bulunan Hy in hidroksil (OH) gruplarını taşıdığı kısımlardan kaynaklanan asiditesi de vardır. Hy tuzları (F, Br, Cr) 10

17 hücresel lipit membran yapıları tarafından tutulur ve bu yüzden lipofilik iyon çifti gibi davranır (29). Bu hidrofobik karakter sayesinde hyperisin sitoplazma içinde 2-4 saat kalabilir. Yapılan çalışmalar hyperisinin hücre içinde özellikle endoplazmik retikülüm ve golgi kompleksinde biriktiğini mitokondrinin ise dışında kaldığı ortaya çıkmıştır. Hyperisinin hücre içi dağılımının hücre tipinden de etkilendiği kolon Caco- 2 hücrelerinde nükleer membranda toplanmış halde bulunmasıyla anlaşılmıştır (15). Hyperisin in hücre içine girişinin enerji gerektirmemesi ve reseptör bağlanmalarının olmamasından difüzyon veya çözünülürlükle olduğu düşünülmektedir. Hücre içi lokalizasyonundan dolayı da esas hedeflerinin membranlar olduğu kabul edilmektedir. Membranlar ışık bağlantılı reaktif oksijen türleri (ROS) üretilen yerler veya hücresel hedeflerin yakın çevresidir (42,37,46). Nöronlarla yapılan çalışmada, Hy in çok yüksek konsantrasyonlarda (20 μm) uygulanması halinde nükleus içinde birkaç bölümde gözlenmiştir (47). Nükleer lümen dışında izole DNA da ve oligonükleotidlerle interaksiyona girmiş olduğu, membran hasarına neden olan ROS üretimi ile DNA hasarına da neden olabileceği belirtilmiştir (48-50). D) Hyperisinin bilinen etkileri: 1- Antikanser etkisi 2-Antivirütik etkisi 3- Antidepresant etkisi 1- Antikanser etkisi Hyperisin bilinen en güçlü doğal fotosensitizerdir. Hyperisinin antikanser etkisi de bu fotosensitizer özelliğinden kaynaklanmaktadır. Fotodinamik terapi (PDT) kanser tedavisi için kullanılan yeni ve umut verici yöntemlerden biridir. Hücre ve organellerin yıkımını ışık aracılığı ile katalizleyen fotosensitizer ajanların kullanılmasına fotodinamik terapi (PDT) denilmektedir. PDT, tümör hücresi tarafından tutulan bir fotosensitizer ajan ve bu ajanın absorbsiyon spektrumuna uyan görülebilir bir ışık dalga boyunu gerektirmektedir. Genellikle fotosensitizerler oksijenin hazır bulunması ve ışık stimülasyonunun olmasıyla peroksit ve hidroksil radikallerine dönüşen süperoksit radikallerini üreten (tip I reaksiyonu) veya non- 11

18 radikal tekil oksijen moleküllerini üreten (tip II reaksiyonu) bileşikler olarak tanımlanırlar (13, 51). Antitümöral fotodinamik tedavi bir fotosensitizerin sistemik uygulanmasını ve tümör lezyonuna görülebilir ışığın dağıtılmasını hedefler. Bunlar sağlandığı zaman tip I veya tip II reaksiyonları vasıtasıyla reaktif oksijen radikallerinin lokal üretimi lipid membranlarda zincirleme oksidasyon reaksiyonlarını gerçekleştirerek tümör harabiyetine sebep olur (52). Reaktif oksijen radikalleri, hücre metabolizması esnasında meydana gelen biyokimyasal reaksiyonlarla ortaya çıkan, dış yörüngelerinde bir süre için bile olsa ortaklanmamış elektron taşıyan atom veya moleküller olarak tanımlanırlar (53,54). Başlıca oksijen radikelleri: -Süperoksit anyon radikali (O 2 - ): Oksijen molekülüne bir elektron transfer edilirse süperoksit anyon radikali (52). -Hidrojen peroksit radikali (H 2 O 2 ): İki elektron transfer edilirse hidrojen peroksit radikali oluşur (52). -Hidroksil radikali (OH. ): Hidrojen peroksit radikali demir (Fe) gibi bir geçiş metal iyonu ile reaksiyona girerse parçalanıp canlı dokular için daha zararlı olan hidroksil radikaline dönüşür (52). - Tekil oksijen (O 1 2 ): Tekil oksijen gerçekte bir serbest radikal değildir, ancak serbest radikal reaksiyonları sırasında üretilen bir reaktif oksijen türüdür (52). Serbest oksjen radikallerinin başlıca endojen kaynakları: 1- NADPH oksidaz, lipooksijenaz, prostoglandin sentetaz gibi plazma membranı enzimleri ve lipid peroksidasyonu, 2- İntoksikasyon, iskemi, travma gibi durumlara bağlı oksidatif stres, 3- Ksantin oksidaz, triptofan oksijenaz gibi enzimler ve hemoglobin, 4- Mitokondrideki ETS, 5- Nükleus ve ER de bulunan ETS (sit p-450), 6- Peroksizomlarda bulunan enzimler, 7- Yaşlanma (53). Eksojen serbest oksijen radikali oluşumuna neden olan kaynaklar: 12

19 1- İyonize ve non iyonize radyasyon, 2- Isı, güneş ışığı, 3- Alkol uyuşturucu ve anestezik ilaçlar, 4- Stres: Stres ile kanda katekolamin seviyesi yükselmekte ve oksidasyona uğraması ile de serbest radikal üretimi artmaktadır (54). Meydana gelen serbest oksijen radikalleri (ROS) yine hücrede süperoksit dismutaz (SOD), katalaz (KAT), glutatyon peroksidaz (GSH-Px) gibi antioksidan enzimlerle veya C vit, E vit, transferin, beta- karoten, seruloplazmin, meletonin gibi enzim olmayan antioksidan maddelerle reaksiyona girerek hücreye zararsız bileşiklere dönüştürülmektedir. Eğer bir hücrede ROS üretimi yıkımından fazla ise hücre hasarı var demektir. Hücrelerin membranalarında bulunan poliansetüre yağ asitleri (PUFA) okside edici serbest radikaller tarafından kolaylıkla etkilenebilmektedir. PUFA nın oksidatif hasarı lipid peroksidasyonu olarak adlandırılır. Lipid peroksidasyonu sonucu hücrede kendiliğinden devam eden zincir reaksiyonları başlamaktadır (55). Zincir reaksiyonlarının en sonunda üretilen hidroksialkenoller hücrenin farklı bölgelerine giderek hasar oluşturabilmektedir. Nükleik asitler ve proteinler serbest radikallere karşı biraz daha dayanıklıdır. Ancak serbest radikaller DNA nın çok yakınında meydana gelirse bu molekülü de kolaylıkla hasara uğratabilir (54). İn vivo çalışmalarda PDT yi takiben kan akışında tıkanma, damarsal kollaps, damar dışına sızıntı gözlenmiştir. PDT, sitokinler ve diğer düzenleyicilerin salıverilmesine neden olur ve bu da takiben inflamatif bir cevap ortaya çıkar. Çeşitli tümör hücrelerinin PDT ye cevabında doku tipi farklılığından ve fotosensitizerin farklı tutulumundan kaynaklanan farklılıklar vardır (56). 1. PDT ile Hücre Ölüm Mekanizmaları PDT nin tümör hücrelerini iki şekilde etkileyip yok ettiği bilinmektedir. Bunlar: Apipitozis ve nekrozis. 13

