ECHINOCOCCUS GRANULOSUS İZOLATLARININ GENOTİPLENDİRİLMESİ

Transkript

1 T.C. TRAKYA ÜNİVERSİTESİ TIP FAKÜLTESİ TIBBİ MİKROBİYOLOJİ ANABİLİM DALI Tez Yöneticisi Doç. Dr. Nermin ŞAKRU ECHINOCOCCUS GRANULOSUS İZOLATLARININ GENOTİPLENDİRİLMESİ (Uzmanlık Tezi) Dr. Canan ERYILDIZ EDİRNE-2010

2 TEŞEKKÜR Uzmanlık eğitimimde ve tez çalışmamda yardımlarını hiçbir zaman esirgemeyen sayın hocam, Doç. Dr. Nermin ŞAKRU ya, sayın hocalarım Prof. Dr. Murat Tuğrul a, Prof. Dr. Metin Otkun a, Doç. Dr. Şaban Gürcan a, Doç. Dr. Neşe Akış a, Doç. Dr. Müşerref OTKUN a, Doç. Dr. Sami ŞİMŞEK e, Yard. Doç. Dr. Tammam SİPAHİ ye, asistan arkadaşlarıma ve laboratuvar personeli arkadaşlarıma teşekkür ederim.

3 İÇİNDEKİLER GİRİŞ VE AMAÇ... 1 GENEL BİLGİLER... 3 ECHINOCOCCUS CİNSİNİN TAKSONOMİSİ... 3 ECHINOCOCCUS CİNSİ PARAZİTLERİN GENEL MORFOLOJİSİ... 4 ECHINOCOCCUS CİNSİ PARAZİTLERİN YAŞAM DÖNGÜSÜ... 5 ECHINOCOCCUS CİNSİNİN TÜRLERİ... 7 ECHINOCOCCUS CİNSİ PARAZİTLERDE VARYASYON ECHINOCOCCUS TA TÜR VE SUŞ BELİRLEMEDE KULLANILAN YÖNTEMLER ECHINOCOCCUS GRANULOSUS UN EPİDEMİYOLOJİSİ KİSTİK EKİNOKOKKOZİS GEREÇ VE YÖNTEMLER BULGULAR TARTIŞMA SONUÇLAR ÖZET SUMMARY KAYNAKLAR EKLER

4 SİMGE VE KISALTMALAR ABD : Amerika Birleşik Devletleri CO1 : Sitokrom c oksidaz subunit 1 DNA : Deoksiribonükleik asit dntp : Deoksiribonükleozid trifosfat ITS1 : Internal transcribed spacer 1 KE : Kistik ekinokokkozis ND1 : NADH dehidrogenaz subunit 1 PAIR : Puncture, aspiration, injection, reaspiration PCR : Polymerase chain reaction RAPD : Random amplification of polymorphic deoxyribonucleic acid RFLP : Restriction fragment length polymorphism rdna : Ribozomal deoksiribonükleik asit SSCP : Single stranded conformation polymorphism TBE : Trisbase - boric acid - ethylenediaminetetraacetic acid UV : Ultraviyole

5 GİRİŞ VE AMAÇ Echinococcus lar, Taeniidae ailesine ait küçük sestodlardır. Günümüzde Echinococcus cinsinin Echinococcus granulosus, E. multilocularis, E. oligarthrus ve E. vogeli olarak dört türü tanımlanmıştır. Yetişkin parazit; son konak olan köpeğin ya da diğer etobur hayvanların ince bağırsağında, larval (metasestod) form; tırnaklı hayvanlar (koyun, sığır, domuz, at vs.) ve insanların iç organlarında bulunur. Metasestod formu bu ara konaklarda ekinokokkozise neden olur (1,2). Echinococcus granulosus, dünya çapında coğrafik dağılıma sahiptir. Yüksek parazit prevalansına sahip bölgeler; Avrasya, Kuzey ve Doğu Afrika, Avustralya ve Güney Amerika dır. (3). E. granulosus un neden olduğu kistik ekinokokkozis (KE), yurdumuzda büyük bir kesimin hayvancılıkla uğraşması ve gerekli/yeterli önlemlerin alınmaması nedenleriyle gerek koyun ve sığır gibi hayvanlarda gerekse insanlarda son derece yaygın bir hastalıktır. Bu nedenle önemli bir sağlık sorunu oluşturmasının yanı sıra önemli ekonomik kayıplara da yol açmaktadır (4). Yazar ve ark. nın (5) yaptığı çalışmaya göre; yılları arasında Türkiye den toplam 14789, Trakya bölgesinden ise 526 KE olgusu bildirilmiştir. Echinococcus larda suş; gen frekanslarında ve ekinokokkozisin epidemiyolojisi ve kontrolü için önemli olan veya olabilecek bir veya daha fazla karakterde, aynı türün diğer gruplarından istatistiksel olarak farklı olan gruplar olarak tanımlanmıştır (6). Echinococcus cinsi içindeki varyasyonların belirlenmesi özellikle birden çok ara konağın bulunduğu, farklı geçiş siklusları ve insan enfeksiyonu için kaynağın olabildiği bölgelerde önemlidir. Echinococcus un suşları arasındaki gelişimsel farklılıklar ekinokokkozisin kontrol çalışmalarını olumsuz yönde etkileyebilir (7). 1

6 Echinococcus ların tür ve suş ayırımında kullanılan deoksiribonükleik asit (DNA) tabanlı yöntemler konak ve çevreye bağlı faktörlerden bağımsız olup doğrudan parazit genomunu incelediğinden oldukça önemli yöntemlerdir (8). Bu alanda Türkiye de yapılan çalışmalar oldukça sınırlı olup Vural ve ark. nın (9) yaptığı çalışmada koyun ve sığırlarda E. granulosus un G1 ve G3 genotipleri saptanmıştır. Utuk ve ark. nın (10) yaptığı çalışmada ise insan, köpek, deve, koyun, keçi ve sığırlardan elde edilen E. granulosus izolatlarının tamamının G1 genotipinde olduğu belirlenmiştir. Ergin ve ark. nın (11) çalışmasında ise; insan izolatların tümünün G1 suşu olduğu belirlenmiştir. Snabel ve ark. (12) Ege bölgesinde bulunan çeşitli illerden topladıkları koyun ve insan izolatlarında Türkiye de ilk kez G7 suşunun varlığını göstermişlerdir. Çalışmada amacımız Edirne ilinde insanlardan ve hayvanlardan (koyun, keçi, sığır gibi büyükbaş ve küçükbaş hayvanlar) elde edilen hidatik kist materyalini inceleyerek E. granulosus türünün suş ayrımını ve dağılımını moleküler teknikler kullanarak göstermektir. Bu şekilde bölgemizde KE ye karşı etkin eradikasyon ve kontrol programlarının uygulanmasına önemli katkıda bulunulacağı düşünülmektedir. 2

7 GENEL BİLGİLER ECHİNOCOCCUS CİNSİNİN TAKSONOMİSİ Echinococcus (Rudolphi, 1801) cinsinin sınıflandırma ve isimlendirme çalışmaları yıllardır devam etmektedir ve 1969 yılları arasında 10 E. granulosus ve 3 E. multilocularis alttürü tanımlanmıştır. Ancak daha sonra E. granulosus un E. granulosus granulosus (Verster, 1965) ve E. granulosus canadensis (Webster ve Cameron, 1961) dışındaki alttürleri geçersiz kılınmıştır. E. multilocularis in 3 alt türü E. multilocularis multilocularis (Vogel, 1957), E. multilocularis sibiricensis (Rausch ve Schiller, 1954) ve E. multilocularis kazakhensis (Shul ts, 1961) Rausch tarafından geçerli alttürler olarak değerlendirilmiştir. Günümüzde Echinococcus cinsi içerinde tanımlanan bu alttürler geçersiz kılınmıştır. Taksonomik durumu kesin olmayan intraspesifik varyantların suş olarak tanımlanması kabul edilmiştir (6). Echinococcus türlerinin sınıflandırmadaki yeri şu şekildedir (1,7,13): Alt alem; Metazoa, şube; Platyhelminthes, sınıf; Cestoda, alt sınıf; Eucestoda, takım; Cyclophyllidea, aile; Taeniidae, cins; Echinococcus, türler; E. granulosus (Batsch, 1786), E. multilocularis (Leuckart, 1863), E. oligarthrus (Diesing, 1863) ve E. vogeli (Rausch ve Bernstein, 1972). Echinococcus granulosus türü içinde genetik çeşitliliğe sahip bazı formlar önceki yıllarda farklı tür veya E. granulosus un alt türü olarak tanımlanmıştır. Günümüzde bu formların taksonomideki durumunun yeniden tanımlanması konusu, DNA dizi verilerinin filogenetik analizi sonucu Echinococcus taksonomisinin tekrar gözden geçirilmesini takiben gündeme gelmiştir (14). Suş kavramı farklı ara konak türlerinden E. granulosus izolatları arasındaki genetik farklılıkları gösteren kanıtların artmasıyla daha da beslenmiştir. Bu genetik varyasyon 3

8 fenotipik değişkenlik ile de ilişkili bulunmuştur, bundan dolayı konağa uyumlu E. granulosus suşları kavramı geliştirilmiştir (15). ECHİNOCOCCUS CİNSİ PARAZİTLERİN GENEL MORFOLOJİSİ Echinococcus cinsi erişkin parazitler mm uzunluğunda ve baş (skoleks), boyun, 2-6 adet proglottide sahip gövdeden (strobilia) oluşur. Skoleks, dört çekmene ve rostellum üzerinde bulunan biri küçük biri büyük olmak üzere iki sıra çengele sahiptir. Strobiliadaki proglottidlerden ilki immatür, sonraki matür ve sonuncusu ise gebe proglottiddir. İmmatür proglottidin seksüel organları henüz gelişmemiştir. Matür proglottid fertilizasyonun gerçekleştiği işlevsel hermafroditik seksüel organları içerir. Gebe proglottidde uterus yumurta ile doludur ve yumurtalar tamamen geliştiği zaman uterus son segmentin çoğunu kaplar (13, 14,16). Şekil 1 de Erişkin E. granulosus gösterilmektedir. Yumurtalar küresel-elipsoid şekillidir ve genellikle µm ile µm µm lik iki çapa sahiptir. Yumurtalar oldukça dirençli keratinize embriyoforun da dahil olduğu birkaç örtü ile çevrili altı çengelli embriyodan (onkosfer = birincil larval evre) oluşur. Bu şekilde yumurta koyu çizgili bir görünüm alır. Vitellin tabakanın (yumurta kabuğu veya dış katman) yumurta serbestleşmeden önce soyulması nedeniyle embriyofor; embriyoyu fiziksel olarak koruyan temel tabakadır. Echinococcus yumurtaları düşük sıcaklıklarda (yaklaşık C ler arasında), nemli bir çevrede enfektivitelerini birkaç aydan bir yıla kadar korurlar. Yumurtalar kuruluğa karşı duyarlıdır. %25 bağıl nem oranında E. granulosus yumurtaları 4 günde, %0 bağıl nem oranında 1 günde ölürler. E. granulosus yumurtaları C de 5 dakikadan kısa bir sürede ölürler. Echinococcus yumurtaları donma sıcaklıklarında canlılıklarını sürdürebilir (7,13,14). Metasestodun (ikincil larval evre) yapı ve gelişimi dört Echinococcus türü arasında farklıdır. Karakteristik olarak tüm türlerin kistleri dış kısmından aselüler laminer tabaka ile desteklenmiş, iç kısımda bulunan germinal tabakadan oluşur. E. multilocularis hariç tüm türlerde laminer tabaka konak tarafından yapılan adventisyal tabaka ile çevrilidir. Germinal tabaka çimlenme kapsüllerine aseksüel gelişim ile çoğalabilen tabakadır. Protoskoleksler çimlenme kapsüllerinin veya birincil kistin iç duvarından ortaya çıkar. Embriyodan gelişen metasestod (hidatik kist) beş ayda 1 cm çapa ulaşır ve büyümeye devam ederek on veya daha fazla yılın sonunda birkaç litre sıvı içerebilen büyük bir kist halini alabilir (6,7,14,16). 4

9 Şekil 1. Erişkin Echinococcus granulosus (17) ECHİNOCOCCUS CİNSİ PARAZİTLERİN YAŞAM DÖNGÜSÜ Echinococcus cinsinin üyeleri yaşam döngülerinde etobur bir son konak ve etobur olmayan memeli bir ara konağa sahiptir. Erişkin parazit; son konak ince bağırsağının mukozasına sıkıca tutunarak yaşar. Seksüel olgunlaşma tür ve suşlara bağlı olarak 28 gün gibi kısa bir sürede yumurta üretiminin başlaması ile 3-4 hafta içinde olur. Yumurtalar proglottidlerin içinde veya serbest olarak feçesle dış ortama atılır. Çevrede olgunlaşma periyoduna ihtiyacı olan immatür yumurtalar salınabilmesine karşın, feçesle atılan yumurtaların tam olarak embriyonize ve enfektif olduğu düşünülmektedir (6). Ara konak tarafından ağız yoluyla alınan embriyonize yumurta mide ve ince bağırsakta açılır. Embriyo veya onkosfer serbestleşir, serbest hale geçen onkosfer çengel hareketi ve histolitik enzimlerin yardımıyla hızlıca villöz epitelyuma penetre olur ve lamina propriaya uzanır. Venül veya lenf damarına geçen onkosfer pasif olarak karaciğer veya akciğere taşınır, bazen böbrekler, dalak, kaslar, beyin veya diğer bölgelere de taşınabilir. Organların etkilenme durumu; ara konağa ve Echinococcus un tür veya suşuna bağlı olarak değişiklik gösterir. İn vivo ve invitro çalışmalar Echinococcus onkosferlerinin ilk 14 gün içinde bir seri olaylar geçirdiğini göstermiştir. Bu olaylar hücresel proliferasyon, onkosferal çengellerin dejenerasyonu, kas atrofisi, vezikülarizasyon, santral kavite oluşumu, germinal ve laminer tabakaların gelişimini içerir. Sonuçta kistik, aseksüel olarak prolifere olan metasestod gelişir. Gelişen kistin tipi farklı türler arasında belirgin olarak değişiklik gösterir. İnsanlarda kist içinde protoskoleks gelişimi için gerekli süre bilinmemektedir. Ancak domuzlarda bu süre ay, koyunlarda 10 ay - 4 yıldır (2,6,13). 5

10 Son konakta hidatik kistteki protoskolekslerin sindirimi ile enfeksiyon başlar. Birkaç saat içinde, sindirilmiş protoskoleksler ince barsak villusları arasında aşağı iner ve erişkin parazitlere gelişir (6). Echinococcus cinsi parazitlerin yaşam döngüsü Şekil 2 de gösterilmektedir. Taksonomik ve epidemiyolojik çalışmalar E. granulosus un vahşi ve evcil yaşam döngülerini tanımlamaktadır. Vahşi döngüler; E. granulosus un bulunduğu alanların çoğunda görülmektedir. Bu döngü son konak olarak kurt, av köpeği, sırtlan, çakal ve dingoları; ara konak olarak antilop, yaban domuzu, geyik ve makropodları içerir. Evcil döngüler; dünyanın tüm endemik alanlarında görülen esas döngüdür. Köpek daima kesin konaktır. Koyun ara konakların en önemlisidir, ancak keçi, at, inek, deve, yak ve domuzlar da ara konak görevi görebilirler (14,18-20). Enfeksiyon; insanlar tarafından enfekte kesin konağa, yumurta içeren feçese, yumurta ile kontamine yüzey veya toprağa elle temastan sonra elin direkt olarak ağza götürülmesi ile kazanılır. Yumurtalar; kontamine çiğ sebze, meyve ve diğer bitkilerin yenmesi ile de alınabilir. Yiyecekler ve yüzeyler rüzgar, kuşlar, arılar ve sinekler yoluyla da ikincil olarak kontamine olabilir. Enfekte etçillerin feçesindeki Echinococcus yumurtaları ile kontamine olmuş içme suları da enfeksiyon için potansiyel bir kaynaktır (1,2). Köpekler için enfeksiyonun en yaygın kaynağı enfekte koyun sakatatlarıdır (19). Şekil 2. Echinococcus cinsi parazitlerin yaşam döngüsü (21) 6

11 ECHİNOCOCCUS CİNSİNİN TÜRLERİ Echinococcus granulosus Erişkin E. granulosus 3-6 mm uzunluğunda, küçük bir sestoddur. Fertil hidatik kistlerden köken alan protoskolekslerin köpek ya da diğer etçil hayvanlar tarafından ağızdan alınmasının ardından Lieberkuhn kriptlerindeki villuslar arasında derin bir biçimde evagine, penetre olur ve 4-5 hafta içinde seksüel açıdan olgun erişkin parazitler oluşur. Parazit kesin konağın ince bağırsak mukozasına sıkı bir şekilde tutunmuş olarak yaşar. E. granulosus genellikle 3 ya da 4 proglottide sahiptir. Sondan ikinci proglottid matür, son proglottid gebedir ve genellikle solucanın uzunluğunun yaklaşık yarısıdır. Rostellum adet (ortalama 36-40) iki sırada dizilmiş çengele sahiptir. Birinci sıradaki büyük çengeller μm, ikinci sıradaki küçük çengeller μm boyundadırlar. Yumurtalık böbrek şeklindedir. Genital delikler değişimli olarak düzensizdir ve normalde matür ve gebe proglottidlerin arka yarısına açılır. Gebe proglottidin uterusu iyi gelişmiş divertiküle sahiptir. Gebe proglottidlerin her biri birkaç yüz adet yumurta içerir (1,14,22,23). Protoskolekslerin köpek ya da diğer etçil hayvanlar tarafından ağızdan alınması ile seksüel açıdan olgun erişkin parazit oluşması arasındaki süre prepatent periyot olarak bilinir. Bu periyodu gebe proglottidlerin veya yumurtaların dışkıyla dış ortama atılması takip eder. Yumurtalar tipik taeniid yumurtalarıdır ve ile μm çapındadırlar. Bu yumurtalar çevreye salındıklarında ara konak için enfektiftirler (1,22). Echinococcus granulosus yumurtalarının; insanlar ve uygun ara konak hayvanlar (tıbbi açıdan önemli olanların çoğu evcil tırnaklılardır) tarafından ağızdan alınmasının ardından onkosfer yumurta çeperinden dışarıya çıkar. Onkosfer intestinal epitelyumda lamina propriaya ve uygun kan damarlarına penetre olur. Daha sonra kan ve lenf damarları ile pasif olarak karaciğer ve akciğerler gibi primer hedef organlara taşınır. Onkosfer; bu organlarda eşmerkezli olarak genişleyerek büyüyen bir vezikül içinde olgunlaşır. Sonunda tamamen olgun metasestod veya hidatik kist meydana gelir. Bu genellikle içi sıvı dolu, uniloküler bir kisttir, fakat odacıkların birleşmesiyle oluşan multipl bir kist de olabilir. Kist; iç kısımda bulunan germinal tabaka ve germinal tabakanın çevresinde dayanıklı, elastik, farklı kalınlıklarda olabilen aselüler laminer tabakadan oluşur. Laminer tabakanın dışında konak tarafından yapılan fibröz adventisyal tabaka bulunur (13,16,22). Çalışmamızdaki E. granulosus kaynaklı hidatik kist sıvısında bulunan protoskolekslerin boyasız preparasyondaki görünümleri Şekil 3 te, E. granulosus metasestodunun kesitsel görünümleri Şekil 4 te gösterilmiştir. 7

12 A B Şekil 3. Echinococcus granulosus protoskolekslerinin boyasız preparasyondaki görünümleri: A-Evagine olmuş protoskoleks, 200x, B-Evagine olmamış protoskoleksler, 100x A B G: Germinal tabaka; L: Laminer tabaka; P: Protoskoleks; Ç: Çimlenme kapsülü Şekil 4. Echinococcus granulosus metasestodunun kesitsel görünümleri: A-Hematoksileneozin boyama, 100x, B-Periyodik asit-schiff boyama, 100x 8

13 Hidatik kistler çoğunlukla 5-10 cm çapında olmakla birlikte daha büyük olanlar da kaydedilmiştir, özellikle insanda, örneğin 50 cm çapında bir kist ve yaklaşık 16 litre sıvı içerdiği bildirilmiştir. Germinal membrandan kist kavitesi içine doğru büyüyen vakuol şeklindeki hücreler kitlesine çimlenme kapsülü denmektedir. Her biri protoskoleks içeren çimlenme kapsülleri enfeksiyondan yaklaşık beş ay sonra gelişir. Kist duvarından ayrılarak kist sıvısında serbestçe yüzen çimlenme kapsülleri hidatik kum olarak isimlendirilir. Bazen hidatik kist içinde kız kistler gelişir ve kist rüptüre olursa protoskoleksler ve çimlenme kapsülleri dış kız kistlere gelişebilir. Dış kız kistler laminer tabaka ile çevrili olan bir parça germinal membran tarafından da oluşturulabilir. Bazı kistler çimlenme kapsülü üretemez ya da çimlenme kapsülleri protoskoleks üretmeyi başaramazlar. Sekonder bakteriyel enfeksiyon veya kistin kalsifiye olması nedeniyle hidatik kist parazit içermeyebilir (1,16). Kemikte hidatik kist olduğu zaman kist anormal gelişir ve sınırlı bir membran oluşmaz. Hidatik kist kemikte ilk olarak kemik iliği kavitesinde gelişir, genişler ve sıklıkla büyük bir bölümünü hasara uğratır (16). Hidatik kistler birincil olarak sıklıkla multiloküler oldukları koyunların akciğerlerinde, domuzların karaciğer ve akciğerlerinde, at ve sığırların karaciğerinde bulunurlar (1). Kaya suyu olarak da adlandırılan hidatik kist sıvısı, renksiz, mg/dl protein içeren, antijenik özelliğe sahip, hafif bazik bir sıvıdır. Kist sıvısı çarpıcı şekilde konağın serumuna benzer ve immunoglobulin içerir (1,24). Echinococcus multilocularis Echinococcus multilocularis in doğal döngüsü kesin konak olarak Vulpex (kızıl) ve Alopex (kutup) cinsi tilkileri içerir. Bazen kurt, çakal, köpek veya kediler de kesin konak olarak döngüde bulunabilirler. E. granulosus gibi, erişkin parazitler ince bağırsak mukozasına tutunurlar. Erişkinler E. granulosus tan daha küçüktür, mm uzunluğundadır. Diğer morfolojik farklılıklar; 2-6 proglottidin bulunması; rostellar çengellerin yapı ve sayısında farklılık (14-34 adet, küçük çengeller 20-21μm, büyük çengeller 25-35μm), gebe proglottidde uterusun lateral poşunun olmayışı, genital deliğin proglottidin ön kısmına daha yakın oluşu, ön-sondan ikinci segmentin karakteristik olarak matür oluşu ve testislerin adet oluşudur. Hermafrodit erişkinler yaklaşık 4 haftada seksüel olgunluğa ulaşır. Yumurta üretimi 28 gün gibi kısa bir sürede başlar (1,14,18,22). Gebe proglottid uterusu onkosferal membran içine gömülmüş ve kalın bir embriyofor ile çevrili tamamen farklılaşmış tek bir onkosferli, µm çapında yuvarlak-ovoid 9

14 yumurtalar içerir Proglottidler ve onların yırtılması ile salınan yumurtalar enfekte kesin konakların feçesinde dışarı atılır. Çevreye salınan yumurtalar oldukça dayanıklıdır (22). E. multilocularis in ara konakları özellikle Arvicolidae ailesine ait kemirgenlerdir. Soricidae (sivri faregiller), Talpidae (köstebekgiller), Sciuridae (sincapgiller), Cricetidae (hamstergiller) ailelerine ait kemirgenler ve insanlar da ara konak olabilir (1,14). Yumurtalar ara konak tarafından alındığında konak midesindeki sindirim süreci ve diğer faktörler onkosferin yumurtadan çıkması ve salınımı ile sonuçlanır, daha sonra muhtemelen safranın yüzey aktif özellikleri ile aktive olur. Aktive onkosfer intestinal villusların epitelyal sınırına penetre olur ve venöz ve lenfatik damarlara girer, ardından diğer anatomik bölgelere dağılır. Onkosferlerin çoğu karaciğerde gelişir, bazıları akciğerler veya diğer organlara ulaşabilir. Germinal tabaka; infiltratif büyüme, tüp benzeri içe transformasyon, endojen ve ekzojen proliferasyondan sorumludur (1,13,14,22). Echinococcus multilocularis in metasestodu E. granulosus un metasestodundan daha komplekstir ve oldukça farklı gelişir. Metasestod sınırlayıcı bir konak-parazit bariyerinin (adventisyel tabaka) bulunmaması nedeniyle multiveziküler infiltratif yapıdadır. Larval kitle genellikle sıvıdan çok yarı katı matriks içerir ve bağ dokunun dens stromasında yerleşmiş çok sayıda küçük veziküllerden oluşmuştur. Vena cava veya portal ven içine büyüme metastazlara yol açabilir. Metastazlar genellikle akciğerler veya beyine olur (13,16). Protoskolekslerin üretimi 2-4 ay içinde gerçekleşebilir, fakat ara konak tür ve suşuna bağlı olarak daha kısa da olabilir (22). Yaşam döngüsünün tamamlanması için kesin konaklar protoskoleks içeren olgun enfektif metasestodu yemelidir. Enfekte dokunun sindirimini invajine skoleksli protoskolekslerin serbestleşmesi takip eder. Pepsin ve safra tuzları skoleksin hızlı evajinasyonunu uyarır, böylece intestinal mukozaya sıkıca bağlanabilir (24). Echinococcus oligarthrus Echinococcus oligarthrus un kesin konağı puma (Felis concolor), jaguar (F. onca), jaguarundi (F. yagouaroundi) ve Geoffroy kedisi (F. geoffroyi) gibi vahşi kedigillerdir. Erişkin parazit mm uzunluğunda olup vücutları üç halkadan oluşmaktadır. Rostellar çengeller adettir (büyük çengeller μm, küçük çengeller μm uzunluğunda). Genital delik olgun halkanın ön ortasında, gebe halkanın ortaya yakın kısmındadır. Testislerin sayısı arasında değişir. Gebe uterus kese şeklindedir (1). Aguti (Dasyprocta) ve diğer rodentler ara konak görevi görmektedir. Ara konakta larval evre subkutanöz kaslarda oluşur. Metasestod polikistiktir ve içi sıvı doludur. Kistler 10

15 septalı ve çok odacıklı şekilde büyüme eğilimindedir. Laminer tabaka E. vogeli den çok daha incedir. E. oligarthrus insanda hidatik hastalık etkeni olarak nadiren rapor edilmiştir, ancak bunların aslında yanlış tanımlanmış E. vogeli vakaları oldukları görüşü de vardır (1,16,22). Echinococcus vogeli Echinococcus vogeli kesin konak olarak olarak çalı köpeği (Speothos venaticus) ve bazen evcil köpekleri; ara konak olarak pakaları (Cuniculus paca) içeren vahşi, av-avcı döngüsünde yaşamını devam ettirir. İnsanlar nadiren enfekte olur (1,14,22). Erişkin parazit mm uzunluğunda olup vücutları ilk halka küçük olup uzunluğu genişliğinden daha azdır. Olgun halka dikdörtgen şeklindedir ve boyu eninden fazladır. Genital delik matür ve gebe halkanın orta arka kısmındadır adet testisleri vardır ve segmentin ön yarısında daha çok yer kaplar. Gebe uterus yan dallara veya keseciklere sahip değildir ve kısmen uzun ve tübüler yapıda olmasıyla karakterizedir. Rostellar çengeller adettir; büyüğü 49-57μm ve küçüğü μm dir (1). Echinococcus vogeli nin metasestodu çok odacıklı kümeler oluşturma eğiliminde olup polikistiktir ve içi sıvı doludur. Metasestod ara konağın daha çok karaciğerinde bulunur. Germinal ve laminer tabakanın endojenöz proliferasyon ve katlanması; çimlenme kapsülü ve protoskolekslerin üretimi ile birincil vezikülde ikincil alt bölmelerin oluşmasına yol açar (20). İnsanlarda E. vogeli kistleri karaciğerde bulunur fakat akciğerler, plevra, perikardium, kalp, interkostal kaslar, diyafram, mide, omentum ve mezenterlerde de görülebilir (16,18). ECHİNOCOCCUS CİNSİ PARAZİTLERDE VARYASYON Echinococcus ta rapor edilen variabilite konak nedenli de olabilmesine karşın daha çok, morfolojik ve biyokimyasal farklılıklar olarak yansıyan genetik bir temele sahiptir (7). Echinococcus larda suş; gen frekanslarında ve ekinokokkozisin epidemiyolojisi ve kontrolü için önemli olan veya olabilecek bir veya daha fazla karakterde, aynı türün diğer gruplarından istatistiksel olarak farklı olan gruplar olarak tanımlanmıştır (6). Bu variabilite yaşam döngü paterni, konak özgüllüğü, gelişim hızı, patojenite, geçiş dinamikleri, antijenite ve kemoterapötik ajanlara duyarlılık, ekinokokkozisin epidemiyolojisi ve kontrolünü etkileyen karakterlerde yansıtılıyor olabilir (14). Echinococcus granulosus un Suşları Evcil koyun suşu: E. granulosus un en önemli ve yaygın ara konağı evcil koyunlardır. E.granulosus un evcil koyun suşu (G1) dünya çapında geniş bir dağılıma sahiptir. Güney 11

