BAZI DENTAL SİMANLARIN SALMONELLA / MİKROZOM TEST SİSTEMİ İLE MUTAJENİK POTANSİYELLERİNİN BELİRLENMESİ

Transkript

1 BAZI DENTAL SİMANLARIN SALMONELLA / MİKROZOM TEST SİSTEMİ İLE MUTAJENİK POTANSİYELLERİNİN BELİRLENMESİ DETECTION OF MUTAGENİC POTENTİALS OF SOME DENTAL CEMENTS BY SALMONELLA / MICROSOME TEST SYSTEM ÇİĞDEM KAPLAN (FE99G2926) Hacettepe Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Yönetmeliğinin Biyoloji Anabilim Dalı İçin Öngördüğü BİLİM UZMANLIĞI TEZİ olarak hazırlanmıştır

2 Fen Bilimleri Enstitüsü Müdürlüğü'ne, Bu çalışma jürimiz tarafından BİYOLOJİ ANABİLİM DALI'nda BİLİM UZMANLIĞI TEZİ olarak kabul edilmiştir. Başkan :...(İmza)... Prof.Dr. Saime Şahin Üye (Danışman) :....(İmza)... Doç.Dr. Nuran Diril Üye :...(İmza)... Prof.Dr. Çervin Çırakoğlu Üye :...(İmza)... Prof.Dr. Erol Aksöz Üye :...(İmza)... Doç.Dr. Afife İzbırak ONAY Bu tez.../.../... tarihinde Enstitü Yönetim Kurulunca belirlenen yukarıdaki jüri üyeleri tarafından tarihinde kabul edilmiştir..../.../... Prof.Dr. Seyfi KULAKSIZ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ MÜDÜRÜ 2

3 Canım Babama, Yıllar geçti önümden Sen her an baş ucumdaydın Uzaktan seyrediyordun her adımımı Biliyorum ki gururla bu benim kızım diyordun İyi ki yanımdasın BABALAR GÜNÜN KUTLU OLSUN SENİ ÇOK SEVİYORUM 3

4 BAZI DENTAL SİMANLARIN SALMONELLA / MİKROZOM TEST SİSTEMİ İLE MUTAJENİK POTANSİYELLERİNİN BELİRLENMESİ. Çiğdem Kaplan Hacettepe Üniversitesi, Biyoloji Bölümü, Moleküler Biyoloji Anabilim Dalı ÖZ Çalışmamızda, bir adet çinko fosfat siman (Poscal), bir adet polikarboksilat siman (Aqualox) ve iki adet cam iyonomer simanın (Argion, Meron) mutajenik potansiyelleri üzerine inkübasyon süresinin, ekstraksiyon için kullanılan serum fizyolojik ile dimetil sülfoksitin (DMSO) ve metabolik aktivasyon sisteminin etkisi Salmonella / mikrozom test sistemi ile Salmonella typhimurium TA98, TA100, TA102 ve TA1535 suşları kullanılarak araştırılmıştır. Test edilen simanlardan Poscal ın S.typhimurium TA98 suşunda (S9, DMSO, 24 saat, 100 µl/petri) mutajenik etki, S.typhimurium TA1535 suşunda (S9, serum fizyolojik, taze, 25 µl/petri) zayıf mutajenik etki gösterdiği; Aqualox un S.typhimurium TA98 suşunda (S9 +, DMSO, 24 saat, 12.5, 25, 50 ve 100 µl/petri; S9 +, serum fizyolojik, 24 saat, 12.5 ve 25 µl/petri) mutajenik etki, S.typhimurium TA1535 suşunda (S9 +, DMSO, serum fizyolojik, taze 100 µl/petri) zayıf mutajenik etki gösterdiği; Meron un sadece S.typhimurium TA98 suşunda (S9, DMSO, taze, 25, 50 ve 100 µl/petri) mutajenik etki gösterdiği; Argion un ise S9 varlığı ve yokluğunda denenen tüm suşlarda mutajenik etki göstermediği bulunmuştur. Çalışma sonunda elde edilen sonuçlara SPSS programı ile çok etkenli varyans çözümlemesi yapılarak değerlendirildiğinde, 0.05 ve 0.10 yanılma düzeyinde S9 fraksiyonunun, çözücü tipinin, inkübasyon süresinin ve farklı dozların mutajenik potansiyelin ortaya çıkarılmasında etkili olduğu belirlenmiştir. Anahtar Kelimeler: Çinko fosfat simanlar, karboksilat simanlar, cam iyonomer simanlar, Salmonella / mikrozom test sistemi (Ames testi), mutajenite Danışman: Doç. Dr. Nuran Diril, Hacettepe Üniversitesi, Biyoloji Bölümü, Moleküler Biyoloji Anabilim Dalı 4

5 DETECTION OF MUTAGENİC POTENTİALS OF SOME DENTAL CEMENTS BY SALMONELLA / MICROSOME TEST SYSTEM Çiğdem Kaplan Hacettepe Üniversitesi, Biyoloji Bölümü, Moleküler Biyoloji Anabilim Dalı ABSTRACT Çalışmamızda, Salmonella / mikrozom test sistemi ile bir adet çinko fosfat siman (poscal), bir adet polikarboksilat siman (aqualox) ve iki adet cam iyonomer simanın (argion, meron) Salmonella typhimurium TA98, TA100, TA102 ve TA1535 suşlarında mutajenik potansiyelleri üzerine inkübasyon süresi, çözücü olarak kullanılan serum fizyolojik ile dimetil sülfoksitin (DMSO) ve metabolik aktivasyon sisteminin etkisi araştırılmıştır. Test edilen simanlardan poscalın S.typhimurium TA98 suşunda (S9, DMSO, 24 saat, 100 µl / petri) mutajenik etki, S.typhimurium TA1535 suşunda (S9, serum fizyolojik, taze, 25 µl / petri) zayıf mutajenik etki gösterdiği; aqualoxun S.typhimurium TA98 suşunda (S9 +, DMSO, 24 saat, 12.5, 25, 50 ve 100 µl / petri; serum fizyolojik, 24 saat, 12.5 ve 25 µl / petri) mutajenik etki, S.typhimurium TA1535 suşunda (S9 +, DMSO, serum fizyolojik, taze 100 µl / petri) zayıf mutajenik etki gösterdiği; meronun sadece S.typhimurium TA98 suşunda (S9, DMSO, taze, 25, 50 ve 100 µl / petri) mutajenik etki gösterdiği; argionun ise S9 varlığı ve yokluğunda denenen tüm suşlarda mutajenik etki göstermediği bulunmuştur. Çalışma sonunda elde edilen sonuçlara SPSS programı ile çok etkenli varyans çözümlemesi yapılarak değerlendirildiğinde, 0.05 ve 0.10 yanılma düzeyinde S9 fraksiyonunun, çözücü tipinin, inkübasyon süresinin ve farklı dozların mutajenik potansiyelin ortaya çıkarılmasında etkili olduğu belirlenmiştir. Anahtar Kelimeler: Dental simanlar, Salmonella / mikrozom test sistemi (Ames testi), mutajenite, S9 fraksiyonu. Danışman: Doç. Dr. Nuran Diril, Hacettepe Üniversitesi, Biyoloji Bölümü, Moleküler Biyoloji Anabilim Dalı 5

6 TEŞEKKÜR Tez çalışmam boyunca ilerlediğim her adımda yanımda olan ve maddi manevi her türlü desteği veren tez danışman hocam Sayın Doç. Dr. Nuran Diril e; Tez çalışmamın deneysel kısmının istatistiksel olarak planlanması ve değerlendirilmesinin her aşamasında yardımlarını esirgemeyen Sayın Doç. Dr. Tülay Saraçbaşı na, deneysel aşamada kullanılan tüm kimyasal maddelerin sağlanmasında yardımcı olan Sayın Prof. Dr. Saime Şahin ve Dr. Murat Çehreli ye; Tüm tez çalışmam boyunca yardımlarını esirgemeyen, her sabah sıcak çayı ve güler yüzü ile içimizi ısıtan Sayın Prof. Dr. Çervin Çırakoğlu na; Tez çalışmamın başlangıcından bitişine kadar maddi manevi her türlü desteği sağlayan en yakın dostum Bilim Uzm. Hatice Eroğlu Şanlı ya; Tez çalışmamın her evresinde en büyük yardımcım ve arkadaşlarım olan özel çalışma öğrencileri Sayın Ayşe Yeşbek ve Bilsev Koyuncu'ya; Tüm tez çalışmam sırasında yardımlarını esirgemeyen Arş.Gör. Emine Öksüzoğlu, Uzm. Hasan Ünal ve Tek. Yard. Vedat Mutlu ya ve Moleküler Biyoloji Anabilim Dalındaki tüm hocalarım ve arkadaşlarıma; maddi ve manevi desteklerini esirgemeyen dostlarım Yoldaş Gökhan Ilgar, Zeynep Sayar, Çağla Karademir, Tolga Mutaf ve Hakan Bulut a; Beni var edip bu günlere ulaşmamı sağlayan ve iyi kötü her anımda eksikliğini hiç hissetmediğim canım annem ve babam Aysel ve Sami Kaplan a, kardeşten çok en yakın dostum olan Cihan Kaplan a; annem kadar sevdiğim bir tanecik teyzem Selma Şahin e ve stresli zamanlarımda kaprislerimi çeken herkese sonsuz teşekkürler. 6