20 1-Apoptozis: Programlı hücre ölümüdür. Biyolojik görevini tamamlamış, yaşlanmış veya DNA hasarı meydana gelmiş hücrelerin ortada bir iz bırakmadan yok olmasıdır ( 57). 2-Nekrozis: Fiziksel veya kimyasal bir tahribat sonucu oluşur ve ortamda bir inflamasyon bırakır (57). Apopitozisin ekstrinsik veya intrinsik sinyal mekanizmasının işlemesi ile gerçekleştiği bilinmektedir. Her iki sinyal yolunda da sistein içeren kaspas proteazlar önemli rol oynamaktadır. Normal halde kaspaslar aktif hallerinden daha uzun bir zincir içerirler, aktifleşince özel bölgelerinden iki alt birime ayrılırlar. Kaspaslar, başlatıcılar (initatör) ve uygulayıcılar (efektör) olmak üzere ikiye ayrılmaktadırlar. Başlatıcı kaspasların (kas-8,9,10) adaptör proteinlere bağlanabilen ölüm zinciri içeren domainleri vardır. Efektör kaspasların (kas-3,6,7) özel ölüm domainleri yoktur ve aktifleşince adaptör proteinlerle birleşmezler. Polipolimeraz (PARP), laminler, topoizomeraz I gibi hücre içi vital substratları parçalarlar (58). Ekstrinsik yolda mutlaka hücre zarında bulunan Fas, TNFR (tümör nekroz faktör reseptörü) TRAIL (TNF-related apopitozis induced ligand) gibi ölüm reseptörlerinin ligandlarınca uyarılması ile sinyal yolu aktiflenir. Uyarılan reseptörün hücre içinde bulunan ölüm domainine hücre içinde özel adaptör proteinler bağlanarak aktiflenir ve sonrasında başlatıcı kaspaslar aktifleşir, başlatıcı kaspaslar efektör kaspasları aktifler ve efektör kaspaslar da vital substratları parçalayarak apoptozisi gerçekleştirirler (59). İntrinsik yolda sinyal ya hücrenin genomundan gelir ya da reseptöre bağlanmaya ihtiyaç göstermeyen ilaç, ışın etkisi ile sağlanır. Eğer DNA hasarı oluştu ise p53, p21 aracılığı ile siklin/cdk(siklin depended kinaz) inhibisyonu ve mitoz bloğu sonrasında apopitozis gerçekleşir. İster DNA hasarı olsun ister ilaç etkisi ile olsun intrinsink yolda proteaz aktivasyonunu başlatan ilk sinyaller mitokondri üzerinden olmaktadır. Normalde proton ve diğer iyonlar mitokondri iç zarında elektriksel bir gradient oluşturacak şekilde dağılmıştır. Katyonik lipofilik boyalar kullanıldığında boya membran içine girerek, membran matriksi boyunca yayılmaktadır. Apopitozise giden bir hücrede ise transmembran potansiyelinin düşmesinden dolayı boya girişi azalmaktadır. Bu azalmaya permabiliti transisyon 14

21 (PT) denilmektedir. Spermin, Bcl-2 gibi proteinler ve Zn (çinko) PT inhibitörü olup hücreyi apopitozisten korumaktadır (59). 2. Hyperisin in Neden Olduğu Apoptozis Hy nedenli apoptozis ilk olarak insan kötü huylu glioma hücrelerinde tanımlanmıştır. Bu hücreler Hy ve ışığa maruz bırakıldığında DNA fragmentasyonu ve hızlı bir apoptotik hücre ölümü olduğu gösterilmiştir. Bu olay diğer kanser hücre türlerinde daha geç meydana gelmiştir. Bu tür Hy aracılı apoptoziste protein kinaz C (PKC) inhibisyonunun tetikleyici olduğu ileri sürülmüştür (60). Daha sonraki çalışmalarla Hy etkili apoptozisin sinyalizasyonunda PKC inhibisyonun yeterli olmadığı ortaya çıkmıştır (61). Apoptozisin gerçekleşmesindeki ekstrinsik ve intrinsik olmak üzere iki sinyal yolunun da etkili olabileceği, hatta ekstrinsik yol intrinsik yol arasında bağlantı olan bir yolun da olduğu belirtilmiştir (62). Çeşitli çevresel uyarılar veya DNA hasarından kaynaklanan uyarılar mitokondri seviyesinde gelişim programlarını uyararak intrinsik yolu tetikler. Mitokondri iç zarında sit-c ve diğer apoptotik proteinler sitosole salınır. Sit-c, apaf-1, prokaspas-9, datp/atp apoptozom kompleksinin oluşumu ile kaspas-9 aktive olur. Aktive kaspas-9 da efektör kaspasların (kas-3,6,7) aktivasyonunu neden olur. Bu kaspaslar da vital proteinleri parçalayarak klasik apoptotik görünümlerin oluşması sağlar. Gerek intrinsik gerekse ekstrinsik yolda kaspas proteazlarının aktivasyonu hücreyi apoptozise sokmaktadır (63). 2- Antiviral Etkileri Hyperisin ve kimyasal benzeri pseudohyperisin hem laboratuvar hem de hayvan deneylerinde: HIV-1 (64), sindbus virüs (18), murin sitomegalo virüs (MCMV) (18), influenze A, herpes simplex I ve II (65) ve radyasyon lösemi virüsü (rad LV) (66) gibi virüslerin replikasyonunu inhibe ettiği ve AZT (3-azido-3-deoksitimidin) ve diğer nükleosid analoglarından farklı bir mekanizma ile bu antiviral etkiyi gösterdiği ortaya çıkmıştır (18). 15

