ÖZET Yüksek Lisans Tezi Salmonella Typhimurium da stj FİMBRİYAL OPERONU AKTİVE EDİLMİŞ MUTANTLARIN GENETİK ANALİZİ Deniz YÜKSEL Ankara Üniversitesi Fe

Transkript

1 ANKARA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ Salmonella Typhimurium da stj FİMBRİYAL OPERONU AKTİVE EDİLMİŞ MUTANTLARIN GENETİK ANALİZİ Deniz YÜKSEL BİYOLOJİ ANABİLİM DALI ANKARA 2010 Her hakkı saklıdır

2 ÖZET Yüksek Lisans Tezi Salmonella Typhimurium da stj FİMBRİYAL OPERONU AKTİVE EDİLMİŞ MUTANTLARIN GENETİK ANALİZİ Deniz YÜKSEL Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Biyoloji Anabilim Dalı Danışman: Prof. Dr. Mustafa AKÇELİK stj fimbriyal operonunun in vitro koşullarda ifadesinin tanımlanması amacı ile stje::laczya füzyonu içeren Salmonella Typhimurium LT2 mutantı (MA2) kullanıldı. T-POP transpozonu ile gerçekleştirilen mutasyonel çalışmalar sonucu stj fimbriyal operonu ifade edilen mutantların seçiminde stj operonu içine füzyonu yapılan laczya genlerinin fenotipik özelliğinden yararlanıldı. Bu mutantlardan yüksek β-galaktozidaz aktivitesi belirlenenlerde T-POP giriş bölgesi ters yön PZR yöntemi kullanılarak çoğaltıldı ve PZR ürünleri, DNA dizi analizine tabi tutuldu. DNA dizi analizleri sonucu, T-POP olası giriş bölgeleri (olası stj regülatör genleri) çoklu ilaç dirençlilik gen bölgesi regülatörü (mdr), transkripsiyonel bir global regülatör olan cadc, bir diğer transkripsiyonel regülatör LysR ve H-NS genleri ile homoloji vermiştir. DNA dizi analizinden elde edilen bulgular, DNA veritabanları, proteomik çalışmalar ile birlikte yorumlandığında; stj fimbriyal operonunun H-NS ve LysR ailesi transkripsiyonel regülatörler tarafından koordineli bir şekilde negatif regülasyona tabi tutulduğu sonucuna varılmıştır. Temmuz 2010, 85 sayfa Anahtar Kelimeler : Salmonella Typhimurium, stj operonu, mutasyon, aktivasyon i

3 ABSTRACT Master Thesis GENETIC ANALYSIS OF stj FIMBRIAL OPERON ACTIVATED MUTANTS IN Salmonella Typhimurium Deniz YÜKSEL Ankara University Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Biology Supervisor: Prof. Dr. Mustafa AKÇELİK Salmonella Typhimurium LT2 mutant (MA2), which contains stje::laczya fusion, was used to identify in vitro expression conditions of stj fimbrial operon. Phenotypic characteristics of laczya genes that are fused in stj fimbrial operon were used for selection of mutants, whose stj fimbrial operon was expressed as a result of T-POP transposon mutation. Among these mutants, inverse PCR analyses and sequencing of PCR products were performed at which exhibit high β-galactosidase activity. As a result of DNA sequence analysis, T-POP entry sites (possible stj regulator genes) shown similarity with the regulator of multi-drug resistance gene (mdr), global transcriptional regulator cadc, another transcriptional regulator LysR and H-NS genes. These findings, obtained from DNA sequence analysis, were interpreted with DNA database and proteomic analyses and it was concluded that stj fimbrial operon is subjected to coordinated negative regulation of H-NS and LysR family transcriptional regulators. July 2010, 85 pages Key Words: Salmonella Typhimurium, stj operon, mutation, activation ii

4 TEŞEKKÜR Yüksek lisans eğitimim boyunca bana emek veren, çalışmalarımın her aşamasında her türlü desteği, anlayışı gösteren ve her zaman yanımda olan sevgili danışman hocam Prof. Dr. Mustafa AKÇELİK e (Ankara Üniversitesi, Fen Fakültesi, Biyoloji Bölümü) Yardıma her ihtiyaç duyduğumda yanımda olan ve bana destek veren biricik hocam, çalışma arkadaşım Arş. Gör. Nefise AKKOÇ a, çalışmaya birlikte başladığım sevgili arkadaşım Uzman Biyolog Meral KAYA ya, yanımda olarak bana destek veren A. Cüneyt ERTUĞAL a, tüm çalışma arkadaşlarıma, Bu günlere gelmemi sağlayan, beni her durumda destekleyen ve yanımda olan anneme ve babama, Yüksek lisans öğrenimim süresince sağladığı yüksek lisans bursu ile destek olan TÜBİTAK-BİDEB e, Sonsuz teşekkürlerimi sunarım. Deniz YÜKSEL Ankara, Temmuz 2010 iii

5 İÇİNDEKİLER ÖZET... i ABSTRACT ii TEŞEKKÜR iii SİMGELER DİZİNİ.. vi ŞEKİLLER DİZİNİ.. viii ÇİZELGELER DİZİNİ ix 1. GİRİŞ..,,,,,, KAYNAK ÖZETLERİ Salmonella Cinsinin Genel Özellikleri Salmonella Patojenitesinin Temel Mekanizmaları Salmonella nın Sahip Olduğu Virülens Faktörler Fimbriyalar stj fimbriyal operonu ve patojenitedeki rolü Salmonella da Virülens Faktörlerin Regülasyonunda Rol Görev Alan Global Regülatör Sistemleri ppgpp sistemi Cad sistemi Csr sistemi SirA/BarA sistemi RpoS sistemi PhoP/PhoQ sistemi OmpD/EnvZ regülatör sistemi LysR-Tip transkripsiyonel regülatör sistemleri MATERYAL VE YÖNTEM Materyal Mikroorganizmalar Mikroorganizmaların saklama koşulları ve besiyeri Çözeltiler Primerler Antibiyotikler 31 iv

6 3.2 Yöntem S. Typhimurium da P22 faj lizatlarının hazırlanması ve faj titresinin yükseltilmesi T-POP transpozonunu içeren P22 faj lizatlarının hazırlanması T-POP transpozon mutasyonu β-galaktozidaz testi Genomik DNA izolasyonu Ters yön polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) cadc gen bölgesinin çoğaltılması Antimikrobiyel duyarlılığın belirlenmesi Bradford yöntemi ile protein miktar tayini Sodyum Dodezil Sülfat (SDS) iki yönlü jel elektroforezi MALDİ-Tof Analizi ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Transpozon Mutasyonu Yöntemi ile stj Fimbriyal Operonunun İfadesinin Sağlanması Mutantlarda T-POP Transpozonunun Genoma Giriş Bölgesinin Belirlenmesi Çoklu İlaç Dirençlilik Regülatörünün stj Fimbriyal Operonu Üzerine Etkilerinin Araştırılması CadC Regülatörünün stj Fimbriyal Operonu Üzerine Etkisinin Araştırılması stj Fimbriyal Operonunun İfadesi Üzerine LysR ve H-NS Regülatör Proteinlerinin Etkisinin Belirlenmesi SONUÇ 67 KAYNAKLAR 68 EK (Ters Yön PZR Veri Analizi Sonuçları) ÖZGEÇMİŞ 85 v

7 KISALTMALAR DİZİNİ ACN Asetonitril AK Amikasin APS Amonyumpersülfat bç Baz çifti BSA Sığır serum albumini C Santigrat Da Dalton DNA Deoksiribonükleik asit dntp Deoksinükleotidtrifosfat EDTA Etilen Diamin Tetraasetik Asit g Gram GEN Gentamisin HTH Heliks-dönüş-heliks IS İnsersiyon sekansı KAN Kanamisin kda Kilodalton LB Luria Bertani LDC Lisin dekarboksilaz LPS Lipopolisakkarit Lys Lisin µg Mikrogram µl Mikrolitre µm Mikrometre mg Miligram ml Mililitre mm Milimolar mm Milimetre NEO Neomisin PZR Polimeraz zincir reaksiyonu vi

8 S. Salmonella SDS Sodyum dodesil sülfat SPI Salmonella patojenite adası STR Streptomisin TAE Tris Asetat Etilen Diamin Tetraasetik Asit TE Tris Etilen Diamin Tetraasetik Asit Tet Tetrasiklin TFA Trifloroasetik asit TTSS Tip 3 Salgı sistemi UV Ultraviole WHO Dünya sağlık örgütü vii

9 ŞEKİLLER DİZİNİ Şekil 4.1 stj fimbriyal operonu aktive edilen mutantlarda ters yön PZR analizi Şekil 4.2 Doğal suş ve mutantlarda çogaltılan cadc gen bölgesi Şekil numaralı mutatın SDS-iki yönlü jel elektroforezi ile belirlenen toplam protein profilleri Şekil 4.4 S. Typhimurium LT2 suşunun SDS-iki yönlü jel elektroforezi ile belirlenen toplam protein profilleri Şekil numaralı mutanta ait tripsin enzim kesimi sonucu stjb ile ortak olan peptitler 54 Şekil 4.6.a Kontrol olarak kullanılan S. Typhimurium LT2 suşu, b. 20 numaralı mutanta ait SDS-iki yönlü jel elektroforezi ile belirlenen stjb ve cadc protein spotları.. 56 Şekil 4.7.a Kontrol suş olarak kullanılan S. Typhimurium LT2 suşu, b. 20 numaralı mutanta ait SDS-iki yönlü jel elektroforezi ile belirlenen sira protein spotlar Şekil 4.8 S. Typhimurium LT2 suşuna ait tripsin enzim kesimi sonucu sira proteini ile ortak olan peptitler Şekil numaralı mutanta ait tripsin enzim kesimi sonucu sira proteini ile ortak olan peptitler Şekil numaralı mutanta ait tripsin enzim kesimi sonucu cadc proteini ile ortak olan peptitler Şekil 4.11.a Kontrol suş olarak kullanılan S. Typhimurium LT2, b. 20 numaralı mutanta ait SDS-iki yönlü jel elektroforezi ile belirlenen ybdh protein spotu Şekil 4.12 S. Typhimurium suşuna ait tripsin enzim kesim sonucu ybdh proteini ile ortak olan peptitler viii

10 ÇİZELGELER DİZİNİ Çizelge 3.1 Çalışmada kullanılan primerler ve sekansları Çizelge 3.2 Çalışmada kullanılan antibiyotik diskleri ve konsantrasyonları Çizelge 4.1 Füzyon suş ve mutantların β-galaktozidaz aktiviteleri. 42 Çizelge 4.2 S. Typhimurium LT2 suşu ve 20 numaralı mutantın antibiyotik duyarlılıkları 48 Çizelge 4.3 Farklı ph değerlerinde füzyon suşun ve transpozon mutantlarının β-galaktozidaz aktiviteleri.. 50 ix

11 1.GİRİŞ Salmonelloz tüm dünyada gıda kökenli hastalıkların en önemlilerinden biridir. Hastalık etmeni olan Salmonella enterica türü gastroenteritin en önemli ajanlarından biri olan Typhimurium ile birlikte 2500 ün üzerinde serovaryete içermektedir. Bakteriyel enfeksiyonun başlamasında ilk aşama patojenin konakçı epitel hücrelere tutunmasıdır. Özgül tutunma, bakteriyel yüzeyler ile konakçı dokular arasında meydana gelen bağlanıcı-almaç bölgelerin tamamlayıcı ilişkisi ile gerçekleşmektedir. Bakterilerin yüzeyinde bulunan protein yapıdaki tutunma organalleri (fimbriya) söz konusu tutunmanın başlıca ajanıdır. Salmonella cinsinin de dahil olduğu Enterobacteriacea ailesinin birçok üyesinde en yaygın bulunan tutunma organeli Tip I fimbriya olarak adlandırılmaktadır. Tip I fimbriya; eritrositler, lökositler, ince bağırsak sistem hücreleri, protozoonlar, mayalar, küf hifleri ve bitki kök saçaklarına tutunma yeteneği içermektedir. Genetik analizler sonucu, Salmonella serovaryetelerinde ayrıca 12 fimbriyal operonun daha varlığı tespit edilmiştir. Bu fimbriyaların yalnız iki adetinin in vitro koşullarda üretildiği belirlenmiştir. Bunlar Tip I fimbriya (fim) ve ince agregatif fimbriyadır (agf). Diğer yaygın Salmonella fimbriyaları içerisinde yer alan plazmid kodlu fimbriyanın (pef) ve uzun polar fimbriyanın (lpf) heterolog konakçılarda ifadesinin sağlanması nedeni ile konakçı hedef hücrelere bağlanma karakteristikleri ve patojenitede oynadıkları rol detaylı bir şekilde tanımlanmıştır. Diğer dokuz Salmonella fimbriyasının in vitro koşullarda üretilememesi nedeni ile tutunma ve kalıcılıkta oynadıkları roller üzerinde çok az bilgi bulunmaktadır. Salmonella da tespit edilen fimbriyal operonların evrimsel açıdan en ilginç olanı, 2500 serovaryete içerisinde yalnız S. Typhimurium da bulunan stj fimbriyal operonudur. Yalnız DNA dizi analizleri sonucu elde edilen verilerin veritabanında değerlendirilmesi sonucu fimbriyal yapılar ile kısmi uyumu tanımlanan bu operonun ifadesi ve regülasyonu üzerinde herhangi bir bilgi bulunmamaktadır. Sadece araştırma grubumuz tarafından yapılan çalışmada stj fimbriyasının fare model sistemlerde S. Typhimurium 1

12 un kalıcılığında rol oynadığı ve dolayısı ile bu serovaryete için konakçı hedef hücrelere tutunmada etkin bir ajan olduğu tanımlanmıştır (Akkoç vd. 2009). Bu araştırmada stj fimbriyal operonunun S. Typhimurium un patojenitesinde oynadığı rolün detaylandırılmasına olanak sağlayacak çalışmaların önünü açmak amacıyla, söz konusu operonun regülasyon karakteristiklerinin belirlemesi amaçlanmıştır. 2

13 2. KAYNAK ÖZETLERİ 2.1 Salmonella Cinsinin Genel Özellikleri Salmonella, adını bulucusu olan Dr. Daniel Salmon dan alan Gram-negatif, çubuk şeklinde, spor oluşturmayan, fakültatif anaerob, Enterobacteriaceae familyasına ait bir cinstir (Brenner vd. 2000). Salmonella enterica serovar Pullorum ve Salmonella enterica serovar Gallinarum hareketini, sahip olduğu flagella ile sağlar. Hareketsiz olan suşlar etkin olmayan flagellaya sahiptir. Salmonella nın üreme sıcaklığı 2-47 C arasındadır. Hızlı üreme 25 C ile 43 C arasında meydana gelmektedir. Üreme için gerekli optimum ph 6.5 ile 7.5 arasındadır. % 3 ve üzerindeki NaCl konsantrasyonu genellikle üremeyi inhibe etmektedir (D Aoust vd. 2001). Salmonella nın sınıflandırması karmaşık ve tartışmalıdır. Salmonella cinsi; S. enterica, S. bongori ve S. subterranea olmak üzere üç tür içermektedir. S. enterica türü ise; S. enterica subsp. enterica, salamae, arizonaei, diarizonae, houtenae ve indica olarak adlandırılan altı alt türe ayrılmıştır (Fluit 2005). Adlandırmada meydana gelen karışıklıktan kaçınmak için serovaryete adlarının ilk harfi büyük yazılmakta ve italik olmamaktadır (Örn; Salmonella enterica subspecies enterica serovar Enteritidis). Kısa yazımda cins adını takiben doğrudan serovaryete adı yazılmaktadır (Salmonella Enteritidis) (Brenner vd. 2000, Ohl ve Miller 2001). Salmonella nın serotiplendirmesi veya antijenik sınıflandırması; bakterinin yüzey antijenleri ile antikor etkileşimi sonucu saptanan reaksiyon tipine göre yapılmaktadır. Spesifik serovaryetelerde LPS O-, flagellar H-, ve polisakkarit V i - antijenlerinin immünolojik olarak farklı kombinasyonları tanımlanmıştır. Bunun sonucu olarak 2500 ün üzerinde Salmonella serovaryetesi izole edildikleri konakçıların veya şehirlerin isimleriyle adlandırılmıştır (Brenner vd. 2000, Santos vd. 2002). Büyük bir çeşitlilik gösteren Salmonella serovaryeteleri tüm dünyada geniş bir dağılıma sahiptir. Bazı Salmonella serovaryeteleri konakçı spesifiktir. Örneğin; S. Pullorum 3

