ĐSTANBUL TEKNĐK ÜNĐVERSĐTESĐ FEN BĐLĐMLERĐ ENSTĐTÜSÜ TÜRKĐYE DEKĐ YENĐLEBĐLĐR SOĞANSI BĐTKĐLERĐN TOPLAM ANTĐOKSĐDAN ĐÇERĐKLERĐNĐN ARAŞTIRILMASI

Transkript

1 ĐSTANBUL TEKNĐK ÜNĐVERSĐTESĐ FEN BĐLĐMLERĐ ENSTĐTÜSÜ TÜRKĐYE DEKĐ YENĐLEBĐLĐR SOĞANSI BĐTKĐLERĐN TOPLAM ANTĐOKSĐDAN ĐÇERĐKLERĐNĐN ARAŞTIRILMASI YÜKSEK LĐSANS TEZĐ Binnur GÖÇ Anabilim Dalı : Kimya Programı : Kimya HAZĐRAN 2009

2

3 ĐSTANBUL TEKNĐK ÜNĐVERSĐTESĐ FEN BĐLĐMLERĐ ENSTĐTÜSÜ TÜRKĐYEDE KĐ YENĐLEBĐLĐR SOĞANSI BĐTKĐLERĐN TOPLAM ANTĐOKSĐDAN ĐÇERĐKLERĐNĐN ARAŞTIRILMASI YÜKSEK LĐSANS TEZĐ Binnur GÖÇ ( ) Tezin Enstitüye Verildiği Tarih Tezin Savunulduğu Tarih : 04 Mayıs 2009 :04 Haziran 2009 Tez Danışmanı : Prof. Dr. Birsen DEMĐRATA ÖZTÜRK (ĐTÜ) Diğer Jüri Üyeleri : Prof. Dr. Reşat APAK (ĐÜ) Doç. Dr. Gülçin Gümüş YILMAZ (ĐTÜ) HAZĐRAN 2009

4

5 Tüm eğitim, öğrenim hayatım ve tez çalışmam süresince maddi ve manevi desteğini hiçbir zaman benden esirgemeyen sevdiğim, saydığım anne ve babama teşekkür ederim. iii

6 iv

7 ÖNSÖZ Bu çalışmamda eğitmen ve öğretici kimliği ile bana yön veren, vizyonumu genişleten çok değerli hocam sayın Prof. Dr. Birsen DEMĐRATA ÖZTÜRK e, tüm laboratuar çalışmalarımda bana her konuda yardımcı olan, bilgi birikimlerini benimle paylaşan Uzman Dilek ÖZYURT a ve laboratuvar çalışmalarımda yardımlarını benden esirgemeyen Araştırma Görevlisi Mustafa ÖZYÜREK e çok teşekkür ederim. Mayıs 2009 Binnur Göç (Kimyager) v

8 vi

9 ĐÇĐNDEKĐLER ÖNSÖZ... v ĐÇĐNDEKĐLER... vii KISALTMALAR... ix ÇĐZELGE LĐSTESĐ... xi ŞEKĐL LĐSTESĐ... xi ÖZET... xv SUMMARY... xvii 1. GĐRĐŞ GENEL BÖLÜM Serbest Radikaller ve Antioksidanlar Literatürde Yer Alan Toplam Antioksidan Kapasite/Aktivite Tayininde Kullanılan Yöntemler TEAC yöntemi FRAP yöntemi DPPH yöntemi CERAC yöntemi CUPRAC yöntemi FOLIN-CIOCALTEU yöntemi Soğan Özellikleri ve Faydaları Soğanın yapısındaki kimyasal bileşenler Flavonoidler Quercetin ve özellikleri DENEYSEL ÇALIŞMALAR Kullanılan Araç Gereç ve Kimyasal Maddeler Kullanılan Ana Çözeltilerin Hazırlanması x10-3 M ceryum(iv)sülfat çözeltisinin hazırlanması Amonyum asetat tamponunun hazırlanması(ph=7) ,003 M neocuproin çözeltisinin hazırlanması ,01 M CuCl 2.H 2 O çözeltisinin hazırlanması Lowry B çözeltisinin hazırlanması Lowry C çözeltisinin hazırlanması Folin-Ciocalteu reaktifinin hazırlanması ,001 M quercetin çözeltisinin hazırlanması Soğan Ekstraktlarının Hazırlanması Uygulanan Yöntemler ve Kalibrasyon Grafiklerinin Çizimi Cerac yöntemi ile quercetin kalibrasyon grafiği Cuprac yöntemiyle quercetin kalibrasyon grafiği Folin yöntemiyle quercetin kalibrasyon grafiği Analiz Yöntemlerinin Soğan Ekstraklarına Uygulanması Sayfa vii

10 3.5.1 Sarı, kırmızı, beyaz soğan, taze yeşil soğan yaprakları, taze yeşil soğanın kök kısımları ekstraktlarına Cerac yönteminin uygulanması Sarı, kırmızı, beyaz soğan, taze yeşil soğan yaprakları, taze yeşil soğanın kök kısımları ekstraktlarına Cuprac yönteminin uygulanması Sarı, kırmızı, beyaz soğan, taze yeşil soğan yaprakları, taze yeşil soğanın kök kısımları ekstraktlarına Folin yönteminin uygulanması Soğan Örneklerine Farklı Isıtma Đşlemlerinin Uygulanması ve Antioksidan Kapasitesindeki Değişimin Đncelenmesi Mikrodalgada 90W de 1, 2 ve 4 dakika süre ile bekletilerek saf su ile hazırlanan sarı, kırmızı, beyaz soğan, taze yeşil soğan yaprakları, taze yeşil soğanın kök kısmı ekstraktlarının CERAC, CUPRAC ve FOLĐN Yöntemleri ile analizi Etüvde 50 0 C de 1, 2 ve 4 saat süre ile bekletilerek saf su ile hazırlanan sarı, kırmızı, beyaz soğan, taze yeşil soğan yaprakları, taze yeşil soğanın kök kısmı ekstraktlarının CERAC, CUPRAC ve FOLĐN Yöntemleri ile analizi SONUÇLAR VE ÖNERĐLER KAYNAKLAR ÖZGEÇMĐŞ viii

11 KISALTMALAR ABTS : 2,2 -azinobis(3-etilbenzotiazolin-6-sülfonat) ACSOs : Alk(en)yl Sisteik Sülfoksit BHA : Bütillenmiş Hidroksianisol BHT...: Bütillenmiş Hidroksitoluen CERAC : Seryum(IV) Đyonu Đndirgeme Antioksidan Kapasitesi Cu(II)-Nc : Bakır(II)-Neokuproin Cu(I)-Nc : Bakır(I)-Neokuproin CUPRAC : Bakır(II) Đyonu Đndirgeme Antioksidan Kapasitesi DPHH : 2,2-difenilpikrilhidrazil(DPPH: 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil) ET : Elektron Transferi F-C : Folin-Ciocalteu metodu FRAP : Femir(III) Đndirgeme Antioksidan Gücü HAT : Hidrojen Atomu Transferi HDL : High Density Lipoprotein LDL : Low Density Lipoprotein PBS : Fosfat Tampon Çözeltisi TAC : Toplam Antioksidan Kapasitesi TEAC : Troloks Eşdeğeri Antioksidan Kapasitesi ix

