TEKNİK BÜLTEN NO: 38

Bakanlık Yayın No : 330 Müdürlük Yayın No : 51 ISSN 1300-9508 DEFNE (Laurus nobilis L.) DE KURAKLIĞA UYUM MEKANİZMALARININ UYARILMASI VE OLUŞAN İÇSEL HORMON DEĞİŞİMLERİNİN İNCELENMESİ Investigation of Induction of Tolerance Mechanisms to Drought and Changes of Endogenous Hormones of Laurel (Laurus nobilis L.) (ODC: 161.4) Dr. Hülya AKÇA Dr. Lale YILDIZ AKTAŞ Nuran ALTUN Yasemin YAĞMUR TEKNİK BÜLTEN NO: 38 T.C. ÇEVRE VE ORMAN BAKANLIĞI EGE ORMANCILIK ARAŞTIRMA MÜDÜRLÜĞÜ EGE FORESTRY RESEARCH INSTITUTE İZMİR - TÜRKİYE

Yayın Kurulu Editorial Board Başkan Head Dr. Fevzi BİLGİN Üyeler Members M. Emin AKKAŞ Dr. Mehmet SAYMAN H. Handan ÖNER Hadiye BAŞAR Yayınlayan Ege Ormancılık Araştırma Müdürlüğü Mustafa Kemal Bulvarı No: 75 Zeytinalanı Urla 35315 İzmir TÜRKİYE Published by Ege Forestry Research Institute Mustafa Kemal Bulvarı No: 75 Zeytinalanı Urla 35315 İzmir TURKEY Yayın Kabul Tarihi: 2008 Tel : +90 232 766 34 95 Faks: +90 232 766 34 99 E-posta: egearastirma@cevreorman.gov.tr Web: www.efri.gov.tr Baskı T.C. Çevre ve Orman Bakanlığı Ege Ormancılık Araştırma Müdürlüğü 2008 ISSN 1300-9508

ÖNSÖZ Defne ihracatında her yıl artan talebe karşın, ülkemizde Defne (Laurus nobilis L.) yayılış alanlarının giderek azalması nedeniyle Ege İhracatçı Birlikleri desteğiyle kurumumuz tarafından defne araştırma programı oluşturulmuştur. Bu program içerisinde yer alan çalışmamızda, defnenin kurak koşullara uyumu ile bu süreçte oluşan içsel hormon miktarları ve bazı fizyolojik parametreler belirlenmiştir. Projenin planlanması aşamasında sulama rejimlerinin belirlenmesi ve uygulanması sırasında bizlere yön vererek destekleyen, Sayın Prof Dr. Mehmet Ali UL a sonsuz teşekkürlerimi sunarım. Projenin fidanlık aşamasında yürütülen sulama çalışmalarına katkılarından dolayı, kurumumuz elemanı Sayın Tülin BAŞCI ya emekleri ve desteği için teşekkür ederim. Çalışmamızda içsel bitki hormonlarının tayininde, yöntem konusunda yardımcı olan ve HPLC analizlerini yapan Van Yüzüncü Yıl Üniversitesi Fen Fakültesi Biyoloji Bölümü Öğretim Üyesi Sayın Doç. Dr. Peyami BATTAL a ilgisi ve emekleri için teşekkürlerimi sunarım. Çalışmamız süresince emeği geçen tüm kurum çalışanlarına teşekkür ederim. Aralık 2008 Dr. Hülya AKÇA I

ÖZ Çalışmamızda, Karaburun yöresinden toplanan tohumlardan elde edilen defne fidanları kullanılmıştır. Ege Ormancılık Araştırma Müdürlüğü Fidanlığında yetiştirilen fidanlarda, kuraklığa tolerans mekanizmalarının uyarılması amacıyla; farklı su kısıtlamalarının yanı sıra absisik asit (ABA) ve prolin uygulamaları yapılmıştır. Defne fidanları, 2004 yılı Temmuz- Ekim ayları arasında, haftada üç kez düzenli olarak sulanmış ve yaz kuraklığı sonunda yaprak örnekleri alınmıştır. Defne fidanları 2004 yılı Aralık ayında araziye aktarılmış ve 2005 yılı yaz kuraklığı sonunda ölçümler yapılarak, analizler için yaprak örnekleri alınmıştır. Fidanlık ve arazideki defne fidanlarında; boy ölçümü, yaprak alanı, fotosentetik aktivite, oransal su içeriği, bitki su potansiyeli ölçülmüş ve içsel hormon (IAA, ABA, GA 3, Zeatin) analizleri yapılmıştır. Anahtar sözcükler: Defne, Laurus nobilis L., kuraklık, bitki hormonu, su stresi, prolin. ABSTRACT In this study, laurel seedlings originated the seeds from Karaburun were used. Seedlings were grown in the nursery of Ege Foresty Research Centre. Aiming to induction of tolerance mechanisms to drought in laurel, seedlings were treated with witholding water and also exogenous abscisic acid (ABA) and proline. In nursery stage of project, laurel seedlings were irrigated regularly three times in a week between July-October 2004 and the leaves were harvested at the end of drought period of summer. Seedlings were transfered to the field in December 2004 and at the end of drought season of summer, measurements were done and leaves were harvested. In samples from nursey and field, elongation of seedlings, leaf area, leaf photosynthetic efficiency, relative water content, plant water potential and endogenous hormone content were measured. Key words: Laurel, Laurus nobilis L., drought, phytohormone, water stress, proline. III

İÇİNDEKİLER ÖNSÖZ... I ÖZ... III ABSTRACT... III İÇİNDEKİLER...V ÇİZELGELER DİZİNİ... VII ŞEKİLLER DİZİNİ...X 1. GİRİŞ... 1 2. MATERYAL VE YÖNTEM... 6 2.1 Materyal... 6 2.2 Yöntem... 6 2.2.1 Fidan Harcının Oluşturulması... 6 2.2.2 Prolin ve Absisik Asit (ABA) Uygulaması... 6 2.2.3. Sulama Miktarının Belirlenmesi... 7 2.2.4. Fidanlarda Boy Ölçümü... 7 2.2.5. Defne Fidanlarında Bitki Su Potansiyelinin Belirlenmesi... 7 2.2.6. Defne Fidanlarında Fotosistem II Aktivitesinin Ölçümü (F V /F M )... 7 2.2.7. Yaprak Oransal Su içeriği (RWC)... 7 2.2.8. Yaprak Alanı Ölçümü... 8 2.2.9. İçsel Hormon Miktarlarının Belirlenmesi... 8 2.2.10. Fidanların Arazi Adaptasyonu... 10 2.2.11. İstatistik Analizler... 11 3. BULGULAR... 12 3.1. Yaprak Alanı Bulguları... 12 3.2. 2004 Fidanlık Bulguları... 13 3.2.1. Boy artımı... 13 V

3.2.2. Yaşama Yüzdesi... 14 3.2.3. Yaprak Oransal Su İçeriği (RWC)... 16 3.2.4. Bitki Su Potansiyeli (MPa)... 18 3.2.5. Fotosistem II aktivitesi (F V /F M oranı)... 19 3.2.6. İçsel Hormon Analizleri Sonuçları... 20 3.3. 2005 Arazi Bulguları... 28 3.3.1. Boy Artımı... 28 3.3.2. Yaprak Oransal Su İçeriği (RWC)... 28 3.3.3. Bitki Su Potansiyeli (MPa)... 30 3.3.4. Fotosistem II Aktivitesi (F V /F M ) oranı... 32 3.3.5. İçsel Hormon Analizleri... 34 3.4. Fidan Harcı Analiz Sonuçları... 41 3.5. Toprak Analiz Sonuçları... 41 4. TARTIŞMA... 43 ÖZET... 48 SUMMARY... 50 KAYNAKLAR... 52 EK 1... 58 VI

