ANKARA ÜNĠVERSĠTESĠ FEN BĠLĠMLERĠ ENSTĠTÜSÜ YÜKSEK LĠSANS TEZĠ

Transkript

1 ANKARA ÜNĠVERSĠTESĠ FEN BĠLĠMLERĠ ENSTĠTÜSÜ YÜKSEK LĠSANS TEZĠ ANKARA ÇUBUK YÖRESĠ TURġULARINDAN ĠZOLE EDĠLEN LAKTĠK ASĠT BAKTERĠLERĠNĠN BAZI TEKNOLOJĠK VE FONKSĠYONEL ÖZELLĠKLERĠNĠN BELĠRLENMESĠ Nurdan ARSLANKOZ GIDA MÜHENDĠSLĠĞĠ ANABĠLĠM DALI ANKARA 2011 Her hakkı saklıdır

2 ÖZET Yüksek Lisans Tezi Ankara Çubuk yöresi turşularından izole edilen laktik asit bakterilerinin bazı teknolojik ve fonksiyonel özelliklerinin belirlenmesi Nurdan ARSLANKOZ Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Gıda Mühendisliği Anabilim Dalı Danışman: Prof. Dr. Filiz ÖZÇELİK Bu çalışmada, Ankara Çubuk bölgesi turşularından izole edilerek tanımlanması yapılmış ve Ankara Üniversitesi Mühendislik Fakültesi Gıda Mühendisliği Bölümü Kültür Koleksiyonu'nda bulunan 36 adet laktik asit bakterisinin bazı teknolojik ve fonksiyonel özellikleri belirlenmiştir. 36 adet laktik asit bakterisi suşunun farklı ph ve tuz değerlerinde gelişmesi, laktik asit, H 2 O 2, bakteriyosin üretim yeteneği, antimikrobiyel ve proteolitik aktivitesi, enzim profilleri gibi bazı teknolojik ve fonksiyonel özellikleri incelenmiştir. Bu çalışma kapsamında incelenen laktik asit bakterisi suşlarının ph 5.0, ph 6.5, % 3 ve % 6.5 tuz konsantrasyonlarında tamamına yakınının geliştiği, 24 saat inkübasyon sonrası g/100 ml asit ürettiği, H 2 O 2 üretim miktarlarının µg/ml olduğu, L. inocua, E. coli ve Salmonella üzerinde antimikrobiyel aktivite gösterdikleri, fakat bakteriyosin ve benzeri maddeler üretmediği sonucuna ulaşılmıştır. Haziran 2011, 71 sayfa Anahtar Kelimeler: Laktik asit bakterisi, turşu, teknolojik ve fonksiyonel özellik ABSTRACT i

3 Determination of some technological and functional properties of lactic acid bacteria isolated from pickles in Ankara Çubuk region Master Thesis Nurdan ARSLANKOZ Ankara University Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Food Engineering Supervisor: Prof. Dr. Filiz ÖZÇELİK In this study, some technological and functional properties of 36 lactic acid bacteria which were isolated from the pickles of Ankara-Çubuk region were determined. These bacteria were identified at the Food Engineering Department of Ankara University and stored in the culture collection of the same department. Some technological and functional properties of 36 lactic acid bacteria strains were determined which are ability to grow at different ph and different salt concentrations; production capability of lactic acid, H 2 O 2 and bacteriocin, proteolytic and antimicrobial activity and enzyme profiles. It is concluded that almost all of the lactic acid bacteria strains examined in this study were able to grow at ph 5.0 and 6.5, 3 % and 6.5 % salt concentrations. The concentration of lactic acid after 24 hour incubation was between g/100 ml and H 2 O 2 produced by the strains was between µg/ml. The strains displayed antimicrobial activities against L. inocua, E. coli and Salmonella but none of the strains were able to produce bacteriocins and bacteriocin-like metabolites. June 2011, 71 pages Key Words:lactic acid bacteria, pickle, technological and functional properties TEġEKKÜR ii

4 Yüksek lisans eğitimim süresince bana yol gösteren, bilgi, öneri ve yardımlarını esirgemeyen danışman hocam Sayın Prof. Dr. Filiz ÖZÇELİK'e (Ankara Üniversitesi Gıda Mühendisliği Bölümü) ve Arş.Gör. Mehmet TOKATLI'ya, bana her zaman destek olan sevgili aileme teşekkür ederim. Bu tez çalışması, TÜBİTAK tarafından desteklenen 108O491 numaralı "Ankara Çubuk yöresi turşularından izole edilen laktik asit bakterilerinin tanımlanmaları, teknolojik ve fonksiyonel özelliklerinin belirlenmesi ve starter olarak kullanılma olanaklarının değerlendirilmesi" konulu projenin bir bölümüdür. Nurdan ARSLANKOZ Ankara, Haziran 2011 ĠÇĠNDEKĠLER ÖZET... i ABSTRACT... i iii

5 TEġEKKÜR... ii SĠMGELER DĠZĠNĠ... v ġekġller DĠZĠNĠ... vi ÇĠZELGELER DĠZĠNĠ... vii 1. GĠRĠġ KAYNAK ÖZETLERĠ Laktik Asit Bakterileri TurĢuda bulunan laktik asit bakterileri Lactobacillus Pediococcus Leuconostoc Enterecoccus Laktik Asit Bakterilerinin Asit Üretim Yetenekleri Laktik Asit Bakterilerinin Farklı ph Değerlerinde GeliĢme Yetenekleri Laktik Asit Bakterilerinin Farklı Tuz Konsantrasyonlarında GeliĢme Yetenekleri Laktik Asit Bakterilerinin Antimikrobiyel Aktivitesi Laktik Asit Bakterileri Tarafından Üretilen Antimikrobiyel BileĢikler Organik asitler Karbondioksit Diasetil Reuterin Etil alkol Hidrojen peroksit Bakteriyosinler Laktik Asit Bakterilerinin Proteolitik Aktiviteleri MATERYAL VE YÖNTEM Materyal Bakteri kültürleri Besiyerleri Yöntem Laktik asit bakterilerinin asit üretim yeteneklerinin ve hızlarının belirlenmesi Laktik asit bakterilerinin farklı ph değerlerinde geliģme yetenekleri Laktik asit bakterilerinin farklı tuz konsantrasyonlarında geliģme yetenekleri Laktik asit bakterilerinin antimikrobiyel aktivitesinin belirlenmesi Laktik asit bakterilerinin bakteriyosin üretim yeteneklerinin belirlenmesi Laktik asit bakterilerinin H 2 O 2 üretim yeteneklerinin belirlenmesi Laktik asit bakterilerinin enzim profillerinin belirlenmesi (API ZYM) Laktik asit bakterilerinin proteolitik aktiviteleri BULGULAR VE TARTIġMA Laktik Asit Bakterilerinin Asit Üretim Yetenekleri Laktik Asit Bakterilerinin Farklı ph Değerlerinde GeliĢme Yetenekleri Laktik Asit Bakterilerinin Farklı Tuz Konsantrasyonlarında GeliĢme Yetenekleri Laktik Asit Bakterilerinin Antimikrobiyel Aktivitesi Laktik Asit Bakterilerinin Bakteriyosin Üretim Yetenekleri iv

6 4.6 Laktik Asit Bakterilerinin Hidrojen Peroksit Üretim Yetenekleri Laktik Asit Bakterileinin Enzim Profillerinin Belirlenmesi (API -ZYM) Laktik Asit Bakterilerinin Proteolitik Aktiviteleri SONUÇ KAYNAKLAR ÖZGEÇMĠġ SĠMGELER DĠZĠNĠ ATP α Adenozin trifosfat Alfa v

7 ß Beta ºC Celcius CO 2 Karbondioksit DNA Deoksiribonükleik FDA Food and Drug Administration H 2 O 2 Hidrojen peroksit LAB Laktik asit bakterileri µg Mikrogram µl Mikrolitre ml Mililitre M.Ö Milattan önce MRS Man Rogosa Sharpe NaCl Sodyum klorür NaOH Sodyum hidroksit OPA o- Phthaldialdehyde RNA Ribonükleik asit pna p-nitroanilide SDS Sodyum dodesil sülfat spp. Subspecies TCA Trikloroasetik asit TSB Tryptic Soy Broth TSBYA Tryptic Soy Broth-Yeast extract Agar UV Ultraviolet ġekġller DĠZĠNĠ Şekil 2.1 Homofermantatif laktik asit fermantasyonu... 4 Şekil 2.2 Heterofermantatif laktik asit fermantasyonu)... 5 vi

8 Şekil 2.3 Fermantasyon sonucu laktik asit oluşumu Şekil 2.4 Gliserolden Reuterin Biyosentezi Şekil 2.5 Por Oluşum Modelleri Şekil 2.6 Nisinin Por Oluşum Mekanizması Şekil 3.1 Hidrojen peroksit standart eğrisi Şekil 4.1 Laktik asit bakterilerinin farklı inkübasyon sürelerinde asit üretim miktarları (g/100 ml) Şekil 4.2 Laktik asit bakterilerinin farklı ph değerlerinde gelişme değerleri (OY 600 ) Şekil 4.3 Laktik asit bakterilerinin farklı tuz konsantrasyonlarında gelişme değerleri Şekil 4.4 LL27 Suşunun Bakteriyosin Aktivitesi Şekil 4.5 Laktik asit bakterilerinin hidrojen peroksit üretim değerleri (µg/ml) ÇĠZELGELER DĠZĠNĠ Çizelge 2.1 Turşu fermantasyonunda fermantasyon aşamaları... 6 Çizelge 2.2 Bazı bakteriyosinlerin kullanıldığı gıdalar ve etkileri Çizelge 2.3 Bazı bakteriyosinlerin sınıflandırılması ve etkili olduğu bakteriler Çizelge 3.1 Çalışmada kullanılan laktik asit bakterisi kültürleri vii

9 Çizelge 4.1 Laktik asit bakterilerinin farklı inkübasyon sürelerinde asit üretim miktarları (g/100 ml) Çizelge 4.2 Laktik asit bakterilerinin farklı ph değerlerinde gelişme değerleri (OY 600 ) Çizelge 4.3 Laktik asit bakterilerinin farklı tuz konsantrasyonlarında gelişme değerleri (OY 600 ) Çizelge 4.4 Laktik asit bakterilerinin farklı mikroorganizmalar üzerindeki Antimikrobiyel aktivitesi sonucu oluşan zon çapları (cm) Çizelge 4.5 Laktik asit bakterilerinin hidrojen peroksit üretim miktarları (µg/ml) Çizelge 4.6 Laktik asit bakterilerinin API-ZYM test kiti ile belirlenen enzim profilleri 59 Çizelge 4.7 Laktik asit bakterilerinin proteolitik aktiviteleri (OY 410 ) viii

10 1. GĠRĠġ Dünya nüfusun hızla artışı ile hazır ve raf ömrü uzun gıdaların ihtiyaç haline gelmesi, gıdaların korunmasının önemini arttırmıştır. Gıdaların güvenilirliğinin uluslararası boyutta önem kazanması ve doğal gıdalara olan talebin artması, en uygun doğal gıda koruyucularının belirlenmesi ve sektörde yer edinmesi ile ilgili çalışmalara hız kazandırmıştır (Dinçer vd. 2009). Doğal gıdalara olan talebin artmasıyla, fermente gıdalara dolayısıyla fermantasyon teknolojisine olan ilgi artmıştır. Fermantasyon, gıdaların korunmasında kullanılan en eski, ekonomik ve pratik yöntemlerdendir (Blandino vd. 2003). Fermantasyon sürecinde birincil gıda ürünlerinde, mikroorganizmalar ve enzimleri tarafından biyokimyasal değişiklikler meydana gelmektedir. Gıda fermantasyonu; tahıl ürünleri, alkollü ve alkolsüz içkiler, süt ürünleri, balık ve et ürünleri, meyve ve sebze ürünleri fermantasyonu olarak sınıflandırılabilir (Steinkraus 1997). Fermantasyon gıdaların tat, aroma, tekstür, besin değeri, raf ömrü gibi özellikleri arttırmakta, ayrıca gıdanın pişirilmesi için gerekli süreyi kısaltmaktadır. Fermente gıdalar, çiğ materyalden mikrobiyel fermantasyon yoluyla meydana gelen sağlıklı ve lezzetli gıdalardır. Avrupada çeşitli ticari bitkisel fermente ürünler bulunmaktadır. Bunlardan en ekonomik olanları zeytin, salatalık turşusu ve lahanadan yapılan sauerkrauttur. Salatalık, turp, havuç vb. sebzelerden; ayrıca zeytin, mango, papaya gibi bazı yeşil meyvelerden, tuz eşliğinde laktik asit fermantasyonu ile fermente gıda elde edilmesi tüm dünyada oldukça yaygındır (Steinkraus 1997). Zamanla sektör haline gelen turşuculuk, Ankara Çubuk İlçesi'nde de oldukça yaygındır. Son yıllarda Çubuk İlçesi'nde düzenlenen Uluslararası Turşu ve Kültür Festivali sayesinde üretilen turşular Ankara dışında diğer illere ve ülke dışına da pazarlanmaktadır. Son yıllarda Çubuk turşusuyla özdeşleşen turşuculuk ilçe halkı için önemli bir gelir kaynağı olmuştur yılı içerisinde tahmini olarak ton turşu üretilip satılmıştır ( 2011). 1

11 Fermente gıdalar elde edilirken, fermantasyondan sorumlu mikroorganizmalar substratın üzerindeki doğal mikroflorada bulunmakta ya da starter kültür olarak gıdalara eklenmektedir (Blandino vd. 2003). Starter kültür çok sayıda mikroorganizmadan oluşan mikrobiyel bir preparattır. Doğal fermantasyon yoluyla üretilen ürünlerde standart bir son ürün elde etmek pek mümkün olmamaktadır. Fakat starter kültürün birincil gıda ürününe eklenmesiyle fermantasyon sürecinin kontrol altında tutulması ve standart bir son ürün elde edilmesi sağlanabilmektedir (Leroy ve Vuyst 2004). Bu çalışmanın temel amacı; Çubuk İlçesi turşularından izole edilerek tanısı yapılmış ve Ankara Üniversitesi Mühendislik Fakültesi Gıda Mühendisliği Bölümü Kültür Koleksiyonunda bulunan 36 adet laktik asit bakterisinin starter kültür olarak değerlendirilebilmesi için bazı teknolojik ve fonksiyonel özelliklerini belirlemektir. 2