16 Amerika nın bir kısmı, Güney ve Doğu Avrupa, Kuzey ve Doğu Afrika ve Asya nın bir bölümü ve Avustralya da bulunmaktadır. Evcil koyun suşu koyun dışında keçi, sığır, manda, yak, deve, domuz ve makropodlar gibi geniş bir ara konak dağılımına sahiptir. Şimdiye kadar cerrahi ile insanlardan elde edilen E. granulosus materyalinin çoğu, moleküler yöntemler kullanılarak evcil koyun suşu olarak belirlenmiştir (6,25-27). Tazmanya koyun suşu: Morfolojik, biyokimyasal ve gelişimsel çalışmalar Avustralya nın Tazmanya adasından elde edilen koyun kökenli E. granulosus izolatlarının Avustralya anakarası ve diğer bölgelerden elde edilen izolatlardan farklı olduğunu göstermiştir. Bu farklılığın olası nedenleri Tazmanya daki Echinococcus enfeksiyonlarının başlangıç odağının Avustralya anakarasından farklı olması (Güney Afrika gibi), veya bulunduğu popülasyonun küçük ve genetik olarak değişime uğramış olmasıdır. Diğer bir olasılık da, Tazmanya da kesin konaklara tanısal arekolin uygulaması programının parazitte adaptif genetik farklılaşmaya yol açabilmesidir. Tazmanya koyun suşu (G2) Tazmanya, Arjantin, Romanya ve Cezayir de bulunmaktadır. (6,14,28,29). Manda suşu: Mandalar özellikle Asya da E. granulosus un önemli bir ara konağıdır. Manda suşu (G3) ile oluşan enfeksiyonlar çoğunlukla akciğer yerleşimlidir ve kistler yüksek fertilite oranına sahiptir. Manda suşunun en karakteristik özelliği gebe halkalarının iki segmentli olmasıdır (6). Pakistan, İtalya, Yunanistan ve Türkiye de bu suşun varlığı bildirilmiştir (9,30-32). At suşu: Bu suş bazı Avrupa ülkelerinde, Ortadoğu ve Güney Afrika da, Yeni Zelanda ve Amerika Birleşik Devletleri nde bulunmaktadır. At suşunun (G4) tek kesin konağının köpek olduğu görülmektedir. Ara konak dağılımı dardır ve şu anki bilgilerimize göre sadece atları ve diğer tek tırnaklıları içerir. Ara konakta daha çok karaciğer enfektedir fakat akciğerler ve diğer organlar da etkilenebilir. Bu suşun larval evresinin koyun, sığır ve insanlar için düşük enfektiviteye sahip olduğu ya da enfektif olmadığı yönünde kanıtlar mevcuttur (25-27). E.granulosus un at suşu önceden bir alttür (E. granulosus equinus) olarak tanımlanmıştır (26). Günümüzde E. equinus adında ayrı bir tür olarak önerilmektedir (15). Sığır suşu: E. granulosus un sığır suşu çeşitli Orta Avrupa ülkelerinde, Rusya, Güney Afrika, Hindistan ve Sri Lanka da bulunmaktadır. Epidemiyolojik olarak önemli kesin ve ara konağının sırasıyla köpek ve sığır olduğu bilinmektedir (26). 12

17 Sığır suşu (G5) E. granulosus un diğer suşlarından morfolojik ve biyolojik özellikler açısından farklıdır. Örneğin, sadece günlük kısa bir prepatent periyodu ile kesin konakta erken bir gelişim dönemine sahiptir. Bu dönem diğer birçok E. granulosus suşunda genellikle gündür. Sığırda metasestod kistleri daha çok akciğerlerde bulunur ve %90 dan fazlası canlı ve enfektif protoskoleks içerir. Epidemiyolojik veriler bu suşun insanlar için enfektif olduğunu göstermiştir (25-27). Sığır suşu günümüzde E. ortleppi adında ayrı bir tür olarak önerilmektedir (15). Deve suşu: Deve (Camelus dromedarius) tüm Afrika ve Ortadoğu da E. granulosus un önemli bir ara konağıdır. Morfolojik olarak deve izolatı at ve koyun kökenli izolatlardan kolayca ayırt edilebilir olup sığır suşu ile benzerlikleri ortaya konmuştur (26). İran da yapılan çalışmalarda da deve suşunun morfolojik olarak koyun suşundan farklı olduğu ortaya konmuştur (33,34). Deve suşu (G6); kesin konak olarak köpekten, ara konak olarak deve, sığır ve keçiden moleküler yöntemler kullanılarak identifiye edilmiştir (35). Deve akciğeri hidatik kistlerin yaygın olduğu yerdir, karaciğer ve diğer organlar daha az sıklıkta enfekte olur. Akciğerdeki kistlerin fertilite oranı genellikle yüksektir (>%90) ve bu oran karaciğerde çok daha düşüktür (26). Deve suşunun insanlar için enfektif olduğunu gösteren çalışmalar mevcuttur (33,34). Arjantin ve Çin de de G6 suşunun varlığı gösterilmiştir (36,37). Domuz suşu: Rusya nın bir kısmını içine alan Orta - Doğu Avrupa nın çeşitli ülkelerinde, Meksika ve Peru da görülmektedir (26,38,39). Enfeksiyonun devamlılığı için köpekler ve domuzlar arasındaki döngü önemlidir. Domuz suşunun (G7) doğal son konağı köpektir. Yapılan çalışmalarda domuz suşuna ait E. granulosus yumurtalarının domuzlar için yüksek oranda enfektif olduğu, fakat kuzu ve danalar için çok düşük enfektiviteye sahip olduğu gösterilmiştir. Domuzlarda E. granulosus metasestodları çoğunlukla karaciğerde, daha az sıklıkta akciğer veya diğer iç organlarda bulunur (26). Domuz suşunun insanlar için düşük enfektiviteye sahip olduğu düşünülmektedir (6). Polonya ve Türkiye de domuz suşu ile enfekte insan vakaları gösterilmiştir (12,40). Vahşi yaşam suşları: E. granulosus un bazı sikluslarının vahşi etoburlar ve evcil tırnaklılar; evcil köpek ve vahşi tırnaklılar; vahşi etoburlar ve vahşi tırnaklılar veya diğer memeliler gibi çeşitli son/ara konak topluluklarını içerdiği tanımlanmıştır. Bunlardan bazıları şunlardır (26): 13

18 Aslan suşu: Doğu Afrika da E. granulosus un erişkin evreleri vahşi köpekgiller (av köpeği, sırtlan, çakallar) ve bir kedigil olan aslanda, metasestodlar vahşi tırnaklıların birkaç türünde bulunmuştur. Kedigiller genellikle E. granulosus a duyarlı olmamalarına karşın bu suş bazı Afrika ülkelerinde aslanlarda ve Güney Afrika da vahşi kedilerde (F. libyca = F. silvestris) bulunur (6,26). Lagomorf suşu: Arjantin de E. granulosus un erişkin evreleri Dusicyon cinsi tilki benzeri köpekgillerde, metasestodlar Avrupa yaban tavşanları olan lagomorflarda bulunur. Döngüde bulunan parazit önceden farklı bir tür olarak tanımlanmış olup (E. patagonicus; Szidat, 1960) daha sonra konak kaynaklı morfolojik varyasyon gösteren E. granulosus olarak isimlendirilmiştir. Yaşam döngüsünün tilkiler ile lagomorflar arasında olup olmadığı veya yabani tavşanların etkeni koyun kökenli parazit taşıyan evcil köpekler ve tilkilerden alıp almadığı konusu net değildir (6,26). Geyik suşu (Kuzey suşu): E. granulosus un geyik suşu Kuzey Amerika nın kuzeyinde ve Avrasya da görülür. Bu form önceden ayrı bir alttür (E. granulosus canadensis) olarak tanımlanmıştır. Doğal siklus daha çok sığır (Alces alces), ren geyiği (Rangifer tarandus) ve kızıl geyik (Cervus elaphus) gibi Cervidae ailesinin tırnaklıları ve kurtlar arasında av-avcı ilişkisi ile sürdürülür. Bununla birlikte evcil döngüleri köpekleri ve evcilleştirilmiş ren geyiklerini içermektedir. Bu döngü Kanada, Alaska, Sibirya, Norveç ve İsviçre nin bir kısmında görülmektedir. Epidemiyolojik kanıtlar bu formun daha çok akciğer lokalizasyonu ile insanlar için enfektif olduğunu ve düşük patojeniteyi desteklemektedir (6,26,27). Echinococcus cinsine ait tür, suş ve izolatlar ile genotipleri Tablo 1 de gösterilmiştir. ECHİNOCOCCUS TA TÜR VE SUŞ BELİRLEMEDE KULLANILAN YÖNTEMLER Coğrafik dağılım, konak genişliği, konak özgüllüğü, antijenik farklılık, metabolizma, üreme biyolojisi, enfektivite, morfoloji, protein, enzim ve DNA analizlerini içeren birçok kriter Echinococcus organizmalarını karakterize etmek için kullanılmıştır. Morfoloji; Echinococcus organizmalarının identifikasyonu ve taksonomik dizaynında önemli bir rol oynamaya devam edecek olmasına karşın, intraspesifik varyasyonları taramadaki yararı tartışmaya açıktır (6,25). Direkt olarak parazit genomunu inceleyen DNA esaslı yöntemler; çevre veya konak kaynaklı faktörlerden veya yaşam döngü evrelerinden etkilenmeyen yöntemlerdir. Genetik varyasyon mitokondriyal veya nükleer genomda araştırılabilir (25). 14

19 Tablo 1. Echinococcus türleri, suşları, izolatları ve genotipleri (15,26,41-43) Türler suş/izolat (genotip) E. granulosus Koyun (G1) Bilinen ara konaklar Koyun, sığır, domuz, deve, keçi, makropod Bilinen kesin konaklar Köpek, tilki, dingo, çakal, sırtlan Coğrafik dağılım Kuzey, Orta ve Güney Amerika, Avrupa, Afrika, Asya, Avustralya Tazmanya koyun Koyun, sığır? Köpek, tilki Tazmanya, Arjantin (G2) Manda (G3) Manda, sığır? Köpek, tilki? Asya At (G4) Atlar ve diğer tek tırnaklılar Köpek Avrupa, Ortadoğu, Güney Afrika, Yeni Zelanda, ABD? Sığır (G5) Sığır Köpek Avrupa, Güney Afrika, Hindistan, Sri Lanka, Rusya, Güney Amerika? Deve (G6) Deve, koyun Köpek Ortadoğu, Afrika, Çin, Arjantin Domuz (G7) Domuz Köpek Avrupa, Rusya, Orta Amerika Geyik (G8) Geyik Kurt, köpek Kuzey Amerika, Avrasya İnsan? (G9) İnsan? Polonya Fennoscandinavian geyik Aslan (?) Geyik? Avrasya Zebra, Afrika antilobu, Afrika domuzu, çalı domuzu, manda, çeşitli antiloplar, hipopotam?,zürafa? Aslan Afrika Lagomorf (?) Yabani tavşanlar Gri tilki Güney Amerika E.multilocularis Avrupa izolatı Avrupa, Çin? Rodentler, evcil ve yabani domuz, köpek, maymun Tilki, köpek, kedi, kurt, rakun Alaska izolatı Rodentler Tilki, köpek, Alaska kedi Kuzey Amerika Rodentler Tilki, köpek, Kuzey Amerika izolatı kedi, koyoti Hokkaido izolatı Rodentler, domuz, Tilki, köpek, Japonya maymun, at kedi, rakun E.vogeli Rodentler Çalı köpeği Orta ve Güney Amerika E. oligarthrus Rodentler Vahşi kediler Orta ve Güney Amerika G: Genotip; (?): Veriler kesin değil, ileri araştırmalar gerekli. 15

20 Evrimleşme hızı daha fazla olduğu için mitokondriyal DNA (mtdna) yakın ilişkili organizmaların ayrımı için kullanışlıdır. mtdna nın rekombinasyon yapmaması analizleri basitleştirir. Ribozomal DNA (rdna) tekrar ünitesi, çeşitli hızlarda gelişen farklı bölgelere sahiptir. Bu bölge, taksonomik düzeylerde varyasyon ve filogeni çalışmalarında kapsamlı olarak kullanılmıştır (25). Polimeraz Zincir Reaksiyonu Polimeraz zincir reaksiyonu, polymerase chain reaction (PCR) iki oligonükleotid primer arasında bulunan bir DNA fragmentinin enzimatik olarak çoğaltılmasıdır. Primerlerden biri hedef dizinin bir tarafındaki DNA molekülünün bir zincirine komplementer, diğer primer de hedef dizinin zıt tarafındaki DNA molekülünün diğer zincirine komplementerdir. Primerler, aralarında kalan diziyi DNA polimeraz ile sentez ederler (44). PCR temelli teknikler özellikle ekinokokkozisin tanısında kullanılan duyarlı yöntemlerdir (19). Dinkel ve ark. PCR yöntemini kullanarak E. granulosus un G1, G5 ve G6/G7 suş ayırımını gerçekleştirmiştir (45). Restriksiyon Fragman Uzunluğu Polimorfizmi Restriksiyon endonükleazlar DNA daki özel çift iplikli dizileri tanıyan ve DNA yı tanıma bölgesinden veya ona yakın yerden kesen enzimlerdir (44). Genomik DNA da dizi değişiklikleri belirli kesim bölgeleri yaratır veya onları yok eder. Bu nedenden dolayı boyutları değişen bir veya birden fazla DNA fragmenti Southern blot ve klonlanmış DNA probu ile hibridizasyondan sonra görünür hale gelir. Southern blot ile belirlenen enzim kesim yerlerindeki DNA değişimleri, restriction fragment length polymorphism (RFLP) olarak adlandırılır (46). McManus ve Rishi (47) tarafından restriksiyon endonükleaz sindirimi ve Southern blot teknikleri kullanılarak yapılan farklı suşları içeren bir çalışmada RFLP paternlerinin belirli suşlar içinde stabil olduğu gösterilmiştir. Bu nedenle RFLP yaklaşımı, E. granulosus un yeni izolatlarının identifikasyonu ve karakterizasyonu için etkin bir yöntem sunmaktadır (48). Polimeraz Zincir Reaksiyonu - Restriksiyon Fragman Uzunluğu Polimorfizmi Polimeraz zincir reaksiyonu - restriksiyon fragman uzunluğu polimorfizmi, polymerase chain reaction - restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) yönteminde genomik DNA nın belirli bir bölgesi PCR ile çoğaltılır. PCR ürünleri bir veya daha çok restriksiyon endonükleaz ile sindirilir ve fragmentler genellikle agaroz jel 16

21 elektroforezi ile ayrılır. Sindirim profilleri etidyum bromid boyalı jelde ultraviyole (UV) ışık ile saptanır ve fotoğraflanarak kaydedilir (49). Bowles ve McManus (50) Echinococcus un tür ve suşlarının hızlı ayırımı için bir yaklaşım geliştirmişlerdir: Çeşitli izolatlardan rdna nın birinci internal transcribed spacer (ITS1) bölgesini çoğaltmışlar ve ürünleri bazı dört baz kesen restriksiyon enzimleriyle sindirmişlerdir. Farklı tür ve suş grupları içinden çok sayıda örnek incelenerek karakteristik paternler elde edilmiştir. Bu yöntem Echinococcus izolatlarının ayırımı ve diğer parazit çalışmaları için basit, yüksek duyarlılıkta ve hızlı bir yaklaşım sağlamıştır (49). Rastgele Çoğaltılmış Polimorfik Deoksiribonükleik Asit Polimeraz Zincir Reaksiyonu Rastgele çoğaltılmış polimorfik DNA polimeraz zincir reaksiyonu, random amplification of polymorphic DNA polymerase chain reaction (RAPD-PCR); nükleotid dizilimi rastgele seçilmiş tek bir primer kullanılarak DNA nın çoğaltılması temeline dayanan bir polimorfizm inceleme yöntemidir. Arbitrary priming - polymerase chain reaction (AP- PCR) olarak da adlandırılan bu teknik; organizmalar arasındaki genetik ilişkilerin analizinde ve tanımlama amacıyla çeşitli parazit gruplarında kullanılmaktadır. RAPD-PCR Echinococcus türlerini ve genetik olarak farklı E. granulosus suşlarını tanımlamada hızlı ve güvenilir bir yöntemdir (51,52). Ancak RAPD-PCR, kullanılan DNA kalıbının kalitesi ve miktarından ve/veya döngü hızından etkilenebilir. Bu nedenle E. granulosus karakterizasyonu için birkaç DNA tekniğinin kullanılması önerilmektedir. Slovakya da yapılan bir çalışmada RAPD analizi ile domuz izolatları arasında iki farklı patern belirlenmiştir (53). İspanya da insan, koyun, sığır, keçi, domuz, yaban domuzu ve atlardan elde edilen izolatlar ile yapılan bir çalışmada bu yöntem ile G1, G4 ve G7 suşları tespit edilmiştir (54). Polimeraz Zincir Reaksiyonu - Tek Sarmal Konformasyon Polimorfizmi Polimeraz zincir reaksiyonu - tek sarmal konformasyon polimorfizmi, polymerase chain reaction - single stranded conformation polymorphism (PCR-SSCP); PCR ile çoğaltılmış çift iplikli DNA nın ısıtma ile tek zincir haline dönüştürülüp, bu tek zincir DNA molekülünün nötral poliakrilamid jeldeki hareketinin incelenmesi temeline dayanır (55,56). Tek zincir moleküller her bir zincir içinde nükleotidler arasında baz çiftleşmesinin sonucu olarak ikincil ve üçüncül yapılar oluşturur. Bu yapılar zincirin uzunluğuna ve baz çiftleşme bölgesinin yer ve sayısına bağlıdır. Onlar da yüksek oranda molekülün birincil dizisine bağlıdır. Yani birincil dizideki belirli nükleotid pozisyonundaki mutasyon molekülün yapısını 17

22 değiştirebilir. DNA fragmanı tek baz değişimi içeriyorsa (örneğin A-T yerine G-C baz çifti) denatürasyonda dört farklı zincir oluşur. Bu zincirlerin üç boyutlu yapıları farklı olduğundan poliakrilamid jelde farklı hızlarda göç ederler. Böylece, çoğaltılan DNA bölgesindeki tek baz değişiminin varlığı nedeniyle farklı örnekler farklı bant paternleri sergilerler. SSCP nin mutasyon saptama oranı fragment boyutu, dizinin baz kompozisyonu, elektroforez sıcaklığı ve jel kompozisyonu gibi parametrelere bağlı olarak çok değişir. Fragment boyutunun mutasyon saptama oranını belirleyen en önemli faktör olduğu görülmektedir. Genellikle, bp uzunluğundaki PCR fragmentleri için %50-95 oranında mutasyonlar belirlenir, fakat üç veya daha fazla elektroforetik şartlar kullanıldığında bu oran %100 e çıkabilir. 200 bp den büyük fragmentler için bu oran fragment boyutunun artması ile azalır (56,57). Gasser ve ark. (58) mitokondriyal sitokrom c oksidaz subunit 1 (CO1) ve NADH dehidrogenaz subunit 1 (ND1) bölgelerini çoğaltarak gerçekleştirdikleri bir çalışmada PCR-SSCP nin Echinococcus un mitokondriyal dizilerindeki varyasyonu göstermek için güvenilir bir yöntem olduğunu göstermişlerdir. Dideoksi Fingerprinting Dideoksi fingerprinting (ddf), PCR ile çoğaltılmış segmentlerde tek baz ve diğer dizi değişikliklerinin varlığını tespit edebilen, dideoksi dizileme ve SSCP yöntemlerinin bir karışımıdır. ddf, bir dideoksinükleotidli Sanger dizileme reaksiyonunun ardından denatüre edici olmayan jel elektroforezini içerir (59). Gasser ve ark. (60) Echinococcus cinsinde mitokondriyal CO1 gen dizisini kullanarak genetik olarak tiplendirmede ddf yöntemini uygulamışlardır. Echinococcus un yedi genotipinin ayırt edilebileceği, G1 genotipini yansıtan sekiz izolatın bazılarında kolay fark edilmeyen varyasyon profillerinin gözlendiği, genotip G4 ve genotip M2 olan iki örnek arasında varyasyon gözlenmediği belirtilmiştir. Deoksiribonükleik Asit Dizi Analizi Deoksiribonükleik asit dizi analizi herhangi bir DNA fragmanının nükleotid baz diziliminin ortaya konulmasıdır. DNA dizi analizi için en yaygın olarak kullanılan yaklaşım Sanger dizi analizidir. Sanger dizi analizinde başlangıçtaki orijinal kalıp için komplementer zinciri sentezleyen DNA polimerazı inhibe etmek amacıyla nükleotidlerin kimyasal analogları kullanılır. Kısa bir oligonükleotid ile DNA sentezi başlatılır ve DNA polimeraz kalıp iplik boyunca hareket eder veya radyoaktif işaretli nükleotidleri veya floresan işaretli nükleotidleri yeni sentezlenen zincir içerisine ekler. Dört sekans reaksiyonunun her birine dört normal 18

23 nükleotidin her biri ve yalnızca bir inhibitör analoğunun eklenmesi ile bir sekans bilgisi sağlanır. Günümüzde, DNA dizi analizine ait işlemleri otomatik olarak gerçekleştiren cihazlar geliştirilmiştir ve hem normal hem mutant genlerin analizi için rutin olarak kullanılmaktadır (44). Echinococcus granulosus un genotip tayininde DNA dizi analizini kullanan Vural ve ark. (9) Türkiye de çeşitli illerden İstanbul a kesim amacıyla getirilen hayvanlardan elde ettikleri izolatların G1 veya G3 suşu olduklarını bulmuşlardır. Dizi analizi ve PCR-RFLP nin birlikte kullanıldığı bir çalışmada ise, Türkiye de doğu ve güney doğu illerinden toplanan 17 izolata dizi analizi uygulanmış, tamamı G1 suşu olarak belirlenmiştir (10). Yine, Snabel ve ark. nın (12) yaptığı ve Ege Bölgesi nden toplanan izolatları kapsayan bir çalışmada Türkiye de ilk kez domuz suşu (G7) tespit edilmiştir. Echinococcus granulosus Suşlarının Epidemiyolojik Önemi Echinococcus granulosus suş/türlerinin patojenitelerindeki farklılıkları KE li hastalarda prognozu etkiler. Epidemiyolojik kanıtlar Kuzey Amerika nın kuzeyindeki E. granulosus un vahşi suşunun daha çok akciğer yerleşimli olduğunu, insanlar için düşük patojeniteye sahip olduğunu göstermektedir. Yine, Çin deki epidemiyolojik incelemeler belirli bölgelerdeki E. granulosus suşlarının daha düşük patojeniteye sahip olabileceğini göstermektedir (14). İnsanlarda en yüksek KE prevalansının koyun yetiştiriciliği yapılan toplumlarda bulunması nedeniyle köpek-koyun döngüsü ve E. granulosus un koyun suşu halk sağlığı açısından oldukça önemlidir. Atlara uyum sağlamış formlar gibi, bazı E. granulosus suşlarının insanlar için enfektivitesinin olmayacağı veya düşük olabileceğini gösteren epidemiyolojik veriler artmaktadır. Domuzlardan elde edilen E. granulosus un insanlar için düşük enfektivitede olduğu varsayılmaktadır. Her ne kadar develer Ortadoğu ve Afrika da yaygın olarak enfekte olsa da, insanlar için deve kökenli E. granulosus un enfektivitesi konusunda görüşler farklıdır. Arjantin den toplanan izolatların moleküler genetik çalışmaları sonucu insanları enfekte edebilen deve suşu genotipi ilk kez gösterilmiştir (3,36). ECHİNOCOCCUS GRANULOSUS UN EPİDEMİYOLOJİSİ Dünyada Echinococcus granulosus Echinococcus granulosus dünya çapında coğrafik dağılıma sahiptir ve kutupların çevresi, ılıman, subtropikal ve tropikal bölgeleri kapsayan tüm kıtalarda görülür. Avrasya 19

24 (Akdeniz ülkeleri, Rusya Federasyonu ve komşu ülkeler, Çin), Afrika (kuzey ve doğu bölgeleri), Avustralya ve Güney Amerika nın bir bölümünde parazit yüksek prevalansa sahiptir. Parazit; endemik alanlarda sporadik vakalardan yüksek prevalansa kadar değişik oranlarda görülmektedir. İzlanda, Grönland gibi sadece birkaç bölgenin E. granulosus bulundurmadığı kabul edilmektedir (3). Echinococcus granulosus un geçişi yaygın olarak kesin konak olan evcil köpekler ve ara konak olarak çiftlik hayvanları ile evcil bir döngüde gerçekleşir. Bu döngüdeki ara konak spektrumu E. granulosus un suşuna, çeşitli ara konak türlerinin bulunabilirliğindeki bölgesel veya lokal farklılıklara bağlıdır. Evcil döngüye sahip E. granulosus formu dünyanın birçok kırsal bölgesinde önemli halk sağlığı veya ekonomik problemler ile ilişkilidir. E. granulosus un vahşi siklusu Avrasya ve Kuzey Amerika nın kuzeyinde görülür. Bu döngü evcil hayvanlar ve insanlar için enfeksiyon kaynağı olarak rol oynayabilir (3,20,22). İnsanlar ve hayvanlar arasında en yüksek prevalans çiftlik hayvanları (büyük oranda koyun) yetiştiriciliğinin olduğu yerlerde bulunmaktadır. Coğrafik olarak insanlardaki KE prevalansı çiftliklerdeki prevalansa büyük oranda benzemektedir. İnsanlara enfeksiyonun geçişindeki ek faktörler (hijyen koşulları, parazitin genotipi), sporadik bölgeler içinde endemik odakların görülmesine ve bu şekilde karışık bir mozaik görünümüne neden olmaktadır (61). Kazakistan, Özbekistan, Kırgızistan, Tacikistan ve Türkmenistan ın bulunduğu Orta Asya da KE endemiktir ve birçok bölgede cerrahi KE insidansı 10/ vakanın üzerindedir (62). Çin de 1950 lerden bu yana yaklaşık insan vakası cerrahi olarak tedavi edilmiştir. Çin in farklı bölgelerinde yapılan çeşitli çalışmalarda insanlarda KE prevalansı % ; çiftlik hayvanlarında (koyun, keçi, yak, sığır, domuz, deve) % ; köpeklerdeki E. granulosus prevalansı ise % olarak bulunmuştur (63). Avrupa da zoonotik E. granulosus suşları İrlanda, İzlanda ve Danimarka hariç her ülkede bulunmaktadır. Akdeniz ülkelerinde (İspanya, İtalya, Sardunya gibi) ve Bulgaristan gibi Doğu Avrupa kısımlarında çok yoğun şekilde endemiktir (19,61). Bulgaristan da ekonomik durumun kötüye gitmesi ve kontrol programlarının durmasına bağlı olarak insanlarda ve hayvanlarda ekinokokkozis son yıllarda tekrar ortaya çıkmıştır yılları arasında köpek ve koyunlardaki enfeksiyon oranı %4-7 iken, yılları arasında bu oran %19-32 ye yükselmiştir (3). Yunanistan da KE prevalansı sığırlarda %82, koyunlarda %80, keçilerde %24 ve domuzlarda %5; 1984 yılında cerrahi insan vakası de 12.9 iken 1984 te KE kontrol programının başlaması ile 1998 yılında bu değerler koyunlarda %31.3 e, keçilerde %10.3 e, domuzlarda %0.6 ya ve sığırlarda %0 a gerilemiştir (63). 20

25 Kıbrıs ta E. granulosus 1970 lerden önce çok yaygındı ve insanda yıllık cerrahi insidans 12.9/ idi de E. granulosus ile enfekte köpeklerin oranı %6.8, iki yaşından büyük koyunlarda %54, keçilerde %12, sığırlarda %30 ve domuzlarda %10 idi de ekinokokkozise karşı kampanya başlatıldı. Kampanya Güney Kıbrıs ta 1985 yılında parazitin eradike edildiği düşüncesiyle sonlandırıldı. Ancak aralıklı olarak kesimhanelerde kistlerin görülmesi 1993 yılında kontrol programının yeniden başlamasına yol açmıştır yılları arasında E. granulosus prevalansının %0.17 olduğu gösterilmiştir yılları arasında 20 yaşın altındaki kişilerde KE e rastlanılmamıştır. Kuzey Kıbrıs ta yılları arasında yıllık insidans 5.7/ olarak belirlenmiştir (3,64). Avustralya da KE önemli bir halk sağlığı sorunudur. Avustralya anakarasında yaban hayvanları E. granulosus un evcil köpekler, çiftlik hayvanları ve insanlara geçişinde önemli rol oynamaktadır (65). Avustralya da parazitin endemik olduğu alanlarda vahşi köpeklerde prevalansın %48-90 olduğu gösterilmiştir, insan KE olgusu yılda ortalama 42.5 tir. Tazmanya adasında 1960 larda E. granulosus prevalansı köpeklerde %12, üç yaş üstü koyunlarda %52 ve sığırlarda %17 iken kontrol programlarının uygulanmasının ardından koyunların % ünde, sığırların %0.007 sinde kiste rastlanmıştır (3). Amerika da E. granulosus Kuzey Amerika da Kuzey Kanada ve Alaska dan Güney Amerika da Tierra del Fuego ya kadar olan alanda büyük oranda görülmektedir. Güney Amerika yüksek insidans ve prevalans değerlerine sahiptir. Örneğin Uruguay da 1995 yılında insidans 9.2/ olarak tespit edilmiştir. Amerika Birleşik Devletleri (ABD) nde enfeksiyonların çoğu ekinokokkozisin yüksek oranda endemik olduğu ülkelerden göç eden kişilerde görülmektedir. Sporadik yerli vakalar Alaska, Kaliforniya, Utah, Arizona ve New Mexico da gösterilmiştir (2,66). Afrika da en yüksek prevalans Kuzey ve Doğu Afrika nın koyun yetiştiriciliği yapılan alanlarından rapor edilmiştir. Doğu Afrika da prevalans %3 ün üzerindedir. Koyun yetiştiriciliği yapanlarda bu oran %7.5 tur. Tunus ve Libya nın koyun yetiştirilen bölgelerinde insan KE prevalansı %2 olarak belirlenmiştir. Kenya nın Turkana bölgesinde 1983 yılında kontrol önlemleri alınmadan önce insanlarda KE prevalansı yaklaşık %7.5 iken 1992 yılında bu oran %3.1 e gerilemiştir (2,3,61,65). Türkiye de Echinococcus granulosus Türkiye de KE veteriner kontrolünde olmayan sokak köpeklerinin yaygınlığı ve gerekli önlemlerin alınmamasından dolayı oldukça sık rastlanmaktadır (67). Sağlık Bakanlığı verilerine göre 1987 ve 1994 arasında, hastanelerde KE vakası bulunmuştur, yıllık 21

