ECHINOCOCCUS GRANULOSUS İZOLATLARININ GENOTİPLENDİRİLMESİ

Transkript

1 T.C. TRAKYA ÜNİVERSİTESİ TIP FAKÜLTESİ TIBBİ MİKROBİYOLOJİ ANABİLİM DALI Tez Yöneticisi Doç. Dr. Nermin ŞAKRU ECHINOCOCCUS GRANULOSUS İZOLATLARININ GENOTİPLENDİRİLMESİ (Uzmanlık Tezi) Dr. Canan ERYILDIZ EDİRNE-2010

2 TEŞEKKÜR Uzmanlık eğitimimde ve tez çalışmamda yardımlarını hiçbir zaman esirgemeyen sayın hocam, Doç. Dr. Nermin ŞAKRU ya, sayın hocalarım Prof. Dr. Murat Tuğrul a, Prof. Dr. Metin Otkun a, Doç. Dr. Şaban Gürcan a, Doç. Dr. Neşe Akış a, Doç. Dr. Müşerref OTKUN a, Doç. Dr. Sami ŞİMŞEK e, Yard. Doç. Dr. Tammam SİPAHİ ye, asistan arkadaşlarıma ve laboratuvar personeli arkadaşlarıma teşekkür ederim.

3 İÇİNDEKİLER GİRİŞ VE AMAÇ... 1 GENEL BİLGİLER... 3 ECHINOCOCCUS CİNSİNİN TAKSONOMİSİ... 3 ECHINOCOCCUS CİNSİ PARAZİTLERİN GENEL MORFOLOJİSİ... 4 ECHINOCOCCUS CİNSİ PARAZİTLERİN YAŞAM DÖNGÜSÜ... 5 ECHINOCOCCUS CİNSİNİN TÜRLERİ... 7 ECHINOCOCCUS CİNSİ PARAZİTLERDE VARYASYON ECHINOCOCCUS TA TÜR VE SUŞ BELİRLEMEDE KULLANILAN YÖNTEMLER ECHINOCOCCUS GRANULOSUS UN EPİDEMİYOLOJİSİ KİSTİK EKİNOKOKKOZİS GEREÇ VE YÖNTEMLER BULGULAR TARTIŞMA SONUÇLAR ÖZET SUMMARY KAYNAKLAR EKLER

4 SİMGE VE KISALTMALAR ABD : Amerika Birleşik Devletleri CO1 : Sitokrom c oksidaz subunit 1 DNA : Deoksiribonükleik asit dntp : Deoksiribonükleozid trifosfat ITS1 : Internal transcribed spacer 1 KE : Kistik ekinokokkozis ND1 : NADH dehidrogenaz subunit 1 PAIR : Puncture, aspiration, injection, reaspiration PCR : Polymerase chain reaction RAPD : Random amplification of polymorphic deoxyribonucleic acid RFLP : Restriction fragment length polymorphism rdna : Ribozomal deoksiribonükleik asit SSCP : Single stranded conformation polymorphism TBE : Trisbase - boric acid - ethylenediaminetetraacetic acid UV : Ultraviyole

5 GİRİŞ VE AMAÇ Echinococcus lar, Taeniidae ailesine ait küçük sestodlardır. Günümüzde Echinococcus cinsinin Echinococcus granulosus, E. multilocularis, E. oligarthrus ve E. vogeli olarak dört türü tanımlanmıştır. Yetişkin parazit; son konak olan köpeğin ya da diğer etobur hayvanların ince bağırsağında, larval (metasestod) form; tırnaklı hayvanlar (koyun, sığır, domuz, at vs.) ve insanların iç organlarında bulunur. Metasestod formu bu ara konaklarda ekinokokkozise neden olur (1,2). Echinococcus granulosus, dünya çapında coğrafik dağılıma sahiptir. Yüksek parazit prevalansına sahip bölgeler; Avrasya, Kuzey ve Doğu Afrika, Avustralya ve Güney Amerika dır. (3). E. granulosus un neden olduğu kistik ekinokokkozis (KE), yurdumuzda büyük bir kesimin hayvancılıkla uğraşması ve gerekli/yeterli önlemlerin alınmaması nedenleriyle gerek koyun ve sığır gibi hayvanlarda gerekse insanlarda son derece yaygın bir hastalıktır. Bu nedenle önemli bir sağlık sorunu oluşturmasının yanı sıra önemli ekonomik kayıplara da yol açmaktadır (4). Yazar ve ark. nın (5) yaptığı çalışmaya göre; yılları arasında Türkiye den toplam 14789, Trakya bölgesinden ise 526 KE olgusu bildirilmiştir. Echinococcus larda suş; gen frekanslarında ve ekinokokkozisin epidemiyolojisi ve kontrolü için önemli olan veya olabilecek bir veya daha fazla karakterde, aynı türün diğer gruplarından istatistiksel olarak farklı olan gruplar olarak tanımlanmıştır (6). Echinococcus cinsi içindeki varyasyonların belirlenmesi özellikle birden çok ara konağın bulunduğu, farklı geçiş siklusları ve insan enfeksiyonu için kaynağın olabildiği bölgelerde önemlidir. Echinococcus un suşları arasındaki gelişimsel farklılıklar ekinokokkozisin kontrol çalışmalarını olumsuz yönde etkileyebilir (7). 1

6 Echinococcus ların tür ve suş ayırımında kullanılan deoksiribonükleik asit (DNA) tabanlı yöntemler konak ve çevreye bağlı faktörlerden bağımsız olup doğrudan parazit genomunu incelediğinden oldukça önemli yöntemlerdir (8). Bu alanda Türkiye de yapılan çalışmalar oldukça sınırlı olup Vural ve ark. nın (9) yaptığı çalışmada koyun ve sığırlarda E. granulosus un G1 ve G3 genotipleri saptanmıştır. Utuk ve ark. nın (10) yaptığı çalışmada ise insan, köpek, deve, koyun, keçi ve sığırlardan elde edilen E. granulosus izolatlarının tamamının G1 genotipinde olduğu belirlenmiştir. Ergin ve ark. nın (11) çalışmasında ise; insan izolatların tümünün G1 suşu olduğu belirlenmiştir. Snabel ve ark. (12) Ege bölgesinde bulunan çeşitli illerden topladıkları koyun ve insan izolatlarında Türkiye de ilk kez G7 suşunun varlığını göstermişlerdir. Çalışmada amacımız Edirne ilinde insanlardan ve hayvanlardan (koyun, keçi, sığır gibi büyükbaş ve küçükbaş hayvanlar) elde edilen hidatik kist materyalini inceleyerek E. granulosus türünün suş ayrımını ve dağılımını moleküler teknikler kullanarak göstermektir. Bu şekilde bölgemizde KE ye karşı etkin eradikasyon ve kontrol programlarının uygulanmasına önemli katkıda bulunulacağı düşünülmektedir. 2

7 GENEL BİLGİLER ECHİNOCOCCUS CİNSİNİN TAKSONOMİSİ Echinococcus (Rudolphi, 1801) cinsinin sınıflandırma ve isimlendirme çalışmaları yıllardır devam etmektedir ve 1969 yılları arasında 10 E. granulosus ve 3 E. multilocularis alttürü tanımlanmıştır. Ancak daha sonra E. granulosus un E. granulosus granulosus (Verster, 1965) ve E. granulosus canadensis (Webster ve Cameron, 1961) dışındaki alttürleri geçersiz kılınmıştır. E. multilocularis in 3 alt türü E. multilocularis multilocularis (Vogel, 1957), E. multilocularis sibiricensis (Rausch ve Schiller, 1954) ve E. multilocularis kazakhensis (Shul ts, 1961) Rausch tarafından geçerli alttürler olarak değerlendirilmiştir. Günümüzde Echinococcus cinsi içerinde tanımlanan bu alttürler geçersiz kılınmıştır. Taksonomik durumu kesin olmayan intraspesifik varyantların suş olarak tanımlanması kabul edilmiştir (6). Echinococcus türlerinin sınıflandırmadaki yeri şu şekildedir (1,7,13): Alt alem; Metazoa, şube; Platyhelminthes, sınıf; Cestoda, alt sınıf; Eucestoda, takım; Cyclophyllidea, aile; Taeniidae, cins; Echinococcus, türler; E. granulosus (Batsch, 1786), E. multilocularis (Leuckart, 1863), E. oligarthrus (Diesing, 1863) ve E. vogeli (Rausch ve Bernstein, 1972). Echinococcus granulosus türü içinde genetik çeşitliliğe sahip bazı formlar önceki yıllarda farklı tür veya E. granulosus un alt türü olarak tanımlanmıştır. Günümüzde bu formların taksonomideki durumunun yeniden tanımlanması konusu, DNA dizi verilerinin filogenetik analizi sonucu Echinococcus taksonomisinin tekrar gözden geçirilmesini takiben gündeme gelmiştir (14). Suş kavramı farklı ara konak türlerinden E. granulosus izolatları arasındaki genetik farklılıkları gösteren kanıtların artmasıyla daha da beslenmiştir. Bu genetik varyasyon 3