12 2. KAYNAK ÖZETLERĠ 2.1 Laktik Asit Bakterileri Modern gıda üretim yöntemlerinde, gıdanın üretiminden tüketimine kadar kabul edilebilir ve istenilen düzeylerde kaliteyi sağlamak ve korumak için çeşitli teknolojilerden yararlanılmaktadır. Bu teknolojiler içinde en eski olanı fermantasyondur. Fermantasyon, mikroorganizmaların biyolojik aktiviteleri sonucu metabolik ürünler üretmesi ve dolayısıyla gıda kaynağı üzerinde istenmeyen mikrofloranın baskılanması ile sonuçlanmaktadır. Gıdaların fermantasyon yoluyla korunması binlerce yıl öncesine dayanmaktadır. M.Ö. 6000'li yıllarda hayvanların evcilleştirilmesiyle peynir üretimi, M.Ö yıllarında Sümerler ve Mısırlılar tarafından şarap ve bira fermantasyonu gerçekleşmiştir. Fermente gıda üretimi çok eski bir yöntem olmasına rağmen, 1861 yılında Louis Pasteur tarafından pastörizasyonun bulunmasıyla mikroorganizmaların fermantasyon ile olan ilişkisi anlaşılmıştır (Ross vd. 2002). Meyve ve sebzelerin fermantasyon yoluyla korunması M.Ö yıllarına dayanmaktadır. Bitki kökenli gıdaların fermantasyonu ile tüm dünyada, çok fazla miktarda ve çeşitlilikte ürün oluşmaktadır. Salatalık, lahana, havuç, kereviz, şalgam, turp, pancar, biber gibi birçok sebze fermente edilmektedir (Daeschel vd. 1987). Ülkemizde de laktik asit fermantasyonu ile turşu üretimi yapılmaktadır. Fermente gıdaların elde edilmesinde mikroorganizmaların çok büyük rolü bulunmaktadır. Bakterilerin gıda fermantasyonu ile olan ilişkisinin anlaşılmasından itibaren laktik asit bakterilerine olan ilgi artmıştır (Karovicová ve Kohajdová 2005). Laktik asit bakterileri, Gram pozitif, spor oluşturmayan, katalaz negatif, sitokroma sahip olmayan, asidi tolere edebilen ve karbohidrat fermantasyonu sırasında başlıca son ürünü laktik asit olan bakteriler olarak tanımlanmaktadır. 3

13 LAB (Laktik Asit Bakterileri), karbohidrat metabolizmasına göre homofermantatif LAB (temel olarak laktik asit üreten), heterofermantatif LAB (laktik asit, karbon dioksit, etanol, asetik asit üretenler) olmak üzere iki ana gruba ayrılmaktadır (Bulut 2003). Şekil 2.1 de homofermantatif laktik asit fermantasyonu, şekil 2.2 de heterofermantatif laktik asit fermantasyonu gösterilmektedir (Tangüler 2010). Şekil 2.1 Homofermantatif laktik asit fermantasyonu (Tangüler 2010) 4

14 Şekil 2.2 Heterofermantatif laktik asit fermantasyonu (Tangüler 2010) Laktik asit bakterileri Turşu; sebze ve meyvelerin belirli tuz konsantrasyonları veya kendi öz suları içinde laktik asit bakterileri tarafından fermantasyona uğratılmaları ile oluşan laktik asidin ve ortamdaki tuzun koruyucu etkisi sonucu, uzun süre dayanıklılık kazanan bir üründür. 5

15 Taze sebze ve meyvelerin doğal mikroflorası çok çeşitli mikroorganizmalardan meydana gelmektedir. Bu populasyonun içinde bozulmalara neden olan mikroorganizmalar ve laktik asit bakterileri de yer almaktadır. Turşu fermantasyonunda fermantasyon aşamaları çizelge 2.1 de gösterilmektedir (Aktan vd. 1998). Çizelge 2.1 Turşu fermantasyonunda fermantasyon aşamaları (Aktan vd. 1998) AĢamalar Mikroflora Başlangıç Birincil fermantasyon İkincil fermantasyon Fermantasyon sonrası Çeşitli Gram (+) ve (-) bakteriler Laktik asit bakterileri ve mayalar Mayalar a) Açık tanklarda:salamura yüzeyinde oksidatif mayalar, küf ve bakteriler b) Anaerobik tanklarda: mikrobiyel etkinlik yoktur. Turşu fermantasyonunun başlangıç aşamasında üründe bulunan fakültatif veya mutlak anaerobik mikroorganizmalar gelişmektedir. Bu sırada laktik asit bakterileri ortama hakim olarak ph'nın düşmesini sağlamakta, Gram negatif ve sporlu bakterilerin gelişimini engellemektedir. Birincil fermantasyon aşamasında mikrofloraya laktik asit bakterileri hâkim olmakla bitlikte bazı fermantatif mayalar da bulunabilmektedir. Bu mikroorganizmaların üremeleri ortamdaki şekerin tamamen kullanılması veya asit inhibisyonu meydana gelinceye kadar devam etmektedir. İkincil fermantasyon aşamasında ise fermantatif mayalar gelişmektedir. Bu mayalar, ph düşüşü nedeniyle, laktik asit bakterilerinin gelişmesi yavaşladıktan sonra ortamda kalan şekeri fermente ederler. Fermantasyon sonrası ortamda karbohidrat kaynağı kalmadığı için anaerobik koşullarda herhangi bir mikrobiyel gelişme gözlenmez. 6

16 Fakat salamura yüzeyi havayla temas ederse oksidatif mayalar, küfler ve bozulma yapan bazı bakteriler gelişebilmektedir (Aktan vd. 1998). Turşu fermantasyonunun başlangıç ve birincil aşamasında, ortama hakim olan laktik asit bakterileri Enterococcus faecalis, Leuconostoc mesenteroides, Lactobacillus brevis, Pediococcus pentocaceus ve Lactobacillus plantarum türleridir. Hıyar turşusu fermantasyonunda Lactobacillus brevis, Pediococcus pentocaceus ve Lactobacillus plantarum türleridir. Lactobacillus plantarum aside en dayanıklı tür olması nedeniyle tüm fermantasyon boyunca baskındır, genelde fermantasyon bu bakterinin etkinliğiyle sonlanmaktadır (Aktan vd. 1998) Lactobacillus Lactobacillus cinsleri çomak şeklinde hücrelere sahiptir. Hücreler düzgün veya hafif kıvrık, bazı türlerde T, Y ve V şeklindedir. Çomakların uçları düzgünce yuvarlanmış, uzun kenarlar birbirine paralel durumdadır. Hücreler türe göre tek veya çift olarak bulunabilmekte, bazılarında kısa veya uzun zincirlere rastlamak da mümkün olmaktadır (Şahin 2003). Lactobacillus cinsleri fermantasyon karakterlerine göre zorunlu homofermantatif, zorunlu heterofermantatif ve fakültatif heterofermentatif olmak üzere üç gruba ayrılmaktadır (Stiles ve Holzapfel 1997). Glikoliz (FBP yolu) enzimlerini kullananlar zorunlu homofermantatif, Hekzos monofosfat yolu enzimlerini kullananlar zorunlu heterofermantatif, her iki yolun enzimlerine sahip olup öncelikle FBP yolunu tercih edenler fakültatif heterofermantatiftir (Tunail 2009). Gelişme sıcaklıkları 2-53 ºC, optimum gelişme sıcaklıkları ise ºC arasındadır. Optimum ph istekleri 'dir. Bununla birlikte gelişmenin 5.0 veya altındaki ph'larda gerçekleştiği görülür. Alkali ph'larda gelişme yetenekleri düşüktür (Şen vd. 2004). Lactobacillus plantarum: Lactobacillus plantarum diğer laktik asit bakterilerine göre daha yüksek asit toleransına sahip olduğu için meyve ve sebze fermantasyonunu 7

17 tamamlayan bakteridir. Salatalık ve lahana fermantasyonunda son ürünün kalitesinde ve mikrobiyel dengenin sağlanmasında önemli bir etkiye sahiptir (Lu vd. 2003). Büyük çoğunluğu glikoz, mannoz, galaktoz, arabinoz, sakkaroz, maltoz, laktoz, salisin ve rafinozu kullanarak; bazıları ise sorbitol, mannitol, dekstrin, gliserol ve ksilozu kullanarak asit meydana getirmektedir. Ramnoz, nişasta ve inülini, genellikle, fermente edememektedirler. % 5.5 tuz yoğunluğunda gelişebilmektedirler. En iyi gelişme sıcaklığı ºC arasında olmakla birlikte ºC arasında gelişebilmektedir. Termal ölüm sıcaklığı ºC'de 15 dakikadır. Süt, peynir, tereyağı, kefir, fermente patates, mısır, hıyar turşusu, domates turşusu gibi gıdalardan izole edilebilmektedir (Pederson 1938). Lactobacıllus brevis: Genel olarak fermente bitkilerde ve hayvansal ürünlerde bulunmaktadır. Peynir, süt, fermente patates, toprak, sauerkraut ve gübreden izole edilebilmektedir. Gram pozitif ve mikroaerofiliktir. Optimum gelişme sıcaklığı ºC arasıdır, en fazla ºC, en az ºC aralığında gelişebilmektedir. Pentozlardan laktik asit ve asetik asit üretebilmektedir. Ksiloz, arabinoz, glikoz, galaktoz ve maltozu kullanarak laktik asit üretebilmektedir (Pederson 1938). Türe bağlı olarak laktoz, sakkaroz, mannoz, rafinoz ve mannitolu fermente edebilmektedir. Sorbitol, gliserol, ramnoz, dekstrin, inülin ve nişastayı nadiren fermente etmektedir. Aldoheksozlardan laktik asit, asetik asit, etil alkol ve Karbondioksit (CO 2 ) üretebilmektedir (Pederson 1938) Pediococcus Pediokoklar Gram pozitif, hareketsiz ve kok şeklinde hücrelere sahiptir. Bu hücreler monokok, diplokok, ve tetrakok şeklinde bulunmaktadır. Hücre boyutları μm'dir (Şahin 2003). Bu bakterilerin sitokromları yoktur, bu yüzden katalaz negatiftir. Pediokoklar amonyum tuzlarını nitrojen kaynağı olarak kullanmazlar ya da nitratları nitrite indirgeyemezler. Empden Meyerhof yolunu kullanarak glikozu fermente ederler ve DL- ya da L- formunda laktat oluşturlar, bu sırada karbondioksit üretmezler (Mavhungu 2006). Pediokoklar bitkilerin üzerinde, çeşitli gıdalarda laktobasillerle ve 8

18 leukonostoklarla beraber bulunurlar. Ayrıca alkollü içkilerde, örneğin birada bozulmalara sebep olmaktadırlar (Stiles ve Holzapfel 1997). Pedioccocus pentocaceus : Hücreleri μm çapındadır. En iyi gelişme sıcaklığı 35 ºC'dir. En yüksek gelişme sıcaklığı ºC aralığındadır (Şahin 2003). Pedioccocus pentocaceus bitkisel materyallerin üzerinde P. acidilactici ile birlikte bulunmaktadır. Her iki türde süt ve süt ürünlerinde bulunmaktadır. Pedioccocus pentocaceus fermente sosislerde starter kültür olarak kullanılmaktadır (Mavhungu 2006). Bu bakteri, bakteriyosin üretmektedir. Ayrıca, pentozlardan eşit miktarda laktat ve asetat üretmektedir (Stiles ve Holzapfel 1997) Leuconostoc Leukonostoklar oval ya da kok şeklinde hücrelere sahiptirler. Hücreler tek, çift, kısa veya uzun zincirler şeklinde bulunmaktadır (Mavhungu 2006). Kolonileri 1mm'den daha küçük, düzgün yüzeyli, yuvarlak ve gri-beyaz renktedir (Şahin 2003). Süt ürünlerinin, turşunun, sauerkrautun ve çeşitli et ürünlerinin fermantasyonunda yer almaktadır. Katalaz negatif olup, sitokromları yoktur. Arjinini hidrolize edemezler ve proteolitik değildirler. Gelişimleri fermente edilebilir karbohidratların varlığına bağlıdır ve glikozun fermantasyonu sırasında heksoz-monofosfat ve fosfoketolaz yollarını birlikte kullanmaktadır. Diasetil ve çeşitli aroma maddeleri üretme kabiliyetine sahiptirler. Sebze ürünleri fermantasyonunun başlatılmasında diğer laktik asit bakterilerden daha hızlıdırlar (Mavhungu 2006). Leuconostoc mesenteroides: Fermente bitki ürünlerinde Leuconostoc mesenteroides ilk gelişen bakteridir ve yaklaşık Laktobasillere benzer asit toleransına sahiptir (Stiles ve Holzapfel 1997). Leuconostoc mesenteroides üç alt türe sahiptir, bunlar; Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris, Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides, Leuconostoc mesenteroides subsp. dextarnicum'dur. Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris tereyağı ve krema üretiminde kullanılmaktadır. Leuconostoc mesenteroides ekzopalisakkarit üretmektedir (Hemme ve Foucaud-Scheunemann 2004). Bu bakteri, mannitol dehidrogenaza sahip olup fruktozdan mannitol üretmekte yeteneğindedir. 9

19 Ayrıca fruktozdan laktat, asetat, mannitol, ethanol ve CO 2 üretmektedir (Erten 1998). Yüksek oranlarda, (%50-60) şekeri tolere edebilmektedir (Mavhungu 2006) Enterecoccus Enterokoklar Gram pozitif, katalaz-negatif, oksidaz-negatif, fakültatif anaerobik ve kok şeklinde hücrelere sahiptir. Optimum gelişme sıcaklıkları 35ºC'dir. Türlere bağlı olarak ºC, %6.5 tuz konsantrasyonu ve ph 9.6'da gelişebilmektedir (Moreno vd. 2006). Glikozdan homofermantatif olarak L(+)- laktik asit üretebilmekte ve aminoasitleri indirgeyerek enerji üretmektedir (Stiles ve Holzapfel 1997). Enterekoklar, enterocin adı verilen bakteriyosin üretme yeteneğine sahiptir, bozulmaya sebep olan ya da patojen Gram pozitif bakterilere karşı antimikrobiyel aktivite göstermektedir. Enterekoklar genellikle insanların ve hayvanların mide-barsak sistemlerinde bulunmaktadır. Ayrıca toprak ve su yüzeyleri ile sebzelerde de bulunabilmektedir. Enterekoklar starter kültür olarak da kullanılmaktadır (Moreno vd. 2006). Enterococcus faecelis : Enterococcus faecelis insan ve hayvanların gastorintestinal florasında bulunmaktadır. Genellikle fekal kontaminasyonda indikatör mikroorganizma olarak kullanılmaktadır. Gıdalarda ve özellikle sularda varlığı patojen bakteri varlığına gösterge olarak kabul edilmektedir (Rince vd. 2003). Fakat, bu bakterinin gıda endüstrisi açısından özellikle süt endüstrisinde önemli yeri vardır. Enteroccocus faecalis probiyotik özellik göstermektedir. Enteroccocus cinslerinin fermente ürünlerin olgunlaştırılması sırasında istenen teknolojik ve metabolik özelliklere sahip olmaları nedeniyle, E. feacium ve E. faecelis peynir ve fermente sucukların üretiminde bazı laktik asit bakterileri ile birlikte kullanılan yaygın starter kültürler arasında bulunmaktadır. E. faecelis asetaldehit, etanol, diasetil ve aseton gibi uçucu bileşikler üreterek peynirlerde aromanın gelişmesine katkıda bulunmaktadır (Erginkaya vd. 2007). 2.2 Laktik Asit Bakterilerinin Asit Üretim Yetenekleri Laktik asit bakterileri tarafından karbohidratlar fermente edilerek laktik asit oluşturulmakta ve laktik asit fermantasyonu gerçekleşmektedir. Laktik asit 10