26 ortalama ise 2663 olarak tespit edilmiştir. Yaklaşık 61 milyon nüfusta, ortalama yıllık insidans de 4.4 tür (3). Yazar ve ark. nın (5) yaptığı bir çalışmada ise Türkiye de yılları arasında toplam kistik ekinokokkozis olgusu bildirildiği belirtilmiştir. Ancak ülkemizde ekinokokkozis ile ilgili verilerin düzenli ve doğru bir şekilde toplanmaması nedeniyle Sağlık Bakanlığı verilerinin gerçeği tam olarak yansıtmadığı düşünülmektedir (67). Trakya bölgesinde 1991 yılında Edirne, Kırklareli ve Tekirdağ illerini kapsayan bir çalışmada; insanlarda Casoni yöntemi ile %16.8, indirekt hemaglütinasyon (IHA) ve Casoni yöntemi ile %9.2, IHA deneyi ile %12 oranında pozitiflik saptanmıştır (68) yılları arasında İstanbul, İzmit, Bursa, Edirne, Tekirdağ ve Kırklareli illerinde değişik hastanelerde KE tanısı ile opere edilen hasta sayısının 3628 olduğu belirtilmiştir (69). Akdeniz bölgesinde bulunan Adana, Antalya, Burdur, Hatay, Isparta, İçel, Kahramanmaraş ve Osmaniye illeri İl Sağlık Müdürlüklerinin yılları arasındaki beş yıllık verilerine göre 1289 erkek, 1284 kadın toplam 2573 olguya KE tanısı konmuştur (70). Adana ve Hatay daki çeşitli hastanelerin patoloji laboratuvarlarından elde edilen verilere göre yılları arasında 962 ekinokokkozis olgusu saptanmıştır (71). Ege bölgesinde yer alan İzmir, Denizli, Afyon, Manisa, Aydın, Kütahya, Uşak illerinde hastane ve İl Sağlık Müdürlüğü kayıtlarına göre yılları arasında KE tanısı almış olguların sayısı 2101 dir (72). Ozkol ve ark. (73) ilköğretim okulu öğrencilerini kapsayan bir çalışmada seropozitiflik oranını enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) yöntemiyle %8.9, IHA yöntemiyle %10.1 olarak tespit etmişlerdir. Altintas ve ark nın (74) yaptıkları bir çalışmada İzmir ve çevresinde insanlardan toplanan toplam 2055 kan örneğinde %3.45 oranında seropozitivite tespit edilmiştir. İç Anadolu bölgesinde bulunan 13 ilde yılları arasında 2348 i erkek, 2998 i kadın olmak üzere toplam 5346 olgu KE tanısı almıştır (75) tarihleri arasında Konya Sosyal Sigortalar Kurumu Hastanesi nde servislere yatırılan hastaların 213 ü (%0.81) KE teşhisi ile opere edilmiştir (76). Kayseri de çeşitli hastane kayıtları ve İl Sağlık Müdürlüğü kayıtları incelendiğinde; yılları arasında 699 KE olgusu saptanmıştır (77). Karadeniz bölgesinde Sağlık Bakanlığı verilerine göre 2001 yılından 2006 nın ilk yarısına kadar olan olgular toplam 3433 adettir (78). Doğu Anadolu Bölgesinde 10 ili kapsayan bir çalışmada (79) yılları arasında kayıt edilen opere olan hasta sayısının 824 olduğu tespit edilmiştir. Kars ili merkezi ve köylerinde yaşayanlarda KE seroprevalansı IHA ve IFA (immün floresan antikor) teknikleri ile araştırılmış ve bu oran %34.6 olarak bulunmuştur (80) yılları arasında Atatürk Üniversitesi Tıp Fakültesi nde histopatolojik olarak 111 KE tanısı konmuştur 22

27 (81). Kaplan ve ark. (82) yılları arasında Fırat Üniversitesi Hastanesi nde 84 KE hastasına tedavi uygulandığını ve KE sıklığının 2-4/ değiştiğini saptamışlardır. Güneydoğu Anadolu Bölgesinde 8 ili kapsayan bir çalışmada (83) yılları arasında 837 olguya KE tanısı konduğu saptanmış, 422 (%50.4) olgu sayısı ili Şanlıurfa ilinin ilk sırada yer aldığı belirtilmiştir yılları arasında Dicle Üniversitesi Tıp Fakültesi nde ve Diyarbakır Eğitim ve Araştırma Hastanesi nde histopatolojik olarak 234 olguya KE tanısının konduğu, ancak ameliyathane kayıtları incelendiğinde KE ön tanısı ile opere edilen olgu sayısının laboratuvar kayıtlarından oldukça yüksek olduğu izlenmiştir (84). Türkiye de hayvanlarda rapor edilen KE prevalansı bölgelere göre farklılık göstermekle birlikte % arasında değişir. En yüksek prevalans koyunlarda gözlenir, bunu keçi, sığır ve manda takip eder (85). Yıldız ve Tunçer in (86) Kırıkkale yöresindeki sığırları kapsayan bir çalışmasında sığırlardaki kist hidatik oranı %14.16 olarak bulunmuştur. Simsek ve ark. (87) Erzurum yöresindeki sığırlarda kist hidatik oranını %33.9 olarak tespit etmişlerdir. Hakkari yöresindeki keçileri kapsayan bir çalışmada KE seroprevalansı IHA yöntemi ile %12.5 olarak saptanmıştır (88). Trakya bölgesindeki kist hidatik oranı sığırlarda %11.6, koyunlarda %3.50 dir (89). Türkiye de köpeklerdeki E. granulosus enfeksiyonu prevalansı sınırlı lokal çalışmalara göre % arasında değişmektedir (85). Hatay ilinde köpeklerde koproantijen ELISA yöntemiyle tespit edilen E. granulosus enfeksiyon oranı %8.86 dır (90). KİSTİK EKİNOKOKKOZİS Kistik ekinokokkozis sıvı dolu, küresel ve uniloküler kistlerle karakterize olan E. granulosus un larval formunun neden olduğu zoonotik bir enfeksiyondur (18,91). Endemik bölgelerdeki birçok ülkede ulusal KE insidansı 5-20/ dir. Ancak kentsel popülasyonların çoğu düşük risk altında olduğundan bu oran kırsal endemik alanlarda çok daha fazladır. KE için tanımlanan risk faktörleri arasında; insanlara yakın olarak yaşayan kontrolsüz köpekler, çiftlik hayvanlarının kontrolsüz kesimi, hijyenik olmayan şartlarda yaşama yer almaktadır. En yüksek hastalık prevalansı koyun yetiştiriciliği olan toplumlarda bulunmaktadır (42). Kistik ekinokokkozis çok önemli sosyal ve ekonomik etkilere sahip bir hastalıktır. İnsanlar için tıbbi tedavi maliyeti oldukça yüksektir, her bir vaka için bu rakam birkaç bin doları bulmaktadır. Aynı zamanda, güncel veriler tedavi gören hastalarda yaşam kalitesinin önemli derecede azaldığını desteklemektedir (92). 23

28 Kistik ekinokokkozis ile ilişkili mortalite oranı diğer bazı enfeksiyöz hastalıkla karşılaştırıldığında düşük görülebilmesine karşın her bir vaka ile ilişkili morbidite oranı dikkate değerdir. KE in %1-2 oranında fatal olduğu rapor edilmiştir (42,92). Klinik Kistik ekinokokkozisin klinik belirtileri değişkendir ve kistin konumu, boyutu ve durumu ile tanımlanır. Enfeksiyon ile klinik belirtiler arasındaki zaman aralığı da değişkendir ve genellikle birkaç yılı bulur. Tanısı konan hastalar genellikle yaş arasındadır (91). Vahşi döngü kaynaklı enfeksiyonlarda kistlerin üçte ikisi akciğerlerde kalan kısım karaciğerde bulunur. Hastalığın evcil döngü kaynaklı formunda kistlerin %60 ı karaciğerde, %25 i akciğerde bulunur. Tüm hastaların beşte birinde birden fazla bölgede tutulum vardır. Çoğu hasta asemptomatiktir, bazen hemoptizi, abdomende sağ alt kadran ağrısı, ağrılı hepatik kitle bulunabilir. Kistlerin rüptüre olma oranı %20 olup ateş, pruritus, ürtiker ve bazen anafilaktik şok ve ölüm gözlenir (93,94). Skolekslerin salınması enfeksiyonun yayılmasına yol açar. Pulmoner kistlerin rüptürü öksürük, göğüs ağrısı ve hemoptiziye de neden olabilir. Karaciğer kistleri diyaframı geçebilir veya safra kanalı veya peritoneal kaviteye rüptüre olabilir (93). Kistlerin biliyer ağaç veya bronkus içine rüptüre olması obstrüksiyon veya postobstrüktif bakteriyel enfeksiyona neden olabilir. Bakteri kiste girebilir ve kistte piyojenik abse oluşmasına neden olabilir (95). Kardiyak lezyonlar; ileti bozuklukları, ventriküler rüptür ve embolik metastazlar ile birlikte olabilir. Dolaşımdaki antijen-antikor kompleksleri böbrekte birikebilir ve membranöz glomerülonefriti başlatabilir (93). Serebral kistlerin ilk semptomları artmış kafa içi basıncı veya fokal epilepsi olabilir. Renal kistler bel ağrısı veya hematüri ile kendini gösterebilir. Kemikteki kistler patolojik kırıklar meydana gelinceye kadar genellikle asemptomatiktir (91). Türkiye de hidatik kistin en sık tuttuğu organ karaciğer (% ) olup akciğer (% ) ikinci sırada yer almaktadır (81,82,96). İntraabdominal yerleşimli kistleri olan hastalarda öne çıkan semptomlar karın ağrısı, ateş ve dispeptik şikayetlerdir (96-98). Türkiye de pulmoner hidatik kistleri olan hastalardaki başlıca semptomlar öksürük, balgam çıkartma, göğüs ağrısı, hemoptizi, solunum zorluğu, kistik sıvı ve membranların ekspektorasyonu olup hastaların bir bölümünde ise herhangi bir yakınma bulunmamaktadır (96,99-101). Türkiye de yapılan adli otopsilerde hidatik kiste rastlanma sıklığı 56/1687 (%3.1) dir (102). 24

29 Tanı Kistik ekinokokkozis tanısı; klinik bulgular, görüntüleme teknikleri ve serolojik yöntemlere dayanır (103). E. granulosus un endemik olduğu bölgelerde koyun köpekleri ile temas öyküsü olan kişide kist benzeri kitle varlığı KE tanısını destekler (91). Görüntüleme yöntemleri: Tüm görüntüleme yöntemleri hidatik kistlerin bazı evrelerini gösterebilir. Fakat genellikle kesitsel görüntüleme yöntemleri (ultrasonografi, bilgisayarlı tomografi, manyetik rezonans görüntüleme) en iyi görüntüleri sağlar. Tek başlarına veya laboratuvar testleriyle birlikte kullanımıyla olguların çoğunda %100 tanı konulabilir. Beyin ve omurgadaki lezyonlar hariç, konvansiyel radyografi ve ultrasonografi (US) tanı ve hastaya yaklaşım için genellikle yeterlidir (104). Radyografi, akciğerlerdeki hidatik kistlerin saptanmasına izin verir; diğer bölgelerde kistin saptanabilmesi için kalsifikasyon gereklidir (91). Grafide akciğer lezyonları hafif düzensiz, kalsifikasyonsuz uniform dansiteli yuvarlak kitle olarak kendini gösterir. Karaciğer lezyonlarının yarısı düz, kalsifik bir kenar sergiler (93). US incelemesi, abdominal bölgede KE tanısında temeldir. US aynı zamanda periferal yerleşimli akciğer kistlerini ve diğer organlardaki kistleri de gösterebilir. Bilgisayarlı tomografi (BT), manyetik rezonans görüntüleme (MRI) ve kolanjiopankreatografi (MRCP) subdiafragmatik yerleşim, yaygın hastalık, ekstraabdominal yerleşim, komplike kistler (abse, kistobiliar fistül) ve cerrahi öncesi değerlendirmede yarar sağlamaktadır. Mümkün olduğunca MRI, sıvı alanların daha iyi görüntülenebilmesi amacıyla BT ye tercih edilmelidir (103). E. granulosus un mikroskobik incelemesi ve canlılık tayini: Vital boyama ile kist sıvısından aspire edilen protoskolekslerin mikroskobik incelemesi parazitin yapısı ve canlılığı hakkında bilgi verir. MR spektroskopi, cerrahi veya perkutanöz olarak alınan kist sıvısında canlılığı değerlendirmek için geliştirilmiştir (103). Serolojik yöntemler: Antikor testleri, KE li bazı hastaların saptanabilir immün yanıtı gösterememesine karşın olası radyolojik tanıyı doğrulamada ve cerrahi veya farmakolojik tedavi sonrası hastaların takibinde kullanılır (20,39). Karaciğer kistleri akciğer kistlerinden yüksek olasılıkla daha fazla bir immün yanıta neden olur. Yerleşimi dikkate almadan, serolojik testlerin duyarlılığı kist içinde ekinokokkal antijenlerin toplanma derecesi ile ters orantılıdır. Örneğin, sağlam, bütünlüğü bozulmamış kistler minimal saptanabilir yanıta neden olurken, rüptüre olmuş veya sızan kistler güçlü immün yanıt ile ilişkilidir (39). 25

30 Enzyme-linked immunosorbent assay, IHA testi, lateks aglütinasyon ve immünblot test en yaygın kullanılan serolojik yöntemlerdir. İmmünfloresans test ve arc-5 immünelektroforez de kullanılan diğer yöntemlerdir (20). Serolojik yöntemler, karaciğer kistleri için % duyarlı ve %88-96 özgül olup akciğer kistleri için duyarlılık %50-56, diğer organ tutulumları için %25-56 ve multiple organ kistleri için % dür (95,103). Diğer sestod enfeksiyonları (E. multilocularis ve Taenia solium), bazı helmint hastalıkları, malignensiler, karaciğer sirozu ve anti-p1 antikorlarına bağlı çapraz reaksiyonlar testlerin özgüllüğünü sınırlandırmaktadır (103). Dolaşımdaki antijenlerin saptanması hastaların cerrahi sonrası takibi, kistlerin aktivite ve büyüme dinamiklerini izlemede de kullanılabilecek bir yöntemdir (20). Riskli toplumlarda kitle taramasında en uygun yöntemler olarak US ve serolojik yöntemler kullanılır (73,103). Moleküler yöntemler: Polimeraz zincir reaksiyonu testi şüpheli KE li hastalardan alınan ince iğne biyopsi materyalinde Echinococcus genomik DNA sının miktarını pikogram düzeyinde saptayabilir (93). Tedavi 1980 lere kadar cerrahi ekinokokkal kistlerin tedavisi için tek seçenekti; ancak benzimidazol bileşikleri ile kemoterapi ve daha yeni bir yöntem olan puncture-aspirationinjection-reaspiration (PAIR) ile tedavi de buna eklenmiştir (39). Cerrahi: Cerrahinin amacı kist içeriklerinin etrafa dağılmasını önleyerek kistin tamamen alınmasıdır (39,91). Cerrahi; büyük karaciğer kistleri (>10 cm çapında), enfekte kistler ve belirli organlarda bulunan (beyin, akciğer, böbrek) veya önemli derecede kitle etkisi yapan kistler için başlıca tedavi yöntemidir (20,39). Cerrahi gebelerde, bilinen riskli tıbbi durumu olanlarda ve multipl kistleri olan hastalarda kontrendikedir (39). Cerrahi yöntemler şunlardır: Perikistektomi, parsiyel hepatektomi veya lobektomi, açık kistektomi (omentoplastili veya omentoplastisiz), palyatif olarak enfekte kistin tüp drenajı. Kist ekstrüzyonu (Barrett tekniği) da pulmoner hastalık için cerrahi bir seçenektir (20). Cerrahi operasyon sırasında; kiste müdahale öncesinde protoskolekslerin inaktivasyonu amacıyla hidatik kistlerin içine hipertonik tuzlu su (%3,15-30), setrimid solüsyonu (%0.5), gümüş nitrat (%0.5), povidon iyot veya etanolün (%70-95) enjekte edilmesi önerilen bir yaklaşımdır (20,91,95, ). Enjeksiyondan otuz dakika sonra kist bütün olarak alınır. Sekonder 26

31 bakteriyel enfeksiyon riskini azaltmak için kist yatağına birkaç adet dren bırakılır. Operasyon sırasında kız kistlerin yayılma riskini azaltmak amacıyla bir antihelmintik ajan ile hasta preoperatif olarak tedavi edilmelidir (95). Kistik ekinokokkozis cerrahisinin en önemli problemlerinden birisi de rekürrens sorunudur, farklı yayınlarda %2-25 olarak rapor edilmiştir. Rekürrens genellikle kistin yetersiz alınması veya önceden saptanamayan kistlere bağlıdır (20). Operatif mortalite %0.5-4 arasında değişmektedir ancak bu oran tekrarlayan müdahaleler ve operasyonun yetersiz olanaklar altında yapılması ile artmaktadır (66). Ponksiyon, aspirasyon, enjeksiyon, reaspirasyon: Ponksiyon, aspirasyon, enjeksiyon, reaspirasyon yöntemi; opere edilemeyen, cerrahiyi reddeden hastalarda, hamile olan, cerrahi sonrası relaps gelişen, multiple kistleri olan veya tek başına benzimidazole yanıtsız olgularda perkütan olarak uygulanan bir tekniktir (103,109,110). Ponksiyon, aspirasyon, enjeksiyon, reaspirasyon yöntemi şu aşamaları içermektedir (111,112): 1. Ultrasonografi eşliğinde kistin perkütan delinmesi 2. Kist içindeki sıvının aspire edilmesi 3. Protoskolisidal madde (%95 etanol, %0.5 setrimid, %15 hipertonik tuzlu su gibi) enjekte edilmesi dakika bekleme sonrasında kist içeriğinin tekrar aspire edilmesi Kalp, beyin, spinal bölge yerleşimli kistlerde ve karaciğerde riskli bir alanda bulunan kistlerde, inaktif veya kalsifiye lezyon varlığında, safra yolları ile birleşmiş kistlerde ve abdominal kavite, bronşlar ve idrar yollarına açılan kistlerde PAIR kontrendikedir (109). Böbrek yerleşimli hidatik kistlerin perkütanöz tedavisinin, açık cerrahinin morbiditesini önlediği ve böbrek fonksiyonlarını koruduğu; karaciğer hidatik kistlerinin perkütanöz tedavisinin de seçilmiş olgularda etkin ve güvenli bir yöntem olduğu gösterilmiştir (112,113). Adrenal bez ve göz yerleşimli hidatik kistlere de perkütanöz tedavi uygulanmış ve cerrahi tedaviye alternatif, etkin ve güvenli bir teknik olduğu belirtilmiştir (114,115). Kemoterapi: Benzimidazol bileşikleri (albendazol ve mebendazol) opere edilemeyen karaciğer veya akciğer KE li hastalarda, iki veya daha fazla organda multipl kistleri olan hastalarda veya peritoneal kistlerde endikedir. Benzimidazoller cerrahi veya PAIR sonrası rekürrensi önlemek için kullanılabilmektedir (103). 27

32 Benzimidazoller, karaciğer ve akciğerdeki E. granulosus kistlerinde yanıt nisbeten iyidir, ancak diğer yerleşimlerde, özellikle beyin, kemik ve gözde yanıt yetersizdir (91). Albendazol ile tedavi (10 mg/kg, günde iki kez) kistlerin %48 kadarının kaybolması ve boyutunda %24 ten fazla küçülme ile sonuçlanır. Toksikolojik verilerin sınırlı olması nedeniyle albendazol 14 günlük aralıklar ile 3-6 kez dört haftalık döngüler halinde uygulanmaktadır. Olağan yan etkileri bulantı, hepatotoksisite, nötropeni ve bazen alopesidir. Tüm hastaların lökosit sayısı ve karaciğer fonksiyon testleri düzenli olarak takip edilmelidir. Albendazol sülfoksit protoskolisidal albendazol metabolitidir (20,66,116). Mebendazol (günde mg/kg, üçe bölünmüş dozlarda) albendazolden daha az etkilidir. Bunun nedeni muhtemelen albendazolün intestinal absorbsiyonu ve kist içine penetrasyonunun daha iyi olmasıdır. Mebendazolün akciğerdeki kistlere karşı karaciğerdekilerden daha etkili olduğu görülmüştür (66,116). Prazikuantel ve albendazol KE tedavisinde başarılı şekilde kullanılmıştır (25-50 mg/kg/gün). Prazikuantel albendazol ile kombine edildiğinde sadece albendazol tedavisine kıyasla daha etkin ve hızlı sonuçlar vermektedir. Prazikuantel albendazol sülfoksidin serum konsantrasyonunu dört kat arttırır. Bu tedavinin albendazol toksisitesini arttırdığı hala net değildir (20,66). Korunma ve Kontrol Kistik ekinokokkozisin kontrolü; sağlık eğitimi, köpeklerin rutin antihelmintik tedavisi, sokak köpeği popülasyonun kontrolü, kesimhanelerin denetimi ve çiftlik hayvanı yetiştiriciliğinin düzenlenmesini içerir (19). Kontrol programları: Kistik ekinokokkozis kontrol programları dört evrede gerçekleştirilir. Bunlar; planlama, girişim, güçlendirme ve eradikasyon evresinin sürdürülmesidir. Girişim evresinde kontrol önlemleri risk altındaki tüm konakçı topluluğa uygulanır. Tüm köpeklere yönelik ilaçlama kampanyaları bu evreye örnektir. Güçlendirme evresinde riskli alanlara yasal uygulamalar çerçevesinde kontrol önlemleri uygulanır. Eradikasyon evresinin sürdürülmesi parazitten kurtulma olasılığı varsa uygulanabilir. Bu evrede et denetimi hizmetleri ve yeni girişleri önlemeye yönelik sınır denetimleri arttırılmalıdır (117). Devam eden kontrol çalışmaları sayesinde birkaç ülke alveolar veya kistik ekinokokkozisi oldukça azaltmış veya eradike etmeyi başarabilmiştir. KE kontrol programlarının yürütüldüğü İzlanda, Yeni Zelanda (1959), Tazmanya (1965), Arjantin de 28

33 Neuquen (1970) ve Rio Negro (1979) illerinde, Kıbrıs (1970) ve Şili de (1978) dikkate değer başarı mevcuttur. İlk başarılı kontrol programı yaklaşık 130 yıl önce İzlanda da başlatılmadan önce her altı İzlandalı dan birinin kist hidatik hastalığından etkilendiği kabul ediliyordu. Son derece etkin sağlık eğitimi kampanyası ve kesimhanelerdeki önlemler sonucunda 1950 lerde ekinokokkozis İzlanda dan eradike edilmiştir. Yeni Zelanda ve Tazmanya da uygulanan (toplum eğitimi, kontrolsüz kesimlerin önlenmesi ve arekolin temelli köpek tedavisi) programlar yıl içinde E. granulosus un hemen hemen eliminasyonu ile sonuçlanmış ve yaklaşık yıl içinde insanlara geçiş neredeyse tamamen durdurulmuştur (18,20,66,118). Kesin konaklarda kontrol: Enfeksiyon zincirinde yer alan köpeklerin sayısının kontrol altına alınması, tümünün kayıtlı hale getirilmesi, köpek sahipliğinin özendirilmesi ve başıboş köpeklerin belediyelerce toplanarak barınma evlerinde tutulması/bakılması önerilen yollardır (119). Echinococcus granulosus geçiş sürekliliğini belirli bir düzeyin altına indirmek amacıyla köpeklere; arekolin hidrobromid veya prazikuantel ile periyodik kitle tedavisi uygulanmaktadır. E. granulosus un prepatent periyodu yaklaşık altı hafta olduğundan genellikle önerilen tedavi aralığı da altı haftadır. Altı haftalık antihelmintik tedavi aralıkları oldukça etkin olmasına karşın yoksul ülkelerde kullanıma çok uygun değildir. Simulasyon modelleri bu sürenin 3 ay olması halinde dahi yıl içinde köpeklerde ve çiftlik hayvanlarındaki prevalansın %1 in altına ineceğini öngörmektedir. Bu görüş Uruguay ve Yeni Zelanda daki alan çalışmaları ile desteklenmiştir (18-20,91). Köpeklerde parazitin erişkin evresine karşı geliştirilen aşının da parazitin büyümesini ve yumurta üretimini % oranında azalttığı belirtilmektedir (66). Ara konaklarda kontrol: kesin konak olan köpeklerin parazitle enfekte olmalarının önlenmesi amacıyla; kasaplık hayvanların kesiminin sadece mezbahalarda yapılması, veteriner kontrolünde olması, kesim sorası kistli organların uygun biçimde yok edilmesi gerekmektedir (119). Kistik ekinokokkozisin kontrolü ve önlenmesinde yeni yaklaşımlar arasında etkin çiftlik hayvanı aşısı ve potansiyel köpek aşısı da bulunmaktadır. Küçükbaş hayvanlardaki kistik ekinokokkozis için 1996 yılında rekombinant bir aşı (EG95) geliştirilmiştir. Avustralya, Yeni Zelanda, Arjantin, İtalya ve Çin de yapılan saha denemeleri EG95 ile koyunların immünizasyonunun etkinliğinin %95 in üzerinde olduğunu göstermiştir (20,66,120). Koyunların yaygın olarak aşılanması parazitin köpeklere geçişini önler ancak sadece yeni 29

34 enfeksiyonları önleyip mevcut kistleri elimine etmediği için kısa sürede sonuç vermez. Bu nedenle, insanlara geçişi önlemek ya da düşük seviyeye indirmek için koyunların aşılanması ile köpeklerin profilaktik tedavisinin birlikte uygulanması etkin bir yaklaşımdır (19). Eğitim her zaman kontrol stratejilerinin önemli bir parçasıdır. E. granulosus hakkında eğitim; parazitin yaşam döngüsü, enfeksiyon yolları, enfeksiyon riskleri, korunma yöntemleri gibi konularda bilgilendirmeyi içermelidir. Bu bilgilendirme programlarında amaçlanan, hedef popülasyonda gereksiz bir korku oluşmasını değil, toplumsal bir bilinç oluşmasını sağlamak olmalıdır (121). 30

35 GEREÇ VE YÖNTEMLER Bu çalışma Trakya Üniversitesi Tıp Fakültesi Etik Kurulu onayı alınarak (Ek 1) ve Trakya Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Komisyonu (TÜBAP) tarafından 2009/61 numaralı proje ile destek sağlanarak (Ek-2) Trakya Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı Laboratuarı ve Biyofizik Anabilim Dalı Laboratuvarı nda gerçekleştirildi. ÇALIŞMA AKIŞI 1. Örneklerin toplanması 2. Direkt mikroskobik inceleme ve canlılık tayini 3. Deoksiribonükleik asit izolasyonu 4. Ribozomal DNA ITS1 gen bölgesi kullanılarak PCR-RFLP yönteminin uygulanması 5. Mitokondriyal ND1 gen bölgesi kullanılarak PCR-SSCP yönteminin uygulanması 6. Mitokondriyal ND1 ve CO1 gen bölgelerinin dizi analizinin yapılması Çalışmada Kullanılan Cihazlar 1. Işık mikroskobu (Carl Zeiss Jena Jenamed, Almanya) 2. Santrifüj cihazı (Heraeus Sepatech Labofuge 200, Almanya) 3. ph metre (Jenco 6173, Kanada) 4. Hassas terazi (Kern EMB600-2, Almanya) 5. Mikrosantifüj cihazı (Nüve NF800R, Türkiye) 6. Isı bloğu (Techne DRI-BLOCK BB-2A, ABD) 7. Vorteks cihazı (elektro-mag M16, Türkiye) 31

36 8. Mikrodalga fırın (Arçelik MD500, Türkiye) 9. Yatay elektroforez cihazı (BioRad Wide mini-sub cell GT cell,, Almanya) 10. Dikey elektroforez cihazı (BioRad PROTEAN II xi Cell, Almanya) 11. Ultraviyole lamba ve görüntüleme cihazı (BioRad, Almanya) 12. Derin dondurucu ve Soğutucu (Bosch, Almanya) 13. Termal döngü cihazı Techne TC-3000, ABD) 14. Çalkalamalı benmari (Nüve ST402, Türkiye) 15. Güç kaynağı (BioRad Power PAC 200, Almanya) 16. Manyetik karıştırıcı (Nüve MK418, Türkiye) 17. Etüv (Nüve EN500, Türkiye) 18. Ultraviyole spektrofotometre (Hitachi U-1800, Japonya) Örneklerin Toplanması A. Kullanılan kimyasallar: 1. %70 etil alkol: Etil alkol absolut (Sigma, ABD) / distile su oranı 100 ml/39 ml olacak şekilde hazırlandı. B. Örneklerin toplanması: ile tarihleri arasında, Trakya Üniversitesi Sağlık Araştırma ve Uygulama Merkezi, Edirne Devlet Hastanesi, Edirne Selimiye Devlet Hastanesi nde opere edilen veya PAIR işlemi uygulanan hastalardan elde edilen hidatik kist materyalleri çalışmaya alındı. Hastalara kist hidatik konusunda bilgi verildi, bilgilendirilmiş onam formu (Ek-3) dolduruldu ve bu çalışma için onayları alındı. Aynı süre içinde Edirne Belediye Mezbahası nda kesim yapılan hayvanlardan toplanan kist hidatik materyalleri de çalışmaya alındı. İnsanlardan ve hayvanlardan alınan kist sıvısı ve/veya germinal membran; ayrı ayrı olacak şekilde steril %70 etil alkol içeren tüplere konuldu ve sonradan çalışılmak üzere -20 C ye kaldırıldı (14). Laboratuvarda incelenmek üzere kist sıvısı ve/veya germinal membrandan birer örnek etil alkol içermeyen tüplere alındı. Direkt Mikroskobik İnceleme ve Canlılık Tayini A. Kullanılan kimyasallar: 1. %0.1 eozin: 0.1 g Eosin Y (Merck, Almanya) serum fizyolojik ile 100 ml ye tamamlandı. 32