12 x

13 ÇĐZELGE LĐSTESĐ Çizelge 3.1 : Quercetin molar absorpsiyon katsayıları Çizelge 3.2 : Quercetin molar absorpsiyon katsayıları Çizelge 3.3 : Quercetin molar absorpsiyon katsayıları Çizelge 3.4 : Cerac yötemi ile yapılan soğan ekstraktlarının analizi Çizelge 3.5 : Cuprac yötemi ile yapılan soğan ekstraktlarının analizi Çizelge 3.6 : Folin yötemi ile yapılan soğan ekstraktlarının analizi Çizelge 3.7 : CERAC yöntemi ile mikrodalgada ısıtma sonucu soğan ekstraktlarındaki değişen antioksidan miktarı Çizelge 3.8 : CUPAC yöntemi ile mikrodalgada ısıtma sonucu soğan ekstraktlarındaki değişen antioksidan miktarı Çizelge 3.9 : FOLĐN yöntemi ile mikrodalgada ısıtma sonucu soğan ekstraktlarındaki değişen antioksidan miktarı Çizelge 3.10 : Mikrodalgada ısıtma işlemi sonucunda değişen madde miktarı(g) ve % de ağırlık kaybı Çizelge 3.11 : CERAC yöntemi ile etüvde ısıtma sonucu soğan ekstraktlarındaki değişen antioksidan miktarı Çizelge 3.12 : CUPRAC yöntemi ile etüvde ısıtma sonucu soğan ekstraktlarındaki değişen antioksidan miktarı Çizelge 3.13 : FOLĐN yöntemi ile etüvde ısıtma sonucu soğan ekstraktlarındaki değişen antioksidan miktarı Çizelge 3.14 : Etüvde ısıtma işlemi sonucunda değişen madde miktarı(g) ve % de ağırlık kaybı Çizelge 4.1 : Quercetin için molar absorpsiyon katsayıları (mol -1 L cm -1 ) Çizelge 4.2 : Analiz yöntemlerinin saf sulu soğan ekstraktlarına uygulanması Çizelge 4.3 : Analiz yöntemlerinin etanoldeki soğan ekstraktlarına uygulanması Çizelge 4.4 : Farklı soğan örneklerinin etanol ve saf sudaki ekstraktlarına uygulanan analiz yöntemleri sonucu bulunan toplam antioksidan miktarlarının toplu olarak gösterilmesi Çizelge 4.5 : Mikrodalgada 90 W de 1, 2 ve 4 dakika süre ile bekletilen soğan örneklerindeki toplam antioksidan miktar değişiminin toplu olarak gösterilmesi Çizelge 4.6 : Etüvde 50 o C de 1, 2 ve 4 saat süre ile bekletilen soğan örneklerindeki toplam antioksidan miktar değişiminin toplu olarak gösterilmesi Sayfa xi

14 xii

15 ŞEKĐL LĐSTESĐ Şekil 2.1 : Soğanın Yapısındaki Kimyasal Bileşenler Şekil 2.2 : Flavonoidlerin Basit Yapısı Şekil 2.3 : Flavonoid ailesinin kimyasal yapısı Şekil 2.4 : Quercetin in kimyasal yapısı Şekil 3.1 : Ce(IV) Quercetin reaksiyonu için kalibrasyon grafiği Şekil 3.2 : Quercetin ve bis(neocuproin)-bakır(ii) klorür için kalibrasyon grafiği Şekil 3.3 : Quercetin ve Folin reaktifi için kalibrasyon grafiği Şekil 3.4 : M Ce(IV) çözeltisi ile saf sulu soğan ekstraktlarıının reaksiyonları sonucu azalan Ce(IV) miktarının 320 nm deki absorbans değerleri Şekil 3.5 : M Ce(IV) çözeltisi ile etanoldeki soğan ekstraktlarının reaksiyonları sonucu azalan Ce(IV) miktarının 320 nm deki absorbans değerleri Şekil 3.6 : M Ce(IV) çözeltisi ile saf sudaki yeşil soğan-kök kısmı ekstraktının reaksiyonu sonucu oluşan çözeltinin nm arasındaki absorpsiyon spektrumu Şekil 3.7 : Saf sudaki soğan çözeltilerinin bis(neocuproin)-bakır(ii) klorür ile reaksiyonu sonucu oluşan komplekslerin 450 nm deki absorbans değerleri ile örnek hacmi arasında çizilen kalibrasyon grafiği Şekil 3.8 : Neocuproin reaktifi ile Beyaz Soğanın sulu ekstraktının reaksiyonu sonucu oluşan çözeltilerin nm arasında absorpsiyospektrumları 25 Şekil 3.9 : Saf sudaki sarı soğan ekstraktı ile Folin reaktifinin reaksiyonu sonucu oluşan reaktifin 750 nm deki absorbans değerleri ile örnek hacmi arasında çizilen kalibrasyon grafiği Şekil 3.10 : Folin reaktifi ile sarı soğanın sulu ekstraktının reaksiyonu sonucu oluşan çözeltilerin nm arasındaki absorpsiyon spektrumları Sayfa xiii

16 xiv

17 TÜRKĐYE DEKĐ YENĐLEBĐLĐR SOĞANSI BĐTKĐLERĐN TOPLAM ANTĐOKSĐDAN ĐÇERĐKLERĐNĐN ARAŞTIRILMASI ÖZET Canlılarda, kimyasal süreçler (prosesler), özellikle oksitlenme, serbest radikallerin oluşmasına neden olur. Yüksek derecede reaktif olan serbest radikaller farklı moleküller ile kolayca reaksiyona girebilir ve böylece hücrelere, canlıya zarar verebilir. Yiyecekler, kozmetikler, ilaçlar, sigara dumanı (Aktif veya pasif) ve modern yaşamın getirdiği diğer pek çok kir serbest radikallerin oluşmasına neden olur. Oksidasyon reaksiyonları sonucu meydana gelen serbest radikaller zincir reaksiyonunu başlatır. Antioksidanlar serbest radikallerle bağ kurarak zincir reaksiyonunu sonlandırır. Kronik hastalıklara karşı meyve ve sebzelerin koruyucu etkisi yapısındaki antioksidan özellikleri olan kimyasal maddelerden kaynaklanmaktadır. Doğal olarak bitkilerde bulunan bu bileşikler, fenolikler, karotenoidler, askorbik asit, tiyoller ve tokoferollerdir. Soğanlı bitkiler yüksek antioksidan aktivitesine sahiptirler. Onların bu özelliği yapılarındaki flavonoidlerden kaynaklanmaktadır. Flavonoid tüketimine bağlı olarak diabet, kalp rahatsızlığı ve kanser riski azalmaktadır. Antioksidanların kimyasal çeşitliliği onları sebzelerden ayırmayı ve miktar tayinini güçleştirir. Bu yüzden toplam antioksidan aktivitesinin ölçümünde kullanılan yöntemlerin ekstrakt çözeltilerine direkt uygulanabilmesine ihtiyaç vardır. Bu çalışmada, Türkiye de bol miktarda bulunan ve tüketilen bazı yenilebilir soğansı bitkilerin (Allium türleri) saf su ve etanoldeki toplam antioksidan miktarı üç farklı yöntemle tayin edilmiştir. Bu yöntemler Cerac, Cuprac ve son olarak Folin-Ciocalteu yöntemidir. Ayrıca, soğanlara(sarı, kırmızı, beyaz, yeşil soğan-yaprak, yeşil soğankök) farklı kurutma (etüv de ve mikrodalga da) işlemleri uygulanarak, toplan antioksidan miktarlarındaki değişim incelenmiştir. Sonuç olarak, soğan çözeltilerine üç farklı yöntem uygulandığında, hazırlanan ekstraksiyon çözeltisi ve uygulanan yönteme göre soğan örneklerindeki toplam antioksidan miktarlarında farklılık gözlemlendi. Isıtılan soğan örneklerindeki toplam antioksidan miktarına bakıldığında, ısıtma süresinin artmasına rağmen, örneklerdeki toplam antioksidan miktarlarında çok büyük değişiklikler gözlemlenmemiştir. xv

18

19 INVESTIGATION OF TOTAL ANTIOXIDANT CONTENTS OF DIETARY ONION PLANTS IN TURKEY SUMMARY In organisms, chemical proses,especially oxidation,can produce free radicals which has high reactivite can easily reagents with different molecules and this is damage to cells. Foods, drugs,cosmetics, smoke and a lot of dirty that comes by modern life result in producing free radicals. Free radicals which produced by oxidation reactions start chain reactions. Antioxidants terminate these chain reactions by binding free radicals. The protective effect of fruits and vegetables against chronic diseases is attributed to their phytochemical content and correspoinding antioxidant activity. These compounds which are natually present in plants are phenolics, carotenoids, ascorbic acid, thiols, and tocopherols. Onions possess a high level of antioxidant activity, which is attributed to the flavonoids. Flavonoid consumption has been associated with a reduced risk of cancer, heart disease, and diabetes. The chemical diversity of antioxidants makes it difficult to separate and quantify antioxidants from the vegetable matrix. Therefore, it is desirable to establish a method that can measure the total antioxidant activity level directly from vegetable extracts. In this study, in Turkey, abundant occuring and largely comsuming some dietary onions plants(allium species)in pure water and ethanol extracts of the amount of total antioxidant have been determined with different methods. These method that was apllied to onion species are Cerac method, secondly, Cuprac and lastly, Folin- Ciocalteu method. Onion species, namely yellow, red, white, fresh green leaf and fresh gren root, were analyzed and the samples have been heated in stove and microwave. The change of total antioxidant amount in onions have been determined. Resultly, when the methods is applied to onion solutions, according to onion extract solution and applied methods, it is observed different results in onion extracts. Although heating time is increase, when it is looked to heated onion samples, it was not observed very great changes total antioxidant quantity in onion samples. xvii