20 fermantasyonun gıda, eczacılık, deri ve tekstil endüstrisi gibi birçok alanda uygulaması bulunmaktadır (Rodríguez-Couto ve Sanromán 2006). Fermantasyon sonucu laktik asit oluşumu şekil 2.3 de gösterilmektedir (Kıran 2006). Şekil 2.3 Fermantasyon sonucu laktik asit oluşumu (Kıran 2006). Bulut (2003) tarafından peynirden izole edilen Lactococcus ve Enterecocous cinslerinin 24 saat sonunda mg/ml, Lactobacillus suşlarının mg/ml laktik asit ürettiği belirtilmiştir. Cheriguene vd. (2006) keçi sütünden izole ettikleri L. paracasei türleri tarafından g/100 ml, L. rhamnosus türleri tarafından g/100ml, L. plantarum türleri tarafından g/100 ml, E. feacium türleri tarafından g/100 ml laktik asit üretildiğini bildirmişlerdir. Çon ve Karasu (2009) tarafından turşudan ve fermente yeşil zeytinden izole edilen L. plantarum ve L. pentosus suşlarının g/100 ml laktik asit ürettikleri belirlenmiştir. 11

21 Herreros vd. (2003), İspanyol keçi peynirinden izole ettikleri Leuconostoc mesenteroides türleri tarafından g/100 ml, L. plantarum türleri tarafından g/100 ml, L. brevis türleri tarfından g/100 ml, L. casei suşları tarafından g/100 ml laktik asit üretildiğini belirtmişlerdir. Erdoğrul vd. (2002) tarafından fermente sucuklardan izole edilen Pediococcus pentosaceus türlerinin % laktik asit ürettiği bildirilmiştir. 2.3 Laktik Asit Bakterilerinin Farklı ph Değerlerinde GeliĢme Yetenekleri Her mikroorganizmanın gelişebildiği bir minimum, maksimum ve optimum ph değeri vardır. Bakteriler gelişecekleri ortamın ph'sı açısından daha seçicidirler. Mikroorganizmaların gelişebildiği ph aralığı aynı cinsin türlerine, hatta aynı türün farklı suşlarına, üreme ortamına, ortamın bileşimine ve diğer çevre faktörlerine bağlı olarak değişmektedir. Lactobacillus türleri gelişme ortamındaki sitrik, hidroklorik, fosforik ve tartarik asitlerin varlığında, asetik asit ve laktik asit varlığına kıyasla daha düşük ph değerlerinde gelişebilmektedir. Uygun olmayan ph değerlerinde mikroorganizmaların hücre geçirgenliği ve enzim aktiviteleri olumsuz yönde etkilenmektedir. Bakteri hücreleri normalde negatif yük fazlalığına sahip olma eğilimindedirler (Temiz 1999). Organik asitler düşük ph değerlerinde iyonize değildirler ve bu şekilde negatif yüklü hücrelerin içine girebilmekte ve daha sonra burada iyonize olarak hücre içi ph'yı değiştirebilmektedir. Yüksek ph değerlerinde ise aynı durum iyonize olmamış zayıf bazlar için geçerlidir. Hücre içi ph'sının değişmesi ise özellikle Deoksiribonükleik asit (DNA), Ribonükleik asit (RNA) ve bazı enzimlerin fonksiyonlarını olumsuz yönde etkilemektedir. Örneğin; hücre içi ph'sının bazik yöne kayması RNA aminoasit transferaz enzimini inhibe etmekte ve protein sentezi durmaktadır (Temiz 1999). Ortam ph'sı yalnızca gelişmeyi değil, aynı zamanda mikroorganizmaların canlılıklarını sürdürme özelliğini de etkilemektedir (Temiz 1999). 12

22 Adnan ve Tan (2007), iki geleneksel Malezya ürününden ve kırmızı biber püresinden izole edilen laktik asit bakterileri arasında, ph 4.5, ph 7.0 ve ph 9.0'da L. brevis ve L. plantarum türlerinin geliştiğini belirtmişlerdir. Kıran (2006) tarafından yapılan bir çalışmada, hazır gıdalardan izole edilen ve çeşitli kültür koleksiyonlarından temin edilen laktik asit bakterilerinden hiçbirinin ph 2.0 ve ph 3.0'da gelişemediği; ph 4.0, ph 5.0 ve ph 6.0'da hepsinin geliştiği belirtilmiştir. ph 9.6'da P. pentocaceus türlerinin bir kısmının geliştiği bazılarının zayıf gelişme gösterdiği, L. plantarum, L. brevis ve L. fermentum türlerinin geliştiği; Leuconostoc suşlarının ise zayıf gelişme gösterdiği belirtilmiştir. Tangüler (2010) tarafından şalgam suyundan izole edilen Lactobacillus, Pediococus, Leuconostoc cinslerinin ph 4.0'da gelişme gösterdiği fakat ph 9.6'da hiçbir bakterinin gelişme gösteremediği belirtilmiştir. Yine aynı çalışmada kontrol olarak kullanılan L. buchneri, L. brevis, L. plantarum, L. fermentum, L. delbrueckii türlerinden L. buchneri hariç diğer 4 bakterinin ph 4.4'de gelişebildiği fakat 5 bakteriden hiçbirinin ph 9.6'da gelişemediği belirtilmiştir. 2.4 Laktik Asit Bakterilerinin Farklı Tuz Konsantrasyonlarında GeliĢme Yetenekleri Tuzun koruyucu özelliğinden dolayı gıda işlemesinde kullanımı Mısır'da, Roma'da ve Anadolu'da yıllar öncesinde bilinmektedir. Tuzun gıdalar üzerindeki etkisini birçok değişik faktör belirlemektedir (Aktan 1998). Bakteriler gıdanın içerisinde yüksek tuz gibi çeşitli ozmotik streslere maruz kalmaktadır. Bu durumlarda, özellikle turgor basıncı (şişme) ve hidrasyon (su kaybetme) bakteriler için çok önemlidir (Dikici 2009). Tuzun mikroorganizmalar üzerindeki en önemli etkisi osmotik basıncı artırması ve böylece hücre geçigenliğini artırarak mikroorganizma etkinliğini azaltması veya önlemesidir. Ancak; bunun için gerekli olan tuz konsantrasyonunu ph, sıcaklık, protein oranı ve protein niteliği, karbohidrat miktarı, metal iyonları varlığı gibi çeşitli faktörlerden etkilenmektedir. 13

23 Tuz konsantrasyonu, fermantasyonun gidişini yönlendiren ve son ürün kalitesini etkileyen en önemli faktörlerden birisidir. Düşük tuz konsantrasyonlarında (% 5-8) fermantasyon hızlı, yüksek tuz konsantrasyonlarında (% 10 ve üzeri) yavaş olarak gerçekleşir veya hiç gerçekleşmez (Aktan 1998). Tuz konsantrasyonun fermantasyonda rol alan mikroorganizmaların faaliyetleri üzerine etkisi seçici özellik göstermektedir. Bu bakımdan ürüne ve proses göre ayarlanması önem taşır. Tuzlama işlemi doğrudan ya da salamura şeklinde uygulanmaktadır (Aktan 1998). Kıran (2006) tarafından yapılan bir çalışmada, hazır gıdalardan izole edilen ve çeşitli kültür koleksiyonlarından temin edilen laktik asit bakterilerinin, % 4 tuzda hepsinin geliştiği, % 6.5 tuzda 5 tanesi hariç diğerlerinin geliştiği, % 12 tuzda 4 tanesinin zayıf gelişme gösterdiği diğerlerinin gelişemediği, % 18 tuz konsantarasyonunda ise hiçbirinin gelişemediği belirtilmiştir. Bulut (2003) tarafından yapılan çalışmada, 9 adet Lactobacillus cinsinin % 6.5 tuz konsantrasyonunda gelişebildiği belirtilmiştir. İşleroğlu vd. (2008), yöresel bir peynirden izole ettikleri E. faecalis'in % 3, % 4 ve % 6.5 tuz konsantrasyonlarında gelişebildiğini fakat % 10 tuz konsantrasyonunda gelişemediği belirtmişlerdir. Sánchez ve Palop (2000) bir çeşit patlıcan turşusu olan Almagro'dan izole ettikleri L. plantarum, L. pentosus, L. brevis, ve L. fermentum türlerinin % 4 tuz konsantrasyonunda geliştiğini, % 6.5 tuz konsantrasyonunda belirli oranlarda bütün türlerde gelişme görülebildiğini, % 8 tuz oranında ise L. fermentum haricinde diğer türlerde gelişme olduğunu belirtmişlerdir. Adnan ve Tan (2007), iki geleneksel Malezya ürününden ve kırmızı biber püresinden izole ettikleri laktik asit bakterileri arasında, % 1.5, % 2.5 ve % 5 tuz 14

24 konsantrasyonlarında tüm L. brevis ve L. plantarum türlerinin geliştiğini, % 7.5 ve % 10 tuzda L. brevis ve L. plantarum türlerinin gelişemediğini belirtmişlerdir. 2.5 Laktik Asit Bakterilerinin Antimikrobiyel Aktivitesi Laktik asit bakterileri "güvenli bakteriler" olarak kabul edilmektedir ve koruyucu kültürlerin özelliklerini taşımaktadır. Gıdalarda, sadece gıda kaynaklı patojen ve bozulma etmeni mikroorganizmaları inhibe etmek veya raf ömrünü uzatmak için kullanılan ve gıdanın duyusal özelliklerinde değişime sebep olmayan antogonistik kültürlere koruyucu kültürler denilmektedir (İşleroğlu vd. 2008). Laktik asit bakterilerinin diğer mikroorganizmalara karşı gösterdikleri antagonistik aktivite, ürettikleri laktik asit, asetik asit, hidrojen peroksit, bakteriyosin, diasetil, alkol ve karbondioksit gibi metabolitlerden kaynaklanmaktadır. LAB'ın temel antimikrobiyel etkisi laktik asit üretimi ile ph'daki düşüş olarak belirtilmektedir (Çon ve Gökalp 2000). Erdoğrul vd. (2002) tarafından fermente sucuklardan izole edilen 4 adet L. pentocaceus türünün genel inhibisyon etkileri incelenmiş; yalnızca bir türün Bacillus subtilis üzerinde etkili olduğu gözlenmiş, dört suşun da Micrococcus luteus, Mycobacterium smegmatus, Staphylococcus aureus, Yersinia enterecolitica üzerinde herhangi bir etkisinin olmadığı bildirilmiştir. Çon ve Karasu (2009) tarafından, turşudan ve fermente yeşil zeytinden izole edilen L. plantarum suşlarının Yersinia lipolitica haricinde Lactobacillus sake, Listeria monocytogenes, E. feacium, E. coli, P. vulgaris, A. hydrophila üzerinde farklı derecelerde antimikrobiyel etki gösterdiği; Lactobacillus brevis suşlarının ise A. hydrophila, Yersinia lipolytica haricinde Lactobacillus sake, Listeria monucytogenes, E. feacium, E. coli, P. vulgaris üzerinde farklı antimikrobiyel etkilerinin olduğu belirtilmiştir. Tamang vd. (2009) tarafından fermente sebzelerden izole edilen L. plantarum, L. brevis, L. curvatus, P. pentosaceus, P. acidilactici, Leuconostoc spp., Enterecoccus durans suşlarının Listeria innocua, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Streptococcus mutans, Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae, Enterobacter agglomerans, 15

25 Pseudomonas eruginosa üzerinde farklı antimikrobiyel etkilerinin olduğu, Listeria monocytogenes ve E. faecium üzerinde herhangi bir etkisinin olmadığı belirlenmiştir. 2.6 Laktik Asit Bakterileri Tarafından Üretilen Antimikrobiyel BileĢikler Organik asitler Organik asitlerin mikroorganizmalar üzerine inhibitör olarak tesir etmesi, asitin sahip olduğu farklı üç potansiyel etkiye bağlanmaktadır: 1. Güçlü asitler, düşük eksternal ph'ya sahip, fakat hücre membranından geçememektedir. Bu asitler hücre yüzeyinde var olan enzimler üzerinde de düşük ph nedeniyle, enzimleri denatüre ederek inhibitör etkide bulunabilmektedir. Ayrıca, hücre içi ve dışı ph farkı çok büyük olduğu zaman hücre zarının proton geçirgenliği sonucu sitoplazmik ph'nın düşüşüne de neden olabilmektedir (Çon ve Gökalp 2000). 2. Zayıf asitler; hücre membranından geçebilmektedir. Bu asitlerin birinci etkisi sitoplazmik ph'yı düşürmeleri nedeniyle olmaktadır. Fakat, doğrudan disosiye olmamış yapılar da metobolizma üzerine özel inhibitör etkiye sahiptir. 3. Süfit, nitrat, karbonat gibi asit potansiyelli iyonlar düşük ph'da potansiyel inhibitördür (Çon ve Gökalp 2000). Fermantasyon sırasında üretilen organik asitlerin çeşitleri ve miktarları bakteri türlerine, kültür bileşimine ve gelişme koşullarına bağlı olmaktadır. Organik asitlerin antimikrobiyel etkileri ph'daki düşüş ve moleküllerin dissosiye olmayan yapılarından kaynaklanmaktadır ve ph'daki düşme ile hücre sitoplazmasında asidifikasyona neden olmaktadır. Dissosiye olmamış asit hücre membranına doğrudan dağılmakta ve hücre membran geçirgenliğini etkileyerek substrat transport sisteminin geçirgenliğini bozmaktadır (Yang 2000). Laktik asit; laktik asit fermantasyonu sırasında oluşan temel bir metabolittir. Düşük ph değerlerinde, fazla miktarda laktik asit dissosiye olmamış yapıda bulunmaktadır ve bu nedenle birçok bakteri, küf ve maya için toksik etki göstermektedir. Farklı 16