7 İÇİNDEKİLER DİZİNİ Sayfa ÖZ...i ABSTRACT...ii TEŞEKKÜR...iii İÇİNDEKİLER DİZİNİ...iv ŞEKİLLER DİZİNİ...vii ÇİZELGELER DİZİNİ...viii 1. GİRİŞ GENEL BİLGİ Biyomateryaller Dental Materyallerin Biyolojik Sistemler ile Uygunlukları Dental Simanlar Fosfat Simanlar Polikarboksilat Simanlar Cam İyonomer Simanlar Kısa Zamanlı Mutajenite Test Sistemleri Ames Test Sistemi Ksenobiyotiklerin Biyotransformasyonu MATERYAL VE METODLAR

8 3.1. Kullanılan Test Suşları Kimyasal Maddeler Çalışmada Kullanılan Kimyasal Maddeler Pozitif Mutajenler Diğer Kimyasal Maddeler Çalışmada Kullanılan Kimyasal Maddeleri Hazırlanması Çalışmada Kullanılan Besi Ortamları ve Çözeltiler Çalışmada Kullanılan Test Suşlarının Üretilmesi Çalışmada Kullanılan Test Suşlarının Genetik İşaretlerinin Kontrolü Histidin Gereksiniminin Kontrolü R Faktörünün Kontrolü paq1 Plazmit Varlığının Kontrolü rfa Mutasyonunun Kontrolü uvrb Mutasyonunun Kontrolü Kendiliğinden Geriye Dönen Koloni Sayısının Kontrolü Çalışmada Kullanılan Test Suşlarının Saklanması Dondurulmuş Örneklerin Hazırlanması Master Plakların Hazırlanması Memeli Karaciğeri S9 Fraksiyonunun Hazırlanması Rat Karaciğeri Enzim İndüksiyonu Karaciğer S9 Fraksiyonunun Hazırlanması.41 8

9 S9 Karışımının Hazırlanması Ames Mutajenite Test Sistemi Sitotoksik Etkinin Saptanması Plak İnkorporasyon Testi Sonuçların Değerlendirilmesi SONUÇLAR Ames Test Sisteminde Kullanılan Suşların Üreme Durumları Salmonella / Mikrozom Test Sonuçları Poscal a Ait Sonuçların Değerlendirilmesi Aqualox a Ait Sonuçların Değerlendirilmesi Argion a Ait Sonuçların Değerlendirilmesi Meron a Ait Sonuçların Değerlendirilmesi ÖNERİLER VE TARTIŞMA.. 69 KAYNAKLAR.82 ÖZGEÇMİŞ

10 ŞEKİLLER DİZİNİ Sayfa Şekil 2.1. Şekil 2.2. Simanların Sınıflandırılması.7 Ksenobiyotiklerin vücut içerisine girişi, dağılması ve atılım yolları..25 ÇİZELGELER DİZİNİ Sayfa Çizelge 2.1. Biyomateyallere karşı ilk 24 saatte meydana gelebilecek hücre cevapları....5 Çizelge 2.2. Hasar sonrası konak dokudaki morfolojik değişiklikler ve bu değişikliklerin belirlenebileceği test sistemleri...6 Çizelge 2.3. Çizelge 2.4 Çizelge 2.5. Dental simanlar ve kullanım alanları.. 8 Simanların fiziksel ve mekanik özellikleri... 9 Simanların karıştırıldıktan sonra belli süreçler İçerisinde gösterdikleri ph değerleri Çizelge 2.6. Mine dokusunun dental simandan kaynaklanan flor miktarı ve asit çözünürlüğünde gösterdiği değişiklikler. 10 Çizelge 2.7. Fosfat (Çinko fosfat) simanın toz ve likit bileşimi...11 Çizelge 2.8. Polikarboksilat simanın bileşimi Çizelge 2.9. Cam iyonomer simanın tozunda kullanılan maddenin bileşimi

11 Çizelge Mutajenlerin saptanması için geliştirilmiş kısa zamanlı test sistemleri ve bunların dayandığı genetiksel ve biyokimyasal yollar...16 Çizelge Salmonella mutant suşlarının genetik özellikleri.. 21 Çizelge 2.12 En önemli biyotransformasyon tepkimeleri ve bu tepkimelerde değişime uğratılan fonksiyonel gruplar. 29 Çizelge 3.1. Çalışmada Kullanılan Kimyasal Maddeler.. 32 Çizelge 4.1. Poscal ın S. typhimurium TA 98, 100, 102 ve 1535 mutant suşlarında S9 fraksiyonu yokluğunda gösterdiği plak inkorporasyon testi sonuçları...46 Çizelge 4.2. Poscal ın S. typhimurium TA 98, 100, 102 ve 1535 mutant suşlarında S9 fraksiyonu varlığında gösterdiği plak inkorporasyon testi sonuçları...47 Çizelge 4.3. Poscal a ait sonuçlarının çok etkenli varyans analizi tablosu Çizelge 4.4. Aqualox un S. typhimurium TA 98, 100, 102 ve 1535 mutant suşlarında S9 fraksiyonu yokluğunda gösterdiği plak inkorporasyon testi sonuçları...52 Çizelge 4.5. Aqualox un S. typhimurium TA 98, 100, 102 ve 1535 mutant suşlarında S9 fraksiyonu varlığında gösterdiği plak inkorporasyon testi sonuçları...53 Çizelge 4.6. Aqualox a ait sonuçların çok etkenli varyans analizi tablosu Çizelge 4.7. Argion un S. typhimurium TA 98, 100, 102 ve 1535 mutant suşlarında S9 fraksiyonu yokluğunda gösterdiği plak inkorporasyon testi sonuçları

12 Çizelge 4.8. Argion un S. typhimurium TA 98, 100, 102 ve 1535 mutant suşlarında S9 fraksiyonu varlığında gösterdiği plak inkorporasyon testi sonuçları...59 Çizelge 4.9. Argion a ait sonuçların çok etkenli varyans analizi tablosu..60 Çizelge Meron un S. typhimurium TA 98, 100, 102 ve 1535 mutant suşlarında S9 fraksiyonu yokluğunda gösterdiği plak inkorporasyon testi sonuçları...63 Çizelge Meron un S. typhimurium TA 98, 100, 102 ve 1535 mutant suşlarında S9 fraksiyonu varlığında gösterdiği plak inkorporasyon testi sonuçları Çizelge Meron a ait sonuçların çok etkenli varyans çözümlemesi tablosu 65 12