8 fenotipik değişkenlik ile de ilişkili bulunmuştur, bundan dolayı konağa uyumlu E. granulosus suşları kavramı geliştirilmiştir (15). ECHİNOCOCCUS CİNSİ PARAZİTLERİN GENEL MORFOLOJİSİ Echinococcus cinsi erişkin parazitler mm uzunluğunda ve baş (skoleks), boyun, 2-6 adet proglottide sahip gövdeden (strobilia) oluşur. Skoleks, dört çekmene ve rostellum üzerinde bulunan biri küçük biri büyük olmak üzere iki sıra çengele sahiptir. Strobiliadaki proglottidlerden ilki immatür, sonraki matür ve sonuncusu ise gebe proglottiddir. İmmatür proglottidin seksüel organları henüz gelişmemiştir. Matür proglottid fertilizasyonun gerçekleştiği işlevsel hermafroditik seksüel organları içerir. Gebe proglottidde uterus yumurta ile doludur ve yumurtalar tamamen geliştiği zaman uterus son segmentin çoğunu kaplar (13, 14,16). Şekil 1 de Erişkin E. granulosus gösterilmektedir. Yumurtalar küresel-elipsoid şekillidir ve genellikle µm ile µm µm lik iki çapa sahiptir. Yumurtalar oldukça dirençli keratinize embriyoforun da dahil olduğu birkaç örtü ile çevrili altı çengelli embriyodan (onkosfer = birincil larval evre) oluşur. Bu şekilde yumurta koyu çizgili bir görünüm alır. Vitellin tabakanın (yumurta kabuğu veya dış katman) yumurta serbestleşmeden önce soyulması nedeniyle embriyofor; embriyoyu fiziksel olarak koruyan temel tabakadır. Echinococcus yumurtaları düşük sıcaklıklarda (yaklaşık C ler arasında), nemli bir çevrede enfektivitelerini birkaç aydan bir yıla kadar korurlar. Yumurtalar kuruluğa karşı duyarlıdır. %25 bağıl nem oranında E. granulosus yumurtaları 4 günde, %0 bağıl nem oranında 1 günde ölürler. E. granulosus yumurtaları C de 5 dakikadan kısa bir sürede ölürler. Echinococcus yumurtaları donma sıcaklıklarında canlılıklarını sürdürebilir (7,13,14). Metasestodun (ikincil larval evre) yapı ve gelişimi dört Echinococcus türü arasında farklıdır. Karakteristik olarak tüm türlerin kistleri dış kısmından aselüler laminer tabaka ile desteklenmiş, iç kısımda bulunan germinal tabakadan oluşur. E. multilocularis hariç tüm türlerde laminer tabaka konak tarafından yapılan adventisyal tabaka ile çevrilidir. Germinal tabaka çimlenme kapsüllerine aseksüel gelişim ile çoğalabilen tabakadır. Protoskoleksler çimlenme kapsüllerinin veya birincil kistin iç duvarından ortaya çıkar. Embriyodan gelişen metasestod (hidatik kist) beş ayda 1 cm çapa ulaşır ve büyümeye devam ederek on veya daha fazla yılın sonunda birkaç litre sıvı içerebilen büyük bir kist halini alabilir (6,7,14,16). 4

9 Şekil 1. Erişkin Echinococcus granulosus (17) ECHİNOCOCCUS CİNSİ PARAZİTLERİN YAŞAM DÖNGÜSÜ Echinococcus cinsinin üyeleri yaşam döngülerinde etobur bir son konak ve etobur olmayan memeli bir ara konağa sahiptir. Erişkin parazit; son konak ince bağırsağının mukozasına sıkıca tutunarak yaşar. Seksüel olgunlaşma tür ve suşlara bağlı olarak 28 gün gibi kısa bir sürede yumurta üretiminin başlaması ile 3-4 hafta içinde olur. Yumurtalar proglottidlerin içinde veya serbest olarak feçesle dış ortama atılır. Çevrede olgunlaşma periyoduna ihtiyacı olan immatür yumurtalar salınabilmesine karşın, feçesle atılan yumurtaların tam olarak embriyonize ve enfektif olduğu düşünülmektedir (6). Ara konak tarafından ağız yoluyla alınan embriyonize yumurta mide ve ince bağırsakta açılır. Embriyo veya onkosfer serbestleşir, serbest hale geçen onkosfer çengel hareketi ve histolitik enzimlerin yardımıyla hızlıca villöz epitelyuma penetre olur ve lamina propriaya uzanır. Venül veya lenf damarına geçen onkosfer pasif olarak karaciğer veya akciğere taşınır, bazen böbrekler, dalak, kaslar, beyin veya diğer bölgelere de taşınabilir. Organların etkilenme durumu; ara konağa ve Echinococcus un tür veya suşuna bağlı olarak değişiklik gösterir. İn vivo ve invitro çalışmalar Echinococcus onkosferlerinin ilk 14 gün içinde bir seri olaylar geçirdiğini göstermiştir. Bu olaylar hücresel proliferasyon, onkosferal çengellerin dejenerasyonu, kas atrofisi, vezikülarizasyon, santral kavite oluşumu, germinal ve laminer tabakaların gelişimini içerir. Sonuçta kistik, aseksüel olarak prolifere olan metasestod gelişir. Gelişen kistin tipi farklı türler arasında belirgin olarak değişiklik gösterir. İnsanlarda kist içinde protoskoleks gelişimi için gerekli süre bilinmemektedir. Ancak domuzlarda bu süre ay, koyunlarda 10 ay - 4 yıldır (2,6,13). 5

10 Son konakta hidatik kistteki protoskolekslerin sindirimi ile enfeksiyon başlar. Birkaç saat içinde, sindirilmiş protoskoleksler ince barsak villusları arasında aşağı iner ve erişkin parazitlere gelişir (6). Echinococcus cinsi parazitlerin yaşam döngüsü Şekil 2 de gösterilmektedir. Taksonomik ve epidemiyolojik çalışmalar E. granulosus un vahşi ve evcil yaşam döngülerini tanımlamaktadır. Vahşi döngüler; E. granulosus un bulunduğu alanların çoğunda görülmektedir. Bu döngü son konak olarak kurt, av köpeği, sırtlan, çakal ve dingoları; ara konak olarak antilop, yaban domuzu, geyik ve makropodları içerir. Evcil döngüler; dünyanın tüm endemik alanlarında görülen esas döngüdür. Köpek daima kesin konaktır. Koyun ara konakların en önemlisidir, ancak keçi, at, inek, deve, yak ve domuzlar da ara konak görevi görebilirler (14,18-20). Enfeksiyon; insanlar tarafından enfekte kesin konağa, yumurta içeren feçese, yumurta ile kontamine yüzey veya toprağa elle temastan sonra elin direkt olarak ağza götürülmesi ile kazanılır. Yumurtalar; kontamine çiğ sebze, meyve ve diğer bitkilerin yenmesi ile de alınabilir. Yiyecekler ve yüzeyler rüzgar, kuşlar, arılar ve sinekler yoluyla da ikincil olarak kontamine olabilir. Enfekte etçillerin feçesindeki Echinococcus yumurtaları ile kontamine olmuş içme suları da enfeksiyon için potansiyel bir kaynaktır (1,2). Köpekler için enfeksiyonun en yaygın kaynağı enfekte koyun sakatatlarıdır (19). Şekil 2. Echinococcus cinsi parazitlerin yaşam döngüsü (21) 6