26 mikroorganizmalar laktik aside karşı değişik duyarlılık gösterebilmektedir. Örneğin, ph 5.0 değerinde laktik asit spor formunda bakterilere inhibitör etki gösterirken, maya ve küflere karşı etkisiz olabilmektedir. Lindgren ve Dobrogosz (1990) tarafından yapılan bir çalışmada, farklı ph aralıklarında dissosiye olmamış yapıda olan laktik asidin Clostridium tyrobutyricum, Enterobacter sp. ve Propionibacterium freudenreichii ssp. shermanii'ye karşı minimum inhibitör konsantrasyon değerlerinin farklı olduğu belirtilmiştir. Gill ve Newton tarafından yapılan bir çalışmada, ette bulunan Gram negatif psikrotroflar üzerine laktik asidin inhibitör etkisinin ph düşüşüne bağlı olduğu, dissosiye olmamış formundan etkilenmediği bildirilmiştir (Çon ve Gökalp 2000). Asetik asit ve propiyonik asit, laktik asit bakterileri tarafından heterofermantatif yolla üretilmekte, hücre içinin asidik bir yapı kazanmasına ve protein denatürasyonuna neden olmaktadır. Yüksek pka değerleri yüzünden (laktik asit 3.08, asetik asit 4.75, propiyonik asit 4.87) antimikrobiyel etkileri laktik asitten daha fazladır. Ayrıca; asetik asit, laktik asit ile sinerjistik etkiye sahiptir. Laktik asit ortam ph'sını azaltırken, asetik asidin toksik etkisini artırmaktadır (Yang 2000). Laktik asit, asetik asit ve p-amino benzoat ile 3.5 ph'ya getirilmiş ortamda Escherichia coli'nin 4 suşu geliştirilmiş ve DNA'nın tek iplikçiğinde kırılmayı onaramayan (DNA polimeraz I enzimi içermeyen) pol A1 suşunda her üç asitin de yüksek toksik etkide bulunduğu görülmüştür (Çon ve Gökalp 2000) Karbondioksit Karbondioksit, genel olarak heterofermantatif LAB tarafından üretilir. Karbondioksit anaerobik bir ortam oluşturarak, enzimatik dekarboksilasyonu inhibe etmekte, lipit membran yapısında birikerek, bu yapının geçirgenlik fonksiyonunu kaybetmesine neden olmaktadır. Karbondioksit etkili bir şekilde gıdalarda bozulma yapan mikroorganizmaların gelişimini engellemektedir. Özellikle Gram negatif psitrotrofik 17

27 bakterilerde % 10 civarında toplam bakteri miktarını % 50 azaltmaktadır ve % civarında CO 2 güçlü bir antifungal etkiye sahiptir (Yang 2000). Tan ve Gill, Pseudomonas fluorescens ile yapılan araştırma sonucunda, ekstrasellülar CO 2 konsantrasyonundaki her 1mM artışın, hücre içi ph'da 0.03 birimlik düşüşe neden oluduğunu; ancak CO 2 varlığında elde edilen gelişme inhibisyonunun temel nedeninin hücre içi ph düşüşü olmadığını belirtmişlerdir (Çon ve Gökalp 2000) Diasetil Süt ürünlerinin (peynir, yoğurt, tereyağı, kefir, kımız) kendine özgü lezzet ve aroması bulunmaktadır. Starter kültürlerinin önemli işlevlerinden birisi de kullanıldıkları süt ürünlerinde lezzet ve aromayı oluşturmalarıdır. Lezzet ve aromayı oluşturan bileşikler, genellikle ürünün yapımında kullanılan starter kültürlerinin faaliyetleri sonucu meydana gelmektedir. Süt ürünlerinde tat ve kokuyu oluşturan diasetil ve asetaldehit, karakteristik aroma bileşikleridir ( Diasetil, tereyağının karakteristik aroma ve kokusunu oluşturmasıyla bilinen bir bileşiktir. Bazı Streptococcus, Leuconostoc, Lactobacillus ve Pediococcus tarafından oluşturulmaktadır. Tereyağının yanısıra, bazı süt ürünlerinde, kırmızı ve beyaz şarap, brandy, silaj ve çeşitli fermente gıdalarda bulunmaktadır. Gram negatif bakteriler diasetile karşı Gram pozitif bakterilerden daha duyarlıdır. 344 µg/ml diasetil Listeria, Salmonella, Yersinia, Escerichia coli ve Aeromonas'ı inhibe etmektedir (Jay 1982) Reuterin Reuterin; 3-hydroxypropanol (ß-hydroxypropionaldehyde) olarak tanımlanan ve yüksek çözünürlükte, nötr ph, küçük boyutlu, antimikrobiyel özellikte, gliserolün fermantasyonu sırasında oluşan ara bir bileşiktir (Yang 2000, Cleusix vd. 2007). 18

28 Lactobacillus reuteri insan ve hayvan kaynaklı bir heterofermantatif laktik asit bakterisidir (Cleusix vd. 2007). Reuterin, bazı Lactobacillus reuteri suşları tarafından üretilmektedir. Gıda kaynaklı patojenler, Gram pozitif ve Gram negatif bakteriler, küfler ve mayalar üzerinde antimikrobiyel aktivite göstermektedir. İnhibitör etkisinin DNA sentezine olan etkisi ile ilişkili olduğu tahmin edilmektedir (Yang 2000). Lactobacillus reuteri suşları probiyotik olarak kullanıldıklarında da mikrobiyolojik, kimyasal ve fiziksel streslerin zararlarına karşı koruyucu etki göstermektedir. Kolesterolün düşürülmesi, immün sistemin düzenlenmesi gibi olumlu etkileri bulunmaktadır (Cleusix vd. 2007). Gliserolden reuterin biyosentezi şekil 2.4 de gösterilmektedir. (Yang 2000) Şekil 2.4 Gliserolden reuterin biyosentezi (Yang 2000) Etil alkol Heterofermentatif laktik asit bakterileri tarafından şekerlerin fermantasyonu sonucu diğer metabolitler ile birlikte alkol de üretilebilmektedir (Çon ve Gökalp 2000). Etil alkol yaygın olarak kullanılan ve uygun yoğunlukta olduğunda orta etkinlikte bir antimikrobiyel bileşiktir. Çeşitli vejetatif hücrelere karşı alkolün inhibisyon etkisi, halen tartışmalı olmakla birlikte, genellikle patojen bakterilerin büyük çoğunluğuna karşı 19

29 bakterisit etki göstermektedir. Bakteri sporlarına karşı ise etkisizdir. Alkolün mikroorganizmalar üzerine bahsedilen bakterisit etkisi; konsantrasyonu, muamele süresi ve molekül ağırlığı ile ilişkilidir (Çon ve Gökalp 2000). Alkolün birçok gaye için en etkili olduğu konsantrasyonu % 70 olarak belirtilmektedir. % 75'den yukarı konsantrasyonlarda ise germisit etki önemli derecede azalmaktadır. Alkollerin bakteriosidal etkisinin mekanizması proteinleri denatüre etmek özelliklerine dayandırılmaktadır. Ayrıca, sitoplazma zarındaki lipit yapıyı bozup zarın işlevine etki ettiği de belirtilmektedir (Çon ve Gökalp 2000). 2.7 Hidrojen peroksit Hidrojen peroksit, oksijen varlığında flavoprotein oksidazlar ve nikotinamid adenin hidroksi dinükleotid peroksidazların etkisiyle, laktik asit bakterileri tarafından üretilmektedir. Oksitleyici bir bileşik olan H 2 O 2 'nin mikroorganizmalar üzerine inhibisyon etkisi, metabolik işlemlerde esansiyel olan enzimlerin sülfidril gruplarını etkileyerek, disülfit köprüleri oluşturmasına bağlanmaktadır. DNA'da hasara neden olan süperoksit ve hidroksil gibi bakterisidal serbest radikallerin üretilmesine de öncülük etmektedir (Yang 2000). Normal koşullarda hidrojen peroksitin antimikrobiyel etkisi laktoperoksidazların ve Thiocynate (SCN) varlığından kaynaklanmaktadır. Laktoperoksidaz, SCN'nin hidrojen peroksit tarafından oksidasyonunu katalizlemektedir. OSCNˉ'nin açığa çıkması sonucunda bakteri membranında yapısal bir değişiklik ve hasar meydana gelmektedir. Bunun yanında temel antimikrobiyel etkisinin glikolizis sonucunda da olduğu belirtilmektedir. Glikoz transport sistemini, heksokinaz aktivitesini, Gliseraldehit 3- fosfatdehidrogenaz aktivitesini sülfidril grupları oksidasyonu nedeniyle inhibe etmektedir. 20

30 H 2 O 2 'nin hücreler üzerine inhibitör etkisi onun konsantrasyonu ve muamele süresi ile mikrobiyel yük, sıcaklık, ph, inorganik iyonlar, UV veya diğer koruyucularla muamele edilmiş olması gibi faktörlerden etkilenmektedir (Çon ve Gökalp 2000). Değişik Lactobacillus türlerinin H 2 O 2 üretimi ile ilgili, literatürde bazı araştırmalara rastlanmaktadır. Bu çalışmalarda 5 C'de Lactobacillus bulgaricus ve Lactobacillus lactis türlerinin, Staphylococcus aureus'u inhibe edebilecek düzeyde (6-12 g/ml), yine Lactobacillus plantarum'un ise Pseudomonas cinslerinin adaptasyon periyodunu (lag faz) uzatacak düzeyde (3-13 g/ml) H 2 O 2 ürettiği, ayrıca laktik Streptococcus cinslerinin de buzdolabında depolanan sütlerde, psikrotrofik bakterilerin gelişmesini önleyecek düzeyde H 2 O 2 ürettiği saptanmıştır yılında yapılan bir çalışmada, kıyılmış sığır etine Streptococcus lactis ve Leuconostoc citrovorum inoküle edilmiş ve bu bakterilerin 7 C'de depolamada gram negatif bakterilerin gelişmesini önlediği saptanmıştır ( 2011) yılında başka bir araştırıcı tarafından, Strepcococcus diacetilactis'in kıyılmış sığır eti, süt ve peynirde Gram negatif bakterilerin gelişmesini önlediği saptanmıştır. ( 2011) yılında yayınlanan bir araştırmada Lactobacillus acidophilus'un az yağlı ve yağsız sütte 37 C ve 4 C'de H 2 O 2 üretimini etkileyen faktörlerle ilgili olarak, bu bakterinin iki suşunun (A ve B) düşük düzeyde, diğer iki suşunun ise (C ve D) yüksek düzeyde H 2 O 2 ürettiği bildirilmiştir. 4 C'de çalkalamalı kültürde, Lactobacillus acidophilus C ve D suşlarının özellikle buzdolabı koşullarında bozulmaya neden olan Pseudomonas fragi türünün gelişmesini önleyecek düzeyde H 2 O 2 ürettiği saptanmıştır ( 2011). Toksoy vd. (1999) tarafından yapılan bir araştırmada, sucuk ve sosislerden izole edilen 39 adet Lactobacillus plantarum suşunun ürettiği H 2 O 2 miktarının, g/ml arasında olduğu belirtilmiştir. 21

31 Zalán vd. (2005) tarafından yapılan bir çalışmada, kullanılan 4 adet Lactobacillus suşunun MRS Broth besiyerinde, 72 saat sonunda, 2-6 g/ml hidrojen peroksit ürettiği belirtilmiştir. L. plantarum 2142 suşunun 24 saat sonunda (2.45 g/ml) H 2 O 2 ürettiği; böylece, L. monocytogenes ve B. cereus gelişimini inhibe ettiği belirtilmiştir. Adeniyi vd. (2006), Nijerya fermente süt ürünlerinden izole edilen Lactobacillus plantarum N 2 suşunun 5.44 g/ml hidrojen peroksit ürettiğini bildirmişlerdir. Erdoğrul vd. (2002) tarafından fermente sucuklardan izole edilen Lactobacillus pentocaceus suşlarının % g/ml hidrojen peroksit ürettiği bildirilmiştir. 2.8 Bakteriyosinler Bakteriyosinler bakteriler tarafından sentezlenen protein yapısındaki bileşiklerdir. Bakteriyosinler genellikle üretici türe yakın akraba olan Gram pozitif türler üzerinde etki göstermektedir, üretici türlere karşı ise herhangi bir etkisi yoktur (Montville vd. 2001). Birçok LAB, çeşitli bakteriyosin üretebilme yeteneğine sahiptir. LAB tarafından üretilen bakteriyosinler çeşitli fermente olan ve olmayan gıdalarda bulunmaktadır. Birçok bakteriyosin, genetik ve biyokimyasal olarak tanımlanmıştır. Bakteriyosinlerin yapıları, fonksiyonları, biyosentezleri ve etki mekanizmaları belirlenmiştir (Clevaland vd. 2001). Bakteriyosinler, duyarlı mikroorganizmalar üzerinde farklı etki mekanizmalarına sahiptirler. Hücrenin sitoplazmik zarına bağlanarak, hücre içerisine girip, zarda gözenekler oluşturmaktadır. Böylece düşük molekül ağırlığına sahip hücre bileşenlerinin hücre dışına sızmasına yol açmaktadır. Bununla birlikte, iyonların, özellikle de ATP kaybı ve hücre içi ph dengesinin korunmasında etkili olan K + iyonunun hücre dışına sızması, hücrede enerji tüketimine neden olmaktadır. Hücrede meydana gelen bu değişimler, DNA ve RNA gibi hücre için hayati önemi olan makro 22