37 2. %0.03 metilen mavisi: 0.03 g Methylene blue (Merck, Almanya) serum fizyolojik ile 100 ml ye tamamlandı. 3. Serum fizyolojik (Medifleks 100 ml; Eczacıbaşı, Türkiye) B. Direkt mikroskobik inceleme ve değerlendirme: Mikroskobik inceleme için alınan kist sıvısı 1600 rpm de 10 dakika santrifüj edildi. Üst sıvı dökülerek dipteki kısımdan lam-lamel arası preparat hazırlanarak, protoskoleks ya da çengel varlığı açısından ışık mikroskobunda incelendi. Germinal membrandan küçük kesitler alınarak lam-lamel arası preparat ile ışık mikroskobunda inceleme yapıldı. Protoskoleks ya da skoleks çengeli rastlanan örnekler fertil olarak değerlendirildi. C. Canlılık tayini ve değerlendirme: Mikroskobik inceleme için alınan kist sıvısı 1600 rpm de 10 dakika santrifüj edildi. Üst sıvı dökülerek dipteki kısımdan, lam üzerinde bir damla çökelti ile birer damla %0.1 eozin ve %0.03 metilen mavisi boyaları ayrı ayrı olarak karıştırılıp üzerleri lamel ile kapatıldı ve 1 dakika sonra protoskoleksler canlılık açısından ışık mikroskobunda incelendi. Boya alanlar cansız, almayanlar canlı olarak değerlendirildi. Deoksiribonükleik Asit İzolasyonu Deoksiribonükleik asit izolasyonu için kist sıvısı ve/veya germinal membran kullanıldı. A. Kullanılan kimyasallar: 1. Fosfat tampon solüsyonu (PBS): KH 2 PO 4 : 0.24 g Na 2 HPO 4 : 1.44 g NaCl : 8.0 g KCl : 0.2 g 900 ml distile su içerisinde karıştırılıp ph:7.4 e ayarlandı ve distile su ile 1000 ml ye tamamlandı x TBE tampon solüsyonu: 10x TRIS borate EDTA buffer solüsyon (Sigma, ABD) distile su ile 1/20 oranında sulandırıldı. 3. %1 agaroz jel: 0.5 g agaroz (Sigma, ABD) 0.5x TBE tampon solüsyonu ile 50 ml ye tamamlandı. Karışım; mikrodalga fırında kaynatıldı, soğuması için bir süre bekletildi, sonra içine 2.5 µl etidyum bromid (10 mg/ml, Sigma, ABD) eklendi. 4. 6x yükleme boyası (Sigma, ABD) 33

38 B. Yöntem ve değerlendirme: -20 C de saklanan materyaller çıkarılıp çözünmesi beklendikten sonra 5 kez steril PBS ile yıkandı. Ardından kit üreticisinin önerileri doğrultusunda DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen, Almanya) ile DNA izole edildi μg doku ya da 200 μl kist sıvısı 1.5 ml lik mikrosantifüj tüpüne aktarıldı. Üzerine 180 μl buffer ATL eklendi μl proteinaz K eklendi ve 56 C de dokular eriyene kadar (2-12 saat) bekletildi. İnkübasyon sırasında ara ara örnekler vortekslendi. 3. İnkübasyon sonunda örnekler 15 sn vortekslenerek üzerlerine 200 μl buffer AL eklendi, vortekslendi. Daha sonra 200 μl saf etanol (Sigma-Aldrich, ABD) eklendi, tekrar vortekslendi. 4. Mikrosantifüj tüp içeriği toplama tüpü içindeki DNeasy Mini spin kolonuna aktarıldı rpm de 1 dakika santrifüj edildi. 5. Toplama tüpü atıldı. DNeasy Mini spin kolonu yeni bir toplama tüpüne yerleştirildi. Üzerine 500 μl buffer AW1 eklendi ve 8000 rpm de 1 dakika santrifüj edildi. 6. Toplama tüpü atıldı. DNeasy Mini spin kolonu yeni bir toplama tüpüne yerleştirildi. Üzerine 500 μl buffer AW2 eklendi ve rpm de 3 dakika santrifüj edildi. 7. Toplama tüpü atıldı. DNeasy Mini spin kolonu yeni bir mikrosantifüj tüpüne konuldu. Üzerine 100 μl buffer AE eklendi ve oda sıcaklığında 1 dakika beklendikten sonra 8000 rpm de 1 dakika santrifüj edildi aşama tekrar edildi. mikrosantifüj tüpünde kalan materyal DNA eldesi olarak, kullanılıncaya kadar -20ºC de saklandı. Elde edilen ürünlerde DNA varlığını araştırmak için 10 μl izolasyon ürünü ile 2 μl yükleme boyası karıştırılıp %1 lik agaroz jelde kuyulara yüklendi. Elektroforez tampon solüsyonu olarak 0.5x TBE kullanıldı ve elektroforez cihazında 90 voltta 1 saat süresince yürütüldü. UV ışığı altında net bir bant oluşturduğu görülen örnekler çalışmanın devamında kullanıldı. Elde edilen DNA miktarı spektrofotometrede ölçülerek belirlendi. Ribozomal Deoksiribonükleik Asit Internal Transcribed Spacer 1 Gen Bölgesi Kullanılarak Polimeraz Zincir Reaksiyonu - Restriksiyon Fragman Uzunluğu Polimorfizmi Yönteminin Uygulanması Echinococcus granulosus un rdna ITS1 gen bölgesi kullanılarak yapılan PCR-RFLP uygulamasında; Bowles ve McManus un (50) tanımladığı yöntem modifiye edilerek kullanıldı. 34

39 A. Kullanılan kimyasallar: mm MgCl 2 solüsyonu: 25 μl 100 mm MgCl 2 (Bioron, Almanya) solüsyonuna 75 μl distile su eklendi mm deoksiribonükleozid trifosfat karışımı: Her bir deoksiribonükleozid trifosfat (dntp, 100 mm; Bioron, Almanya) tan 2 μl alınıp 92 μl distile su ile karıştırıldı x TBE tampon solüsyonu: 10x TRIS borate EDTA buffer solüsyon (Sigma, ABD) distile su ile 1/20 oranında sulandırıldı. 4. Primerler: BD1 ve 4S (Bioron, Almanya) primerleri önce her biri için belirtilen nmol değerlerine göre 100 μm olacak şekilde distile su ile sulandırıldı. Ardından distile su ile 1/4 oranında sulandırılarak 25 μm lık konsantrasyon elde edildi x PCR tamponu (Bioron, Almanya): KCl : 500 mm Tris HCl ph:8.8 : 100 mm Tween-20 : %0.1 MgCl 2 : 15 mm 6. %1,5 agaroz jel: 0.75 g agaroz (Sigma, ABD) 0.5x TBE tampon solüsyonu ile 50 ml ye tamamlandı. Karışım; mikrodalga fırında kaynatıldı, soğuması için bir süre bekletildi, sonra içine 2.5 µl etidyum bromid (10 mg/ml, Sigma, ABD) eklendi. 7. %3 agaroz jel: 1.5 g agaroz (Sigma, ABD) 0.5x TBE tampon solüsyonu ile 50 ml ye tamamlandı. Karışım; mikrodalga fırında kaynatıldı, soğuması için bir süre bekletildi, sonra içine 2.5 µl etidyum bromid (10 mg/ml, Sigma, ABD) eklendi. 8. Taq DNA polimeraz, 5U/µl (Bioron, Almanya) 9. 6x yükleme boyası (Sigma, ABD) 10. AluI, 10 U/µl (Bioron, Almanya) 11. MspI (HpaII), 10 U/µl (Fermentas, Litvanya) 12. HhaI, 10 U/µl (Fermentas, Litvanya) 13. RsaI, 12 U/µl (Bioron, Almanya) 14. DNA boyut markırı (Q RangeRuler 100 bp DNA Ladder; Fermentas, Litvanya) B. Yöntem ve değerlendirme: Toplam hacim 60 µl olacak şekilde PCR gerçekleştirildi. PCR karışımı: 10x PCR tamponu dntp : 6 μl : 6 μl 35

40 MgCl 2 Primer BD1 Primer 4S Taq DNA polimeraz genomik DNA Distile su ile 60 μl ye tamamlandı. : 2.4 μl : 1.2 μl : 1.2 μl : 0.25 μl : 100 ng Amplifikasyon: Ribozomal DNA ITS1 gen bölgesini çoğaltmak amacıyla termal döngü cihazı şu şekilde programlandı: 95 C de 2 dakika ön denatürasyon 95 C de 1 dakika denatürasyon 52 C de 1 dakika bağlanma 35 döngü 72 C de 1 dakika sentez 72 C de 5 dakika son uzama Tüm PCR uygulamalarında; pozitif kontrol olarak Fırat Üniversitesi Veteriner Fakültesi Parazitoloji AD nda görevli Doç.Dr. Sami ŞİMŞEK ten temin edilen evcil koyun suşu DNA sı ve negatif kontrol olarak steril distile su kullanıldı. Elektroforez ve değerlendirme: 10 μl PCR ürünü ile 2 μl yükleme boyası karıştırılıp %1,5 luk agaroz jelde kuyulara yüklendi. Elektroforez tampon solüsyonu olarak 0.5x TBE kullanıldı ve elektroforez cihazında 90 voltta 1 saat süresince yürütüldü. UV ışığı altında DNA boyut markırı ve pozitif kontrole göre uygun yerde bant görülen örnekler çalışmanın devamında kullanıldı. Kesim: ITS1 bölgesi çoğalan örnekler AluI, RsaI, MspI ve HhaI enzimleri ile kesim işlemine tabi tutuldu. Reaksiyon içeriği şu şekilde idi: PCR ürünü : 10 μl 10x restriksiyon tamponu : 2 μl Restriksiyon enzimi : 5 U Steril distile su ile 20 µl ye tamamlandı. 16 saat boyunca 37 C de inkübe edildi. Elektroforez ve değerlendirme: İnkübasyon sonunda ürünler %3 lük agaroz jele yüklendi. Agaroz jelde ilk kuyuya 5 µl DNA boyut markırı yüklendi. 90 voltta 1.5 saat süresince elektroforez işlemi uygulandı. Bu süre sonunda agaroz jel UV ışıkta incelenerek 36

41 örneklerin bant paternleri ile evcil koyun suşu kontrol izolatının (patern I) sergilediği bant paternleri karşılaştırıldı. Farklı bant paternlerine numara verildi (patern II, III gibi). Mitokondriyal NADH Dehidrogenaz Subunit 1 Gen Bölgesi Kullanılarak Polimeraz Zincir Reaksiyonu - Tek Sarmal Konformasyon Polimorfizmi Yönteminin Uygulanması Polimeraz zincir reaksiyonu - tek sarmal konformasyon polimorfizmi analizi (58,122,123) ve gümüş boyama (124,125) için önceden tanımlanan yöntemler modifiye edilerek uygulandı. A. Kullanılan kimyasallar: 1. 2 mm deoksiribonükleozid trifosfat karışımı: Her bir deoksiribonükleozid trifosfat (dntp, 100 mm; Bioron, Almanya) tan 2 μl alınıp 92 μl distile su ile karıştırıldı x TBE tampon solüsyonu: 10x TRIS borate EDTA buffer solüsyon (Sigma, ABD) distile su ile 1/20 oranında sulandırıldı. 3. Primerler: MS1 ve MS2 (Integrated DNA Technologies, Belçika) primerleri önce her biri için belirtilen nmol değerlerine göre 100 μm olacak şekilde distile su ile sulandırıldı. Ardından distile su ile 1/4 oranında sulandırılarak 25 μm lık konsantrasyon elde edildi x PCR tamponu (Fermentas, Litvanya): KCl : 500 mm Tris HCl ph:8.8 : 100 mm Nonidet P40 : % %2 agaroz jel: 1 g agaroz (Sigma, ABD) 0.5x TBE tampon solüsyonu ile 50 ml ye tamamlandı. Karışım; mikrodalga fırında kaynatıldı, soğuması için bir süre bekletildi, sonra içine 2.5 µl etidyum bromid (10 mg/ml, Sigma, ABD) eklendi M Tris ph:8.8: g Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Sigma-Aldrich, ABD) distile su ile 90 ml ye tamamlandı. ph 8.8 e ayarlandıktan sonra distile su ile 100 ml ye tamamlandı M Tris ph:6.8: 6.05 g Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Sigma-Aldrich, ABD) distile su ile 40 ml ye tamamlandı. ph 6.8 e ayarlandıktan sonra distile su ile 50 ml ye tamamlandı. 8. %30 akrilamid/bisakrilamid: 30 g Acrylamide:N,N -Methylenebisacrylamide 29:1 (Fluka, ABD) distile su ile 100 ml ye tamamlandı. 9. %10 amonyum persülfat: 1g Ammonium persulfate (Sigma, ABD) distile su ile 10 ml ye tamamlandı. 37

42 10. 1 M NaOH: 0.4 g Sodium hydroxide (Riedel-de Haën, ABD) distile su ile 10 ml ye tamamlandı. 11. %2.5 bromfenol mavisi: 0.25 g Bromophenol Blue (Sigma-Aldrich, ABD) distile su ile 10 ml ye tamamlandı. 12. %2.5 ksilen siyanol: 0.25 g Xylene Cyanol FF (Sigma-Aldrich, ABD) distile su ile 10 ml ye tamamlandı. 13. Denatürasyon tamponu: 10 µl 1 M NaOH, 20 µl %2.5 bromfenol mavisi, 20 µl %2.5 ksilen siyanol 950 µl formamid (Sigma Aldrich, ABD) e eklendi. 14. %10 etanol + %5 asetik asit: 25 ml saf etanol ile 12.5 ml asetik asit (Sigma- Aldrich, ABD) distile su ile 250 ml ye tamamlandı. 15. %0.1 gümüş nitrat solüsyonu: 0.25 gr gümüş nitrat (Sigma-Aldrich, ABD) önce bir miktar distile suda çözüldü, ardından distile su ile 250 ml ye tamamlandı. 16. %1.5 sodyum hidroksit solüsyonu: 3.75 g NaOH (Riedel-de Haën, ABD) önce bir miktar distile suda çözüldü ardından distile su ile 250 ml ye tamamlandı. 17. %0.75 sodyum karbonat solüsyonu: g Na 2 CO 3 (Riedel-de Haën, ABD) önce bir miktar distile suda çözüldü ardından distile su ile 250 ml ye tamamlandı. 18. Taq DNA polimeraz, 5U/µl (Fermentas, Litvanya) mm MgCl 2 (Fermentas, Litvanya) 20. Gliserol (Sigma, ABD) 21. TEMED (N,N,N,N -Tetramethylethylenediamine; Sigma, ABD) 22. Etil alkol absolut (Sigma, ABD) 23. Formaldehit solüsyonu ( %36; Sigma, ABD) 24. Deoksiribonükleik asit boyut markırı (Q RangeRuler 100 bp DNA Ladder; Fermentas, Litvanya) 25. 6x yükleme boyası (Sigma, ABD) 26. Deoksiribonükleik asit boyut markırı (BenchTop pgem DNA Markers; Promega, ABD) B. Yöntem ve değerlendirme: Toplam hacim 50 µl olacak şekilde PCR gerçekleştirildi. PCR karışımı: 10x PCR tamponu dntp MgCl 2 : 5 μl : 5 μl : 5 μl 38

43 Primer MS1 Primer MS2 Taq DNA polimeraz genomik DNA Distile su ile 50 μl ye tamamlandı. : 1 μl : 1 μl : 0.2 μl : 80 ng Amplifikasyon: Parsiyel mitokondriyal ND1 gen bölgesini çoğaltmak amacıyla termal döngü cihazı şu şekilde programlandı: 95 C de 5 dakika ön denatürasyon 95 C de 0.5 dakika denatürasyon 52 C de 0.5 dakika bağlanma 35 döngü 72 C de 0.5 dakika sentez 72 C de 5 dakika son uzama Amplifikasyon işleminde pozitif kontrol olarak Fırat Üniversitesi Veteriner Fakültesi Parazitoloji AD nda görevli Doç.Dr. Sami ŞİMŞEK ten temin edilen evcil koyun suşu DNA sı ve negatif kontrol olarak steril distile su kullanıldı. Elektroforez ve değerlendirme: 10 μl PCR ürünü ile 2 μl 6x yükleme boyası (Sigma, ABD) karıştırılıp %2 lik agaroz jelde kuyulara yüklendi. Elektroforez tampon solüsyonu olarak 0.5x TBE kullanıldı ve elektroforez cihazında 90 voltta 1 saat süresince yürütüldü. UV ışığı altında beklenen uzunluğa uyan bölgede bant görülen örnekler çalışmanın devamında kullanılmak üzere +4 C ye kaldırıldı. Poliakrilamid jelin hazırlanması: %12 lik denatüre edici olmayan jel (ayırma jeli) aşağıdaki maddeleri içerdi: Distile su : 12 ml Tris ph:8.8 : 10 ml Akrilamid/bisakrilamid 29:1 : 16 ml Gliserol : 2 ml TEMED : 15 µl Amonyum persülfat : 200 µl Yukarıda sayılan maddeler karıştırılarak hızlıca dikey elektroforez cihazının saf etanol ile temizlenmiş ve kurutulmuş iki cam plağı arasına döküldü, üzeri distile su ile kapatıldı. Jel donduktan sonra (yaklaşık 2 saat) üzerindeki distile su kurutma kağıdı ile alındı. 39

44 Toplama jeli şu maddeleri içerdi: Distile su : 3.4 ml Tris ph:6.8 : 625µl Akrilamid/bisakrilamid 29:1 : 1 ml TEMED : 2.5 µl Amonyum persülfat : 50 µl Yukarıda sayılan maddeler karıştırılarak hızlıca ayırma jelinin üzerine döküldü ve tarak yerleştirildi. Jel donduktan sonra (yaklaşık 1 saat) tarak çıkartıldı ve kuyulardaki su kurutma kağıdı ile alındı. Cam plaklar dikey elektroforez cihazının gövde kısmına monte edildi ve cihaz tankına yerleştirildi. Tanka ve jelin üst kısmındaki bölmeye 0.5x TBE konuldu. Denatürasyon ve elektroforez: Çoğaltılmış mitokondriyal ND1 gen bölgesini denatüre etmek amacıyla 12 µl denatürasyon tamponu ile 4 µl PCR ürünü karıştırılıp termal döngü cihazına yerleştirildi ve 95 C de 10 dakika bekletildi. Bu süre sonunda örnekler cihazdan çıkartılıp hızlıca -20 C den çıkartılan buz kalıbının içine yerleştirildi. Hazırlanan jele her bir örnekten 10 µl ve DNA boyut markırından 1 µl yüklendi. Örnekler oda ısında, 200 voltta, 20 saat boyunca yürütüldü. Daha sonra jel gümüş boyama yöntemi ile boyandı. Gümüş boyama: 1. Jel %10 etanol ve %5 asetik asit solüsyonu içinde 6 dakika bekletildi. 2. Jelin içinde bulunduğu sıvı enjektör yardımıyla boşaltıldı. Üzerine %0.1 gümüş nitrat solüsyonu döküldü. 15 dakika bekletildi. Ardından sıvı boşaltıldı. 3. %1.5 sodyum hidroksit solüsyonuna 375 µl formaldehit solüsyonu eklendi. Jel bu solüsyonda 30 dakika bekletildi, ardından sıvı boşaltıldı. 4. Jel %0.75 sodyum karbonat solüsyonunda 10 dakika bekletildi. Bu süre sonunda sıvı boşaltılıp jel şeffaf dosya içerisine kondu ve +4 C de saklandı. Değerlendirme: Tek sarmal konformasyon polimorfizmi yönteminde Fırat Üniversitesi Veteriner Fakültesi Parazitoloji AD nda görevli Doç.Dr. Sami ŞİMŞEK ten temin edilen evcil koyun suşu ve domuz suşu izolatları kontrol olarak kullanıldı. Gümüş boyama sonunda kontrol izolatlarına göre değerlendirilen bant paternleri farklı harfler ile (patern A, B gibi) simgelendi. 40

45 Mitokondriyal NADH Dehidrogenaz Subunit 1 ve Sitokrom C Oksidaz Subunit 1 Gen Bölgelerinin Dizi Analizinin Yapılması Polimeraz zincir reaksiyonu RFLP ve PCR-SSCP analizi sonucunda evcil koyun suşu ve domuz suşundan farklı bant paterni sergileyen ve bu suşlar ile aynı paterni sergileyen örneklerden rastgele seçilen 13 adet örneğin mitokondriyal CO1 ve ND1 gen bölgeleri çoğaltılıp saflaştırıldı. Dizi analizi yaptırılmak üzere Refgen (Ankara, Türkiye) firmasına gönderildi. A. Kullanılan kimyasallar: 1. 2 mm deoksiribonükleozid trifosfat karışımı: Her bir deoksiribonükleozid trifosfat (dntp, 100 mm; Bioron, Almanya) tan 2 μl alınıp 92 μl distile su ile karıştırıldı x TBE tampon solüsyonu: 10x TRIS borate EDTA buffer solüsyon (Sigma, ABD) distile su ile 1/20 oranında sulandırıldı. 3. Primerler: JB3, JB4.5 (Bioron, Almanya), MS1 ve MS2 (Integrated DNA Technologies, Belçika) primerleri önce her biri için belirtilen nmol değerlerine göre 100 μm olacak şekilde distile su ile sulandırıldı. Ardından distile su ile 1/4 oranında sulandırılarak 25 μm lık konsantrasyon elde edildi x PCR tamponu (Fermentas, Litvanya): KCl : 500 mm Tris HCl ph:8.8 : 100 mm Nonidet P40 : % Taq DNA polimeraz, 5U/µl (Fermentas, Litvanya) mm MgCl 2 (Fermentas, Litvanya) 7. DNA boyut markırı (Q RangeRuler 100 bp DNA Ladder; Fermentas, Litvanya) 8. 6x yükleme boyası (Sigma, ABD) B. Yöntem ve değerlendirme: Toplam hacim 50 µl olacak şekilde PCR gerçekleştirildi. Mitokondriyal ND1 gen bölgesini çoğaltmak için MS1 ve MS2, mitokondriyal CO1 gen bölgesi için JB3 ve JB4.5 primerleri kullanıldı. PCR karışımı: 10x PCR tamponu dntp MgCl 2 Primer MS1/ JB3 Primer MS2/ JB4.5 : 5 μl : 5 μl : 5 μl : 1 μl : 1 μl 41

46 Taq DNA polimeraz genomik DNA Distile su ile 50 μl ye tamamlandı. : 0.2 μl : 80 ng Amplifikasyon: Parsiyel mitokondriyal CO1 ve ND1 gen bölgesini çoğaltmak amacıyla termal döngü cihazı şu şekilde programlandı: 95 C de 5 dakika ön denatürasyon 95 C de 0.5 dakika denatürasyon 50 C (ND1)/55 C (CO1) de 0.5 dakika bağlanma 35 döngü 72 C de 0.5 dakika sentez 72 C de 5 dakika son uzama Amplifikasyon işleminde pozitif kontrol olarak Fırat Üniversitesi Veteriner Fakültesi Parazitoloji AD nda görevli Doç.Dr. Sami ŞİMŞEK ten temin edilen evcil koyun suşu DNA sı ve negatif kontrol olarak steril distile su kullanıldı. Elektroforez ve değerlendirme: 10 μl PCR ürünü ile 2 μl yükleme boyası ile karıştırılıp %2 lik agaroz jelde kuyulara yüklendi. 90 voltta 1 saat süresince elektroforez işlemine tabi tutuldu. UV ışığı altında DNA boyut markırı ve pozitif kontrole göre uygun yerde bant görülen örnekler çalışmanın devamında kullanıldı. Amplifikasyon ürünü saflaştırma: PCR ürünleri High Pure PCR Product Purification Kit (Roche, Almanya) kiti kullanılarak üreticinin önerileri doğrultusunda ancak kullanılan PCR ürünü ve elüsyon tampon miktarı eşit oranda azaltılarak saflaştırıldı. Saflaştırma işlemi şu şekilde yapıldı: µl PCR ürünü 1.5 ml lik mikrosantifüj tüpüne aktarıldı ve üzerine 500µl binding buffer eklendi. 2. Toplama tüpünün içine High Pure filtre tüpü yerleştirildi. Filtre tüpünün içine 1. maddedeki karışım aktarıldı. 20 C de, rpm de, 1 dakika santrifüj edildi. 3. Filtre tüpü çıkartılıp toplama tüpünde biriken sıvı döküldü ve filtre tüpü tekrar toplama tüpünün içine yerleştirildi. 4. Filtre tüpünün içine 500 µl wash buffer kondu ve 20 C de, rpm de, 1 dakika santrifüj edildi. 42

47 5. Filtre tüpü çıkartılıp toplama tüpünde biriken sıvı döküldü ve filtre tüpü tekrar toplama tüpünün içine yerleştirildi. Filtre tüpünün içine 200 µl wash buffer kondu ve 20 C de, rpm de, 1 dakika santrifüj edildi. 6. Filtre tüpü çıkartılıp toplama tüpünde biriken sıvı döküldü ve filtre tüpü 1.5 ml lik mikrosantifüj tüpünün içine yerleştirildi. 7. Filtre tüpünün içine 40 µl elution buffer kondu ve 20 C de, rpm de, 1 dakika santrifüj edildi. 8. Filtre tüpü atıldı, mikrosantifüj tüpünde kalan sıvı saflaştırılmış PCR ürünü olarak kullanıldı. Tüm PCR uygulamalarında kullanılan primerler ve nükleotid dizilimleri Tablo 2 de gösterilmektedir. Parsiyel mitokondriyal CO1 ve ND1 gen bölgelerinin dizi analizi sonucu elde edilen veriler GenBank ta ( bulunan referans dizilerle karşılaştırıldı. Mitokondriyal CO1 ve ND1 gen bölgeleri referans dizileri Tablo 3 te listelenmiştir. Tablo 2. Echinococcus granulosus un polimeraz zincir reaksiyonu analizinde kullanılan primerler Primer Gen bölgesi Nükleotid Dizisi BD1 ITS1 5 -GTCGTAACAAGGTTTCCGTA S ITS1 5 -TCTAGATGCGTTCGA(G/A)TGCGATG-3 50 JB3 CO1 5 -TTTTTTGGGCATCCTGAGGTTTAT JB4.5 CO1 5 -TAAAGAAAGAACATAATGAAAATG MS1 ND1 5'- CGTAGGTATGTTGGTTTGTTTGGT- 3' 127 MS2 ND1 5'- CCATAATCAAATGGCGTACGAT -3' 127 Kaynak ITS1: Internal transcribed spacer 1 ; CO1: Sitokrom c oksidaz subunit 1; ND1: NADH dehidrogenaz subunit 1; G: Guanin; T: Timin; C: Sitozin; A: Adenin. Filogenetik analiz: Elde edilen parsiyel mitokondriyal CO1 ve ND1 dizi verilerine Iontek (İstanbul, Türkiye) firması tarafından filogenetik analiz yapıldı. Filogenetik ağaç, firma tarafından Bayesian inference (BI) yöntemi kullanılarak her iki dizi verilerinin birlikte analiziyle oluşturuldu. 43

48 Tablo 3. Mitokondriyal sitokrom c oksidaz subunit 1 ve NADH dehidrogenaz subunit 1 gen bölgeleri referans dizileri Genotip Erişim Kaynak Erişim Kaynak numarası (CO1) numarası (ND1) Genotip 1 U AJ Genotip 2 M AJ Genotip 3 M AJ Genotip 4 M AJ Genotip 5 M AJ Genotip 6 M AJ Genotip 7 M AJ Genotip 8 AB AJ Genotip 10 AF AF CO1: Sitokrom c oksidaz subunit 1; ND1: NADH dehidrogenaz subunit 1 44

49 BULGULAR ile tarihleri arasında, Trakya Üniversitesi Sağlık Araştırma ve Uygulama Merkezi, Edirne Devlet Hastanesi, Edirne Selimiye Devlet Hastanesi nde opere edilen veya PAIR işlemi uygulanan hastalardan 42, Edirne Belediye Mezbahası nda kesim yapılan hayvanlardan 16 adet olmak üzere toplam 58 hidatik kist materyali çalışmaya alındı. Bu izolatların tümü; direkt mikroskobik inceleme ve/veya biyopsi materyali patolojik kesitlerinde kist hidatik elemanları görülerek KE olarak kanıtlanmıştır. YAPILAN ÇALIŞMALAR Direkt Mikroskobik İnceleme ve Canlılık Tayini Direkt mikroskobik inceleme: Çalışmaya dahil edilen 58 izolatın mikroskobik incelemesi sonucunda insanlardan elde edilen 21, koyunlardan elde edilen 3 adet kist sıvısı ve germinal membranda protoskoleks; insanlardan elde edilen 4; sığırlardan elde edilen 1 adet germinal membranda skoleks ve insanlardan elde edilen 2 adet kist sıvısında sadece skoleks çengeline rastlanıldı. Toplamda örneklerin 31 inin fertil, 27 sinin steril olduğu tespit edildi. Fertilite durumu her konak türü içinde değerlendirildiğinde; insanlarda %64.3, sığırlarda %7.7, koyunlarda %100 olarak bulundu. Edirne deki çeşitli hastanelerden ve kesimhaneden toplanan hidatik kist materyallerinin lokalizasyon, fertilite durumu ve illere göre dağılımı Tablo 4 te gösterilmektedir. 45