22 Hy HIV sinsitiyum oluşumunu bloke (67) etmesine rağmen revers transkriptaz (RT) aktivitesinde direkt olarak bir değişiklik yapmaz (68). Hy ile tedavi edilen hücrelerde immatür veya normal olmayan öz yapılar oluşmaktadır. Bu gag (p24 geni) tarafından kodlanan öncü poliproteinlerin işleyişinin bloke edildiğini gösterir. Hy nin ister hücre içinde olsun ister hücre membranına bağlanmış olsun protein sentezini engelleme yoluyla revers transkriptaz aktivitesini düşürdüğü sanılmaktadır. gag geni tarafından kodlanan poliproteinlerin klevajı veya sentezi engellendiğinde viral partiküller oluşamaz. Birleşmiş (assemble) virüs özyapısı içinde revers transkriptaz muhtemelen proenzim veya inaktif bir enzim formunu alır. Virüsler tarafından kodlanan proteazlar veya kinazların işe karıştığı mekanizmalar RT yi tekrar aktif hale getirebilir. Bu proteaz ve kinazlar etkilendiğinde RT aktivitesi etkilenebilir. Hyperisin ve pseudohyperisin nin proteaz aktivitesini etkilediği sanılmaktadır. Sıra ile değişen proteaz aktivitesi gag tarafından kodlanan poliproteinlerin sentezi ve klevajının bozulmasına sebep olabilir. Sonuç olarak immatür viral özyapı oluşabilir (14,69). Son bulgular bu bileşiğin hem RNA hem de DNA virüslerinden sadece lipid zarfı olanlara etkili olduğu yönündedir (70,71). Alternatif olarak Hy viral proteinlere seçici olarak bağlanarak virüs birleşimi (assemble) için gerekli olan gag ve gag poliproteinlerinin işleyişine engel olabilir. Bu yüzden Hy RNA nın viral kapsid içine paketlenmesi sürecinde blok yapabilir (14). Bazı araştırmacılar Hy nin gag tarafından kodlanan prekürsör poliproteinler veya diğer proteinleri bozmak yerine zarflı virüslerle direkt etkileşime girerek infeksiyöz virüsü lize ettiğini savunmaktadırlar (72). Özetle: 1- Zarflı virüslerin lipid olan zarf yapısı direkt olarak hyperisin tarafından parçalanır, antijenik özelliğini kaybeden virüs inaktive olur (72). 2- Hyperisin proteaz aktivitesini etkileyerek gag tarafından poliproteinlerin klevajlanması ve sentezine engel olarak veya bu ptoteinlere bağlanarak viral nükleikasidin özyapı içine paketlenmesini engelleyip bozuk veya immatür özyapı oluşumuna sebep olur (72). 16

23 3- Antidepresan Etkileri Hypericum perforatum bitkisi antik çağlardan beri antidepresan özellikleri için kullanılmaktadır. Eski Yunan kültüründe bu bitkinin özellikle kötü ruhları kovduğuna inanılırmış (20). Tarih boyunca insanlar H. perforatumu ruhsal sıkıntı, hafif depresyon, yorgunluk, bitkinlik tedavisi için kullanmışlardır. Bu bitkinin günümüz tıbbında bilinçli bir şekilde kullanılması tesadüf değildir. Geçmiş bugüne ışık tutmuştur (20). Hypericum ekstrakları antidepresif etkilerinin bitkinin hangi bileşeni tarafından gerçekleştiği tam olarak belli olmamakla birlikte hypersin nin de bu etkide önemli rol oynadığı sanılmaktadır (73,74).Hypericum ekstrakları son zamanlarda dünyanın her yerinde özellikle de Almanya, diğer Avrupa ülkelerinde ve Amerika da antidepresan olarak doğal, güvenli ve daha az yan etkiye sahip olduğu için geleneksel antidepresanlara tercih edilmektedir (75). H. perforatum dan hazırlanan antidepresan etkisi kanıtlanmış ekstraklar Tablo 2 de verilmiştir. Tablo 2: Hypericum perforatum un antidepresan etkisi kanıtlanmış extraktları. Extraktlar Kaynaklar Hyperisin (76) Total ekstrakt (77) Total ekstrakt fraksiyon II (77) Total ekstrakt fraksiyon IIIc (77) ZE117 (78) LI160 (79) Hyperiforce (80) Jarsin 300 (81) işaretli olanlar ticari ürünlerdir. 17

24 H. perforatum ekstraktının beyinde etkilediği yerler: Diensefalon (82) Serebal korteks (82 ) Prefrontal kortex (83) Lokus serulus (84) Hipokappus (85) Hipotalamus (85) Etki mekanizması H. perforatumun serotonin norepinefrin ve dopamin geri salımında blokaj; serotonerjik ve dopaminerjik reseptörlerin yoğunluğunda bir artma; ayrıca MAO inhibisyonu gibi geleneksel antidepresanların etkilerine benzer etkiler gösterdiği düşünülmektedir (86,87). Araştırılmakta olan birkaç teori olmasına rağmen bir çok depresyon çeşidini tedavi kabiliyeti olan H. perforatum un nasıl işlev gördüğü açık değildir. Bir teoriye göre H. perforatum monoaminoksidaz (MAO) ve katekolamin metil transferaz (COMT) enzimlerini inhibe etmektedir (88). MAO kaynağı tiramin oksidaz olan vücudun değişik yerlerinde ve beyinde sinaptik aralıkta dopamin, noradrenalin, serotonin, gibi primer ve sekonder aminlerin terminal fazında aminoalkol grubunun yıkımını sağlayarak nöromedyatör etkinliği baskı altında tutan mitokondrial bir enzimdir (89). Diğer bir teori serotonin ve norepinefrin nörotransimiterlerinin seviyesini yükselmektedir. Bunu SSRI (selective serotonin re-uptake inhibitors) lar ve SNRI (selective norepinephrine re-uptake inhibitors) lar serotonin ve norepinefrinin geri salınımını engelleyerek sinaptik aralıktaki etki süresi ve sayısının artışını sağlayarak yaptığı ileri sürülmüştür (90). Bir diğerine göre ise H. perforatum ekstraktı stres hormonu kortizolün seviyesini düşürür veya beyindeki gama amino bütirik asit (GABA) reseptörlerini etkiler. GABA beyin ana inhibitör mediyatörüdür (91). 18

25 Bahsedilen teorilerden sonra bu etkileri yapan bileşiklerinin hangisi veya hangileri olduğu sorusu akla gelmektedir ki bu konuda çelişkili raporlar mevcuttur (92). Çalışmalar sürmektedir Hyperforin Bir floroglusindir. Sedatif etkisi vardır. Hyperforinin antibiyotik etki gösterdiği de savunulmuştur (12). Şekil 3: Hyperforinin aromatik görünümü (35). 19