32 moleküllerin degredasyonuna, bu moleküllerle birlikte protein ve peptidoglikan gibi biyolojik yapıların bozulmasına yol açmaktadır. Bakteriyosinler, pozitif yüklü moleküller olup, stoplazmik zar üzerinde etkili olmalarında sahip oldukları hidrofobik kısımlar önemli rol oynamaktadır. Hücre zarında bulunan negatif yüklü fosfat gruplarının etkisiyle ortaya çıkan elektrostatik etkileşim sonucu bakteriyosin hücre zarına tutunmaktadır (Kurt ve Zorba 2005). Bakteriyosinler tarafından oluşturulan por modelleri şekil 2.5 de gösterilmekedir(de Martinis vd. 2002). Şekil 2.5 Por oluşum modelleri (De Martinis vd. 2002) a)wedge b)barrel-stave Hidrofobik kısım zar yapısının içine girerek gözenek oluşumuna yol açmaktadır. Ancak oluşan gözenekler farklılık göstermektedir. Örneğin; nisin daha çok "barrel-stave" ve "wedge" olarak isimlendirilen modellerde gözenek oluşumunu sağlamaktadır. "Barrelstave" modelde, herbir nisin molekülü dikey bir şekilde zara bağlanarak, zarda bir iyon kanalı oluşturmaktadır. "Wedge" modelde ise, belirli sayıda nisin molekülü fosfolipidlerin baş gruplarıyla interaksiyona girdikten sonra, lipit-protein gözeneği oluşmaktadır. Bakteriyosinler bütün duyarlı türler üzerinde aynı etkiye sahip olmayıp, ortam ph'sı ve kritik inhibisyon konsantrasyonu gibi faktörlerden etkilenmektedir (Clevaland vd. 2001). 23

33 Nisin, bakterisidal etkisini, duyarlı hücrelerin membranlarını etkileyerek gösterir. Şekil 2.6'da görüldüğü gibi, nisin molekülünün pozitif yüklü N - ve C - terminal uçları ile hücre membranında bulunan negatif yüklü fosfolipitler reaksiyona girerek, membranı porlar oluşturmak suretiyle bozar (Hampikyan ve Çolak 2007). Nisinin por oluşturma mekanizması şekil 2.6 da gösterilmektedir (Hampikyan ve Çolak 2007). Şekil 2.6 Nisinin Por Oluşum Mekanizması (Hampikyan ve Çolak 2007) Bakteriyosinlerin gıdalarda koruyucu olarak ilk kullanımları, resmî olarak 1951 yılı olmasına rağmen, insanoğlu 8000 yıldır (peynir ve diğer fermente gıdaları üretmeye başladığından beri) farkında olmadan bakteriyosinlerden faydalanılmaktadır yılında çeşitli laktokok türlerinin diğer laktik asit bakterileri üzerinde inhibitör etki gösterdikleri belirlenmiştir. Nisin ilk olarak 1953 yılında ticari şekilde İngiltere'de satışa sunulmuştur ve günümüzde yaklaşık 50 ülkede kullanılmaktadır yılında Gıda ve Tarım Organizasyonu/Dünya Sağlık Organizasyonu gıda katkıları uzman kurulu tarafından gıdalarda kullanımının güvenli olduğu onaylanmıştır. Nisin, 1983 yılında Avrupa gıda katkı maddeleri listesinde E234 olarak numaralandırılmış, 1988'de FDA tarafından peynir üretiminde kullanımına izin verilmiştir (Akkoç vd. 2009). Bakteriyosinler inhibisyon aktivitelerine, biyokimyasal ve genetik özelliklerine göre sınıflandırılmaktadır. Klaenhammer'a göre bakteriyosinler dört gruba ayrılmaktadır; Grup I bu bakteriyosinler küçük peptit yapısındadır ve lantibiyotikler olarak adlandırılmaktadır. Grup I bakteriyosinleri Grup Ia ve Grup Ib olmak üzere iki gruba ayrılmaktadır. Grup I peptitleri genellikle aminoasitten oluşmaktadır. Lanthionine, methyl-lanthionine, dehydrobutryrine, dehydroalanine gibi ender bulunan 24

34 aminoasitlere sahiptir. Grup Ia bakteriyosinlerinin en bilinen üyesi nisin'dir (Clevaland vd. 2001). Tip B lantibiyotikler, Tip A lantibiyotiklerden oldukça küçüktür. Büyüklükleri 19 aminoasiti aşmamaktadır. Tip B lantibiyotikler konakçı hücre enzimlerini inhibe etmektedir (Akkoç vd. 2009). Grup II bakteriyosinler Grup I'den farklı olarak lanthionine içermezler. Ayrıca, molekül ağırlıkları 10 kda'dan daha düşük olup, ısı stabilitesine sahiptirler. Amfilik helikse, değişik oranlarda hidrofobiteye ve β-tabakalı yapıya sahiptirler. Ayrıca, bu gruptaki bazı bakteriyosinler 100 o C'den 121 o C'ye kadar olan sıcaklıklara karşı stabildirler. Antimikrobiyel aktiviteleri, membran aktif olmalarından kaynaklanmaktadır (De Martinis vd. 2002). Grup III bakteriyosinler daha büyük molekül ağırlığına (>30 kda) sahip olup, ısıya karşı duyarlı peptit zincirlerinden oluşmaktadır. Ancak, bu gruptaki bakteriyosinler henüz yeterince karakterize edilememişlerdir (De Martinis vd. 2002). Grup IV bakteriyosinler ise büyük ve kompleks moleküller olup, aktiviteleri için karbohidrat veya lipit bileşenlerine gereksinim duymaktadır. Bu bakteriyosinler hakkındaki bilgiler yetersiz olup, biyokimyasal olarak henüz yeterince karakterize edilememiştir. Dolayısıyla, bu konuda daha fazla bilgiye ihtiyaç duyulmaktadır (Chen ve Hoover 2003). Tüketiciler, kimyasal katkı maddelerinin yol açabileceği olumsuz sağlık etkileri nedeniyle doğal gıdaları tüketmek istemektedir. Az işlem görmüş fakat raf ömrü uzun gıdalar elde etmek için en uygun koruma yöntemlerine ilgi giderek artmaktadır. Bu nedenle bakteriyosinler doğal koruyucular olarak düşünülebilir. Bazı bakteriyosinlerin koruyucu olarak kullanıldığı gıdalar ve etkileri çizelge 2.2'de, sınıflandırılmaları ve etki spektrumları ise çizelge 2.3'de verilmiştir. 25

35 Çizelge 2.2 Bazı bakteriyosinlerin kullanıldığı gıdalar ve etkileri (Kurt ve Zorba 2005) Bakteriyosin Uygulanan Gıda Etkileri Nisin A İşlenmiş et ürünleri Bakteriyel inaktivasyon Nisin A Ricotta peyniri L. monocytogenes'in gelişimini engellemiştir. Enterocin4 Entorocin sentezleyen E. faecalis INIA4 L. monocytogenes Ohio'yu inhibe ederken, Manchego peyniri üretiminde L. monocytogenes Scott A'yı inhibe kullanılmıştır. etmemiştir. Enterocin Jambon, domuz eti, tavuk göğsü,sosis'te Çeşitli şartlar altında L.monocytogenes kullanılmıştır. gelişimini kontrol etmiştir. Leucocin A L.gelidium UAL187 vakum paketlenmiş L sake'nin de etkisiyle bozulma 8 haftaya sığır etinde kullanılmıştır. kadar geciktirilmiştir. Lactocin 705 Kıyılmış sığır etinde L. monocytogenes'in L. monocytogenes'in kıyılmış etlerde gelişimini önlemek için kullanılmıştır. gelişimini önlemiştir. Pediocin Şarap ve fırıncılık ürünlerinde kullanım Bu tür ürünlerde kullanım potansiyeli potansiyeli araştırılmıştır. olduğu belirlenmiştir. Pediocin Tavuk etine pediocin preparatı 5 o C'de 28 gün L. monocytogenes'in ilave edilmiştir. gelişimini kontrol etmiştir. Pediocin PA-1 Fermente sosiste starter olarak L. monocytogenes'i etkili bir şekilde P. acidilactici kullanılmıştır. kontrol etmiştir. 26

36 Çizelge 2.3 Bazı Bakteriyosinlerin Sınıflandırılması ve Etkili Olduğu Bakteriler (Kurt ve Zorba 2005) Bakteriyosin Sentezleyen Etkili Olduğu Bakteriler Grup IA Nisin Lactococcus lactis Lactococcus spp.,lactobacillus spp., Streptococcus spp., Micrococcus spp., Mycobacterium spp., Bacillus spp. Corynebacterium spp., Clostiridium spp.,.listeria spp., Staphylococcus aureus Lactocin S Lactobacillus sake Lactobacillus spp., L. helveticus, L. bulgaricus Epidermin Staphylococcus epidermis Gallidermin Staphylococcus gallinarum Lacticin 481 Lactobacillus lactis Lactococcus spp., L. helveticus, L. bulcaricus Grup IB Mersacidin Bacillus subtilis Cinnamycin Streptomyces cinnamoneus Ancovenin Streptomyces spp. Duramycin S. cinnamoneus Actagardin Actinoplenes spp. Grup 2A Pediocin PA-1 Pediococcus acidilactici Lactobacillus spp.,pediococcus spp., L. monocytogenes Pediocin AcH Pediococcus acidilactici L. monocytogenes, L. ivanovii, Sakacin A L. sake Lactobacillus spp.,l. monocytogenes Sakacin P L. sake Enterococcus spp., Lactobacillus, Pediococcus, L. innocua, L. ivanovii, L. monocytogenes Mesentericin Leuconostoc mesenteroides L.monocytogenes Enterocin A Enterococcus faecium Lactococcin L. lactis Enterococcus spp., Lactobacillus spp., Lactococcus spp. Divercin Carnobacterium divergens Lactobacillus spp., L. monocytogenes Grup IIB Lactococcin L. lactis Lactacin Lactobacillus johnsoii L. bulgaricus, L. helveticus, L. lactis L. fermentum, E. faecalis Plantaracin A L. plantarum L. plantarum, L. paramesenteroides, E. faecalis Pediococcus pentosaceus Plantaracin S L.plantarum Lactobacillus spp., Leuconostoc spp.,pediococcus spp Grup IIC Acidocin Lactobacilus acidophilus Divergicin A C. divergens Enterocin P E. faecium Enterocin B E. faecium Grup III Helveticin Lactobacillus helveticus 27

37 Gıdalara inokule edilen LAB, bakteriyosin üretmektedir. Bakteriyosinler saf ya da yarı saf olarak gıdalara eklenebilmekte ya da gıdaların üretim süreci boyunca bakteriyosin üreten suşlar seçilmektedir. 2.9 Laktik Asit Bakterilerinin Proteolitik Aktiviteleri Laktik asit bakterilerinde proteolitik sistemin önemi, LAB'ın proteince zengin ortamlarda hızla gelişebilmesinden kaynaklanmaktadır. Proteinazların ve peptidazların birlikte etkisi sonucu, hücre için gerekli küçük peptitler ve esansiyel aminoasitler oluşmaktadır (Kok 1990). Laktik asit bakterilerinin proteolitik sistemi proteinazlardan, peptit ve aminoasit sistemlerinden ve sitoplazmik peptidazlardan oluşmaktadır (Moulay 2006). Laktik asit bakterilerinin proteolitik sistemi sitoplazma dışındaki enzimler, transport sistemi ve hücre içi enzim sistemi olmak üzere üçe ayrılmaktadır (Johnson ve Steele 2001). Laktokoklarda hücre dışı proteinazlar (PrtP), kazein kullanımında ilk aşamayı katalize etmektedir. Proteinazların hücre dışı aktiviteleri sonucunda kazeinlerde farklı uzunlukta oligopeptitler oluşmaktadır. Kazeinden türeyen oligopeptitler, hücre dışı peptidazlar tarafından hidrolize edilmekte ve oluşan peptitler aminopeptidazlar tarafından hücre içine alınmaktadır. Hücre dışı oligopeptit hidrolizinde sınırlı bir aktivite gösteren aminopeptidazların kazein türevi oligopeptitler üzerindeki enzimatik faaliyeti ile serin, treonin, glutamin, valin, lösin, alanin ve lisin gibi aminoasitler serbest kalmakta ve serin-lösin ya da glisinserin içeren dipeptitler üretilmektedir. Oluşan bu aminoasit ya da di ve tri peptit transport sisitemleri üzerinden hücre içine alınmaktadır (Akçelik ve Şanlıbaba 2000). Azotlu bileşiklerin sitoplazmik membran boyunca yer değişmesi özel transport sistemleri sayesinde olmaktadır. Özel transport sistemleri di\tripeptit transport sistemleri ve oligopeptit transport sistemlerinden (Opp) oluşmaktadır (Johnson ve Steele 2001). 28

38 Hücre içi peptitler, peptidazlar tarafından hidrolize edilmektedir. Peptidazlar endopeptidazlar ve ekzopeptidazlar olmak üzere iki sınıfa ayrılmaktadır. Amino peptidazlar, tripeptidazlar ve dipeptidazlar ekzopeptidazlar grubundadır. Endopeptidazların ve ekzopeptidazlar sayesinde peptitler serbest aminoasitlere dönüşerek laktokokların gelşimine katkıda bulunmaktadır. LAB'ın proteolitik sistemi sütte gelişme kabiliyetlerine ve peynirlerde tadın gelişimine katkıda bulunmaktadır. Sütte bulunan serbest aminoasitlerin miktarı LAB'ın gelişerek yüksek bir hücre yoğunluğuna sahip olması için yeterli değildir. Bu yüzden sütte bulunan peptidleri ve süt proteinlerini kullanarak aminoasitlerin ortaya çıkarılması gerekmektedir. Proteoliz yoluyla peptitlerin ve aminoasitlerin oluşumu, sonucu direk ya da dolaylı yoldan tat oluşumuna katkıda bulunmaktadır. Tat oluşumu olumlu ya da olumsuz etki yapabilmektedir. İyi kalitede süt ürünlerinin oluşumunda LAB'ın proteolitik etkisi önemlidir (Johnson ve Steele 2001). Bitki kökenli laktik asit bakterilerinin proteolitik aktivitesi ya çok azdır ya da yoktur ve diğer mikroorganizmalarla karşılaştırıldığında aminoasitleri indirgeme özellikleri düşüktür (Daeschel vd. 1987). Ekstraselüler proteinazlar dışında Lactobacillus plantarum, proteinin indirgenmesi için birçok gene sahiptir ve Opp sistemi için birçok geni kodlayabilmektedir. Diğer laktobasiller, laktokoklara benzer bir şekilde PrtP proteinlerine sahiptir (Axelsson 2004). 29