20 xviii

21 1. GĐRĐŞ Yiyeceklerin hazırlanması ve tüketimi esnasında ortaya çıkan major değişikliklerden birisi de oksidasyondur. Antioksidanlar (AO), vücut hücreleri tarafından üretildikleri gibi, gıdalarla da alınan ve diyetin temel bir maddesi olan lipidlerin oksidatif bozulmasını önleme yoluyla gıda kalitesini koruyabilen özellikteki bir grup kimyasal maddedir. Meyve ve sebzeler antioksidan olarak iyi birer kaynaktır[1]. Fenolik bileşikler ve onların bazı türleri otooksidasyonun önlenmesinde çok etkilidirler. Tüm flavonoidler, 3'-4'dihidroksi konfigürasyonu ile antioksidan aktiviteye sahiptir. Flavonoidler, bitkisel kaynaklı fenolik bileşiklerdir den daha fazla flavonoid bulunduğu bilinmektedir[2]. Çeşitli enzim sistemlerinin aktivitelerinin inhibe ederler ve damar sağlığını koruyarak kalp ve damar hastalıklarının önlenmesine yardımcı olurlar. Flavonoid tüketimine bağlı olarak kalp hastalıklarından kaynaklanan ölüm oranı azalmaktadır[3]. Flavonoidlerin tüketimi fazla olan kadınların göğüs kanserine yakalanma riskinin azaldığı bilimsel deneylerce kanıtlanmıştır. Soğan iyi bir flavonoid kaynağıdır. P- vitamini olarakta bilinen flavonoidler, çiçek, meyve ve yapraklarda sarıdan turuncuya kadar değişen renklerden sorumlu olmaları yanında, kılcal damarların geçirgenliğini ve kırılganlığını önleyici, antioksidan, antiviral, antimikrobiyal, antikarsinojen etkileri, ışığın zararlı etkisinden koruyucu, bitkisel solunum ve fotosentezi düzenleme, etkilerine sahip oldukları birçok araştırıcı tarafından rapor edilmiştir[4]. Flavonoidler, endüstride boyama malzemesi, metal kompleksleştirme, dericilikte tabaklama bileşimine katılma, kozmetikte güneş kremleri, analitik olarak uranyum, titan, zirkonyum metallerinin tayininde, et konserveciliğinde proteoliz hızlandırıcı olarak kullanılmaktadırlar. Flavonoidler günümüzde henüz büyük ölçekli sentetik olarak üretilmediklerinden temel kaynakları bitkilerdir. Bu bakımdan izolasyonları, miktar tayinleri ve tanınmaları önemlidir. 1

22 2

23 2. GENEL BÖLÜM 2.1 Serbest Radikaller ve Antioksidanlar Her nefes aldığımızda ciğerlerimize yarım litre hava dolar. Bunun %20.7`si oksijendir. Oksijen alyuvarlarımıza bağlanır ve kalbe gider. Kalp, bu oksijenli kanı tüm hücrelere pompalar. Oksijen, hücredeki şekeri yakarak yaşam enerjisinin üretimi sağlar. Bu işlem esnasında oksijen moleküllerinin %1-5`i değişime uğrar ve vücut için çok zararlı hale gelir ve serbest radikal oluşumuna neden olur. Serbest radikaller, peroksidasyon denen zincir reaksiyonlara sebep olurlar. Bu reaksiyonun kalp-damar, kanser ve romatizmal kireçlenmeler gibi hastalıklar üzerinde olası rolleri büyüktür. Vücudumuzda serbest radikalleri zararsız hale getiren enzim sistemi vardır. Enzim sisteminin güçlü çalışmaması sonucu hastalıklar ortaya çıkar. Bu durumda serbest radikalleri uzaklaştıracak dışardan alınacak maddelere ihtiyaç duyulur. Serbest radikalleri zararsız hale getiren bu maddelere antioksidan denir. Antioksidanlar serbest radikallerin neden olduğu kanser ve kalp rahatsızlıkları gibi kronik hastalıkları önlenmesi açısından çok büyük bir öneme sahiptir[5]. Serbest radikaller ve reaktif karakterli maddeler ile bu maddeleri üreten tüm faktörler "oksidan" veya "prooksidan" olarak tanımlanır. Orbitallerinde bir ya da daha fazla eşlenmemiş elektron taşıyan halojen atomlar(cl, Br), hidrojen atomu, Na, K gibi alkali metal atomları ve oksijenin redüksiyon ara ürünleri, süperoksit radikali (O 2 ), hidrojen peroksit(h 2 O 2 ), singlet O 2 ve hidroksil radikali(oh ) gibi bağımsız, kısa ömürlü, reaktif atomlar serbest radikal olarak tanımlanmaktadır. Fe 3+, Cu 2+, Mn 2+ ve Mo 5+ gibi geçiş metalleri de serbest radikal oluşumunda önemli rol oynarlar. Serbest radikaller yiyeceklerde lipid peroksidasyonuna sebep olmaktadır. Bu durum besinlerin hem kokusunu bozmakta hem de besin değerini düşürmektedir[6]. Serbest radikaller yaşam için gereklidir. Elektron taransferi, enerji üretimi ve pek çok diğer metabolik işlevde temel oluşturur. Ama eğer zincir reaksiyonu kontrolsüz bir davranış gösterirse hücrede hasarlara neden olur. Bilim adamları 1954'lerden beri 3

24 serbest radikallerin yaşlanma ve dejeneratif hastalıklara neden olduğunu bilmektedirler. Hücrede normal metabolik yollardaki enzimatik reaksiyonlarda enzimlerin aktif yerinde ara ürünler olarak devamlı şekilde serbest radikaller oluştumaktadır. Bazen bu serbest radikal ara ürünler enzimlerin aktif yerinden sızmakta, moleküler oksijenle etkileşerek serbest oksijen radikalleri oluşturmaktadırlar. Hücrede oluşan reaktif oksijen türleri (ROS), "antioksidan savunma sistemleri" veya kısaca "antioksidanlar" olarak bilinen mekanizmalarla ortadan kaldırılırlar. Ancak bazen hücresel savunma mekanizması vasıtasıyla ortadan kaldırılandan daha fazla reaktif oksijen türleri (ROS) oluşabilir. Organizmada hücresel savunma mekanizması vasıtasıyla ortadan kaldırılandan daha fazla reaktif oksijen türlerinin (ROS) meydana gelmesi oksidatif stres olarak tanımlanır[7]. Diğer bir deyişle, organizmadaki prooksidan ve anti-oksidan dengenin bozulması olarak tanımlanmaktadır. Oksidatif stres, kendini çeşitli kalp damar hastalıkları(arterioskleroz ve hipertansiyon), diyabet, hücre yıpranması ve yaşlanma, kıkırdak iltihabından gelen patoloji, solunum yolu hastalıkları, Down sendromu ve kanser gibi çeşitli hastalıklarda hissettirir. Serbest radikaller normal hücresel metabolizma sırasında oluşabildiği gibi, çeşitli dış etkenler aracılığı ile de meydana gelebilir. Oksidatif stres, radikaller; lipidler, proteinler ve nükleik asitler gibi temel hücresel bileşenlerde hasara yol açabilme özelliğine sahiptir. Oluşan bu hasarın kanser, yaşa bağlı bağışıklık yetersizliği ve hipertansiyon gibi çeşitli hastalıklar ile ilişkilidir ve biyolojik yaşlanma sürecinde rol oynamaktadır. Günümüzde hemen her hastalığın bir dereceye kadar oksidatif strese bağlı olduğu kabul edilmektedir Serbest radikaller hücrelerin lipid, protein, DNA, karbonhidrat ve enzim gibi tüm önemli biyolojik makro moleküllerine etki ederler ve eğer nötralize edilmezlerse vücutta ciddi hasarlara neden olabilirler: 1)Hücre membranı proteinlerini yıkarak hücreleri öldürmek, 2)Membran lipit ve proteinlerini yok ederek hücre membranını sertleştirip hücre fonksiyonunu engellemek, 3)Nuklear membranını yararak nukleustaki genetik materyale etki edip DNA'yı kırılma ve mutasyonlara açık hale getirmek, 4)Bağışıklık sistemindeki hücreleri yok ederek bağışıklık sistemini zorlamak, 4