ÇİZELGELER DİZİNİ Çizelge 1. Defne fidanlarının yaprak alanı ölçümlerinin varyans analizi... 12 Çizelge 2. ABA-prolin uygulamasının yaprak alanına etkisinin Duncan çoklu testi... 12 Çizelge 3. Sulamanın yaprak alanına etkisinin Duncan çoklu testi... 13 Çizelge 4. Fidanlıkta yetiştirilen defnelerde boy artımı sonuçlarına uygulanan varyans analiz tablosu... 13 Çizelge 5. Fidanlıktaki defne fidanlarının boy artımına sulamanın etkisini gösteren Duncan çoklu testi... 14 Çizelge 6. Fidanlık denemesinde defne fidanlarının yaşama yüzdelerinin varyans analiz tablosu... 15 Çizelge 7. Fidanlık denemesinde ABA-prolin ve sulama uygulamalarının fidanların yaşama yüzdesi üzerine etkisinin Duncan çoklu testi... 15 Çizelge 8. Fidanlıktaki defne fidanlarının yapraklarının oransal su içeriklerinin varyans analiz tablosu... 16 Çizelge 9. Fidanlık denemesinde ABA-prolin ve sulama uygulamalarının fidanların yaprak oransal su içeriği üzerine etkisinin Duncan çoklu testi... 17 Çizelge 10. Fidanlıktaki defne fidanlarının bitki su potansiyellerinin varyans analiz tablosu... 18 Çizelge 11. Fidanlık denemesinde ABA-prolin ve sulama uygulamalarının fidanların bitki su potansiyelleri üzerine etkisinin Duncan çoklu testi 19 Çizelge 12. Fidanlıktaki defne fidanlarının yapraklarındaki içsel ABA miktarlarının varyans analiz tablosu... 20 Çizelge 13. Fidanlık denemesinde ABA-prolin ve sulama uygulamalarının fidanların yapraklarındaki içsel ABA miktarları üzerine etkisinin Duncan çoklu testi... 21 VII

Çizelge 14. Fidanlıktaki defne fidanlarının yapraklarındaki içsel giberelik asit miktarlarının varyans analiz tablosu... 23 Çizelge 15. Fidanlık denemesinde ABA-prolin ve sulama uygulamalarının fidanların yapraklarındaki içsel giberelik asit miktarları üzerine etkisinin Duncan çoklu testi... 23 Çizelge 16. Fidanlıktaki defne fidanlarının yapraklarındaki içsel zeatin miktarlarının varyans analiz tablosu... 24 Çizelge 17. Fidanlık denemesinde ABA-prolin ve sulama uygulamalarının fidanların yapraklarındaki içsel zeatin miktarları üzerine etkisinin Duncan çoklu testi... 25 Çizelge 18. Fidanlıktaki defne fidanlarının yapraklarındaki içsel Indol 3- Asetik Asit (IAA) miktarlarının varyans analiz tablosu... 26 Çizelge 19. Fidanlık denemesinde ABA-prolin ve sulama uygulamalarının fidanların yapraklarındaki içsel Indol 3- Asetik Asit (IAA) miktarları üzerine etkisinin Duncan çoklu testi... 27 Çizelge 20. Arazideki defne fidanlarının yapraklarının oransal su içeriklerinin varyans analiz tablosu... 29 Çizelge 21. Arazi denemesinde ABA-prolin ve sulama uygulamalarının fidanların yaprak oransal su içeriği üzerine etkisinin Duncan çoklu testi... 29 Çizelge 22. Arazideki defne fidanlarının bitki su potansiyellerinin varyans analiz tablosu... 31 Çizelge 23. Arazi denemesinde ABA-prolin ve sulama uygulamalarının fidanların bitki su potansiyeli üzerine etkisinin Duncan çoklu testi... 31 Çizelge 24. Arazideki defne fidanlarının Fotosistem II Aktivitesi (F V /F M ) varyans analiz tablosu... 33 VIII

Çizelge 25. Arazi denemesinde ABA-prolin ve sulama uygulamalarının fidanların Fotosistem II Aktivitesi (F V /F M ) üzerine etkisinin Duncan çoklu testi... 33 Çizelge 26. Arazideki defne fidanlarının yapraklarındaki içsel ABA miktarlarının varyans analiz tablosu... 34 Çizelge 27. Arazi denemesinde ABA-prolin uygulamalarının fidanların yapraklarındaki içsel ABA miktarları üzerine etkisinin Duncan çoklu testi... 35 Çizelge 28. Arazideki defne fidanlarının yapraklarındaki içsel giberelik asit miktarlarının varyans analiz tablosu... 36 Çizelge 29. Arazi denemesinde ABA-prolin ve sulama uygulamalarının fidanların yapraklarındaki içsel giberelik asit miktarları üzerine etkisinin Duncan çoklu testi... 36 Çizelge 30. Arazideki defne fidanlarının yapraklarındaki içsel zeatin miktarlarının varyans analiz tablosu... 38 Çizelge 31. Arazi denemesinde ABA-prolin ve sulama uygulamalarının fidanların yapraklarındaki içsel zeatin miktarları üzerine etkisinin Duncan çoklu testi... 38 Çizelge 32. Arazideki defne fidanlarının yapraklarındaki içsel Indol 3- Asetik Asit (IAA) miktarlarının varyans analiz tablosu... 40 Çizelge 33. Arazi denemesinde ABA-prolin ve sulama uygulamalarının fidanların yapraklarındaki içsel Indol 3- Asetik Asit (IAA) miktarları üzerine etkisinin Duncan çoklu testi... 40 Çizelge 34. Fidanlık denemesinde kullanılan harç materyaline ait analiz sonuçları 41 Çizelge 35. Arazi denemesine ait toprak analiz sonuçları... 42 IX

ŞEKİLLER DİZİNİ Şekil 1. Bitki hormon standartlarına ait HPLC kromatogram... 9 Şekil 2. Fidanlık denemesindeki fidanlarda fotosistem II aktivitesi... 20 Şekil 3. 2005 arazi uygulamasında, defne fidanlarındaki boy artımı... 28 X

1. GİRİŞ Bitki gelişimi ve verimliliği, çeşitli biyotik ve abiyotik stres faktörlerinden olumsuz etkilenir. Her bitkinin en iyi şekilde adapte olabileceği bir ortam ve kendine özgü belirli bir çevresel isteği bulunmaktadır. Bu çevrede devamlı veya kısa süreli, olumsuz fakat hemen öldürücü olmayan koşullar stres olarak bilinir. Bir başka yaklaşımla; bitkide metabolizmayı, büyüme ve gelişmeyi etkileyen veya engelleyen, uygun olmayan herhangi bir durum veya madde stres olarak kabul edilir. Elverişsiz bir çevre faktörüne karşı bitkinin hayatta kalabilme yeteneği ise stres direnci veya toleransı olarak adlandırılır (Levitt, 1980). Herhangi bir stres faktörüne maruz kalan organizmanın bütün fonksiyonel düzeylerinde, değişimler ve tepkiler meydana gelir. Stresin ortadan kalkması veya strese karşı direnç sağlanması durumunda, stres geri dönüşümlü olabilir. Ancak stresin uzun süre devam etmesi, şiddetini arttırması veya dayanıklılık sağlanamaması durumunda, bitki canlılığı gerilemeye başlayarak geri dönüşümsüz bir zarara dönüşebilmekte ve bitkinin ölümüne neden olabilmektedir (Özcan vd., 2004). Bitkiler yaşamları boyunca birçok stres faktörü ile karşılaşmaktadırlar. Stres faktörleri, orijinlerine göre biyotik (patojenler, hayvanlar, parazitik bitkiler, allelopati ve çeşitli antropogenik aktiviteler) ve abiyotik (kuraklık, düşük sıcaklık, tuzluluk, su baskını, sıcaklık, radyasyon, oksidatif stres, rüzgâr ve toprağın besleyicilerden yoksun olması gibi) olarak iki grupta ele alınmaktadır. Tarım yapılabilecek alanlar en fazla kuraklık stresinden (% 26) etkilenmektedir. Kuraklığı, sırasıyla tuz stresi, soğuk ve don stresi takip etmektedir (Blum, 1986). Kuraklık stresi büyümeyi ve verimi etkileyen en yaygın çevresel streslerden biri olup bitkilerde fizyolojik, biyokimyasal ve moleküler tepkileri uyarmakta ve böylece bitkiler, şiddetli olmayan çevresel stres koşullarına adapte olmayı sağlayacak tolerans mekanizmaları geliştirebilmektedirler (Arora et al., 2002). Genel olarak kuraklık terimi; topraktaki su içeriğinin, bitkilerin su azlığından sıkıntı çektiği miktara düşünceye kadar, belirgin yağışın olmadığı bir periyodu ifade etmektedir (Özcan vd., 2004). Yağışsız dönemin kuraklık oluşturması; toprağın su tutma kapasitesi ve bitkiler tarafından gerçekleştirilen evapo-transpirasyon hızına bağlı olarak gerçekleşmektedir (Kozlowski and Pallardy, 1997). Kuraklık genel olarak su noksanlığı ve kuruma olarak iki tipe ayrılabilir. Buna göre; su noksanlığı, stomalarda kapanmaya ve gaz değişiminde kısıtlamaya neden olan orta düzeydeki su kaybıdır. Oransal su içeriğinin yaklaşık %70 te kaldığı hafif su noksanlığına maruz kalan bitkilerde stomaların kapanmasına bağlı 1