14 kümes hayvanlarında, S. Cholerasuius domuzlarda, S. Dublin büyükbaş hayvanlarda görülmektedir. Diğer yandan S. Typhimurium gibi bazı serotipler oldukça geniş konakçı çeşitliliğine sahiptir. Salmonella neredeyse tüm hayvan sınıflarından izole edilebilmektedir. Salmonella nın bu geniş yayılımı bakterinin farklı çevrelere kolay uyum sağladığına işaret etmektedir (Fredorka-Cray ve Wray 2000, Santos 2003). Patojenik Salmonella türleri bulaşıcı hastalıklara sebep olmaları nedeniyle dünya çapında önemli bir risk grubu olarak değerlendirilmektedir. Organizmaların taşınması fekal-oral yolla olmakta ve tifo ateşinden gastroenterite kadar çeşitli enfeksiyonlara yol açmaktadır. Zorunlu insan patojeni S. Typhi, dünya çapında her yıl 16 milyon sıklığa sahip ve 600,000 ölümle sonuçlanan sistemik bir hastalık olan tifo ateşine neden olmaktadır. İnsan populasyonunda Salmonella kaynaklı hastalıklar, genellikle gelişmekte olan ülkelerde su ve besin kaynaklarının iyi arıtılmaması sonucunda ortaya çıkmaktadır. Hastalığın yayılmasını önlemede temel yaklaşım; antibiyotik tedavisi yanında temizlik koşullarının iyileştirilmesini içermektedir. Bununla birlikte, antibiyotik dirençli Salmonella türlerinin enfeksiyonlarının ortaya çıkması, tedavide büyük sorunlar yaratmaktadır (WHO 1997, Jones 2005). Salmonella sadece dünya çapında halk sağlığını tehdit etmeye devam etmesi açısından değil, bakteriyel patojenitenin temel mekanizmalarını çalışmak için verimli bir model sistem olması bakımından da önem taşımaktadır. Moleküler genetik yöntemlere iyi yanıt vermesi ve insanlarda görülen tifo ateşinin fare modellerindekine benzemesi nedeniyle, neredeyse tüm Salmonella patojenitesi çalışmalarında S. Typhimurium kullanılmaktadır (Ohl ve Miller 2001, Santos vd. 2001, Jones 2005). 2.2 Salmonella Patojenitesinin Temel Mekanizmaları Salmonella enfeksiyonuyla ilgili başlıca klinik sendromlar tifo ateşi ve gastroenterittir. Tifo ateşi, yalnız insan patojenleri olan S. Typhi ve S. Paratyphi ile bulaşı sonucu oluşan sistemik hastalıktır. Tersi bir durum olarak S. Enteritidis ve S. Typhimurium gibi tifoid 4

15 olmayan Salmonella suşları geniş konakçı dizgesine sahiptirler (Miller ve Pegues 2000, Ohl ve Miller 2001). Hastalık sürecinde ilk basamak duyarlı konakçıya geçiştir. Salmonella için bu durum genellikle kontamine gıdaların tüketimiyle olmaktadır. Yapılan çalışmalarla enfeksiyonun başlaması için bakterinin gerekliliği hesaplanmıştır (McCulloug ve Eisele 1951, Glaser ve Newman 1982, Ohl ve Miller 2001). Gıda ile alınan suşların virülansı ve ayrıca konakçının fiziksel durumu da hastalık için önemlidir. Genellikle, mide asiditesinin üstesinden gelmek ve bağırsak sistemindeki normal florayla yarışabilmek için fazla miktarda bakterinin alınması gerektiğine inanılmaktadır. Bunu destekleyen çok sayıda kanıt vardır. Yiyeceklerle tüketilen Salmonella nın bulaşıcı dozu arttıkça mideden geçişi hızlanmaktadır. Ayrıca yemekler bu durumda mide asiditesinin etkisini düşürmektedir (örneğin; peynir, süt) (Tauxe ve Pavia 1998, Santos 2002). Özellikle yaşlılardaki yüksek gastrik ph, enfeksiyon duyarlılığını arttırmaktadır. Diğer yandan, farelere önceden streptomisin muamelesi yapılması normal flora miktarını düşürmekte ve bu durum farelerin % 50 sinde enfeksiyon için gerekli Salmonella dozunu azaltmaktadır (Bohnhoff vd. 1964, Voino-Yasenetsky 1977, Ryan 1987, Santos 2003). Antibiyotik muamelesinin benzer etkileri insanlarda da saptanmıştır. Gastrik ph yı arttıran koşullar Salmonella enfeksiyonunun dozunu düşürmektedir. Bu durum, gastrik asiditenin enfeksiyon için önemli bir ön bariyer olduğunu göstermektedir. Diğer yandan Salmonella lar düşük ph ya maruz kalma sonucunda mide gibi asidik çevrelerde hayatta kalmayı yöneten adaptif asit tolerans cevabı da oluşturabilmektedir (Gianella vd. 1972, Garcia-del Portillo vd. 1993, Darwin ve Miller 1999, Zhang 2003). Patojen; ince bağırsağa girişinin ardından, bağırsak epitel hücrelerine ulaşmak için önce bağırsak mukoza tabakasını geçmek zorundadır. Salmonella lar epitel hücrelere tutunma yeteneğine katkıda bulunan çeşitli fimbriyaları sentezlemektedir (Baumler vd. 1996, Ohl and Miller 2001, Zhang 2003). İntestinal invazyon Salmonella patojenitesinin karakteristik özelliğidir. Salmonella patojenitesinin en ilginç noktalarından biri, bu bakterilerin fagositoz benzeri bir süreci yönlendirerek fagositik olmayan hücreleri istila etme yeteneğidir. M hücreleri, Peyer plaklarında folikülle ilişkili epitel hücrelerinde yer 5

16 almaktadır. Peyer plakları, farelerde Salmonella nın hedef olarak seçtiği birincil bağırsak epitel hücreleridir. S. Typhimurium, sığırlarda M hücreleri ve enterositleri istila etme yeteneğine sahiptir (Jones vd. 1994, Santos vd. 2002, Santos 2003). Bağırsak epitel hücrelerine tutunmanın ardından, S. Typhimurium SPI-1 tarafından kodlanan tip III salgı sistemleri (TTSS), konakçı hücre sitozolünde yer alan bakteriyel efektör proteinlerle yer değiştirmektedir. Bu proteinlerden bazıları; kinaz, fosfataz veya aktin bağlanma aktivitesine sahiptir ve öncelikle konakçı hücre iskeletindeki hareketi yöneten yolakları değiştirmektedir. Dolayısı ile Tip III Salgı Sistemi, enfeksiyon süresinde bakteriyel istilayı ve konakçı gen ifadesini yönlendiren ana sistemdir (Galan ve Zhou 2000, Santos 2003). Salmonella nın ökaryotik hücreleri istila etmesinin moleküler esasları, hücre kültürleri kullanılarak in vitro koşullarda yoğun bir şekilde çalışılmaktadır. Benzer genetik yaklaşımlar günümüzde in vivo intestinal invazyon çalışmaları için de kullanılmaktadır. SPI-1, sistemik enfeksiyonun ilk basamağı için zorunludur. TTSS leri, bitki, hayvan ve insan patojeni olan Gram-negatif patojenlerde bulunan karmaşık moleküler makinelerdir. TTSS leri fonksiyonel ve yapısal olarak flagellar sistemlerle ilişkilidir ve tipik olarak bakteriyel hücrenin sitoplazma ve periplazmasındaki iç ve dış membranlarda yer alan yirmiden fazla protein alt ünitesi içermektedir. Bununla birlikte TTSS lerinin temel fonksiyonunun hedef ökaryot hücrelerdeki substrat proteinlerinin temas-bağımlı translokasyon olduğu saptanmıştır (Jones ve Falkow 1996, Hueck 1998, Hanser-Wester ve Hensel 2001, Zhang 2003). Konakçı hücre içindeki translokasyon, SPI-1 kodlu TTSS tarafından salgılanan efektör proteinlerle sağlanmaktadır. SipA, SipB, SipC, SptP ve AvrA, SPI-1 lokusundaki genler tarafından kodlanmaktadır. SipA doğrudan konakçı hücredeki aktine bağlanmakta, polimerizasyon için gerekli kritik konsantrasyonu düşürmekte ve polimerizasyonun inhibisyonu yoluyla aktin flamentlerini stabilize etmektedir. SopA, SopB, SopD, SopE ve SopE2, SPI-1 den bağımsız bir bölgede kodlanmaktadır. SptP, SopE ve SopE2 nin yapı ve fonksiyonu detaylı olarak çalışılmıştır. Bu proteinler, küçük GTPaz ailesine dahil olan konakçı hücre proteinlerinin fonksiyonlarına engel olmaktadır (örneğin; Cdc42, Rac-1 ve Rho). Ayrıca, sitoiskeletin hareketliliğini ve F-aktin filamentlerinin oluşumunu düzenlemektedir. SPI-1 tarafından kodlanan Tip III salgı sisteminin içeriklerinden, efektör proteinlerden veya SPI-1 transkripsiyonel regülatörlerden yoksun 6

17 mutant S. Typhimurium suşları epitel hücrelerini istila etme yeteneğine sahip değildir. Bu da söz konusu sistemlerin Salmonella enfeksiyonu için zorunlu olduğuna işaret etmektedir (Penheiter vd. 1997, Zhou vd. 1999, Marcus vd. 2000, Mirold vd. 2001, Gerstel vd. 2003) ların ilk yıllarında yürütülen çalışmalarda, S. Typhimurium ve tek katman bağırsak epitel hücreleri arasındaki etkileşimin morfolojik özellikleri belirlenmiştir. Daha sonra gerçekleştirilen araştırmalarla salınma karakteristikleri Salmonella nın tek katman epitel hücrelerinin apikal yüzeylerine tutunup hücre içine girmesinden kısa bir süre sonra, epitel hücrelerinde var olan hücre iskeletinin bozulmasıyla sitoplazmik giriş başlamakta olduğu ve enfeksiyondan 30 dk sonra hücre işgalinin meydana geldiği saptanmıştır. Enfeksiyondan 2 saat sonra ise, serbest bakteriler tek katman yapının bazolateral bölgesinden salınmaktadır (Finlay ve Falkow 1991, Santos 2003). S. Typhimurium farelerde sirkülasyon yolu ile sistematik olarak yayılmaktadır ve enfeksiyon Peyer plaklarında, mezenterik lenf nodüllerinde, karaciğerde ve dalakta yüksek sayıda bakteri içeren dokuyla ve çeşitli patolojik değişimlerle karakterize edilmektedir (Hensel vd. 1997, Raffatellu vd. 2005). Dokularda bakterinin neden olduğu benzer sistemik hasarlar tifo ateşine sahip hastalarda da rapor edilmiştir (Coburn vd. 2005, Berger vd. 2006). Bu sendromda tipik olarak düşük seviyede bakteremi ortaya çıkmaktadır (Zhang vd. 2003, Tükel vd. 2005, Mastroeni ve Maskel 2006). Tersi bir durum olarak, insanda S. Typhimurium enfeksiyonunda genellikle bakteriler bağırsak ve mezenterik lenf nodüllerinde lokalize olur. Bakteremi, enterokolit süresince geçici bir durum olup, enfeksiyonun spesifik bir sonucu değildir. Tifo ateşi ve enterokolit süresince konakçı cevaptan kaynaklanan en dikkat çekici farklılıklar, bağırsakta tanımlanan inflamasyon tipidir. Tifo, inflamasyon oluşturan mononükleer hücrelerin yavaş bir şekilde gelişen sızıntısı ve az veya hiç olmayan doku hasarı ile karakterize edilir. S. Typhimurium la enfekte edilmiş farelerde mononükleer lökositlerin sızıntısıyla karakterize edilen enfeksiyon sonrasında 3 ile 5 gün içinde ince bağırsakta yayılan enterit gelişmektedir (Walsh vd. 2000, Hapfelmeier vd. 2005, Miao vd. 2006). Bununla birlikte enterokolit, baskın hücre tipi olarak hızlı bir şekilde gelişen nötrofil sızıntısı yanında ileum ve kolonun büyük bölgelerindeki üst mukozanın nekrozu ile karakterize 7

18 edilmektedir. S. Typhimurium la enfekte olmuş hastalardan alınan rektal biyopsiler, ilk olarak nötrofil sızıntısıyla oluşan inflamasyonla karakterize edilen akut enteridi açığa çıkarmaktadır (Zhang vd. 2003, Lawley vd. 2008). Bu nötrofil pompalaması ileum ve kolonun son bölgesindeki mukozanın üst yüzeyinde geniş bir bölgede oluşan nekroz ile ilişkilidir (Fischbach vd. 2006, Crouch vd. 2008). S. Typhimurium un fare ve insandaki enfeksiyonu; konakçı yanıtı, sendromlar ve bağırsak patolojisi açısından önemli farklılıklar içermektedir. Bu farklılıklar, insanda meydana gelen S. Typhimurium enfeksiyonunun patojenitesinin fare modellerinden elde edilen verilerle açıklanmasını zorlaştırmaktadır. İnsan ve fare bağırsaklarında gözlenen farklı inflamasyon yanıtlarına rağmen, kemirgenle ilişkili ileal parçalar S. Typhimurium tarafından indüklenen patojenez çevriminde muhtemel virülens faktörlerin katkısının değerlendirilmesinde model olarak kullanılmaktadır (Miao vd. 2006, Santos 2009). 2.3 Salmonella nın Sahip Olduğu Virülens Faktörler Fimbriyalar Salmonella nın hastalığa neden olmasını sağlayan mekanizmaların anlaşılabilmesi için; hücre ve doku kültür sistemleri yanında hayvan modelleri de geliştirilmiştir. Bu biyolojik araçların kullanımı ile Salmonella patojenitesi için gerekli çeşitli virülens faktörlerin karakterizasyonu gerçekleştirilmiştir. Örneğin; doku kültüründe oluşturulan epitel ve makrofaj hücrelerinin enfeksiyonu, invazyon ve Salmonella nın hücre içinde hayatta kalması için gerekli genetik elementlerin tanımlanmasına ve karakterize edilmesine yardım etmiştir. Ek olarak, fare ve sığır modelleri, gastroenterit için önemli bilgiler elde edilmesini sağlarken, kemirgen modellerde ağız yoluyla enfeksiyon ve bağırsak bağımlı çalışmalar tifo ateşinin sistemik patojenitesini yöneten virülens faktörlerin keşfedilmesine olanak tanımıştır (Wallis ve Golyov 2000, Jones 2005). Böylece in vivo ve in vitro çalışmalar, Salmonella nın neden olduğu hastalık için gerekli virülens faktörlere dair daha çok bilgi elde edilmesini sağlamıştır. Salmonella için önemli olan virülens özelliklerden bir tanesi, farklı Salmonella serovaryetelerinin sahip olduğu çeşitli fimbriya tipleri tarafından yönetilen konakçı intestinal dokulara tutunma yeteneğidir. Fimbriyalar, bakterilerin yüzeyinde bulunan ve reseptöre 8