25 Bu etkiler oksidatif stres olarak bilinen DNA mutasyonları, hücre ölümleri ve hastalıkları gibi hasarlara neden olur. Serbest radikallerin bu hasarları çok çeşitli mekanizmalara dayandırılabilmekle beraber en temel etkileri, lipit peroksidasyonu, proteinler arasında disülfür bağı oluşumu ve DNA hasarıdır. a)serbest radikallerin lipidlere etkileri Lipidler serbest radikallerin etkilerine karşı en hassas olan biyomoleküllerdir. Hücre membranlarındaki kolesterol ve yağ asitlerinin doymamış bağları, serbest radikallerle kolayca reaksiyona girerek peroksidasyon ürünleri oluştururlar. Poliansatüre yağ asitlerinin oksidatif yıkımı lipid peroksidasyonu olarak bilinir. Lipid peroksidasyonu kendi kendini devam ettiren zincir reaksiyonu şeklinde ilerler ve oldukça zararlıdır. Hücre membranlarında lipid serbest radikalleri (L ) ve lipid peroksit radikallerinin (LOO ) oluşması, reaktif oksijen türlerinin (ROS) neden olduğu hücre hasarının önemli bir özelliği olarak kabul edilir. Serbest radikallerin sebep olduğu lipid peroksidasyonuna "nonenzimatik lipid peroksidasyonu" denir. Bu durum, serbest radikaller hücrenin membranına saldırdıklarında gerçekleşir. Serbest radikaller, hücre membranının stabilizasyonunu ortadan kaldırarak, hızlı hücre ve doku bozulmalarına neden olurlar. b) Serbest radikallerin proteinlere etkileri Proteinler serbest radikallere karşı poliansatüre yağ asitlerinden daha az hassastırlar. Proteinlerin serbest radikallerden etkilenme derecesi amino asit kompozisyonlarına bağlıdır. Doymamış bağ ve kükürt içeren triptofan, tirozin, fenilalanin, histidin, metiyonin, sistein gibi amino asitlere sahip proteinler serbest radikallerden kolaylıkla etkilenirler. Bu etki sonucunda özellikle sülfür radikalleri ve karbon merkezli organik radikaller oluşur. Glutatyon (GSH) gibi tiyollerin (R-SH) oksidasyonu tiyol ve oksijen radikallerinin oluşumuna neden olur. Tiyol radikalleri, hidroksil radikallerinden daha zayıf olsalar da bazı biyolojik sorunlara neden olurlar. Bunlar sülfür merkezli radikallerdir (RSH) ve proteinlerdeki homolitik fisyon (sülfürlerin karşılıklı bağlanması) reaksiyonları disülfür bağını oluşturur. Bu da proteinlerin konfigürasyonlarını bozarak vücuttaki metabolik aktivitelerini engeller. 5

26 c) Serbest radikallerin DNA ya etkileri Radyasyonla oluşan serbest radikaller DNA'yı etkileyerek hücrede mutasyona ve ölüme yol açarlar. Hidroksil radikali (OH ), deoksiriboz ve bazlarla kolayca reaksiyona girer ve değişikliklere yol açar. Hidrojen peroksit (H 2 O 2 ) membranlardan kolayca geçerek ve hücre çekirdeğine ulaşarak DNA hasarına, hücre fonksiyonlarının bozulmasına ve hatta hücre ölümüne yol açabilir. Serbest radikal etkisiyle DNA'nın yapısının değişmesi mutasyonlara ve hatta canlının eşey hücrelerindeki mutasyona bağlı olarak döllerin ölmesine neden olur. Canlı organizmalar serbest radikallerin etkisinden korunmak için antioksidatif korunma sistemine sahiptirler. Đnsanoğlu hayatı boyunca yaşamın beraberinde getirdiği stres vb. zorlukları aşmak, hastalıklardan korunmak için takviye kuvvetler almak durumundadır. Bu tür koruyucu engelleyici maddelere antioksidan maddeler denir[8]. Çoğunlukla polifenolik yapıda olan antioksidan maddeler neredeyse tüm bitkilerde, meyvelerde, sebzelerde, mikroorganizmalarda, mantarlarda ve hayvansal dokularda bulunmaktadır[9]. Bu bileşikler hidrokinon olup, tersinir olarak kinona yükseltgenirler. Bu antioksidan maddelerin en önemlileri; tokoferoller, flavonoidler, karotenoidler ve askorbik asitdir. Flavonoidler, bitkilere renklerini veren polifenolik yapılı bileşiklerdir ve 4000 civarında flavonoid bileşiğinin kimyasal yapısı aydınlatılmıştır. Yapılan araştırmalar sonucunda antioksidanların başta kalp-damar hastalıkları olmak üzere daha birçok hastalığın oluşumunun önlenmesinde olumlu etkiler sağladığı tespit edilmiştir. 2.2 Literatürde Yer Alan Toplam Antioksidan Kapasite/Aktivite Tayininde Kullanılan Yöntemler Literatürde verilen antioksidan tayinlerinde temel sınıflandırma reaksiyon tipidir. Antioksidan tayinleri elektron transferine (ET) veya hidrojen atomu transferine (HAT) ne dayanır. 6

27 2.2.1 TEAC yöntemi TEAC yöntemi ilk olarak Miller ve arkadaşları tarafından, daha sonra ise Re ve arkadaşları tarafından biraz daha geliştirilmiştir[10,11]. Miller in geliştirmiş olduğu TEAC yönteminde metilmiyoglobinin H 2 O 2 ile reaksiyonu sonucu oluşan ferrilmiyoglobin radikallerinin ABTS ile etkileşimi sonucu oluşan ABTS. + radikallerinin 660, 734 ve 820 nm deki maksimum absorbans değerleri ölçülmüş ve ABTS. + radikal katyonunun absorbansındaki azalmadan yaralanarak toplam antioksidan kapasitesi trolox cinsinden bulunmuştur. TEAC; 1 mm deneysel örneğin indirgeme gücüne eşdeğer miktardaki mm trolox konsantrasyonudur. Bu yöntemin dezavantajı numuneler içindeki antioksidan maddelerin ABTS. + radikallerini indirgemesi yanında ferrilmiyoglobin radikallerini de indirgeyebilmesidir. Re ve arkadaşları tarafından geliştirilen TEAC yönteminde ise ABTS. + radikal katyonu ABTS nin [2, 2 ı Azino-bis(3 etilbenzotriazolin-6-sülfonik asit di amonyum tuzu)] potasyum persülfat ile oksidasyonu sonucu oluşmaktadır. Oluşan radikal katyonu fosfat tampon çözeltisi(pbs) ile seyreltilir ve PBS (ph =7.1)çözeltisine karşı 734 nm de azalan absorbans değeri ölçülür[12]. TEAC yöntemi antioksidan ve oksidan arasında elektron alışverişine dayanan bir yöntemdir. Oluşan renk değişiminin derecesi antioksidan miktarı ile orantılıdır. ABTS. + radikal katyonunun oluşması için çözelti şişesi alüminyum folyo ile kaplanmalı ve karanlıkta ve oda sıcaklığında saat bekletilmelidir.abts radikali, analizden 12 saat önce hazırlanmalı ve karanlıkta ve oda sıcaklığında muhafaza edilerek 2 gün kullanılabilir[13] FRAP yöntemi Toplam antioksidan gücünü ölçen bir yöntemdir. Đlk olarak plazmadaki antioksidan kapasitesini ölçmek için kullanılmış daha sonra ise diğer sıvılardaki antioksidan kapasitesini ölçmek için geliştirilmiştir. Bu yöntemde antioksidanlar ferric-tripridilazin (Fe +3 -TPTZ) kompleksini mavi renkli ferrous-triridilazin (Fe +2 -TPTZ) formuna indirgerler. Bu yöntemde düşük ph ta çalışılır(3.6) ve 593 nm de saf suya karşı artan absorbans değerleri ölçülerek toplam antioksidan kapasitesi direkt olarak bulunur[14]. 7