olarak karbondioksit alımı kısıtlanmaktadır (Kalefetoğlu ve Ekmekçi, 2005). Kuruma, metabolizma ve hücre yapısının tamamen bozulmasına ve sonunda enzimle katalizlenen reaksiyonların durmasına neden olabilecek aşırı miktardaki su kaybıdır. Genel bir kural olarak, kurumaya duyarlı vasküler bitkilerin çoğunda vejetatif doku, %30 un altındaki oransal su kapsamında iyileşme sürecine giremez (Smirnoff., 1993, Kalefetoğlu ve Ekmekçi, 2005). Bitkilerde kuraklık stresinin etkileri mekanik, metabolik ve oksidatif etkiler olarak üçe ayrılabilmektedir. Mekanik etki, bitki hücrelerinde, belirgin su kaybı gerçekleştiği zaman bitkide turgor kaybıyla kendini gösteren birincil strestir (Levitt, 1980). Su kaybına bağlı olarak hücrede hacim azalır, hücre özsuyu konsantrasyonu artar ve protoplazmada artan bir dehidrasyona neden olur. Böylece plazma membranı hücre çeperinden ayrılarak yalnız plazmodezmler aracılığıyla ilişkisini sürdürür (plazmoliz). Gerilim altındaki plazma membranı ve tonoplastta gerçekleşen çökme, yırtılmalara yol açabilir (McKersie and Leshem, 1994) ve zarlar üzerinde yerleşmiş olan hidrolitik enzimler serbest kalarak sitoplazmanın otolizine neden olabilir (Salisbury and Rose, 1992). Bu zarar, normal hücresel metabolizmayı genelde kalıcı olarak bozar. Su eksikliğinde bitkilerin büyümeyle ve özellikle de uzama büyümesiyle ilgili işlemlerde yavaşlamalar ve turgorlarında azalmalar meydana gelmektedir (Özcan vd., 2004). Metabolik etkide ise, hücrede aşırı su kaybının olması durumunda, normal regülasyon devam edemez ve metabolizma bozulur (Kalefetoğlu ve Ekmekçi, 2005). Bu durumda, su kaybıyla gerçekleşen iyon-birikimi, membran bütünlüğünün ve proteinlerin yapısının bozulmasına yol açarak hücreye zarar verebilir. Proteinlerin yapısında bulunan amino asitlerin su ile etkileşimleri bozularak (Campbell, 1991) protein denatürasyonlarına ve enzim inhibisyonlarına neden olur (Bray, 1997). Su eksikliğinin bir sonucu olarak, en çok engellenen enzimlerden biri nitrat redüktazdır. Su kısıtlı hale geldiğinde bitkiler stomalarını kapatır; böylece CO 2 in alınımı kısıtlanır. Kuraklık stresi dokularda fotosentetik aktiviteyi inhibe ederek ışık alımı ile kullanımı arasında dengesizlik oluşumuna neden olur (Foyer and Noctor, 2000). Photosystem II (PSII) aktivitesindeki azalma elektron oluşumu ile kullanımı arasındaki dengeyi bozduğundan, kuantum veriminin değişimine neden olur. Kuraklık stresine maruz kalmış bitkilerde kloroplast fotokimyasında oluşan değişimler, PSII reaksiyon merkezi ve antenna sisteminde aşırı dağılıma neden olmasıyla, kurak koşullarda potansiyel olarak tehlikeli reaktif oksijen türlerinin (ROS-O - 2, 1 O 2, H 2 O 2, OH) oluşumuna neden olur (Peltzer et al., 2002). Kloroplastlarda hızlanan reaktif oksijen türlerinin üretimi Mehler reaksiyonuna neden olur (Asada, 1999). Birçok türde kuraklık stresi altında artan O - 2 oluşum hızı; lipid peroksidasyonuna, yağ asidi doygunluğuna ve sonuçta membranların bütünüyle zarar görmesine neden olur (Sgherry et al., 1996). Bitkiler bu durumda 2

kendilerini antioksidant enzimlerin aktivitesini ve/veya antioksidant molekülleri artırarak savunurlar (Ramachandra Reddy et al., 2000; Chaitanya et al., 2002; Mano, 2002). Vejetatif dokularda kuraklık stresine karşı geliştirilen iki ana savunma mekanizması; kuraklıktan kaçınma ve kuraklık toleransıdır. Bitkiler dokularındaki uygun su içeriklerini koruyabilmek için, topraktan iyileştirilmiş su alınımı, difüzyona dayanıklılıkta erken ve etkili bir artış, transpirasyon yüzeyinin azalması sonucu meydana gelebilen su kaybının azaltılması, yüksek bir su iletim kapasitesi veya su depolaması gibi kuraklıktan kaçınma için gerekli fonksiyonel önlemler almaktadırlar. Bu önlemler bitki morfolojisine de yansımaktadır. Yaprak alanının küçülmesi, nemli toprak tabakalarına doğru derinlemesine kök gelişimi ve stomaların kapanması kuraklığa karşı savunmanın ilk adımları olarak örnek verilebilir (Larcher, 1995; Taiz and Zeiger, 1998). Kuraklıktan kaçınmada; protoplazmanın su potansiyelindeki zarar verici bir azalmanın uzun sürmesi engellenebilmektedir. Kuraklık toleransında ise, protoplazma zarar görmüş hale gelmeden daha fazla kuruma göstermektedir (Özcan vd., 2004). Kuraklık toleransı, türe özeldir ve protoplazmanın su kaybını ciddi boyutta tolere etme kapasitesini adapte etmektedir. Su stresine karşı bitkilerin toleranslılıkları açısından; belli bir sürede nispi büyüme oranlarının tespit edilerek, en uygun toprak-su koşullarında yetiştirilen kontrol bitkileriyle, su stresine maruz kalmış bitkilerin kuru maddelerinin karşılaştırılması ve bu bitkilerin stomalarını kapatarak ve yapraklarını dökerek su stresinden kaçınma yeteneklerinin belirlenmesi büyük önem taşır. Kuraklık stresine karşı oluşturulacak cevabın regülasyonundaki ilk basamak stresin algılanmasıdır. Hücreden suyun kaybı, hücresel bir sinyal iletim yolunu tetiklemektedir. Bu durumda su kaybının hücresel algılanmasını takiben, bir sinyal mekanizması ile spesifik genler aktive edilmektedir (Bray, 1997). Bazı genler kuraklık stresine oldukça hızlı cevap verirken; diğerleri ABA birikiminden sonra, yavaş olarak indüklenmektedir. Su kaybı ABA üretimini tetikler ve sentezlenen ABA, çeşitli genlerin indüklenmesini uyarır (Shinozaki and Yamaguchi-Shinozaki, 1996). Su noksanlığı koşulları altında bitki hormonu absisik asit (ABA), dehidrasyona tepkide ve toleransta temel bir rol oynar (Ramachandra Reddy et al., 2004). Absisik asitin kuraklık, tuzluluk ve düşük sıcaklık stresleri gibi farklı abiyotik streslerde toleransı uyarmak üzere (Giraudat et al., 1994; Chandrasekar et al., 2000; Ramachandra Reddy et al., 2004), stoma açılmasını (Hartung et al., 1998) ve kök hidrolik konduktivitesini düzenlediği (Hose et al., 2001; Wilkinson and Davies, 2002) rapor edilmiştir. 3