19 bağlanmayı yöneten katı, filamentli yapılardır. Çoğu fimbriya, şaperon-usher sistemi kullanmaktadır ve filamentli yapı genellikle birkaç alt üniteden oluşmaktadır. Fimbriya tipik olarak tekrarlı bir ana alt ünite ve bu ana alt ünitelere bağlanan ve fonksiyonu bilinmeyen küçük alt ünitelerden oluşmaktadır. Bu tutunma yapılarının en bilinenleri; Tip 1 fimbriya, uzun polar fimbriya, plazmid kodlu fimbriya ve ince agregatif fimbriyadır (Hultgren vd. 1991, Darwin ve Miller 1999, Jones 2005). Sıvı besiyerinde gelişen S. Typhimurium hücrelerinin yüzeyinde fimbriya olarak adlandırılan filamentli uzantılar ilk olarak 1958 yılında tanımlanmıştır. Daha sonra birçok S. Typhimurium suşunda fimbriyanın ifadesi ve sıvı besiyeri kültüründe maya ya da kırmızı kan hücrelerini aglütinasyon etme yeteneği saptanmıştır. Ortaya çıkan bu aglütinasyon, ortama mannozun ilavesi ile inhibe edilebilir. Bu mannoz duyarlı aglütinasyon ile düzenlenen adhezin, Tip1 fimbriya olarak adlandırılmıştır. Tip1 fimbriya, S. Typhimurium kromozomundaki fim operonu tarafından kodlanmakta ve şaperon-usher sistemi içermektedir. fima geni; ana alt üniteyi, fimh geni ise; reseptöre bağlanmayı yöneten ve fimbriyal yapının uç bölgesinde lokalize olmuş olan adhezin proteinini kodlamaktadır. Bu fimbriya, 37 C de 48 saatlik statik gelişmenin ardından in vitro olarak ifade edilmektedir. Yapılan çalışmalarda söz konusu fimbriyanın, tavuk bağırsak sisteminde, kemirgen bağırsak epitelinde ve Hep-2 doku kültür hücrelerinde biyofilm oluşumunda rol aldığı belirlenmiştir (Lockman ve Curtiss 1992, Boddicker vd. 2002, Ledeboer ve Jones 2005). Elektron mikroskopi yöntemleri ve sıvı bakteri kültürlerinde yürütülen hemaglütinasyon testleri, çoğu S. Typhimurium izolatında Tip1 fimbriyanın sadece sıvı besiyerinde üremenin ardından ifade edilen bir fimbriyal adhezin olduğunu göstermiştir. Katı ortamda üreyen hücrelerde, elektron mikroskopi yöntemiyle tanımlanan fimbriyal tipler morfolojik olarak Tip1 fimbriyadan farklılıklar göstermektedir. Bu yüzey uzantıları mannoz-dirençli hemaglütinasyon bağlantılı ince kıvrımlı fimbriya olarak adlandırılmaktadır. S. Typhimurium da ince kıvrımlı fimbriyanın agf (csg) operonu tarafından kodlandığı, saflaştırılan fimbriya ana protein bandının N-terminal ucunun dizi analiziyle belirlenmiştir (Stolpe vd. 1994, Romling vd. 1998, Raffatellu vd. 2005). 9

20 Genomik analiz verileri S. Typhimurium un Tip I ve ince kıvrımlı fimbriya dışında başka fimbriyal adhezinlere de sahip olduğunu göstermiştir. Genetik analizler sonucunda; S. Typhimurium da fim ve agf ye ek olarak en az beş adet daha fimbriyal operon bulunduğu saptanmıştır. Bunlar; lpf (uzun polar fimbriya), pef (plazmid kodlu fimbriya), bcf (sığır kolonizasyon faktörü), stf (S.Typhimurium fimbriya) ve saf (Salmonella atipik fimbriya) yı içermektedir. Salmonella nın sahip olduğu diğer fimbriyalar da kısmen karakterize edilmiştir. Uzun polar fimbriya (Lpf) lpfabcde genleri tarafından kodlanmaktadır ve kemirgen bağırsak mukozasında kolonizasyona yardımcı olmaktadır (Baumler ve Heffron 1995, Baumler vd. 1996, Tsolis vd. 1999, Kingsley vd. 2002, White vd. 2006). Bilimsel veriler lpf genlerinin ifadesinin, konakçı immün sisteminden kaçmaya yardım eden faz varyasyonu mekanizması tarafından kontrol edildiğini göstermiştir. Escherichia coli ve Proteus mirabilis ile yürütülen faz varyasyon çalışmaları, bakterilerde in vivo koşullarda fimbriyaya sahip olma veya olamama seçiminin organda kolonizasyon ve fimbriya gerekliliğine bağlı olduğunu göstermiştir. Plazmid kodlu fimbriya (pef) 90-kb büyüklüğündeki Salmonella virülens plazmidinde yer alan ve bağımsız transkribe edilen iki operon tarafından kodlanmaktadır (Friedrich vd. 1993, Norris vd. 1998, Fitzgerald vd. 2003, Suar vd. 2006). Pef fimbriya, Salmonella nın kemirgen epitel hücrelerine tutunması sonucu oluşan sıvı birikmesini yönetmektedir. Bu fimbriyanın regülasyonu E. coli Pap sisteminin analoğu olan faz varyasyonu mekanizmasıyla sağlanmaktadır. İnce agregatif fimbriya (Tafi), yüksek adhezif özelliğe sahip olan uzantılardır. Bu tutunma faktörünün içerikleri, farklı olarak transkribe edilen csgbac ve csgdefg operonları tarafından kodlanmaktadır. Tafi ekstraselüler matriks proteinlerine tutunmayı, faz proteinleriyle ve ana doku uyuşum kompleksi sınıf I molekülleriyle iletişim kurmayı sağlamaktadır. Tafi, ayrıca biyofilm oluşumunda ve fare virülensine katkı sağlamada rol almaktadır. Tafi nin in vitro ifadesi, düşük sıcaklıkta optimum olarak gerçekleşmektedir. Çevresel sinyallerle düzenlenen Tafi biyosentezi, ana alt ünite olan CsgA nın ifadesini doğrudan düzenleyen csgd gen ürünüyle ilerlemektedir. Bunlara ek olarak, Tafi ifadesinin regülasyonunda rol alan CsgD ayrıca selüloz biyosentezinin ve bazı yüzeylerde oluşan Salmonella biyofilminde bulunan ekzopolisakkaritlerin bileşenlerinin regülasyonunda da görev almaktadır (McClelland vd. 2001, Prouty vd. 2002, Solano vd. 2002, Prouty ve Gunn 2003, Garcia vd. 2004, Ledeboer ve Jones 2005, Tükel vd. 2005, Tükel vd. 2007). 10

21 Yukarıda tanımlananlara ek olarak Salmonella genom analizleri sonucu altı adet olası fimbriyal operon daha belirlenmiştir. Bunlardan stj fimbriyal operonu sadece S. Typhimurium da bulanmaktadır (Chessa vd. 2008). Fimbriyaların in vitro koşullarda doku kültür hücrelerine invazyon için de gerekli olduğu belirlenmiştir. SPI1 tarafından kodlanan Tip III salgı sistemi, tüm hücre tiplerinin istilası için gerekli iken, her bir fimbriyal operon sadece belirli hücrelere tutunma ve bu hücreleri istila etmede rol oynamaktadır. Bu yüzden fimbriyalar, serovaryete Typhimurium a farklı epitel hücreleri ayırt etme yeteneği sağlıyor olabilir. Yapılan çalışmalarda, Salmonella nın epitel hücrelere ve fare bağırsak dokusuna tutunmasını ve biyofilm oluşumunu yöneten adhezin molekülü olan Tip 1 fimbriyadaki spesifik amino asitlerin önemini açığa çıkarmıştır. Uzun polar fimbriyanın, bağırsaktaki lenf folikülleri boyunca yer alan peyer plaklarına bağlanmayı sağladığı kesin kanıtlarla belirlenmiştir (Baumler vd. 1996, Darwin ve Miller, 1999, Humpries vd. 2001, Boekema vd. 2004, Wilson vd. 2008). Fimbriyalar tarafından sağlanan tutunma enfeksiyon için kritik önem taşımakta, ancak bu yüzey yapılarının ifadesi aynı zamanda patojen için potansiyel bir dezavantaj da teşkil etmektedir. Zira yaklaşık olarak 1000 ana alt ünite kopyasından oluşan fimbriyal filamentler, konakçının immün cevabı oluşturması için iyi bir hedef teşkil etmektedir. Bu görüşü destekler kanıtlar, yani fimbriyal adhezinlerin enfeksiyonda antijen gibi rol alması; SefA, PefA ve FimA için S. Enteritidis ile yürütülen tavuk enfeksiyon ve LpfA için S. Typhimurium ile yürütülen fare enfeksiyon modellerinden elde edilmiştir (Nicholson ve Baumler 2001, Humpries vd. 2001, Helms vd. 2005, Wilson vd. 2008). Farelerdeki Typhimurium enfeksiyonuna karşı oluşan adaptif immün cevap, B hücrebağımlı ve T-hücre bağımlı efektör mekanizmaların her ikisini de içermektedir. Bu duruma örnek olarak; B hücrelerinden yoksun farelerde S. Typhimurium a karşı oluşan immün cevabın bozulmamış B hücrelerine sahip farelerde oluşan cevaba göre daha duyarlı oluşu, gösterilebilir. Benzer şekilde, S. Typhimurim la enfekte edilmiş T hücrelerinden yoksun farelerin virülent S. Typhimurium a karşı direnmede duyarlılığı artmaktadır. Bu çalışmalar ışığında, Salmonella serovaryetelerinin oluşturduğu enfeksiyon süresince fimbriyal proteinlere maruz kalma sonucu T hücre ve B hücre 11

22 bağımlı cevabın ortaya çıktığı düşünülmektedir (Mastroeni vd. 1992, Barbour vd. 2000, Humpries vd. 2001, Chakravortty vd. 2002, Desvaux vd. 2004, Srivatsan ve Wong 2008) stj fimbriyal operonu ve patojenitedeki rolü S. Typhimurium genomu agf(csg), fim, lpf, pef, bcf, stb, ste, std, stf, sth, sti, saf ve stj yi içeren 13 fimbriyal operon içermektedir (Weening vd. 2005, Tükel vd. 2007, Chessa vd. 2008). Bu 13 fimbriyal operondan biri olan stj operonu sadece S. Typhimurium genomunda bulunmaktadır. Bu durum Stj fimbriyasının serovaryete-spesifik virülens karakteristik olarak etki gösterebileceğine işaret etmektedir. stj fimbriyal operonu sadece S. Typhimurium LT2 genom dizi analiziyle tanımlanmıştır. Stj fimbriyasının S. Typhimurium un konakçı sistemde virülensi ve hayatta kalması üzerine 2009 yılına kadar herhangi bir çalışma bulunmamaktadır. Çalışma grubumuz tarafından yürütülen araştırma, S. Typhimurium da stj fimbriyal operonunun fare model sistemlerinde kolonizasyon ve konakçı sistemde kalıcılık üzerinde etkili olduğunu gösteren ilk çalışmadır (Akkoç vd. 2009). Bu çalışmada stj fimbriyal operonunun genetik olarak dirençli farelerde (CBA) S. Typhimurium un hayatta kalmasını arttırdığını belirlemek için intihar plazmidi olan PGP704 plazmidinin kromozomal insersiyonuyla MA44 olarak adlandırılan stj mutant elde edilmiştir. Stj fimbriyal operonunun intestinal sistemde hayatta kalmada oynadığı rolü araştırmak amacıyla dört CBA fare grubunda yarışmalı inhibisyon denemeleri yapılmıştır. Eşit sayıda stj mutant (MA44) ve phon de mutasyon taşıyan S. Typhimurium AJB715 suşu, CBA fare grubunda mide içine inoküle edilmiştir. Fare fekal örnekleri enfeksiyonun 3, 7, 9, 14, 17, 21, 25, 28, 30 ve 34 günlerinde toplanmıştır. Yarışmacı suş AJB715 in (phon, beyaz koloniler) ve stj fimbriyal mutant MA44 ün (phon +, mavi koloniler) sayıları LB agar ortamınına fekal homojenatlardan yayma ekim yapılarak belirlenmiştir. Deneydeki 34 günlük zaman periyodundan sonra stj mutant MA44 ün, yarışmacı suş olan AJB715 ten önemli ölçüde daha az sayıda olduğu belirlenmiştir (p<0.005). Tüm periferal bölgedeki örneklerde (dalak, bağırsak ve mezenterik lenf nodülleri) mutant, doğal suş olan AJB715 ten daha az kolonize olmuştur (p<0.005). Bu sonuçlar stj fimbriyal operonunun, S. 12

23 Typhimurium un farede kolonizasyonunda ve fare intestinal sistemde uzun süreli kalıcılığında kritik bir oynadığını kanıtlamıştır (Akkoç vd. 2009). stj fimbriyal operonunun S. Typhimurium un patojenitesinde kritik bir role sahip olduğunun belirlenmesi, bu operonun genetik regülasyonunun tanımlanmasının önemini arttırmıştır. 2.4 Salmonella da Virülens Faktörlerin Regülasyonunda Görev Alan Global Regülatör Sistemleri Salmonella patojenitesi, konakçı hayvanda farklı anatomik bölgeleri kullanan çeşitli bakteriyel virülens faktörlerin koordineli regülasyonunu gerektiren oldukça karışık bir süreçtir. Yapılan çalışmalar, konakçı hücreleri istila için gerekli olan genlerin regülasyonu üzerine yoğunlaşmıştır. Araştırmalar sonucunda; bakteriyel gelişme, ozmolarite, oksijen gerilimi gibi belli başlı çevresel koşulların, Salmonella nın doku kültür hücrelerini istila etme yeteneğini etkilediği belirlenmiştir. Bu koşullara in vitro ve in vivo süreçlerde adaptasyon genellikle global regülatörler tarafından sağlanmaktadır (Galan ve Curtiss III 1989, Ernst vd. 1990, Lee ve Falkow 1990, McBeth ve Lee 1993, Jones 2005). Fakültatif hücre içi patojenler, memeli konakçıları enfekte etme süresince; gastrointestinal sistem ve onu takiben makrofajlar ve epitel hücreler içindeki çeşitli çevresel koşullara hızlı şekilde uyum sağlamak zorundadırlar. Konakçıda başarılı bir enfeksiyon için, enfeksiyonun hücre içi ve hücre dışı fazları arasındaki adaptasyonda görev alan çok sayıda virülenslikle ilişkili genin ifadesi gerekmektedir. Bakteriyel genetik döngüler hiyerarşik bir organizasyon sürecinde gerçekleşmektedir. Bu hiyerarşik regülasyon basamakları gen, operon, modülen ve stimülen sistemlerden oluşmaktadır (Gottesman 1984, Haralalka vd. 2003, Raffatellu vd. 2006, Tükel vd. 2007). 13

24 2.4.1 ppgpp sistemi Son yıllarda yürütülen çalışmalarda; gelişme, stres, besinsel azlık ve konakçıda hayatta kalmayla ilişkili süreçlerde (p)ppgpp nin gerekliliği saptanmıştır. Bakteriyel sinyal molekülü ppgpp, hücre içi ve hücre dışı koşullar doğrultusunda virülens gen sistemlerinin regülasyonunu sağlayan önemli bir global regülatördür. ppgpp nin Mycobacterium tuberculossis, Leigonella pneumophila, Vibrio cholera ve Pseudomonas aeruginosa yı içeren patojenik bakterilerin virülensinde önemli bir rol oynadığını gösteren kanıtlar artmaktadır (Primm vd. 2000, Taylor vd. 2002, Haralalka vd. 2003, Erickson vd. 2004, Ngwei vd. 2006, Ezequiel vd. 2008, Potrykus ve Cashel 2008). Yapılan çalışmalarda duyarlı BALB/c farelerde, rela spot S. Typhimurium mutantların kalıcılığının düştüğü ve in vitro denemelerde epitel hücreleri istila yeteneğini yitirdiği belirlenmiştir. Bu sonuçlar ppgpp nin Salmonella da virülens gen ifadesinde kritik rol oynayabileceğini göstermektedir. ppgpp nin, konakçı enfeksiyonuyla ilgili gelişme koşullarına dair neredeyse bilinen tüm Salmonella virülens genlerinin ifadesi için gerekli olduğu belirlenmiştir (Pizarro-Cerda ve Tedin 2004, Thompson vd. 2006, Chessa vd. 2008) Cad sistemi Ağız yoluyla vücuda alınan enterik bakteriler, gastrik bariyeri aşmaya ve asidik koşullar altında bağırsakta çoğalmaya çalışmaktadırlar. E. coli, Salmonella ve Shigella gibi enterik bakteriler hayatta kalabilmek için karmaşık asit indükleyen stratejiler geliştirmişlerdir. Düşük ph, hücresel yaşam için uygun ph seviyesini oluşturan çeşitli amino asit dekarboksilazların transkripsiyonunu harekete geçiren moleküler cevapları indüklemektedir (Bearson vd. 1997, Merrell ve Camilli 2002). ph dengesini sağlayan üç büyük dekarboksilaz sisteminden bir tanesi lisin dekarboksilaz aktivitesini esas alan sistemdir. E. coli de bu aktivite, lisin dekarboksilaz (cada) ve lisin dekarboksilaz taşıyıcı protein (cadb) vasıtasıyla gerçekleşmektedir. Bu sistem düşük ph ve lisin varlığında indüklenmektedir. cadba operonunun ifadesi; bu 14