28 Canlı metabolizmalarındaki antioksidan kapasitelerinin FRAP yöntemi ile ölçülmesi durumunda, Fe +2 iyonlarının ortamdaki H 2 O 2 ile etkileşmesi hidroksi radikallerinin(oh. ) oluşmasına neden olabilir. Bu yüzden örnek numuneler içerisindeki antioksidanların Fe +3 -TPTZ kompleksini indirgemesi yanında ortamda hidroksi radikalleri ile etkileşmesinden dolayı antioksidan kapasitesi direkt olarak değil indirekt olarak ölçülebilir. FRAP yöntemi prooksidan içermeyen ortamlarda yapılan toplam antioksidan gücünün tayininde direkt bir yöntem olmasına karşın genel olarak düşünüldüğünde indirekt bir yöntemdir DPPH yöntemi Bu yöntemde DPPH ın indirgenmesi ile çözeltinin radikal süpürücü aktivitesi(radical scavenging activitiy) ölçülür[15]. Bazı saf bileşikler ve buna benzeyen ekstraktların elektron verme yeteneği DPPH nin metanoldeki mor renkli çözeltisinin renginin kaybolması ile ölçülür. Bu spektrofotometrik metotta DPPH(2,2-diphenylpicrylhydrazyl) radikal olarak kullanılır. Bu radikalin antioksidanlarla reaksiyonu sonucu 517 nm de azalan absorbansı ölçülerek radikal süpürücü aktivite ölçülür.(2.1) I%=(A blank -A sample ) 100 (2.1) A blank, test tüpündeki örnek hariç tüm maddelerin absorbansıdır. A sample bileşiğinin absorbansıdır[16]. test DPPH radikal süpürücü aktivitesi örnek konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak çizilir. Örnek konsantrasyonu arttıkça DPPH radikal süpürücü aktivite artar. Yüksek konsantrasyonlarda DPPH radikal süpürücü aktivite bir doygunluk noktasına ulaşır ve bundan sonra aktivite artan konsantrasyonla azalmaya başlar. Bu durum eksraksiyon çözeltisindeki başka maddelerin varlığından kaynaklanmaktadır[17] CERAC yöntemi Sülfat asitli ortamda Ce(IV) ün maksimum dalga boyundaki (320 nm) absorbans değeri Ce(IV) ün antioksidanlarla reaksiyonu sonucu azalmaktadır. Ce(IV) ün maksimum dalga boyundaki bu azalmadan yararlanılarak toplam antioksidan miktarı hesaplanamaktadır. (2.2) 8

29 Antioksidan Miktarı=[(A o -A 1 )/ε q ] V s /V ö SF V e /m (2.2) A o = Ce(IV) ün absorbansı A 1 =320 nm deki absorbans değeri V s =Örneğin son hacmi V ö =Alınan örnek miktarı(ml) SF=Seyreltme faktörü V e =Ekstraksiyon hacmi m =Soğan miktarı(g) ε q = Quercetin molar absorpsiyon katsayısı CUPRAC yöntemi Cu +2 indirgeyici toplam antioksidan miktarını ölçüm yöntemlerinden biridir. Bu yöntemde kromojenik bir redoks reaktifi olan bis(neocuproin)-bakır(ii) klorür kullanılır. Yöntem kolay, hızlı ve etkili bir yöntem olması yanında, reaktifin Cu(II) indirgeyici antioksidan kapasitesi ile hem hidrofilik hem de lipofilik toplam antioksidan kapasitesi (TAC) kolaylıkla tayin edilebilmektedir[18]. Bu spektrofotometrik metot, antioksidan çözeltisinin, bakır(ii)klorür çözeltisi, neocuproinin alkoldeki çözeltisi ve ph 7 amonyum asetat sulu tampon çözeltisi ile karıştırılması ve ardından oluşan Cu(I)-neocuproin kelatının absorbansının 450 nm de okunmasını içerir[19]. Antioksidan Miktarı=[A/ε q ] V s /V ö SF V e /m (2.3) Bu yöntem, demir (III) iyonu indirgeme kapasitesi cinsinden sonuç veren FRAP gibi yöntemlerden daha hızlıdır, çünkü FRAP yönteminin bazı antioksidanları reaksiyon süresince tam yükseltgeyemediği ve glutatyon gibi tiol tipi antioksidanları ölçemediği literatürden bilinmektedir. Ayrıca reaktif oldukça seçimlidir, çünkü redoks potansiyeli fenantrolin veya tripridiltriazin tipi ligantların varlığında ferriferro çiftinden daha düşüktür. 9

30 2.2.6 FOLIN-CIOCALTEU yöntemi Elektron transferine dayanan bu yöntem çok spesifik olmamasına rağmen toplam fenol miktarının belirlenmesinde iyi bir yöntemdir[20]. Elektron alkali ortamda fenolik bileşiklerden fosfomolibdic/fosfotungstic asit kompleksine transfer olur[21]. Folin-Ciocalteu(F-C) metodu polifenoller tarafından folin reaktifinin redüksiyonuna dayanan bir yöntemdir. Reaksiyon sonucu mavi renkli çözelti oluşur ve bu renkli çözelti 750 nm de maksimum absorpsiyona sahiptir. Antioksidan Miktarı=[A/ε q ] V s /V ö SF V e /m (2.4) Her bir örnekten x ml alınıp üzerine (2-x) ml su ilave edildi. Ardından Lowry C eklenip 10 dakika bekletildi. Süre sonunda karışıma 0,25 ml Folin rekatifi ilave edilip oluşan mavi rengin stabil kalması için 30 dakika beklendi. 750 nm'de referans çözeltiye karşı absorbanslar ölçüldü[22]. 2.3 Soğan Özellikleri ve Faydaları Allium, Alliaceae familyasına dahil olan ve soğan, sarımsak, pırasa gibi çok bilinen türleri içeren bir bitki cinsidir. Đçermiş olduğu 1250 kadar tür ile dünyanın en büyük bitki cinslerinden biri olan Allium, bazı sınıflandırmalarda Liliaceae familyasına dahil edilmiştir. Đçerdiği türler çok yıllık ve yumru gövdeli olup, tipik soğan ya da sarımsak koku ve tadını veren kimyasal bileşikler üretirler. Pek çoğu yenilebilir türdür[23]. Allium türleri esasen kuzey yarı kürenin ılıman iklimlerinde bulunur. Ancak, Allium juncifolium gibi Şili de, Allium sellovianum gibi Brezilya da ve Allium spathaceum gibi Afrika nın tropik bölgelerinde yetişenler de vardır. Soğan en yaygın olarak tüketilen sebzelerden biridir. Dünya çapında yıllık kişi başına yaklaşık 5,5 kg soğan tüketlmektedir[24]. Kuru soğanın biçimi, büyüklüğü, rengi ve tadı mevsime göre değişir. Yazlık ve kışlık olmak üzere iki gruba ayrılır. Soğanın özgün yakıcı lezzeti, bileşimindeki bol kükürtlü, uçucu yağdan ileri gelmektedir. Türkiyede soğan üretimi, büyük kentlerin çevresi ile orta Karadenizin iç kesimlerinde yoğunlaşmıştır. En çok kuru soğan üretimi yapılan iller arasında Bursa, 10

31 Amasya, Tekirdağ, Çorum, Gaziantep, Hatay ve Tokat gelir. Buralarda imralı kırması ve kantar topu gibi dayanıklı türlerle, tatlı soğan ve sarı soğan gibi dayanıksız türler yetiştirilir. Soğan, yapısında bol miktarda bulunan ve antioksidan özellik gösteren bileşikler sayesinde, yiyecek endüstrisinde son yıllarda büyük bir ilgi uyandırmıştır. Bazı çalışmalar, soğanın yapısındaki antioksidanların, yiyecek endüstrisinde kullanılan BHA(bütillenmiş hidroksianisol) ve BHT(bütillenmiş hidroksitoluen) gibi sentetik antioksidanlardan daha güçlü etkiye sahip olduğunu göstermiştir[25]. Soğan türlerinin, bazı kanser türleri ve kalp-damar rahatsızlıklarını önlediğini gösteren pek çok çalışma yapılmıştır. Soğanın kalp ve prostat bozukluğu, pankreas tembelliği, sinir hastalıkları, romatizma, cilt hastalıkları, cinsel iktidarsızlık, mide zayıflığı gibi hastalıkların tedavisinde etkili olduğu, bol idrar söktürdüğü ve vücutta birikmiş su ve üreyi dışarı atmada yardımcı olduğu bilinmektedir[26-27]. Bazı biyokimyasal araştırmalar, soğanın yapısında su, protein, yağ, karbonhidrat, az miktarda Ca, Fe, Zn elementleri, vitaminler ve farklı antioksidanlar bulunduğunu göstermiştir. Soğanın içeriğinde bulunan ana maddelerden biri de glukokinin dir. Glukokinin kandaki şeker oranını düşürür. Çok etkin bir antiseptik olan soğan, küçük kesiklerde, hafif yanıklarda ve iltihaplarda, suyunu sıkarak kullanabileceğiniz doğal bir ilaçtır. Vücudumuzda üretilen çok güçlü bir antioksidan olan Glutatyon`un üretimi için soğanın içinde bulunan sistein maddesinin soğan veya sarımsak yiyerek alınması gerekiyor. Çok kuvvetli bir antioksidan olan glutatyon, birçok hastalığın sebebi sayılan serbest radikalleri hücre içinde nötralize etmektedir Soğanın yapısındaki kimyasal bileşenler Soğanın yapısında flavonoidler ve alk(en)yl sisteik sülfoksitler(acsos) olmak üzere iki ana kimyasal grup bulunur[28]. Flavonoidlerin alt grubu olan antosiyaninler soğanın bazı türlerine kırmızı-pembe renklerini veriyorken, kuersetin ve onun türevleri gibi flavanoller soğanlara sarı ve kahverengi renklerini vermektedir. ACSOs soğanlara karakteristik lezzet ve koku veren maddelerdir. 11