26 2.2. Kardeş Kromatid Değişimi (KKD) Kardeş kromatid değişimi (KKD), DNA replikasyonu sırasında kardeş kromatidler arasında özdeş segmentlerin karşılıklı simetrik yer değiştirmesidir (93). Bu olay kromozomun her iki kromatidinin birden kırılması ile ortaya çıkmaktadır (94). KKD de yeni duplike olmuş kromatid ve eski kendi kardeş kromatidi arasında, kromozom morfolojisi değişmeden simetrik olarak özdeş segmentlerin değişimi söz konusudur. KKD memelilerde hücre bölünmesinin normal bir özelliği olarak spontan meydana gelebilir (95). Her kırık sonrasında devreye giren tamir mekanizmaları, zaman zaman iki homolog parçanın karşılıklı yer değiştirerek kardeş kromatide yeniden bağlanması ile sonuçlanmaktadır. Bu değişim sonucunda kromatidlerin morfolojisinde bir değişiklik ortaya çıkmamaktadır. Olayın moleküler mekanizması ve biyolojik anlamı tam olarak bilinmemektedir (94). Günümüzde artık insanların günlük yaşamlarında ve çalışma ortamlarında genotoksik ajanlara mutajenik ve karsinojenik maddelere maruz kalmadan yaşamaları mümkün olmamaktadır. Gelişen teknoloji ile üretilen yeni kimyasal maddeler, ilaçlar, gıda katkı maddeleri, çevreye verilen atıklar, tarımda kullanılan kimyasal maddeler ve manyetik alan oluşturan elektronik cihazlar, canlıların genetik yapısında mutasyon oluşturma ihtimali taşımaktadırlar. DNA oluşan hasarı kromozom düzeyinde tespit etmemizi sağlayan doğrudan metodların birisi de kardeş kromatid değişimi (KKD) analizidir (24). KKD, DNA daki çok küçük harabiyetlerin bile hassas göstergesi olarak kabul edilir. DNA hasarının ve indüklenmiş DNA tamirinin gösterilmesinde en basit, duyarlı ve kısa zamanda sonuç veren bir yöntem olarak kullanılmaktadır (25). Vücuttaki total DNA nın %1 inden daha az bir bölümdeki kayıp bile KKD ile rahatlıkla tespit edilebilir (93). Bir çok mitojen ve karsinojen çalışmasında KKD, güçlü bir indikatör tekniği olarak hizmet etmektedir. Bazı kimyasallarda aynı çalışmada KKD ve KA (kromozon aberasyon testi) yöntemleri birlikte yapıldığında, KKD yönteminin KA yönteminden daha fazla hassas olduğu gösterilmiştir (93). Yapılan çalışmlarda, Bloom sendromu, Ataksi telenjaktazi, Werner sendromu, Kseroderme pigmentozum, Fanconi anemisi, Cockayne sendromu, 20

27 Duchenne ve Becker tipi kas distrofilerinde ve down sendromunda KKD değerleri anlamlı derecede artmış olduğu rapor edilmiştir (96) KKD nin Tarihçesi Mc Clintock yılları arsında mısır bitkisinin monosentrik halka kromozomlarının kaybolurken, disentrik halka kromozomlarının oluşumunun arttığını gözlemiştir (97). Kardeş kromatid değişimi ilk kez 1957 yılında Taylor ve arkadaşları bitki mitotik kromozomlarında (Vicia faba ve Bellenalia romana) DNA replikasyonu ve reğresyonu konusunda yaptığı otoradyografik çalışmalarla gözlemlemiştir (25). Zakharov ve Egolina 1972 de Chinese Hamster hücrelerinde uzun süreli kültür kurmuş timin analoğu olan 5-Bromo-2 deoxiuridine (BrdU) ile replike olan kromozomların morfolojisini incelemiştir (98) yılında Latt DNA çift sarmalına BrdU bağlandığında, Bisbenzamid (Hoecst 33258) boyasının fluoresansını azalttığını (99), Perry ve Wolf, 1974 yılında BrdU nin kromatin yapısına Giemsa boyasının girişini kısıtladığını göstermişlerdir. Bu bulgular ışığında yeni bir teknik geliştirerek (Fluoresans boya + Giemsa tekniği= FPG), otoradyografiye gerek kalmaksızın gösterilebilmişlerdir (97). Latt ın 1974 te mitomisin-c nin KKD frekansında artışlara neden olduğu (100) göstermesinden sonra günümüze kadar, KKD genotoksisitenin sensitif bir indikatörü olarak kabul edilmekte ve çalışmalarda yaygın olarak kullanılmaktadır KKD nin Kullanım Alanları KKD analizi hem laboratuar hayvanlarında hem de insan populasyonlarında çalışılabilir. KKD analizi, kültürde replikasyon yapabilen, filogenetik spektrumu Drozofiladan insana kadar uzanan her hücre hattında yapılabilir. Çin Hamster fibroblast hatları, Hela gibi insan hücre hatları, deri ve akciğerden alınmış insan hücreleri, fare, sıçan, tavşan gibi laboratuar hayvanlarının ve insanların lenfosit kültürleri yaygın olarak çalışılmaktadır. İnsan ve fare amniyotik sıvısında da çalışılmıştır. Bitki, böcek, balık ve memelilere kadar in vivo KKD indüklenmesi hem 21

28 fiziksel hem de kimyasal ajanların değerlendirilmesinde kullanılmaktadır (96). KKD, bireylerde somatik hücrelerde bilinen ya da potansiyel mutajen ve karsinojenlere maruz kalmanın etkilerini saptamada da kullanılanır (25). KKD analizi, daha çok çeşitli kimyasalların genotoksik etkilerini araştırmakta kullanılmakla birlikte, kromozom instabilitesi ile seyreden Bloom Sendromu ve Fankoni Aplastik Anemisi gibi bazı hastalıklarda da araştırma ve tanı amaçlı olarak kullanılmaktadır. İn vivo kardeş kromatid değişiminin klinik açıdan önemini belirten çalışmalarda dengesiz kardeş kromatid değişimi, Duchenne ve Becker tipi kas distrofilerinin kalıtımında rol oynadığı ortaya çıkmıştır. Bu tür değişikliklerin duplikasyonlara yol açarak bazı hastalıkların beklenenden farklı kalıtım yolları izlemesine neden olabileceği bildirilmektedir (94) KKD Mekanizmaları Kardeş kromatid değişimi çoğalan hücrelerde spontan meydana gelebilir. Çeşitli fiziksel ve kimyasal etkenlerle kromozom DNA sında meydana gelen, replikasyon esnasında onarılamayan hatalar KKD nin ortaya çıkmasını ya da artmasını sağlar. Yani DNA nın hasarına neden olan pek çok ajanın KKD sıklığını artırdığı bilinmektedir. Bu nedenle pek çok mutajenik yada karsinojenik etkileri göstermede duyarlı bir parametre olarak kabul edilir (25). KKD oluş mekanizması üzerine çeşitli modeller ileri sürülmekle birlikte KKD nin moleküler mekanizması henüz tam olarak bilinmemektedir. Şekil 4 de bir kromozomda oluşabilecek KKD ler görülmektedir. 22

29 Şekil 4: Kromozomlarda oluşabilecek KKD lerin şematik gösterimi (24). a) KKD oluşumu yok. BrdU iki tam döngü veya iki tam döngünün ilkinde DNA sentezine girmiştir. b) Tek KKD oluşumu ( ) c) İki KKD oluşumu d) Üç KKD oluşumu e) Sentromerde oluşan KKD f) Boya kalıntısı veya BrdU nun DNA ile tam birleşmemesi KKD olarak sayılmaz. g-h) DNA sentezi sırasında BrdU nun iki replikasyon döngüsünden fazla DNA ya girmesi, KKD olarak değerlendirilmez. i) Bir kromatin genişliğinden daha dar olan boyanma KKD olarak değerlendirilebilir (24). 23