50 Tablo 4. Hidatik kist materyallerinin lokalizasyon, fertilite durumu ve illere göre dağılımı No Konak Lokalizasyon İl Kesin tanı Fertilite 1 İnsan Karaciğer Edirne Patoloji/ DM + 2 İnsan Karaciğer Edirne DM + 3 İnsan Karaciğer Edirne DM + 4 İnsan Karaciğer Tekirdağ Patoloji - 5 İnsan Akciğer Edirne Patoloji - 6 İnsan Karaciğer Tekirdağ Patoloji/ DM + 7 İnsan Akciğer Kırklareli Patoloji - 8 İnsan Karaciğer Kırklareli DM + 9 İnsan Karaciğer Edirne Patoloji/ DM + 10 İnsan Akciğer Edirne Patoloji/ DM - 11 İnsan Akciğer Edirne Patoloji/ DM - 12 İnsan Karaciğer Tekirdağ DM + 13 İnsan Kalp Kırklareli Patoloji/DM + 14 İnsan Karaciğer Tekirdağ Patoloji/DM + 15 İnsan Karaciğer Tekirdağ Patoloji/DM + 16 İnsan Karaciğer Tekirdağ Patoloji/DM + 17 İnsan Karaciğer Çanakkale DM + 18 İnsan Karaciğer Çanakkale DM + 19 İnsan Karaciğer Edirne DM + 20 İnsan Karaciğer Edirne DM + 21 İnsan Akciğer Edirne Patoloji/DM + 22 İnsan Karaciğer Kırklareli DM + 23 İnsan Karaciğer Kırklareli DM + 24 İnsan Karaciğer Edirne DM + 25 İnsan Akciğer Kırklareli Patoloji - 26 İnsan Akciğer Tekirdağ Patoloji/DM + 27 İnsan Akciğer Tekirdağ Patoloji - 28 İnsan Akciğer Tekirdağ Patoloji - 29 İnsan Akciğer Tekirdağ Patoloji - 30 İnsan Akciğer Tekirdağ DM + 31 İnsan Akciğer Tekirdağ Patoloji - 32 İnsan Akciğer Tekirdağ Patoloji - 33 İnsan Akciğer Tekirdağ Patoloji - 34 İnsan Akciğer Tekirdağ Patoloji - 35 İnsan Akciğer Tekirdağ Patoloji - 36 İnsan Karaciğer Edirne DM + 37 İnsan Akciğer Edirne Patoloji - 38 İnsan Akciğer Tekirdağ DM + 39 İnsan Batın içi Tekirdağ DM + 40 İnsan Lomber bölge Tekirdağ DM + 41 İnsan Akciğer Edirne DM + 42 İnsan Karaciğer Edirne DM + 43 Sığır Karaciğer Edirne Patoloji - 44 Sığır Karaciğer Edirne Patoloji - 45 Koyun Akciğer Edirne Patoloji/DM + 46 Koyun Akciğer Edirne Patoloji/DM + 46

51 Tablo 4 (devamı): Hidatik kist materyallerinin lokalizasyon, fertilite durumu ve illere göre dağılımı No Konak Lokalizasyon İl Kesin tanı Fertilite 47 Koyun Akciğer Edirne Patoloji/DM + 48 Sığır Akciğer Edirne Patoloji - 49 Sığır Karaciğer Edirne Patoloji - 50 Sığır Karaciğer Edirne Patoloji - 51 Sığır Akciğer Edirne Patoloji - 52 Sığır Akciğer Edirne Patoloji - 53 Sığır Karaciğer Edirne Patoloji - 54 Sığır Karaciğer Edirne Patoloji - 55 Sığır Karaciğer Edirne Patoloji - 56 Sığır Karaciğer Edirne Patoloji/DM + 57 Sığır Karaciğer Edirne Patoloji - 58 Sığır Akciğer Edirne Patoloji - DM: Direkt mikroskobi; (+): Fertil; (-): Steril. Çalışmaya dahil edilen insanlardaki 42 hidatik kistin 20 si (%47.6) karaciğer; 19 u (%45.2) akciğer lokalizasyonlu idi. Sığırlardaki hidatik kistlerin ise 9 u (%69.2) karaciğer; 4 ü (%30.8) akciğer lokalizasyonlu idi. 3 adet koyun hidatik kistinin tamamı akciğer lokalizasyonlu idi. Kistlerin organlara göre fertilite durumuna bakıldığında; insanlarda karaciğer lokalizasyonlu kistlerin 19 u (%95), akciğer lokalizasyonlu kistlerin 5 i (%26.3); sığırlarda karaciğer lokalizasyonlu kistlerin 1 i (%11.1) fertil iken akciğer lokalizasyonlu fertil kiste rastlanmadı. Akciğer lokalizasyonlu koyun hidatik kistlerinin 3 ü (%100) de fertil olarak belirlendi. Canlılık tayini: Kist sıvılarında bulunan protoskolekslerin canlı olup olmadığını araştırmak amacıyla konaklardan elde edilen toplam 21 adet kist sıvısının metilen mavisi ve eozin ile boyanması sonucunda insanlarda canlı protoskoleks içeren kistlerin oranı; karaciğerde 1/14 (%7.1), akciğerde 2/5 (%40) olarak bulundu. Akciğer lokalizasyonlu 3 adet koyun hidatik kist sıvısındaki protoskolekslerin 3 (%100) hidatik kist sıvısında da canlı olduğu tespit edildi. Canlılık boyaları ile boyanan protoskolekslerin mikroskobik görüntüsü Şekil 5 te gösterilmektedir. Polimeraz Zincir Reaksiyonu - Restriksiyon Fragman Uzunluğu Polimorfizmi İzolatların rdna ITS1 gen bölgelerinin BD1 ve 4S primerleriyle PCR-RFLP yöntemi ile çoğaltılmaları sonucunda yaklaşık 1000 ve 1100 bp lik iki bant elde edildi. Şekil 6 da pozitif kontrol ve örneklere ait ITS1 gen bölgesinin elektroforez sonrası elde edilen bant profilleri görülmektedir. 47

52 A B C D Şekil 5. Echinococcus granulosus protoskolekslerinin canlılık boyaları ile boyanma görüntüleri: A-Cansız protoskoleksler, 100x, metilen mavisi, B-Canlı (yukarıda) ve cansız (aşağıda) protoskoleksler, 40x, metilen mavisi, C-Cansız protoskoleks, 200x, eozin, D- Canlı (yukarıda) ve cansız (aşağıda) protoskoleks, 100x, eozin 48

53 M bp 1000 bp 500 bp M: Deoksiribonükleik asit boyut markırı (100 bp); 1: pozitif kontrol; 2: sığır izolatı; 3: insan izolatı; 4: koyun izolatı; 5: negatif kontrol. Şekil 6. Echinococcus granulosus un insan, sığır ve koyun izolatlarının internal transcribed spacer 1 gen bölgesinin polimeraz zincir reaksiyonu ile çoğaltılması sonucunda oluşan bantlar Çalışmaya dahil edilen 58 izolatın ITS1 gen bölgesi AluI, RsaI, MspI ve HhaI enzimleri ile kesildi ve bant paternleri pozitif kontrol suşu ile karşılaştırıldı. Buna göre; 47 izolatın pozitif kontrol (patern I) ile aynı bant paternine sahip olduğu, pozitif kontrolden farklı olduğu gözlenen 10 adet izolatın patern II yi; 1 adet izolatın ise patern III ü sergilediği belirlendi. Örneklerin ITS1 ürünlerinin kesimi sonucu gözlenen patern I ve patern II Şekil 7 de; patern I ve patern III Şekil 8 de gösterilmektedir. Polimeraz Zincir Reaksiyonu - Tek Sarmal Konformasyon Polimorfizmi Protoskoleks ve germinal membranlardan elde edilen genomik DNA nın mitokondriyal ND1 gen bölgesinin MS1 ve MS2 primerleri ile çoğaltılması sonucunda yaklaşık 400 bp büyüklüğünde bant elde edildi. Şekil 9 da pozitif kontrol ve örneklere ait mitokondriyal ND1 gen bölgesinin elektroforez sonrası elde edilen bant profilleri görülmektedir. Toplanan izolatların mitokondriyal ND1 gen bölgesinin PCR -SSCP analizi yapılarak G1 ve G7 kontrol suşları ile karşılaştırıldı ve üç farklı bant paterni tespit edildi. İzolatların 56 sı patern A (G1 kontrol suşu ile uyumlu), 1 i patern B, 1 i patern C yi sergiledi. PCR- SSCP analizi sonucunda izolatların sergilediği bant paternleri Şekil 10 da gösterilmektedir. 49

54 M M bp 1000 bp 500 bp 1500 bp 1000 bp 500 bp 100 bp 100 bp A B M M bp 1000 bp 500 bp 1500 bp 1000 bp 500 bp 100 bp 100 bp C D M: Deoksiribonükleik asit boyut markırı; 1: Pozitif kontrol (patern I); 2: Patern II; 3: Patern I. Şekil 7. Echinococcus granulosus izolatlarının internal transcribed spacer 1 gen ürünlerinin kesimi sonucu gözlenen paternler: A-AluI enzimi ile kesim sonucu gözlenen bant paternleri, B-RsaI enzimi ile kesim sonucu gözlenen bant paternleri, C-MspI enzimi ile kesim sonucu gözlenen bant paternleri, D-HhaI enzimi ile kesim sonucu gözlenen bant paternleri 50

55 M 1 2 M bp 1000 bp 500 bp 1500 bp 1000 bp 500 bp 100 bp 100 bp A B M 1 2 M bp 1000 bp 500 bp 1500 bp 1000 bp 500 bp 100 bp 100 bp C D M: Deoksiribonükleik asit boyut markırı; 1: Pozitif kontrol (patern I); 2: Patern III. Şekil 8. Echinococcus granulosus izolatlarının internal transcribed spacer 1 gen ürünlerinin kesimi sonucu gözlenen paternler: A-AluI enzimi ile kesim sonucu gözlenen bant paternleri, B-RsaI enzimi ile kesim sonucu gözlenen bant paternleri, C-MspI enzimi ile kesim sonucu gözlenen bant paternleri, D-HhaI enzimi ile kesim sonucu gözlenen bant paternleri 51

56 M bp M: Deoksiribonükleik asit boyut markırı (100 bp); 1: Pozitif kontrol; 2,3: İnsan izolatı, 4: Sığır izolatı; 5: Koyun izolatı; 6: Negatif kontrol. Şekil 9. Echinococcus granulosus un insan, sığır ve koyun izolatlarının mitokondriyal NADH dehidrogenaz subunit 1 bölgesinin polimeraz zincir reaksiyonu ile çoğaltılması sonucunda oluşan bantlar M M bp 2645 bp 1605 bp 1605 bp 1198 bp 1198 bp A B M: Deoksiribonükleik asit boyut markırı Şekil 10. Echinococcus granulosus izolatlarının mitokondriyal NADH dehidrogenaz subunit 1 bölgesinin polimeraz zincir reaksiyonu tek sarmal konformasyon polimorfizmi analizi sonucunda elde edilen bantlar: A-Genotip 1 kontrol suşu (1), genotip 7 kontrol suşu (2), patern A (3,4,5,6,7) ve patern B (8), B-Genotip 1 kontrol suşu (1), patern A (2,3), patern C (4) 52

57 Deoksiribonükleik Asit Dizi Analizi Polimeraz zincir reaksiyonu - RFLP yöntemi ve PCR-SSCP yöntemi ile G1 ve G7 kontrol suşlarına ait bant paternlerinden farklı örnekler arasından rastgele seçilen 8 izolat ve kontrol suşları ile aynı paterni sergileyen örneklerden rastgele seçilen 5 izolatın mitokondriyal CO1 ve ND1 gen bölgeleri amplifiye edildi. Mitokondriyal CO1 gen bölgesinin JB3 ve JB4.5 primerleri ile çoğaltılması sonucunda yaklaşık 450 bp, mitokondriyal ND1 gen bölgesinin MS1 ve MS2 primerleri ile çoğaltılması sonucunda yaklaşık 400 bp büyüklüğünde bant elde edildi. Şekil 11 de pozitif kontrol ve örneklere ait mitokondriyal CO1 gen bölgesinin elektroforez sonrası elde edilen bant profilleri görülmektedir. Çoğaltılan ve saflaştırılan 13 izolata ait parsiyel mitokondriyal CO1 ve ND1 PCR ürünleri Refgen (Ankara, Türkiye) firmasına gönderilerek çift yönlü DNA dizi analizi yaptırıldı. Dizi analizi sonuçlarının referans dizilerle karşılaştırılması sonucunda Edirne ilinden bir izolatın (insan) G7 suşuna, diğer 12 izolatın G1 suşuna ait olduğu belirlendi. M bp 400 bp M: Deoksiribonükleik asit boyut markırı (100 bp); 1: Pozitif kontrol; 2: İnsan izolatı; 3: Sığır izolatı; 4: Koyun izolatı; 5: Negatif kontrol. Şekil 11. E. granulosus un insan, sığır ve koyun izolatlarının mitokondriyal sitokrom oksidaz c subunit 1 bölgesinin polimeraz zincir reaksiyonu ile çoğaltılması sonucunda oluşan bantlar Dizi analizi sonucunda parsiyel mitokondriyal CO1 ve ND1 gen bölgeleri birlikte değerlendirildiğinde 8 haplotipin bulunduğu tespit edildi ve Iontek (İstanbul, Türkiye) 53

58 firmasına bu haplotiplerin filogenetik analizi yaptırıldı. Örneklerimize ait parsiyel mitokondriyal CO1 ve ND1 dizileri GenBank veri tabanına kayıt edildi (Ek 4-13). Referans diziler ve çalışmamızda elde edilen haplotiplerin filogenetik analizi sonucu elde edilen dendrogram Şekil 12 de gösterilmektedir Dizi analizine gönderilen örnekler ve genotipleri Tablo 5 de; haplotipler ve GenBank erişim numaraları Tablo 6 da gösterilmektedir.. Echinococcus granulosus Genotip 1 - Genotip 3 kompleksi Genotip 6 - Genotip 10 kompleksi G: Referans diziler, H: Çalışmada elde edilen haplotiplere ait diziler Şekil 12. Referans diziler ve çalışmamızda elde edilen haplotiplerin filogenetik analizi sonucu elde edilen dendrogram 54

59 Tablo 5. Dizi analizine gönderilen örnekler ve genotipleri Analiz no İzolat no Konak PCR- RFLP paterni PCR- SSCP paterni CO1 Dizi analizi 1 4 İnsan I A G1 G1 ND1 Genotip/ Haplotip G1/H1 (195C/T) 2 5 İnsan III B G7 G7 G7/H2 (3A/G) 3 10 İnsan I C G1 G1 G1/H İnsan I A G1 (56C/T) 5 19 İnsan I A G1 (56C/T) 6 25 İnsan II A G1 (108T/C) 7 28 İnsan II A G1 (108T/C) 8 29 İnsan II A G1 (108T/C) 9 30 İnsan II A G1 (108T/C) İnsan II A G1 (108T/C) (195C/T, 288 T/C) G1 G1 (195C/T) G1 (195C/T) G1 (195C/T) G1 (195C/T) G1 (195C/T) G1 (195C/T) G1/H4 G1/H5 G1/H6 G1/H6 G1/H6 G1/H6 G1/H Sığır I A G1 G1 G1/H Koyun I A G1 (66C/T, 306G/A) Sığır I A G1 (66C/T) (195C/T) G1 (195C/T) G1 (195C/T) G1/H7 G1/H8 PCR-RFLP: Polymerase chain reaction - restriction fragment length polymorphism ; PCR-SSCP: Polymerase chain reaction - single stranded conformation polymorphism ; CO1: Sitokrom oksidaz c subunit 1; ND1: NADH dehidrogenaz subunit 1; G: Genotip; C:Sitozin; T: Timin; G: Guanin; A: Adenin; H: Haplotip. 55

60 Tablo 6. Haplotipler ve GenBank erişim numaraları Haplotip Konak (sayı) Erişim no (CO1) Erişim no (ND1) Haplotip 1 İnsan (1), sığır (1) HQ HQ Haplotip 2 İnsan (1) HQ HQ Haplotip 3 İnsan (1) HQ HQ Haplotip 4 İnsan (1) HQ HQ Haplotip 5 İnsan (1) HQ HQ Haplotip 6 İnsan (5) HQ HQ Haplotip 7 Koyun (1) HQ HQ Haplotip 8 Sığır (1) HQ HQ CO1: Sitokrom c oksidaz subunit 1; ND1: NADH dehidrogenaz subunit 1. 56

61 TARTIŞMA Echinococcus cinsi parazitler tüm dünyada oldukça yaygın olup, insanlarda ciddi zoonotik enfeksiyonlara yol açmaları nedeniyle tıbbi olarak ve halk sağlığı açısından çok önemli sestodlardır. Echinococcus cinsinin dört türü bulunmakta olup bunlardan E. granulosus türü içinde de önemli suş varyasyonları bulunmaktadır. Her bir türün kesin konağı bir etçil iken ara konak birçok memeli türünden biri olabilir. Parazitin larval döneminin neden olduğu KE ara konaklarda patojenik ve ekonomik açıdan oldukça önemlidir. Bazı türler sınırlı coğrafik dağılıma sahip olsa da Echinococcus cinsi tüm dünyada bulunur (19,20). Çalışmaya dahil edilen insanlardaki 42 hidatik kistin 20 si (%47.6) karaciğer; 19 u (%45.2) akciğer lokalizasyonlu idi. Sığırlardaki hidatik kistlerin ise 9 u (%69.2) karaciğer; 4 ü (%30.8) akciğer lokalizasyonlu idi. İnsanlarda diğer çalışmalarda (54,81,82,133) belirtildiği gibi ilk sıklıkta karaciğer lokalizasyonu, ikinci sıklıkta akciğer tutulumu olduğu görülmüştür. Sığırlarda saptanan organ lokalizasyon oranının bazı çalışmalarla uyumlu (134,135); bazı çalışmalarla (86,136) uyumsuz olduğu görülmüştür. Hidatik kistlerde fertilite E. granulosus döngüsünün stabilitesini etkileyen önemli bir faktördür. Kistler; coğrafik durum, enfekte konağın cinsi, kistlerin yeri, boyutu ve tipine göre farklı fertilite oranlarına sahip olabilirler (137). Duyarlı ara konakların çok olduğu endemik bölgelerde parazitin fertil kist üretmesi ya o bölgede bulunan suşun geniş bir konak dağılımına sahip olduğunu ya da o bölgede birden fazla suşun bulunduğunu gösterir (6). KE te protoskolekslerin canlılığının belirlenmesi çeşitli in vivo ve in vitro çalışmalarda ve ilaç deneylerinde önemlidir ( ). Manterola ve ark. (145) insanlardaki karaciğer hidatik kistlerde fertilite oranını %57.1, bu kistlerdeki protoskolekslerin canlılık oranını ise %42 olarak belirlemişlerdir. Esfandiari ve 57

62 Youssefi (146) koyunlardaki canlı protoskoleks oranını eozin boyama ile akciğerlerde %88, karaciğerde %93; trypan blue boyama ile akciğerlerde %82, karaciğerde %95 olarak saptamışlardır. Sığırlardaki canlı protoskoleks oranını ise eozin boyama ile akciğerlerde %69, karaciğerde %82, trypan blue boyama ile akciğerlerde %65, karaciğerde %76 olarak tespit etmişlerdir. Dalimi ve ark. (137) koyunlardaki canlı protoskoleks oranını akciğerlerde %25.2, karaciğerde %36.9; sığırlardaki canlı protoskoleks oranını akciğerlerde %14.1, karaciğerde %10.2 olarak saptamışlardır. Yıldırım ve ark. (147) koyunlarda karaciğerde fertil kist oranını % 30.1; kalsifiye kist oranını %35.9; kazeifiye kist oranını ise %6.8 olarak saptamışlardır. Koyunlardaki canlı protoskoleks oranını metilen mavisi ile boyama sonucu %68.8, trypan blue boyama ile %71.5, eozin boyama ile %67.1 olarak bulmuşlardır. Yaptığımız bu çalışmada insanlarda fertil kist oranı karaciğerde %95, akciğerlerde %26.3; sığırlarda fertil kist oranı karaciğerde %11.1 olarak bulundu, akciğerlerde fertil kiste rastlanmadı. Koyundan elde edilen 3 adet kistin de fertil olduğu belirlendi. Çalışmamızda; insanlarda canlı protoskoleks oranı karaciğerde %7.1 (1/14), akciğerde %40 (2/5) olarak bulunurken, koyuna ait kistlerin %100 ünün (3/3) canlı protoskoleks içerdiği tespit edildi. Çalışmamızdaki koyun hidatik kist sayısı az olmasına karşın; fertilite oranının koyunlarda sığırlara göre oldukça yüksek olarak saptanması ve akciğer lokalizasyonlu kistlerde yüksek protoskoleks canlılık oranlarının diğer çalışmalar ( ) ile uyumlu olduğu görülmüştür. İnsan kaynaklı kistlerde protoskoleks canlılık oranının Manterola ve ark. nın (145) yaptıkları çalışma ile uyumsuz olduğu belirlenmiştir. Bizdeki düşük canlılık oranı nedeninin insanlarda operasyon öncesi/sırasında ilaç kullanımı olduğunu düşünmekteyiz. Polimeraz zincir reaksiyonu restriksiyon fragman uzunluğu polimorfizmi yöntemi nükleer genomik rdna ITS1 bölgesinin boyu ve dizisini kullanarak Echinococcus izolatlarının kolay ve hızlı bir şekilde ayırt edilmesine olanak verir. Ribozomal RNA (rrna) genleri; yüksek oranda korunmuş kodlanan bölgeler ile bu bölgeler arasında nispeten zayıf olarak korunmuş kodlanmayan aralık bölgelerinin bulunduğu rdna üniteleri içinde organize olmuşlardır. Her 4-baz kesen restriksiyon enziminin yaklaşık 1 kb uzunluğundaki ITS1 bölgesini dört kez kestiği varsayılır. Yani her enzimin 16 nükleotidi incelemesi beklenir. Örneğin beş enzimin kullanıldığı bir çalışmada ITS1 fragmentinin %8 i incelenmiş olur. Farklı tür ve suş gruplarındaki örnekler analiz edilmiş ve karakteristik RFLP paternleri ortaya konmuştur. Bu yaklaşım toplanan E. granulosus izolatlarının tanımlanması ve geçiş paternlerinin araştırılmasında hızlı ve ideal bir yöntemdir (25,43,50). 58

63 Bowles ve ark. (150) Hollanda dan insan kökenli bir E. granulosus izolatında rdna ITS1 bölgesinin PCR-RFLP paternlerini incelemişler ve mitokondriyal CO1 ve ND1 bölgelerinin dizi analizini yaparak bu izolatın sığır suşu olduğunu tespit etmişlerdir. Bu suşun CO1 için %8.7 ve ND1 için %13.8 oranında koyun suşu dizisinden farklı olduğunu belirtmişlerdir. Bowles ve McManus (50) çeşitli ülkelerden topladıkları E. granulosus izolatlarını AluI, RsaI, MspI, CfoI ve TaqI restriksiyon enzimlerini kullanarak rrna ITS1 bölgesini PCR-RFLP yöntemi ile incelemişler, Türkiye den iki izolatı da koyun suşu olarak belirlemişlerdir. Yine Maravilla ve ark. (151) Meksika lı bir hastadan elde edilen kist materyalinin RAPD, PCR-RFLP ve mitokondriyal CO1 gen analizi ile identifikasyonu sonucunda sığır suşu olduğunu belirlemişlerdir. Wachira ve ark. (35) Kenya da iki farklı bölgeden topladıkları larval ve erişkin E. granulosus örneklerini PCR-RFLP yöntemi ile incelemişler, önceki çalışmalar ile uyumlu olarak bu bölgelerde E. granulosus un koyun ve deve suşlarının varlığını göstermişler, keçi ve sığırda deve suşu tespit etmişlerdir. Scott ve ark. (152) Polonya da insan ve domuzlardan elde ettikleri E. granulosus izolatlarını tanımlamak için ribozomal ITS1 bölgesini PCR-RFLP yöntemi ile incelemişler: insanlardan elde ettikleri izolatların farklı ITS1-RFLP paterni sergilediğini ve mitokondriyal ND1 dizisinde farklılıklar olduğunu tespit etmişlerdir. Bu izolatların daha önce tanımlanmamış, yeni bir genotipik grup (G9) olduklarını ifade etmişlerdir. Rosenzvit ve ark. (36) Arjantin de farklı bölge ve konaklardan topladıkları E. granulosus izolatlarını tanımlamak için RsaI, CfoI ve HpaII enzimlerini kullanarak PCR-RFLP analizi ile mitokondriyal CO1 ve ND1 gen dizilemesi yapmışlar; bu bölgelerde G1, G2, G6 ve G7 genotiplerinin bulunduğunu göstermişlerdir. Ancak PCR-RFLP yönteminin ile G1 ve G2 genotipleri ile G6 ve G7 genotipleri arasındaki ayırımı göstermediğini tespit etmişlerdir. Bu çalışma ile ilk kez insanda G2 ve G6 genotiplerinin varlığını rapor etmişlerdir. Zhang ve ark. (153) İran da insan, koyun, keçi, sığır ve develerden topladıkları E. granulosus izolatlarının mitokondriyal CO1 ve ND1 gen bölgelerinin dizi analizini; BfaI enzimi kullanılarak mitokondriyal ND1 bölgesinin PCR-RFLP analizini yapmışlardır. Sonuçta deve izolatlarının G6, diğer izolatların G1 genotipinde olduklarını saptamışlardır. Harandi ve ark. nın (33) İran da farklı coğrafik bölgelerden topladıkları insan, koyun, sığır ve deve kökenli E. granulosus izolatlarını AluI, HhaI, MspI, RsaI ve TaqI enzimlerini kullandıklarak PCR-RFLP yöntemi ile incelemişler; insanlarda deve suşunun varlığını göstermişlerdir. İran ın Tebriz bölgesinde kesimhanelerden toplanan koyun ve sığır hidatik kistleri ile hastanelerden elde edilen insan izolatlarının ITS1 fragmentleri RsaI ve HpaII enzimleri ile 59

64 kesime uğratılmıştır. Tüm izolatlarda benzer olarak, RsaI ile kesim sonucunda yaklaşık 600 bp ve 300 bp uzunluğunda iki bant; HpaII ile kesim sonucunda yaklaşık 600 bp ve 200 bp uzunluğunda bantlar elde edilmiştir. İzolatların tamamının E. granulosus un o bölgede baskın genotipi olan koyun suşu olabileceği belirtilmiştir (154). Shartbatkhori ve ark. (155) İran da koyun, keçi, sığır ve develerden elde ettikleri 112 E. granulosus izolatını AluI enzimini kullanarak PCR-RFLP yöntemi ile incelemişler; 106 izolatı G1, 6 izolatı G6 olarak belirlemişlerdir. İran da yapılan başka bir çalışmada; insan, koyun ve develerden elde edilen E. granulosus izolatlarının ITS1 bölgesinin AluI, HpaII, RsaI ve TaqI enzimleri ile kesimi sonucunda, insan ve koyun kökenli izolatlar ile deve kökenli izolatların farklı RFLP paternleri sergiledikleri gözlenmiştir (34). Lavikainen ve ark. (130) Finlandiya nın kuzeydoğusunda dört ren geyiği ve bir fareden topladıkları beş E. granulosus izolatının rdna ITS1 bölgesi ile mitokondriyal CO1 ve ND1 bölgelerinin dizi analizi sonucunda Fennoscandian geyik suşu olarak isimlendirilen yeni bir genotip tanımlamışlardır. Dinkel ve ark. (45) Kenya ve Sudan da insan, deve, koyun, keçi, domuz, sığırlardan ve elde ettikleri E. granulosus izolatlarını PCR, PCR-RFLP ve dizi analizi yöntemleriyle incelemişlerdir. Analizler sonucunda insanlarda, develerde ve koyunlarda G1 ve G6, keçilerde G6, domuzlarda G1, G6 ve E. ortleppi (G5), sığırlarda G6 genotipi ve E. ortleppi tespit edilmiştir. Bu çalışma ile Afrika nın doğusundaki insanlarda ilk kez deve suşu (G6) ile enfeksiyon belirlenmiş, Kenya ve Sudan daki çiftlik hayvanlarında ilk kez E. ortleppi rapor edilmiştir. M rad ve ark. (156) Tunus ta insan, sığır, koyun ve develerden elde ettikleri fertil kist materyallerinin rdna ITS1 bölgesini PCR-RFLP yöntemi ile incelemişlerdir. CfoI ve HpaII ile kesim sonrasında deve izolatlarında G6, diğer izolatlarda G1 paternini gözlemlemişlerdir. G1 paterni sergileyen izolatların mitokondriyal CO1 bölgesinin dizi analizi sonucunda bazı izolatlarda C56T, T123C, G312A veya T204G mutasyon varlığını tespit etmişlerdir. Varsacia ve ark (157) Sardunya da koyun, sığır ve domuzlardan elde ettiği E. granulosus izolatlarını PCR, PCR-RFLP ve mitokondriyal CO1 ve ND1 dizi analizi yöntemleri ile incelemişlerdir. PCR ile domuz izolatlarından 2 sinin G6/7, 89 izolatın G1; PCR-RFLP ve dizi analizi ile de 2 izolatın G7, diğerlerinin G1 genotipinde olduğunu saptamışlardır. Utuk ve ark. (10) yaptığı Elazığ, Malatya, Erzurum, Van, Diyarbakır ve Şanlıurfa illerinden toplanan 179 koyun, 19 sığır, 7 keçi, 1 deve, 1 köpek ve 1 insan izolatını içeren bir çalışma yapmışlardır. Bu çalışmada sığır, koyun ve keçi izolatları CfoI, MspI, RsaI ve AluI restriksiyon enzimlerinin kullanıldığı PCR-RFLP yöntemleri ile incelenmiş, tüm izolatlar benzer paternleri sergilemiştir. Rastgele seçilen 6 sığır, 4 koyun, 4 keçi ve 1 deve, 1 köpek, 1 60