25 genlerin üst transkripsiyon bölgesinde yer alan, bu operondan bağımsız olarak transkripsiyonu yapılabilen ve bu operonun pozitif aktivatörü olan CadC ye bağlıdır (Merrell ve Camilli 2002). Lisin dekarboksilaz (CadA) biyolojik parçalanmayı sağlayan bir enzimdir ve hücre dışından sağlanan lizini, alkali ürün olan kadaverine dönüştürerek asidik çevrenin ph dengesinin ayarlanmasına katkıda bulunmaktadır. Bu aktivitesini, kadaverini hücre dışına salgılayarak gerçekleştirmektedir. Ayrıca, dekarboksilasyon süresince CadA tarafından üretilen CO 2 in, nükleotit biyosentezini de içeren çeşitli metabolik yollara katkıda bulunduğu düşünülmektedir (Takayama vd. 1994, Helms vd. 2005). Patojenik E. coli suşları için bağırsak epitel hücrelerine tutunma, enfeksiyonun gerçekleşmesi için gereklidir. Yapılan çalışmalarda, bu tutunmada birçok faktörün rol aldığı bulunmuştur. Bu faktörlerden bir tanesi de CadA proteinidir. Bu proteinin çeşitli enterik patojenlerde virülensi negatif olarak düzenlediği düşünülmektedir. Flagella ve F9 fimbriyanın cada mutantlarda daha fazla regüle edildiği saptanmıştır. Bu durum Cad regülatör mekanizmasının tutunmadaki ilişkisini ortaya koymaktadır (Morita vd. 2006). Japonya da S. Enteritidis in LDC-negatif izolatlarının sayısının beklenmedik derecede yüksek olduğu ve tüm izolatların cadc geninde aynı pozisyonda tek baz delesyonu içerdiği belirlenmiştir. LDC-pozitif fenotip Salmonella suşlarında ana karakteristik özelliktir (Farmer 2003, Wilson 2004, Morita vd. 2006). Salmonella daki CadC yokluğu, konakçı dokularda hayatta kalmasını arttırmak için ortaya çıkan patoadaptif bir mutasyon olarak değerlendirilebilir. Bununla birlikte, S. Typhimurium da CadC nin enfeksiyon süresince indüklendiği tespit edilmiştir. Bu durum, CadC nin konakçı dokusunda hayatta kalmaya katkıda bulunarak patojeniteyi arttırdığını düşündürmektedir (Heithoff vd. 1997, Eriksonn vd. 2003, Vazquez-Juarez vd. 2008). 15

26 2.4.3 Csr sistemi Csr sistemi, çeşitli bakteri türlerinde bulunan post-transkripsiyonel bir regülatördür. Bu sistem yaygın olarak E. coli de çalışılmış ve karbon metabolizmasının ve hareketliliğin düzenlenmesinden sorumlu olduğu belirlenmiştir. S. Typhimurium da csra ve csrb nin her ikisi de E. coli deki eşdeğerleriyle güçlü bir sekans homolojisi göstermektedir (Romeo vd. 1993, Altier vd. 2000b). CsrA, E. coli de karbon metabolizması gibi temel fonksiyonları düzenleyen global bir regülatör olmasına rağmen S. Typhimurium da E. coli de bulunmayan özel virülens determinantları düzenlemektedir (Wei vd. 2001, Baker vd. 2002). CsrA, S. Typhimurium da invazyon genlerinin regülatörüdür. SPI-1 invazyon gelerinin ifadesi csra mutantlarda büyük ölçüde indüklenmektedir. Salmonella suşlarında doğal ya da yapay csra mutantların flagellasız ve hareketsiz olduğu saptanmıştır. Salmonella tarafından benzer şekilde kullanılan iki metabolik yolun genlerinin; etanolamin katabolizması için zorunlu eut operonu ve 1,2-propanediol katabolizması için zorunlu pdu operonunun ifadesinin Csr sistemi tarafından indüklendiği tanımlanmıştır. Ayrıca CsrA nın, etanolamin ve 1,2-propanediol ün her ikisinin de metabolizması için gerekli olan B12 vitamininin sentezini cob operonu ile birlikte düzenlendiği belirlenmiştir. Diğer yandan csra mutantlarda maltoz ve maltodekstrinlerin kullanımı ve taşınması için gerekli olan mal operonunun genleri zayıf olarak ifade edilmekte ve normalde dış membranın baskın proteini olan maltoporinin miktarı indirgenmektedir. S. Typhimurium patojenitesinin ilk basamağı olan epitel hücreleri istila etme yeteneği, SPI-1 de lokalize olmuş Tip III salgı sistemi tarafından kodlanmaktadır. Oksijen azlığı, ph, ozmolarite ve gelişme fazının, invazyon genlerinin ifadesinde değişime neden olduğu gösterilmiştir. Bu koşullara cevabın birçoğu SPI-1 in OmpR/ToxR ailesi bir regülatör olan HilA tarafından düzenlenmektedir (Bajaj vd. 1995, Bajaj vd. 1996, Altier vd. 2000a, Altier vd. 2000b, Lawhon vd. 2003, Unsworth vd. 2004). SPI-1 invazyon genlerinin CsrAB tarafından regülasyonu ise oldukça karmaşık bir süreçtir. CsrA nın kaybı veya CsrB nin fazla ifade edilmesiyle serbest CsrA nın indirgenmesi, SPI-1 genlerinin ifadesini ve epitel hücre invazyonunu azaltmaktadır. Ancak CsrA nın fazla ifadesi veya CsrB nin kaybı da aynı etkilere yol açmaktadır. Bu bulgular Csr sisteminin invazyonu hem pozitif hem de negatif olarak regüle ettiğini göstermektedir. Optimum invazyon için aktif CsrA 16

27 seviyesinin sıkı kontrolü gerekmektedir. CsrA, SPI-1 genlerinin ifadesini pozitif olarak düzenlemekte ayrıca diğer SPI-1 genlerinin regülatörü olan HilA yı da kontrol etmektedir. CsrA ya, HilA dan bağımsız olarak, invf ve sipc nin ifadesi için de ihtiyaç duyulmaktadır. InvF, sip operonunun transkripsiyonunu aktive ederek sipc nin tam olarak ifade edilmesi için gereklidir. csra nın yüksek seviyede ifade edilmesi, SPI-1 genlerine csra mutantlardakiyle aynı etkiyi göstermektedir. CsrA, SPI-1 genlerini aktive eden CsrB nin repressörüdür (Altier vd. 2000a,b, Unsworth vd. 2004, Bourzac ve Guillemin 2005, Galan 2008) SirA/BarA Sistemi Salmonella da bir çok patojenite adası kendi transkripsiyonel regülatörlerini kodlamaktadır. Bu durum transkripsiyonel regülatörlerin, organizmanın merkezi metabolizma regülatörleri tarafından düzenlenen adaptör regülatörler olduğuna işaret etmektedir. Bunun en iyi örneği SPI1 in regülasyon mekanizmasıdır. HilA, diğer SPI1 genlerinin ifadesinin kontrolünü sağlayan, SPI1 tarafından kodlanan ompr/toxr ailesinin transkripsiyonel regülatörüdür. Bununla birlikte HilA, fosforil akseptör bölgesinden yoksun bir temel aktivatördür. Çeşitli çevresel faktörlerin hila transkripsiyonunda etkili olduğu bilinmektedir. Bu koşullar; ozmolarite, ph, oksijen ve divalent katyonları içermektedir (Guiney vd. 1995, Lee vd. 1992, Bajaj vd. 1995, Ahmer vd. 1999). HilA nın ifadesinin regülasyonundan sorumlu sensör proteinler tam olarak belirlenmiştir. En iyi şekilde karakterize edileni iki-bileşenli PhoPQ regülatör sistemidir. Bu sistem enfeksiyonun intestinal fazı tamamlandıktan sonra HilA yı baskılamaktadır. hila ifadesinin ikinci bir regülatörü prgh dir. Bu regülatör sira (Salmonella invasion regulator) olarak adlandırılmıştır ve uvrc genlerinin üst transkripsiyon bölgesinde yer almaktadır. PhoQ nun aksine SirA, hila nın aktivatörüdür (Johnston vd. 1996, Soncini vd. 1996, Vescovi vd. 1997, Ahmer vd. 1999). sira geni, S. Typhimurium, Erwinia carovata ve çeşitli Pseudomanas türlerinde salgılanan virülens faktörlerin ifadesi için gereklidir (Rich ve Willis 1997, Eriksson vd. 1998, Ahmer vd. 1999). Virülens genlerin ifadesinde, fosforile edilmiş SirA, SPI1- kodlu virülens regülatörler hila ve hilc nin promotoruyla doğrudan etkileşime geçmektedir. Bununla birlikte SPI-4 ve SPI-5 te SirA tarafından düzenlenen genler de 17

28 hila bağımlıdır. S. Typhimurium da bara ve sira genleri, iki bileşenli sensör kinazı ve cevap regülatörü kodlamaktadır. Bu sistem virülens genlerinin ifadesini arttırmasının yanında, hareket genlerinin ifadesini azaltmaktadır. Flagellar genlerin temel regülatörü flhdc, intestinal virülens faktörlerin birincil regülatörü olan hila üzerinde pozitif regülatör etkisi göstermektedir; fakat hila nın flhdc üzerinde etkisi yoktur. SirA, hila mutantlarda flhdc yi baskılamakta ve flhdc mutantlarda hila yı aktive etmektedir. flhdc ve hila regülatörleri birbirini etkilemesine rağmen, sira bunların her birine bağımsız olarak etki etmektedir (Teplitski vd. 2003, Gente vd. 2004). CsrA/CsrB sistemin flagellar gen ifadesi üzerine doğrudan etkili olduğu bilinmektedir. sira geni ise csra yı düzenlememekte fakat csrb nin ifadesini aktive etmektedir. Fosforlanmış SirA nın csra promotoruna bağlanmadığı, fakat csrb promotoruna doğrudan bağlandığı bulunmuştur. Bu modele göre, SirA; csrb aracılığıyla flagellar regülonu dolaylı olarak baskılarken, HilA aracılığıyla virülens ifadesini doğrudan aktive etmektedir (Teplitski vd. 2003, Teplitski vd. 2006). SirA ve Csr sisteminin ayrıca Tip1 fimbriyayı kodlayan fim operonunu kontrol ettiği belirlenmiştir. Diğer bakterilerdeki sira ortologlarının ve S. Typhimurium daki sira regülonunun biyofilm üretimi üzerindeki etkinliği in vitro koşullarda test edilmiştir. sira, csrb/csrc ve fiml mutantlarda biyofilm oluşumu engellenmiştir. Ayrıca flhdc nin inaktivasyonunun biyofilm oluşumunu arttırdığı belirlenmiştir. Diğer yandan SirA, biyofilm oluşumunu arttıran fim operonu, csrb ve csrc yi aktive etmektedir. csrb ve csrc, fim operonunun translasyonunu arttırırken, aynı zamanda biyofilm oluşumunu inhibe eden flagella translasyonunu da engellemektedir (Teplitski vd. 2006, Chessa vd. 2008) RpoS sistemi Bakteriler; toksik kimyasallar, asit koşullar, yüksek ozmolarite ve sıcaklık, sınırlı besin kaynaklarını içeren çeşitli stres koşullarına karşı hızlı bir şekilde adaptasyon sağlama yeteneğine sahiptir. Bu koşullar altında bakteriler genellikle spesifik gen setlerinin aktivasyonu için sigma faktörlerini harekete geçirirler. E. coli ve çeşitli diğer bakteriler, 18

29 sigma-24, sigma-28, sigma-32, sigma-38 ve sigma-54 olarak tanımlanan alternatif sigma faktörlerine sahiptir (Jishage vd. 1996). Bunlardan sigma-38 (ayrıca KatF, RpoS ve sigma-s olarak da adlandırılır), asidik ph, sınırlı besin kaynaklarının bulunduğu koşullarda veya üssel gelişme evresinde aktive edilen çeşitli genlerin ifadesinde rol almaktadır (Hengge-Aronis 1996, Zambrano ve Kolter 1996). Ayrıca sigma-s, hidrojen peroksitin toksit etkilerine karşı bakteriyel dirence, sekonder metabolitlerin üretimine ve S. Typhimurium gibi hayvan patojenlerinin virülensine de katkıda bulunmaktadır (Sarniguet vd. 1995, Fang vd. 1996). Salmonella nın oral enfeksiyonu sonrası organizmalar bağırsak epitel hücrelerine doğru göç eder ve Peyer plaklarının parçası olan makrofajlarca fagosite edilir. Yaygın olarak görülen enfeksiyonlarda Salmonella lenf dokuya ve kan damarlarına yayılır, ardından başta karaciğer ve dalak olmak üzere iç organlarda çoğalır. Salmonella spp. nin makrofajları enfeksiyonu, patojenitesi için son derece önemli bir evredir ve makrofajlarda hayatta kalma yeteneğinde olmayan mutantlar virülens özelliğe sahip değildir. Virülens plazmid tarafından kodlanan spv genleri konakçı hücrenin hücre içi koşulları tarafından indüklenmektedir (Rhen vd. 1993, Guiney vd. 1995, Santos vd. 2003). spv genleri, S. Typhimurium, S. Dublin, S. Enteritidis, S. Choleraesuis ve S. Gallinarum-Pullorum u içeren sistemik hastalıklarla ilişkili Salmonella serovaryetelerinde bulunmaktadır. spvrabcd gen kümesi Salmonella nın iç organlarda gelişme düzeyini kontrol etmektedir. Ayrıca insanlarda ve hayvanlarda sistemik enfeksiyon ve bakterimi için zorunludur. S. Typhimurium da σ s, Salmonella virülens plazmidindeki spv genlerinin ifadesini sağlamaktadır. Salmonella RpoS mutantlarla enfekte edilmiş farelerin dalağında kolonizasyonun ciddi miktarda azaldığı belirlenmiştir. Buna ek olarak RpoS mutasyonlarının, enfekte farelerde S. Typhimurium un Peyer plaklarında kolonizasyonunu önemli ölçüde düşürdüğü ve virülens plazmidi giderilmiş mutantların ise aynı serovaryetenin dalaktaki kolonizasyonunu düşürdüğü saptanmıştır (Kowarz vd. 1994, Nickerson ve Curtiss 1997, Marcus vd. 2000, Hensen-Wester ve Hensel 2001, Gentle vd. 2004, Morgan vd. 2007). 19