Kuraklık sonucunda osmotik strese maruz kalan bitkiler, osmolitler olarak bilinen ve turgorun devamını sağlayan maddeleri biriktirirler. Osmotik koruyucular büyük ölçüde organeller de dahil olmak üzere sitoplazmada birikmekte ve vakuolde neredeyse hiç bulunmamaktadır (Moghaieb et al., 2004). Osmotik düzenleme, hücresel çevrenin su potansiyelindeki düşüşe cevap olarak, hücrede organik ve inorganik çözünür maddelerin aktif birikimini içermektedir (Sánchez et al., 2004). Biriken organik bileşikler hücre içinde kararlı durumda bulunmakta, kolaylıkla metabolize edilememekte ve yüksek konsantrasyonlarda birikimleri durumunda bile hücresel fonksiyonlarını negatif etkileri bulunmamaktadır (Iba, 2002). Osmotik düzenleme, su noksanlığına cevapta, çözünür maddelerin net birikimlerine bağlı olarak, osmotik potansiyelin düşürülmesini ifade etmekte ve büyüme, fotosentez ve stomaların açılması gibi fizyolojik fonksiyonlar üzerinde stresin etkilerinin sınırlanmasını sağlayan yüksek bir turgor potansiyeli devamıyla sonuçlanmaktadır (Chimenti et al., 2002). Prolin, betainler, dimetilsülfoniopropionat (DMSP), polyoller (mannitol, sorbitol, pinitol), trehaloz ve fruktanlar osmotik koruyuculara örnektir (Smirnoff, 1998). Bunlardan prolin, osmotik bir koruyucu olup subselular yapıların korunması ile serbest radikallerin uzaklaştırılmasında rol oynarken (Mani et al., 2002); kuraklık stresine cevapta oluşturulan osmotik düzenleme yukarıda belirtilen osmolitlerin sentezinde görev alan spesifik enzimler (prolin-5-karboksilat sentetaz, prolin-5-karboksilat redüktaz, betain aldehid dehidrogenaz, kolin monooksidaz gibi) ile sağlanmaktadır (Bray, 1997; Moghaieb et al., 2004). En önemli osmolitlerden biri olan prolin, hücrede osmotik düzenlemede rol alan ve dehidrasyon sürecinde proteinlerin korunmasını sağlayan önemli bir amino asittir (Rontein et al., 2002). Aynı zamanda serbest radikallerin detoksifiye edilmesindeki etkinliği ile bitkilerin özellikle kuraklık ve tuz stresinde stresin üstesinden gelmelerinde önemli bir moleküldür (Ramachandra Reddy et al., 2004; Verslues and Bray, 2006). Akdeniz iklimi sıcaklık ve su açısından mevsimler arasında çok büyük farklılıklar göstermektedir (Di Castri and Mooney, 1973). Yaz aylarında ışık şiddeti ve sıcaklık oldukça yüksekken, yağış minimum seviyededir. Bitkide yüksek oranda evaporasyona neden olan, kuru, sıcak ve bulutsuz yaz mevsimi Akdeniz iklimi etkisindeki lokal flora üzerinde en stresli periyodu oluşturmaktadır (Mooney, 1981). Laurus nobilis L. (defne) Akdeniz Bölgesi vejetasyonunun yavaş büyüyen bir üyesidir. De Lillis (1991) tarafından defnenin kuraklığa toleranslı bir tür olduğu ve suyu düşük düzeyde kullandığı rapor edilmiştir. Kserofitik (kurak bölgelerde yetişebilen bitkiler) grubuna dahil olan bitkiler sukkulent ve sukkulent olmayan bitkiler olarak ayrılmaktadır. Kseromorf özellik gösteren ve sukkulent olmayan çok yıllık bitkilerden Laurus nobilis in de dahil olduğu grup, terlemeyi azaltma özeliği gösterecek şekilde değişikliğe uğramıştır. Defnenin yanı sıra mersin (Myrtus communis) ve zeytinin de (Olea europea) yaprakları sert ve derimsi şekilde olup 4

çok az su içerirler. Küçük ve kalın çeperli parankima hücrelerinden meydana gelen mezofil dokularında bol sklerenkima elementleri, sklereitler bulunmaktadır. Epidermis hücrelerinin dış çeperleri kalınlaşmış ve üzeri kalın bir kütiküla tabakası ile çevrilmiştir. Stomaların sayısı azalmış ve epidermis hücreleri arasına gömülmüş durumdadır. Bir kısmında ise epidermis hücrelerinin üzeri kalkan şeklinde tüylerle kaplanmıştır (Kılınç ve Kutbay, 2004). Akdeniz Bölgesi vejetasyonunun diğer üyelerinde olduğu gibi genç defne fideleri de yeterince uzun olmayan kök sistemleri nedeniyle ergin bireylere göre kuraklığa duyarlıdırlar (Lo Gullo et al., 2003). Bu tür, gelişiminin erken aşamasında su eksikliğinden fazlasıyla zarar görebilir. Laurus nobilis yaprakları ve meyveleri ticari öneme sahiptir ve Ege İhracatçı Birlikleri raporuna (2005) göre her yıl dünya tüketimi % 5 artmaktadır. Defnenin kuraklığa tolerans potansiyeli, genç fideler toprağa tutunarak kök boyları artıncaya dek artırmalıdır. Bu yolla Güney ve Batı Anadolu kıyılarında makilik veya bozunmuş alanlarda yeniden orman oluşturmak ve defne üretimini artırmak mümkündür. Literatürden elde edilen bilgiler ışığında, defnenin ekolojik karakteristikleri, hidrolitik yapısı (mimarisi) (Niinemets et al., 2005; Salleo et al., 2001) ve aromatik özeliklerinin (Hassiotis and Efthymiou, 2000; Acar, 1987) yoğun olarak çalışılmış olmasına karşın; bu bitkinin hormon içeriği ile bunun kuraklığa aklimasyon veya toleransına etkisi belirlenmemiş bir konudur. Bu çalışmada, Laurus nobilis L. fidelerine dışarıdan absisik asit (ABA) ve prolin uygulanmasının yanı sıra farklı su kısıtlamalarıyla defnenin kuraklığa tolerans mekanizması ve bu süreçte oluşan fizyolojik değişimlerin belirlenmesi amaçlanmaktadır. 5

2. MATERYAL VE YÖNTEM 2.1 Materyal Karaburun yöresinden toplanan defne tohumları ile Ege Ormancılık Araştırma Müdürlüğü serasında yetiştirilen defne fidanları materyal olarak kullanılmıştır. 2.2 Yöntem 2.2.1 Fidan Harcının Oluşturulması Fidanların yetişme ortamı olarak hazırlanan tüp harcı mil: torf: orman toprağı: gübre: kum (3:3:2:2:0.5) oranında hazırlanan karışımdan elde edilmiştir. Ege Ormancılık Araştırma Müdürlüğü Fidanlığında homojen bir karışım elde edilinceye kadar karıştırılan harç tartılarak tüplere birer kilogram olarak konulmuştur. Karaburun Ambarseki Köyü nden toplanan ve serada çimlendirilen tohumlar daha sonra torbalara alınarak bir ay beklenilmiş, önce absisik asit (ABA) ve prolin uygulaması ve ardından sulama rejimi uygulamasına başlanmıştır. Biri kontrol olmak üzere 6 grup, 3 farklı sulama, 2 tekerrürlü olarak ve herbir sulama için 25 adet fidan olmak üzere toplam 900 fidan kullanılmıştır (6x3x2x25=900). 2.2.2 Prolin ve Absisik Asit (ABA) Uygulaması Bitkide kuraklığa uyum mekanizmalarının uyarılması amacıyla defne fidanlarına farklı konsantrasyonlarda ABA ve prolin 02 Temmuz 2004 tarihinde uygulanmıştır. Bu konsantrasyonlar: 1. grup: 100µM ABA + 1µM prolin 2. grup: 50µM ABA + 1µM prolin 3. grup: 100µM ABA 4. grup: 50µM ABA 5. grup: 1µM prolin 6. grup: kontrol olarak belirlenmiştir. Absisik asit ve prolinin hem birlikte hem de ayrı ayrı etki düzeylerinin ortaya konması hedeflenmiştir. 6