65 insan izolatının mitokondriyal CO1 gen bölgesinin dizi analizi sonucunda 17 izolat da E. granulosus un G1 suşu olarak identifiye edilmiştir. Çalışmamızda 42 insan, 13 sığır ve 3 koyun izolatının rdna ITS1 gen bölgesi HhaI, MspI, RsaI ve AluI restriksiyon enzimleri kullanılarak PCR-RFLP yöntemi ile incelenmiştir. Yapılan analizler sonucunda G1 kontrol suşundan farklı 2 patern (patern II ve patern III) gözlenmiştir. Buna göre; 47 izolatın G1 kontrol suşu (patern I) ile aynı bant paternine sahip olduğu, pozitif kontrolden farklı olduğu gözlenen 10 izolatın patern II yi; 1 adet izolatın ise patern III ü sergilediği belirlendi. Farklı patern sergileyen örneklerin parsiyel mitokondriyal CO1 ve ND1 gen bölgelerinin dizi analizi sonucunda; patern II nin G1, patern III ün G7 suşuna ait olduğu tespit edildi. Çalışmamızın diğer çalışmalar gibi (33,35,50,150,152,155,156) E. granulosus genotiplerini ayırabildiği gözlemlendi. Tek zincir konformasyon polimorfizmi DNA fragmentlerinde dizi benzerliği olup olmadığını taramak için basit, ucuz ve duyarlı ve ihtiyaç duyulan dizileme miktarını önemli oranda azaltabilen bir yöntemdir (158). SSCP özel donanım gerektirmeyen, uygulaması nispeten kolay, radyoaktif olmayan mutasyon tarama yöntemlerine uygun ve çeşitli elektroforetik şartlara uyum sağlayabilen bir tekniktir. Bu yöntemin en önemli dezavantajı deneyim gerektiren bir teknik olmasıdır. Çok sayıda bant içeren jellerin yorumlanması zor olabilir. Sonuçta, SSCP mutasyonların hemen hemen %100 ünü saptayabilir fakat çeşitli elektroforetik şartlara gereksinim duyabilir (122). Gasser ve ark. (58) E. granulosus un G1, G4, G6, G8 genotipleri ile E. multilocularis, E. oligarthrus ve E. vogeli genotiplerini kullanarak enzimatik olarak çoğalttıkları mitokondriyal CO1 ve ND1 bölgelerinin SSCP analizini geliştirmişlerdir. Bu çalışma sonucunda, DNA dizileme veya restriksiyon analizlerine gerek duyulmadan Echinococcus un mitokondriyal DNA dizi varyasyonlarının direkt olarak gösterilmesinde SSCP nin yararlı olduğunu göstermişlerdir. Zhang ve ark. (159) Arjantin ve Çin den insan, domuz, koyun, deve ve yaklardan topladıkları E. granulosus izolatlarının CO1 ve ND1 fragmentlerini SSCP yöntemi ile incelemiş, farklı patern gösteren izolatların dizi analizini yapmış ve sonuçta G1, G2, G6, G7 genotiplerini tespit etmiştir. Sharbatkhori ve ark. (127) İran daki çeşitli ara konaklardan topladıkları E. granulosus izolatlarının mitokondriyal CO1 ve ND1 gen bölgelerini kullanarak PCR temelli SSCP analizi ile bu izolatların karakterizasyonu ve genetik ilişkilerini incelemişlerdir. PCR-SSCP analizinde elektroforetik profillerine göre parsiyel mitokondriyal CO1 gen bölgesi için 5, parsiyel mitokondriyal ND1 gen bölgesi için 9 farklı profil gözlemlemişler ve her bir profili sergileyen birer amplikonun dizi analizini yapmışlardır. Dizi analizi sonucunda 148 örneğin 61

66 142 sinin E. granulosus un G1-G3 kompleksi (E. granulosus sensu stricto), 6 sının G6-G10 kompleksi (E. canadensis) ne ait olduğunu tespit etmişler; PCR-SSCP nin tek nokta mutasyonlarını kolayca saptayabildiğini belirtmişlerdir. Abushhewa ve ark. (160) Libya da insan, sığır ve develerden elde ettikleri toplam 176 izolatın mitokondriyal CO1 ve ND1 gen bölgelerini PCR-SSCP yöntemi ile incelemişler; her iki bölge için 4 er farklı elektroforetik patern saptamışlardır. Jabbar ve ark. (161) Moğolistan da insanlardan elde ettikleri 50 hidatik kist materyalinin mitokondriyal CO1 ve ND1 gen bölgelerini PCR-SSCP yöntemi ile incelemişler; her iki bölge için 4 er farklı elektroforetik patern saptamışlardır. Çalışmamızda; izolatların mitokondriyal ND1 gen bölgesinin PCR-SSCP analizi yapılarak G1 ve G7 kontrol suşları ile karşılaştırıldı ve üç farklı bant paterni tespit edildi. İzolatların 56 sı patern A yı (G1 kontrol suşu ile uyumlu), 1 i patern B yi (G7 kontrol suşu ile uyumlu), 1 i patern C yi sergiledi. Farklı patern sergileyen örneklerin parsiyel mitokondriyal CO1 ve ND1 gen bölgelerinin dizi analizi sonucunda; patern B nin G7, patern C nin G1 suşuna ait olduğu tespit edildi. Organizmalar arasında belirli DNA segmentlerinin nükleotid dizilerinin karşılaştırması genetik varyasyonun saptanmasında en direkt ve duyarlı araçtır. Mitokondriyal DNA; nisbeten hızlı gelişim oranı nedeniyle yakın ilişkili organizmaların ayrımı için kullanışlıdır. Ayrıca mitokondriyal DNA maternal geçişli olduğundan ve rekombine olmadığından analizi daha basittir (162). Özellikle mitokondriyal protein kodlayan genler CO1 ve ND1 E. granulosus suş identifikasyonu için çok değerlidir. (43). Genel olarak, ND1 geni CO1 geninden daha değişkendir. Echinococcus türleri arasındaki ND1 gen dizi farklılığı % ; suşlar arasında % dur. Echinococcus türleri arasındaki CO1 gen dizi farklılığı % ; suşlar arasında % tür (131). Mitokondriyal CO1 ve ND1 veri setlerinin bağımsız ve birlikte analizi E. granulosus un çeşitli suşlarının bir monofilektik gruptan oluşmadığını göstermektedir. Mitokondriyal CO1 ve ND1 verileri çeşitli grupları değerlendirmede tek başına yeterli olmayıp nükleer ITS1 bölgesinden de veriler elde edilmelidir (25). Günümüzde Echinococcus popülasyonlarının filogenetik analizi için mitokondriyal DNA CO1, ND1 ve adenozin trifosfat 6 (ATP6) genleri ile nükleer rdna ITS1 genleri kullanılmaktadır (41). Bowles ve ark. (126) 56 Echinococcus izolatının mitokondriyal CO1 gen bölgesini dizileyerek 4 Echinococcus türünün net bir şekilde ayırımını yapıp E. granulosus içinde 7, E. multilocularis içinde 2 genotip saptamışlardır. Santivanez ve ark. (163) Peru da suş ayırımını yapmak amacıyla 21 insan materyali toplamışlar, 20 örneğin mitokondriyal CO1 gen bölgesini çoğaltıp dizi analizi yapmışlardır. Analiz sonucunda 19 izolatın G1, 1 izolatın G6 suşu 62

67 olduğunu belirlemişlerdir. Güney Brezilya da 28 sığır ve 12 koyundan elde edilen E. granulosus izolatı PCR ile G1 ve G5 olarak tespit edilmiş, ardından doğrulama amacıyla parsiyel mitokondriyal CO1 dizi analizi yapılmıştır. Analizler sonucunda 38 izolat G1, 2 sığır izolatı G5 olarak bulunmuştur (164). Latif ve ark. (30) Pakistan da insan ve çiftlik hayvanlarından elde ettikleri kist materyallerinin CO1 gen bölgesini dizileyerek filogenetik analizini yapmışlardır. Bu analizler sonucunda çiftlik hayvanlarında G1 ve G3, iki insan örneğinde ise G1 suşu tespit edilmiştir. Bhattacharya ve ark. (165) Hindistan da koyun, sığır ve manda izolatlarını içeren; ITS1 ile mitokondriyal CO1 ve ND1 gen bölgelerinin dizi analizinin yapıldığı çalışmada E. granulosus un G2 genotipini manda ve koyunlarda tespit etmişlerdir. Bu çalışma, mandada G2 genotipinin varlığını gösteren ilk rapordur. Bir başka çalışmada Bart ve ark. (37) mitokondriyal CO1 bölgesi dizi analizi sonucunda Çin de ilk kez hastalarda G6 genotipini saptamışlardır. Lavikainen ve ark. (166) Finlandiya ve İsveç teki 33 geyik izolatı (ren geyiği ve mus) mitokondriyal ND1 gen dizi analizi ile karakterize edilmiştir. Buna ek olarak mitokondriyal ATP6, ND1, ND3 ve CO1 genleri kullanılarak E. granulosus suşlarının filogenetik analizi yapılmıştır. Filogenetik analizde G6, G7, G8 ve G10 suşları bir monofiletik grupta kümelenmiş; G1 ve G4 suşlarından net bir şekilde ayrılmış; G5 suşu ile yakın ilişkili bulunmuştur. Bu sonuçlar G6-10 genotiplerinin E. granulosus sensu stricto türlerinden ayrı olduğunu belirten önceki çalışmaları desteklemektedir. Capuano ve ark. (31) İtalya nın güney kesiminde 48 mandadan elde edilen hidatik kist materyalinin mitokondriyal CO1 gen bölgesinin dizi analizini yapmışlar; 33 örneği evcil koyun suşu (G1), 15 izolatı manda suşu (G3) olarak tespit etmişlerdir. Bart ve ark. (28) nükleer BG1/3 ile mitokondriyal CO1 ve ND1 gen bölgelerinin dizi analizi sonucunda Romanya nın çeşitli bölgelerinden topladıkları E. granulosus izolatlarının G1, G2 ve G7 genotipinde olduğunu belirlemişlerdir. Bu çalışma ile ilk kez sığırda Tazmanya koyun suşunun varlığı tespit edilmiştir. Varsacia ve ark. (32) Yunanistan da 20 koyun ve 20 keçiden topladıkları hidatik kist materyallerinin G1, G5 ve G6/G7 suş ayırımı için PCR/ seminested PCR uygulamışlar; özgül moleküler tanı için ise mitokondriyal CO1 ve ND1 gen bölgesini çoğaltıp dizi analizi yapmışlardır. Analizler sonucunda 18 koyunun G1, 2 koyunun G3 ve keçilerin tamamının G7 suşu ile enfekte olduğu tespit edilmiştir. Breyer ve ark. (167) Bulgaristan da sığır, koyun, domuz, çakal ve kurtlardan elde edilen 24 E. granulosus izolatının nükleer ActII ve AgB1 gen bölgeleri ile mitokondriyal ND1 ve Hbx2 gen bölgelerinin dizi analizi sonucunda izolatların 63

68 tamamının G1 genotipinde olduğunu belirlemişlerdir. Mitokondriyal ND1 dizi analizi sonucunda domuz izolatlarında 376. pozisyonda T/C baz değişimi saptanmasına karşın bu veri epidemiyolojik açıdan önemli kabul edilmemiştir. Vural ve ark nın (9) yapmış olduğu çalışmada Afyon, Ardahan, Erzurum, Siirt, Tekirdağ, Yozgat ve Kars illerinden toplanan 100 koyun ve 12 sığırdan elde edilen E. granulosus izolatlarının CO1 gen bölgesinin dizi analizi sonucunda örneklerin 107 si G1, 5 i G3 olarak belirlenmiştir. Simsek ve Eroksuz (168) Anadolu yaban koyununda (Ovis gmelinii anatolica) kist materyalinin moleküler yapısını belirlemek amacıyla mitokondriyal CO1 gen bölgesini çoğaltmışlar ve dizi analizi yapmışlar, G1 suşu olduğunu tespit etmişlerdir. Bu çalışma Anadolu yaban koyununda E. granulosus un varlığı ve moleküler karakterizasyonu için ilk rapordur. Snabel ve ark. (12) tarafından; İzmir, Manisa, Denizli ve Uşak illerinden, 12 koyun ve 10 insan izolatının çeşitli gen bölgelerinin (cox1 uzun ve kısa fragmentler, atp6, nad1, rrns) dizi analizi yapılmıştır. Bu çalışmada 2 koyun izolatı ile 1 insan izolatının G7, 1 koyun izolatının G3, bir koyun izolatının G1 ve G3 referans dizileri arasında ara diziye sahip olduğu, diğer izolatların G1 suşu olduğunu belirlemişlerdir. Böylelikle Türkiye de ilk kez G7 suşu rapor edilmiştir. Ergin ve ark. (11) 46 hastadan elde ettikleri E. granulosus izolatının mitokondriyal CO1 gen bölgesinin dizi analizi sonucunda örneklerin tamamının G1 genotipinde olduğu belirlenmiştir. Sharbatkhori ve ark. (127) İran da çalıştıkları 148 izolatta; parsiyel mitokondriyal CO1 ve ND1 gen bölgesi dizi analizi sonucunda, her iki gen bölgesini birlikte değerlendirilerek 12 haplotip belirlemişlerdir. Referans diziler ile birlikte yapılan filogenetik analizde 142 izolatın dahil olduğu haplotip 1-11 in genotip G1-G3 ü (G1-G3 kompleksi = E. granulosus sensu stricto) sergilediği; 6 izolatın dahil olduğu haplotip 12 nin G6 genotipini (G6-G10 kompleksi = E. canadensis) sergilediği tespit edilmiştir. Abushhewa ve ark. (160) Libya da insan, sığır ve develerden elde ettikleri toplam izolatların Parsiyel mitokondriyal CO1 ve ND1 dizi analizi sonucunda 5 haplotip (haplotip A- E) belirlenmiş; bu haplotipleri ve referans dizileri içeren filogenetik analiz sonucunda ise haplotip A-D nin G1-G3 kompleksine, haplotip A nın G6-G10 kompleksine ait olduğu tespit edilmiştir. Buna göre 55 insan izolatının tamamı ve 38 sığır izolatının %13 ü G1-G3 kompleksine, 83 deve izolatının tamamı ve kalan sığır izolatlarının G6-G10 kompleksine ait olduğu saptanmıştır. Jabbar ve ark. (161) Moğolistan da insanlardan elde ettikleri hidatik kist materyallerinin mitokondriyal CO1 ve ND1 gen bölgeleri için PCR-SSCP yönteminde 64

69 saptadıkları farklı paterni sergileyen örneklerin aynı bölgelerine dizi analizi yapmışlar; bunun sonucunda 4 ayrı haplotip belirlemişlerdir. Parsiyel mitokondriyal CO1 ve ND1 dizilerinin birlikte değerlendirildiği, referans dizileri de içeren filogenetik analizde izolatların %68 inin E. granulosus un G1-G3 kompleksine; %32 sinin G6-G10 kompleksine ait olduğunu saptamışlardır. Çalışmamızda 42 insan, 13 sığır ve 3 koyun izolatının rdna ITS1 gen bölgelerinin PCR-RFLP analizi ve mitokondriyal ND1 gen bölgelerinin PCR-SSCP analizi yapılmış; her iki yöntemde de 3 farklı elektroforetik patern saptanmıştır. Her bir paterni sergileyen izolatlar arasından seçilen ve aynı paterni sergileyen izolatlar arasından rastgele seçilen toplam 13 izolatın mitokondriyal CO1 ve ND1 gen bölgelerine dizi analizi yaptırılmıştır. Dizi analizi sonucunda 8 haplotip saptanmış; insandan elde edilen bir izolat G7, insanlardan elde edilen 9 izolat, sığırlardan elde edilen 2 izolat ve koyunlardan elde edilen 1 izolat G1 genotipi olarak belirlenmiştir. Haplotipleri ve referans dizileri içeren filogenetik analiz sonucunda haplotip 1 ve 3-8 in E. granulosus un G1-G3 kompleksine; haplotip 2 nin G6-G10 kompleksine ait olduğu belirlenmiştir. Parsiyel mitokondriyal CO1 dizi verilerini değerlendirildiğinde; insan izolatlarımızda saptadığımız 56. pozisyonda C/T değişiminin GenBank ta bulunan ve aralarında Türkiye izolatlarının da bulunduğu birçok dizide (HM598459, HM563013, AB gibi) olduğu görülmüştür. Sığır izolatında saptadığımız 66. pozisyonda C/T değişimi de daha önce tanımlanmıştır (HM130578, AB491456, DQ gibi). İnsan izolatlarımızda saptadığımız 108. pozisyonda T/C değişimi de daha önce Avustralya da koyun izolatında (AJ508005) rapor edilmiştir. Koyun izolatımızda saptadığımız 66C/T ve 306G/A değişimlerinin birlikte bulunduğu diziye GenBank ta rastlanmazken, sadece 306G/A mutasyonu olan bir insan izolatının (AJ508024) Obwaller ve ark. (169) tarafından tanımlandığı görülmüştür. Parsiyel mitokondriyal ND1 dizi verilerini değerlendirildiğinde; insan, koyun ve sığır izolatlerımızda belirlediğimiz 195. pozisyonda C/T değişiminin daha önce birçok izolatta (HM853645, HM563026, EU gibi) saptandığı belirlenmiştir. Bir insan izolatında saptadığımız 195 C/T ve 288 T/C değişimleri birlikteliğinin de daha önce tanımlanmış olduğu (FJ796212) görülmüştür. G7 genotipi olarak saptadığımız bir insan izolatında 3. pozisyonda referans G7 dizisinden farklı olarak guanin bulunduğu saptanmıştır. GenBank ta bu değişimi (3A/G) içeren G7 genotipi dizisine rastlanılmamıştır. Çalışmamızdaki moleküler analizler sonucunda Trakya bölgesinde hakim E. granulosus genotipinin G1 olduğu ve bu bölgede G7 genotipinin de bulunduğu gösterilmiştir. 65

70 Evcil koyun suşu tüm dünyada en yaygın olarak bulunan suş olup, domuz suşu özellikle Orta ve Doğu Avrupa ile Güney Amerika da bulunmaktadır (26,38-40,170,171). Çalışmamızın sonuçlarının Türkiye de E. granulosus un evcil koyun suşunun baskın genotip olduğunu belirten çalışmalar (9,10,12) ile uyumlu olduğu gözlenmiştir. Türkiye de domuz suşunun varlığı ilk kez Snabel ve ark. (12) tarafından İzmir de insan ve koyunlarda rapor edilmiştir. Snabel ve ark. (12) İzmir de saptamış oldukları domuz suşu izolatlarının 2003 yılında ara konaklardan elde edildiğini, 2004 yılında İzmir de ortaya çıkan trişinelloz salgını sonrasında alınan tedbirler nedeniyle bu tarihten sonra toplanan kist materyallerinde domuz suşuna rastlamamış olabileceklerini belirtmişlerdir. Çalışmamızda Edirne ilinde yaşayan bir insanda tespit ettiğimiz domuz suşu Trakya bölgesi için ilk olma özelliğini taşımaktadır. Echinococcus suşları arasındaki gelişimsel farklılıklar KE nin kontrol çalışmalarını etkilemektedir. Özellikle bazı suşlarda yumurta üretim süresindeki değişkenlikler (G1 genotipinin köpeklerdeki prepatent periyodu yaklaşık 45 gün iken G7 suşu için bu süre ortalama 34 gündür) nedeniyle genotiplerin saptanması kontrol programlarında önem kazanmaktadır (6,7,153). Verilerimizin ülkemizde KE nin kontrol çalışmalarına destek olacağına inanıyoruz. Sonuç olarak; yapılan bu çalışmada E. granulosus un çeşitli ara konaklarından elde edilen hidatik kist materyali PCR-RFLP, PCR-SSCP ve dizi analizi yöntemleri ile incelenerek Trakya bölgesindeki genotip çeşitliliği araştırılmıştır. Araştırma sonucunda Trakya bölgesinde yaygın genotipin evcil koyun suşu olduğu belirlenmiş ve bu bölgede ilk kez domuz suşu saptanmıştır. Bu saptama önemli bir halk sağlığı sorunu olan KE nin kontrolü için bölgemizde alınacak önlemlerin kapsamı ve yöntemi konusunda yönlendirici bir veridir. Ülkemizde KE nin kontrol altına alınabilmesi için; belirli aralıklarla, geniş kapsamlı olarak epidemiyolojik/moleküler çalışmaların yapılması ve eradikasyon programlarının uygulanması yerinde bir yaklaşım olacaktır. 66

71 SONUÇLAR ile tarihleri arasında, Trakya Üniversitesi Sağlık Araştırma ve Uygulama Merkezi, Edirne Devlet Hastanesi ve Edirne Selimiye Devlet Hastanesi nde opere edilen veya PAIR işlemi uygulanan hastalardan 42, Edirne Belediye Mezbahası nda kesim yapılan hayvanlardan 16 olmak üzere toplam 58 hidatik kist materyali Trakya bölgesindeki E. granulosus un genotip çeşitliliğini araştırmak amacıyla çalışmaya alındı. Bu kist materyallerinden DNA izole edildi ve rdna ITS1 gen bölgesi kullanılarak PCR-RFLP, mitokondriyal ND1 gen bölgesi kullanılarak PCR-SSCP yöntemleri çalışıldı. Seçilen örneklere mitokondriyal ND1 ve CO1 gen bölgelerinin dizi analizi yaptırıldı. Çalışmada elde edilen sonuçlar aşağıda belirtilmiştir: 1. Polimeraz zincir reaksiyonu-rflp ve PCR-SSCP yöntemleri E. granulosus da suş ayırımını yapabilmektedir. 2. Suş içi mutasyonların tanımlanabilmesi için dizi analizi yöntemi kullanılmalıdır. 3. Trakya bölgesinde E. granulosus un hakim suşu evcil koyun suşu olmakla birlikte domuz suşuna da rastlanılmıştır. 4. Trakya bölgesinde KE nin kontrol altına alınabilmesi için gerekli önlemler alınırken E. granulosus un evcil koyun suşu ve domuz suşunun biyolojik ve gelişimsel özellikleri dikkate alınmalıdır. 5. Kistik ekinokokkozisin kontrolü için Trakya bölgesinde koyun/sığır-köpek ve domuz-köpek döngüsü kırılmalıdır. 67

72 ÖZET Echinococcus granulosus insanlarda ve birçok evcil hayvanda kistik ekinokokkozis etkenidir ve dünyada geniş bir dağılıma sahiptir. Kistik ekinokokkozis Türkiye de hala önemli bir sağlık sorunudur. Bu çalışmanın amacı; Türkiye de Trakya bölgesindeki insanlardan ve çiftlik hayvanlarından elde edilen E. granulosus izolatlarının genotiplendirilmesidir. Ocak 2009 Aralık 2009 tarihleri arasında Edirne de bulunan çeşitli hastanelerde cerrahi operasyon uygulanan ve kesimhanedeki hayvanlardan toplam 58 izolat elde edildi. E. granulosus un insan ve hayvan izolatlarını karakterize etmek için ribozomal birinci internal transcribed spacer fragmanının polimeraz zincir reaksiyonu - restriksiyon fragman uzunluğu polimorfizmi analizi ve parsiyel mitokondriyal NADH dehidrogenaz subunit 1 geninin polimeraz zincir reaksiyonu - tek sarmal konformasyon polimorfizmi yöntemi kullanıldı. Yapılan analizler E. granulosus izolatları içinde üç farklı genotip olabileceğini gösterdi. İzolatların genetik karakteristiklerinin ileri incelemeleri için mitokondriyal sitokrom oksidaz c subunit 1 ve NADH dehidrogenaz subunit 1 gen bölgelerinin dizi analizi kullanıldı. Sonuçlar G1 (evcil koyun suşu) ve G7 (domuz suşu) olmak üzere iki farklı genotip bulunduğunu gösterdi. Mevcut çalışma Türkiye nin Trakya bölgesinde E. granulosus un evcil koyun suşunun baskın genotip olduğunu göstermektedir. Yapılan çalışma bu bölgede domuz suşunun bulunduğunu gösteren ilk rapordur. Bu bilgi bu bölge ve çevre ülkelerde hayvanlardaki parazitlerin epidemiyolojisi ve ekolojisi ile ilgili ileri çalışmalar açısından oldukça önemlidir. Anahtar kelimeler: Echinococcus granulosus, Trakya, Türkiye, genotipleme 68

73 GENOTYPING OF ECHINOCOCCUS GRANULOSUS ISOLATES SUMMARY Echinococcus granulosus is the causative agent of cystic echinococcosis in human and many domestic animals, and has a widely distribution in the world. Cystic echinococcosis is still an important health problem in Turkey. The aim of this study is genotyping the isolates of E. granulosus obtained from human and livestock animals in Thrace region of Turkey. A total of 58 isolates were obtained from the patients who underwent surgery at several hospitals and from the animals in slaughterhouse in Edirne, between January 2009 and December Polymerase chain reaction - restriction fragment length polymorphism analysis of ribosomal internal transcribed spacer 1 fragment and polymerase chain reaction - based single strand conformation polymorphism of partial mitochondrial NADH dehydrogenase subunit 1 gene were used to characterize E. granulosus in human and animal isolates. The analysis revealed that there are three possible genotypes within E. granulosus isolates. To investigate the further genetic characteristics of isolates, deoxyribonucleic acid sequencing of mitochondrial cytochrome c oxidase subunit 1 and NADH dehydrogenase subunit 1 genes were used. The results indicated that there are two distinct genotypes, G1 (domestic sheep strain) and G7 (pig strain) in isolates. The present study revealed that domestic sheep strain is the most common genotype in Thrace region of Turkey. This is the first report indicating that E. granulosus pig strain is present in human in this region. This knowledge is quite important for future studies on the 69

74 epidemiology and ecology of the parasites in animals and humans in this region and surrounding countries. Key words: Echinococcus granulosus, Thrace, Turkey, genotyping 70

75 KAYNAKLAR 1. Soulsby EJL. Helminths, arthropods and of domesticated animals. 7 th ed. London: Bailliere Tindall, 1986: Eckert J, Deplazes P. Biological, epidemiological, and clinical aspects of Echinococcosis, a zoonosis of increasing concern. Clin Microbiol Rev 2004;17(1): Eckert J, Schantz PM, Gasser RB, Torgerson PR, Bessonov AS, Movsessian SO et al. Geographic distribution and prevalence. In: Eckert J, Gemmell MA, Meslin F.-X, Pawlowski ZS (Eds.). WHO/OIE manual on Echinococcosis in humans and animals: a public health problem of global concern. Paris: World organisation for animal health; 2001.p Özbilgin A, Kilimcioğlu AA. Kistik echinococcosis. Özcel MA (Editör). Özcel in tıbbi parazit hastalıkları nda. İzmir: Türkiye Parazitoloji Derneği; 2007.s Yazar S, Taylan Özkan A, Hökelek M, Polat E, Yılmaz H, Özbilge H et al. Türkiye de yılları arasında kistik ekinokokkozis. Turkiye Parazitol Derg 2008;32(3): Thompson RCA, Lymbery AJ. The nature, extent and significance of variation within the genus Echinococcus. Adv Parasitol 1988;27: Thompson RCA. Biology and systematics of Echinococcus. In: Thompson RCA, Lymbery AJ (Eds.). Echinococcus and hydatid disease. Wallingford: CAB International; 1995.p McManus DP, Le TH, Blair D. Genomics of parasitic flatworms. Int J Parasitol 2004;34(2): Vural G, Unsal Baca A, Gauci CG, Bagci O, Gicik Y, Lightowlers MW. Variability in the Echinococcus granulosus cytochrome c oxidase 1 mitochondrial gene sequence 71

76 from livestock in Turkey and a re-appraisal of the G1-3 genotype cluster. Vet Parasitol 2008;154(3-4): Utuk AE, Simsek S, Koroglu E, McManus DP. Molecular genetic characterization of different isolates of Echinococcus granulosus in east and southeast regions of Turkey. Acta Trop 2008;107(2): Ergin S, Saribas S, Yuksel P, Zengin K, Midilli K, Adas G et al. Genotypic characterisation of Echinococcus granulosus isolated from human in Turkey. Afr J Microbiol Res 2010;4(7): Snabel V, Altintas N, D Amelio S, Nakao M, Romig T, Yolasigmaz A et al. Cystic echinococcosis in Turkey: genetic variability and first record of the pig strain (G7) in the country. Parasitol Res 2009;105(1): Flisser A. Larval Cestodes. In: Collier L, Balows A, Sussman M (Eds.). Topley and Wilson s microbiology and microbial infections vol.5, London: Arnold;1998;ch.28, Thompson RCA, McManus DP. Aetiology: parasites and life-cycles. In: Eckert J, Gemmell MA, Meslin F.-X, Pawlowski ZS (Eds.). WHO/OIE manual on Echinococcosis in humans and animals: a public health problem of global concern. Paris: World organisation for animal health; 2001.p Thompson RCA, McManus DP. Towards a taxonomic revision of the genus Echinococcus. Trends Parasitol 2002;18(10): Markell EK, John DT, Krotoski WA. Markell and Voge s medical parasitology. 8 th ed. Philadelphia: W.B. Saunders Co, 1999: McGreevy PB, Nelson GS. Larval cestode infections. In: Strickland GT (Ed.). Hunter s tropical medicine. 7 th ed. Philadelphia: W.B. Saunders Co; 1991.p Torgerson PR, Budke CM. Echinococcosis an international public health challenge. Res Vet Sci 2003;74(3): McManus DP, Zhang W, Li J, Bartley PB. Echinococcosis. Lancet 2003;362(9392): Gottstein B, Reichen J. Echinococcosis/Hydatidosis. In: Cook GC (Ed.). Manson s Tropical Diseases. 20 th ed. London: WB Saunders Co;1996.p Merdivenci A. Türkiye de hidatik kist hastalığı. İstanbul: İstanbul Üniversitesi Cerrahpaşa Tıp Fakültesi, 1976:

77 24. Merdivenci A, Aydınlıoğlu K. Hidatidoz (Hidatik kist hastalığı). İstanbul: İstanbul Üniversitesi Cerrahpaşa Tıp Fakültesi, 1982: Bowles J, McManus DP. Molecular variation in Echinococcus. Acta Trop 1993;53(3-4): Eckert J, Thompson RCA. Intraspesifik variation of Echinococcus granulosus and related species with emphasis on their infectivity to humans. Acta Trop 1997;64(1-2): Eckert J, Thompson RCA. Echinococcus strains in Europe: a review. Trop Med Parasitol 1988;39(1): Bart JM, Morariu S, Knapp J, Ilie MS, Pitulescu M, Anghel A et al. Genetic typing of Echinococcus granulosus in Romania. Parasitol Res 2006;98(2): Maillard S, Benchikh-Elfegoun MC, Knapp J, Bart JM, Koskei P, Gottstein B et al. Taxonomic position and geographical distribution of the common sheep G1 and camel G6 strains of Echinococcus granulosus in three African countries. Parasitol Res 2007;100(3): Latif AA, Tanveer A, Maqbool A, Siddiqi N, Kyaw-Tanner M, Traub RJ. Morphological and molecular characterisation of Echinococcus granulosus in livestock and humans in Punjab, Pakistan. Vet Parasitol 2010;170(1-2): Capuano F, Rinaldi L, Maurelli MP, Perugini AG, Veneziano V, Garippa G et al. Cystic echinococcocosis in water buffaloes: Epidemiological survey and molecular evidence of ovine (G1) and buffalo (G3) strains. Vet Parasitol 2006;137(3-4): Varcasia A, Canu S, Kogkos A, Pipia AP, Scala A, Garippa G et al. Molecular characterization of Echinococcus granulosus in sheep and goats of Peloponnesus, Greece. Parasitol Res 2007;101(4): Harandi MF, Hobbs RP, Adams PJ, Mobedi I, Morgan-Ryan UM, Thompson RCA. Molecular and morphological characterization of Echinococcus granulosus of human and animal origin in Iran. Parasitology 2002;125(4): Ahmadi N, Dalimi A. Characterization of Echinococcus granulosus isolates from human, sheep and camel in Iran. Infect Genet Evol 2006;6(2): Wachira TM, Bowles J, Zeyhle E, McManus DP. Molecular examination of the sympatry and distribution of sheep and camel strains of Echinococcus granulosus in Kenya. Am J Trop Med Hyg 1993;48(4): Rosenzvit MC, Zhang LH, Kamenetzky L, Canova SG, Guarnera EA, McManus DP. Genetic variation and epidemiology of Echinococcus granulosus in Argentina. Parasitology 1999;118(5): Bart JM, Abdukader M, Zhang YL, Lin RY, Wang YH, Nakao M et al. Genotyping of human cystic echinococcosis in Xinjiang, PR China. Parasitology 2006;133(5):

78 38. Villabos N, Gonzalez LM, Morales J, de Aluja AS, Jimenez MI, Blanco MA et al. Molecular identification of Echinococcus granulosus genotypes (G1 and G7) isolated from pigs in Mexico. Vet Parasitol 2007;147(1-2): Moro PL, Nakao M, Ito A, Schantz PM, Cavero C, Cabrera L. Molecular identification of Echinococcus isolates from Peru. Parasitol Int 2009;58(2): Pawlowski Z, Stefaniak J. The pig strain of Echinococcus granulosus in humans: a neglected issue? Trends Parasitol 2003;19(10): Thompson RCA. The taxonomy, phylogeny and transmission of Echinococcus. Exp Parasitol 2008;119(4): Schantz PM. Progress in diagnosis, treatment and elimination of echinococcosis and cysticercosis. Parasitol Int 2006;55: McManus DP. The molecular epidemiology of Echinococcus granulosus and cystic hydatid disease. Trans S Soc Trop Med Hyg 2002;96(1): Nussbaum RL, McInnes RR, Willard HF. İnsan moleküler genetiği için araçlar (çeviri: E. Yılmaz). Thompson and Thompson tıbbi genetik de. Ankara: Güneş Kitabevi; 2005.s Dinkel A, Njoroge EM, Zimmermann A, Wälz M, Zeyhle E, Elmahdi İE et al. A PCR system for detection of species and genotypes of the Echinococcus granulosuscomplex, with reference to the epidemiological situation in eastern Africa. Int J Parasitol 2004;34(5): Nussbaum RL, McInnes RR, Willard HF. İnsanlarda genetik varyasyon: Mutasyon ve polimorfizm (çeviri: S. Emre). Thompson and Thompson tıbbi genetik de. Ankara: Güneş Kitabevi;2005.s McManus DP, Rishi AK. Genetic heterogeneity within Echinococcus granulosus: isolates from different hosts and geographical areas characterized with DNA probes. Parasitology 1989;99(1): McManus DP, Simpson AJG. Identification of the Echinococcus (hydatid disease) organisms using cloned DNA markers. Mol Biochem Parasitol 1985;17(2): Gasser RB. PCR-based technology in veterinary parasitology. Vet Parasitol 1999;84(3-4): Bowles J, McManus DP. Rapid discrimination of Echinococcus species and strains using a polymerase chain reaction-based RFLP method. Mol Biochem Parasitol 1993;57(2): Williams JGK, Kubelik AR, Livak KJ, Rafalski JA, Tingey SV. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic Acids Res 1990;18(22):

79 52. Scott JC, McManus DP. The random amplification of polymorphic DNA can discriminate species and strains of Echinococcus. Trop Med Parasitol 1994;45(1): Turcekova L, Snabel V, D Amelio S, Busi M, Dubinsky P. Morphological and genetic characterization of Echinococcus granulosus in the Slovak Republic. Acta Trop 2003;85(2): Mwambete KD, Ponce-Gordo F, Cuesta-Bandera C. Genetic identification and host range of the Spanish strains of Echinococcus granulosus. Acta Trop 2004;91(2): Orita M, Iwahana H, Kanazawa H, Hayashi K, Sekiya T. Detection of polymorphisms of human DNA by gel electrophoresis as single-strand conformation polymorhisms. Proc Natl Acad Sci USA 1989;86(8): Leung KH, Yip SP. Single strand conformation polymorphism. In: Walker JM, Rapley R (Eds.). Molecular biomethods handbook. 2 nd ed. New Jersey: Humana Pres; 2008.p Gasser RB. Mutation scanning methods for the analysis of parasite genes. Int J Parasitol 1997;27(12): Gasser RB, Zhu X, McManus DP. Display of sequence variation in PCR-amplified mitochondrial DNA regions of Echinococcus by single-strand conformation polymorphism. Acta Trop 1998;71(2): Sarkar G, Yoon HS, Sommer SS. Dideoxy fingerprinting (ddf): A rapid and efficient screen for the presence of mutations. Genomics 1992;13(2): Gasser RB, Zhu X, McManus DP. Dideoxy fingerprinting: applicartion to the genotyping of Echinococcus. Int J Parasitol 1998;28(11): Romig T. Epidemiology of echinococcosis. Langenbecks Arch Surg 2003;388(4): Torgerson PR, Oguljahan B, Muminov AE, Karaeva RR, Kuttubaev OT, Aminjanov M et al. Present situation of cystic echinococcosis in Central Asia. Parasitol Int 2006;55: Zhenghuan W, Xiaoming W, Xiaoqing L. Echinococcosis in China, a Review of the Epidemiology of Echinococcus spp. Ecohealth 2008;5(2): Dakkak A. Echinococcosis/hydatidosis: A severe threat in Mediterranean countries. Vet Parasitol 2010;174(1-2): Jenkins DJ, Romig T, Thompson RCA. Emergence/re-emergence of Echinococcus spp.-a global update. Int J Parasitol 2005;35(11-12): Moro P, Schantz PM. Echinococcosis: a review. Int J Infect Dis 2009;13(2):

80 67. Saygı G. Hydatidosis in Turkey within the last fourteen years ( ). Sivas: Cumhuriyet University Press, 1996: Özkan MC. Edirne ve Çevresinde Kist Hidatiğin Casoni ve İndirekt Hemaglütinasyon Testleri İle Sıklığının Araştırılması (tez). Edirne: Trakya Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü; Polat E, Sakru N, Sönmez Tamer G, Alver O. Marmara bölgesinde cystic echinococcosis. 3. Ulusal Hidatidoloji Kongresi Özet Kitabı s.25, Samsun, Koltaş İS, Koç Z, Demirci M, Aktaş H, Parsak CK, Özerdem D. Akdeniz bölgesinde cystic echinococcosis. 3. Ulusal Hidatidoloji Kongresi Özet Kitabı s.27, Samsun, Hakverdi S, Sayar H, Yaldız M, Erdoğan Ş, Akansu B, Canda MŞ. Çukurova yöresinde seyrek yerleşimli ekinokokkozis (134 olgu). Turkiye Parazitol Derg 2009;33(1): Üstün Ş, Girginkardeşler N, Çetinkaya Z, Türk M. Ege bölgesinde cystic echinococcosis. 3. Ulusal Hidatidoloji Kongresi Özet Kitabı s.26, Samsun, Ozkol M, Kilimcioglu AA, Girginkardesler N, Balcioglu IC, Sakru N, Korkmaz M et al. A discrepancy between cystic echinococcosis confirmed by ultrasound and seropositivity in Turkish children. Acta Trop 2005;93(2): Altintas N, Yazar S, Yolasigmaz A, Akisu C, Sakru N, Karacasu F et al. A seroepidemiological study of cystic echinococcosis in Izmir and its surrounding area, Turkey. Helminthologia 1999;36(1): Taylan Özkan A, Yazar S, Ertek M. İç Anadolu bölgesinde cystic echinococcosis. 3. Ulusal Hidatidoloji Kongresi Özet Kitabı s.28, Samsun, Aldemir OS, Baykan M, Gökçen A. Konya SSK Hastanesi nde kistik ekinokokkozis olguları. Genel Tıp Derg 2000;10(3): Yazar S. Kayseri de kistik ekinokokkozisin son altı yıldaki durumu. Türkiye Parazitol Derg 2005;29(4): Hökelek M. Karadeniz bölgesinde cystic echinococcosis. 3. Ulusal Hidatidoloji Kongresi Özet Kitabı s.29, Samsun, Yılmaz H, Cengiz ZT, Özer A, Keklik K, Yemenici N, Turan M ve ark. Doğu Anadolu bölgesinde cystic echinococcosis. 3. Ulusal Hidatidoloji Kongresi Özet Kitabı s.30, Samsun, Karaman Ü, Miman Ö, Kara M, Gıcık Y, Aycan ÖM, Atambay M. Kars bölgesinde hidatik kist prevalansı. Türkiye Parazitol Derg 2005;29(4):

81 81. Gündoğdu C, Arslan R, Arslan MÖ, Gıcık Y. Erzurum ve çevresinde insanlarda kistik ve alveolar ekinokokkozis olgularının değerlendirilmesi. Türkiye Parazitol Derg 2005;29(2): Kaplan M, Aygen E, Özyurtkan MO, Bakal Ü yılları arasında Fırat Üniversitesi Hastanesindeki kistik ekinokokkozis olguları. F Ü Sağ.Bil Tıp Derg 2010;24(2): Özbilge H. Güney Doğu Anadolu bölgesinde cystic echinococcosis. 3. Ulusal Hidatidoloji Kongresi Özet Kitabı s.31, Samsun, Özekinci S, Bakır Ş, Mızrak B yılları arasında Diyarbakır da histopatolojik tanı alan kistik ekinokokkozis olgularının değerlendirilmesi. Türkiye Parazitol Derg 2009;33(3): Altintas N. Parasitic zoonotic diseases in Turkey. Vet Ital 2008;44(4): Yıldız K, Tunçer Ç. Kırıkkale de sığırlarda kist hidatiğin yayılışı. Türkiye Parazitol Derg 2005;29(4): Simsek S, Balkaya I, Koroglu E. Epidemiological survey and molecular characterization of Echinococcus granulosus in cattle in an endemic area of eastern Turkey. Vet Parasitol 2010;172(3-4): Goz Y, Aydın A, Gül A, Değer S. Seroprevalence of cystic echinococcosis in goats in region of Hakkari, Turkey. YYÜ Vet Fak Derg 2007;18(1): Ulutaş Esatgil M, Tüzer E. Prevalence of hydatidosis in slaughtered animals in Thrace, Turkey. Türkiye Parazitol Derg 2007;31(1): Guzel M, Yaman M, Koltas IS, Demirkazik M, Aktas H. Detection of Echinococcus granulosus coproantigens in dogs from Antakya Province, Turkey. Helminthologia 2008;45(3): Schantz PM. Larval cestodiasis. In: Hoeprich PD, Jordan MC (Eds.). Infectious diseases. 4 th ed. Philadelphia: J. B. Lippincott Co; 1989.p Torgerson PR. Economic effects of echinococcosis. Acta Trop 2003;85(2): Plorde JJ. Cestodes. In: Ryan KJ, Ray CG (Eds.). Sherris medical microbiology an introduction to infectious diseases. 4 th ed. New York: Mc Graw Hill Co; 2004.p Bostan H, Yücel AF, Şahin DA. Ameliyat sırasında oluşan şokun nadir bir sebebi: Karaciğer hidatik kist rüptürüne bağlı anaflaksi. Olgu sunumu. J Surg Arts 2010;1: King CH. Cestodes (Tapeworms). In: Mandell GL, Bennet JE, Dolin R (Eds.). Mandell, Douglas, and Bennett s principles and practice of infectious diseases. 6 th ed. Philadelphia: Elsevier Churchill Livingstone; 2005.p

82 96. Miman Ö, Atambay M, Aydın NE, Daldal N. Kistik ekinokokkozis nedeniyle opere edilmiş 91 olguda klinik, morfolojik ve serolojik irdelemeler. Türkiye Parazitol Derg 2010;34(3): Pekcici MR, Canlı AB, Uyanık İ, İnceköy M. Abdominal kist hidatik olgularımızın retrospektif değerlendirilmesi. Tıp Araştırmaları Dergisi 2004;2(1): Inan M, Ayvaz S, Baser M, Karaayvaz A, Ciftci A, Hatipoglu AR et al. Hepatic hydatid disease in children and adults living in different areas in Turkey. Saudi Med J 2007;28(4): Işıtmangil T, Görür R, Yiyit N, Erdik O, Yıldızhan A, Candaş F ve ark. Toraksta kist hidatik hastalığı nedeniyle cerrahi tedavi uygulanan 308 hastanın değerlendirilmesi. Türk Göğüs Kalp Damar Cer Derg 2010;18(1): Tatar D, Senol G, Gunes E, Unsal S, Perim G. Diagnosis and treatment of pulmonary cystic hydatidosis. Indian J Pediatr 2008;75(10): Çakan A, Çağırıcı U, Veral A, Bilkay Ö. Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi nde akciğer kist hidatid hastalığının cerrahi sağaltım sonuçları. Türkiye Ekopatoloji Dergisi 2001;7(1-2): Açıkgöz D, İnceboz T, Özkara E, Korkmaz M, Birgen N, Üzün İ. İstanbul Adli Tıp Kurumu Morg İhtisas Dairesi nde yapılan otopsilerde kistik ekinokokkozis görülme sıklığının araştırılması. Türkiye Parazitol Derg 2009;33(2): Brunetti E, Kern P, Vuitton DA. Expert consensus for the diagnosis and treatment of cystic and alveolar echinococcosis in humans. Acta Trop 2010;114(1): Sever A, Elmas A. Echinococcosisde görüntüleme yöntemleri. Altıntaş N, Tınar R, Çoker A (Editörler). Echinococcosis de. İzmir:Hidatidoloji Derneği;2004.s Brunetti E, Gulizia R, Troia G, Filice C. Effects of chemical agents on hydatid cyst membranes. Am J Roentgenol 2005;184(3): Şahin EM, Yüksek YN, Dağlar G, Gözalan U, Kama NA. Kist hidatikte tanı ve tedavi: 120 hastaya ait sonuçlar. Trakya Univ Tip Fak Derg 2008;25(1): Albayrak D, Sezer YA, Ibiş AC, Yağcı MA, Hatipoğlu AR, Coşkun I. Karaciğer kist hidatik olgularımız. Trakya Univ Tip Fak Derg 2008;25(2): Tekin A, Kartal A, Aksoy F, Vatansev C, Küçükkartallar T, Belviranli M et al. Longterm results utilizing the unroofing technique in treating hydatid cysts of the liver. Surg Today 2008;38(9): World Health Organization Informal Working Group of Echinococcosis. Puncture, aspiration, injection, re-aspiration. An option for the treatment of cystic echinococcosis. Document: WHO/CDS/CSR/APH/ Geneva: World Health Organization;

83 110. Akhan O. Karaciğer kist hidatiklerinin perkütan tedavisi. Altıntaş N, Tınar R, Çoker A (Editörler). Echinococcosis de. İzmir: Hidatidoloji Derneği;2004.s Filice C, Brunetti E. Use of PAIR in human cystic echinococcosis. Acta Trop 1997;64(1-2): Akhan O, Ozmen MN, Dinçer A, Sayek I, Göçmen A. Liver hydatid disease: longterm results of percutaneous treatment. Radiology 1996;198(1): Akhan O, Üstünsöz B, Somuncu İ, Özmen M, Öner A, Alemdaroğlu A et al. Percutaneous renal hydatid cyst treatment: long-term results. Abdom Imaging 1998;23(2): Akhan O, Canyigit M, Kaya D, Koksal A, Akgoz A, Yucesoy C et al. Long-term follow-up of the percutaneous treatment of hydatid cyst in the adrenal gland: A case report and review of the literature. Cardiovasc Intervent Radiol. Epub ahead of print Akhan O, Bilgiç S, Akata D, Kiratli H, Özmen MN. Percutaneous treatment of an orbital hydatid cyst: A new therapeutic approach. Am J Ophthalmol 1998;125(6): Pawlowski ZS, Eckert J, Vuitton DA, Ammann RW, Kern P, Craig PS et al. Echinococcosis in humans: clinical aspects, diagnosis and treatment. In: Eckert J, Gemmell MA, Meslin F.-X, Pawlowski ZS (Eds.). WHO/OIE manual on Echinococcosis in humans and animals: a public health problem of global concern. Paris: World organisation for animal health; 2001.p Gemmell MA, Roberts MG, Beard TC, Campano Diaz S, Lawson JR, Nonnemaker JM. Control of Echinococcus granulosus. In: Eckert J, Gemmell MA, Meslin F.-X, Pawlowski ZS (Eds.). WHO/OIE manual on Echinococcosis in humans and animals: a public health problem of global concern. Paris: World organisation for animal health; 2001.p Eckert J, Conraths FJ, Tackmann K. Echinococcosis: an emerging or re-emerging zoonosis? Int J Parasitol 2000;30(12-13): Altıntaş N, Karababa AO. Echinococcosisde korunma ve kontrol. Altıntaş N, Tınar R, Çoker A (Editörler). Echinococcosis de. İzmir: Hidatidoloji Derneği;2004.s Craig PS, McManus DP, Lightowlers MW, Chabalgoity JA, Garcia HH, Gavidia CM et al. Prevention and control of cystic echinococcosis. Lancet Infect Dis 2007;7(6): Eckert J, Schantz PM, Gemmell MA, Romig T, Sato N, Suzuki K. Control of Echinococcus multilocularis. In: Eckert J, Gemmell MA, Meslin F.-X, Pawlowski ZS (Eds.). WHO/OIE manual on Echinococcosis in humans and animals: a public health problem of global concern. Paris: World organisation for animal health; 2001.p

84 122. Sambrook J, Russell DW. Molecular cloning a laboratory manual. 3 rd ed. New York;Cold Sring Harbor Laboratory Press;1989: Davis L, Kuehl M, Battey J. Methods in molecular biology. 2 nd ed. Norwalk: Appleton and Lange, 1994: Bassam BJ, Caetano-Anolles G, Gresshoff PM. Fast and sensitive silver staining of DNA in polyacrylamide gels. Anal Biochem 1991;196(1): Byun SO, Fang Q, Zhou H, Hickford JGH. An effective method for silver-staining DNA in large numbers of polyacrylamide gels. Anal Biochem 2009;385(1): Bowles J, Blair D, McManus DP. Genetic variants within the genus Echinococcus identified by mitochondrial DNA sequencing. Mol Biochem Parasitol 1992;54(2): Sharbatkhori M, Mirhendi H, Jex AR, Pangasa A, Campbell BE, Kia EB et al. Genetic categorization of Echinococcus granulosus from humans and herbivorous hosts in Iran using an integrated mutation scanning-phylogenetic approach. Electrophoresis 2009;30(15): Okamoto M, Bessho Y, Kmiya M, Kurosawa T, Horii T. Phylogenetic relationships within Taenia taeniaeformis variants and other taeniid cestodes inferred from the nucleotide sequence of the cytochrome c oxidase subunit I gene. Parasitol Res 1995;81(6): Nakao M, McManus DP, Schantz PM, Craig PS, Ito A. A molecular phylogeny of the genus Echinococcus inferred from complete mitochondrial genomes. Parasitology 2007;134(5): Lavikainen A, Lehtinen MJ, Meri T, Hirvela-Koski V, Meri S. Molecular genetic characterization of the Fennoscandian cervid strain, a new genotypic group (G10) of Echinococcus granulosus. Parasitology 2003;127(3): Bowles J, McManus DP. NADH dehydrogenase 1 gene sequences compared for species and strains of the genus Echinococcus. Int J Parasitol 1993;23(7): Bowles J, Blair D, McManus DP. Molecular genetic characterization of the cervid strain ( northern form ) of Echinococcus granulosus. Parasitology 1994;109(2): Hakverdi S, Çulha G, Canda MŞ, Yaldız M, Altıntaş S. Hatay İli nde kistik ekinokokkozis sorunu. Türkiye Parazitol Derg 2008;32(4): Düzlü O, Yıldırım A, Sarıözkan S, İnci A. Kayseri yöresinde üç farklı mezbahada kesilen koyun ve sığırlarda kistik echinococcosisin ekonomik önemi. Erciyes Üniv Vet Fak Derg 2010;7(1): Baldock FC, Arthur RJ, Lawrence AR. A meatworks survey of bovine hydatidosis in southern Queensland. Aust Vet J 1985;62(7):

85 136. Arene FOI. Prevalence of hydatid cysts in domestic livestock in the Niger Delta. Trop Amin Hlth Prod 1985;17(1): Dalimi A, Motamedi G, Hosseini M, Mohammadian B, Malaki H, Ghamari Z et al. Echinococcosis/hydatidosis in western Iran. Vet Parasitol 2002;105(2): Gemmel MA, Parmeter SN, Sutton RJ, Khan N. Effect of mebendazole against Echinococcus granulosus and Taenia hydatigena cysts in naturally infected sheep and relevance to larval tapeworm infections in man. Z Parasitenkd 1981;64(2): Casado N, Rodriguez-Caaberio F, Hernandez S. In vitro survival of Echinococcus granulosus protoscolices in several media, at +4 C and +37 C. Z Parasitenkd 1986;72(2): Walker M, Rossignol JF, Torgerson P, Hemphill A. In vitro effects of nitazoxanide on Echinococcus granulosus protoscoleces and metacestodes. J Antimicrob Chemother 2004;54(3): Ciftci İH, Esme H, Sahin DA, Solak O, Sezer M, Dilek ON. Effect of octenidine dihydrochloride on viability of protoscoleces in hepatic and pulmonary hydatid diseases. J Natl Med Assoc 2007;99(6): Celina Elissondo M, Albani CM, Gende L, Eguaras M, Denegri G. Efficacy of thymol against Echinococcus granulosus protoscoleces. Parasitol Int 2008;57(2): Polat E, Aslan M, Cakan H, Saribas S, Ipek T, Kocazeybek B. The effects of albendazole and povidone iodine for hydatid cysts protoscoleces, in-vitro and vivo. Afr J Microbiol Res 2009; 3(11): Gavidia CM, Gonzalez AE, Lopero L, Jayashi C, Angelats R, Baron EA et al. Evaluation of nitazoxanide and oxfendazole efficacy against cystic echinococcosis in naturally infected sheep. Am J Trop Med Hyg 2009;80(3): Manterola C, Vial M, Melo A, Oberg C, Fonseca F. Viability and fertility of human hepatic hydatid cysts. World J Surg 2006;30(2): Esfandiari B, Youssefi MR. Comparison of eosin and trypan blue staining in viability of hydatid cyst protoscoleces. Global Veterinaria 2010;4(5): Yıldırım A, İça A, Düzlü Ö, İnci A. Kistik Echinococcosis de canlılık tayininde kullanılan çeşitli boyama yöntemlerinin istatistiksel analizi. Türkiye Parazitol Derg 2007;31(2): Ütük AE. Echinococcus granulosus un Doğu ve Güneydoğu Anadolu bölgesi izolatlarının moleküler ayrımı (tez). Elazığ: Fırat Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü; Kamenetzky L, Gutierrez AM, Canova SG, Haag KL, Guarnera EA, Para A et al. Several strains of Echinococcus granulosus infect livestock in humans in Argentina. Infect Genet Evol 2002;2(2):

86 150. Bowles J, Knapen FV, McManus D. Cattle strain of Echinococcus granulosus and human infection. The Lancet 1992;339(8805): Maravilla P, Thompson RCA, Palacios-Ruiz JA, Estcourt A, Ramirez-Solis E, Mondragon-de-la-Pena C et al. Echinococcus granulosus cattle strain identification in an autochthonous case of cystic echinococcosis in central Mexico. Acta Trop 2004;92(3): Scott JC, Stefaniak J, Pawlowski ZS, McManus DP. Molecular genetic analysis of human cystic hydatid cases from Poland: identification of a new genotypic group (G9) of Echinococcus granulosus. Parasitology 1997;114(1): Zhang L, Eslami A, Hosseini SH, McManus DP. İndication of the presence of two distinct strains of Echinococcus granulosus in Iran by mitochondrial DNA markers. Am J Trop Med Hyg 1998;59(1): Jamali R, Ghazanchaei A, Asgharzadeh M. Identification and characterization of Echinococcus granulosus by PCR-RFLP technique in Tabriz district. Dist J Parasitic Dis 2004;28: Sharbatkhori M, Mirhendi H, Harandi MF, Rezaeian M, Mohebali M, Eshraghian M et al. Echinococcus granulosus genotypes in livestock in Iran indicating high frequency of G1 genotype in camels. Exp Parasitol 2010;124(4): M rad S, Filisetti D, Quidni M, Mekki M, Belguith M, Nouri A et al. Molecular evidence of ovine (G1) and camel (G6) strains of Echinococcus granulosus in Tunisia and putative role of cattle in human contamination. Vet Parasitol 2005;129(3-4): Varcasia A, Canu S, Lightowlers MW, Scala A, Garippa G. Molecular characterization of Echinococcus granulosus strains in Sardinia. Parasitol Res 2006;98(3): Sunnucks P, Wilson ACC, Beheregaray LB, Zenger K, French J, Taylor AC. SSCP is not so difficult: the application and utility of single-stranded conformation polymorphism in evolutionary biology and molecular ecology. Mol Ecol 200;9(11): Zhang L, Gasser RB, Zhu X, McManus DP. Screening for different genotypes of Echinococcus granulosus within China and Argentina by single-strand conformation polymorphism (SSCP) analysis. Trans R Soc Trop Med Hyg 1999;93(3): Abushhewa MH, Abushhiwa MHS, Nolan MJ, Jex AR, Campbell BE, Jabbar A et al. Gentic classification of Echinococcus granulosus cysts from humans, cattle and camels in Libya using mutation scanning-based analysis of mitochpndrial loci. Mol Cell Probes 2010;24(6): Jabbar A, Narankhajid M, Nolan MJ, Jex AR, Campbell BE, Gasser RB. A first insight into the genotypes of Echinococcus granulosus from humans in Mongolia. Mol Cell Probes. Epub ahead of print

87 162. McManus DP. Molecular discrimination of taeniid cestodes. Parasitol Int 2006;55: Santivanez SJ, Gutierrez AM, Rosenzvit MC, Muzulin PM, Rodriguez ML, Vasquez JC et al. Human hydatid diseases in Peru is basically restricted to Echinococcus granulosus genotype 1. Am J Trop Med Hyg 2008;79(1): De La Rue ML, Dinkel A, Mackenstedt U, Romig T. New data on Echinococcus spp. in southern Brazil. Rev Inst Med Trop S Paulo 2006;48(2): Bhattacharya D, Bera AK, Bera BC, Maity A, Das SK. Genotypic characterisation in Indian cattle, buffalo and sheep isolates of Echinococcus granulosus. Vet Parasitol 2007;143(3-4): Lavikainen A, Lehtinen MJ, Laaksonen S, Agren E, Oksanen A, Meri S. Molecular characterization of Echinococcus isolates of cervid origin from Finland and Sweden. Parasitology 2006;133(5): Breyer I, Georgieva D, Kurdova Gottstein B. Echinococcus granulosus strain typing in Bulgaria: the G1 genotype is predominant in intermediate and definitive wild hosts. Parasitol Res 2004;93(2): Simsek S, Eroksuz Y. Ocurrence and molecular characterization of Echinococcus granulosus in Turkish mouflon (Ovis gmelinii anatolica). Acta Trop 2009;109(2): Obwaller A, Schneider R, Walochnik J, Gollackner B, Deutz A, Janitschke K et al. Echinococcus granulosus strain differentiation based on sequence heterogeneity in mitochondrial genes of cytochrome c oxidase-1 and NADH dehydrogenase-1. Parasitology 2004;128(5): Gonzalez LM, Daniel-Mwambete K, Montero E, Rosenzvit MC, McManus DP, Garate T et al. Further molecular discrimination of Spanish strains of Echinococcus granulosus. Exp Parasitol 2002;102(1): Snabel V, D Amelio S, Mathiopoulos K, Turcekova L, Dubinsky P. Molecular evidence for the presence of a G7 genotype of Echinococcus granulosus in Slovakia. J Helminthol 2000;74(2):