13 1. GİRİŞ Biyomateryaller, vücudun zarar görmüş veya işlevini yitiren parçalarının onarımı, yeniden yapılandırılması veya yerini alması için özel olarak tasarlanmış seramiklerin geliştirilmesi ile meydana getirilmişlerdir. İnorganik malzemelerin önemli bir grubunu oluşturan bu malzemeler, özellikle sağlık sektöründe çok çeşitli uygulamalarda kullanılmaktadır. Diş hekimliğinde en yaygın kullanılan biyomateryaller ise, simanlardır (Zaimoğlu, 1993; Ratner et al., 1996; Craig and Ward, 1997; O Brein, 1997). Simanlar dişhekimliğinde sabit protezlerin simantasyonu ve kayıp diş dokularının restorasyonu amacı ile kullanılmaktadır (Zaimoğlu, 1993; Craig and Ward, 1997; O Brein, 1997; Billington et al., 2001; Ewoldsen and Demke, 2001). Restoratif dental materyallerin klinik uygulamalarda düzenli olarak kullanılması, bu materyallerin fiziksel, kimyasal ve biyolojik özelliklerinin daha geniş şekilde incelenmesine neden olmuştur (Faivre et al., 1991; Rainer and Gülzow, 1999; Persson-Sjögren and Sjögren, 2002; Çelebi ve Nalbant, 2002; Fleming and Narayan, 2003). Günümüzde, ağız içi materyallerin geliştirilmesinde sadece bu materyallerin kuvveti, estetiği veya fonksiyonel özellikleri değil aynı zamanda bunların biyolojik sistemlerle uyuşması da göz önünde tutulur. Bu nedenle Amerikan Ulusal Standartlar Enstitüsü ve Amerikan Dişhekimleri Birliği (ANSI/ADA) 1972 de dişhekimliğinde kullanılan araç ve gereçlere yönelik dental materyallerin biyolojik değerlendirilmeleri için gerekli standart uygulamaları içeren 41 numaralı belgeyi hazırlamıştır. Bu belgede biyolojik sistemlerle ağız içi materyallerin uyumluluğunu saptamak için in vitro test sistemleri önerilmektedir. Bu sistemlere Ames test sistemi de 1982 yılında eklenmiştir (Ratner et al., 1996; Craig,1997). Bu çalışmada, Salmonella / mikrozom test sistemi ile bir adet çinko fosfat siman (Poscal), bir adet polikarboksilat siman (Aqualox) ve iki adet cam iyonomer simanın (Argion, Meron) S. typhimurium TA98, TA100, TA102 ve TA1535 suşlarında mutajenik potansiyelleri üzerine inkübasyon süresi, ekstraksiyon için kullanılan serum fizyolojik ve DMSO nun ve memeli metabolik aktivasyon sisteminin etkisi araştırılmıştır. 13

14 2. GENEL BİLGİ 2.1. Biyomateryaller Biyomateryaller insan vücudunda işlevini yitirmiş ya da yitirmekte olan pek çok dokunun işlevini yerine getirmek veya desteklemek için kullanılan doğal ya da sentetik malzemelerdir. Bu malzemelerin geliştirilmesi ve kullanımı üzerinde çalışan bilim dalına biyomateryal bilimi adı verilmektedir (Ratner et. al., 1996). Biyomateryallerin kullanılması günümüzde yeni gelişen bir alan olmasına karşın, zamanımızdan 2000 yıl önce Romalılar, Çinliler ve Azteklerin diş yenilenmesinde altın kullanması bu konudaki bilginin insanlığın gelişimi ile paralel ilerlediğini göstermektedir. Ayrıca yazılı tarih boyunca, cam gözlerin ve tahta dişlerin kullanıldığına ilişkin pek çok belgeye rastlanmaktadır. 20. yüzyılın başlarında biyomateryal bilimi hızlı bir gelişim sürecine girmiş ve biyomateryaller pek çok alanda hayatımızın bir parçası olmaya başlamıştır (Ratner et al., 1996). Tıpta biyomateryaller pek çok uygulamada kullanılmaktadır. İskelet sisteminde meydana gelen çeşitli hasar tiplerini tedavi etmek için genellikle titanyum, alüminyum, teflon, kalsiyum fosfat, poli(metil metakrilat), paslanmaz çelik kobalt-krom alaşımları, dakron ve hidroksiapatit gibi pek çok materyal yapay eklem, kırıkların sabitlenmesi için kemik plaklar, kemik simanları, yapay tendon ve ligamentler ve kaybedilen dişler için dental implantlar olarak kullanılmaktadır. Kalp ve kalp damarı sisteminde ise teflon, poliüretan, silikon, paslanmaz çelik, karbon, dakron, yeniden işlenmiş dokulardan oluşan materyaller, kan damarı protezleri, kalp kapakçığı ve kateter (tüp şeklinde ortası açık madeni lastik veya plastikten yapılma araç) olarak kullanılırlar. Ayrıca poliüretrandan yapay kalp, silikon-kollojen karışımlarından geçici deri, selüloz ve poliakrilonitrilden yapay karaciğer ve silikon lastiklerden kalp-akciğer makinesi gibi yapay organlar üretilmektedir. Duyu organlarında meydana gelmiş hasarları gidermek için ise platin elektrodlar koklea (kulak salyangozu) olarak, poli(metil metakrilat), silikon lastik ve hidrojel intraoküler lens olarak, silikon-akrilat ve hidrojel kontakt lens, kollojen ve hidrojel ise korneal bandaj olarak kullanılmaktadır (Ratner et al., 1996). 14

15 Biyomateryaller öncelikle tıbbi uygulamalarda kullanılmakla birlikte, hücre kültürü çalışmalarında, laboratuarlarda protein elde etmede kullanılan cihazlarda, sığırların verimliliğini düzenleyen araçlarda, istiridyelerin kültüre edilmesinde de kullanılmaktadır (Ratner et al., 1996). Bir biyomateryalin genel uygulama şekli biyolojik sistemler ile sentetik materyaller arasında bir ilişki kurulması yolu ile olmaktadır. Bu sebeple, materyalin biyolojik sisteme karşı toksik etki göstermemesi, biyolojik sistemle uyuşması, insan sağlığı açısından zararlı olmaması gerekir. Biyomateryallerin tasarlanmasında bu prensipler göz önüne alınır. Bu nedenle biyomateryal bilimi birçok disipline mensup bilim adamının bir arada çalışmasını gerektirir (Ratner et al., 1996) Dişhekimliğinde Kullanılan Materyallerin Biyolojik Sistemler ile Uygunlukları Biyolojik sistemler ile uygunluk, tedavi amacı ile uygun dokuya yerleştirilen biyomateryale karşı vücut dokularının ya da sıvılarının gösterdiği uygunluk olarak tanımlanabilmektedir (Thull, 2002). Dokuyla etkileşim içinde olan bu materyal normal metabolizmayı ve vücut içindeki fizyolojik olayları değiştirebilir (Ratner et al., 1996; Craig and Ward, 1997) Doku ile bir biyomateryalin ilk karşılaşmasından itibaren sırasıyla biyokimyasal, fonksiyonel ve morfolojik olarak hücre ve doku hasarı meydana gelebilmektedir. Bu hasarlar, bağ dokusunda bir dizi iltihaplanma reaksiyonları, immünolojik reaksiyonlar ve onarım reaksiyonlarının başlamasına neden olur. Doku ile ilk temasından itibaren biyomateyallere karşı ilk 24 saatte meydana gelebilecek hücre cevapları Çizelge 2.1 de; hasar sonrası konak dokudaki morfolojik değişiklikler ve bu değişikliklerin belirlenebileceği test sistemleri ise Çizelge 2.2 de gösterilmektedir (Ratner et al., 1996 ; Craig and Ward, 1997). Ağız içerisinde direkt olarak dişeti hücreleri ve dolaylı olarak kılcal kan damarları ile etkileşime girebilen Dişhekimliğinde kullanılan materyallerin biyolojik uygunluklarının saptanması için ilk kez bir kılavuz çıkarma fikri 1926 da Amerika Dişhekimleri Birliği (American Dental Association, ADA) tarafından ortaya 15

16 atılmıştır. Uluslar arası Bilim ve Teknoloji Enstitüsü (International Institute of Science and Technology, NIST) bünyesindeki bilim adamları 1926 yılında Dişhekimliğinde kullanılan amalgam için bir şartname geliştirmişlerdir (ADA, 1982a, 1982b; Ratner et al., 1996; Craig and Ward, 1997) yılında Amerika Ulusal Standartlar Enstitüsü ve Amerikan Dişhekimleri Birliği (ANSI/ADA) Dişhekimliğinde kullanılan araç ve gereçlerin biyolojik sistemlere uygunluğunun test edilmesi için gerekli standart yöntemleri içeren 41 numaralı belgeyi yayınlamıştır. Bu belgeye 1982 yılında Ames test sistemi de eklenmiştir (ADA, 1982a; Craig and Ward, 1997) yılında son halini alan ANSI/ADA belgesinde biyolojik uygunluk testleri başlangıç, ikincil ve kullanım testleri olmak üzere üç aşamada toplanmaktadır (ADA, 1982a; Craig and Ward, 1997). Başlangıç testleri (in vitro tarama testleri) hücre düzeyinde kanserojenite, mutajenite, kırmızı kan hücrelerindeki lizis (hemolizis) ve sitotoksisite için kullanılması için önerilen in vitro yöntemleri ve tüm organizma düzeyinde meydana gelen akut fizyolojik etkileri ve ölümü içermektedir. Başlangıç testleri kısa zamanlı testleri de içerir. Biyomateryallere uygulanması önerilen ikincil testler ise in vitro memeli hücreleri veya deney hayvanları ile yapılmakta ve yaşam sürelerinin bir dönemi içerisinde kimyasallarla yüz yüze getirilen hayvanların karaciğer fonksiyonlarının değişimi veya tümör indüksiyonunun artışı ölçülmektedir (ADA, 1982b). Kullanım testleri (uzun zamanlı testler) ise, deney hayvanının yaşam süresinin büyük bölümünde kimyasal madde ile ilişkisinin devam ettirilmesi ile ortaya çıkan değişimleri incelemektedir (ADA, 1982b; Ratner et al., 1996; Craig and Ward, 1997). Uluslararası Standartlar Organizasyonu (International Standards Organization, ISO) standardına göre bir biyomateryalin biyolojik sistemler ile uygunluğunun belirlenmesi için, biyomateryalin in vitro ve in vivo genotoksisite ve kanserojenite testleri yapılmalı ve en son aşamada insanlarda kullanılmalıdır (Craig and Ward, 1997). 16