Fidanlara uygulanan ABA ve prolinin yapraklarda tutulması amacıyla yayıcı-yapıştırıcı olarak kullanılan Tween 80 her örneğe %0,1 oranında eklenmiştir. 2.2.3. Sulama Miktarının Belirlenmesi Sulama miktarının belirlenmesinde tanık fidanlardan yararlanılmıştır. Bu amaçla ayrılan altı adet fidan sulama öncesi ve sonrası tartılarak aradaki fark hesaplanmıştır. Elde edilen altı fidan ölçüm sonuçlarının ortalaması tam doygunluk olarak belirlenmiş ve bu ortalamanın %75, %50 ve %25 i oranında sulama yapılmıştır. Kontrollü sulama haftada üç kez dört ay süresince yapılmıştır. 2.2.4. Fidanlarda Boy Ölçümü Defne fidanlarında boy ölçümleri kontrollü sulama ile birlikte başlamış (Temmuz 2004) araziye dikildikleri Aralık 2004 e kadar yapılmıştır. 2.2.5. Defne Fidanlarında Bitki Su Potansiyelinin Belirlenmesi Bitki su içeriğinin belirlenmesi amacıyla, fidanlık ve arazideki fidanların sürgün uçlarından bitki su potansiyeli ölçme cihazı kullanılarak ölçümler yapılmıştır. 2.2.6. Defne Fidanlarında Fotosistem II Aktivitesinin Ölçümü (F V /F M ) Fidanlık ve arazi şartlarında her grup için fotosentetik aktivite ölçümleri 2005 yaz kuraklığı sonunda ölçülmüştür. In vivo klorofil floresansı, bitki etkilik analizörü (Hansatech, UK) kullanılarak ölçülmüştür. Fotosistem II nin (F V /F M : değişken ve maksimum floresans oranı) maksimum kuantum verimi 30 dakika karalığa adapte edilmiş örneklerde ölçülmüştür 2.2.7. Yaprak Oransal Su içeriği (RWC) Yaprak oransal su içeriği (RWC) Ekanayake et al., (1993) metoduna göre belirlenmiştir. Yaprak materyali (4 yaprak), taze ağırlığın belirlenmesi için tartıldıktan sonra saf su içerisinde +4 C de 19 saat tutularak turgorlu duruma getirilmiş ve saf sudan alınan yapraklarda turgorlu ağırlıklar kaydedilmiştir. Aynı yapraklar etüvde 65-70 C de 48 saat tutularak kurutulmuş ve kuru ağırlıkları tartılmıştır. Yaprakların oransal su içeriği (RWC) aşağıda gösterilen formülle hesaplanmıştır: RWC = [(taze ağırlık- kuru ağırlık) / (turgorlu ağırlık- kuru ağırlık)] x 100 7

2.2.8. Yaprak Alanı Ölçümü Farklı sulama rejimi yanında ABA ve prolin uygulamalarının yaprak alanına etkisini test etmek amacıyla fidanlarda yaprak alanı ölçülmüştür (Odabaş ve Gülümser, 2005). Yaprak alanı: 9,68434 + boy x 1,763312 + en x 4,066757 2.2.9. İçsel Hormon Miktarlarının Belirlenmesi 2.2.9.1. Hormon Ekstraksiyonu Sıvı azot içerisinde iki gram defne yaprağı toz haline getirilmiştir. Toz haline getirilen materyal -40 ºC de soğutulmuş %80 lik 20 ml metanol ile parçalanarak ekstre edilmiştir. Parçalama sırasında 0,2 gr BHT antioksidant olarak ilave edilmiştir. Örnekler +4 ºC de 24 saat bekletilerek ekstraksiyon işlemine devam edilmiştir. Bekletilen örnek Whatman No:1 den süzüldükten sonra kalan posaya 10 ml %80 metanol eklenerek, 30 dakika +4 ºC de bekledikten sonra tekrar süzülmüştür. Ardından süpernatantlar birleştirilmiştir. Birleştirilen süpernatantlar 0,45µm lik PTFE filtrelerinden (Cutting, 1991) geçirilirek elde edilen filtrat evaporatörde kurutulmuştur. Kalıntı 100µM KH 2 PO 4 (ph 8,0) tamponunda tekrar çözülmüştür. Örnekler +4ºC de 1 saat süreyle 10.000 g de santrifüj edilmiştir. Fenolik bileşikleri ve renk maddelerini ayırmak için (Qamaruddin et al., 1990; Kovac and Zel, 1994), her örneğe daha önceden hazırlanmış çözünmeyen Polivinilpolipirolidon dan (PVPP) 1 er gram konulmuştur. PVPP ile karıştırılan supernatant, Whatman No:1 filtre kağıdından süzülerek PVPP den ayrılmıştır. Daha spesifik bir ayırım yapabilmek için Sep-Pak C 18 kartuşları kullanılmıştır (Machackova vd. 1993). Kartujdan geçirilen örnekler HPLC analizinde kullanılmak üzere -40ºC de saklanmıştır (Cheikh ve Jones 1994). 2.2.9.2. HPLC de Bitki Hormonlarının Analizi Saflaştırılan örneklerin HPLC de miktar tayinlerinin yapılabilmesi amacıyla, HPLC de uygun kolon, mobil faz ve tampon içerisinde öncelikle standart olarak alınan ve HPLC grade IAA, GA, ABA ve Sitokinin in (trans-zeatin) kromatogramları elde edilmiştir. 8

Şekil 1. Bitki hormon standartlarına ait HPLC kromatogram Figure 1. HPLC chromatograme of plant hormone standards Alıkonma süreleri: 1: GA 3 2,4 dk; 2: t-z 5,2 dk. 3: IAA 8,72 dk. 4: ABA 24,6 dk. Kolon: µbondapak C18; Detektör: UV; Mobil faz: %12,5 asetonitril; ph: 4,98; Tampon: TEAA HPLC analizi için izokratik sistem kullanılmıştır. Viallere alınmış olan örnekler; Waters 6000 A pompası (Hichrom Ltd. UK), Ultraviyole dedektör (Unicam Analytical Systems, Cambridge, UK) ve μbondapak C18 kolon (Waters, Hichrom Ltd. UK) bulunan HPLC sisteminde analiz edilmiş, mobil faz olarak asetonitril kullanılmıştır (%12; ph 4.98). Akış hızı 2 ml dk-1, basınç 2000 psi ve dalga boyu 265 nm olarak seçilmiştir. Bu koşullar altında, standartlar kullanılarak GA3, Z, IAA ve ABA için retensiyon zamanları 2,85, 3,88, 7,17 ve 22,21 dakika olarak belirlenmiştir. 9