30 2.4.6 PhoP/PhoQ Regülatör Sistemi İki elemanlı PhoP/PhoQ regülatör sistemi S. Typhimurium un patojenitesinin ve kırktan fazla genin transkripsiyonunun kontrolü için gereklidir. PhoP/PhoQ, farede virülenslik, makrofajların içinde hayatta kalma, katyonik antimikrobiyel peptitler (CAMPs) için direnç, tek karbon kaynağı süksinat olan ortamda gelişme ve sınırlı miktarda magnezyum bulunan ortamda gelişme için gereklidir. PhoQ, PhoP yi fosforile eden sensör histidin kinazdır ve çevresel koşullara cevap oluşturan bir regülatördür. PhoQ nun aktivitesi divalent katyonlar olan magnezyum ve kalsiyum tarafından baskılanmaktadır. PhoP, pags (PhoP tarafından aktive edilen genler) olarak adlandırılan bir grup genin ifadesini aktive etmektedir. Bu genler, tahminen katyonlar gibi spesifik moleküllerin transportunu aktive ederek ve dış membranın CAMP lara karşı bariyer fonksiyonunu geliştirerek Salmonella nın konakçı dokularda hayatta kalma olasılığını yükseltmektedir (Groisman vd. 1992, Gunn vd. 1996, Helms vd. 2005). PhoP ile aktive edilen genler tarafından kodlanan proteinler; spesifik olmayan asit fosfatazı, katyon taşıyıcılarını, dış membran proteinlerini ve lipopolisakkarit modifikasyonu için önemli olan enzimleri içermektedir. PhoP-PO 4 ayrıca, pacb, pmrab olarak da bilinen pmrcab operonunun (polimiksin direnç lokusu) ifadesini de aktive etmektedir. Bu lokus asidik koşullara karşı cevap oluşturmada pozitif regülatör olarak görev alan iki elemanlı regülatör sistemi kodlamaktadır. PmrB; Mg +2 duyarlı PhoPQ sistem ile dolaylı olarak iletişime geçen ve Mg +2 duyarlılığı olan sensör kinazdır. Oysa PmrA, transkripsiyonel bir cevap regülatörüdür. PhoPQ sistem, SPI-1 de bulunan prgs olarak tanımlanan başka bir grup genin transkripsiyonunu baskılamaktadır. Bu genler; transkripsiyonel bir regülatör kodlayan hila ve TTSS içeriklerini kodlayan prghijkorga operonunu içermektedir. Çok sayıda genin regülasyonu için phopq operonu kendi kendini regüle etmektedir. Bunun için, PhoP ve PhoQ nun tamamen ifade edilmesi gerekmektedir. (Soncini vd. 1995, Hueck vd. 1995, Pegues vd. 1995, Soncini ve Groisman 1996, Guo vd. 1998, Ohl ve Miller. 2001, Gerlach ve Hensel 2007). PhoQ nun aktivasyonu için in vivo sinyaller tam olarak tanımlanmamıştır. Aktivasyon in vitro koşullarda, divalent katyonlar olan Ca +2 ve Mg +2 un mikromolar konsantrasyonlarını içeren ortamda gelişme sonucu veya düşük ph ile indükleniyor 20

31 olabilir. PhoQ, Mg +2 ve Ca +2 için ayrı bağlanma bölgelerine sahiptir ve bu iki katyonun varlığında baskılanması en üst seviyede olmaktadır (Bearson 1998, Chessa vd. 2008) OmpD/EnvZ regülatör sistemi Hücre dışı ozmolariteye karşı oluşturulan cevap iki içerikli regülatör sistem OmpD /EnvZ tarafından kontrol edimektedir. OmpD, dış membran porları olan; OmpC ve OmpF nin ifadesini düzenlemektedir. S. Typhimurium, yüksek ozmolarite koşullarına maruz kalırsa OmpF nin seviyesi düşerken, membrandaki OmpC nin seviyesi artmaktadır. OmpC, yapı olarak OmpF den daha küçük çaptaki porlardır. Bakteri yüksek ozmolariteye maruz kaldığında membrandaki OmpC nin ifade edilmesiyle membranın zararlı maddelere karşı geçirgenliğinin düştüğü düşünülmektedir. ompc veya ompf deki nokta mutasyonlar S. Typhimurium da virülensliği azaltmamaktadır. Örneğin, farelere ağız yoluyla verilen ompcompf mutantlardaki virülensliğin büyük oranda düştüğü belirlenmiştir (Chaltfield vd. 1991). OmpR/EnvZ, ayrıca makrofajlar içindeki S. Typhimurium tarafından indüklenen geç hücre ölümünün başlaması için gereklidir. OmpR, ssra promotoruna doğrudan bağlanarak iki bileşenli SsrAB regülatör sisteminin aktivitesini kontrol etmektedir. OmpR ve EnvZ ayrıca, iplik şeklinde tübüler lizozomların oluşumu için gereklidir. OmpZ/EnvZ tarafından düzenlenen genlerin, Salmonella içeren fagozomların enfekte ökaryot sistemlerdeki hareketide de etkili olduğu düşünülmektedir (Lindgren vd. 1996, Lee vd. 2000, Hendrson vd. 2004, Gerlach vd. 2007) LysR-Tip transkripsiyonel regülatör sistemleri LysR-tip transkripsiyonel regülatör (LTTR) ailesi transkripsiyonel regülatörler içerisinde iyi karakterize edilmiş olan gruptur. LTTR ailesi ilk olarak Henikoff vd. (1988) tarafından tanımlanmıştır. DNA bağlanma bölgeleri (DBD) ve sekans benzerlikleri olan transkripsiyonel regülatörlerden en az dokuz fonksiyonunun farklılığıyla ayrılmaktadır. Farklı bakterilerin genomlarındaki LTTR lerin korunmuş bölgeleri bulunmaktadır. Bu proteinler; metabolizma, hücre bölünmesi, virülens, 21

32 hareketlilik, azot fiksasyonu ve oksidatif strese karşı oluşturulan cevap ve toksin üretimini sağlayan genlerin regülasyonunda rol almaktadır (Kovacikova ve Skorupski 1999, Deghmane vd. 2000, Deghmane vd. 2002, Cao vd. 2001, Kim vd. 2004, Russell vd. 2004, Bryne vd. 2007, Sperandio vd. 2007). Çoğu LTTR, hedef genlerin ifadesini aktive ederken kendi ifadelerini baskılamaktadır. Bunu sıklıkla farklı promotorları kullanarak yapmaktadırlar. Diğer bakteriyel transkripsiyon faktörleriyle ortak olarak LTTR ler homodimer veya heterodimer yapıda aktiftir. İkinci yapı tahmin metodlarına göre LTTR lerin DNA bağlanma bölgeleri heliks-dönüş-heliks (HTH) motifine benzer bir yapı göstermektedir. Çoğu HTH motifi içeren transkripsiyonel regülatörler, transkripsiyonel aktivatörler ve baskılayıcılar olmak üzere iki farklı gruba ayrılırlar. Tarnskripsiyonel aktivatörler karakteristik olarak HTH motifine C ucunda sahipken, baskılayıcılar bu motifte N ucunda sahiptir. HTH motifi N terminal uçtan amino asit uzağa lokalize olmuştur ve bu durum LTTR lere, kendilerini veya düzenledikleri diğer genleri aktive etme veya baskılama yeteneği kazandırmaktadır (Grob ve Guiney 1996, Zaim ve Kierzek 2003, Maddocks ve Onston, 2008). Salmonella daki virülens plazmidinin esas rolü tartışmalıdır. Bununla birlikte, plazmidi giderilmiş suşların spv lokusunun tamamlanması durumunda virülens fenotipi kazanmada etkili olduğu görülmüştür. Salmonella plazmidindeki spv bölgesi, bir regülonda yer alan spvrabcd yi içeren beş genden meydana gelmektedir. Bu lokusun regülatörü, 33 kda büyüklükte LysR-tip protein olan SpvR dir. SpvR, spvrabcd operonunun ifadesini, ayrıca makrofaj içinde üreme ve bakteriyel üremenin durma fazında kendi ifadesini baskılamaktadır. spvr nin virülens gen ifadesinin regülasyonu üzerindeki önemli fonksiyonu, hedef genlerin fonksiyonunun açıklamasıyla daha anlaşılır bir hale gelmiştir. spvb, farklı hücrelerde ve fare modellerinde ifade edilen aktini substrat olarak kullanarak aktin filamentlerini depolimerize eden, ADP-ribolizasyon enzimini kodlamaktadır (Sperandino vd. 2007, Maddocks ve Onston 2008, Lahiri ve Chakrovorty 2009). 22

33 3. MATERYAL VE YÖNTEM 3.1 Materyal Mikroorganizmalar Bu çalışmada kullanılan S. Typhimurium MA2 suşu, S. Typhimurium TH3923 suşu, kontrol olarak kullanılan S. Typhimurium LT2 suşu ve P22 fajı Ankara Üniversitesi Fen Fakültesi Biyoloji Bölümü, Prokaryot Genetiği Laboratuarı kültür koleksiyonundan sağlanmıştır Mikroorganizmaların saklama koşulları ve besiyerleri Bakterilerin geliştirilmesinde; Salmonella suşları için LB broth ve agar besiyeri kullanılmıştır. Bakteriler yukarıda belirtilen gelişme ortamlarına % 30 oranında steril gliserol ilave edilerek -20 C de saklanmıştır. Luria Bertani (LB) Broth ve Agar (Merck, Germany) Tripton Maya ekstratı NaCl Agar 10 g 5 g 10 g 15 g ph7.0±0.002 (sterilizasyondan önce) Ortam içerikleri 1000mL distile su içerisinde çözülmüş ve sterilizasyon, 121 C de 15 dakika süre ile yapılmıştır. 23

34 3.1.3 Çözeltiler Minimal E Ortamı MgSO 4. 7H 2 O Sitrik Asit K 2 HPO 4.3H 2 O NaNH 4 PO 4. 4H 2 O Distile Su 28,9 g 300 g 1965 g 525 g 3000 ml P22 Transdüksiyon Ortamı LB Broth Minimal E Ortamı Glukoz (% 20) P22 Faj Lizatı 97 ml 2 ml 1 ml 0,1 ml PBS NaCl KCl Na 2 HPO 4 KH 2 PO 4 8 g 0,2 g 1,44 g 0,24 g 24

35 Z Tampon Çözeltisi Na 2 HPO 4.7H 2 O Na 2 HPO 4.H 2 O KCl (1M) MgSO 4 (1M) β-merkaptoetanol (0,05M) 0,80 g 0,28 g 1 ml 0,05 ml 0,05 ml Ortama, hacim 40 ml ye ulaşıncaya kadar destile su ilave edilir. Tüm tuzlar çözülür. Ortam ph sı 2N HCl kullanılarak 7.0±0.002 olacak şekilde ayarlanır. Distile su ilavesi ile toplam hacim 50 ml ye tamamlanır. Sterilizasyon, 0,45µm por çaplı filtreden geçirilerek yapılır. Hazırlanan çözelti +4 C de saklanır. ONPG (o-nitrofenil-β-d-galaktozidaz) Çözeltisi ONPG Fosfat Tamponu 0,004 g 1 ml Fosfat Tampon Çözeltisi Na 2 HPO 4.7H 2 O Na 2 HPO 4.H 2 O Distile su 1,61 g 0,55 g 100 ml ph 7.0±0.002 Sterilizasyon 0,45 µm por çaplı filtreden geçirilerek yapılır. Hazırlanan çözelti +4 C de saklanır. 25

36 CTAB/NaCl Çözeltisi NaCl CTAB 4,1 g 10 g NaCl 80 ml destile su içerisinde çözülür. 10 g CTAB yavaş yavaş eklenir. CTAB ın çözünmesi için çözelti aralıklarla 65 C ye kadar ısıtılır. Son aşamada toplam hacim distile su ile 100 ml ye tamamlanır. Tris/HCl Çözeltisi (0.5 M EDTA ph8) Tris EDTA Distile su 1,21 g 0,37 g 1000 ml ph 7.0±0.002 (Sterilizasyondan önce) Sterilizasyon işlemi 121 C de 15 dk süre ile yapılır. %10 SDS Çözeltisi SDS Steril distile su 5 g 50 ml DNA Jel Yükleme Tampon Çözetisi Bromfenol mavisi Sakkaroz Steril distile su 0.25 ml 40 g 100 ml 26

37 % 20 Glukoz Çözeltisi Glukoz Distile su 0.7 g 20 ml Sterilizasyon işlemi 0.45 µm por çaplı filtreden geçirilerek yapılır. Fenol/Kloroform/İzoamil Alkol Çözeltisi Fenol Kloroform İzoamil alkol 25 ml 24 ml 1 ml Kloroform/ İzoamil Alkol Çözeltisi Kloroform İzoamil Alkol 24 ml 1 ml Liziz Tamponu (0.15M NaCl, 5mM EDTA, 50 mm Tris-HCl) NaCl EDTA Tris-HCl 0.43 g 0.09 g 0.3 g Proteaz inhibitör Karışımı (Roche) 1 tablet Ultra saf su su 50 ml ph 7.5±

38 Hazırlanan çözeltiye % 1 oranında olacak şekilde Np40 (Applichem) eklenir. Sterilizasyon işlemi 0.20µm por çaplı filtreden geçirilerek yapılır. Çözelti -20 C de saklanır. Dengeleme Tamponu I (6M Üre, 1.5M Tris-HCl) Üre Tris-HCl 4.3 g 3 ml % 10 SDS 2.4 ml Gliserol 2.4 ml Çözelti hazırlandıktan sonra son konsantrasyon % 2 olacak şekilde DDT eklenir. Kullanımdan önce bromfenol mavisi eklenir. Dengeleme Tamponu II (6M Üre, 1.5M Tris-HCl) Üre Tris-HCl 4.3 g 3 ml % 10 SDS 2.4 ml Gliserol 2.4 ml Çözelti hazırlandıktan sonra son konsantrasyon % 2.5 olacak şekilde iodoasetamid eklenir. Kullanımdan önce bromfenol mavisi eklenir. 28

39 Ekstraksiyon Tamponu % 1 Formik Asit 50 µl % 2 Asetonitril (ACN) 100 µl Ultra saf su 4.85 ml Fiksasyon (Tespit) Çözeltisi Metanol Asetik Asit Ultra saf su 100 ml 70 ml 830 ml Çözelti hazırlanırken öncelikle su konulur. Ardından diğer bileşenler eklenir. Yığma Jel (1 adet jel için) 0.5 M Tris-HCl 5.5 ml Akrilamid/Bisakrilamid 2.2 ml % 10 SDS 220 µl Ultra saf su 13.9 ml % 10 APS 110 µl TEMED 22 µl 29

40 Ayırıcı Jel (1 adet jel için) 1.5 M Tris-HCl ml Akrilamid/Bisakrilamid ml % 10 SDS µl Ultra saf su ml % 10 APS µl TEMED 39.7 µl Çözücü Solüsyon ACN 225 µl Ultra saf su 225 µl % 1 Trifloroasetik asit (TFA) (Supelco) 50 µl Matriks Çözeltisi 2 mg matriks 100 µl çözücü çözeltide ultra sonik su banyosunda çözülür. Daha sonra kısa süreli santrifüj uygulanarak süpernatant yeni bir mkrosantrifüj tüpüne alınır. Beş Peptit Karışımı 1mg/mL stok solüsyonu olan angiotensin, substans P, Glu Fib, Rennin-14pep ve ACTH-18,39 (Proteomass Maldi MS Standart, Sigma Chem Co., USA) peptit solüsyonlarından son konsantrasyonları 100 pmol olacak şekilde ultra saf su ile seyreltilerek her birinden eşit hacimde mikrosantrifüj tüpüne alınır. Üzerine 1/1 hacimde matriks çözeltisi eklenir. 30

41 3.1.4 Primerler Çalışmada kullanılan primerlerin dizilimleri ve PZR koşulları Çizelge 3.1 de verilmiştir. Çizelge 3.1 Çalışmada kullanılan primer ve sekansları Primer Primer sekansı(ileri/geri) T a /t e PZR ürünü (bç) T-POP CGCTTTTCCCGAGATCATATG/ GCACTTGTCTCCTGTTTACTCC 55 C/60 sn değişken cadc TTCGGCCCGCATAAAGTG/ TGCAATCCCGCTCCCCATCA 60 C/60 sn 2100 T a : Bağlanma sıcaklığı, t e : Bağlanma süresi Antibiyotikler Çizelge 3.2 Çalışmada kullanılan antibiyotik diskleri ve konsantrasyonları Antibiyotikler (Sembol) Antibiyotik Grubu Disk konsantrasyonu (µg) Amikasin (AK) Aminoglikozid 30 Streptomisin (STR) Aminoglikozid 10 Neomisin (NEO) Aminoglikozid 5 Kanamisin (KAN) Aminoglikozid 30 Gentamisin (GEN) Aminoglikozid 10 31