17 Çizelge 2.1. Biyomateyallere karşı ilk 24 saatte meydana gelebilecek hücre cevapları (Craig and Ward, 1997) Biyokimyasal Fonksiyonel Dejeneratif Değişiklikler Nekrotik değişiklikler Morfolojik Birkaç saniye O 2 yokluğu Oksidatif fosforilasyon <60 saniye Mitokondriyal fonksiyon ATP üretimi Na+ pompası Glikolizis Hücre içinde Na + /K + oranı Hücre içinde Ca ++ /Mg ++ oranı Kromatin katlanmasının ilk işaretleri Glikojen depoları Laktat üretimi ph Hücre Şişmesi Kromatin Katlanması Birkaç saat Mitokondriyal şişme Lizozomal şişme Düz endoplazmik retikulumun degranülasyonu Membran geçirgenliği Lizozom geçirgenliği Hidrolazların salınması Hücre içi enzimlerin salınması Dışarıdan gelen moleküllere karşı geçirgenlik saat Karyolizis Hücre membranlarından miyelin formlarının türetilmesi Hücresel yıkım ürünleri Hücre bileşenlerinin sindirilmesi Mitokondriyal kasılma Piknotik çekirdekler Mitokondrial degranülasyon ER genişlemesi Protein sentezi : Artışı göstermektedir. : Azalışı göstermektedir. 17

18 6 Çizelge 2.2. Hasar sonrası konak dokudaki morfolojik değişiklikler ve bu değişikliklerin belirlenebileceği test sistemleri (Craig and Ward, 1997) Karşılaşma Zamanı Hücre Cevabının Tipi Başlangıç Olayları (0-12 saat) Hücre Dejenerasyonu, Ölümü ve Nekroz Doku Cevabı (12 saat-1 hafta) İnflamasyon İmmun Cevap Sonuç Durumları (1-6 hafta) Rejenerasyon ve Tamir Konak cevapları Hücre şişmesi Enzim fonksiyonunun kaybı Kılcallardan sızıntı (iyonlar ve serum molekülleri) Hücresel sızıntı ve süzülme Parankimal rejenerasyon Membranların yarı geçirgenliklerini kaybetmesi Nötrofiller Lenfositler Plazma hücreleri OR Piknozis ve çekirdek kaybı Fibroblastlar } Angioblastlar } Makrofajlar Belirti (örn: fibrilli kapsül) Biyolojik Sistemlere Uygunluk Testleri Tarama testleri Yapışma, büyüme ve makromoleküler sentez Membran geçirgenliği Enzim yöntemleri Tarama testleri Nötrofilik kemotaksis Lenfosit kemotaksis Tarama testleri Yok Fibroblast kemotaksis Lenfosit transformasyonu İkincil testler İkincil testler İkincil testler Kullanım testleri Kullanım testleri Kullanım testleri 6

19 Dişhekimliğinde Kullanılan Simanlar Dişhekimliğinde kullanılan simanlar, genellikle sabit protetik restorasyonların yapıştırılması ya da daimi ve süt dişlerinin daimi dolgularla birlikte restorasyonu için kullanılan maddelerdir. Bazı simanların endodonti, ortodonti, periodontoloji ve cerrahi işlemlerde özel kullanım alanları da bulunmaktadır. Simanlar, dayanıklılık, çözünürlük ve aşınma gibi özellikleri bakımından altın, amalgam ve porselen ile karşılaştırıldığında, daha zayıftırlar. Bu sebeple, ağız içinde bu materyallerin kullanımı sınırlıdır (Zaimoğlu, 1993; Craig and Ward, 1997). Simanların toz ve likit (sıvı) şeklinde bulunan bileşenlerinin karıştırılması sırasında ortaya çıkan sertleşme reaksiyonu, genellikle bir asit-baz reaksiyonudur. Reaksiyon sırasında likit kısım asit, toz kısmı ise baz olarak davranır (Zaimoğlu, 1993; O Brein, 1997; Ewoldsen, 2001). Siman likitleri, fosfat simanlar için fosforik asit, öjenol simanlar için kelasyon ajanı, poliakrilik simanlar için polikarboksilik asitler ve rezin simanlar için ise monomer olmak üzere dört ana grup altında toplanabilir. Simanların matriks yapma özelliklerine göre sınıflandırılmaları Şekil 2.1 de, kullanım alanları ve bazı özellikleri ise Çizelge 2.3 ve 2.4 de gösterilmektedir (Zaimoğlu, 1993; O Brein, 1997). Çinko fosfat Fosfat Çinko silika fosfat Polimer ZnO-Öjenol EBA Siman Tipi Fenolat Ca(OH) 2 salisilat Alumina Polikarboksilat Çinko Polikarboksilat Cam iyonomer Akrilat Polimetilakrilat Dimetilakrilat Şekil 2.1. Simanların sınıflandırılması (O Brein, 1997) 7

20 8 Çizelge 2.3. Dişhekimliğinde kullanılan simanlar ve kullanım alanları DİŞHEKİMLİĞİNDE KULLANILAN SİMANLAR Çinko fosfat* Polikarboksilat* Cam iyonomer* Çinko oksit öjenol (ZOE) Silikat Siliko fosfat Metal destekli cam iyonomer Rezin Kalsiyum hidroksit KULLANIM ALANLARI Protetik restorasyonlar ve ortodontik uygulamalar için yapıştırma, geçici restorasyonda Protetik restorasyonların yapıştırılması, ortodontik bantların yapıştırılması Anterior restorasyonlar, daimi restorasyonlarda kavite kaplayıcı olarak ve ortodontik uygulamalarda yapıştırıcı olarak Geçici dolgu materyali olarak ve geçiş restorasyonlarının yapıştırılmasında Anterior restorasyonlar Protetik restorasyonların yapıştırılması Konservatif posterior restorasyonlar, kor yapısı olarak Protetik restorasyonlar ve ortodontik uygulamalar için yapıştırma Pulpa kaplama, ısı izole edici kaide olarak * Çalışmada kullanılan siman tipleri Simanların dayanıklılıkları genellikle bir sıkıştırma kuvveti uygulanarak belirlenir. ADA (American Dental Association) nın 8 numaralı spesifikasyonuna göre standart olarak bilinen çinko fosfat simanın 24 saatlik maksimum değeri 75 MN/m 2 olarak bildirilmiştir. Simanların genel fiziksel ve mekanik özellikleri Çizelge 2.4 de gösterilmiştir (Craig and Ward, 1997). Simanın dayanıklılığı toz-likit oranına bağlıdır ve toz oranı arttıkça dayanıklılık artmaktadır (O Brein, 1997).. 8