30 KKD Oluş Mekanizması ile İlgili İleri Sürülen Modeller a) Taylor modeli: 1957 de Taylor un çalışmalarında kromozomların radyoaktif timidin (3 HdTh=3H-deoksi-timidin) varlığında bir defa kendilerini eşlemelerine ve sonraki replikasyonda da izotopun yokluğunda da kendilerini eşlemelerine izin verilmiştir. Otoradyografide DNA nın semikonservatif eşlenmesi sonucunda, her bir kromozomun sadece bir kromatidinin işaretlendiği görülmüştür. Bu işaretleme sonucunda kardeş kromatidler arasında simetrik değişmeler gözlenmiş ve Taylor bunları kardeş kromatid değişimi olarak adlandırmıştır (24)(Şekil 5). Şekil 5: KKD oluşum mekanizması (24). b) Zakharov-Egolina modeli: Zakharov ve Egolina adındaki araştırmacılar Çin Hamster hücrelerinde, timinin analoğu olan 5- bromo-2 deoksi üridin kullanarak kromozom yapısını incelemişler. BrdU nin yeni sentez edilen DNA ya girişi uygulanışını takip eden ilk S sırasında olmaktadır. Replikasyon sırasında timinin yerine BrdU ni alan zincir, diğer DNA sırasında replike olur. Timinin analoğu olan BrdU, replikasyon sırasında DNA ya girer timinindeki metil grubunun yerini brom atomunun almasıyla DNA molekülünde oluşan bir seri fiziko-kimyasal değişikler sonucu, ikincil grupların şekillenmesinde güçlüklere sebep olur (98) (Şekil 6). 24

31 Şekil 6: Timinin ve BrdU in halkasal yapısı (98). Bu durum BrdU nin çift sarmal DNA yapısına girmesinin kromozom spirilizasyonunu geçiktirdiğini çok küçük morfolojik değişikliklere neden olabileceğini göstermektedir. Zakharov ve Egolina tarafından spirilizasyon gecikmesi olarak tanımlanan bu olayda, spirilizasyondaki bu gecikmenin, BrdU varlığına ve yoğunluğuna, bu ajanın hangi fazda kromozom yapısına girdiğine ve mitozlar arasındaki zaman süresine bağlı olduğunu bildirilmektedir (98). Buna göre, eğer kromozom spirilizasyonundaki gecikme, gerçekten BrdU in DNA ya girmesine bağlı ise, ikinci hücre siklusundaki tüm metafazlar giemsa ile boyandıklarında, üç farklı morfolojik yapı görülecektir (98) (Şekil 7). 25

32 Şekil 7: BrdU varlığına bağlı spirilizasyon gecikmesi (98). Her iki replikasyonda veya mitozda ortamda BrdU bulunması halinde kromatidlerden birinin, her iki DNA zincirinde BrdU bulunur, diğer kromatidinin ise yalnızca bir zincirinde BrdU, diğerinde timinin yer alır ve her iki kromatidde de spirilizasyon gecikmesi gözlenir. Yalnız, iki DNA zincirinde de BrdU bulunduran kromatidde spirilizasyon gecikmesi daha fazla olacağından diğerinden daha uzun ve daha soluk boyanacaktır (Şekil 7a). Yalnız ikinci replikasyon ortamında BrdU bulunması durumunda kromozomun her iki kromotidinde eş zamanlı spirilizasyon gecikmesi olacak, ama kromozomlar aynı boyanacaktır (Şekil 7b). Her iki replikasyon siklusunda ortamda BrdU bulunmaması veya sadece birinci replikasyon siklusunda ortamda Brdu bulunması durumunda spirilizasyon gecikmesi görülmez, morfolojik değişim oluşmaz ve normal boyanır (Şekil 7 d-e) (98,100). Kromozom morfolojisindeki bu farklılıklar DNA replikasyonunda farklılığa ve belki de genetik aktivitede değişikliklere neden olabilir (92). Kromatidlerdeki bu uzunluk farkı, protein ile BrdU içeren DNA arasındaki etkileşimin farklı olması nedeniyle ortaya çıkmaktadır. Proteinler kromozomların kondenzasyonda ve spirilizasyonunda etkili olmaktadır. Proteinler BrdU içermeyen DNA dan daha sıkı bağlanmakta ve kromozomların spirilizasyonunu ve yoğunlaşmasını 26

33 zorlaştırmaktadır. BrdU nin kromozomlardaki esas etkisinin paketlenme esansında olabileceği de belirtilmiştir (101). c) Evens isimli araştırıcının öne sürdüğü KKD oluş modeli: Yalnızca replikasyon süresince mevcut etkenlerin KKD leri ortaya çıkarabildiğini, bu nedenle değiş tokuşun replikasyon çentiğinden başlaması gerektiği ileri sürülmüştür. KKD oluşumunun bir kromatid üzerinden yeni sentezlenmiş zincir ile onun kardeşinin atasal zinciri arasında değiş-tokuşu içerdiğini, bu esnada zincirlerden birinde veya her ikisinde kırığın gerçekleştiğini öne süren bir modeldir (25)(Şekil 8). Şekil 8: Evens isimli araştırıcının ileri sürdüğü KKD oluş mekanizması (25). 1- G1 evresinde timin yerine BrdU içeren DNA ve S evresinde sentezlenen DNA da herhangi bir etkenle hata oluşması BrdU varlığında S evresinde ikinci replikasyon devam ederken hatalı bölgeye gelindiğinde bir veya her iki zincirde kırılmalar meydana gelmektedir. 4- Hatanın çıkarılması, ancak kırık zincirlerin birbiri ile değil, kardeşleri ile birleşmeleri sonucunda zincirler arasında değiş tokuş meydana gelmesi. 5- Replikasyon tamamlandığında molekülde, her iki zincirde de timin ve BrdU içeren bölgeler ortaya çıkması. 6- Her iki zincirde de BrdU içeren bölgelerin soluk, timin içeren bölgelerin koyu boyanması ve oluşan KKD lerin gözlenmesi (102). 27