11 ECHİNOCOCCUS CİNSİNİN TÜRLERİ Echinococcus granulosus Erişkin E. granulosus 3-6 mm uzunluğunda, küçük bir sestoddur. Fertil hidatik kistlerden köken alan protoskolekslerin köpek ya da diğer etçil hayvanlar tarafından ağızdan alınmasının ardından Lieberkuhn kriptlerindeki villuslar arasında derin bir biçimde evagine, penetre olur ve 4-5 hafta içinde seksüel açıdan olgun erişkin parazitler oluşur. Parazit kesin konağın ince bağırsak mukozasına sıkı bir şekilde tutunmuş olarak yaşar. E. granulosus genellikle 3 ya da 4 proglottide sahiptir. Sondan ikinci proglottid matür, son proglottid gebedir ve genellikle solucanın uzunluğunun yaklaşık yarısıdır. Rostellum adet (ortalama 36-40) iki sırada dizilmiş çengele sahiptir. Birinci sıradaki büyük çengeller μm, ikinci sıradaki küçük çengeller μm boyundadırlar. Yumurtalık böbrek şeklindedir. Genital delikler değişimli olarak düzensizdir ve normalde matür ve gebe proglottidlerin arka yarısına açılır. Gebe proglottidin uterusu iyi gelişmiş divertiküle sahiptir. Gebe proglottidlerin her biri birkaç yüz adet yumurta içerir (1,14,22,23). Protoskolekslerin köpek ya da diğer etçil hayvanlar tarafından ağızdan alınması ile seksüel açıdan olgun erişkin parazit oluşması arasındaki süre prepatent periyot olarak bilinir. Bu periyodu gebe proglottidlerin veya yumurtaların dışkıyla dış ortama atılması takip eder. Yumurtalar tipik taeniid yumurtalarıdır ve ile μm çapındadırlar. Bu yumurtalar çevreye salındıklarında ara konak için enfektiftirler (1,22). Echinococcus granulosus yumurtalarının; insanlar ve uygun ara konak hayvanlar (tıbbi açıdan önemli olanların çoğu evcil tırnaklılardır) tarafından ağızdan alınmasının ardından onkosfer yumurta çeperinden dışarıya çıkar. Onkosfer intestinal epitelyumda lamina propriaya ve uygun kan damarlarına penetre olur. Daha sonra kan ve lenf damarları ile pasif olarak karaciğer ve akciğerler gibi primer hedef organlara taşınır. Onkosfer; bu organlarda eşmerkezli olarak genişleyerek büyüyen bir vezikül içinde olgunlaşır. Sonunda tamamen olgun metasestod veya hidatik kist meydana gelir. Bu genellikle içi sıvı dolu, uniloküler bir kisttir, fakat odacıkların birleşmesiyle oluşan multipl bir kist de olabilir. Kist; iç kısımda bulunan germinal tabaka ve germinal tabakanın çevresinde dayanıklı, elastik, farklı kalınlıklarda olabilen aselüler laminer tabakadan oluşur. Laminer tabakanın dışında konak tarafından yapılan fibröz adventisyal tabaka bulunur (13,16,22). Çalışmamızdaki E. granulosus kaynaklı hidatik kist sıvısında bulunan protoskolekslerin boyasız preparasyondaki görünümleri Şekil 3 te, E. granulosus metasestodunun kesitsel görünümleri Şekil 4 te gösterilmiştir. 7

12 A B Şekil 3. Echinococcus granulosus protoskolekslerinin boyasız preparasyondaki görünümleri: A-Evagine olmuş protoskoleks, 200x, B-Evagine olmamış protoskoleksler, 100x A B G: Germinal tabaka; L: Laminer tabaka; P: Protoskoleks; Ç: Çimlenme kapsülü Şekil 4. Echinococcus granulosus metasestodunun kesitsel görünümleri: A-Hematoksileneozin boyama, 100x, B-Periyodik asit-schiff boyama, 100x 8

13 Hidatik kistler çoğunlukla 5-10 cm çapında olmakla birlikte daha büyük olanlar da kaydedilmiştir, özellikle insanda, örneğin 50 cm çapında bir kist ve yaklaşık 16 litre sıvı içerdiği bildirilmiştir. Germinal membrandan kist kavitesi içine doğru büyüyen vakuol şeklindeki hücreler kitlesine çimlenme kapsülü denmektedir. Her biri protoskoleks içeren çimlenme kapsülleri enfeksiyondan yaklaşık beş ay sonra gelişir. Kist duvarından ayrılarak kist sıvısında serbestçe yüzen çimlenme kapsülleri hidatik kum olarak isimlendirilir. Bazen hidatik kist içinde kız kistler gelişir ve kist rüptüre olursa protoskoleksler ve çimlenme kapsülleri dış kız kistlere gelişebilir. Dış kız kistler laminer tabaka ile çevrili olan bir parça germinal membran tarafından da oluşturulabilir. Bazı kistler çimlenme kapsülü üretemez ya da çimlenme kapsülleri protoskoleks üretmeyi başaramazlar. Sekonder bakteriyel enfeksiyon veya kistin kalsifiye olması nedeniyle hidatik kist parazit içermeyebilir (1,16). Kemikte hidatik kist olduğu zaman kist anormal gelişir ve sınırlı bir membran oluşmaz. Hidatik kist kemikte ilk olarak kemik iliği kavitesinde gelişir, genişler ve sıklıkla büyük bir bölümünü hasara uğratır (16). Hidatik kistler birincil olarak sıklıkla multiloküler oldukları koyunların akciğerlerinde, domuzların karaciğer ve akciğerlerinde, at ve sığırların karaciğerinde bulunurlar (1). Kaya suyu olarak da adlandırılan hidatik kist sıvısı, renksiz, mg/dl protein içeren, antijenik özelliğe sahip, hafif bazik bir sıvıdır. Kist sıvısı çarpıcı şekilde konağın serumuna benzer ve immunoglobulin içerir (1,24). Echinococcus multilocularis Echinococcus multilocularis in doğal döngüsü kesin konak olarak Vulpex (kızıl) ve Alopex (kutup) cinsi tilkileri içerir. Bazen kurt, çakal, köpek veya kediler de kesin konak olarak döngüde bulunabilirler. E. granulosus gibi, erişkin parazitler ince bağırsak mukozasına tutunurlar. Erişkinler E. granulosus tan daha küçüktür, mm uzunluğundadır. Diğer morfolojik farklılıklar; 2-6 proglottidin bulunması; rostellar çengellerin yapı ve sayısında farklılık (14-34 adet, küçük çengeller 20-21μm, büyük çengeller 25-35μm), gebe proglottidde uterusun lateral poşunun olmayışı, genital deliğin proglottidin ön kısmına daha yakın oluşu, ön-sondan ikinci segmentin karakteristik olarak matür oluşu ve testislerin adet oluşudur. Hermafrodit erişkinler yaklaşık 4 haftada seksüel olgunluğa ulaşır. Yumurta üretimi 28 gün gibi kısa bir sürede başlar (1,14,18,22). Gebe proglottid uterusu onkosferal membran içine gömülmüş ve kalın bir embriyofor ile çevrili tamamen farklılaşmış tek bir onkosferli, µm çapında yuvarlak-ovoid 9