21 9 Çizelge 2.4. Simanların fiziksel ve mekanik özellikleri (Craig and Ward, 1997) Siman tipi Sıkışma dayanıklılığı MN/m 2 Çekme dayanıklılığı MN/m 2 Elastik Modül GN/m 2 Suda çözünürlük 24 saatte 37 o C de sertleşme zamanı (%100 nem) (dak.) Film kalınlığı µm Çinko fosfat 98,133 3,1-4,5 9,3-313,4 0,2 mak mak. Çinko oksit öjenol polimeri , EBA- Alumina ,02-0, Çinko poliakrilat ,6-6,3 4,0-4,7 0, Cam iyonomer ,2-5,3 3,5-6,4 0,4-1, Kompozit rezin , Dişhekimliğinde kullanılan her türlü malzemenin seçim ve kullanımında göz önüne alınan en önemli kriterler çözünürlük ve bozunmadır. Simanların 24 saat distile su içerisindeki maksimum çözünürlükleri genellikle % 0,2 den düşüktür. Genellikle de pek çok siman bu değerin çok altında çözünürlük değeri vermektedir (Zaimoğlu, 1993; O Brein, 1997 ; Craig and Ward, 1997). Seyreltik organik asitlerdeki çözünürlükleri ise, distile sudakinden daha yüksektir. Yani, ortam ph sı düştükçe çözünürlük artmaktadır (Czarnecka et al., 2002). Bunun sebebi, simanın çinko asit bileşeninin bu ortamda daha yüksek çözünürlük göstermesi ve az da olsa fosfat matriksinin çözünürlüğünün artmasıdır. Ayrıca, simanın çözünürlüğü inley ve kronların çevresinde ikincil çürüklerin meydana gelmesine sebep olabilmektedir (Craig and Ward, 1997; Nomoto and McCabe, 2001). Ağız boşluğunda, ağız florası ve alınan besinlere bağlı olarak çeşitli konsantrasyonlarda organik asitler bulunmaktadır. Belli besinlerin sindirimleri sırasında diş ve restorasyonların yüzeyinde meydana gelen plak, bir saatten daha fazla süreyle asidik özellik göstermektedir. Asetik asit veya diğer organik asitler 9

22 10 ph yı düşürürler. Dolayısı ile çinko fosfatın çözürlüğü ağız sıvısından etkilenebilmektedir (Nomoto and McCabe, 2001). Bazı simanların karıştırıldıktan sonra belli süreçler içerisinde gösterdikleri ph değerleri Çizelge 2.5 de gösterilmektedir (Zaimoğlu, 1993). Çizelge 2.5. Simanların karıştırıldıktan sonra belli süreçler içerisinde gösterdikleri ph değerleri (Zaimoğlu, 1993). Siman Tipi 3 dak. 1 saat 24 saat 48 saat 7 gün 28 gün Çinko fosfat 3,5 5,9 6,6 6,8 6,9 6,9 Silika fosfat 3,2 5,4 6,1 6,3 6,5 6,7 Silikat 2,8 3,7 5,0 5,2 5,2 5,2 Simanlar restorasyonda kullanıldıktan sonra diş minesinin flor miktarı ve asit içerisindeki çözünürlüğü de değişmektedir (Hatibovic-Kofman and Koch, 1991; Zaimoğlu, 1993; Ashcraft et al., 1997). Bazı simanların bileşimlerindeki flor, restorasyondan sonra ağız içerisine salınmaktadır (Billington et al., 2001). Mine dokusunun simandan kaynaklanan flor miktarı ve asit çözünürlüğünde görülen değişiklikler Çizelge 2.6 da gösterilmektedir. Çizelge 2.6. Mine dokusunun simandan kaynaklanan flor miktarı ve asit çözünürlüğünde görülen değişiklikler (Zaimoğlu, 1993) Siman Tipi Flor miktarında değişme (%) Asitte çözünme (%) Silikat (Florsuz) Silikat (Florlu) Çinko siliko fosfat Cam iyonomer Bazı simanların antibakteriyel etkiye sahip olduğu bilinmektedir (O Brein, 1997, Akashi et al., 2001). Ancak, yapılan çalışmalar mikrobiyal artışın sadece kısa bir süre, ilk inci saatler arası inhibe edildiğini göstermiştir. Başlangıçta görülen bu inhibitör etki fosforik aside bağlanmaktadır. Ancak, çok az miktardaki florun bile enzim inhibitörü olarak davrandığı ve karbohidrat metabolizmasını önlediği gösterilmiştir (Zaimoğlu, 1993). 10

23 11 Simanların dişhekimliğinde kullanılabilmesi için uygulama alanlarına uygun özellikler içermesi istenmektedir. Restoratif simanların ağız içinde yüksek çözünme direncinin olması gerekmektedir (O Brein, 1997; Nomoto and McCabe, 2001). Ayrıca, mekanik olarak ve doku-restorasyon ara yüzeyi boyunca yeterli sağlamlıkta bağlantı yapabilmeli, gerilimin çok olduğu bölgelerde kesmeye ve sıkıştırmaya karşı yüksek dayanıklılığa sahip olmalıdır (O Brein, 1997). Simanlar hem baskıya karşı dayanıklılığı sağlayan yapıyı oluştururlar hem de, çalışma süresi ve oluşum zamanının kısalığından ötürü başarılı uygulamalara olanak verirler. Uygulanmaları sırasında simanların hazırlanması pratikte bazı hata sınırlarına izin vermelidir. Biyolojik olarak bu materyallerin doku tarafından kabul edilebilir olması oldukça önemlidir (Zaimoğlu,1993 ; O Brein, 1997; Craig and Ward, 1997). Bu tez çalışmasında kullanılan fosfat siman, polikarboksilat siman ve cam iyonomer simanlar hakkında daha ayrıntılı bilgi aşağıda verilmektedir Fosfat simanlar (Çinko fosfat simanlar) Fosfat simanlar dişhekimliğinde ilk kullanılan siman tipi olduğundan standart siman olarak kabul edilirler. Bu nedenle bu siman için anlatılan bilgiler diğer tipler içinde geçerlidir (Craig and Ward, 1997). Siman tozunun ana bileşeni çinko oksittir. Çalışma özelliklerini ve karıştırılmış simanın sonuç özelliklerini değiştirmek için magnezyum oksit, silikon dioksit, bizmut trioksit ve diğer küçük maddeler ilave edilir. Çizelge 2.7 de çinko fosfat simanın toz ve likit bileşenleri gösterilmektedir (Craig and Ward, 1997). Çizelge 2.7. Fosfat (Çinko fosfat) simanın toz ve likit bileşenleri (Craig and Ward, 1997) Bileşimi TOZ ZnO 90,2 MgO 8,2 SiO 2 1,4 Bi 2 O 3 0,1 Eser BaO, Ba 2 SO 4, CaO 0,1 LİKİT H 3 PO 4 (serbest asit) 38,2 H 3 PO 4 16,2 Al 2,5 Zn 7,1 H 2 O 36,0 Ağırlık (% w/w) 11

24 12 Siman tozu, likit ile karıştırıldığında, kimyasal reaksiyon başlar. Alkalin tozun yüzeyi, asidik likit ile başlangıçta çözünür ve ekzotermik bir reaksiyon gerçeklerşir. Bu reaksiyonun tam olarak nasıl meydana geldiği açıklık kazanmamıştır (Craig and Ward, 1997). Karıştırmadan hemen sonra simanın ph sı 1-2 arasında olup oldukça asidiktir. Sertleşmeden 1 saat sonra bile ph hala 4 ün altında olabilmektedir. Yirmi dört saat sonunda ise ph genellikle 6-7 arasındadır (Smith and Ruse, 1986). Simantasyon sırasında hastada meydana gelebilecek hassasiyet, yüksek asiditeden ve dental tübüllerin içerisine giren siman likidinin osmotik basınçta meydana getirdiği değişiklikten kaynaklanır (O Brein, 1997; Craig and Ward, 1997). Restorasyonun yerleştirilmesi sırasında oluşan hidrolik basınç da pulpal hasara neden olabilir (O Brein, 1997). Restorasyonda bazik yapıdaki kalsiyum hidroksit eklenen bir materyal kullanıldığında pulpa üzerindeki olumsuz etki daha düşüktür. Çünkü kalsiyum hidroksit karıştırmadan hemen sonra meydana gelen düşük ph değerinin yükselmesine neden olmaktadır (Ratner et al., 1996; O Brein, 1997). Fosfat simanların dayanıklılığı, protetik restorasyonların yapıştırılması için yeterlidir. Ancak, bunlar geçici dolgu maddeleri olarak kullanılır. Bunun nedeni ağız içi kuvvetlere maruz kaldıklarında, kırılganlık ve düşük dayanıklılık özelliklerinden dolayı kırılıp bozulmalarıdır ( O Brein, 1997; Mansur,et al., 1998) Polikarboksilat ( Poliakrilat veya Karboksilat ) simanlar Polikarboksilat veya poliakrilat siman diş yapısına tutunma (adhezyon) özelliği gösterdiği bulunan ilk simandır. Bu simanların en önemli özelliklerinden biri, pulpaya gösterdiği mükemmel biyolojik uyumluluktur (O Brein, 1997; Craig and Ward, 1997). Likidi poliakrilik asit ile kopolimerlerin sulu çözeltisi veya itakonik asit gibi diğer organik asitlerle birlikte bir akrilik asit kopolimerinin sulu çözeltisidir. Toz bileşeni ise çinko fosfat simanın tozu ile aynı olup, esas olarak çinko oksit ile bir miktar magnezyum oksit içerir (Craig and Ward, 1997; O Brein, 1997). Magnezyum oksit yerine kalay oksit de içerebilir. Ayrıca, sertleşme süresini değiştirmek ve işlenebilme özelliklerini düzeltmek için az miktarda kalay florür ve diğer tuzları da içerir. İçeriğindeki kalay florür simanın dayanıklılığını artırıp, çürüğü 12