42 3.2 Yöntem S. Typhimurium da P22 faj lizatlarının hazırlanması ve faj titresinin yükseltilmesi %1 inokülasyon oranı ile LB broth ortamına aktarılan Salmonella suşları 37 C de 200 rpm çalkalama hızında 12 saat inkübasyona bırakıldı. Bu süre sonunda sonunda gelişen kültür ortamından alınan 1 ml lik hacimler üzerine 4 ml P22 transdüksiyon broth ortamı aktarıldı. Hazırlanan bu ortamlar 37 C de 200 rpm çalkalama hızında 12 saat inkübe edildikten sonra 8000 rpm de +4 C de 10 dakika santrifüj edilerek bakteriler ve hücre kalıntıları çöktürüldü. Üst sıvı yeni steril tüplere aktarıldı ve üzerine 0.2 ml kloroform ilave edilerek 30 saniye karıştırıldı. Bu işlem ayrıca üst sıvı 0.45 µm por çaplı filtreden (Sartorius, Germany) geçirilerek de gerçekleştirildi. Hazırlanan faj lizatları +4 C de saklandı. Hazırlanan faj lizatlarının titresini belirlemek için transdüksiyon broth ortamında 10-7 seviyesine kadar faj dilüsyonları hazırlandı. Bu dilüsyonlar 900 µl PBS içeren steril ortamlarda yapıldı. Aktif S. Typhimurium LT2 suş kültüründen LB agar ortamına 100 µl aktarılarak yayma ekim yapıldı. Agar yüzeyleri kuruduktan sonra her bir dilüsyondan uygun yerlere 10 µl damlatma yapıldı. 37 C de 18 saat inkübasyon süresinin sonunda faj plakları incelendi. Faj titreleri aşağıdaki formül kullanılarak hesaplandı (Sanderson ve Roth 1983, Margolin 1987, Casjens ve Hayden 1988). Faj Titresi (pfu/ml) : Plakların sayısı Dilüsyon Faktörü 1000 (µl/ ml) Damlatma miktarı (µl) T-POP transpoznunu içeren P22 faj lizatlarının hazırlanması T-POP transpozonunu içeren S. Typhimurium TH3923 (Carb R, Tet R ) suşu gerekli antibiyotikler eklenmiş LB broth ortamında % 1 inokülasyon oranı ile aktarılıp 37 C de 200 rpm çalkalama hızında 12 saat inkübasyona bırakıldı. İnkübasyon sonunda TH3923 suşundan 1 ml, P22 fajı için hazırlanmış transdüksiyon broth ortamından 4 ml alınıp steril tüpe aktarıldı ve 37 C de 200 rpm çalkalama hızında 12 saat inkübasyona tabi 32

43 tutuldu. İnkübasyon bitiminde 8000 rpm de +4 C de 10 dakika santrifüj işlemine tabi tutulan ortam 0.45 µm por çaplı membran filtrelerden (Sartorius, Germany) geçirilerek steril tüpe aktarıldı. T-POP transpozonunu içeren bu faj süspansiyonları, söz konusu transpozonun hedef suşlara aktarımında kullanıldı (Rappleye ve Roth 1997) T-POP transpozon mutasyonu Alıcı olarak kullanılan S. Typhimurium MA2 (StjE::LacZYA, Carb R, Cm R ) gerekli antibiyotikler ilave edilen LB broth ortamına % 1 inokülasyon oranı ile aktarıldı ve 37 C de 200 rpm çalkalama hızında 12 saat inkübasyona bırakıldı. Bu süre sonunda 0.1 ml alıcı suş ile 0.1 ml T-POP transpozonunu içeren P22 transdüksiyon broth karıştırıldı ve 37 C de 30 dk süre ile inkübasyona tabi tutuldu. Süre sonunda tetrasiklin ve X-Gal içeren agar ortamlarına yayma ekim yapıldı. 37 C de 18 saat süre ile inkübasyona bırakılan ortamlarda gelişen koyu mavi renkli koloniler öze ile alınarak aynı koloni hem tetrasiklin ve X-Gal içeren ve hem de sadece X-Gal içeren LB agara ekildi. Tekrar 37 C de 18 saat süre ile inkübasyona bırakılan ortamlarda aynı koloninin tetrasiklin ve X-Gal içeren ve sadece X-Gal içeren besiyerinde verdiği renk karşılaştırıldı. X-Gal içeren besiyerinde beyaz, tetrasiklin ve X-Gal içeren besiyerinde koyu mavi renk veya her ikisinde de koyu mavi renk veren koloniler tetrasiklin içeren LB broth ortamlarına alındı (Schmieger 1972, Rapplaye ve Roth 1997) β-galaktozidaz testi Transdüktantlar; tetrasiklin içeren LB broth ortamına % 1 oranında inoküle edildi ve 37 C de 200 rpm çalkalama hızında 12 saat geliştirildi. Aktif transdüktantlar bu kez tetrasiklin içeren ve içermeyen LB ortamlarına % 1 oranında inoküle edildi ve 3 saat yukarıda belirtilen inkübasyon koşullarında geliştirildi. Negatif kontrol olarak β-galaktozidaz aktivitesi içermeyen S. Typhimurium MA2 suşu kullanıldı. Optik yoğunlukları (OD 600 ) arasına ulaşan (yaklaşık 3 saat) bakteri kültürleriden 1 ml hücre süspansiyonu, 1 ml Z tampon içerisinde çözüldü. Seyreltilen hücre süspansiyonu üzerine 100 µl kloroform ve 50 µl % 0.1 SDS ilave edilerek karıştırılan tüpler, 28 C su banyosunda 5 dk inkübasyona tabi tutuldu. Reaksiyon, 0.2 ml ONPG 33

44 (o-nitrofenil-β-d-galaktozidaz, 4 mg/ml) (Fluka Biochemica, Switzerland) eklenerek başlatıldı ve bu ortamlar 28 C su banyosunda (GFL 1002, GFL GmbH., Germany) inkübe edildi. Reaksiyon uygun sarı renk oluşuncaya kadar sürdürüldü. Uygun sarı renk oluşumu saptandıktan ve bunun için geçen zaman kaydedildikten sonra reaksiyon 0.5 ml, 1M Na 2 CO 3 ilave edilerek durduruldu. Bu ortamdan alınan 1mL lik hacimler mikrosantrifüj tüplerine aktarıldı ve 5 dk santrifüj edilerek kloroform ve hücre çökeltisi uzaklaştırıldı. Her bir tüpteki üst sıvının optik yoğunluğu 420 nm ve 550 nm dalga boylarında ölçüldü (Shimadzu spektrophotometer, Japan). β-galaktozidaz aktivitesi aşağıdaki formül kullanılarak hesaplandı (Miller 1972): Miller Ünitesi: 1000 (OD OD 550 ) / (T V OD 600 ) T: Dakika olarak reaksiyon zamanları V: Deneyde kullanılan kültürün ml olarak hacmi Genomik DNA izolasyonu Çalışılan bakteri 5 ml LB broth ortamına % 1 oranında inoküle edildi ve 37 C de 200 rpm çalkalama hızında 12 saat süre ile geliştirildi. Bu süre bitiminde 1.5 ml kültür mikrosantrifüj tüplerine alındı ve rpm de 2 dk santrifüj edilerek bakteri hücreleri çöktürüldü. Üst svı ortamdan uzaklaştırıldıktan sonra, hücre çökeltisi 567 µl Tris- EDTA tampon içerisinde çözüldü. Üzerine 30 µl % 10 SDS ve 3 µl proteinaz K (20 mg/ ml, Sigma Chem Co., USA) aktarılıp karıştırıldı ve 37 C de 1 saat tutuldu. Ortama 100 µl 5M NaCl ilave edilerek karıştırıldı. 80 µl CTAB/NaCl çözeltisinin ilavesinin ardından kesik uçlu mikropipet uçları kullanılarak beyaz partikül yapısı oluşuncaya kadar iyice karıştırılan tüpler, 65 C de 10 dk tutuldu. Bu ortam üzerine 0.75 µl kloroform/izoamil alkol (24/1 hacim/hacim) aktarılıp karıştırıldı rpm de 5 dk santrifüj edilen ortamın üst fazı yeni mikrosantrifüj tüplerine alındı. Alınan faz üzerine 0.75 ml fenol/kloroform/izoamil alkol (25/24/1 hacim/hacim) ilave edildi ve rpm de 5 dk santrifüj işlemine tabi tutuldu. Santrifüj işleminin sonunda tüplerdeki üst sıvı yeni mikrosantrifüj tüplerine aktarıldı ve bu sıvının üzerine hacmin 0.6 sı (~350 µl) oranında izopropanol ilave edildi. Tüpler beyaz çökelti oluşuncaya kadar öne arkaya hareket ettirilerek karıştırıldı. Daha sonra rpm de 5 dk santrifüj 34

45 işlemi uygulandı. Üst sıvı döküldükten sonra çökelti üzerine 350 µl % 70 etanol eklenerek tekrar rpm de 5 dk santrifüj işlemine tabi tutuldu. Üst sıvı dikkatli bir şekilde ortamdan uzaklaştırıldı ve kromozomal DNA örneği oda sıcaklığında kurutuldu. Son aşamada DNA çözeltisi 100 µl TE tampon içerisinde yaklaşık 1 saat muamele edilerek çözüldü (Wilson 2001) Ters yön polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) S. Typhimurium dan izole edilen kromozomal DNA AluI restriksiyon endonükleaz enzimi (Fermentas, Finland) ile kesildi. Kesim reaksiyonu için 3 ayrı tüpte 85 µl kromozomal DNA izolasyon örneği, 5 µl AluI ve 10 µl kesim reaksiyon tamponu ile karıştırıldı ve 37 C de 2 saat tutuldu. Bu reaksiyonun gerçekleştirildiği üç tüp (toplam 300 µl) karıştırılıp üzerine 200 µl TE tampon ilave edildi. Ortam karıştırıldıktan sonra 500 µl fenol/kloroform/izoamil alkol (25/24/1 hacim/hacim) ilave edilerek rpm de 7,5 dk oda sıcaklığında santrifüj işlemine tabi tutuldu. Üst faz yeni mikrosantrifüj tüplerine aktarıldı ve 35 µl 3M sodyum asetat (ph 4.8) ve 700 µl saf etanol eklenerek yavaş bir şekilde karıştırıldı. Ortam -20 C de 30 dk bekletilerek DNA nın yoğunlaşması sağlandı ve rpm de 5 dk santrifüj edilerek çöktürüldü. DNA çökeltisi % 75 etanol ile yıkanarak oda sıcaklığında kurutuldu. DNA çökeltisi 75 µl steril destile su içerisinde çözüldükten sonra üzerine 20 µl T4 DNA ligaz tamponu (Fermentas, Finland) ve 5 µl T4 DNA ligaz enzimi ilave edildi. Ortam 15 C de 1 gece bekletildi. İnkübasyon süresinin sonunda tekrar 35 µl 3M sodyum asetat ve 700 µl saf etanol ilave edilerek karıştırıldı. -20 C de 30 dk tutulan ortam rpm de 5 dk santrifüj edilerek çöktürüldü. Kurutulan DNA çökeltisi % 75 etanol ile yıkanarak oda sıcaklığında kurutuldu. Son aşamada DNA örneği 10 µl saf su içerisinde çözülerek ters yön PZR işleminde şablon olarak kullanıldı. T-POP uç bölgeleri primer dizaynı için kullanıldı. Bu primerler birbirine zıt iki yön esas alınarak oluşturuldu. PZR için GeneAmp9700 Thermocycler (Applied Biosystems, USA) kullanıldı. PZR için kullanılan karışım ve PZR koşulları aşağıda belirtildiği şekilde hazırlandı ve uygulandı (Tükel vd. 2007). 35

46 PZR karışımı (tek reaksiyon için): - Steril distile su...36 µl - 10X PZR tampon MgCl 2 (Fermentas) 5 µl - dntp (2 mm Fermentas)...1 µl - İleri primer (Bioneer) 1 µl - Geri primer (Bioneer) 1 µl - MgCl 2 (25 mm Fermentas)...4 µl - Taq DNA polimeraz (5u/mL Fermentas)..1 µl - DNA..2 µl PZR koşulları: - 94 C 2 dakika - 94 C 30 saniye - 55 C 1 dakika 30 döngü - 72 C 5 dakika - 72 C 10 dakika - +4 C T a (bağlanma sıcaklığı, C) her bir primer için ayrı ayrı T a = 2 (A+T) + 4 (G+C) formülü kullanılarak hesaplandı. PZR sonrasında, elde edilen ürünlerden 10 µl alınarak 2 µl 6x yükleme boyası ile karıştırıldı ve % 1 oranında agaroz içeren jelde 100 volt elektrik akımı altında 1.5 saat koşturuldu. Bant büyüklüklerinin belirlenmesi amacı ile 1kb DNA Marker dan (Fermentas, Finland) yararlanıldı. Elektroforez sonrasında jeller, 0.2 µg/ml etidyum bromit (Sigma Chem. Co., USA) çözeltisinde 20 dakika süre ile boyama işlemine tabi tutuldu ve 366 nm dalga boyunda UV ışık altında görüntülenerek fotoğrafları çekildi (Kodak Gel Logic 200 Imaging System).Saflaştırılan DNA örneklerinin dizi analizi REFGEN (ODTÜ Teknokent, Ankara) firması tarafından yapıldı ve sonuçlar PSI- BLAST programı kullanılarak değerlendirildi. 36

47 3.2.7 cadc gen bölgesinin çoğaltılması Bu işlem için cadc gen bölgesine spesifik primerlerle PZR gerçekleştirildi. Yöntem Kim vd. (2001) önerilen şekilde optimize edilerek uygulandı. Bu amaçla GeneAmp9700 Thermocycler (Applied Biosystems, USA) kullanıldı. PZR u için kullanılan karışım ve PZR koşulları aşağıda belirtildiği şekilde hazırlanmış ve uygulanmıştır. PZR karışımı (tek reaksiyon için): - Steril distile su µl - 5X PZR tampon-mgcl 2 (Promega).10 µl - dntp µl - İleri primer (metabion) µl - Geri primer (metabion)....1 µl - MgCl 2 (25mM Promega)..4 µl - Taq DNA Polimeraz (5u/mL Promega) µl -DNA..2 µl PZR koşulları: - 95 C.5 dakika - 95 C.1 dakika - 60 C.1 dakika 30 döngü - 72 C.1 dakika - 72 C.5 dakika - 4 C.. 37