88 EKLER

89 EK-1

90 EK-2

91 EK-3 BİLGİLENDİRİLMİŞ OLUR FORMU Bu katıldığınız çalışma bilimsel bir araştırma olup, araştırmanın adı Echinococcus granulosus izolatlarının genotiplendirilmesi dir. Bu araştırmanın amacı, çeşitli büyükbaş ve küçükbaş memeli hayvanlarda (koyun, keçi, sığır vs.) ve insanlardaki hidatik kist materyalini kullanarak Echinococcus granulosus türünün suş ayrımını ve dağılımını moleküler biyolojik teknikler kullanarak göstermektir. Böylece bölgemizde kist hidatik hastalığına karşı etkin kontrol programları uygulanabilecek, E. granulosus parazitine karşı aşı, tanı için yöntem ve etkili ilaçlar geliştirilebilecektir. Bu araştırmada size hekiminiz tarafından uygulanan tedavi dışında herhangi bir tedavi ya da girişim uygulanmayacaktır. Bu araştırmada yer aldığınız takdirde hekiminizin öngördüğü tedavi süresi dışında herhangi bir süre gerekli olmayacaktır. Araştırmada yer alacak gönüllülerin sayısı yaklaşık 50 kişidir. Bu araştırma ile ilgili olarak herhangi bir sorumluluğunuz bulunmamaktadır. Bu araştırmada sizin için herhangi bir risk ya da yarar bulunmamaktadır. Bu araştırmada size alternatif bir tedavi ya da işlem uygulanmayacaktır. Araştırma sırasında sizi ilgilendirebilecek herhangi bir gelişme olduğunda, bu durum size veya yasal temsilcinize derhal bildirilecektir. Araştırma hakkında ek bilgiler almak için ya da çalışma ile ilgili herhangi bir sorun, istenmeyen etki ya da diğer rahatsızlıklarınız için no.lu telefondan Dr.Canan Eryıldız a başvurabilirsiniz. Bu araştırmada yer almanız nedeniyle size hiçbir ödeme yapılmayacaktır. Ayrıca, bu araştırma kapsamındaki bütün muayene, tetkik, testler ve tıbbi bakım hizmetleri için sizden veya bağlı bulunduğunuz sosyal güvenlik kuruluşundan hiçbir ücret istenmeyecektir. Bu araştırma Trakya Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri tarafından desteklenmektedir. Bu araştırmada yer almak tamamen sizin isteğinize bağlıdır. Araştırmada yer almayı reddedebilirsiniz ya da herhangi bir aşamada araştırmadan ayrılabilirsiniz; bu durum herhangi bir cezaya ya da sizin yararlarınıza engel duruma yol açmayacaktır. Araştırmanın sonuçları bilimsel amaçla kullanılacaktır; çalışmadan çekilmeniz ya da araştırıcı tarafından çıkarılmanız durumunda, sizle ilgili tıbbi veriler de gerekirse bilimsel amaçla kullanılabilecektir. Size ait tüm tıbbi ve kimlik bilgileriniz gizli tutulacaktır ve araştırma yayınlansa bile kimlik bilgileriniz verilmeyecektir, ancak araştırmanın izleyicileri, yoklama yapanlar, etik kurullar ve resmi makamlar gerektiğinde tıbbi bilgilerinize ulaşabilir. Siz de istediğinizde kendinize ait tıbbi bilgilere ulaşabilirsiniz. Çalışmaya Katılma Onayı: Yukarıda yer alan ve araştırmaya başlanmadan önce gönüllüye verilmesi gereken bilgileri okudum ve sözlü olarak dinledim. Aklıma gelen tüm soruları araştırıcıya sordum, yazılı ve sözlü olarak bana yapılan tüm açıklamaları ayrıntılarıyla anlamış bulunmaktayım. Çalışmaya katılmayı isteyip istemediğime karar vermem için bana yeterli zaman tanındı. Bu koşullar altında, bana ait tıbbi bilgilerin gözden geçirilmesi, transfer edilmesi ve işlenmesi konusunda araştırma yürütücüsüne yetki veriyor ve söz konusu araştırmaya ilişkin bana yapılan katılım davetini hiçbir zorlama ve baskı olmaksızın büyük bir gönüllülük içerisinde kabul ediyorum. Bu formun imzalı bir kopyası bana verilecektir.

92 EK-4 Echinococcus granulosus isolate edr10 cytochrome oxidase subunit I (CO1) gene, partial cds; mitochondrial GenBank: HQ FASTA Graphics Go to:featuressequence LOCUS HQ bp DNA linear INV 26-DEC-2010 DEFINITION Echinococcus granulosus isolate edr10 cytochrome oxidase subunit I (CO1) gene, partial cds; mitochondrial. ACCESSION HQ VERSION HQ GI: KEYWORDS. SOURCE mitochondrion Echinococcus granulosus ORGANISM Echinococcus granulosus Eukaryota; Metazoa; Platyhelminthes; Cestoda; Eucestoda; Cyclophyllidea; Taeniidae; Echinococcus. REFERENCE 1 (bases 1 to 366) AUTHORS Eryildiz,C. and Sakru,N. TITLE Genotyping of Echinococcus granulosus isolates JOURNAL Unpublished REFERENCE 2 (bases 1 to 366) AUTHORS Eryildiz,C. and Sakru,N. TITLE Direct Submission JOURNAL Submitted (14-DEC-2010) Medical Microbiology, Trakya University Medical School, Gullapoglu, Edirne, Edirne 22030, Turkey FEATURES Location/Qualifiers source /organism="echinococcus granulosus" /organelle="mitochondrion" /mol_type="genomic DNA" /isolate="edr10" /host="homo sapiens" /db_xref="taxon:6210" gene <1..>366 /gene="co1" CDS <1..>366 /gene="co1" /codon_start=1 /transl_table=9 /product="cytochrome oxidase subunit I" /protein_id="adu " /db_xref="gi: " /translation="pgfgiishiclsisanfdafgfygllfamfsivclgssvwghhm FTVGLDVKTAVFFSSVTMIIGVPTGIKVFTWLYMLLNSSVNVSDPVLWWVVSFIVLFT FGGVTGIVLSACVLDNILHD" ORIGIN 1 cctggatttg gtataattag tcatatttgt ttgagtatta gtgctaattt tgatgcgttt 61 gggttctatg ggttgttgtt tgctatgttt tctatagtgt gtttgggcag cagggtttgg 121 ggtcatcata tgtttactgt tgggttggat gtgaagacgg ctgttttttt tagctctgtt 181 actatgatta taggggttcc tactggtata aaggtgttta cttggttata tatgttgttg 241 aattcgagtg ttaatgttag tgatccggtt ttgtgatggg ttgtttcttt tatagtgttg 301 tttacgtttg ggggagttac gggtatagtt ttgtctgctt gtgtgttaga taatattttg 361 catgat //

93 EK-5 Echinococcus granulosus isolate edr1 cytochrome oxidase subunit I (CO1) gene, partial cds; mitochondrial GenBank: HQ FASTA Graphics Go to:featuressequence LOCUS HQ bp DNA linear INV 26-DEC-2010 DEFINITION Echinococcus granulosus isolate edr1 cytochrome oxidase subunit I (CO1) gene, partial cds; mitochondrial. ACCESSION HQ VERSION HQ GI: KEYWORDS. SOURCE mitochondrion Echinococcus granulosus ORGANISM Echinococcus granulosus Eukaryota; Metazoa; Platyhelminthes; Cestoda; Eucestoda; Cyclophyllidea; Taeniidae; Echinococcus. REFERENCE 1 (bases 1 to 366) AUTHORS Eryildiz,C. TITLE Genotyping of Echinococcus granulosus isolates JOURNAL Unpublished REFERENCE 2 (bases 1 to 366) AUTHORS Eryildiz,C. TITLE Direct Submission JOURNAL Submitted (15-DEC-2010) Medical Microbiology, Trakya University Medical School, Gullapoglu, Edirne, Edirne 22030, Turkey FEATURES Location/Qualifiers source /organism="echinococcus granulosus" /organelle="mitochondrion" /mol_type="genomic DNA" /isolate="edr1" /host="homo sapiens" /db_xref="taxon:6210" gene <1..>366 /gene="co1" CDS <1..>366 /gene="co1" /codon_start=1 /transl_table=9 /product="cytochrome oxidase subunit I" /protein_id="adu " /db_xref="gi: " /translation="pgfgiishiclsisanfdvfgfygllfamfsivclgssvwghhm FTVGLDVKTAVFFSSVTMIIGVPTGIKVFTWLYMLLNSSVNVSDPVLWWVVSFIVLFT FGGVTGIVLSACVLDNILHD" ORIGIN 1 cctggatttg gtataattag tcatatttgt ttgagtatta gtgctaattt tgatgtgttt 61 gggttctatg ggttgttgtt tgctatgttt tctatagtgt gtttgggtag cagggtttgg 121 ggtcatcata tgtttactgt tgggttggat gtgaagacgg ctgttttttt tagctctgtt 181 actatgatta taggggttcc tactggtata aaggtgttta cttggttata tatgttgttg 241 aattcgagtg ttaatgttag tgatccggtt ttgtgatggg ttgtttcttt tatagtgttg 301 tttacgtttg ggggagttac gggtatagtt ttgtctgctt gtgtgttaga taatattttg 361 catgat //

94 EK-6 Echinococcus granulosus isolate edr2 cytochrome oxidase subunit I (CO1) gene, partial cds; mitochondrial GenBank: HQ FASTA Graphics Go to:featuressequence LOCUS HQ bp DNA linear INV 26-DEC-2010 DEFINITION Echinococcus granulosus isolate edr2 cytochrome oxidase subunit I (CO1) gene, partial cds; mitochondrial. ACCESSION HQ VERSION HQ GI: KEYWORDS. SOURCE mitochondrion Echinococcus granulosus ORGANISM Echinococcus granulosus Eukaryota; Metazoa; Platyhelminthes; Cestoda; Eucestoda; Cyclophyllidea; Taeniidae; Echinococcus. REFERENCE 1 (bases 1 to 366) AUTHORS Eryildiz,C. TITLE Genotyping of Echinococcus granulosus isolates JOURNAL Unpublished REFERENCE 2 (bases 1 to 366) AUTHORS Eryildiz,C. TITLE Direct Submission JOURNAL Submitted (15-DEC-2010) Medical Microbiology, Trakya University Medical School, Gullapoglu, Edirne, Edirne 22030, Turkey FEATURES Location/Qualifiers source /organism="echinococcus granulosus" /organelle="mitochondrion" /mol_type="genomic DNA" /isolate="edr2" /host="sheep" /db_xref="taxon:6210" gene <1..>366 /gene="co1" CDS <1..>366 /gene="co1" /codon_start=1 /transl_table=9 /product="cytochrome oxidase subunit I" /protein_id="adu " /db_xref="gi: " /translation="pgfgiishiclsisanfdafgfygllfamfsivclgssvwghhm FTVGLDVKTAVFFSSVTMIIGVPTGIKVFTWLYMLLNSSVNVSDPVLWWVVSFIVLFT FGGVTGIVLSACVLDNILHD" ORIGIN 1 cctggatttg gtataattag tcatatttgt ttgagtatta gtgctaattt tgatgcgttt 61 gggttttatg ggttgttgtt tgctatgttt tctatagtgt gtttgggtag cagggtttgg 121 ggtcatcata tgtttactgt tgggttggat gtgaagacgg ctgttttttt tagctctgtt 181 actatgatta taggggttcc tactggtata aaggtgttta cttggttata tatgttgttg 241 aattcgagtg ttaatgttag tgatccggtt ttgtgatggg ttgtttcttt tatagtgttg 301 tttacatttg ggggagttac gggtatagtt ttgtctgctt gtgtgttaga taatattttg 361 catgat //

95 EK-7 Echinococcus granulosus isolate edr3 cytochrome oxidase subunit I (CO1) gene, partial cds; mitochondrial GenBank: HQ FASTA Graphics Go to:featuressequence LOCUS HQ bp DNA linear INV 26-DEC-2010 DEFINITION Echinococcus granulosus isolate edr3 cytochrome oxidase subunit I (CO1) gene, partial cds; mitochondrial. ACCESSION HQ VERSION HQ GI: KEYWORDS. SOURCE mitochondrion Echinococcus granulosus ORGANISM Echinococcus granulosus Eukaryota; Metazoa; Platyhelminthes; Cestoda; Eucestoda; Cyclophyllidea; Taeniidae; Echinococcus. REFERENCE 1 (bases 1 to 366) AUTHORS Eryildiz,C. and Sakru,N. TITLE Genotyping of Echinococcus granulosus isolates JOURNAL Unpublished REFERENCE 2 (bases 1 to 366) AUTHORS Eryildiz,C. and Sakru,N. TITLE Direct Submission JOURNAL Submitted (15-DEC-2010) Medical Microbiology, Trakya University Medical School, Gullapoglu, Edirne, Edirne 22030, Turkey FEATURES Location/Qualifiers source /organism="echinococcus granulosus" /organelle="mitochondrion" /mol_type="genomic DNA" /isolate="edr3" /host="cattle" /db_xref="taxon:6210" gene <1..>366 /gene="co1" CDS <1..>366 /gene="co1" /codon_start=1 /transl_table=9 /product="cytochrome oxidase subunit I" /protein_id="adu " /db_xref="gi: " /translation="pgfgiishiclsisanfdafgfygllfamfsivclgssvwghhm FTVGLDVKTAVFFSSVTMIIGVPTGIKVFTWLYMLLNSSVNVSDPVLWWVVSFIVLFT FGGVTGIVLSACVLDNILHD" ORIGIN 1 cctggatttg gtataattag tcatatttgt ttgagtatta gtgctaattt tgatgcgttt 61 gggttctatg ggttgttgtt tgctatgttt tctatagtgt gtttgggtag cagggtttgg 121 ggtcatcata tgtttactgt tgggttggat gtgaagacgg ctgttttttt tagctctgtt 181 actatgatta taggggttcc tactggtata aaggtgttta cttggttata tatgttgttg 241 aattcgagtg ttaatgttag tgatccggtt ttgtgatggg ttgtttcttt tatagtgttg 301 tttacgtttg ggggagttac gggtatagtt ttgtctgctt gtgtgttaga taatattttg 361 catgat //

96 EK-8 Echinococcus granulosus isolate edr4 NADH dehydrogenase subunit 1 (ND1) gene, partial cds; mitochondrial GenBank: HQ FASTA Graphics Go to:featuressequence LOCUS HQ bp DNA linear INV 26-DEC-2010 DEFINITION Echinococcus granulosus isolate edr4 NADH dehydrogenase subunit 1 (ND1) gene, partial cds; mitochondrial. ACCESSION HQ VERSION HQ GI: KEYWORDS. SOURCE mitochondrion Echinococcus granulosus ORGANISM Echinococcus granulosus Eukaryota; Metazoa; Platyhelminthes; Cestoda; Eucestoda; Cyclophyllidea; Taeniidae; Echinococcus. REFERENCE 1 (bases 1 to 369) AUTHORS Eryildiz,C. and Sakru,N. TITLE Genotyping of Echinococcus granulosus isolates JOURNAL Unpublished REFERENCE 2 (bases 1 to 369) AUTHORS Eryildiz,C. and Sakru,N. TITLE Direct Submission JOURNAL Submitted (15-DEC-2010) Medical Microbiology, Trakya University Medical School, Gullapoglu, Edirne, Edirne 22030, Turkey FEATURES Location/Qualifiers source /organism="echinococcus granulosus" /organelle="mitochondrion" /mol_type="genomic DNA" /isolate="edr4" /host="cattle" /db_xref="taxon:6210" gene <1..>369 /gene="nd1" CDS <1..>369 /gene="nd1" /codon_start=1 /transl_table=9 /product="nadh dehydrogenase subunit 1" /protein_id="adu " /db_xref="gi: " /translation="lfgvvllmalvivysfiygsyysasysglsvlwflaaastssys LLCTGWGGYNNYSFLSSVRCAFGSVSFEACFMCVVIFCALCSCSYNLIDFYYNCWLSL LLFPLIYVLFLICILCETNRT" ORIGIN 1 ttgtttggtg ttgtgttatt aatggctttg gtgattgttt attcatttat ttatggtaga 61 tattatagag ctagttatag aggcctctcc gtgttgtggt ttttggctgc cgccagaaca 121 tctaggtatt ctttgttgtg tactggttgg ggtggttaca acaattattc atttttaagg 181 tcggttcgat gtgcttttgg atctgttagg tttgaggctt gttttatgtg tgtggtgatt 241 ttttgtgctt tgtgtagttg taggtataat ttaattgatt tttattataa ttgttgatta 301 agtttgttat tatttccatt aatttatgtg ttatttttaa tatgtatatt gtgtgaaact 361 aatcgtacg //

97 EK-9 Echinococcus granulosus isolate edr5 NADH dehydrogenase subunit 1 (ND1) gene, partial cds; mitochondrial GenBank: HQ FASTA Graphics Go to:featuressequence LOCUS HQ bp DNA linear INV 26-DEC-2010 DEFINITION Echinococcus granulosus isolate edr5 NADH dehydrogenase subunit 1 (ND1) gene, partial cds; mitochondrial. ACCESSION HQ VERSION HQ GI: KEYWORDS. SOURCE mitochondrion Echinococcus granulosus ORGANISM Echinococcus granulosus Eukaryota; Metazoa; Platyhelminthes; Cestoda; Eucestoda; Cyclophyllidea; Taeniidae; Echinococcus. REFERENCE 1 (bases 1 to 369) AUTHORS Eryildiz,C. and Sakru,N. TITLE Genotyping of Echinococcus granulosus isolates JOURNAL Unpublished REFERENCE 2 (bases 1 to 369) AUTHORS Eryildiz,C. and Sakru,N. TITLE Direct Submission JOURNAL Submitted (15-DEC-2010) Medical Microbiology, Trakya University Medical School, Gullapoglu, Edirne, Edirne 22030, Turkey FEATURES Location/Qualifiers source /organism="echinococcus granulosus" /organelle="mitochondrion" /mol_type="genomic DNA" /isolate="edr5" /host="homo sapiens" /db_xref="taxon:6210" gene <1..>369 /gene="nd1" CDS <1..>369 /gene="nd1" /codon_start=1 /transl_table=9 /product="nadh dehydrogenase subunit 1" /protein_id="adu " /db_xref="gi: " /translation="lfgvvllmalvivysfiygsyysasysglsvlwflaaastssys LLCTGWGGYNNYSFLSSVRCAFGSVSFEACFMCVVIFCALCSCSYNLIDFYYNCWLSL LLFPLIYVLFLICILCETNRT" ORIGIN 1 ttgtttggtg ttgtgttatt aatggctttg gtgattgttt attcatttat ttatggtaga 61 tattatagag ctagttatag aggcctctcc gtgttgtggt ttttggctgc cgccagaaca 121 tctaggtatt ctttgttgtg tactggttgg ggtggttaca acaattattc atttttaagg 181 tcggttcgat gtgcttttgg atctgttagg tttgaggctt gttttatgtg tgtggtgatt 241 ttttgtgctt tgtgtagttg taggtataat ttaattgatt tttattacaa ttgttgatta 301 agtttgttat tatttccatt aatttatgtg ttatttttaa tatgtatatt gtgtgaaact 361 aatcgtacg //

98 EK-10 Echinococcus granulosus isolate edr6 NADH dehydrogenase subunit 1 (ND1) gene, partial cds; mitochondrial GenBank: HQ FASTA Graphics Go to:featuressequence LOCUS HQ bp DNA linear INV 26-DEC-2010 DEFINITION Echinococcus granulosus isolate edr6 NADH dehydrogenase subunit 1 (ND1) gene, partial cds; mitochondrial. ACCESSION HQ VERSION HQ GI: KEYWORDS. SOURCE mitochondrion Echinococcus granulosus ORGANISM Echinococcus granulosus Eukaryota; Metazoa; Platyhelminthes; Cestoda; Eucestoda; Cyclophyllidea; Taeniidae; Echinococcus. REFERENCE 1 (bases 1 to 369) AUTHORS Eryildiz,C. and Sakru,N. TITLE Genotyping of Echinococcus granulosus isolates JOURNAL Unpublished REFERENCE 2 (bases 1 to 369) AUTHORS Eryildiz,C. and Sakru,N. TITLE Direct Submission JOURNAL Submitted (15-DEC-2010) Medical Microbiology, Trakya University Medical School, Gullapoglu, Edirne, Edirne 22030, Turkey FEATURES Location/Qualifiers source /organism="echinococcus granulosus" /organelle="mitochondrion" /mol_type="genomic DNA" /isolate="edr6" /host="homo sapiens" /db_xref="taxon:6210" gene <1..>369 /gene="nd1" CDS <1..>369 /gene="nd1" /codon_start=1 /transl_table=9 /product="nadh dehydrogenase subunit 1" /protein_id="adu " /db_xref="gi: " /translation="lfgvvllmalvivysfiygsyysasysglsvlwflaaastssys LLCTGWGGYNNYSFLSSVRCAFGSVSFEACFMCVVIFCALCSCSYNLIDFYYNCWLSL LLFPLIYVLFLICILCETNRT" ORIGIN 1 ttgtttggtg ttgtgttatt aatggctttg gtgattgttt attcatttat ttatggtaga 61 tattatagag ctagttatag aggcctctcc gtgttgtggt ttttggctgc cgccagaaca 121 tctaggtatt ctttgttgtg tactggttgg ggtggttaca acaattattc atttttaagg 181 tcggttcgat gtgcctttgg atctgttagg tttgaggctt gttttatgtg tgtggtgatt 241 ttttgtgctt tgtgtagttg taggtataat ttaattgatt tttattataa ttgttgatta 301 agtttgttat tatttccatt aatttatgtg ttatttttaa tatgtatatt gtgtgaaact 361 aatcgtacg //

99 EK-11 Echinococcus granulosus isolate edr7 NADH dehydrogenase subunit 1 (ND1) gene, partial cds; mitochondrial GenBank: HQ FASTA Graphics Go to:featuressequence LOCUS HQ bp DNA linear INV 26-DEC-2010 DEFINITION Echinococcus granulosus isolate edr7 NADH dehydrogenase subunit 1 (ND1) gene, partial cds; mitochondrial. ACCESSION HQ VERSION HQ GI: KEYWORDS. SOURCE mitochondrion Echinococcus granulosus ORGANISM Echinococcus granulosus Eukaryota; Metazoa; Platyhelminthes; Cestoda; Eucestoda; Cyclophyllidea; Taeniidae; Echinococcus. REFERENCE 1 (bases 1 to 367) AUTHORS Eryildiz,C. and Sakru,N. TITLE Genotyping of Echinococcus granulosus isolates JOURNAL Unpublished REFERENCE 2 (bases 1 to 367) AUTHORS Eryildiz,C. and Sakru,N. TITLE Direct Submission JOURNAL Submitted (15-DEC-2010) Medical Microbiology, Trakya University Medical School, Gullapoglu, Edirne, Edirne 22030, Turkey FEATURES Location/Qualifiers source /organism="echinococcus granulosus" /organelle="mitochondrion" /mol_type="genomic DNA" /isolate="edr7" /host="homo sapiens" /db_xref="taxon:6210" gene <1..>367 /gene="nd1" CDS <1..>367 /gene="nd1" /codon_start=1 /transl_table=9 /product="nadh dehydrogenase subunit 1" /protein_id="adu " /db_xref="gi: " /translation="lfgvlllivlvvvysfiygsyysvsysmlsvlwflaassissys LLCTGWGSYNSYSFLSSVRCAFGSVSFEACFMCVVIFCALCCCGYNLIDFYYSYWWSW LLFPLIYGLFLVCVLCETNR" ORIGIN 1 ttgtttggtg ttttgttgtt gatagttttg gttgtggtgt attcgtttat ttatggtaga 61 tattatagag ttagttatag tatgctttct gtgttatgat ttttagctgc ttctagaatt 121 tctaggtatt ccttgttgtg tactggttgg ggtagttaca atagttattc ttttttaagg 181 tcggttcgat gtgcttttgg atctgttagg tttgaggctt gttttatgtg tgtggttatt 241 ttttgcgctt tatgctgttg tgggtataat ttaattgatt tttattatag ttactggtga 301 agttgattat tattcccatt aatttatggg ttattcttgg tgtgtgtgtt atgtgagact 361 aatcgta //

100 EK-12 Echinococcus granulosus isolate edr8 cytochrome oxidase subunit I (CO1) gene, partial cds; mitochondrial GenBank: HQ FASTA Graphics FeaturesSequence LOCUS HQ bp DNA linear INV 26-DEC-2010 DEFINITION Echinococcus granulosus isolate edr8 cytochrome oxidase subunit I (CO1) gene, partial cds; mitochondrial. ACCESSION HQ VERSION HQ GI: KEYWORDS. SOURCE mitochondrion Echinococcus granulosus ORGANISM Echinococcus granulosus Eukaryota; Metazoa; Platyhelminthes; Cestoda; Eucestoda; Cyclophyllidea; Taeniidae; Echinococcus. REFERENCE 1 (bases 1 to 366) AUTHORS Eryildiz,C. and Sakru,N. TITLE Genotyping of Echinococcus granulosus isolates JOURNAL Unpublished REFERENCE 2 (bases 1 to 366) AUTHORS Eryildiz,C. and Sakru,N. TITLE Direct Submission JOURNAL Submitted (15-DEC-2010) Medical Microbiology, Trakya University Medical School, Gullapoglu, Edirne, Edirne 22030, Turkey FEATURES Location/Qualifiers source /organism="echinococcus granulosus" /organelle="mitochondrion" /mol_type="genomic DNA" /isolate="edr8" /host="homo sapiens" /db_xref="taxon:6210" gene <1..>366 /gene="co1" CDS <1..>366 /gene="co1" /codon_start=1 /transl_table=9 /product="cytochrome oxidase subunit I" /protein_id="adu " /db_xref="gi: " /translation="pgfgvishiclsissnldvfgfygllfamfsivclgssvwghhm FTVGLDVKTAVFFSSVTMIIGVPTGIKVFTWLYMLLNSNVNASDPVLWWVISFIVLFT FGGVTGIVLSACVLDNVLHD" ORIGIN 1 cccggatttg gtgttattag tcatatttgt ttgaggatta gttctaattt ggatgttttt 61 gggttttatg ggttgttgtt tgctatgttt tctatagtgt gtttaggtag tagtgtttgg 121 ggacatcata tgtttactgt tggattagat gtgaagactg ctgttttttt tagttctgtt 181 actatgatta taggtgttcc tactggtata aaggtgttta cttggttgta tatgttattg 241 aattctaatg ttaatgctag tgatcctgtt ttgtggtggg ttatttcttt tatagtttta 301 tttacgtttg ggggcgtcac tggtatagtt ttgtctgctt gtgtgttgga taatgtttta 361 catgat //

101 EK-13 Echinococcus granulosus isolate edr9 cytochrome oxidase subunit I (CO1) gene, partial cds; mitochondrial GenBank: HQ FASTA Graphics Go to:featuressequence LOCUS HQ bp DNA linear INV 26-DEC-2010 DEFINITION Echinococcus granulosus isolate edr9 cytochrome oxidase subunit I (CO1) gene, partial cds; mitochondrial. ACCESSION HQ VERSION HQ GI: KEYWORDS. SOURCE mitochondrion Echinococcus granulosus ORGANISM Echinococcus granulosus Eukaryota; Metazoa; Platyhelminthes; Cestoda; Eucestoda; Cyclophyllidea; Taeniidae; Echinococcus. REFERENCE 1 (bases 1 to 366) AUTHORS Eryildiz,C. and Sakru,N. TITLE Genotyping of Echinococcus granulosus isolates JOURNAL Unpublished REFERENCE 2 (bases 1 to 366) AUTHORS Eryildiz,C. and Sakru,N. TITLE Direct Submission JOURNAL Submitted (15-DEC-2010) Medical Microbiology, Trakya University Medical School, Gullapoglu, Edirne, Edirne 22030, Turkey FEATURES Location/Qualifiers source /organism="echinococcus granulosus" /organelle="mitochondrion" /mol_type="genomic DNA" /isolate="edr9" /host="cattle" /db_xref="taxon:6210" gene <1..>366 /gene="co1" CDS <1..>366 /gene="co1" /codon_start=1 /transl_table=9 /product="cytochrome oxidase subunit I" /protein_id="adu " /db_xref="gi: " /translation="pgfgiishiclsisanfdafgfygllfamfsivclgssvwghhm FTVGLDVKTAVFFSSVTMIIGVPTGIKVFTWLYMLLNSSVNVSDPVLWWVVSFIVLFT FGGVTGIVLSACVLDNILHD" ORIGIN 1 cctggatttg gtataattag tcatatttgt ttgagtatta gtgctaattt tgatgcgttt 61 gggttttatg ggttgttgtt tgctatgttt tctatagtgt gtttgggtag cagggtttgg 121 ggtcatcata tgtttactgt tgggttggat gtgaagacgg ctgttttttt tagctctgtt 181 actatgatta taggggttcc tactggtata aaggtgttta cttggttata tatgttgttg 241 aattcgagtg ttaatgttag tgatccggtt ttgtgatggg ttgtttcttt tatagtgttg 301 tttacgtttg ggggagttac gggtatagtt ttgtctgctt gtgtgttaga taatattttg 361 catgat //