2.2.10. Fidanların Arazi Adaptasyonu 2.2.10.1. Sahanın Toprak Yapısının Belirlenmesi Defne fidanlarının arazi adaptasyonu amacıyla Seferihisar-Doğanbey ağaçlandırma sahası seçilmiştir. Belirlenen sahadan alınan toprak örneklerinin kimyasal ve fiziksel özellikleri laboratuvarda analizlerle belirlenmiştir. Bu amaçla alınan örnekler öncelikle hava kurusu haline getirilip, 2mm lik elekten geçirildikten sonra aşağıda sıralanan analizlere hazır hale getirilmiştir (Kacar, 1993). Tekstür (Bünye): Toprak bünyeleri Bouyoucos Hidrometre Yöntemi ile belirlenmiştir (Gülçur, 1974). Total Kireç: Total kireç miktarları Scheibler Kalsimetre Yöntemi ile belirlenmiştir (Kacar, 1993). EC 103: Elektriki iletkenlikleri 1:2,5 oranında hazırlanmış süspansiyonda cam elektrotlu EC metre ile belirlenmiştir (Jackson, 1958). Toprak reaksiyonu (ph) : Toprak örneklerinin reaksiyonları (ph), 1:2,5 oranında toprak-su süspansiyonunda cam elektrotlu ph metre ile ölçülmüştür (Jackson, 1958). Organik Madde: Organik madde miktarları Walkley-Black Yaş Yakma Yöntemi ile belirlenmiştir (Kacar, 1993). Total Azot: Total azot içerikleri Kjeldahl Yöntemi ile tam otomatik Kjeltec-20 cihazı kullanılarak belirlenmiştir (Bremner, 1965). Yarayışlı Fosfor: Fosfor miktarları, toprakların ph ve kireç miktarları göz önünde bulundurularak, Olsen Yöntemi ve Bray-Kurtz No 1 Yöntemi ne göre belirlenmiştir (Kacar, 1993). Değişebilir Potasyum, Kalsiyum: Nötr 1N Amonyum Asetat Yöntemi ile flamefotometre ve atomik absorbsiyon spektrofotometre (AAS) kullanılarak belirlenmiştir (Jackson,1958). Bulgulara ait minimum ve maksimum değerler profil derinlik kademeleri esas alınarak, genel toprak özellikleri ise tüm profil esas alınarak değerlendirilmiştir. Sadece fosfor analizinde toprak reaksiyonuna ve kireç içeriğine bağlı olarak iki farklı yöntem kullanıldığından, fosfor değerlerinde minimum ve maksimum değerler verilmemiştir. 2.2.10.2. Deneme Deseninin Oluşturulması Fidanlar araziye fidanlıkta uygulanan deneme desenine göre dikilememiştir. Fidanlara uygulanan %25 lik su rejiminde araziye taşınabilecek sayıda fidan kalmaması nedeniyle deneme deseninde değişiklik yapılmasına karar verilmiştir. Sonuçların istatistiksel olarak değerlendirilemeyeceği gerekçesiyle araziye %75 ve 10

%50 sulama uygulanan gruplardan sekizer fidan üç yinelemeli olarak dikilmiştir. Ancak ileride yapılabilecek ölçümler ve gözlemler amacıyla yineleme yapılmaksızın araziye dördüncü blok olarak, %25 sulama uygulanan fidanlardan her grup için altışar fidan dikilmiştir. 2.2.11. İstatistik Analizler Elde edilen veriler tesadüf blokları deneme desenine göre 2 faktörlü 3 tekerrürlü olarak değerlendirilmiştir. İstatistik analizler Tarist istatistik programının bu yönteme uygun gelen modeli kullanılarak yapılmıştır. 11

3. BULGULAR 3.1. Yaprak Alanı Bulguları Yaprak alanına, sulama ve ABA ile prolin uygulamalarının etkisi genel olarak değerlendirildiğinde, her iki faktörün yaprak alanı üzerinde etkili olduğu belirlenmiştir. Sulama miktarının azalmasına paralel olarak yaprak alanının azaldığı görülmektedir. Yaprak alanı kontrol bitkilerinde daha düşükken uygulama yapılmış olan bitkilerde bu azalma sınırlıdır. Çizelge 1. Defne fidanlarının yaprak alanı ölçümlerinin varyans analizi Table 1. The variance analysis of leaf area of laurel seedlings VARYANS ANALİZ TABLOSU Varyasyon kaynağı Serbestlik derecesi Kareler toplamı 12 Kareler ortalaması Hesaplanan F Alfa tipi hata ihtimali Tekerrür 9 1618.265 179.807 0.249ns 0.9856 Faktör-A 5 64617.370 12923.474 17.878*** 0.0000 Faktör-B 2 127868.761 63934.381 88.445*** 0.0000 A*B 10 3139.970 313.997 0.434ns 0.9277 Hata 153 110599.649 722.874 Genel 179 307844.016 1719.799 Çizelge 2. ABA-prolin uygulamasının yaprak alanına etkisinin Duncan çoklu testi Table 2. Results of Duncan multiple range test for ABA-proline treatment on leaf area Test Edilen Karakter: Alan Ana faktör: Hormon ****D U N C A N Ç O K L U T E S T İ**** Orijinal sıra Testten sonra 1 172.341 5 183.606 a 2 180.646 2 180.646 a 3 180.148 3 180.148 a 4 177.455 4 177.455 a 5 183.606 1 172.341 a 6 128.854 6 128.854 b Hko=722,874 dir.

Çizelge 3. Sulamanın yaprak alanına etkisinin Duncan çoklu testi Table 3. Results of Duncan multiple range test for irrigation on leaf area Test Edilen Karakter: Alan Ana faktör: Sulama ****D U N C A N Ç O K L U T E S T İ**** Orijinal sıra Testten sonra 1 201.355 1 201.355 a 2 173.845 2 173.845 b 3 136.325 3 136.325 c Hko=722,874 dir. Varyans analizi sonuçlarına uygulanan Duncan testi sulamanın yaprak alanına etkisini üç farklı grup oluşturarak açıkça ortaya koymaktadır. Diğer bir deyişle, sulama artışına paralel olarak yaprak alanının da arttığı görülmektedir. ABA ve prolin uygulamasında ise Duncan testine göre kontrol grubu en küçük yaprak alanına sahip olup tek başına, diğer beş farklı uygulama ise hep birlikte bir grup oluşturmuştur. 3.2. 2004 Fidanlık Bulguları 3.2.1. Boy artımı Fidanlıkta 2004 yılı içerisinde ABA ve prolin ile sulama işlemleriyle birlikte başlatılan boy ölçümlerinin yaz kuraklığı sonundaki boy farklarından elde edilen sonuçlara varyans analizi uygulanmıştır. ABA ve prolin uygulamalarının etkisi ise istatistiksel önemde bulunmamıştır. Sulama kısıtlarının boy üzerindeki etkisi istatistiksel anlamda önemli çıkması nedeniyle sonuçlara Duncan testi uygulanalarak gruplar belirlenmiştir. Tarla kapasitesinin % 25 i oranında sulanan fidanlarda en düşük, % 75 oranında sulanan fidanlarda ise en yüksek olmak üzere boy artımında su kısıtına paralel olarak üç farklı grup oluşmuştur. Çizelge 4. Fidanlıkta yetiştirilen defnelerde boy artımı sonuçlarına uygulanan varyans analiz tablosu Table 4. The variance analysis of elongation of seedlings in nursery Kullanılan Değişkenler Tekerrür Tekerrür Seviyesi 1 2 FaktörA ABA-Prolin Seviyesi 1 6 FaktörB SULAMA Seviyesi 1 3 13

Analizi yapılan karakter: Boy artımı VARYANS ANALİZ TABLOSU Varyasyon kaynağı Serbestlik derecesi Kareler toplamı Kareler ortalaması Hesaplanan F Alfa tipi hata ihtimali Tekerrür 1 0.200 0.200 1.545ns 0.2292 Faktör-A 5 0.726 0.145 1.125ns 0.3848 Faktör-B 2 19.736 9.868 76.402*** 0.0000 A*B 10 0.633 0.063 0.490ns 0.8739 Hata 17 2.196 0.129 Genel 35 23.490 0.671 Çizelge 5. Fidanlıktaki defne fidanlarının boy artımına sulamanın etkisini gösteren Duncan çoklu testi Table 5. Results of Duncan multiple range test for irrigation on elongation of seedlings in nursery Test Edilen Karakter: Boy artımı Ana faktör: Sulama ****D U N C A N Ç O K L U T E S T İ**** Orijinal sıra Testten sonra 1 3.106 1 3.106 a 2 2.273 2 2.273 b 3 1.294 3 1.294 c Hko=0.129 dir. 3.2.2. Yaşama Yüzdesi Fidanlıkta yaz kuraklığı ardından elde edilen canlı birey sayılarına uygulanan varyans analizi sonuçlarına göre ABA-prolin uygulaması ve sulama ile bu işlemler arasındaki interaksiyon istatistiksel anlamda önemli olmuştur. %75 ve %50 sulamalarda 50 μm ABA + Prolin (2 no lu işlem) uygulamasında en yüksek yaşam yüzdesi (sırasıyla %90 ve %92) belirlenmiştir. Buna karşın %25 sulamada tek başına prolin (5 no lu işlem) uygulaması en yüksek yaşama yüzdesine (%52) sahip olmuştur. 14