32 Şekil 2.1 : Soğanın Yapısındaki Kimyasal Bileşenler 2.4 Flavonoidler Flavonoidler bir milyon yıldan daha uzun süredir pek çok meyve ve sebzede bulunan bileşiklerdir. Bu yüzden flavonoidler bol miktarda tüketilmektedir[29]. Flavonoidler vitamin P olarak bilinen antioksidanlardır. Çoğu doğada bulunan bu bileşikler 2-fenil-benzo-gama-pironunu basit yapısına sahiptirler. Bunların tamamının temel yapısında C 6 -C 3 -C 6 konfigurasyonunda dizilmis 15 karbon atomu vardır. Her bir halka A, B ve C olarak adlandırılır. Bu karbon atomlarının her biri bir numaralandırma sistemiyle numaralanır. A ve C halkaları için normal rakamlar kullanılırken, B halkası için üslü rakamlar kullanılır. Şekil 2.2 de flavonoidlerin temelini olusturan bir flavan çekirdeği görülmektedir. 12

33 Şekil 2.2 : Flavonoidlerin Basit Yapısı Heterosiklik halkalarındaki değişimler flavonoller, flavonlar, flavanonlar, antosiyanidinler ve isoflavonları verir. Literatürde 4000 nin üzerinde farklı flavonoid olduğu tespit edilmiştir[30]. Bir bileşik sınıfı olarak flavonoidler doğanın biyolojik yanıt düzenleyicileri olarak anılırlar. Bunun nedeni, kanıtlanmış anti-enflamatuar, anti-allerjik, anti-viral ve antikanserojenik özellikleri ile allerjenler, virüsler, karsinojenler gibi diğer bileşiklere karşı vücudun yanıtını düzenleme yeteneklerindendir. Buna ek olarak, flavonoidler oksidatif ve serbest radikal hasarına karşı belirgin koruma sağlayan güçlü antioksidanlardır. Bu antioksidan aktiviteleri ile ilgili görüş, 805 erkek üzerinde yapılan; besinle alınan flavonoidlerin kalp hastalıklarına karşı koruyucu etkisini inceleyen bir çalışmada gösterilmiştir. Çalışmada flavonoid alımı ile kalp krizine bağlı ölüm arasında ters bir ilişki olduğu ortaya konmuştur. Bu etki muhtemelen flavonoidlerin C ve E vitaminleri gibi kolesterolün oksidasyonundan koruyucu antioksidan etkilerinden kaynaklanabilir. Fakat flavonoidlerin antioksidan aktivitesi C ve E vitaminleri, Selenyum ve Çinko gibi geleneksel antioksidan besinlerle karşılaştırıldığında daha güçlüdür ve daha geniş bir oksidan grubuna karşı etkilidirler. Doğada ki flavonoidler polifenoliktir. Polifenoller, aromatik bir halka biçiminde bir veya daha çok hidroksil i geçici bir süre içeren maddelerdir. Fenolik bileşikler mükemmel oksijen radikal süpürücülerdir. Bunun sebebi fenolik radikalin redüksiyon potansiyelinin, oksijen radikalinin redüksiyon potansiyelinden çok daha düşük olmasıdır. Ayrıca, fenoksil radikalleri genellikle oksijen radikallerinden daha az reaktiftir. Bu yüzden, fenolik bileşikler reaktif oksijen ara ürünlerini daha ileri düzeyde oksidatif reaksiyonlar olmadan engelleyebilir[31]. Fenolik maddeler 13

34 genellikle suda çözünür ve sık sık glikozid gibi bir şeker ile birleşmiştir Flavonoidler, yapısı bilinen fenoliklerin binlerce büyük grubundandır. Bu bileşikler ortak olarak fenilbenzopiron yapısına sahiptir.[32] Flavonoid ailesi içerisinde flavonlar, flavanoller, isoflavonoller, flavonoller, flavononlar, flavononoller bulunmaktdır. Bol miktarda flavonid içeren besinler elma, çay, soğan, fındık, çilek, kiraz, karnabahar ve lahanadır. Şekil 2.3 : Flavonoid ailesinin kimyasal yapısı Quercetin ve özellikleri Quercetin, kimyasal yapı olarak rutin ve hesperidine benzeyen ve bitkilerde yaygın bulunan bir flavonoiddir. Soğanın içerisindeki ana flavonoid çok güçlü bir 14

35 antioksidan olan quercetindir[33]. Quercetin güçlü bir hidroksi antioksidandır ve ana besleyici flavonoiddir. Quercetin yapısında bulunan hidroksi ve okso gruplar çeşitli metal iyonları ile kompleks oluşturma yeteniğine sahiptir. Suda eser miktarda çözülebilen bioflavonoidler sınıfına ait Quercetin (3,3,4,5,7-pentahidroksiflavon), yenebilir meyve ve sebzeler dahil bir çok bitkide bulunmaktadır. Kırmızı sarap, greyfurt, soğan, elma, siyah çay ve az miktarlarda yapraklı yesil sebzelerde ve fasulyede bulunur. Quercetin bağısıklık hücrelerinde histaminin açığa çıkmasının engellenmesine yardımcı olur. Şekil 2.4 : Quercetin in kimyasal yapısı Quercetin nin en önemli görevi; metabolizmayı hızlandırmaktır. Bu sayede vücudunuzdaki yağları yakar ve toksinlerden arınmamızı sağlamaktadır. Flavonoid tüketiminin artması ile koroner kalp hastalığı görülmesi arasında ters bir iliski vardır. Japonya da yürütülen bir çalısmada quercetin alımının artmasıyla plazma total kolesterol ve LDL-kolesterol konsantrasyonlarının azaldığı görülmüstür. Finlandiya daki bir baska çalısmada ise quercetin den zengin elma ve soğan tüketimi arttığında koroner mortalite azalmıs olarak bulunmustur. Günümüzde kırmızı sarap, greyfurt, soğan, elma, siyah çay, ve az miktarlarda yapraklı yesil sebzelerde ve fasulyede çesitli bitki çaylarının içinde bulunan quercetin flavonoidlerin flavon grubunda olup, biyokimya, gıda kimyası, tıp ve ilaç yapımı alanlarında kullanılmaktadır. Genellikle bir çok bitkide farklı flavonoidlerle birlikte bulunur. En yüksek quercetin miktarına sahip sebzelerden biri soğandır[34]. Quercetin in vücutta histamin salıverilmesini inhibe ettiği bilinmektedir, yani bir anti-histaminik olarak iş görür. Bunun yanında aldoz redüktaz enziminin de güçlü inhibitörüdür. 15