25 13 önleyici özellik kazandıran flor kaynağı olarak davranmaktadır (Zaimoğlu, 1993; Craig and Ward, 1997). Polikarboksilat simanların genel toz ve likit içeriği Çizelge 2.8 de gösterilmektedir. Çizelge 2.8. Polikarboksilat simanın bileşenleri ( O Brein, 1997) Bileşimi Ağırlık % TOZ ZnO 74,45 MgO 8,27 SnF 2 5,28 Poliakrilik asit 12,00 LİKİT H 2 O 100 Polikarboksilat simanlarının damıtık sudaki çözünürlüğü çinko fosfat simanların çözünürlüğü ile aynı düzeydedir. Bu simanda aynen çinko fosfat ve çinko oksit öjenol simanlar gibi organik asitlerde hızlı bozunma göstermektedir (Zaimoğlu, 1993; Stea et. al., 1994) Siman likidinin ph ı yaklaşık 1,7 dir. Ancak bu likit, toz ile karıştırıldığında, hızla nötralleşmektedir. Dolayısıyla, karışımın ph ı sertleşme reaksiyonu ilerledikçe artar. Başlangıçtaki yüksek asiditesine rağmen, pulpada çok az hassasiyet oluşturur. Bu açıdan çinko oksit öjenol simanları ile hemen hemen aynı gruba girerler (Zaimoğlu, 1993) Cam iyonomer simanlar Cam iyonomer simanlar ilk kez 1972 yılında Wilson ve Kent tarafından silikat simanların, kompozit rezinlerin ve polikarboksilat simanların en iyi özelliklerinin birleştirilmesi amaçlanarak üretilmiştir (Stea et. al., 1994). Yarı şeffaf görünüşü ve yapışma özelliğinden dolayı ilk olarak ön dişlerin restorasyonu amacı ile geliştirilmişlerdir. Dişhekimliğinde kullanılan restoratif materyallerin diş dokusuna tutunması önemlidir. Bu nedenle, ideal bir restoratif materyal, diş dokularının fiziksel özelliklerine benzer nitelikler taşımalı, dentin ve mineye iyi yapışmalı ve ağız ortamında yapısal değişikliğe uğramamalıdır. Tüm bu özelliklere sahip bir restoratif materyal üretimi henüz başarılamamasına karşın, son otuz yılda mine ve dentine bağlanabilen dolgu materyalleri olan cam iyonomer simanların 13

26 14 geliştirilmesi bu yolda atılmış bir adımdır. Cam iyonomer simanlar yukarıda sözü edilen özelliklerin pek çoğunu içermektedir (Zaimoğlu, 1993). Cam iyonomer simandaki toz bileşen; kuartz, alümina, kriyolit, alüminyum triflorür ve amonyum fosfatın birleşimi olup, esas olarak yüksek flor içerikli bir alümina silikat camdır (O Brein, 1997). Cam iyonomer simanın likidi poliakrilik itakonik asidin veya %5 tartarik asit içeren diğer polikarboksilik asit kopolimerlerinin %50 sulu çözeltisidir. Toz içeriği genellikle Çizelge 2.9 da gösterildiği şekildedir. Ancak, bu bileşimi güçlendirmek amacıyla gümüş gibi çeşitli metaller bu bileşime eklenebilmektedir (Craig and Ward, 1997). Çizelge 2.9. Cam iyonomer simanın tozunda kullanılan maddeler (Craig and Ward, 1997) Bileşimi Ağırlık % (w/w) SiO 2 29,0 Al 2 O 3 16,6 CaF 2 34,3 Na 3 AlF 6 5,0 AlF 3 5,3 AlPO 4 9,9 Cam iyonomer simanların 24 saat içinde saf sudaki çözünürlükleri, diğer simanlar gibi oldukça düşüktür. Ayrıca bu simanların organik asitlere karşı diğer simanlardan daha dayanıklı olduğu gözlenmektedir (Nomoto and McCabe, 2001). Bu kimyasalların biyolojik uygunlukları oldukça yüksek olup ve flor içeriklerinden dolayı diş çürüklerini önleyici özelliğe de sahiptirler (Hume and Mount, 1988; Zaimoğlu, 1993). Flor içerikleri bakteriyositatik ve bakterisit etki gösterebilir. Flor asiditeyi düşürdüğü için, mine veya dentinin zarar görmesini de azaltmaktadır (Craig and Ward, 1997). 14

27 Kısa Zamanlı Mutajenite Test Sistemleri Teknolojinin ilerlemesine paralel olarak yüz yüze kalınan doğal ya da yapay kimyasal maddelerin sayısı gün geçtikçe artmaktadır. Bu kimyasal maddelerin bir kısmının mutajenik ve kanserojenik olabileceği yıllardan beri tartışılmaktadır (Tomatis, 1979; Vahl et al., 1997; Paolini and Forti, 1997). Çevresel faktörlerin, kalıtımsal doğum bozukluklarına, kalp ve karaciğer hastalıklarına, akciğer yetmezliklerine, yaşlanmaya, katarakta, gelişimsel doğum bozukluklarına ve alerjik reaksiyonlara neden olmalarının yanı sıra, kanserin temel nedeni olduklarına ilişkin hipotez, gün geçtikçe destek kazanmaktadır (Ames, 1979; Murray, et al., 1990; Yoshikawa, 1996; Paolini and Forti, 1997; Mortelmans and Zeiger, 2000). Kimyasal maddelerin kanserojenik risklerini ortaya çıkarmak için en akılcı yaklaşım deney hayvanlarında tümör indüksiyonudur (Commoner et al., 1974). Ancak hayvan deneylerinin maliyetinin yüksek olması ve uzun sürmesi (her kimyasal için en az üç yıl) kimyasal bir maddenin kanserojenik riskinin ortaya çıkarılmasını dezavantajlı hale getirmektedir (IARC,1980, 1986; Lave, 1988; Bridges, 1988; Paolini and Forti, 1997). Bu nedenle araştırıcılar kanserojenik etki taramalarına esas olabilecek kimyasalların mutajenik etkilerini belirlemeye yönelik, kısa sürede sonuç verebilen ve düşük maliyetli birçok kısa zamanlı mutajenite test sistemi geliştirmişlerdir. Çizelge 2.10 da mutajenlerin saptanması için geliştirilmiş kısa zamanlı test sistemleri ve bunların dayandığı genetiksel ve biyokimyasal yollar gösterilmektedir. Kanserojenlerin taranmasında mutajenitenin esas alınması, iki önemli nedene dayanmaktadır: 1- Genetik kodun ve genetik sistemin evrensel olması, 2- Kanserojenik etki ile mutajenik etki arasındaki ilişkinin yüksek oluşudur (de Serres, 1976; Ramel and Rannung, 1980; Levin and Ames, 1986 ) 200 den fazla kısa zamanlı test, den fazla kimyasalın mutajenik etkilerinin belirlenmesinde kullanılmaktadır. Çevresel Mutajenler Bilgi Merkezi veri tabanı referanstan fazla veriyi içermektedir. (Waters et al., 1990; Gerber et al., 2002). Kısa zamanlı test sistemlerinde en yaygın olarak kullanılanları, bakteriyel testlerdir. Bakteriler, basit üreme ortamlarında hızla ürediklerinden, basit, çabuk, 15