14 yumurtalar içerir Proglottidler ve onların yırtılması ile salınan yumurtalar enfekte kesin konakların feçesinde dışarı atılır. Çevreye salınan yumurtalar oldukça dayanıklıdır (22). E. multilocularis in ara konakları özellikle Arvicolidae ailesine ait kemirgenlerdir. Soricidae (sivri faregiller), Talpidae (köstebekgiller), Sciuridae (sincapgiller), Cricetidae (hamstergiller) ailelerine ait kemirgenler ve insanlar da ara konak olabilir (1,14). Yumurtalar ara konak tarafından alındığında konak midesindeki sindirim süreci ve diğer faktörler onkosferin yumurtadan çıkması ve salınımı ile sonuçlanır, daha sonra muhtemelen safranın yüzey aktif özellikleri ile aktive olur. Aktive onkosfer intestinal villusların epitelyal sınırına penetre olur ve venöz ve lenfatik damarlara girer, ardından diğer anatomik bölgelere dağılır. Onkosferlerin çoğu karaciğerde gelişir, bazıları akciğerler veya diğer organlara ulaşabilir. Germinal tabaka; infiltratif büyüme, tüp benzeri içe transformasyon, endojen ve ekzojen proliferasyondan sorumludur (1,13,14,22). Echinococcus multilocularis in metasestodu E. granulosus un metasestodundan daha komplekstir ve oldukça farklı gelişir. Metasestod sınırlayıcı bir konak-parazit bariyerinin (adventisyel tabaka) bulunmaması nedeniyle multiveziküler infiltratif yapıdadır. Larval kitle genellikle sıvıdan çok yarı katı matriks içerir ve bağ dokunun dens stromasında yerleşmiş çok sayıda küçük veziküllerden oluşmuştur. Vena cava veya portal ven içine büyüme metastazlara yol açabilir. Metastazlar genellikle akciğerler veya beyine olur (13,16). Protoskolekslerin üretimi 2-4 ay içinde gerçekleşebilir, fakat ara konak tür ve suşuna bağlı olarak daha kısa da olabilir (22). Yaşam döngüsünün tamamlanması için kesin konaklar protoskoleks içeren olgun enfektif metasestodu yemelidir. Enfekte dokunun sindirimini invajine skoleksli protoskolekslerin serbestleşmesi takip eder. Pepsin ve safra tuzları skoleksin hızlı evajinasyonunu uyarır, böylece intestinal mukozaya sıkıca bağlanabilir (24). Echinococcus oligarthrus Echinococcus oligarthrus un kesin konağı puma (Felis concolor), jaguar (F. onca), jaguarundi (F. yagouaroundi) ve Geoffroy kedisi (F. geoffroyi) gibi vahşi kedigillerdir. Erişkin parazit mm uzunluğunda olup vücutları üç halkadan oluşmaktadır. Rostellar çengeller adettir (büyük çengeller μm, küçük çengeller μm uzunluğunda). Genital delik olgun halkanın ön ortasında, gebe halkanın ortaya yakın kısmındadır. Testislerin sayısı arasında değişir. Gebe uterus kese şeklindedir (1). Aguti (Dasyprocta) ve diğer rodentler ara konak görevi görmektedir. Ara konakta larval evre subkutanöz kaslarda oluşur. Metasestod polikistiktir ve içi sıvı doludur. Kistler 10

15 septalı ve çok odacıklı şekilde büyüme eğilimindedir. Laminer tabaka E. vogeli den çok daha incedir. E. oligarthrus insanda hidatik hastalık etkeni olarak nadiren rapor edilmiştir, ancak bunların aslında yanlış tanımlanmış E. vogeli vakaları oldukları görüşü de vardır (1,16,22). Echinococcus vogeli Echinococcus vogeli kesin konak olarak olarak çalı köpeği (Speothos venaticus) ve bazen evcil köpekleri; ara konak olarak pakaları (Cuniculus paca) içeren vahşi, av-avcı döngüsünde yaşamını devam ettirir. İnsanlar nadiren enfekte olur (1,14,22). Erişkin parazit mm uzunluğunda olup vücutları ilk halka küçük olup uzunluğu genişliğinden daha azdır. Olgun halka dikdörtgen şeklindedir ve boyu eninden fazladır. Genital delik matür ve gebe halkanın orta arka kısmındadır adet testisleri vardır ve segmentin ön yarısında daha çok yer kaplar. Gebe uterus yan dallara veya keseciklere sahip değildir ve kısmen uzun ve tübüler yapıda olmasıyla karakterizedir. Rostellar çengeller adettir; büyüğü 49-57μm ve küçüğü μm dir (1). Echinococcus vogeli nin metasestodu çok odacıklı kümeler oluşturma eğiliminde olup polikistiktir ve içi sıvı doludur. Metasestod ara konağın daha çok karaciğerinde bulunur. Germinal ve laminer tabakanın endojenöz proliferasyon ve katlanması; çimlenme kapsülü ve protoskolekslerin üretimi ile birincil vezikülde ikincil alt bölmelerin oluşmasına yol açar (20). İnsanlarda E. vogeli kistleri karaciğerde bulunur fakat akciğerler, plevra, perikardium, kalp, interkostal kaslar, diyafram, mide, omentum ve mezenterlerde de görülebilir (16,18). ECHİNOCOCCUS CİNSİ PARAZİTLERDE VARYASYON Echinococcus ta rapor edilen variabilite konak nedenli de olabilmesine karşın daha çok, morfolojik ve biyokimyasal farklılıklar olarak yansıyan genetik bir temele sahiptir (7). Echinococcus larda suş; gen frekanslarında ve ekinokokkozisin epidemiyolojisi ve kontrolü için önemli olan veya olabilecek bir veya daha fazla karakterde, aynı türün diğer gruplarından istatistiksel olarak farklı olan gruplar olarak tanımlanmıştır (6). Bu variabilite yaşam döngü paterni, konak özgüllüğü, gelişim hızı, patojenite, geçiş dinamikleri, antijenite ve kemoterapötik ajanlara duyarlılık, ekinokokkozisin epidemiyolojisi ve kontrolünü etkileyen karakterlerde yansıtılıyor olabilir (14). Echinococcus granulosus un Suşları Evcil koyun suşu: E. granulosus un en önemli ve yaygın ara konağı evcil koyunlardır. E.granulosus un evcil koyun suşu (G1) dünya çapında geniş bir dağılıma sahiptir. Güney 11

16 Amerika nın bir kısmı, Güney ve Doğu Avrupa, Kuzey ve Doğu Afrika ve Asya nın bir bölümü ve Avustralya da bulunmaktadır. Evcil koyun suşu koyun dışında keçi, sığır, manda, yak, deve, domuz ve makropodlar gibi geniş bir ara konak dağılımına sahiptir. Şimdiye kadar cerrahi ile insanlardan elde edilen E. granulosus materyalinin çoğu, moleküler yöntemler kullanılarak evcil koyun suşu olarak belirlenmiştir (6,25-27). Tazmanya koyun suşu: Morfolojik, biyokimyasal ve gelişimsel çalışmalar Avustralya nın Tazmanya adasından elde edilen koyun kökenli E. granulosus izolatlarının Avustralya anakarası ve diğer bölgelerden elde edilen izolatlardan farklı olduğunu göstermiştir. Bu farklılığın olası nedenleri Tazmanya daki Echinococcus enfeksiyonlarının başlangıç odağının Avustralya anakarasından farklı olması (Güney Afrika gibi), veya bulunduğu popülasyonun küçük ve genetik olarak değişime uğramış olmasıdır. Diğer bir olasılık da, Tazmanya da kesin konaklara tanısal arekolin uygulaması programının parazitte adaptif genetik farklılaşmaya yol açabilmesidir. Tazmanya koyun suşu (G2) Tazmanya, Arjantin, Romanya ve Cezayir de bulunmaktadır. (6,14,28,29). Manda suşu: Mandalar özellikle Asya da E. granulosus un önemli bir ara konağıdır. Manda suşu (G3) ile oluşan enfeksiyonlar çoğunlukla akciğer yerleşimlidir ve kistler yüksek fertilite oranına sahiptir. Manda suşunun en karakteristik özelliği gebe halkalarının iki segmentli olmasıdır (6). Pakistan, İtalya, Yunanistan ve Türkiye de bu suşun varlığı bildirilmiştir (9,30-32). At suşu: Bu suş bazı Avrupa ülkelerinde, Ortadoğu ve Güney Afrika da, Yeni Zelanda ve Amerika Birleşik Devletleri nde bulunmaktadır. At suşunun (G4) tek kesin konağının köpek olduğu görülmektedir. Ara konak dağılımı dardır ve şu anki bilgilerimize göre sadece atları ve diğer tek tırnaklıları içerir. Ara konakta daha çok karaciğer enfektedir fakat akciğerler ve diğer organlar da etkilenebilir. Bu suşun larval evresinin koyun, sığır ve insanlar için düşük enfektiviteye sahip olduğu ya da enfektif olmadığı yönünde kanıtlar mevcuttur (25-27). E.granulosus un at suşu önceden bir alttür (E. granulosus equinus) olarak tanımlanmıştır (26). Günümüzde E. equinus adında ayrı bir tür olarak önerilmektedir (15). Sığır suşu: E. granulosus un sığır suşu çeşitli Orta Avrupa ülkelerinde, Rusya, Güney Afrika, Hindistan ve Sri Lanka da bulunmaktadır. Epidemiyolojik olarak önemli kesin ve ara konağının sırasıyla köpek ve sığır olduğu bilinmektedir (26). 12