39 3. MATERYAL VE YÖNTEM 3.1 Materyal Bakteri kültürleri Çalışmada, Ankara Üniversitesi Mühendislik Fakültesi Gıda Mühendisliği Bölümü Kültür Koleksiyonu'nda bulunan, önceki çalışmalarda turşulardan izole edilen, seçilmiş 36 adet laktik asit bakterisi suşu kullanılmıştır (Çizelge 3.1). Ankara'nın Çubuk İlçesinin farklı bölgelerinde ve farklı işletmelerinde değişik hammaddeler kullanılarak üretilen turşulardan izole edilerek, biyokimyasal ve moleküler yöntemlerle tanımlamaları gerçekleştirilmiş kültürler içinde % 30 (v/v) gliserin bulunan "kriyo" tüplerine alınarak, -65 o C'de muhafaza edilmiştir. Yapılan çalışmalar öncesi bakteri kültürleri, -65 o C'den alınarak MRS sıvı besiyerinde 30 o C'de, 48 saat süre Binder (USA) marka inkübatörde aktifleştirilmiştir. Sterilizasyon işlemleri için CL-40 M Alp (Japain) marka otoklav kullanılmıştır. Spektrofotometrik ölçümler için Shimadzu UV-1208 (Japain) marka spektrofotometre kullanılmıştır. ph ölçümleri için ph 4.0 ve ph 7.0 tamponlarıyla (Hamilton Duracal Buffer, Switzerland) kalibre edilmiş ph metre (Metler Toledo Seven Easy ph, China) kullanılmıştır. Tüplerin karıştırtması aşamasında Heidolph MR Hei-Standard (Germany) marka vorteks kullanılmıştır. Santrifüj işlemleri için Mikro 22R Hettich Zentrifugen (Germany) ve Biofuge 15 Heraus Sepatech (Germany) marka satrifüjler kullanılmıştır. 30

40 Çizelge 3.1 Çalışmada kullanılan laktik asit bakterisi kültürleri Laktik Asit Bakterisi ÇalıĢma Kodu Ġzole Edildiği Kaynak Enterococcus casseliflavus T1 Hıyar Turşusu Lactobacillus brevis T2 Erik Turşusu Lactobacillus brevis T3 Hıyar Turşusu Lactobacillus brevis T4 Hıyar Turşusu Lactobacillus parabrevis T5 Erik Turşusu Lactobacillus namurensis T6 Hıyar Turşusu Lactobacillus namurensis T7 Hıyar Turşusu Pediococcus parvulus T8 Hıyar Turşusu Pediococcus parvulus T9 Erik Turşusu Pediococcus parvulus T10 Hıyar Turşusu Pediococcus parvulus T11 Hıyar Turşusu Pediococcus parvulus T12 Hıyar Turşusu Lactobacillus plantarum T13 Hıyar Turşusu Lactobacillus plantarum T14 Hıyar Turşusu Lactobacillus plantarum T15 Hıyar Turşusu Lactobacillus plantarum T16 Erik Turşusu Lactobacillus plantarum T17 Karışık Turşu Lactobacillus buchneri T18 Hıyar Turşusu Lactobacillus buchneri T19 Hıyar Turşusu Lactobacillus buchneri T20 Hıyar Turşusu Lactobacillus buchneri T21 Hıyar Turşusu Lactobacillus buchneri T22 Hıyar Turşusu Lactobacillus buchneri T23 Hıyar Turşusu Pediococcus ethanolidurans T24 Hıyar Turşusu Pediococcus ethanolidurans T25 Hıyar Turşusu Pediococcus ethanolidurans T26 Hıyar Turşusu Pediococcus ethanolidurans T27 Hıyar Turşusu Pediococcus ethanolidurans T28 Hıyar Turşusu Pediococcus ethanolidurans T29 Hıyar Turşusu Pediococcus ethanolidurans T30 Hıyar Turşusu Pediococcus ethanolidurans T31 Hıyar Turşusu Pediococcus ethanolidurans T32 Hıyar Turşusu Pediococcus ethanolidurans T33 Hıyar Turşusu Pediococcus ethanolidurans T34 Hıyar Turşusu Pediococcus ethanolidurans T35 Erik Turşusu Pediococcus ethanolidurans T36 Erik Turşusu 31

41 3.1.2 Besiyerleri MRS BROTH (g/litre) Peptone from casein (10); Meat extract (8); Yeast extract (4); D(+) glucose (20.0); Dipotassium hydrogen phosphate (2); Tween* 80 (1); Di-ammonium hydrogen citrate (2); Sodium acetate (5); Magnesium sulfate (0.2); Manganese sulfate (0.04) MRS-AGAR (g/litre) Peptone from casein (10); Meat extract (8); Yeast extract (4); D(+) glucose (20.0); Dipotassium hydrogen phosphate (2); Tween* 80 (1); Di-ammonium hydrogen citrate (2); Sodium acetate (5); Magnesium sulfate(0.2); Manganese sulfate(0.04); Agar-agar (14) TSBY BROTH (g/litre) Peptone from casein (17); Peptone from soymeal (3); D(+) glucose (2,5); Sodium chloride (5); Di-potassium hydrogen phosphate (2,5); Yeast extract (6) TSBY AGAR(g/litre) Peptone from casein (17); Peptone from soymeal (3); D(+) glucose (2,5); Sodium chloride (5); Di-potassium hydrogen phosphate (2,5); Yeast extract (6); Agar-agar (7) 3.2 Yöntem Laktik asit bakterilerinin asit üretim yeteneklerinin ve hızlarının belirlenmesi Laktik asit bakterilerinin asit üretim yeteneklerinin ve hızlarının belirlenmesi amacı ile kültürler MRS (Merck) sıvı besiyerinde 30 o C'de 48 saat süre aktifleştirilmiştir. 10 ml steril MRS sıvı besiyerine, aktif kültürlerden % 0.1 oranında 2 tekerrürlü olarak aşılanmış, 30 o C'de inkübasyona bırakılmıştır. İnkübasyonun 12, 24, 48. saatlerinde

42 ml örnek alınmıştır. Örneklerin üzerine belirli miktar (40 ml) saf su ilave edilmiş ve 2-3 damla % 1'lik fenolfitaleyn (Merck, Germany) indikatörü eşliğinde, ayarlı 0.01 N NaOH (Merck, Germany) çözeltisiyle hafif pembe renk oluşuncaya kadar titre edilmiş ve harcanan alkali miktarı kaydedilmiştir (V 1 ). İnkübe edilmemiş sıvı kültür (şahit) de titre edilerek, harcanan alkali miktarı kaydedilmiştir (V 2 ). Her bir tekerrürün 2 paralelinin ortalaması alınmış ve toplam asitlik, aşağıda verilen formüle göre hesaplanarak % laktik asit cinsinden ifade edilmiştir (Bulut 2003). V: Titrasyonda harcanan (V 1 -V 2 ) NaOH miktarı (ml) F: Titrasyonda kullanılan bazın normalitesi E: 1 ml NaOH'ın eşdeğeri asit miktarı (g) Laktik asit için E: 0.09 g m: Örnek miktarı (ml) Laktik asit bakterilerinin farklı ph değerlerinde geliģme yetenekleri LAB'ın farklı ph değerlerinde gelişebilme yeteneklerini belirlemek amacıyla, kültürler MRS sıvı besiyerinde 30 o C'de 48 saat süre ile aktifleştirilmiştir. MRS sıvı besiyerlerinin ph değerleri 2N NaOH ve 2N HCl ile ph 2.0, ph 3.0, ph 4.0, ph 5.0, ph 6.5, ph 9.6 olarak ayarlanmıştır. ph ayarlaması yapılan besiyerlerine, aktif kültürlerden % 0.1 oranında 2 tekerrürlü aşılama yapılmış, 30 o C'de 48 saat gelişmeye bırakılmıştır. Gelişme sonrası, kültürlerin 600 nm dalga boyunda ölçülen absorbans değerleri OY 600 olarak ifade edilmiştir 33

43 3.2.3 Laktik asit bakterilerinin farklı tuz konsantrasyonlarında geliģme yetenekleri LAB'ın farklı tuz konsantrasyonlarında gelişebilme yeteneklerini belirlemek amacıyla, MRS (Merck) sıvı besiyerinde kültürler 48 saat süre ile aktifleştirilmiştir. MRS sıvı besiyerine tuz konsantrasyonu ; % 0, % 3, % 4, % 6.5, % 10 ve % 12 olacak şekilde NaCl eklenerek, sıvı besiyerleri 121 o C'de 15 dakika sterilize edilmiştir. Daha sonra içerisinde steril besiyeri bulunan tüplere, aktif kültürlerden % 0.1 oranında aşılanarak 30 o C'de 7 gün gelişmeye bırakılmıştır. Gelişim sonrası, kültürlerin spektrofotometrede 600 nm dalga boyunda ölçülen absorbans değerleri OY 600 olarak ifade edilmiştir Laktik asit bakterilerinin antimikrobiyel aktivitesinin belirlenmesi Antimikrobiyel aktivitenin belirlenmesinde, nokta ekim (spot on lawn) yöntemi kullanılmıştır. Antimikrobiyel aktivitenin belirlenmesi aşamasında indikatör mikroorganizma olarak Bacillus cereus FM1, Candida albicans SLM, Lactobacillus brevis, Salmonella sp., E. coli, Listeria innocua, kullanılmıştır. MRS Broth besiyerinde LAB 30 o C'de 48 saat süre aktifleştirilmiştir. 20 ml steril MRS Agar (Merck) besiyeri içeren Petri kutularına, aktif kültürlerden 1 µl, 2 paralelli ekim yapılarak, LAB geliştirilmiştir. Lactobacillus brevis MRS sıvı besiyerinde, diğer indikatör mikroorganizmalar ise TSB besiyerinde saat geliştirilmiştir. 121 o C'de 15 dakika sterilize edilerek su banyosunda 45 o C'de bekletilen TSBYA (0.7 Agar) besiyerine % 1 oranında aktif indikatör mikroorganizma eklenerek, ikinci tabaka olarak Petri kutusuna 7 ml dökülüp yayılmıştır. Petri kutuları 30 o C de gelişmeye bırakılmıştır. Gelişme sonrası, nokta koloni etrafında oluşan berrak zonun çapı ölçülmüştür (Schillinger ve Lücke 1989, Jacobsen 1999, Sanni 1999) Laktik asit bakterilerinin bakteriyosin üretim yeteneklerinin belirlenmesi Antimikrobiyel aktivite gösteren suşlarda bakteriyosin üretim yeteneklerini belirlemek amacı ile kuyucuk difüzyon yöntemi uygulanmıştır. Bu aşamada indikatör 34

44 mikroorganizma olarak, Listeria innocua, Staphylococcus carnosus, Lactobacillus brevis ve Micrococcus luteus suşu kullanılmıştır. Referans suş olarak ise, Ankara Üniversitesi Biyoloji Bölümü'nden temin edilen ve bakteriyosin üretme yeteneği olan Lactococcus lactis 27 (LL27) kullanılmıştır. Aktif kültür kullanılarak gerçekleştirilen antimikrobiyel aktivite testleri sonucunda zon veren kültürlerin sıvı kısımları elde edilerek testler indikatörlere karşı denenmiştir. Bunun için 10 ml MRS sıvı besiyerinde geliştirilmiş 48 saatlik aktif kültürlerin asitliği nötralize edilerek, g'de 10 dk santrifüj edilmiştir. Elde edilen süpernatant 0.45 µm'lik mebran filtreden (Millipore Millex-HV Hydrophilic PVDF) geçirilerek filtrasyon işlemi gerçekleştirilmiştir. 121 o C'de 15 dakika sterilize edilerek, su banyosunda 45 o C'ye getirilmiş TSBYA (% 0.7 agar) besiyerine %1 oranında indikatör mikroorganizma ilave edilerek besiyeri Petri kutularına aktarılmış ve oda sıcaklığında katılaşana kadar bekletilmiştir. Katılaşan besiyeri üzerinde 6 mm çapında kuyucuklar açılmış, filtrasyon işlemi gerçekleştirilen sıvı kısım kuyucuklara aktarılarak difüze olabilmesi için oda sıcaklığında 30 dakika bekletilmiştir. Daha sonra petriler 24 saat inkübe edilerek, gelişme sonucunda kuyucuk etrafında zon oluşumu değerlendirilmiştir (Tagg ve Mcgiven 1971) Laktik asit bakterilerinin H 2 O 2 üretim yeteneklerinin belirlenmesi LAB'ın H 2 O 2 üretim yeteneklerinin belirlenmesi amacıyla kültürler MRS sıvı besiyerinde 30 o C'de 48 saat süre ile aktifleştirilmiştir. Aktif kültürlerden, 10 ml MRS sıvı besiyerine % 0.1 oranında aşılanarak, 30 o C'de 48 saat geliştirilmiştir. Hidrojen peroksit miktarının belirlenmesinde standart kurvenin çizilmesi için; 100 µl H 2 O 2 (% 30) alınıp steril MRS sıvı besiyeri ile 50 ml'ye tamamlanarak stok hidrojen peroksit çözeltisi hazırlanmıştır. Hazırlanan stok çözeltiden µl arası hacimlerde alınmış, 25 ml ye steril MRS sıvı besiyeri ile tamamlanarak artan konsantrasyonlarda seri çözeltiler elde edilmiştir. Her seri çözeltilerden 5 ml alınarak üzerine 5 ml saf su eklenmiştir. Daha sonra her bir konsantrasyondan 2.5 ml alınarak üzerine 0.5 ml peroksidaz çözeltisi (% 0.001), 0.05 ml o-dianisidin çözeltisi (% 1) ilave edilerek 30 35

45 o C'de 10 dk inkübe edilmiş, reaksiyon 0.1 ml 4N HCl ile durdurulmuştur. 5 dk bekletilen standartların 400 nm dalga boyunda absorbansları okunarak standart kurve çizilmiştir (Şekil 3.1). Aynı işlemler inkübe edilen sıvı bakteri kültürlerinde paralelli olarak yapılmış ve üretilen hidrojen peroksit miktarı hesaplanmıştır (Gilliland 1969, Yap ve Gilliland 2000, Sunil ve Narayana 2008). 1,6 1,4 1,2 1 y = 65,516x - 0,0487 R 2 = 0,9968 0,8 0,6 0,4 0,2 0-0,2 0 0,005 0,01 0,015 0,02 0,025 Şekil 3.1 Hidrojen peroksit standart eğrisi Laktik asit bakterilerinin enzim profillerinin belirlenmesi (API ZYM) LAB'ın enzim profillerinin belirlenmesi amacıyla API-ZYM (Biomerieux France) test kitleri kullanılmıştır. Analiz aşamasında MRS besiyerinde 24 saat süre ile aktifleştirilen kültürler g'de 10 dk santrifüj edilmiş, sıvı kısım uzaklaştırıldıktan sonra 1 ml kit içerisindeki steril "% 0.85 API NaCl çözeltisi" ile süspanse edilen bakteri kültürlerinden, 5-6 McFarland bulanıklığında bakteri süspansiyonları hazırlanmıştır. Daha sonra plastik kutuların yuvarlak kuyucukları içerisine nemli bir ortam sağlamak için yaklaşık 5 ml saf su koyulmuştur. Hazırlanan bakteri süspansiyonlardan kuyucukların içerisine 65 µl ilave edilerek plastik kutuların kapağı kapatılmış 37 o C'de 4 saat inkübasyona bırakılmıştır. İnkübasyon sonrası kuyucukların içerisine, sırasıyla, birer damla ZYM A ve ZYM B reaktifi damlatılarak renk oluşumu için 5 dk bekletilmiş ve 10 sn 1000 W ışık kaynağı altında tutulmuştur. API-ZYM test kiti içerinde bulunan 36