Çizelge 6. Fidanlık denemesinde defne fidanlarının yaşama yüzdelerinin varyans analiz tablosu Table 6. The variance analysis of surviving percentage of seedlings in nursery Kullanılan Değişkenler Tekerrür Tekerrür Seviyesi 1 2 FaktörA ABA-Prolin Seviyesi 1 6 FaktörB SULAMA Seviyesi 1 3 Analizi yapılan karakter: Yaşama yüzdesi Varyasyon kaynağı Serbestlik derecesi VARYANS ANALİZ TABLOSU Kareler Kareler Hesaplanan toplamı ortalaması F Alfa tipi hata ihtimali Tekerrür 1 100.000 100.000 1.763ns 0.1995 Faktör-A 5 2308.000 461.600 8.140*** 0.0007 Faktör-B 2 11122.667 5561.333 98.073*** 0.0000 A*B 10 2381.333 238.133 4.199** 0.0050 Hata 17 964.000 56.706 Genel 35 16876.000 482.171 Çizelge 7. Fidanlık denemesinde ABA-prolin ve sulama uygulamalarının fidanların yaşama yüzdesi üzerine etkisinin Duncan çoklu testi Table 7. Results of Duncan multiple range test for irrigation and ABA-proline on surviving percentage of seedlings in nursery Fidanlık yaşama yüzdesi Duncan çoklu testi %75 SULAMA %50 SULAMA %25 SULAMA 2 92.000 a 5 52.000 a 4 92.000 a 4 42.000 ab 1 88.000 ab 1 40.000 ab 3 76.000 ab 3 40.000 ab 5 72.000 b 2 30.000 b 6 52.000 c 6 30.000 b 2 90.000 a 1 88.000 ab 4 72.000 bc 3 64.000 c 6 64.000 c 5 62.000 c Hko=56.706 dir 15

ABA1+ Prolin 1 88.000 a 2 88.000 a 3 40.000 b Fidanlık yaşama yüzdesi Duncan çoklu testi ABA2+ Prolin 2 92.000 a 1 90.000 a 3 30.000 b ABA1 ABA2 Prolin Kontrol 2 76.000 a 1 64.000 a 3 40.000 b 16 2 92.000 a 1 72.000 b 3 42.000 c 2 72.000 a 1 62.000 ab 3 52.000 b 1 64.000 a 2 52.000 a 3 30.000 b Hko=56.706 dir. Varyans analizi sonuçlarına uygulanan Duncan testine göre%75 ve %50 sulamada uygulamalar üç grup oluştururken, %25 sulamada iki grup oluşmuştur. Su kısıtı artmasıyla (%50 ve %25) ABA-prolin uygulaması yapılmayan kontrol grubunun, yaşama yüzdesi en düşük grup olarak en alt sırada yer aldığı görülmektedir. 3.2.3. Yaprak Oransal Su İçeriği (RWC) Defne fidanlarının yapraklarında ölçülen oransal su içeriği miktarlarına uygulanan varyans analizinde yapraktaki oransal su içeriği üzerinde, ABA ve prolin uygulamasının istatistiksel anlamda önemli bir etkisinin olmadığı, ancak sulamanın ve iki işlem arasındaki interaksiyonun önemli olduğu belirlenmiştir. Çizelge 8. Fidanlıktaki defne fidanlarının yapraklarının oransal su içeriklerinin varyans analiz tablosu Table 8. The variance analysis of leaf relative water content of seedlings in nursery Kullanılan Değişkenler Tekerrür Tekerrür Seviyesi 1 2 FaktörA ABA-Prolin Seviyesi 1 6 FaktörB SULAMA Seviyesi 1 3 Analizi yapılan karakter: RWC V A R Y A N S A N A L İ Z T A B L O S U Varyasyon kaynağı Serbestlik derecesi Kareler toplamı Kareler ortalaması Hesaplanan F Alfa tipi hata ihtimali Tekerrür 2 6.448 3.224 0.247ns 0.7842 Faktör-A 5 74.713 14.943 1.146ns 0.3553 Faktör-B 2 850.653 425.326 32.631*** 0.0000 A*B 10 1010.834 101.083 7.755*** 0.0000 Hata 34 443.171 13.034 Genel 53 2385.819 45.015

Çizelge 9. Fidanlık denemesinde ABA-prolin ve sulama uygulamalarının fidanların yaprak oransal su içeriği üzerine etkisinin Duncan çoklu testi Table 9. Results of Duncan multiple range test for irrigation and ABA-proline on leaf relative water content of seedlings in nursery Fidanlık RWC Duncan çoklu testi %75 SULAMA %50 SULAMA %25 SULAMA 2 97.490 a 4 96.720 a 3 93.527 a 1 92.977 ab 6 96.097 a 5 84.080 b 4 88.497 bc 2 92.867 ab 6 82.583 bc 3 87.297 bc 1 92.063 ab 1 80.967 bc 5 86.203 c 5 89.233 b 4 79.983 bc 6 82.197 c 3 88.803 b 2 76.993 c Hko=13.034 dir ABA1+ Prolin 1 92.977 a 2 92.063 a 3 80.967 b Hko=13.034 dir. ABA2+ Prolin 1 97.490 a 2 92.867 a 3 76.993 b Fidanlık RWC Duncan çoklu testi ABA1 ABA2 Prolin Kontrol 3 93.527 a 2 88.803 a 1 87.297 a 17 2 96.720 a 1 88.497 b 3 79.983 c 2 89.233 a 1 86.203 a 3 84.080 a 2 96.097 a 3 82.583 b 1 82.197 b Sulamanın ABA ve prolin uygulamasına RWC değerleri açısından etkisi Duncan testi ile ortaya konulmuştur. Bu sonuçlara göre; %75 sulamada RWC değerleri açısından istatistiksel anlamda önemli farklılıklar içeren üç grup oluşmuştur. Bu gruplardan, 50 μm ABA + Prolin (2 no lu işlem) uygulaması yapılan fidanlar en yüksek, kontrol grubu ise (6 no lu işlem) en düşük oransal su içeriği değerine sahiptir. %50 sulamada ise istatistiksel önemde farklı iki grup oluşmuştur. Bu sulamada 50 μm ABA uygulaması (4 no lu işlem) yapılan fidanlar en yüksek, prolin uygulaması (3 no lu işlem) yapılan fidanlar ise en düşük oransal su içeriği değerine sahip olmuştur. %25 sulama ise 100 μm ABA (3 no lu işlem) uygulanması; en yüksek oransal su içeriği değeri ile tek başına birinci grubu, 5, 6, 1, 4 ikinci grubu, 2 en düşük RWC değeri ile 6, 1, 4 ile birlikte üçüncü grubu oluşturmuştur.

Bunun yanı sıra ABA ve prolin uygulamalarının, sulama üzerine RWC değerleri açısından etkisinin test edildiği Duncan testi sonuçlarına göre; 3 ve 5 no lu uygulamalarda su kısıtının istatistiksel önemde bir fark oluşturmadığı bulunmuştur. 1 ve 2 numaralı uygulamalarda iki farklı grup oluştuğu ve sıralamanın %75,%50, %25 şeklinde olduğu görülmektedir. 4 no lu uygulamada 3 (%50, %75,%25), 6 no lu uygulamada ise iki farklı grup oluşmuştur (%50, %25-%75). 3.2.4. Bitki Su Potansiyeli (MPa) Fidanlıkta yetiştirilen defne fidanlarında ölçülen ozmotik basınç değerlerine varyans analizi uygulanmıştır. Bu sonuçlara göre ABA ve prolin uygulaması ile sulamanın bitki su potansiyeli üzerinde etkisinin istatistiksel anlamda önemli olduğu belirlenmiştir. Ayrıca her iki işlem arasındaki ilişkinin de istatistiksel önemde olduğu bulunmuştur. Çizelge 10. Fidanlıktaki defne fidanlarının bitki su potansiyellerinin varyans analiz tablosu Table 10. The variance analysis of water potential (osmotic pressure) of seedlings in nursery Kullanılan Değişkenler Tekerrür Tekerrür Seviyesi 1 2 FaktörA ABA-Prolin Seviyesi 1 6 FaktörB SULAMA Seviyesi 1 3 Varyasyon kaynağı Analizi yapılan karakter: Bitki su potansiyeli Serbestlik derecesi VARYANS ANALİZ TABLOSU Kareler Kareler toplamı ortalaması Hesaplanan F Alfa tipi hata ihtimali Tekerrür 2 0.006 0.003 1.338ns 0.2753 Faktör-A 5 1.198 0.240 100.153*** 0.0000 Faktör-B 2 5.196 2.598 1086.140*** 0.0000 A*B 10 0.603 0.060 25.225*** 0.0000 Hata 34 0.081 0.002 Genel 53 7.085 0.134 18