17 Sığır suşu (G5) E. granulosus un diğer suşlarından morfolojik ve biyolojik özellikler açısından farklıdır. Örneğin, sadece günlük kısa bir prepatent periyodu ile kesin konakta erken bir gelişim dönemine sahiptir. Bu dönem diğer birçok E. granulosus suşunda genellikle gündür. Sığırda metasestod kistleri daha çok akciğerlerde bulunur ve %90 dan fazlası canlı ve enfektif protoskoleks içerir. Epidemiyolojik veriler bu suşun insanlar için enfektif olduğunu göstermiştir (25-27). Sığır suşu günümüzde E. ortleppi adında ayrı bir tür olarak önerilmektedir (15). Deve suşu: Deve (Camelus dromedarius) tüm Afrika ve Ortadoğu da E. granulosus un önemli bir ara konağıdır. Morfolojik olarak deve izolatı at ve koyun kökenli izolatlardan kolayca ayırt edilebilir olup sığır suşu ile benzerlikleri ortaya konmuştur (26). İran da yapılan çalışmalarda da deve suşunun morfolojik olarak koyun suşundan farklı olduğu ortaya konmuştur (33,34). Deve suşu (G6); kesin konak olarak köpekten, ara konak olarak deve, sığır ve keçiden moleküler yöntemler kullanılarak identifiye edilmiştir (35). Deve akciğeri hidatik kistlerin yaygın olduğu yerdir, karaciğer ve diğer organlar daha az sıklıkta enfekte olur. Akciğerdeki kistlerin fertilite oranı genellikle yüksektir (>%90) ve bu oran karaciğerde çok daha düşüktür (26). Deve suşunun insanlar için enfektif olduğunu gösteren çalışmalar mevcuttur (33,34). Arjantin ve Çin de de G6 suşunun varlığı gösterilmiştir (36,37). Domuz suşu: Rusya nın bir kısmını içine alan Orta - Doğu Avrupa nın çeşitli ülkelerinde, Meksika ve Peru da görülmektedir (26,38,39). Enfeksiyonun devamlılığı için köpekler ve domuzlar arasındaki döngü önemlidir. Domuz suşunun (G7) doğal son konağı köpektir. Yapılan çalışmalarda domuz suşuna ait E. granulosus yumurtalarının domuzlar için yüksek oranda enfektif olduğu, fakat kuzu ve danalar için çok düşük enfektiviteye sahip olduğu gösterilmiştir. Domuzlarda E. granulosus metasestodları çoğunlukla karaciğerde, daha az sıklıkta akciğer veya diğer iç organlarda bulunur (26). Domuz suşunun insanlar için düşük enfektiviteye sahip olduğu düşünülmektedir (6). Polonya ve Türkiye de domuz suşu ile enfekte insan vakaları gösterilmiştir (12,40). Vahşi yaşam suşları: E. granulosus un bazı sikluslarının vahşi etoburlar ve evcil tırnaklılar; evcil köpek ve vahşi tırnaklılar; vahşi etoburlar ve vahşi tırnaklılar veya diğer memeliler gibi çeşitli son/ara konak topluluklarını içerdiği tanımlanmıştır. Bunlardan bazıları şunlardır (26): 13

18 Aslan suşu: Doğu Afrika da E. granulosus un erişkin evreleri vahşi köpekgiller (av köpeği, sırtlan, çakallar) ve bir kedigil olan aslanda, metasestodlar vahşi tırnaklıların birkaç türünde bulunmuştur. Kedigiller genellikle E. granulosus a duyarlı olmamalarına karşın bu suş bazı Afrika ülkelerinde aslanlarda ve Güney Afrika da vahşi kedilerde (F. libyca = F. silvestris) bulunur (6,26). Lagomorf suşu: Arjantin de E. granulosus un erişkin evreleri Dusicyon cinsi tilki benzeri köpekgillerde, metasestodlar Avrupa yaban tavşanları olan lagomorflarda bulunur. Döngüde bulunan parazit önceden farklı bir tür olarak tanımlanmış olup (E. patagonicus; Szidat, 1960) daha sonra konak kaynaklı morfolojik varyasyon gösteren E. granulosus olarak isimlendirilmiştir. Yaşam döngüsünün tilkiler ile lagomorflar arasında olup olmadığı veya yabani tavşanların etkeni koyun kökenli parazit taşıyan evcil köpekler ve tilkilerden alıp almadığı konusu net değildir (6,26). Geyik suşu (Kuzey suşu): E. granulosus un geyik suşu Kuzey Amerika nın kuzeyinde ve Avrasya da görülür. Bu form önceden ayrı bir alttür (E. granulosus canadensis) olarak tanımlanmıştır. Doğal siklus daha çok sığır (Alces alces), ren geyiği (Rangifer tarandus) ve kızıl geyik (Cervus elaphus) gibi Cervidae ailesinin tırnaklıları ve kurtlar arasında av-avcı ilişkisi ile sürdürülür. Bununla birlikte evcil döngüleri köpekleri ve evcilleştirilmiş ren geyiklerini içermektedir. Bu döngü Kanada, Alaska, Sibirya, Norveç ve İsviçre nin bir kısmında görülmektedir. Epidemiyolojik kanıtlar bu formun daha çok akciğer lokalizasyonu ile insanlar için enfektif olduğunu ve düşük patojeniteyi desteklemektedir (6,26,27). Echinococcus cinsine ait tür, suş ve izolatlar ile genotipleri Tablo 1 de gösterilmiştir. ECHİNOCOCCUS TA TÜR VE SUŞ BELİRLEMEDE KULLANILAN YÖNTEMLER Coğrafik dağılım, konak genişliği, konak özgüllüğü, antijenik farklılık, metabolizma, üreme biyolojisi, enfektivite, morfoloji, protein, enzim ve DNA analizlerini içeren birçok kriter Echinococcus organizmalarını karakterize etmek için kullanılmıştır. Morfoloji; Echinococcus organizmalarının identifikasyonu ve taksonomik dizaynında önemli bir rol oynamaya devam edecek olmasına karşın, intraspesifik varyasyonları taramadaki yararı tartışmaya açıktır (6,25). Direkt olarak parazit genomunu inceleyen DNA esaslı yöntemler; çevre veya konak kaynaklı faktörlerden veya yaşam döngü evrelerinden etkilenmeyen yöntemlerdir. Genetik varyasyon mitokondriyal veya nükleer genomda araştırılabilir (25). 14

19 Tablo 1. Echinococcus türleri, suşları, izolatları ve genotipleri (15,26,41-43) Türler suş/izolat (genotip) E. granulosus Koyun (G1) Bilinen ara konaklar Koyun, sığır, domuz, deve, keçi, makropod Bilinen kesin konaklar Köpek, tilki, dingo, çakal, sırtlan Coğrafik dağılım Kuzey, Orta ve Güney Amerika, Avrupa, Afrika, Asya, Avustralya Tazmanya koyun Koyun, sığır? Köpek, tilki Tazmanya, Arjantin (G2) Manda (G3) Manda, sığır? Köpek, tilki? Asya At (G4) Atlar ve diğer tek tırnaklılar Köpek Avrupa, Ortadoğu, Güney Afrika, Yeni Zelanda, ABD? Sığır (G5) Sığır Köpek Avrupa, Güney Afrika, Hindistan, Sri Lanka, Rusya, Güney Amerika? Deve (G6) Deve, koyun Köpek Ortadoğu, Afrika, Çin, Arjantin Domuz (G7) Domuz Köpek Avrupa, Rusya, Orta Amerika Geyik (G8) Geyik Kurt, köpek Kuzey Amerika, Avrasya İnsan? (G9) İnsan? Polonya Fennoscandinavian geyik Aslan (?) Geyik? Avrasya Zebra, Afrika antilobu, Afrika domuzu, çalı domuzu, manda, çeşitli antiloplar, hipopotam?,zürafa? Aslan Afrika Lagomorf (?) Yabani tavşanlar Gri tilki Güney Amerika E.multilocularis Avrupa izolatı Avrupa, Çin? Rodentler, evcil ve yabani domuz, köpek, maymun Tilki, köpek, kedi, kurt, rakun Alaska izolatı Rodentler Tilki, köpek, Alaska kedi Kuzey Amerika Rodentler Tilki, köpek, Kuzey Amerika izolatı kedi, koyoti Hokkaido izolatı Rodentler, domuz, Tilki, köpek, Japonya maymun, at kedi, rakun E.vogeli Rodentler Çalı köpeği Orta ve Güney Amerika E. oligarthrus Rodentler Vahşi kediler Orta ve Güney Amerika G: Genotip; (?): Veriler kesin değil, ileri araştırmalar gerekli. 15