48 3.2.8 Antimikrobiyel duyarlılığın belirlenmesi Antibiyotik duyarlılık düzeylerinin belirlenmesinde Bauer ve arkadaşları (1966) tarafından önerilen antibiyotik disk difüzyon yöntemi modifiye edilerek kullanıldı. Kültürler steril öze aracılığı ile 4 ml LB broth ortamına inoküle edildi ve çalkalamalı (200 rpm) inkübatörde 37 C de 18 saat inkübasyona bırakıldı. İnkübasyon sonrasında, steril saf su ile 1:100 (hacim/hacim) oranında seyreltilen edilen örneklerden Müller Hinton (Oxoid, UK) agar plakaları üzerine yayma ekim yapıldı (100 µl). Antimikrobiyel ajanlar (Oxoid,UK) emdirilmiş 6 mm lik steril kağıt diskler, agar yüzeyine yerleştirildi ve 37 C de 18 saat inkübe edildi. Disk difüzyon yöntemi için 5 farklı antimikrobiyel madde kullanıldı. Kullanılan antimikrobiyel diskler ve içerikleri Çizelge 3.2 de verildi. İnkübasyon süresinin sonunda antibiyotik disklerinin etrafında oluşan zonların çapı ölçüldü ve iki paralelin ortalaması alınarak sonuçlar belirlendi Bradford yöntemi ile protein miktar tayini S. Typhimurium suşları 20 ml LB broth ortamına % 1 oranı ile inoküle edildi ve 37 C de 200 rpm çalkalama hızında 12 saat süre ile geliştirildi. Bu süre sonunda bakteri kültürü rpm de 2 dakika santrifüj edilerek bakteri hücreleri çöktürüldü. Üst sıvı ortamdan uzaklaştırıldıktan sonra hücre çökeltisi ağırlığının iki katı hacimde liziz tamponunda çözüldü. Hücrelerin parçalanması için ultrasonik su banyosunda (Transsonic 570/H, Elma, USA) 3 dakika bekletildi. Hücre parçalanmasının tamamlanması için 40 Amp. da sonikasyon (Ultrasonic processor, Sonics, Vibra cell, Taiwan) işlemi uygulandı. Bu işlemin ardından örnek rpm de 10 dakika santrifüj edilerek hücre kalıntıları çöktürüldü. Üst sıvı yeni mikrosantrifüj tüpüne aktarıldı. Protein miktarının belirlenebilmesi için protein ayıracı boya (Bio-Rad, USA) ile 1/40 oranında karıştırıldı. Spektrofotometrik ölçümde 250 µg/ml, 500 µg/ml, 750 µg/ml ve 1000 µg/ml konsantrasyonlarında BSA (sığır serum albumini) (ambresco,usa) kullanıldı. Örnekler, spektrofotometrede (Spectra Max M2, USA) 595 nm dalga boyunda ölçülerek protein miktarı belirlendi (Bradford 1976). 38

49 Sodyum Dodesil Sülfat (SDS) iki yönlü jel elektroforezi SDS-iki yönlü jel elektroforezi için ilk aşamada izoelektrik fokuslama yapıldı. Bu işlem için 17 cm lik ph 5-8 strip (Ready-Strip, Ipg Strip, Bio-Rad, USA) kullanıldı. Protein miktarı 175 µg/ml olacak şekilde alınarak son hacim rehidratasyon tamponuyla 300 µl ye tamamlandı. Hazırlanan karışım tanka yüklendi strip jel kısmı tanka gelecek şekilde yerleştirildi. Buharlaşmayı önlemek için stribin üzeri mineral yağ ile kaplandı. Rehidratasyon işlemi için stripler 20 C de 50 V akımda 15 saat süre tutuldu (Protean IEF Cell, Bio-Rad, USA) ve izoelektrik fokuslama gerçekleştirildi (Protean IEF Cell, Bio-Rad, USA). Elde edilen strip dengeleme tamponu I ve II ile 15 er dakika mumamele edilerek yığma jelde 70V, ayırıcı jelde 120V elektrik akımı altına 1 gece boyunca koşturuldu. Bant büyüklüklerinin belirlenmesi amacı ile Protein Ladder (BioRad, USA, kda) dan yararlanıldı. Elektroforez sonrasında jeller 45 dakika tespit (fiksasyon) çözeltisinde bekletildi. SYBRO Ruby Protein Jel Boyası (Bio-Rad, USA) ile bir gece muamele edilen jeller tekrar 45 dakika süreyle tespit çözeltisine alındı. Bu işlemin ardından jellerin fotoğrafları çekildi (Bio-Rad Versa Doc Model 1000) (Garrels 1979) MALDİ-Tof analizi Moleküler ağırlıkları ve izoelektrik noktalarına göre belirlenen protein spotları PD Quest programı kullanılarak jelden kesildi (Proteome Works Spot Cutter, Bio-Rad). Kesilen spotlar 200 µl ultra saf su eklenmiş 96 kuyucuklu mikroplakların içerisine alındı. Tripsinizasyon işlemi için öncelikle kuyucuklardaki su çekildi. Başlangıç yıkaması ve boya uzaklaştırması için; kuyucuklara 50 µl 100 mm NH 4 HCO 3 ve 50 µl asetonitril (ACN) ilave edildi ve 37 C de 10 dk inkübasyona tabi tutuldu. Pipetle çözeltiler geri çekilerek işlem tekrarlandı. Redüksiyon ve alkilasyon için; kuyucuklara 50 µl ACN ilave edildi ve 37 C de 5 dakika inkübe edildi. Bu sürenin ardından ACN geri çekilerek 37 C de 10 dakika daha inkübasyona tabi tutuldu. 50 µl 10 mm diklorodifeniltrikloretan (DDT) (Molecula, USA) ve 50 mm NH 4 HCO 3 ilave edilerek 37 C de 30 dakika inkübasyona bırakıldı. İnkübasyon süresi bitiminde 50 µl 55 mm iyodoasetamid ve 50 mm NH 4 HCO 3 çözeltisi ilave edilerek 37 C de 20 dakika 39

50 bekletildi. Bu süre sonunda kuyucuklara 100 µl ACN eklenerek 37 C de 5 dakika bekletildi. Son aşamada kuyucuklardaki tüm çözeltiler geri çekildi. Yıkama ve dehidratasyon işlemi için bu ortama 50 µl ACN ilave edilerek 37 C de 5 dakika bekletildi ve bu işlem üç kez tekrarlandı. Daha sonra konulan tüm çözeltiler geri çekilerek oda sıcaklığında 15 dakika bekletildi. Tripsinle kesim işlemi için; 5 ng/µl tripsin (Promega,) olacak şekilde 50 mm NH 4 HCO 3 çözeltisinde hazırlanmış enzim çözeltisinden 30 µl ilave edildi ve oda sıcaklığında 30 dakika bekletildi. Daha sonra plakanın üzeri streç filmle kaplanarak 37 C de bir gece boyunca inkübasyona bırakıldı ve ardından dakika oda sıcaklığında bekletildi. Ekstraksiyon işlemi için 30 µl ekstraksiyon tamponu ilave edildi ve oda sıcaklığında 30 dakika tutuldu. Kısa süreli bir santrifüj işleminin ardından üst faz PZR plakalarına alındı. 12 µl ekstraksiyon tamponu ve 12 µl ACN ilave edilerek ortam oda sıcaklığında 30 dakika bekletildi. Sıvı faz PZR plakasına tekrar aktarıldı ve 2-3 saat oda sıcaklığında tutularak kurutuldu. Tripsin le kesim işleminden sonra kurutulan örneklerin üzerine 1/1 hacimde çözücü solüsyonu ve matriks eklenerek maldi plakasına yüklenebilecek duruma geldi. Hazırlanan örneklerden µl hacimle maldi plakasına yükleme yapıldı ve örneklerin kuruması için beklendi. Analizde standart olarak hazırlanan beş peptit karışımı kullanıldı. Elde edilen sonuçlar MASCOT/Mass Finger Print programı kullanılarak değerlendirildi (Shevchenko vd. 2007). 40

51 4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA 4.1 Transpozon Mutasyonu Yöntemi ile stj Fimbriyal Operonunun İfadesinin Sağlanması Transpozon (T-POP) mutasyon yöntemi ile stj fimbriyal operonunun sağlanmasında Akkoç vd. (2009) tarafından oluşturulan stje::laczya füzyonuna sahip S. Typhimurium MA2 mutantı kullanılmıştır. Transpozaz genini içeren bu mutanta T-POP transpozonu transdüksiyon yöntemi ile aktarıldıktan sonra, stj fimbriyal operonunun ifadesi ilk aşamada fenotipik testlerle tanımlanmıştır. T-POP transpozonunu içeren P22 faj transdüksiyon broth ile S. Typhimurium MA2 mutantının muamelesinden sonra bu ortamlardan tetrasiklin (100 µg/ml) ve X-Gal (30 µg/ml) içeren agar ortamlarına yayma ekimler yapılarak 37 C de 1 gece tutulmuştur. İnkübasyon süresi sonunda agar ortamlarında tanımlanan koyu mavi koloniler tetrasiklin içeren ve tetrasiklin içermeyen LB broth ortamlarında geliştirilerek β-galaktozidaz aktiviteleri tespit edilmiştir. Salmonella da fimbriyal operonların ve patojenite ile ilişkili diğer moleküler elemanların ifadesi çoğu durumda bu organizmaların konakçı sisteme dahil olması ile teşvik edilmektedir. İn-vitro koşullarda yürütülen çalışmalarda fenotipik ifade, bir reporter gen ya da gen grubu ile gerçekleştirilen füzyon aracılığı ile tanımlanmaktadır (Marcus vd. 2000, Hanser-Wester ve Hensel 2001, Nuccino vd. 2007). Bu çalışmada reporter genler olarak laktoz operonu genleri kullanılmıştır (lacz; β-galaktozidaz geni, lacy; laktoz permeaz geni ve laca; giogalaktozit transferaz geni). S. Typhimurium MA2, stj operonu ile laczya genlerinin füzyonu gerçekleştirilmiş bir mutanttır. Bu mutantta laczya genleri stj operonunun promotorunun önüne klonlanmıştır. Dolayısı ile S. Typhimurium MA2 mutantında stj fimbriyal operonunun promotorunun aktif olduğu koşullarda (bir başka deyişle stj fimbriyasının üretildiği durumlarda) yüksek düzeyde β-galaktozidaz aktivitesi ortaya çıkacaktır (Rapplaye ve Roth 1997, Nuccio vd. 2007). 41

52 Tn10 türevi olan T-POP transpozonu, Salmonella genomu üzerinde yaklaşık 1000 farklı bölgeye girme yeteneğinde bir transpozondur. S.Typhimurium MA2 mutantında in-vitro koşullarda çok düşük β-galaktozidaz aktivitesi belirlenmesi, stj fimbriyal operonunun bu koşullarda ifade edilmediğini kanıtlamaktadır. Transpozon mutasyonu gerçekleştirilerek tetrasiklin ve X-Gal (yapay laktoz) içeren ortamlarda seçilen koyu mavi koloniler yüksek β-galaktozidaz aktivitesine işaret etmiştir. Zira bu yüksek β-galaktozidaz aktivitesi sayesinde yapay laktoz olan X-Gal parçalanmakta ve söz konusu substrata bağlı olan mavi renk salınmaktadır. Ortamdaki bu koyu mavi koloniler tetrasiklin içeren ve içermeyen LB broth ortamlarında geliştirildikten sonra β-galaktozidaz aktiviteleri Miller ünitesi cinsinden belirlenmiştir (Çizelge 4.1). Çizelge 4.1 Füzyon suş ve mutantların β-galaktozidaz aktiviteleri Füzyon Suş ve Mutantlar OD 600 (Z tampon ile) OD 550 OD 420 T (dk) Miller Ünitesi MA2 0,354 0,006 0,937 30, ,487 0,015 3,068 10, Tet 0,351 0,012 2,489 12, ,586 0,010 2,408 12, Tet 0,587 0,058 1,362 20, ,350 0,010 2,659 9, Tet 0,356 0,014 3,215 11,

53 Çizelge 4.1 Füzyon suş ve mutantların β-galaktozidaz aktiviteleri (devam) Füzyon Suş ve Mutantlar OD 600 (Z tampon ile) OD 550 OD 420 T (dk) Miller Ünitesi MA 2 0,674 0,03 1,614 21, ,361 0,005 2,709 8, Tet 0,600 0,023 3,612 8, ,405 0,007 2,914 10, Tet 0,397 0,006 2,498 17, ,359 0,012 2,395 6, Tet 0,511 0,007 2,914 7, ,327 0,092 2,515 8, Tet 0,729 0,012 3,612 5, Tetrasiklinin gelişme ortamında kullanılmasının nedeni T-POP transpozonunun tetrasiklin tarafından teşvik edilen bir promotor içermesidir. S. Typhimurium MA2 suşu ile yürütülen transpozon mutasyonunun stj fimbriyal operonu açma koşulu; T-POP transpozisyonu sonucunda bu hareketli elementin stj fimbriyal operonunu regüle eden genin promotor bölgesine lokalize olarak, tetrasiklin promotorunun indüksiyonu doğrultusunda regülatörü üretmesidir. Bu koşullardaki mutantlarda tetrasiklin ortamda iken T-POP promotoru (ve dolayısı ile regülatör gen) teşvik edilecek ve regülatörün üretimi sağlanacaktır. Eğer regülatör negatif bir regülatör ise tetrasiklin teşvikine bağlı olarak stj operonunun baskılanması, aksi durumda da aktivasyonu gerçekleşecektir 43

54 (Tükel vd. 2007, Jakomin vd. 2008). Bu çalışmada fenotipik tanı ile seçilen mutantlarda her iki durum da gözlenmiştir. 2, 18 ve 21 numaralı mutantlarda tetrasiklin içeren ve içermeyen ortamlarda belirgin bir şekilde β-galaktozidaz aktiviteleri birbirine yakın bulunurken; 7, 18 ve 20 numaralı mutantlarda tetrasiklin içeren ortamlarda belirgin bir β-galaktozidaz aktivite düşmesi saptanmıştır (Çizelge 4.1). Bu durum stj fimbriyal operonunun negatif bir regülatör tarafından regüle edildiğine işaret etmektedir. Zira T-POP transpozonun regülatör genin promotor bölgesini vurması halinde ortama tetrasiklin verildiğinde baskılama gerçekleşmektedir. Ancak bu durumda stj fimbriyal operonunun halen nasıl oluyor da ifade ediliyor olduğu açıklanamaz. İkinci olasılık ise T-POP transpozonunun regülatör genin promotorunun değil de doğrudan yapısal geninin içerisine lokalize olmasıdır ki bu çalışmadaki sonuçlar daha yüksek oranda söz konusu duruma işaret etmektedir. Böyle bir durumda negatif regülatörün üretimi engelleneceğinden baskılanma kalkmaktadır. Tetrasiklin varlığında β-galaktozidaz aktivitesindeki (dolayısı ile stj fimbriyal operonunun ifadesindeki) düşme böylesi bir olasılıkta mutasyonun pleitropik etkilerinden kaynaklanabilir. Regülatör genin tanısı ve bu olasılıkların belirlenmesi için, β-galaktozidaz aktivitesi esas alınarak seçilen mutantlarda T-POP transpozonunun bölge tayini çalışmalarına geçilmiştir. 4.2 Mutantlarda T-POP Transpozonunun Genoma Giriş Bölgesinin Belirlenmesi stj fimbriyal operonu aktive edilmiş mutantlarda ters yön (invörs) PZR yöntemi ile çoğaltılan transpozon giriş bölgelerinin dizi analizleri yapılarak olası regülatörler ve bunların mekanizmaları tespit edilmiştir. Genomik DNA izolasyonu yapılan mutantların AluI enzim kesimleri ve ters yön PZR leri gerçekleştirilmiştir. Genomik DNA, AluI kesim ve ters yön PZR sonuçları Şekil 4.1 de verilmiştir. 44

55 bç 3000 bç 1000 bç 250 bç Şekil 4.1 stj fimbriyal operonu aktive edilen mutantlarda ters yön PZR analiz 45

56 Kuyu Sırası Örnek Ürün 1-18 Marker bç Genomik DNA (Sırasıyla) AluI Enzim Kesimi (Sırasıyla) 19 2 (T a :52 C) 383 bç 20 2 (T a :55 C) 383 bç 21 7 (T a :52 C) 383 bç, 950 bç 22 7 (T a :55 C) 383 bç, 950 bç (T a :52 C) 383 bç (T a :55 C) 383 bç (T a :52 C) 383 bç, 950 bç (T a :55 C) 383 bç, 950 bç (T a :52 C) 383 bç (T a :55 C) 383 bç (T a :52 C) 383 bç (T a :55 C) 383 bç (T a :52 C) 383 bç (T a :55 C) 383 bç (T a :52 C) 383 bç (T a :55 C) 383 bç 35 Negatif Ters yön PZR çalışmasında esas; mutant genomlarında bilinmeyen bölgede bulunan T-POP transpozonunun giriş yerinin belirlenmesidir. Bu amaçla T-POP transpozonunun uç bölgelerine özgü ve birbirine ters yönde düzenlenmiş primerler, bu mutantların AluI enzimi ile kesilmiş DNA parçaları ile muamele edilmiş ve her bir parça ligasyon ile çevrimsel hale getirildikten sonra PZR nu gerçekleştirilmiştir. Bu sayede T-POP un entegre olduğu bölgeler çoğaltılmıştır. Tüm mutantlarda 383 baz çifti uzunluktaki bir 46