34 d) Loveday ve Latt isimli araştırmacıların ileri sürdüğü model: 1981 yılında Loveday ve Latt isimli araştrıcılar Potter ve Dressler in önerdiği modelden yola çıkarak yeni bir model öne sürmüşlerdir. Bu modele göre kalıp DNA dan komplementer olarak timin yerine BrdU in girdiği tamamlayıcı DNA zinciri sentezlenir. Her bir çift sarmalda tek zincir kırığı oluşur ve bir dupleksteki bir zincir ile diğer dupleksteki DNA nın tamamlayıcısı, kardeş zinciri arasında krosingover gerçekleşir. Rekombinasyon sonucu hem timin, hem de BrdU in yer aldığı heterodupleks zincirler oluşur. DNA nın krosingover noktası etrafındaki rotasyonu ile X formu meydana gelirken, kırıklar oluşur ve kırılan zincirler birbiri ile değil, kardeş zincirlerin parçaları ile DNA ligaz ile birleştirilerek her iki zincirde BrdU ve her iki zincirde timinin içeren 2 rekombinant yapı oluşur. Her iki zincirde BrdU içeren bölgeler soluk, her iki zincirin de timin veya bir zincirinde BrdU, diğerinde timin içeren bölgelerin koyu boyanması ile KKD değerlendirilir (99) (Şekil 9). 28

35 Şekil 9: KKD oluş mekanizması (99) KKD Yöntemini Etkileyen Faktörler 1- Biyolojik Faktörler Başta genetik faktörler olmak üzere yaş, cinsiyet, hastalıklar, diyet, ilaç kullanımı, alkol ve sigara alışkanlığının KKD sıklığını etkilediği belirtilmektedir ( ). Sigara kullanımının KKD sıklığını artırdığı yapılan bir çok çalışmayla kanıtlanmıştır (104). 29

36 2- Kültür Koşulları ile İlgili Faktörler a) BrdU konsantrasyonu: BrdU toksik sınırlar dışında yüksek dozda hücre kültürüne eklenirse, mitotik indekste azalmalara ve KKD frekansında umulandan fazla artışlara neden olmaktadır. BrdU konsantrasyonu %10 artırıldığında KKD frekansının %50 artığı gösterilmiştir (102). b) Sıcaklık: Kültür ortamının optimum sıcaklık 37 o C olup o C aralığına tekabül eder. Sıcaklığın geçiçi düşmesi hücreleri öldürmez gelişimlerini duraklatıp hasat zamanını geçiktirirken sıcaklık 39 o C nin üzerine çıkarsa hücreler ölür (94). c) Besiyeri: Farklı besiyerinde üretilen insan lenfositlerinin KKD sıklığının farklı olduğu gözlenmiştir (102). d) Antibiyotik: Kültür ortamında antibiyotik kullanılması KKD sıklığını azaltır (102). e) Serum: Besiyerine konulan serumun konsantrasyonu KKD oluşumunu etkiler (102). f) Mitoz Uyarıcı: Günümüzde in vitro koşullarda kullanılan mitotik ajanla, TTP (tüberkülin pürifiye protein), tetenoz ekstresi, konkavanalin A, PWM (prokeweed mitojen) ve PHA (fitohemaglutinin) dır. PHA, barbunya fasulyesi (phaseolus vrilganis) ekstrası olan bir mukopolisakkarittir. En çok kullanılan PHA nın işlergesi bilinmemekte olup indüksiyon sürecinin ilk 24 saatinde gereklidir. Kültürde ilk 24 saatten sonra RNA sentezini artırır. İkinci 24 saat süresince çekirdek genişlemekte ve DNA sentezi başlamaktadır (94). g) Kültür Süresi: İlk mitoz 48 saatte gözlenir. Her 24 saatte bir mitoz dalgası gerçekleşir. Bu nedenle hasat 72. saatte veye 96. saatte yapılır. Rutin amaçlı kültürlerde önerilen süre 72 saattir (94). h) Karanlık Ortam: Hücrelerin kültüre edildiği sürece flourans ışığa maruz kalmaları BrdU içeren DNA nın fotolizine neden olarak hareketli alkali gruplarının oluşumuna neden olur. Bu oluşum guanin ile reaksiyona girerek DNA nın depürine olmasına ve bu da tek sarmalda kırılmalara neden olarak KKD nin oluşumunu 30

37 indükler. Bu neden KKD analizi için kullanılacak kültürlerin ışıktan koruması gerekir. (94) i) Kolşisin Konsantrasyonu: Mitozu metafazda durdurmak için mekik inhibitörleri kullanılır. Kolşisin de bunlardan biridir ve 10 μg/ml olacak şekilde hazırlanır. Kolşisinde bırakma süresi ile metafaz indeksinin sayısı birbiri ile orantılıdır. Fakat uzun süre bırakmalarda kromozom boylarında kısalma gözlenir. Bu nedenle süre iyi ayarlanmalıdır (94). j) Hipotonik solüsyon: Hipotonik çözeltilerin yoğunluğu hücre plazma yoğunluğundan az olduğundan hücreler içine su alır, şişer ve eritrositlerin çoğu patlar. Hipotonik uygulaması kritik bir zamanı gerektirir. Kolşisinin etkisini sonlandırıp kromozomların dağılmasını sağlar. Hipotonik çözelti olarak % 1 lik sodyum sitrat veya 0,075 M KCl kullanılabilir. Kromozomda en az hasar yaptığından en çok kullanılan hipotonik çözelti KCl dir (94). k) Fiksasyon: Fiksasyonda 3:1 alkol ve glasiyal asetik asit oranı önemlidir. Asetik asitin fazla olması hücrelerin erken yırtılmasına neden olur. Bu da kromozom kayıplarına yol açar. Kan kültürlerinde ilk fiksasyonda karıştırma çok önemlidir, kalan eritrositler hemoliz olur. Kırmızı renkli hemoglobin koyu kahve renkli hematine dönüşür. Yeterli karıştırma yapılmazsa koyu kahve renkli çökeltiler gözlenirken mitotik indeks düşer ve kalitesiz preperatlar elde edilir (94). 31

38 3. MATERYAL VE METOD 3.1. Materyal Kimyasallar Fitohemaglutinin (Biologcal Industries BI H), Fetal calf serum (Biologcal Industries BI B), Leguamine IU (Roche HEP-5), RPMI 1640 Medium (Biologcal IndustriesB B), Bis Benzimide (Serva II33258), Giemsa (Merck ), Potasyum dihydrogen phosphate (KH2PO4, Merck ), Di-sodium hydrogen phosphate anhydrous (Na2HPO4.2H2O, Merck ), Colchicine (Serva), Penisilin/Streptomisin (Irvine Scientific), L- Glutamin (Irvine Scientific ), 5-Bromo-2 deoxyuridine (Sigma), Asetic asit glacial (Merck), Methanol (Merck), Potasyum chloride (KCl) (Merck), PBS tablets (phosphate buffered saline, amresco E TABS), Hypericin 1 mg (Sigma), Dimetilsülfoksit (Sigma) Diğer Malzemeler Kapaklı falkon tüp (greiner), cam pastör pipeti 3 ml (Isolab), lam (rodajlı Superior marienfeld ), plastik pastör pipet 3ml lik (disposebl), 5cc lik enjektör, plastik pipet, şale, balon joje, beher, etüv, benmari, santrifüj, vortex Deney Gruplarının Oluşturulması Deney, Süleyman Demirel Üniversitesi Tıbbi Biyoloji Sitogenetik laboratuvarında yürütülmüştür. Kan örnekleri 10 (5 bayan ve 5 bay) gönüllü, sağlıklı, sigara kullanmayan bireyden alındı. Birbirine bağlı üç grup oluşturuldu: Grup 1 (kontrol grubu), grup 2 (5μM hyperisin), grup 3 (10 μm hyperisin) (33). Her bireye ait kan örneğinden 3 ekim yapıldı. 32