36 16

37 3. DENEYSEL ÇALIŞMALAR 3.1 Kullanılan Araç Gereç ve Kimyasal Maddeler Varian Cary100 spektrofotometre, Edmund Bühler Tübingen çalkalayıcı, Magic Bullet blender, Bosch Mikro dalga fırın, Heraus Etüv ve çözeltilerin hazırlanmasında ependorf mikro pipet kullanılmıştır. Quercetin, Cerium(IV)sulfate tetrahydrate (Ce(SO 4 ) 2.4H 2 O), Sülfirik asit(h 2 SO 4 ), Etilalkol(C 2 H 5 OH), Neocuproin(2,9- dimethyl-1,10-phenanthroline), Amonyum Asetat(NH 4 CH 3 COO), Bakır(II) Klorür(CuCl 2 xh 2 O), Sodyum Karbonat(Na 2 CO 3 ), Sodyum Hidroksit(NaOH), Bakır Sülfat(CuSO 4 ), Sodyum Potasyum Tartarat(NaKC 4 H 4 O 6 ), Folin-Ciocalteau phenol reagent analitik saflıktaki kimyasallar kullanıldı. 3.2 Kullanılan Ana Çözeltilerin Hazırlanması x10-3 M ceryum(iv)sülfat çözeltisinin hazırlanması Yaklaşık 0,2 g Ce(SO 4 ) 2.4H 2 O tartılıp, önce az miktarda suda çözdükten sonra üzerine 41 ml derişik H 2 SO 4 ilave edip tamamen çözününceye kadar karıştırıldı. Tamamen çözündükten sonra 250 ml lik balon jojede saf su ile 250 ml ye tamamlandı Amonyum asetat tamponunun hazırlanması(ph=7) 19,27 g amonyum asetat tartılıp, su ile biraz çözüldükten sonra balon jojede 250 ml ye tamamlandı ,003 M neocuproin çözeltisinin hazırlanması 0,15 g neocuproin alınıp, alkolde biraz çözüldükten sonra balon jojede 250 ml ye etanol ile tamamlandı ,01 M CuCl 2.H 2 O çözeltisinin hazırlanması 0,4 g CuCl 2 tartılıp, su ile biraz çözüldükten sonra balon jojede 250 ml ye su ile tamamlandı. 17

38 3.2.5 Lowry A çözeltisinin hazırlanması %2 Na 2 CO 3 0,1M NaOH Đçerisinde hazırlandı. 2g Na 2 CO 3 100ml 0,1M NaOH içerisinde çözüldü Lowry B çözeltisinin hazırlanması %0,5 CuSO 4 %1 lik NaKC 4 H 4 O 6 içerisinde hazırlandı. 0,025 g CuSO 4 5mL %1 lik NaKC 4 H 4 O 6 içerisinde çözüldü Lowry C çözeltisinin hazırlanması 100 ml Lowry A+2 ml Lowry B karıştırılarak hazırlandı Folin-Ciocalteu reaktifinin hazırlanması Reaktif su ile 1:3 oranında seyreltilir. Reaktif çözeltisi günlük olarak hazırlandı.3ml reaktif alınıp, toplam 9 ml olarak şekilde saf su ilave edildi ,001 M quercetin çözeltisinin hazırlanması 0,0084 g quercetin etanol ile biraz çözüldükten sonra, 25 ml lik balon jojede etanol ile hacme tamamlandı. 3.3 Soğan Ekstraktlarının Hazırlanması Kırmızı, beyaz, sarı ve taze yeşil soğan marketten alındı. Her bir soğan örneği rondoda parçalandıktan sonra 5 g tartılıp, iki ayrı erlene alındı. 50 ml saf su ve etanol ilave edilip yarım saat çalkalıyıcıda dakikada 350 rpm hızla çalkalandı. Süre sonunda çözelti Whatman tipi süzgeç kağıdından süzüldü. Mikrodalga ve etüvde olmak üzere iki farklı ısıtma işlemi uygulanan soğan örneklerinin ekstraktları ise şu şekilde hazırlandı; rondoda parçalanan soğan örneklerinden 5 g alınarak, örnekler mikrodalgada 90 W de 1, 2 ve 4 dakika süre ve etüvde 50 0 C de 1, 2 ve 4 saat bekletildi. Isıtılmış soğan örnekleri üzerine 50 ml saf ilave edilip yarım saat çalkalıyıcıda dakikada 350 rpm hızla çalkalandı ve çözeltiler whatman tipi süzgeç kağıdından süzüldü. 18

39 3.4 Uygulanan Yöntemler ve Kalibrasyon Grafiklerinin Çizimi Cerac yöntemi ile quercetin kalibrasyon grafiği Konsantrasyon değerleri M arasında olacak şekilde bir seri quercetin çözeltisi hazırlandı. Bunun üzerine 1 ml M Ce(IV) çözeltisi eklenip 10 ml ye saf su ile tamamlandı. Ağzı kapalı olarak 30 dakika bekletildikten sonra 320 nm de absorbans değerleri referans suya karşı ölçüldü. Ölçülen absorbans değerleri ve quercetin konsantrasyonları arasında kalibrasyon grafiği çizildi. Ölçüm iki kez tekrarlanarak bulunan Quercetin molar absorpsiyon katsayıları ve ortalama değeri çizelge 3.1 de verilmiştir. A y = x R² = y = x R² = C Quercetin x 10 5 (mol/ L) Şekil 3.1 : Ce(IV) Quercetin reaksiyonu için kalibrasyon grafiği Çizelge 3.1 : Quercetin molar absorpsiyon katsayıları Deney No Molar Absorpsiyon Katsayısı (mol -1 L cm -1 ) Ortalama Cuprac yöntemiyle quercetin kalibrasyon grafiği Deney tüplerine hazırlanan reaktif çözeltilerinden 1 ml alındı(1ml bakır klorür çözeltisi+1ml neocuproin çözeltisi+1ml amonyum asetat çözeltisi). Üzerlerine 19

40 değişen miktarlarda saf su ilave edilip, toplam hacim 4,1 ml olacak şekilde quercetin çözeltisi eklendi. Örnekler yarım saat bekletildikten sonra 450 nm de reaktif körüne karşı absorbans değerleri ölçüldü. Ölçüm dört kez tekrarlanarak bulunan quercetin molar absorpsiyon katsayıları ve ortalama değeri çizelge 3.2 de verilmştir. Cuprac yönteminde bis(neocuproin)-bakır(ii) klorür kompleksi kullanılmaktadır. Cu(II)-Nc kompleksi Ar(OH)n grubu antioksidan bileşiklerle reaksiyona girerek renk oluşumu ile birlikte 450nm de absorbans veren Cu(I)-Nc kelatına dönüşmektedir. A y = 73880x y = 75530x y = 73486x y = 74716x C Quercetin x 10 5 (mol/l) Şekil 3.2 : Quercetin ve bis(neocuproin)-bakır(ii) klorür için kalibrasyon grafiği Çizelge 3.2 : Quercetin molar absorpsiyon katsayıları Deney No Molar Absorpsiyon Katsayısı (mol -1 L cm -1 ) Ortalama Folin yöntemiyle quercetin kalibrasyon grafiği 0,001M Quercetin çözeltisinden 0,1-0,5 ml arasında değişen miktarlarda alındı. Üzerine toplam hacim 2 ml olacak şekilde su ilave edildi. Ardından Lowry C eklenip 10 dakika bekletildi. Süre sonunda karışıma 0,25 ml Folin reaktifi ilave edilip oluşan mavi rengin stabil kalması için 30 dakika beklenildi. 750 nm'de referans çözeltiye karşı absorbanslar ölçüldü. Ölçüm dört kez tekrarlanarak bulunan quercetin molar absorpsiyon katsayıları ve ortalama değeri çizelge 3.3 de verilmiştir. 20

41 Şekil 3.3 : Quercetin ve Folin reaktifi için kalibrasyon grafiği Çizelge 3.3 : Quercetin molar absorpsiyon katsayıları Deney No Molar Absorpsiyon Katsayısı (mol -1 L cm -1 ) Ortalama Analiz Yöntemlerinin Soğan Ekstraklarına Uygulanması Sarı, kırmızı, beyaz soğan, taze yeşil soğan yaprakları, taze yeşil soğanın kök kısımları ekstraktlarına Cerac yönteminin uygulanması Deney tüplerine ml arasında değişen saf su ve etanolde hazırlanan soğan ekstraktları konuldu. Üzerine 1 ml M Ce(IV) çözeltisi ekleyip 10 ml ye saf su ile tamamlandı. Ağzı kapalı olarak yarım saat bekletildi. Absorbans değerleri 320 nm de saf suya karşı ölçüldü. Ce(IV) ün başlangıç ve reaksiyon sonrası ölçülen absorbansları arasındaki fark soğanda bulunan toplam antioksidan miktarının ölçüsüdür. Örneklerin her biri için quercetin cinsinden antioksidan miktarı aşağıdaki denklem yardımıyla hesaplandı(2.5). 3 farklı tartım ile saf su ve etanolde hazırlanan soğan ekstraktlarının sonuçlarının ortalaması çizelge 3.4 de verilmiştir. 21