46 20 adet enzim aktivitesi belirlemek için plastik kutucuklardaki renk değişimleri ve yoğunlukları değerlendirilmiştir. LAB'ın enzim profilleri belirlenirken, oluşan renklerin değerlendirilmesi aşamasında kit içerinde bulunan renk skalasından faydalanılmış, oluşan rengin yoğunluğuna göre 0-5 aralığında puanlama yapılmıştır Laktik asit bakterilerinin proteolitik aktiviteleri Proteolitik aktivitenin belirlenmesi aşamasında farklı yöntemler denenmiştir. İlk aşamada, OPA metodu kullanılarak LAB'da proteolitik aktivite belirlenmeye çalışılmıştır. Bakteri kültürleri MRS sıvı besiyerine aşılanarak 30 o C'de 48 saat boyunca gelişmeye bırakılmış, gelişme sonrası santrifüj edilen ( g, 10 dk) örneklerin çökeltileri 2 kez fosfat buffer ile yıkanarak, ilk hacimlerine buffer ile tamamlanmıştır. Hazırlanan bakteri süspansiyonundan % 1 oranında Skim Milk besiyerine (ph 6.8) aşılanarak 24 saat gelişmeye bırakılmıştır. Ancak, inkübasyon sonrası deneme kapsamındaki kültürlerde gelişme gözlenmemiştir. Gelişmenin sağlanabilmesi için süt besiyeri sterilize edildikten sonra aseptik koşullarda ph değeri 5.7'ye ayarlanmıştır. İçerisine % 2 oranında glikoz ilave edilerek ve laktozsuz süt besiyeri kullanılarak da kültürler tekrar inkübe edilmiş, ancak gelişme yine sağlanamamıştır. Bunun üzerine, 1:1 oranda MRS sıvı besiyeri ve Skim Milk besiyeri karıştırılarak hazırlanan ortamda bakteriler geliştirilmiştir. Geliştirilen kültürler 0.75 N TCA ile muamele edilerek santrifüjle proteinler çöktürülmüş ve sıvı fazın 50 µl'sine 1 ml o- phthaldialdehyde (OPA) çözeltisi (25 ml 100 mm borax, 2.5 ml %20 Sodyum dodesil sülfat (SDS), 40 mg OPA, 100 µl β-merkaptaetanol ilave edilmiştir. Aynı şartlarda serin standardı ile hazırlanan seri çözeltilerden standart kurve hazırlanmış, fakat okuma hassasiyeti sağlanamamıştır. MRS besiyeri oranı kademeli olarak azaltılmış ancak spektrofotometrede okunabilir değerlere ulaşıldığında da bakterilerde bir gelişme gözlenmemiştir. Benzer şekilde, süt besiyerine MRS iz elementleri ilave edilmiş, hem de MRS besiyerinin bileşenleri değiştirilerek (pepton, meat ekstrakt, yeast ekstrakt) farklı kombinasyonlar denenmiş, ancak başarılı bir sonuç alınamamıştır. İkinci yöntem olarak kromojenik substrat yöntemi denenmiştir. Bu yöntemde; LAB kültürleri 10 ml MRS-Ca (10 mm CaCl 2 ) besiyerinde 24 saat 30 o C'de geliştirilerek 10 37

47 000 g'de 10 dk 4 o C'de santrifüj edilmiş, elde edilen bakteri çökeltisi 2 kez 10 mm CaCl 2 -tuz çözeltisiyle yıkanmıştır. Daha sonra çökelti üzerine 0.5 ml Tris buffer (50 mm, ph 7.8) ilave edilmiştir. Hazırlanan enzim çözeltisinden 200 µl alınarak üzerine, sırasıyla, µl fosfat buffer (0.2 M, ph 7.0), 225 µl 5 M NaCl ve 20 µl S-Ala (N-succinyl-Ala-Ala-Pro- Phe-p-nitroanilide, 20 mm) koyularak 30 o C'de 30 dakika inkübe edilmiştir. İnkübasyon sonrası reaksiyonu durdurmak için 175 µl % 80'lik asetik asit ilave edilerek g'de 5 dk santrifüj edilmiştir. Sıvı fazın absorbansı spektrofotometrede 410 nm'de okunmuştur (Savoy ve Hebert 2001). 38

48 4.BULGULAR VE TARTIġMA 4.1 Laktik Asit Bakterilerinin Asit Üretim Yetenekleri Laktik asit bakterileri tarafından karbohidratlar fermente edilerek laktik asit oluşturulmakta ve laktik asit fermantasyonu gerçekleşmektedir. Laktik asit fermantasyonunun gıda, eczacılık, deri ve tekstil endüstrisi gibi birçok alanda uygulaması bulunmaktadır (Rodríguez-Couto ve Sanromán 2006). Deneme kapsamındaki LAB'ın asit üretim miktarları 12, 24 ve 48 saat inkübasyon süreleri sonunda, laktik asit cinsinden hesaplanmıştır. 12 saat inkübasyon sonrası g/100 ml, 24 saat inkübasyon sonrası g/100 ml ve 48 saat inkübasyon sonrası g/100 ml laktik asit üretimi belirlenmiştir. Her üç saatin sonunda da en iyi laktik asit oluşturan tür Lactobacillus plantarum olarak tespit edilmiştir (Çizelge 4.1, Şekil 4.1). Bulut (2003) tarafından peynirden izole edilen, Lactococcus ve Enterecoccus türlerinin 24 saat sonunda g/100 ml, Lactobacillus cinslerinin g/100 ml laktik asit ürettiği belirtilmiştir. Cheriguene vd. (2006) keçi sütünden izole ettikleri, L. paracasei türleri tarafından 24 saat sonunda g/100 ml, L. rhamnosus türleri tarafından 24 saat sonunda g/100 ml, L. plantarum türleri tarafından 24 saat sonunda g/100 ml, E. feacium türleri tarafından 24 saat sonunda g/100 ml laktik asit üretildiğini bildirmişlerdir. 39

49 Çizelge 4.1 Laktik asit bakterilerinin farklı inkübasyon sürelerinde asit üretim miktarları (g/100 ml) 12. saat 24. saat 48. saat E. casseliflavus T ± ± ± 0.22 L. brevis T ± ± ± 0.02 L. brevis T ± ± ± 0.01 L. brevis T ± ± ± 0.02 L. parabrevis T ± ± ± 0.03 L. namurensis T ± ± ± 0.02 L. namurensis T ± ± ± 0.01 P. parvulus T ± ± ± 0.02 P. parvulus T ± ± ± 0.03 P. parvulus T ± ± ± 0.06 P. parvulus T ± ± ± 0.03 P. parvulus T ± ± ± 0.05 L. plantarum T ± ± ± 0.02 L. plantarum T ± ± ± 0.01 L. plantarum T ± ± ± 0.02 L. plantarum T ± ± ± 0.03 L. plantarum T ± ± ± 0.02 L. buchneri T ± ± ± 0.04 L. buchneri T ± ± ± 0.18 L. buchneri T ± ± ± 0.02 L. buchneri T ± ± ± 0.03 L. buchneri T ± ± ± 0.04 L. buchneri T ± ± ± 0.01 P. ethanolidurans T ± ± ± 0.02 P. ethanolidurans T ± ± ± 0.02 P. ethanolidurans T ± ± ± 0.04 P. ethanolidurans T ± ± ± 0.02 P. ethanolidurans T ± ± ± 0.03 P. ethanolidurans T ± ± ± 0.01 P. ethanolidurans T ± ± ± 0.01 P. ethanolidurans T ± ± ± 0.01 P. ethanolidurans T ± ± ± 0.03 P. ethanolidurans T ± ± ± 0.02 P. ethanolidurans T ± ± ± 0.01 P. ethanolidurans T ± ± ± 0.02 P. ethanolidurans T ± ± ±

50 g\100 ml g\100 ml g\100 ml Asit Üretim Miktarı 1,5 1 0,5 12.saat 24.saat 48.saat 0 T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10 T11 T12 Asit Üretim Miktarı 1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 T13 T14 T15 T16 T17 T18 T19 T20 T21 T22 T23 12.saat 24.saat 48.saat Asit Üretim Miktarı 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 T24 T25 T26 T27 T28 T29 T30 T31 T32 T33 T34 T35 T36 12.saat 24.saat 48.saat Şekil 4.1 Laktik asit bakterilerinin farklı inkübasyon sürelerinde asit üretim miktarları (g/100 ml) 41

51 Çon ve Karasu (2009) tarafından turşudan ve fermente yeşil zeytinden izole edilen L. plantarum ve L. pentosus suşlarının 24 saat sonunda g/100 ml laktik asit ürettikleri belirlenmiştir. Herreros vd. (2003), İspanyol keçi peynirinden izole ettikleri L. mesenteroides türleri tarafından 24 saat sonunda g/100 ml, L. plantarum türleri tarafından 24 saat sonunda g/100 ml, L. brevis türleri tarafından 24 saat sonunda g/100 ml, L. casei suşları tarafından 24 saat sonunda g/100 ml laktik asit üretildiğini belirtmişlerdir. Erdoğrul vd. (2002) fermente sucuklardan izole ettikleri Pediococcus pentosaceus türlerinin 24 saat sonunda g/100 ml laktik asit ürettiğini bildirmişlerdir. Bu çalışmada 24 saat inkübasyon sonunda Pediococcus türlerinin g/100 ml laktik asit ürettiği belirlenmiş ve Erdoğrul vd. (2002)'nın sonuçlarına göre daha yüksek sonuçlar tespit edilmiştir. Enterococcus cinsinin 0.02 g/100 ml asit ürettiği belirlenerek, Bulut (2003) ve Cheriguene vd. (2006) sonuçlarına göre daha düşük değerler belirlenmiştir. Lactobacillus türleri g/100 ml asit belirlenmiş; Bulut (2003), Cheriguene vd. (2006), Herreros vd. (2003) tarafından bulunan değerlerine göre yüksek, Çon ve Karasu (2009)'nun değerlere göre düşük sonuçlar tespit edilmiştir. LAB'ın temel antimikrobiyel etkisi laktik asit üretimi ile ph'daki düşüş olarak belirtilmektedir (Çon ve Gökalp 2000). Bu nedenle LAB tarafından üretilen laktik asit miktarı önem taşımaktadır. 4.2 Laktik Asit Bakterilerinin Farklı ph Değerlerinde GeliĢme Yetenekleri Her mikroorganizmanın gelişebildiği bir minimum, maksimum ve optimum ph değeri vardır. Bakteriler gelişecekleri ortamın ph'sı açısından daha seçicidirler. LAB'ın ph 2.0, ph 3.0, ph 4.0, ph 5.0, ph 6.5, ph 9.6 değerlerinde gelişme yetenekleri incelenmiştir. ph 2.0'da L. plantarum (T16, T17) suşlarının çok zayıf gelişme gösterdiği, diğer bakterilerin gelişemediği; ph 3.0'da L. plantarum (T13, T15, T16, 42

52 T17) suşlarının zayıf gelişme gösterdiği, diğer bakterilerin gelişemediği; ph 4.0'da L. plantarum türlerinin iyi geliştiği, 5 bakterinin gelişemediği, diğer bakterilerin ise değişken gelişme gösterdiği; ph 5.0 ve ph 6.5'de tüm bakterilerin geliştiği, en iyi gelişmeyi L. plantarum türlerinin gösterdiği; ph 9.6'da E. casseliflavus (T1) ve L. namurensis (T7) suşlarının iyi gelişme gösterdiği, diğer bakterilerin gelişemediği tespit edilmiştir (Çizelge 4.2, Şekil 4.2). Adnan ve Tan (2007) iki geleneksel Malezya ürününden ve kırmızı biber püresinden izole edilen laktik asit bakterileri arasında ph 4.5, ph 7.0 ve ph 9.0'da L. brevis ve L. plantarum türlerinin geliştiğini belirtmişlerdir. Kıran (2006) tarafından yapılan bir çalışmada, hazır gıdalardan izole edilen ve çeşitli kültür koleksiyonlarından temin edilen laktik asit bakterilerinden hiçbirinin ph 2.0 ve ph 3.0'da gelişemediği; ph 4.0, ph 5.0 ve ph 6.0 değerlerinde hepsinin geliştiği; ph 9.6 değerinde P. pentocaceus türlerinin bir kısmının geliştiği bazılarının zayıf gelişme gösterdiği; L. plantarum, L. brevis ve L. fermentum türlerinin geliştiği, Leuconostoc cinslerinin zayıf gelişme gösterdiği belirtilmiştir. 43