39 3.2. Metod Hücre Kültürlerinin Kurulması 5 cc lik heparinli enjektörlere yaklaşık 5 cc periferel kan örnekleri alındı. Besiyeri hazırlanması: 100 ml RPMI 1640 Medium (Biological Industries,BİO B) 2 ml L-glutamin (Biological Industries,BİO B) 2 ml penisilin-streptomisin (Biological Industries,BİO H) 3,3 ml fitohemaglutinin (Biological Industries,BİO B) 30 ml fetal bovin serum (Biological Industries,BİO B) karıştırılır. Fitohemaglutinin hazırlanması: Ticari olarak 5 ml gelen fitohemaglutinin 5 ml RPMI 1640 Medium ile sulandırıldı. Fetal bovin serumun hazırlanması: Fetal bovin serum çözdürüldükten sonra 65 o C de 1 saat inaktive edildi. Hyperisinin çözülmesi: 1 mg lık toz Hyperisin (Sigma), 2 ml DMSO (dimetilsülfoksit) ile ışık geçirmeyen kendi ambalajında çözüldü (105). Sonra distile-noniyonize su ile 10 ml ye tamamlandı. Işık geçirmeyen cam şişe içersinde 20 o C de saklandı. 5-Bromo-2 deoxyuridine (BrdU) solüsyonunun hazırlanması: 15,37 mg BrdU (Sigma, B5002) 10 ml distile su ile çözüldü, filtre edildi. Steril ağzı kapaklı bir tüp içersinde üzeri aluminyum folyo il sarılıp +4 o C de stok olarak saklandı. 33

40 İşlemler: Hazırlanan besiyerinden plastik ağzı kapaklı konik santrifüj tüpüne kontrol için 9 ml üzerine 1 ml kan ilave edildi. Deney grularında da aynı işlem yapılıp hyperisin dozlarının da eklenmesi ile toplam hacim 10 ml ye tamamlandı. Bütün tüpler alt-üst edildikten sonra 0,1 ml 5-Bromo-2 deoxyuridine (BrdU) stok solüsyonu eklendi. Tüplerin üzeri aliminyum folyo ile kapatıldı. Tüpler yavaş vortekslendi. Tüpler 37 o C ye ayarlanmış etüve 45 derecelik açı ile kondu. Her gün sabah tüpler alt üst edildi. 70. saatte tüpler etüvde çıkarılıp 2 damla kolşisin (2 lik enjektörle) damlatıldı. 1 saat 10 dakika 37 o C ye ayarlanmış etüvde bekletildi Kromozom Eldesi Hipotonik solüsyonun hazırlanması: 0,075 M KCl (Merck 4935) olacak şekilde 0,56 gr tartılır distile su ile 100 ml ye tamamlanır. Kullanımdan en az 1 saat önce hazırlanır ve 37 o C de bekletilir. Fiksatifin hazırlanması: Bir kısım glasial asetik asit 3 kısım metanol (30 ml GAA+90 ml metanol) karıştırıldı. Lamların hazırlanışı: Lamlar önce distile sudan geçirilip şaleye yerleştirilir, yarıya kadar distile su ile doldurulup üstüne alkol ile tamamlanır. Kullanılacağı gün sabah alkol boşaltılıp distile su konur. Uygulama sırasında buzlu şale içersinden alınarak kullanılır. İşlemler: Kromozom preperasyonu için modifiye Moorheard ve arkadaşlarının tekniği uygulandı (105). Süre bitiminde tüpler 1200 rpm de 10 dak. santrifüj edildi. Süpernatan kısım atıldı. Sonra tüpler bir taraftan vortekslenirken bir yandan da hipotonik yavaş yavaş 6 ml çigisine kadar üzerine ilave edildi. Biraz daha vortekslenip 37 o C ye ayarlanmış etüvde 1 saat bekletildi. Süre sonunda tüpler 1200 rpm de 10 dak. santrüfüj edildi, süpernatan kısmı 1,5-2 ml kalıncaya kadar atıldıktan sonra tüpler vortekslendi ve vortekslenirken fiksatif pipet ile tüpün kenarından ilave edildi. İlk uygulamada tüpte bir renk 34

41 değişimi gözlendi (eritrositler patlayıp hemoglobin açığa çıktığı için) koyu kahverengi siyah bir görümün aldı. Fiksatif 6 çizgisine kadar ilave edildi. İlk fiksatif uygulamasından sonra tüpler 18 o C de bekletildi. Diğer fiksatif uygulamalarında bekletmeye gerek yoktur. Tüplerdeki renk berrak oluncaya kadar önce santrifüj sonra fiksatif uygulandı. Genellikle 3 4 uygulamadan sonra istenilen renk elde edildi. Son fiksasyondan sonra santrifüj edilip süpernatan kısım atılarak 1,5-2 ml bırakıldı ve cam pastör pipetlerle birkaç kez pipetaj yapıldı. En az bir gün önceden şale içine hazırlanıp -18 o C ye konulan lamlar buzlu şale içersinden çıkarıldı (lamların soğuk olması gerekir). Pipetlere çekilen homojenat önce 45 derece eğimli tutulan lama mümkün olan en yüksek mesafeden damlatıldı. 15 damladan sonra bu eğim kaldırıldı lam düz tutularak 15 damla daha damlatıldı. Aynı şekilde her bir örnekten paralel ikinci lam da yayıldı. Yayılan lamlara isim ve tarih yazılarak ya 24 saat 65 o C de ya da 3 gün 37 o C de bekletilerek yaşlandırıldı Kardeş Kromatid Değişimi Boyama Tekniği Korenberg ve arkadaşlarının önerdikleri modifiye boyama yöntemi kullanıldı (106). Kullanılan Solüsyonlar: 2xSSC solüsyonu: 0,87 gr sodyum sitrat (0,03 M Mecrk,104873) ve 0,44 gr sodyum klorür (0,3 M Merck,106404) 100 ml bidistile suda çözüldü. PBS solüsyonu: 5 adet PBS tablet ( amresco AIE )) 500 ml distile suda çözüldü. 100 ml,100 ml ve 99 ml şeklinde şalelere hazırlandı geri kalan da balon jojede bırakıldı (UV de kullanmak için). Bis Benzimide (hoechst) stok solüsyonu: 0,5 mg Bis Benzimide (Serva, 15090) tartıldı ve 20 ml deiyonize suda çözüldü +4 o C de saklandı. 35