57 spesifik fragmentin çoğaltılması (Şekil 4.1), β-galaktozidaz aktivitesi artan (stj fimbriyası ifade edilen) fenotiplerde T-POP transpozonunun aynı bölgeye girdiğine işaret etmektedir. 7 ve 18 numaralı mutantlarda 383 bç dışında çoğaltılan ikinci bir bant (950 bç) ise spesifik olmayan PZR ürünüdür. PZR ürünlerinin tamamının PSI-BLAST programı kullanılarak değerlendirilmesi sonucunda; T-POP transpozonunun S. Typhimurium genomunda en olası giriş bölgeleri olarak çoklu ilaç dirençlilik gen bölgesi regülatörü (mdr), transkripsiyonel bir global regülatör olan cadc gen bölgesi, transkripsiyonel bir diğer regülatör LysR geni ve H-NS ailesi ile homoloji göstermiştir (Ek). Tüm mutantlarda aynı PZR ürünlerinin alınması ve çok benzer DNA dizi analizlerine sahip olmaları nedeniyle, çalışmalara yalnız 20 numaralı mutant ile devam edilmiştir. Bu çalışmalarda her bir aday gen ve buradan üretilen regülatörün stj fimbriyasının ifadesindeki etkinliği tek tek araştırılmıştır. 4.3 Çoklu İlaç Dirençlilik Regülatörünün stj Fimbriyal Operonu Üzerine Etkilerinin Araştırılması Çoklu ilaç dirençlilik regülatörlerinin fimbriyal operonlar üzerinde etkili olması şimdiye kadar bakterilerde tanımlanmış bir durum değildir. Bu nedenle çoğaltılan PZR ürününün dizi analizleri mdr regülatör gen dizi analizleri ile karşılaştırılmış ve ortak bölgelerin yalnız insert serilerde (IS-II) çakıştığı belirlenmiştir. Bu durum stj fimbriyal operonunun bu regülatör ile ilişkili ifadesinin söz konusu olmadığına işaret etmiştir. Bu sonuca ikinci bir kanıt, S. Typhimurium LT2 ve 20 numaralı mutantların antibiyotik duyarlılık testlerinden sağlanmıştır. Her iki bakteride de dirençli oldukları beş antibiyotiğe karşı dirençlilik düzeyleri birbirine çok yakın bulunmuştur (Çizelge 4.2). 47

58 Çizelge 4.2 S. Typhimurium LT2 suşu ve 20 numaralı mutantın antibiyotik duyarlılıkları Antibiyotik Duyarlılık LT2 20 Amikasin (30µg/mL) 17mm 20mm Streptomisin (10 µg/ml) 12mm 13mm Neomisin (5 µg/ml) 14mm 18mm Kanamisin (30 µg/ml) 19mm 21mm Gentamisin (10 µg/ml) 19mm 22mm Eğer T-POP transpozonu mdr genleri regülatörünün promotoruna lokalize olmuş olsa idi, 20 numaralı mutantta antibiyotik dirençlilik teşviki sonucu dirençlilik düzeyinde önemli bir artış olması doğal bir sonuçtur. İkinci olasılıkta, yani T-POP transpozonunun söz konusu regülatör genin içerisine girmesi durumunda ise beklenen sonuç 20 numaralı mutantta çoklu antibiyotik dirençlilik fenotipinin ortadan kalkmasıdır. Bu iki sonuçtan hiçbirinin gerçekleşmemesi, DNA dizi analiz verilerinin karşılaştırılmasından elde edilen sonucu kesinleştirmektedir. 4.4 CadC Regülatörünün stj Fimbriyal Operonu Üzerine Etkisinin Araştırılması CadC regülatörünün stj fimbriyal operonu üzerinde bir etkisinin bulunup blunmadığının belirlenmesi amacı ile ilk aşamada 7, 18 ve 20 numaralı mutantlarda cadc gen bölgesi çoğaltılarak (Şekil 4.2) dizi analizi yapılmıştır. Bu dizi analizlerinin PSI-BLAST programında incelenmesi sonucunda T-POP transpozonuna ait bir bölge ile eşleşmediği ve tamamının cadc dizileri olduğu saptanmıştır. Bu durum ters yön PZR verilerinin benzerliğinin sadece insert serilerden (IS-II) ileri geldiğine işaret etmiştir. 48

59 bç 2100 bç 3000 bç 1000 bç 250 bç Şekil 4.2 Doğal suş ve mutantlarda çoğaltılan cadc gen bölgesi Kuyu Sırası Örnek PZR Ürünü (bç) LT2 (Pozitif Kontrol) Negatif Kontrol - 6 Marker

60 Dizi analiz verilerinin fenotipik kanıtlarla desteklenmesi için seçilen üç mutantta ph 5.8 ve ph 7.8 de lisin içeren ve lisin içermeyen ortamlardaki β-galaktozidaz aktivitelerindeki değişimler incelenmiştir. Yürütülen çalışmalar sonucunda ph 5.8 ve ph 7.8 de mutantların β-galaktozidaz aktivitelerinde önemli bir değişimin meydana gelmediği saptanmıştır (Çizelge 4.3). Çizelge 4.3 Farklı ph değerlerinde füzyon suşun ve transpozon mutantlarının β-galaktozidaz aktiviteleri Füzyon Suş ve Mutantlar β-galaktozidaz Aktivitesi (Miller Ünitesi) ph 5.8 ph 7.8 MA Lys Lys Lys Bu bulgular cad lokusunun regülatörü olan cad geninin stj fimbriyal operonunun regülasyonunda doğrudan ya da dolaylı bir rol almadığının bir diğer kanıtıdır. Zira ağız yoluyla vücuda alınan enterik bakteriler, gastrik bariyeri aşma ve asidik koşullara adaptasyonda lisin dekarboksilaz aktivitesinden yararlanmaktadır. E. coli de bu aktivite, lisin dekarboksilaz (cada) ve lisin dekarboksilaz taşıyıcı protein (cadb) vasıtasıyla gerçekleşmektedir (Eink vd. 2007, Chuang vd. 2009). Ortamda lisin amino asidi varlığında aktive olan bu sistem lizini bazik kadaverine çevirerek ph dengesinin ayarlanmasına yardımcı olmaktadır. cada geninin bazı enterik bakterilerde epitel yüzeylerde tutunmada, bu yolla etkin olduğu bilinmektedir (Merrel ve Camilli 2002, Vazquez Jaurez vd. 2008, Yoon vd. 2009). Ancak lisin varlığı ve yokluğunda farklı ph 50

61 değerlerinde T-POP mutantlarında β-galaktozidaz aktivitesinde bir değişiklik meydana gelmemesi söz konusu regülatörün mutant suşlarda stj fimbriyasının ifadesinde herhangi bir rolü olmadığını kanıtlamaktadır. 4.5 stj Fimbriyal Operonunun İfadesi Üzerine LysR ve H-NS Regülatör Proteinlerinin Etkisinin Belirlenmesi Mutantlarda çoğaltılan ters yön PZR ürünlerinin LysR (ybdo) ve H-NS regülatör protein genleri ile IS-II serileri dışında da sekans benzerliği göstermesi, bu regülatörlerin stj fimbriyal operonunun regülasyonunda rol aldığına işaret etmektedir (Ek 1). DNA dizi analizlerinin kısmi benzerliği etkin bir kanıt niteliği taşımadığından, söz konusu regülatör proteinlerin mutantlarda ifadesinin arttığına dair kanıtlar için proteomik çalışmalar yapılmıştır. Bu çalışmalarda da, tüm mutantların aynı genotipik ve fenotipik karakteristiklere sahip olması nedeniyle, 20 numaralı mutant kullanılmıştır. S. Typhimurium LT2 suşunun ve 20 numaralı T-POP mutantının toplam protein profilleri 17 cm lik ph 5-8 strip kullanılarak SDS-iki yönlü jel sistemlerinde tanımlandı (Şekil 4.3 ve 4.4). 51

62 Marker ph:5 ph:8 80 kda 25 kda Şekil numaralı mutantın SDS-iki yönlü jel elektroforezi ile belirlenen toplam protein profilleri 52

63 Marker ph:5 ph:8 80 kda 25 kda Şekil 4.4 S. Typhimurium LT2 suşunun SDS-iki yönlü jel elektroforezi ile belirlenen toplam protein profilleri İki yönlü jel elektroforezi yapılan örneklerde izoelektrik noktalarına ve moleküler büyüklüğüne göre seçilen ve ana suş ile farklanma olan protein spotlarının MALDİ- TOF analizleri yapıldı. Elde edilen sonuçlar Mascot-Peptit Mass Fingerprint programında değerlendirildi. Bu sonuçlara göre kontrol olarak kullanılan S. Typhimurium LT2 suşunda stjb proteini tanımlanamazken 20 numaralı mutantta tripsin enzimi kesimi sonucu oluşan peptitlerden , , , , , , , Dalton olan sekiz ortak peptitle stjb proteininin ifade edildiği saptanmıştır (Şekil 4.5). 53

64 Şekil numaralı mutanta ait tripsin enzim kesimi sonucu stjb ile ortak olan peptitler 54

65 Şekil numaralı mutanta ait tripsin enzim kesimi sonucu stjb ile ortak olan peptitler (Devam) Bu bulgu β-galaktozidaz aktivitesiyle belirlenen, mutanttaki Stj fimbriyal protein üretim düzeyindeki artışı gösteren sonuçları desteklemektedir. SDS-iki yönlü jel elektroforezinde stjb olarak tanımlanan protein spotu Şekil 4.6 da verilmiştir. 55

66 a b stjb cadc Şekil 4.6.a Kontrol olarak kullanılan S. Typhimurium LT2 suşu, b. 20 numaralı mutanta ait SDS-iki yönlü jel elektroforezi ile belirlenen stjb ve cadc protein spotları Bu sonuçlar 20 numaralı T-POP mutantında transpozonun girdiği bölgenin stj fimbriyal operonunu aktive ettiğini kesinleştiren kanıtlardır. Beş farklı genden oluşan stj operonu (stja, stjb, stjc, stjd ve stje) sadece S. Typhimurium genom dizi analizlerinden elde edilen verilerin, E. coli genomu ile karşılaştırılması sonucu teorik olarak tanımlanmıştır (McClelland vd. 2001). Bundan sonra 2009 yılına kadar stj operonu ile ilgili herhangi bir yayın yapılmamıştır. Akkoç vd. (2009), S. Typhimurium LT2 ve onun stj operonu bozulmuş mutantları ile yürüttükleri çalışmalarda, stj operonunun fare model sistemlerde gastrointestinal sistemde kalıcılık üzerinde önemli bir etkinliğe sahip olduğunu tanımlamıştır. Çalışmamızda elde edilen protein analiz verileri; S. Typhimurium da stj fimbriyasının, bu bakterinin konakçı sisteme dahil olması sonucu (in vitro koşullarda) üretildiğini kesin bir şekilde kanıtlamıştır. Salmonella enterica nın yaklaşık 2500 serotipi çerisinde sadece serovaryete Typhimurium da bulunan bu fimbriyal operonun (McClelland vd. 2001, Akkoç vd. 2009) regülasyonunun 56

67 belirlenmesi, serovaryete evrimi açısından da büyük önem taşımaktadır. Bu amaçla doğal suş ve mutantta protein profillerindeki tüm farklılıklar dikkate alınarak analizlere devam edilmiştir. Bu farklanmada belirginlik gösteren bir protein bandı sira dır. SirA için tanımlanan olası bantlar Şekil 4.7 de verilmiştir. a b sira Şekil 4.7.a Kontrol suş olarak kullanılan S. Typhimurium LT2 suşu, b. 20 numaralı mutanta ait SDS-iki yönlü jel elektroforezi ile belirlenen sira protein spotları S. Typhimurium da bara ve sira genleri iki bileşenli sensör kinazı ve cevap regülatörü kodlamaktadır. Bu sistem virülens genlerinin ifadesini arttırmasının yanında, hareket genlerinin ifadesini azaltmaktadır. Flagellar genlerin temel regülatörü flhdc, intestinal virülens etmenlerinin birincil regülatörü olan hila üzerinde pozitif regülatör etkisi 57

68 göstermektedir. SirA sisteminin ayrıca Tip1 fimbriyayı kodlayan fim operonunu kontrol ettiği belirlenmiştir. Diğer bakterilerdeki sira ortologlarının ve S. Typhimurium daki sira regülonunun tüm üyelerinin biofilm üretimi in vitro koşullarda test edilmiş ve sira mutanlarda biofilm oluşumunun gerçekleşmediği saptanmıştır (Teplitski vd. 2003, Teplitski vd. 2006, Bodero vd. 2006, Foley ve Lynne 2008, Dorman ve Corcoran 2009). Söz konusu sira protein bantları ile yürütülen enzim kesimi sonucunda kontrol suş S. Typhimurium LT2 da; , , , ve Dalton olmak üzere beş ortak peptitle sira proteini tanımlanmıştır (Şekil 4.8). Şekil 4.8 S. Typhimurium LT2 suşuna ait tripsin enzim kesimi sonucu sira proteini ile ortak olan peptitler 58

69 Şekil 4.8 S. Typhimurium LT2 suşuna ait tripsin enzim kesimi sonucu sira proteini ile ortak olan peptitler (Devam) 59

70 Ancak 20 numaralı mutant suşta sadece , , ve Dalton büyüklükte olan dört ortak peptit bulunmuştur (Şekil 4.9). Şekil numaralı mutanta ait tripsin enzim kesimi sonucu sira proteini ile ortak olan peptitler 60

71 Şekil numaralı mutanta ait tripsin enzim kesimi sonucu sira proteini ile ortak olan peptitler (Devam) Aktivatör SirA proteinin doğal ve mutant suşta üretiliyor olması; özellikle stj operonunun doğal suşta ifade edilmediği göz önünde bulundurulur ise, stj fimbriyal operonunun regülasyonuna katılmadığına işaret etmektedir. CadC regülatör proteinin genetik ve fenotipik verileri stj fimbriyal operonunun regülasyonuna katılmadığını göstermiş olmasına rağmen, söz konusu proteinin olası bölgesinde iki yönlü SDS-PAGE analizleri sonucu ifadesi artmış bir bandın görülmesi (Şekil 4.6) nedeni ile tripsinizasyon bantları değerlendirilmiştir. Bu işlem sonrasında 20 numaralı mutant için sadece , , ve Daltonluk dört adet peptidin belirlenmesi (Şekil 4.10) ve söz konusu bandın S. Typhimurium LT2 için tanımlanamaması, bu regülatörün dolaylı bir şekilde stj operonunun regülasyonuna katıldığı olasılığına işaret etmektedir. Ancak bu durum büyük olasılıkla T-POP mutasyonunun pleitropik etkisinden kaynaklanmaktadır. Bu öngörünün kesinlik kazanması için söz konusu doğal suş ve mutantın mikrodizin analizlerinin yapılması zorunludur. 61

72 Şekil numaralı mutanta ait tripsin enzim kesimi sonucu cadc proteini ile ortak olan peptitler 62

73 Son olarak S. Typhimurium LT2 doğal suşunda iki yönlü SDS-PAGE sistemlerinde tanımlanan, ancak 20 numaralı mutantta bulunmayan ybdh proteini (Şekil 4.11), LT2 protein jellerinden kesilerek tripsinizasyona tabi tutulmuş ve , , ve Dalton büyüklüğünde dört ortak peptit ile Mascot-Mass Fingerprint programında tanımlanmıştır (Şekil 4.12). a b ybdh Şekil 4.11.a Kontrol suş olarak kullanılan S. Typhimurium LT2, b. 20 numaralı mutanta ait SDS-iki yönlü jel elektroforezi ile belirlenen ybdh protein spotu 63

74 Şekil 4.12 S. Typhimurium LT2 suşuna ait tripsin enzim kesimi sonucu ybdh proteini ile ortak olan peptitler 64