28 16 ve ucuz uygulanabilir olmalarından ötürü bakteriyel testler tercih edilmektedir (Vennit et al., 1986; Josephy et al., 1997) Çizelge Mutajenlerin saptanması için geliştirilmiş kısa zamanlı test sistemleri ve bunların dayandığı genetiksel ve biyokimyasal yollar. Kısa- Zamanlı Testler İzlenen Genetiksel / Biyokimyasal Yol Kaynak 1.Salmonella typhimurium Histidin okzotrofları Ames et al., 1973b; Maron and Ames, Escherichia coli Arjinin-triptofan okzotrofları Profaj indüksiyonu Green and Muriel, Elesperu and Yarmolinsky, 1979; Onarım eksikliği olan suşların büyümelerinin inhibisyonu SOS cevabı Moreu et al., Rosenkranz and Mermelstein, 1983; Slater et al.,1971; Leifer et al., 1981 Büyüme inhibisyonu DNA onarımı hatalı suşlar Quillardet and Hofnung, Gümüş et al., Vibrio harveyi GTP-binding proteini (cgta Czy'z et al., geni) hasarı olan suşların kimyasal ile muamelesinden sonra neomycin-dirençli mutantların tespiti 4. Bacillus subtilis Büyüme inhibisyonu DNA onarımı hatalı suşlar Leifer et al., Kada and Hirano, Neurospora crassa Adenin okzotrofları Brockman et al., Çin hamsteri ovaryum ve HGPRT (Hipoksantinguanin Beaudet et al., akciğer hücreleri ile fosforiboziltransferaz) lokusunda mutasyonlar 7.Drosaphila melanogaster Kromozomal hatalar Vogel and Sobels,

29 17 Yapılmış pek çok çalışma ile Ames test sisteminde bazı kanserojenlerin mutajenik potansiyelleri test edilmiş ve bu kimyasalların yapılarına ve seçilme kriterlerine bağlı olarak yaklaşık % ının mutajenik etkili olduğu saptanmıştır. Ames test sisteminde pozitif cevap gösteren kimyasalların % nin deney hayvanlarında kanserojen etkili olabileceği öne sürülmektedir (Mc Cann et al., 1975b; Sugimura et al., 1976; Purchase et al., 1978; Kier et al., 1986; Paolini and Forti,1997; Zeiger, 1998, 2001). Mc Cann ve arkadaşları (1975a) kanserojen olan ve olmayan 300 kimyasalı, Ames test sistemi ile taradıklarında 175 kanserojen maddenin 157 tanesinin mutajenik etkili, kanserojenik etki göstermeyen 108 maddenin 94 tanesinin mutajenik etkili olmadığını saptamışlardır. Görüldüğü gibi kanserojenlerin % 90 ı mutajenik, kanserojen olmayanların % 87 sinin de mutajenik etki göstermediği bulunmuştur. Amerika Birleşik Devletlerinde yapılan bir araştırma sonucunda 1976 yılında meydana gelen ölümlerin %16 sının nedeninin kanser, bu kanser vakalarının %30 unun da mutasyonlar sonucunda meydana gelen genetik hastalıklardan kaynaklandığı rapor edilmiştir (Duncan et al., 1976). Kısa zamanlı bakteriyel mutajenite testleri laboratuarlarda mutajenik öncül maddelerin saptanması, antimutajenik ve antikanserojenik mekanizmaların aydınlatılması, insanların maruz kaldığı endüstriyel ve tedavi amaçlı kullanılan zararlı kimyasalların gösteriminde kullanılabilmektedir. Ayrıca ksenojenik maddelerin metabolizmalarının saptanması, mutajen ve kanserojenlerin organizmadaki şekillerinin saptanması gibi çeşitli amaçlar için de kullanılabilirler. Bu nedenle, biyo-tıp biliminin çok çeşitli alanlarında, kısa zamanlı bakteriyel mutajenite testlerinin çok yaygın uygulama alanları bulunmaktadır. Bütün kısa zamanlı bakteriyel mutasyon testleri içinde, Ames testi en çok önerilen testtir (Mc Cann and Ames, 1976; Sugimura, 1988). Bununla birlikte kısa zamanlı test sistemlerinin hiç biri tek başına mükemmel değildir; çünkü bunların her biri, sadece bir kaç mutajeni tanımlayabilmektedir. Bu nedenle kısa zamanlı testlerin birbirini izleyen bir sıra içinde kullanılmaları birçok bilim adamı tarafından önerilmektedir (Ennever and Rosenkranz, 1986; Venitt et 17

30 18 al., 1986; Quillardet and Hofnung, 1988; Rahden- Storen et al., 1994; Jolibois, 2003). Kanserojen veya mutajen maddelerin birçoğu organizmada metabolize edilerek çok çeşitli reaktif ara ürünlere dönüştürülmekte ve bu yolla biyolojik aktivite göstermektedir. Bu nedenle kısa zamanlı test sistemlerine, biyolojik olarak aktif kimyasal maddelerin genotoksik potansiyellerini belirlemek amacı ile genellikle fare veya ratlardan elde edilen biyoaktive edici bir sistem de (biyotransformasyon sistemi) eklenmesi önerilmektedir (Maron and Ames, 1983). Kısa zamanlı testlere biyoaktive edici bir sistem eklenmesi organizmalar (örneğin, bakteriler ve memeliler) arası metabolizma farklılıklarının ortadan kaldırılmasını sağlamaktadır (Paolini and Forti, 1997). Bu amaç için geliştirilmiş yöntemlerden biri karaciğer mikrozom yöntemi dir. Karaciğer mikrozom yöntemi Malling in 1967 de öncülüğünü yaptığı çalışmayı temel alarak (Malling, 1967) metabolik aktivasyona ihtiyaç duyan in vitro genotoksik ajanların ortaya çıkarılması için kullanılan en yaygın yöntemdir. Bu metabolik sistemle birlikte çalışan testler metabolik karşılaştırma yapılmasını sağlarlar (Mortelmans and Zeiger, 2000; Paolini and Forti,1997, Maron and Ames 1983) Ames test sistemi Salmonella / mikrozom test sistemi gen mutasyonlarına neden olabilen kimyasal maddelerin önemli bir kısmını saptamak amacı ile geliştirilmiş, pek çok ülkenin laboratuarlarında yaygın olarak kullanılan kısa zamanlı bakteriyel test sistemlerinden birisidir. Dr. Bruce N. Ames tarafından geliştirilmiş olduğu için Ames testi olarak da adlandırılmaktadır (Belser et al., 1981; Maron and Ames, 1983; Hofnung and Quillardet,1986; Claxton et al., 1987; Sugimura,1988; Quillardet and Hofnung,1993; Mortelmans and Zeiger, 2000; Cooper and Porter, 2000). İnternet üzerinden dergiye doğrudan ulaşım sağlayan Science Direct veri tabanı araştırıldığında yılları arasındaki 1329 çalışmada, Dünya Sağlık Örgütü (WHO) veri tabanı araştırıldığında ise yılları arasında 2594 çalışmada Ames test sisteminin kullanıldığı görülmektedir (Science Direct, 2003; NCBI, 2003). 18

31 19 Ames test sisteminde, in vitro mutasyonlar sonucu histidin sentezi yapamayan bir dizi mutant Salmonella suşu kullanılmaktadır. Histidin bulunmayan ortamlarda bu bakterilerin üremesi ve koloni oluşturması olanaksızdır. Histidin genindeki mutasyon bölgesinde veya bu genin yakınındaki bir bölgede oluşan yeni bir mutasyonla bu genin fonksiyonu düzeltilebilir ve hücreler histidin olmayan ortamda üreyebilirler. Bu nedenle, bu test sıklıkla bir reversiyon (geri dönüşüm) yöntemi olarak bilinmektedir (Mortelmans and Zeiger, 2000). Bu test sisteminde, Salmonella typhimurium LT2 atasal suşundan in vitro mutasyonlar ile elde edilmiş TA1535 TA1537, TA1538, TA98, TA100, TA97, TA mutant suşları kullanılmaktadır. Salmonella suşları histidin operonundaki çeşitli genlerde farklı mutasyonlara sahiptir. Bu mutasyonların her biri, farklı mekanizmalar ile etki gösteren mutajenlere karşı cevap oluşturur (Levin et al., 1982b,1984a; Maron and Ames, 1983; Aeschbacher et al., 1983; Levin and Ames 1986; Mortelmans and Zeiger, 2000). Son yıllarda, Ames test sistemi içerisinde yer alan bu mutantlara başka genetik özellikler taşıyan yeni suşlar eklenmiştir. Nitroarenler ve/veya aromatik aminlerin hücre içinde metabolik aktivasyonunu sağlayan asetil transferaz ve nitroredüktaz enzimlerinin sentezinden sorumlu genleri taşıyan plazmitlerin eklenmesiyle yeni suşlar (YG 1021, YG 1026, YG 1041 ve YG 1042) geliştirilmiştir (Watanabe, 1989; Hagiwara et al.,1993; Hughes et al., 1997). Ames test sisteminde standart suşlar olan S. typhimurium TA98 ve TA100 suşlarından nitroredüktaz enzim sentezinden sorumlu genlerde hasarlar yaratılarak TA98 NR ve TA100 NR suşları geliştirilmiştir (Rosenkranz and Mermelstein, 1983; Hughes et al., 1997). Gee ve arkadaşları (1998) baz değişimi mutasyonlarını daha kolay tanımlayabilmek amacı ile 6 yeni his S. typhimurium suşu geliştirmişler, bu suşlardan TA7001, TA7002, TA7003 A:T baz çiftindeki, TA7004, TA7005, TA7004 ise G:C baz çiftindeki değişimlerini saptayabilmektedir (Gee et al., 1998). S. typhimurium mutant suşlarının genetik özellikleri Çizelge 2.11 de gösterilmiştir. 19