20 Evrimleşme hızı daha fazla olduğu için mitokondriyal DNA (mtdna) yakın ilişkili organizmaların ayrımı için kullanışlıdır. mtdna nın rekombinasyon yapmaması analizleri basitleştirir. Ribozomal DNA (rdna) tekrar ünitesi, çeşitli hızlarda gelişen farklı bölgelere sahiptir. Bu bölge, taksonomik düzeylerde varyasyon ve filogeni çalışmalarında kapsamlı olarak kullanılmıştır (25). Polimeraz Zincir Reaksiyonu Polimeraz zincir reaksiyonu, polymerase chain reaction (PCR) iki oligonükleotid primer arasında bulunan bir DNA fragmentinin enzimatik olarak çoğaltılmasıdır. Primerlerden biri hedef dizinin bir tarafındaki DNA molekülünün bir zincirine komplementer, diğer primer de hedef dizinin zıt tarafındaki DNA molekülünün diğer zincirine komplementerdir. Primerler, aralarında kalan diziyi DNA polimeraz ile sentez ederler (44). PCR temelli teknikler özellikle ekinokokkozisin tanısında kullanılan duyarlı yöntemlerdir (19). Dinkel ve ark. PCR yöntemini kullanarak E. granulosus un G1, G5 ve G6/G7 suş ayırımını gerçekleştirmiştir (45). Restriksiyon Fragman Uzunluğu Polimorfizmi Restriksiyon endonükleazlar DNA daki özel çift iplikli dizileri tanıyan ve DNA yı tanıma bölgesinden veya ona yakın yerden kesen enzimlerdir (44). Genomik DNA da dizi değişiklikleri belirli kesim bölgeleri yaratır veya onları yok eder. Bu nedenden dolayı boyutları değişen bir veya birden fazla DNA fragmenti Southern blot ve klonlanmış DNA probu ile hibridizasyondan sonra görünür hale gelir. Southern blot ile belirlenen enzim kesim yerlerindeki DNA değişimleri, restriction fragment length polymorphism (RFLP) olarak adlandırılır (46). McManus ve Rishi (47) tarafından restriksiyon endonükleaz sindirimi ve Southern blot teknikleri kullanılarak yapılan farklı suşları içeren bir çalışmada RFLP paternlerinin belirli suşlar içinde stabil olduğu gösterilmiştir. Bu nedenle RFLP yaklaşımı, E. granulosus un yeni izolatlarının identifikasyonu ve karakterizasyonu için etkin bir yöntem sunmaktadır (48). Polimeraz Zincir Reaksiyonu - Restriksiyon Fragman Uzunluğu Polimorfizmi Polimeraz zincir reaksiyonu - restriksiyon fragman uzunluğu polimorfizmi, polymerase chain reaction - restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) yönteminde genomik DNA nın belirli bir bölgesi PCR ile çoğaltılır. PCR ürünleri bir veya daha çok restriksiyon endonükleaz ile sindirilir ve fragmentler genellikle agaroz jel 16

21 elektroforezi ile ayrılır. Sindirim profilleri etidyum bromid boyalı jelde ultraviyole (UV) ışık ile saptanır ve fotoğraflanarak kaydedilir (49). Bowles ve McManus (50) Echinococcus un tür ve suşlarının hızlı ayırımı için bir yaklaşım geliştirmişlerdir: Çeşitli izolatlardan rdna nın birinci internal transcribed spacer (ITS1) bölgesini çoğaltmışlar ve ürünleri bazı dört baz kesen restriksiyon enzimleriyle sindirmişlerdir. Farklı tür ve suş grupları içinden çok sayıda örnek incelenerek karakteristik paternler elde edilmiştir. Bu yöntem Echinococcus izolatlarının ayırımı ve diğer parazit çalışmaları için basit, yüksek duyarlılıkta ve hızlı bir yaklaşım sağlamıştır (49). Rastgele Çoğaltılmış Polimorfik Deoksiribonükleik Asit Polimeraz Zincir Reaksiyonu Rastgele çoğaltılmış polimorfik DNA polimeraz zincir reaksiyonu, random amplification of polymorphic DNA polymerase chain reaction (RAPD-PCR); nükleotid dizilimi rastgele seçilmiş tek bir primer kullanılarak DNA nın çoğaltılması temeline dayanan bir polimorfizm inceleme yöntemidir. Arbitrary priming - polymerase chain reaction (AP- PCR) olarak da adlandırılan bu teknik; organizmalar arasındaki genetik ilişkilerin analizinde ve tanımlama amacıyla çeşitli parazit gruplarında kullanılmaktadır. RAPD-PCR Echinococcus türlerini ve genetik olarak farklı E. granulosus suşlarını tanımlamada hızlı ve güvenilir bir yöntemdir (51,52). Ancak RAPD-PCR, kullanılan DNA kalıbının kalitesi ve miktarından ve/veya döngü hızından etkilenebilir. Bu nedenle E. granulosus karakterizasyonu için birkaç DNA tekniğinin kullanılması önerilmektedir. Slovakya da yapılan bir çalışmada RAPD analizi ile domuz izolatları arasında iki farklı patern belirlenmiştir (53). İspanya da insan, koyun, sığır, keçi, domuz, yaban domuzu ve atlardan elde edilen izolatlar ile yapılan bir çalışmada bu yöntem ile G1, G4 ve G7 suşları tespit edilmiştir (54). Polimeraz Zincir Reaksiyonu - Tek Sarmal Konformasyon Polimorfizmi Polimeraz zincir reaksiyonu - tek sarmal konformasyon polimorfizmi, polymerase chain reaction - single stranded conformation polymorphism (PCR-SSCP); PCR ile çoğaltılmış çift iplikli DNA nın ısıtma ile tek zincir haline dönüştürülüp, bu tek zincir DNA molekülünün nötral poliakrilamid jeldeki hareketinin incelenmesi temeline dayanır (55,56). Tek zincir moleküller her bir zincir içinde nükleotidler arasında baz çiftleşmesinin sonucu olarak ikincil ve üçüncül yapılar oluşturur. Bu yapılar zincirin uzunluğuna ve baz çiftleşme bölgesinin yer ve sayısına bağlıdır. Onlar da yüksek oranda molekülün birincil dizisine bağlıdır. Yani birincil dizideki belirli nükleotid pozisyonundaki mutasyon molekülün yapısını 17