42 Söranson tamponu: A solüsyonu: Potasyum dihydrogen phosphate (KH2PO4, Merck ) 4, 537 gr 500 ml distile suda çözüldü. B solüsyonu: Di-sodium hydrogen phosphate anhydrous (Na2HPO4.2H2O, Merck ) 5,936 gr 500 ml distile suda çözüldü. Balon jojeye A solüsyonundan alınarak ph 6,8 e gelinceye kadar B solüsyonu eklendi. Giemza boya solüsyonu: 3 ml Giemsa (Merck ) + 97 ml Söranson tamponu 100 ml ye tamamlandı. İşlemler: Preperatlar, ml PBS solüsyonunda 5 dakika bekletildi. - 9 ml PBS solüsyonu + 1 ml Bis Benzimide de 20 dakika bekletildi ml PBS solüsyonunda çalkalandı. - preperatlar tepsiye dizildi geri kalan PBS üzerine döküldü ve UV altıda 25 dakika bekletildi. - Distile suda çalkalandı. - 2xSSC solüsyonunda (benmaride) 15 dakika bekletildi. - Distile suda çalkalandı. - Giemza boya solüsyonunda 20 dakika bekletilerek boyandı. - Distile suda çalkalandı. - Son olarak preperatlar kurutma kağıdı ile kurutuldu. Mikroskopta immersiyon yağı ile 100 lük objektifle incelendi KKD nin Değerlendirilmesi Her birey için iyi dağılmış 20 metafazdaki KKD oranları 100X lik mikroskop (Olimpus) altında incelendi. Birli, ikili, üçlü ve dörtlü değişimlerdeki 36

43 kırık noktaları gözlendi, her bir metafazdaki toplam değişim değeri belirlendi ve her birey için 20 metafaz değerlendirilerek değişimlerin ortalaması alındı İstatistiksel İşlemler Kontrol grubu ve vaka gruplarının her bir bireyi için KKD ortalamaları alındı. Kontrol grubu ile vaka grupları KKD değerleri Paired-t Testi kullanılarak, istatistik açıdan değerlendirildi. İstatistik analizler SPSS for Windows istatistik programı ile bilgisayarda yapıldı. İstatistik analizlerde p<0,05 anlamlı kabul edildi. Değerler, ortalama ± standart sapma olarak verildi Fotoğrafik İşlemler Tezde üç gruba ait önreklerden kaliteli olan birkaç mefazın 100X objektifle immersiyon yağı altında Zeis marka mikroskop ve Canon marka digital fotograf makinesi kullanılarak fotografları çekildi. 37

44 4. BULGULAR Türkiye genelinde yaygın olarak yetişen özellikle de Isparta yöresinde kantaron otu olarak tanınan bu bitkinin çiçeğinin zeytinyağı içerisine katılarak güneşte bekletilip elde edilen karışımın folklorik olarak haricen yara iyileştirici, dahilen sindirim sistemi hastalıkları için kullanıldığı bilinmektedir. Bu çalışmamızda, H. perforatum bitkisinin aktif maddesi olan hyperisinin insan lenfosit kültürlerinde KKD sıklığına olan etkisi araştırıldı. Gönüllü ve sağlıklı (son 6 ay içinde radyasyon almamış, herhangi bir sistemik hastalığı olmayan, herhangi bir ilaç, sigara ve alkol kullanmayan) yaşları arasında kadınlarda ortalama 26.8 ± 2.9, erkeklerde 25.4 ± 2.5 olan 5 erkek 5 kadın toplam 10 kişiden alınan kan örnekleri her grup için bir adet olmak üzere 3 ekim yapıldı. Birici grup kontrol grubu olarak seçildi. İkinci ve üçüncü gruba hyperisinin nin farklı iki dozu (5 μm/l ve 10 μm/l) uygulanarak KKD sıklığı değişimi araştırıldı. Çalışılan gruplara ait preperatlarda ortalama 20 metafazda sayım yapılmıştır. Her olgu için metafazlarda 1 li, 2 li, 3 lü ve 4 lü kırıklar sayılmış KKD değeri olarak kaydedilmiştir. Grup I için KKD ortalama 6.5 ± 1.2, grup II ortalaması 7.2 ± 0.9 grup III için 8.2 ± 0.4 bulunmuştur (Tablo 3). Grup I ile grup II arasındaki fark istatistiksel olarak anlamsız bulunurken grup I ile grup III arasındaki arasındaki fark Paired-t testine göre anlamlı bulunmuştur (p<0,05). Tablo 3: Gruplar arasındaki KKD değerleri Gruplar N KKD ortalama ±ss Grup I (kntrol grubu) ± 1.2 Grup II (5 μm/l Hy) ± 0.9 Grup III (10 μm/l Hy) ±0.4 ss: standart sapma N: Birey sayısı Ayrıca grup I ve II KKD karşılaştırması grafik 1 de, grup I ve grup III KKD karşılaştırması grafik 2 de, grup II ve III karşılaştırması da grafik 3 te gösterilmiştir. 38

45 Grup I ve II 10 KKD ortalaması ,83 7,65 7,76 7,2 5,85 4,47 6 6,1 5,9 5,8 8,25 8,3 8,9 8,3 7,35 6,05 6,61 6,4 6,5 6, Bireyler Grup I Grup II Grafik 1: Grup I ve II nin KKD değerlerinin karşılaştırılması. 39

46 Grup I ve III ,83 7,65 7,76 8,4 8,6 7,9 8,95 8,45 8,25 8,3 7,66 7,8 8,3 KKD ortalaması ,47 5,85 6 5,9 6,05 6,5 6, Bireyler Grup I Grup III Grafik 2: Grup I ve III ün KKD değerlerinin karşılaştırılması. Grup II ve III 10 KKD ortalaması ,83 7,83 7,76 7,76 7,2 8,4 6,1 8,6 8,9 8,95 8,3 8,45 7,9 7,66 7,8 7,35 6,61 5,8 6,4 8, Bireyler Grup II Grup III Grafik 3: Grup II ve III ün KKD değerlerinin karşılaştırması. 40

47 Tüm gruplarda kadın ve erkek KKD ortalamalarını karşılaştırıldığında grup I, grup II, grup III de erkeklerin KKD oranları kadınlardan yüksek bulunmuştur (Tablo 4). Grup I ve II deki fark istatisitksel olarak anlamlı (p<0,05) iken grup III deki fark anlamsız bulunmuştur. Tablo 4: Kadın ve erkek KKD değerleri CİNSİYET Grup I KKD ortalaması ± ss Grup II KKD ortalaması ± ss Grup III KKD ortalaması ± ss Kadın (N:5) 5.9 ± ± ± 0.4 Erkek (N:5) 7.1 ± ± ± 0.5 ss: standart sapma N: Birey sayısı 41

48 Resim 1: Grup I e ait bir metafaz örneği. Resim 2: Grup II e ait metafaz örneği. 42

49 Resim 3: Grup III e ait bir metafaz örneği. 43