32 20 Histidin mutasyonu: Her test suşu, histidin operonunun değişik bölgelerinde çeşitli mutasyonlar içermektedir. Bunlar ya DNA daki tek bir bazın değişmesi ile ortaya çıkan baz değişimleri ya da bir bazın eklenmesi ya da çıkarılması ile kendini gösteren çerçeve kayması mutasyonlarıdır. Test edilen bileşiğin neden olduğu mutasyonun esas mekanizması, moleküler düzeyde bu şuşlarla gösterilebilir (Ames, et. al., 1973a). S. typhimurium his (histidine gereksinim duyan) mutantlarının DNA baz dizilimi analizleri yapılarak, mutasyonların yerleri ve karakterleri saptanmıştır (Maron and Ames, 1983). S. typhimurium TA100 ve S. typhimurium TA1535 suşlarında bulunan his G46 mutasyonu, histidin biyosentezindeki ilk enzim olan pirofosforilazı kodlayan PR-ATP his G geni üzerindedir. Bu mutasyon, his G geninde, lösin amino asidinin -GAG- -GGG- kodonu olan -CTC- yerine prolin amino asidinin kodonu olan -CCC- nin gelmesine neden olur. S. typhimurium TA100 ve S. typhimurium TA1535 suşu, baz çifti değişimine neden olan mutajenler tarafından geri döndürülmektedir (Barnes et al., 1982; Levin and Ames, 1986; Brayn et al., 1993; Mortelmans and Zeiger, 2000). His D 3052 mutasyonu, S. typhimurium TA1538 ve S. typhimurium TA98 test suşlarında bulunur. Bu mutasyon, histidin biyosentezindeki son enzim olan L- histidinol dehidrogenazı kodlayan his D geni üzerindedir. His D 3052 mutasyonu çerçeve kayması tipinde bir mutasyon olup, tek bir nükleotidin eksikliği (çerçeve kayması) sonucu oluşmuştur (Brayn et al., 1993; Mortelmans and Zeiger, 2000). 20

33 21 Çizelge Salmonella mutant suşlarının genetik özellikleri (Mortelmens and Zeiger, 2000) Suş Histidin Mutasyonu LPS Onarım pkm101 Mutasyonun Niteliği Belirlenecek Bileşik Sınıfları TA1535 his G46 Rfa uvrb - AT GC transisyon TA1537 his C3076 Rfa uvrb - C...C yanına + 1 Baz çifti yer değişimine neden olan mutajenler Çerçeve kaymasına neden olan mutajenler TA1538 his D3052 Rfa uvrb - CG...CG yanından 1 Çerçeve kaymasına neden olan mutajenler TA98 his D3052 Rfa uvrb + CG yanından -1 TA100 his G46 Rfa uvrb + AT CG transisyon TA97 his D6610 Rfa uvrb + CCC yanına + 4 TA102 PA Q1 his G428 his Rfa + + G Ochre AT Çerçeve kaymasına neden olan mutajenler Baz çifti değişimine neden olan mutajenler Çerçeve kaymasına neden olan mutajenler Oksidantlar, X- ışınları, U.V., mitomisin C, bleomisin, H 2 O 2 ve kinonlar -GCGCGCGC- His D3052 mutasyonu, his D geni içinde, -CGCGCGCG-,dizilimi olan, 8 kere tekrarlanan GC dizisine sahiptir ve bu dizi 1 çerçeve kayması mutasyon bölgesinin yanındadır (Isono and Yourna, 1974). Çerçeve kaymasına neden olan mutajenler, DNA nın tekrarlanan dizileri ya da sıcak noktalar denilen bölgelerinde görülen kodon kaymalarını geri dönüştürerek bu kodonların yeniden doğru okunmalarını sağlarlar (Ames, 1972; Ames et al.,1975). S. typhimurium TA1538 ve S. typhimurium TA98 suşları, çerçeve kayması tipi mutasyonlara neden olan 2- nitrofloren ve amino türevleri, çeşitli aromatik nitroso türevleri gibi farklı mutajenler tarafından indüklenmesi ile tekrar his + hale geri dönüştürülmektedir (Maron and Ames,1983; Mortelmans and Zeiger, 2000 ). S. typhimurium TA102 suşundaki his G genindeki TAA kodonu altı muhtemel baz çifti değişiminin tümü, yani hem transisyon hem de transversiyon ile geri döndürülebilir. Bu mutasyon aynı 21

34 22 zamanda oksidatif mutajenler, X-ışınları, UV ışığı, bleomisin, hidrojen peroksit, streptonigrin, çeşitli aldehitler, tarafından da geri döndürülebilir. DNA onarım sistemi sağlam olan S. typhimurium TA102 suşu bleomisin ve mitomisin C gibi DNA ya çapraz bağlanan ajanları da saptamaktadır (Levin et al.,1982a, 1984a, 1984b; Mortelmans and Zeiger, 2000). TA102 de çapraz bağ ajanlarının DNA üzerindeki etkilerininin ortaya çıkabilmesi için nükleotid kesip çıkarma onarım sisteminin çalışır durumda olması gerekmektedir (Levin and Ames, 1986; Bryan et al., 1993; Williams-Hill et al., 1999; Mortelmans and Zeiger, 2000). Genel mutajenite testleri için, birincil test suşları da denilen TA97, TA98, TA100 ve TA102 suşları kullanılmaktadır. TA1535 ve TA1538 suşları araştırıcının isteğine bağlı olarak S. typhimurium TA98 ve TA100 suşlarına yardımcı olmak için kullanılabilmektedir. S. typhimurium TA1535 in kendiliğinden mutasyon sıklığı TA100 den daha düşüktür. S. typhimurium TA1538, 4-nitro-o-fenilendiamin gibi çerçeve kaymasına neden olan bazı aromatik mutajenlerin ortaya çıkarılmasında uygun olmakla birlikte bu suş, S. typhimurium TA98 e çok benzediğinden genel taramalarda bu suş yerine S. typhimurium TA98 suşu kullanılmaktadır (Maron and Ames,1983; Mortelmans and Zeiger, 2000). S. typhimurium TA97 suşu çerçeve kayması mutajenlerine cevap verir ve TA1537 yerine kullanılması tavsiye edilmiştir (Levin et al., 1982b). Başlangıçta geliştirilen his mutantlarının çeşitli kimyasallara karşı duyarlılığını artırmak üzere, bu suşlara aşağıda bahsedilen bazı mutasyonlar eklenmiştir. rfa mutasyonu : Bu mutasyon bakteri hücre duvarının lipopolisakkarit (LPS) tabakasını kodlayan genlerde meydana gelir. Böylece hücre duvarının geçirgenliğinin artmasına ve büyük moleküllerin geçişine neden olur. Bu mutasyonla kimyasalların toksik etkisi ve mutajenitesi artmış olur (Claxton et al., 1987). uvrb mutasyonu : DNA onarım sisteminde kesip çıkarma görevini üslenen enzimi kodlayan uvrb genindeki delesyon sonucu oluşur. uvrb mutasyonu, birçok mutajenin ortaya çıkarılmasında duyarlılığın artmasına neden olur. Ancak, teknik nedenlerden dolayı uvrb geninin kesilerek uzaklaştırılması sırasında bu delesyon biyotin (bio) genine kadar uzanmaktadır. Biyotin geni ise H vitamini denilen 22