22 değiştirebilir. DNA fragmanı tek baz değişimi içeriyorsa (örneğin A-T yerine G-C baz çifti) denatürasyonda dört farklı zincir oluşur. Bu zincirlerin üç boyutlu yapıları farklı olduğundan poliakrilamid jelde farklı hızlarda göç ederler. Böylece, çoğaltılan DNA bölgesindeki tek baz değişiminin varlığı nedeniyle farklı örnekler farklı bant paternleri sergilerler. SSCP nin mutasyon saptama oranı fragment boyutu, dizinin baz kompozisyonu, elektroforez sıcaklığı ve jel kompozisyonu gibi parametrelere bağlı olarak çok değişir. Fragment boyutunun mutasyon saptama oranını belirleyen en önemli faktör olduğu görülmektedir. Genellikle, bp uzunluğundaki PCR fragmentleri için %50-95 oranında mutasyonlar belirlenir, fakat üç veya daha fazla elektroforetik şartlar kullanıldığında bu oran %100 e çıkabilir. 200 bp den büyük fragmentler için bu oran fragment boyutunun artması ile azalır (56,57). Gasser ve ark. (58) mitokondriyal sitokrom c oksidaz subunit 1 (CO1) ve NADH dehidrogenaz subunit 1 (ND1) bölgelerini çoğaltarak gerçekleştirdikleri bir çalışmada PCR-SSCP nin Echinococcus un mitokondriyal dizilerindeki varyasyonu göstermek için güvenilir bir yöntem olduğunu göstermişlerdir. Dideoksi Fingerprinting Dideoksi fingerprinting (ddf), PCR ile çoğaltılmış segmentlerde tek baz ve diğer dizi değişikliklerinin varlığını tespit edebilen, dideoksi dizileme ve SSCP yöntemlerinin bir karışımıdır. ddf, bir dideoksinükleotidli Sanger dizileme reaksiyonunun ardından denatüre edici olmayan jel elektroforezini içerir (59). Gasser ve ark. (60) Echinococcus cinsinde mitokondriyal CO1 gen dizisini kullanarak genetik olarak tiplendirmede ddf yöntemini uygulamışlardır. Echinococcus un yedi genotipinin ayırt edilebileceği, G1 genotipini yansıtan sekiz izolatın bazılarında kolay fark edilmeyen varyasyon profillerinin gözlendiği, genotip G4 ve genotip M2 olan iki örnek arasında varyasyon gözlenmediği belirtilmiştir. Deoksiribonükleik Asit Dizi Analizi Deoksiribonükleik asit dizi analizi herhangi bir DNA fragmanının nükleotid baz diziliminin ortaya konulmasıdır. DNA dizi analizi için en yaygın olarak kullanılan yaklaşım Sanger dizi analizidir. Sanger dizi analizinde başlangıçtaki orijinal kalıp için komplementer zinciri sentezleyen DNA polimerazı inhibe etmek amacıyla nükleotidlerin kimyasal analogları kullanılır. Kısa bir oligonükleotid ile DNA sentezi başlatılır ve DNA polimeraz kalıp iplik boyunca hareket eder veya radyoaktif işaretli nükleotidleri veya floresan işaretli nükleotidleri yeni sentezlenen zincir içerisine ekler. Dört sekans reaksiyonunun her birine dört normal 18

23 nükleotidin her biri ve yalnızca bir inhibitör analoğunun eklenmesi ile bir sekans bilgisi sağlanır. Günümüzde, DNA dizi analizine ait işlemleri otomatik olarak gerçekleştiren cihazlar geliştirilmiştir ve hem normal hem mutant genlerin analizi için rutin olarak kullanılmaktadır (44). Echinococcus granulosus un genotip tayininde DNA dizi analizini kullanan Vural ve ark. (9) Türkiye de çeşitli illerden İstanbul a kesim amacıyla getirilen hayvanlardan elde ettikleri izolatların G1 veya G3 suşu olduklarını bulmuşlardır. Dizi analizi ve PCR-RFLP nin birlikte kullanıldığı bir çalışmada ise, Türkiye de doğu ve güney doğu illerinden toplanan 17 izolata dizi analizi uygulanmış, tamamı G1 suşu olarak belirlenmiştir (10). Yine, Snabel ve ark. nın (12) yaptığı ve Ege Bölgesi nden toplanan izolatları kapsayan bir çalışmada Türkiye de ilk kez domuz suşu (G7) tespit edilmiştir. Echinococcus granulosus Suşlarının Epidemiyolojik Önemi Echinococcus granulosus suş/türlerinin patojenitelerindeki farklılıkları KE li hastalarda prognozu etkiler. Epidemiyolojik kanıtlar Kuzey Amerika nın kuzeyindeki E. granulosus un vahşi suşunun daha çok akciğer yerleşimli olduğunu, insanlar için düşük patojeniteye sahip olduğunu göstermektedir. Yine, Çin deki epidemiyolojik incelemeler belirli bölgelerdeki E. granulosus suşlarının daha düşük patojeniteye sahip olabileceğini göstermektedir (14). İnsanlarda en yüksek KE prevalansının koyun yetiştiriciliği yapılan toplumlarda bulunması nedeniyle köpek-koyun döngüsü ve E. granulosus un koyun suşu halk sağlığı açısından oldukça önemlidir. Atlara uyum sağlamış formlar gibi, bazı E. granulosus suşlarının insanlar için enfektivitesinin olmayacağı veya düşük olabileceğini gösteren epidemiyolojik veriler artmaktadır. Domuzlardan elde edilen E. granulosus un insanlar için düşük enfektivitede olduğu varsayılmaktadır. Her ne kadar develer Ortadoğu ve Afrika da yaygın olarak enfekte olsa da, insanlar için deve kökenli E. granulosus un enfektivitesi konusunda görüşler farklıdır. Arjantin den toplanan izolatların moleküler genetik çalışmaları sonucu insanları enfekte edebilen deve suşu genotipi ilk kez gösterilmiştir (3,36). ECHİNOCOCCUS GRANULOSUS UN EPİDEMİYOLOJİSİ Dünyada Echinococcus granulosus Echinococcus granulosus dünya çapında coğrafik dağılıma sahiptir ve kutupların çevresi, ılıman, subtropikal ve tropikal bölgeleri kapsayan tüm kıtalarda görülür. Avrasya 19

24 (Akdeniz ülkeleri, Rusya Federasyonu ve komşu ülkeler, Çin), Afrika (kuzey ve doğu bölgeleri), Avustralya ve Güney Amerika nın bir bölümünde parazit yüksek prevalansa sahiptir. Parazit; endemik alanlarda sporadik vakalardan yüksek prevalansa kadar değişik oranlarda görülmektedir. İzlanda, Grönland gibi sadece birkaç bölgenin E. granulosus bulundurmadığı kabul edilmektedir (3). Echinococcus granulosus un geçişi yaygın olarak kesin konak olan evcil köpekler ve ara konak olarak çiftlik hayvanları ile evcil bir döngüde gerçekleşir. Bu döngüdeki ara konak spektrumu E. granulosus un suşuna, çeşitli ara konak türlerinin bulunabilirliğindeki bölgesel veya lokal farklılıklara bağlıdır. Evcil döngüye sahip E. granulosus formu dünyanın birçok kırsal bölgesinde önemli halk sağlığı veya ekonomik problemler ile ilişkilidir. E. granulosus un vahşi siklusu Avrasya ve Kuzey Amerika nın kuzeyinde görülür. Bu döngü evcil hayvanlar ve insanlar için enfeksiyon kaynağı olarak rol oynayabilir (3,20,22). İnsanlar ve hayvanlar arasında en yüksek prevalans çiftlik hayvanları (büyük oranda koyun) yetiştiriciliğinin olduğu yerlerde bulunmaktadır. Coğrafik olarak insanlardaki KE prevalansı çiftliklerdeki prevalansa büyük oranda benzemektedir. İnsanlara enfeksiyonun geçişindeki ek faktörler (hijyen koşulları, parazitin genotipi), sporadik bölgeler içinde endemik odakların görülmesine ve bu şekilde karışık bir mozaik görünümüne neden olmaktadır (61). Kazakistan, Özbekistan, Kırgızistan, Tacikistan ve Türkmenistan ın bulunduğu Orta Asya da KE endemiktir ve birçok bölgede cerrahi KE insidansı 10/ vakanın üzerindedir (62). Çin de 1950 lerden bu yana yaklaşık insan vakası cerrahi olarak tedavi edilmiştir. Çin in farklı bölgelerinde yapılan çeşitli çalışmalarda insanlarda KE prevalansı % ; çiftlik hayvanlarında (koyun, keçi, yak, sığır, domuz, deve) % ; köpeklerdeki E. granulosus prevalansı ise % olarak bulunmuştur (63). Avrupa da zoonotik E. granulosus suşları İrlanda, İzlanda ve Danimarka hariç her ülkede bulunmaktadır. Akdeniz ülkelerinde (İspanya, İtalya, Sardunya gibi) ve Bulgaristan gibi Doğu Avrupa kısımlarında çok yoğun şekilde endemiktir (19,61). Bulgaristan da ekonomik durumun kötüye gitmesi ve kontrol programlarının durmasına bağlı olarak insanlarda ve hayvanlarda ekinokokkozis son yıllarda tekrar ortaya çıkmıştır yılları arasında köpek ve koyunlardaki enfeksiyon oranı %4-7 iken, yılları arasında bu oran %19-32 ye yükselmiştir (3). Yunanistan da KE prevalansı sığırlarda %82, koyunlarda %80, keçilerde %24 ve domuzlarda %5; 1984 yılında cerrahi insan vakası de 12.9 iken 1984 te KE kontrol programının başlaması ile 1998 yılında bu değerler koyunlarda %31.3 e, keçilerde %10.3 e, domuzlarda %0.6 ya ve sığırlarda %0 a gerilemiştir (63). 20