42 Toplam Antioksidan Miktarı (TAM) = [A 0 -A 1 /ε q ] V s /V ö SF V e /m (2.5) TAM=[( A 0- A 1 )/ε q ]x sulu ekstrakt toplam hacmi/örnek ağırlık (g) TAM=Toplam Antioksidan Miktarı A 0 =Ce (IV) ün, başlangıçtaki absorbansı ( λ=320 nm) A 1 =Ce (IV) ün, soğan ekstraktı ilave edildikten sonraki absorbansı ( λ=320 nm) ε q = Quercetin molar absorpsiyon katsayısı (L mol -1 cm -1 ) Şekil 3.4 ve 3.5 te saf su ve etanolde hazırlanan soğan ekstraktlarına uygulanan CERAC yönteminin sonucu çizilen kalibrasyon grafikleri gösterilmiştir. A Sarı Soğan Kırmızı Soğan Beyaz Soğan Yeşil Soğan Yaprak Yeşil Soğan Kök Örnek Hacmi (V ö ;ml) Şekil 3.4 : M Ce(IV) çözeltisi ile saf sulu soğan ekstraktlarıının reaksiyonları sonucu azalan Ce(IV) miktarının 320 nm deki absorbans değerleri 22

43 A Sarı Soğan Kırmızı Soğan Beyaz Soğan Yeşil Soğan Yaprak Yeşil Soğan Kök Örnek Hcmi( V ö ;ml) Şekil 3.5 : M Ce(IV) çözeltisi ile etanoldeki soğan ekstraktlarının reaksiyonları sonucu azalan Ce(IV) miktarının 320 nm deki absorbans değerleri A ceryum çözeltisi 0,2 ml soğan çözeltisi 0,4 ml soğan çözeltisi 0,8 ml soğan çözeltisi 1,6 ml soğan çözeltisi 2 ml soğan çözeltisi 3 ml soğan çözeltisi 4 ml soğan çözeltisi Dalga Boyu(nm) Şekil 3.6 : M Ce(IV) çözeltisi ile saf sudaki yeşil soğan-kök kısmı ekstraktının reaksiyonu sonucu oluşan çözeltinin nm arasındaki absorpsiyon spektrumu Şekil 3.6 da soğan örneklerine uygulanan CERAC yönteminin absorpsiyon spektrumları görülmektedir. Şekil 3.6 de görülen spektrumda max. absorpsiyon dalga boyu 320 nm dir. Bu absorbans M Ce(IV) çözeltisine aittir. Ce(IV) çözeltisi üzerine 0,1-4 ml arasında değişen değerlerde soğan çözeltisi eklendikçe artan antioksidan miktarına bağlı olarak 320 nm deki absorbans değeri düşmüştür. 23

44 Absorpsiyon spekturumunda görüldüğü gibi 0,4 ml soğan çözeltisi eklendiği noktada Ce(IV) miktarında en fazla azalma gözlenmektedir. Çizelge 3.4 : Cerac yötemi ile yapılan soğan ekstraktlarının analizi Örnek Beyaz Soğan Ekstraksiyon Yöntemi(mmol quercetin/g yaş soğan ekstraktı) Saf Su Etanol 2, , Sarı Soğan Kırmızı Soğan Taze Yeşil Soğan-Yaprak Taze Yeşil Soğan-Kök 3, , , , , , , , Her örnek için üç kez ekstraksiyon ve her ekstraksiyon çözeltisi içinde on ölçüm yapıldı. Yukarıdaki tabloda ortalama değerler verildi Sarı, kırmızı, beyaz soğan, taze yeşil soğan yaprakları, taze yeşil soğanın kök kısımları ekstraktlarına Cuprac yönteminin uygulanması Deney tüplerine toplam 3 ml olacak şekilde reaktif çözeltilerinden alındı (1ml bakır klorür çözeltisi+1ml neocuproin çözeltisi+1ml amonyum asetat çözeltisi). Üzerlerine önce saf su daha sonra soğan ekstraktı(0,1-1ml) toplam hacim 4,1 ml olacak şekilde eklendi. Örnekler yarım saat bekletildikten sonra 450 nm de reaktif körüne karşı absorbans değerleri ölçüldü. Örneklerin her biri için quercetin cinsinden antioksidan miktarı hesaplandı. 3 farklı tartım ile saf su ve etanolde hazırlanan soğan ekstraktlarının sonuçlarının ortalaması çizelge 3.5 de verilmiştir. Şekil 3.7 de saf su ile hazırlanan soğan ekstraktlarına CUPRAC yönteminin uygulanması ile çizilen kalibrasyon grafiği gösterilmiştir. 24

45 A Örnek Hacmi(V ö ; ml) Sarı Soğan Kırmızı Soğan Beyaz Soğan Yeşil Soğan Yaprak Yeşil Soğan Kök Şekil 3.7 : Saf sudaki soğan çözeltilerinin bis(neocuproin)-bakır(ii) klorür ile reaksiyonu sonucu oluşan komplekslerin 450 nm deki absorbans değerleri ile örnek hacmi arasında çizilen kalibrasyon grafiği A Dalga Boyu(nm) 0,1 ml soğan çözeltisi 0,2 ml soğan çözeltisi 0,4 ml soğan çözeltisi 0,6 ml soğan çözeltisi 0,8 ml soğan çöeltisi 1 ml soğan çözeltisi Şekil 3.8 : Neocuproin reaktifi ile Beyaz Soğanın sulu ekstraktının reaksiyonu sonucu oluşan çözeltilerin nm arasında absorpsiyospektrumları Şekil 3.8. deki absorpsiyon spektrumunda artan madde miktarına bağlı olarak absorpsiyon şiddetinin arttığı görülmektedir. Cuprac yönteminde bis(neocuproin)- bakır(ii) klorür kompleksi kromofor olarak kullanılmaktadır. Cu(II)-Nc kompleksi Ar(OH)n grubu antioksidan bileşiklerle reaksiyona girerek renk oluşumu ile birlikte 450nm de absorbans veren Cu(I)-Nc kelatına dönüşmektedir. 25

46 Çizelge 3.5 : Cuprac yötemi ile yapılan soğan ekstraktlarının analizi Örnek Beyaz Soğan Ekstraksiyon Yöntemi(mmol quercetin/g yaş soğan ekstraktı) Saf Su Etanol 1, , Sarı Soğan Kırmızı Soğan Taze Yeşil Soğan-Yaprak 2, , , , , , Taze Yeşil Soğan-Kök 3, , Her örnek için üç kez ekstraksiyon ve her ekstraksiyon çözeltisi içinde altı ölçüm yapıldı. Yukarıdaki tabloda ortalama değerler verildi Sarı, kırmızı, beyaz soğan, taze yeşil soğan yaprakları, taze yeşil soğanın kök kısımları ekstraktlarına Folin yönteminin uygulanması Hazırlanan soğan ekstraktlarından x ml alınıp,üzerlerine (2-x) ml olacak şekilde saf su eklendi. 2,5 ml Lowry C reaktifi ilave edildikten sonra 10 dk. bekletildi. Süre sonunda 0,25 ml Folin reaktifi eklenip oluşan mavi rengin stabil kalması için 30 dakika beklendi. 750 nm de referans çözeltiye karşı absorbanslar ölçüldü. Antioksidan sonuçlarını quercetin cinsinden vermek üzere quercetinin molar absorpsiyon katsayısı kullanıldı. 3 farklı tartım ile saf su ve etanolde hazırlanan soğan ekstraktlarının sonuçlarının ortalaması çizelge 3.6 da verilmiştir. Şekil 3.9 da sarı soğanın saf sudaki çözeltisine uygulanan FOLĐN yöntemi sonucu çizilen kalibrasyon grafiği ve şekil 3.10 da absorpsiyon spektrumları görülmektedir. 26

47 A Örnek Hacmi(V ö ;ml) Şekil 3.9 : Saf sudaki sarı soğan ekstraktı ile Folin reaktifinin reaksiyonu sonucu oluşan reaktifin 750 nm deki absorbans değerleri ile örnek hacmi arasında çizilen kalibrasyon grafiği Şekil 3.9 : Şekil 3.10 : Folin reaktifi ile sarı soğanın sulu ekstraktının reaksiyonu sonucu oluşançözeltilerin nm arasındaki absorpsiyon spektrumları 27