53 Çizelge 4.2 Laktik asit bakterilerinin farklı ph değerlerinde gelişme değerleri (OY 600 ) ph 2.0 ph 3.0 ph 4.0 ph 5.0 ph 6.5 ph9.6 E. casseliflavus T ± ± ± ± ± ± 0.01 L. brevis T ± ± ± ± ± ± 0.00 L. brevis T ± ± ± ± ± ± 0.00 L. brevis T ± ± ± ± ± ± 0.00 L. parabrevis T ± ± ± ± ± ± 0.00 L. namurensis T ± ± ± ± ± ± 0.00 L. namurensis T ± ± ± ± ± ± 0.06 P. parvulus T ± ± ± ± ± ± 0.00 P. parvulus T ± ± ± ± ± ± 0.00 P. parvulus T ± ± ± ± ± ± 0.00 P. parvulus T ± ± ± ± ± ± 0.00 P. parvulus T ± ± ± ± ± ± 0.00 L. plantarum T ± ± ± ± ± ± 0.00 L. plantarum T ± ± ± ± ± ± 0.00 L. plantarum T ± ± ± ± ± ± 0.00 L. plantarum T ± ± ± ± ± ± 0.00 L. plantarum T ± ± ± ± ± ± 0.00 L. buchneri T ± ± ± ± ± ± 0.00 L. buchneri T ± ± ± ± ± ± 0.00 L. buchneri T ± ± ± ± ± ± 0.00 L. buchneri T ± ± ± ± ± ± 0.00 L. buchneri T ± ± ± ± ± ± 0.00 L. buchneri T ± ± ± ± ± ± 0.00 P. ethanolidurans T ± ± ± ± ± ± 0.00 P. ethanolidurans T ± ± ± ± ± ± 0.00 P. ethanolidurans T ± ± ± ± ± ± 0.00 P. ethanolidurans T ± ± ± ± ± ± 0.00 P. ethanolidurans T ± ± ± ± ± ± 0.00 P. ethanolidurans T ± ± ± ± ± ± 0.00 P. ethanolidurans T ± ± ± ± ± ± 0.00 P. ethanolidurans T ± ± ± ± ± ± 0.00 P. ethanolidurans T ± ± ± ± ± ± 0.00 P. ethanolidurans T ± ± ± ± ± ± 0.00 P. ethanolidurans T ± ± ± ± ± ± 0.00 P. ethanolidurans T ± ± ± ± ± ± 0.00 P. ethanolidurans T ± ± ± ± ± ±

54 OY(600nm) OY(600nm) OY(600nm) ph Toleransı 2 1,5 1 0,5 0 T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10 T11 T12 ph2 ph3 ph4 ph5 ph6,5 ph9,6 ph Toleransı 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 T13 T14 T15 T16 T17 T18 T19 T20 T21 T22 T23 ph2 ph3 ph4 ph5 ph6,5 ph9,6 ph Toleransı 2,5 2 1,5 1 0,5 0 T24 T25 T26 T27 T28 T29 T30 T31 T32 T33 T34 T35 T36 ph2 ph3 ph4 ph5 ph6,5 ph9,6 Şekil 4.2 Laktik asit bakterilerinin farklı ph değerlerinde gelişme değerleri (OY 600 ) 45

55 Tangüler (2010), şalgam suyundan izole ettiği Lactobacillus, Pediococus, Leuconostoc cinslerinin ph 4.4'de gelişme gösterdiğini fakat ph 9.6'da hiçbir bakterinin gelişme gösteremediği belirtmiştir.yine aynı çalışmada kontrol olarak kullanılan L. buchneri, L. brevis, L. plantarum, L. fermentum, L. delbrueckii türlerinden L. buchneri hariç diğer 4 bakterinin ph 4.4'de gelişebildiği, fakat 5 bakteriden hiçbirinin ph 9.6 da gelişemediğini belirtmiştir. Bu çalışmada ph 9.6'da yalnızca E. casseliflavus (T1) ve L. namurensis (T7) türlerinin iyi geliştiği sonucuna varılırken; Adnan ve Tan (2007) tarafından ph 9.0'da L. brevis ve L. plantarum türlerinin geliştiği, Kıran (2006) tarafından ph 9.6'da bazı Lactobacillus ve Pediococcus cinslerinin geliştiği belirtilmektedir. Tangüler (2010)'in sonuçları ile uyumlu sonuçlar elde edilmiştir. Aktan vd. (1998) tarafından L. plantarum'un aside en dayanıklı tür olduğu ve hıyar turşusu fermantasyonunun bu bakterinin etkinliğiyle sonlandığı belirtilmektedir. Bu çalışmada da ph 2.0 da çok zayıf, ph 3.0'da zayıf ve ph 4.0'da en iyi gelişme gösteren türün Lactobacillus plantarum olması, bu türün aside en dayanıklı tür olduğunu desteklemektedir 4.3 Laktik Asit Bakterilerinin Farklı Tuz Konsantrasyonlarında GeliĢme Yetenekleri Tuz konsantrasyonu, fermantasyonun gidişini yönlendiren ve son ürün kalitesini etkileyen en önemli faktörlerden birisidir. Düşük tuz konsantrasyonlarında (% 5-8) fermantasyon hızlı, yüksek tuz konsantrasyonlarında (% 10 ve üzeri) yavaş olarak gerçekleşir veya hiç gerçekleşmez. Tuz konsantrasyonun fermantasyonda rol alan mikroorganizmaların faaliyetleri üzerine etkisi seçici özellik göstermektedir. Bu bakımdan ürüne ve prosese göre ayarlanması önem taşır. Tuzlama işlemi doğrudan ya da salamura şeklinde uygulanmaktadır (Aktan 1998). LAB'ın % 0, % 3, % 6.5, % 10 ve % 12 tuz konsantrasyonlarında gelişme yetenekleri incelenmiştir. % 3 tuz konsantrasyonunda tüm bakterilerin gelişme gösterdiği, en iyi gelişmeyi L. plantarum türlerinin gösterdiği; % 6.5 tuz konsantrasyonunda en iyi gelişmeyi L. plantarum türlerinin gösterdiği, 3 bakterinin gelişemediği; % 10 tuz konsantrasyonunda P. ethanolidurans ve L. plantarum türlerinin en iyi gelişme 46

56 gösterdiği, 12 bakterinin gelişemediği; % 12 tuz konsantrasyonunda P. ethanolidurans (T24) ve L. namurensis (T7)'in zayıf gelişme gösterdiği tespit edilmiştir (Çizelge 4.3, Şekil 4.3). Kıran (2006) tarafından yapılan bir çalışmada, hazır gıdalardan izole edilen ve çeşitli kültür koleksiyonlarından temin edilen laktik asit bakterileri arasında, % 4 tuzda tüm bakterilerin geliştiği, % 6.5 tuzda 5 tanesi hariç diğerlerinin geliştiği, % 12 tuzda 4 tanesinin zayıf gelişme gösterdiği diğerlerinin gelişemediği, % 18 tuz konsantrasyonunda ise hiçbirinin gelişemediği belirtilmiştir. Bulut (2003) tarafından yapılan çalışmada, 9 adet Lactobacillus türünün % 6.5 tuz konsantrasyonunda gelişebildiği belirtilmiştir. 47

57 Çizelge 4.3 Laktik asit bakterilerinin farklı tuz konsantrasyonlarında gelişme değerleri (OY 600 ) %0 NaCl %3 NaCl %6,5 NaCl %10 NaCl %12 NaCl E. casseliflavus L. brevis L. brevis L. brevis L. parabrevis L. namurensis L. namurensis P. parvulus P. parvulus P. parvulus P. parvulus P. parvulus L. plantarum L. plantarum L. plantarum L. plantarum L. plantarum L. buchneri L. buchneri L. buchneri L. buchneri L. buchneri L. buchneri P. ethanolidurans P. ethanolidurans P. ethanolidurans P. ethanolidurans P. ethanolidurans P. ethanolidurans P. ethanolidurans P. ethanolidurans P. ethanolidurans P. ethanolidurans P. ethanolidurans P. ethanolidurans P. ethanolidurans T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10 T11 T12 T13 T14 T15 T16 T17 T18 T19 T20 T21 T22 T23 T24 T25 T26 T27 T28 T29 T30 T31 T32 T33 T34 T35 T ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ±

58 OY(600nm) OY(600nm) OY(600nm) Tuz Toleransı 2,5 2 1,5 1 0,5 0 T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10 T11 T12 0% 3% 6,50% 10% 12% Tuz Toleransı 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 T13 T14 T15 T16 T17 T18 T19 T20 T21 T22 T23 0% 3% 6,50% 10% 12% Tuz Toleransı 2,5 2 1,5 1 0,5 0 T24 T25 T26 T27 T28 T29 T30 T31 T32 T33 T34 T35 T36 0% 3% 6,50% 10% 12% Şekil 4.3 Laktik asit bakterilerinin farklı tuz konsantrasyonlarında gelişme değerleri 49

59 İşleroğlu vd. (2008) yöresel bir peynirden izole ettikleri, Enterococcus faecalis'in % 3, % 4 ve % 6.5 tuz konsantrasyonlarında gelişebildiğini fakat %10 tuz konsantrasyonunda gelişemediği belirtmişlerdir. Sánchez ve Palop (2000) bir çeşit patlıcan turşusu olan Almagro'dan izole ettikleri, L. plantarum, L. pentosus, L. brevis, ve L. fermentum türlerinin % 4 tuz konsantrasyonunda geliştiğini, % 6.5 tuz konsantrasyonunda belirli oranlarda bütün türlerde gelişme görülebildiğini, % 8 tuz oranında L. fermentum haricinde diğer türlerde gelişme olduğunu bildirmişlerdir. Adnan ve Tan (2007) iki geleneksel Malezya ürününden ve kırmızı biber püresinden izole ettikleri laktik asit bakterileri arasında, % 1.5, % 2.5 ve % 5 tuz konsantrasyonlarında tüm L. brevis ve L. plantarum türlerinin geliştiğini, % 7.5 ve % 10 tuzda L. brevis ve L. plantarum türlerinin gelişemediğini bildirmişlerdir. Adnan ve Tan (2007) L. plantarum türlerinin % 10 tuz konsantrasyonunda gelişemediğini bildirmiş olmalarına karşın, bizim çalışmamızda % 10 tuz konsantrasyonunda L. plantarum türlerinin gelişebildiği sonucuna varılmıştır. Bu çalışmanın bulguları Kıran (2006) ve Bulut (2003) ile uyumludur. Turşu, sebze ve meyvelerin belirli tuz konsantrasyonlarında laktik asit bakterileri tarafından fermantasyona uğratılmasıyla elde edilen bir ürün olması nedeniyle, laktik asit bakterileri belirli tuz konsantrasyonlarına dayanıklı olmalıdır. Bu çalışmada % 6.5 ve % 10 tuz konsantrasyonlarına en dayanıklı tür Lactobacillus plantarum olarak tespit edilmiştir. 4.4 Laktik Asit Bakterilerinin Antimikrobiyel Aktivitesi LAB'ın 6 adet indikatör mikroorganizmaya karşı genel antimikrobiyel aktivitesi belirlenmiştir.indikatör mikroorganizma olarak seçilen Candida albicans, Lactobacillus brevis, Bacillus cereus, Salmonella sp, E. coli, Listeria inocua'ya karşı, laktik asit bakterilerinin oluşturdukları inhibisyon zon çapları ölçülmüştür. 0.5 cm ve bundan küçük inhibisyon zonu veren örneklerde antimikrobiyel aktivite yok olarak kabul 50

60 edilmiştir. Suşlar Listeria innocua, E. coli ve Salmonella sp. üzerinde antimikrobiyel aktivite göstermiş, fakat Candida albicans'a karşı antimikrobiyel aktivite gösterememişlerdir. L. plantarum (T16 ve T17) türünün B. cereus'a karşı oluşturdukları inhibisyon zon çaplarının büyüklüğünün diğer bakterilerinkinden daha fazla olduğu tespit edilmiştir. Erdoğrul vd. (2002) fermente sucuklardan izole ettikleri 4 adet P. pentosaceus türünün Bacillus megaterium, Bacillus subtilis, Micrococcus luteus, Mycobacterium smegmatus, Staphylococcus aureus, Yersinia enterocolitica üzerine olan genel inhibisyon etkisini incelemiş ve sadece bir suşun S. aureus'a karşı 1cm'lik zon oluşturduğunu bildirmişlerdir. Bu çalışmada ise Pediococcus türlerinin L. inocua, E. coli ve Salmonella sp.'ye karşı 1cm ve 1cm'den büyük zon oluşturduğu; B. cereus, L. brevis'e karşı 1cm'den küçük zon oluşturduğu belirlenmiştir. Çon ve Karasu (2009) turşudan ve fermente yeşil zeytinden izole ettikleri, L. plantarum türlerinin L. sake, L. monocytogenes'e karşı iyi, E. feacium ve E. coli'ye karşı orta düzeyde, P. vulgaris ve A. hydrophila'ya karşı zayıf, Y.lipolitica'ya karşı ise negatif antimikrobiyel etki gösterdiklerini bildirmişlerdir. Toksoy vd. (1999), sucuk ve sosislerden izole ettikleri 39 adet Lactobacillus plantarum suşunun P. aeruginosa, E. coli, S. aures, B. subtilis üzerinde genel inhibisyon etkilerinin belirtilen sırada olduğunu bildirmişlerdir. 51

61 Çizelge 4.4 Laktik asit bakterilerinin farklı mikroorganizmalar üzerindeki antimikrobiyel aktivitesi sonucu oluşan zon çapları (cm) B. cereus FM1 C. albicans SLM L. brevis Salmonella E. coli L. innocua E. casseliflavus T L. brevis T L. brevis T L. brevis T L. parabrevis T L. namurensis T L. namurensis T P. parvulus T P. parvulus T P. parvulus T P. parvulus T P. parvulus T L. plantarum T L. plantarum T L. plantarum T L. plantarum T L. plantarum T L. buchneri T L. buchneri T L. buchneri T L. buchneri T L. buchneri T L. buchneri T P. ethanolidurans T P. ethanolidurans T P. ethanolidurans T P. ethanolidurans T P. ethanolidurans T P. ethanolidurans T P. ethanolidurans T P. ethanolidurans T P. ethanolidurans T P. ethanolidurans T P. ethanolidurans T P. ethanolidurans T P. ethanolidurans T

62 4.5 Laktik Asit Bakterilerinin Bakteriyosin Üretim Yetenekleri Genel antimikrobiyel aktiviteleri belirlenen LAB türlerinin aktivitelerinin bakteriyosin veya diğer bileşiklerden kaynaklanıp kaynaklanmadığını belirlemek amacıyla türlerin antimikrobiyel aktivitesi agar kuyu difizyon yöntemiyle test edilmiştir. Bu aşamada indikatör mikroorganizma olarak L. innocua, Staphylococcus carnosus, L. brevis ve Micrococcus luteus suşları kullanılmıştır. Referans suş olarak ise, Ankara Üniversitesi Biyoloji Bölümü'nden temin edilen ve bakteriyosin üreten Lactococcus lactis 27 (LL27) suşu kullanılmıştır. Şekil 4.4 LL27 Suşunun Bakteriyosin Aktivitesi Asitliği nötralize edilerek santrifüj edilen ve membran filtreden geçirilen kültürlerin hiçbirinde indikatör mikroorganizmalara karşı inhibisyon zonuna rastlanmamıştır. Genel inhibisyonun asitlikten kaynaklandığı ve seçilen kültürler tarafından inhibisyona neden olacak oranda bakteriyosin üretilmediği sonucuna ulaşılmıştır. 4.6 Laktik Asit Bakterilerinin Hidrojen Peroksit Üretim Yetenekleri 53