25 Kıbrıs ta E. granulosus 1970 lerden önce çok yaygındı ve insanda yıllık cerrahi insidans 12.9/ idi de E. granulosus ile enfekte köpeklerin oranı %6.8, iki yaşından büyük koyunlarda %54, keçilerde %12, sığırlarda %30 ve domuzlarda %10 idi de ekinokokkozise karşı kampanya başlatıldı. Kampanya Güney Kıbrıs ta 1985 yılında parazitin eradike edildiği düşüncesiyle sonlandırıldı. Ancak aralıklı olarak kesimhanelerde kistlerin görülmesi 1993 yılında kontrol programının yeniden başlamasına yol açmıştır yılları arasında E. granulosus prevalansının %0.17 olduğu gösterilmiştir yılları arasında 20 yaşın altındaki kişilerde KE e rastlanılmamıştır. Kuzey Kıbrıs ta yılları arasında yıllık insidans 5.7/ olarak belirlenmiştir (3,64). Avustralya da KE önemli bir halk sağlığı sorunudur. Avustralya anakarasında yaban hayvanları E. granulosus un evcil köpekler, çiftlik hayvanları ve insanlara geçişinde önemli rol oynamaktadır (65). Avustralya da parazitin endemik olduğu alanlarda vahşi köpeklerde prevalansın %48-90 olduğu gösterilmiştir, insan KE olgusu yılda ortalama 42.5 tir. Tazmanya adasında 1960 larda E. granulosus prevalansı köpeklerde %12, üç yaş üstü koyunlarda %52 ve sığırlarda %17 iken kontrol programlarının uygulanmasının ardından koyunların % ünde, sığırların %0.007 sinde kiste rastlanmıştır (3). Amerika da E. granulosus Kuzey Amerika da Kuzey Kanada ve Alaska dan Güney Amerika da Tierra del Fuego ya kadar olan alanda büyük oranda görülmektedir. Güney Amerika yüksek insidans ve prevalans değerlerine sahiptir. Örneğin Uruguay da 1995 yılında insidans 9.2/ olarak tespit edilmiştir. Amerika Birleşik Devletleri (ABD) nde enfeksiyonların çoğu ekinokokkozisin yüksek oranda endemik olduğu ülkelerden göç eden kişilerde görülmektedir. Sporadik yerli vakalar Alaska, Kaliforniya, Utah, Arizona ve New Mexico da gösterilmiştir (2,66). Afrika da en yüksek prevalans Kuzey ve Doğu Afrika nın koyun yetiştiriciliği yapılan alanlarından rapor edilmiştir. Doğu Afrika da prevalans %3 ün üzerindedir. Koyun yetiştiriciliği yapanlarda bu oran %7.5 tur. Tunus ve Libya nın koyun yetiştirilen bölgelerinde insan KE prevalansı %2 olarak belirlenmiştir. Kenya nın Turkana bölgesinde 1983 yılında kontrol önlemleri alınmadan önce insanlarda KE prevalansı yaklaşık %7.5 iken 1992 yılında bu oran %3.1 e gerilemiştir (2,3,61,65). Türkiye de Echinococcus granulosus Türkiye de KE veteriner kontrolünde olmayan sokak köpeklerinin yaygınlığı ve gerekli önlemlerin alınmamasından dolayı oldukça sık rastlanmaktadır (67). Sağlık Bakanlığı verilerine göre 1987 ve 1994 arasında, hastanelerde KE vakası bulunmuştur, yıllık 21

26 ortalama ise 2663 olarak tespit edilmiştir. Yaklaşık 61 milyon nüfusta, ortalama yıllık insidans de 4.4 tür (3). Yazar ve ark. nın (5) yaptığı bir çalışmada ise Türkiye de yılları arasında toplam kistik ekinokokkozis olgusu bildirildiği belirtilmiştir. Ancak ülkemizde ekinokokkozis ile ilgili verilerin düzenli ve doğru bir şekilde toplanmaması nedeniyle Sağlık Bakanlığı verilerinin gerçeği tam olarak yansıtmadığı düşünülmektedir (67). Trakya bölgesinde 1991 yılında Edirne, Kırklareli ve Tekirdağ illerini kapsayan bir çalışmada; insanlarda Casoni yöntemi ile %16.8, indirekt hemaglütinasyon (IHA) ve Casoni yöntemi ile %9.2, IHA deneyi ile %12 oranında pozitiflik saptanmıştır (68) yılları arasında İstanbul, İzmit, Bursa, Edirne, Tekirdağ ve Kırklareli illerinde değişik hastanelerde KE tanısı ile opere edilen hasta sayısının 3628 olduğu belirtilmiştir (69). Akdeniz bölgesinde bulunan Adana, Antalya, Burdur, Hatay, Isparta, İçel, Kahramanmaraş ve Osmaniye illeri İl Sağlık Müdürlüklerinin yılları arasındaki beş yıllık verilerine göre 1289 erkek, 1284 kadın toplam 2573 olguya KE tanısı konmuştur (70). Adana ve Hatay daki çeşitli hastanelerin patoloji laboratuvarlarından elde edilen verilere göre yılları arasında 962 ekinokokkozis olgusu saptanmıştır (71). Ege bölgesinde yer alan İzmir, Denizli, Afyon, Manisa, Aydın, Kütahya, Uşak illerinde hastane ve İl Sağlık Müdürlüğü kayıtlarına göre yılları arasında KE tanısı almış olguların sayısı 2101 dir (72). Ozkol ve ark. (73) ilköğretim okulu öğrencilerini kapsayan bir çalışmada seropozitiflik oranını enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) yöntemiyle %8.9, IHA yöntemiyle %10.1 olarak tespit etmişlerdir. Altintas ve ark nın (74) yaptıkları bir çalışmada İzmir ve çevresinde insanlardan toplanan toplam 2055 kan örneğinde %3.45 oranında seropozitivite tespit edilmiştir. İç Anadolu bölgesinde bulunan 13 ilde yılları arasında 2348 i erkek, 2998 i kadın olmak üzere toplam 5346 olgu KE tanısı almıştır (75) tarihleri arasında Konya Sosyal Sigortalar Kurumu Hastanesi nde servislere yatırılan hastaların 213 ü (%0.81) KE teşhisi ile opere edilmiştir (76). Kayseri de çeşitli hastane kayıtları ve İl Sağlık Müdürlüğü kayıtları incelendiğinde; yılları arasında 699 KE olgusu saptanmıştır (77). Karadeniz bölgesinde Sağlık Bakanlığı verilerine göre 2001 yılından 2006 nın ilk yarısına kadar olan olgular toplam 3433 adettir (78). Doğu Anadolu Bölgesinde 10 ili kapsayan bir çalışmada (79) yılları arasında kayıt edilen opere olan hasta sayısının 824 olduğu tespit edilmiştir. Kars ili merkezi ve köylerinde yaşayanlarda KE seroprevalansı IHA ve IFA (immün floresan antikor) teknikleri ile araştırılmış ve bu oran %34.6 olarak bulunmuştur (80) yılları arasında Atatürk Üniversitesi Tıp Fakültesi nde histopatolojik olarak 111 KE tanısı konmuştur 22