Çizelge 11. Fidanlık denemesinde ABA-prolin ve sulama uygulamalarının fidanların bitki su potansiyelleri üzerine etkisinin Duncan çoklu testi Table 11. Results of Duncan multiple range test for irrigation and ABA-proline on water potential (osmotic pressure) of seedlings in nursery Fidanlık bitki su potansiyeli Duncan çoklu testi %75 SULAMA %50 SULAMA %25 SULAMA 3 1.920 a 5 2.530 a 2 1.730 b 2 2.300 b 6 1.680 bc 3 2.300 b 5 1.680 bc 6 2.300 b 1 1.630 c 4 2.020 c 4 1.600 c 1 1.720 d 3 1.630 a 6 1.543 b 2 1.500 b 5 1.500 b 1 1.327 c 4 1.180 d Hko=0.002 dir ABA1+ Prolin 3 1.720 a 2 1.630 b 1 1.327 c Hko=0.002 dir. Fidanlık bitki su potansiyeli Duncan çoklu testi ABA2+ Prolin 3 2.300 a 2 1.730 b 1 1.500 c ABA1 ABA2 Prolin Kontrol 3 2.300 a 2 1.920 b 1 1.630 c 19 3 2.020 a 2 1.600 b 1 1.180 c 3 2.530 a 2 1.680 b 1 1.500 c 3 2.300 a 2 1.680 b 1 1.543 c Varyans analizi sonuçlarına uygulanan Duncan testi ile sulamanın ABA ve prolin uygulamasına ozmotik basınç açısından etkisi incelenmiştir. Buna göre %75 ve % 25 sulamada uygulamalar ozmotik basınç değerleri açısından istatistiksel önemde 4, %50 sulama ise üç farklı grup oluşturmaktadır. ABA ve prolin uygulamasının sulama üzerinde ozmotik basınç değeri açısından etkisi Duncan testi ile ortaya konulmuştur. Bu sonuçlara göre bütün uygulamalardaki sulamalarda en yüksek su potansiyeli %25 sulamada belirken, değerler %50, %75 sulamaya göre azalmaktadır ve istatistiksel anlamda önemli farklılıklar içeren üç grup oluşturmuştur. 3.2.5. Fotosistem II aktivitesi (F V /F M oranı) Fidanlıkta yetiştirilen defnelerdeki fotosentetik verim ölçümlerine uygulanan varyans analizine göre; ABA ve prolin uygulaması, sulama ve her iki işlem arasındaki ilişki istatistiksel önemde değildir. Bu amaçla grafik ortalamalar kullanılarak elde edilmiştir.

F V /F M Oranı 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 %75 Sulama %50 Sulama %25 Sulama 0 ABA1+ ProlinABA2+ Prolin ABA1 ABA2 Prolin Kontrol Şekil 2. Fidanlık denemesindeki fidanlarda fotosistem II aktivitesi Figure 2. Fotosystem II activitiy (F V /F M ) of seedlings in the nursery 3.2.6. İçsel Hormon Analizleri Sonuçları 3.2.6.1. ABA (Absisik Asit) Serada yaz kuraklığını geçiren fidanlardan alınan yaprak örneklerinden elde edilen içsel ABA miktarlarına ait verilere varyans analizi uygulanmıştır. Bu sonuçlara göre ABA ve prolin uygulaması ile sulama işlemlerinin içsel ABA miktarı üzerine etkisi ve birbirleri ile ilişkileri istatistiksel anlamda önemlidir (%0.1). Uygulamalar arasındaki interaksiyonun önemli çıkması nedeniyle sulamanın ABA ve prolin uygulamasına içsel ABA miktarı açısından etkisi Duncan testi ile belirlenmiştir. Çizelge 12. Fidanlıktaki defne fidanlarının yapraklarındaki içsel ABA miktarlarının varyans analiz tablosu Table 12. Table the variance analysis of leaf abscisic acid (ABA) content of seedlings in nursery Kullanılan Değişkenler Tekerrür TEKERRÜR Seviyesi 1 3 FaktörA HORMON Seviyesi 1 6 FaktörB SULAMA Seviyesi 1 3 20

Varyasyon kaynağı Analizi yapılan karakter: ABA VARYANS ANALİZ TABLOSU Serbestlik derecesi Kareler toplam Kareler ortalaması Hesaplanan F Alfa tipi hata ihtimali Tekerrür 2 0.634 0.317 0.417ns 0.6677 Faktör-A 5 88.792 17.758 23.371*** 0.0000 Faktör-B 2 26.875 13.437 17.684*** 0.0000 A*B 10 166.483 16.648 21.910*** 0.0000 Hata 34 25.835 0.760 Genel 53 308.618 5.823 Çizelge 13. Fidanlık denemesinde ABA-prolin ve sulama uygulamalarının fidanların yapraklarındaki içsel ABA miktarları üzerine etkisinin Duncan çoklu testi Table 13. Results of Duncan multiple range test for irrigation and ABA-proline treatments on leaf abscisic acid (ABA) content of seedlings in nursery Fidanlık ABA Duncan çoklu testi %75 SULAMA %50 SULAMA %25 SULAMA 5 10.897 a 6 6.423 a 6 2.787 b 1 2.460 b 1 2.340 b 5 2.417 b 3 2.120 b 3 2.047 b 2 1.277 b 2 1.860 b 4 1.247 b 4 1.580 b 3 2.110 a 5 1.857 a 1 1.717 a 4 1.700 a 6 1.630 a 2 1.387 a Hko=0.760 dir. ABA1+ Prolin ABA2+ Prolin Fidanlık ABA Duncan çoklu testi ABA1 ABA2 Prolin Kontrol 3 2.460 a 2 2.340 a 1 1.717 a Hko=0.760 dir. 3 1.860 a 1 1.387 a 2 1.277 a 2 2.120 a 1 2.110 a 3 2.047 a 1 1.700 a 3 1.580 a 2 1.247 a 2 10.897 a 3 2.417 b 1 1.857 b 3 6.423 a 2 2.787 b 1 1.630 b 21

Bu sonuçlara göre %75 sulamanın içsel ABA miktarı açısından ABA ve prolin uygulamaları arasında istatistiksel anlamda her hangi bir farklılığa neden olmadığı belirlenmiştir. %50 ve %25 sulamalarda ise iki farklı grup oluşmuştur. %50 sulamada en yüksek ABA içeriği ile 5 (1µM prolin) no lu uygulama tek başına, diğer uygulamalar ise birlikte iki grup oluşmuştur. %25 de ise kontrol uygulaması değerlerinden ayrılarak en yüksek ABA içeriğine ortaya koyan grup olurken, diğer uygulamalar birlikte ikinci grubu oluşturmuştur. Diğer yandan ABA ve prolin uygulamasının sulamalar üzerine etkisi Duncan testi ile belirlenmiştir. Bu sonuçlara göre, 1 (100µM ABA + 1µM prolin, 2 (50µM ABA + 1µM prolin), 3 (100µM ABA) ve 4 (50µM ABA) numaralı uygulamaların da istatistik önemde bir farklılığa neden olmadığı görülmektedir. Diğer iki uygulama olan 5 (1µM prolin) ve 6 (kontrol) no lu uygulamalarda iki farklı grup oluşmuştur. 5 no lu uygulamada %50 lik sulama en yüksek ABA içeriği ile; 6 no lu uygulamada %25 lik sulama en yüksek ABA içeriği ile tek başına, diğer iki sulama ise birlikte grup oluşturmuştur. 3.2.6.2. Gibberellik Asit Serada yaz kuraklığını geçiren fidanlardan alınan yaprak örneklerinden elde edilen içsel GA 3 miktarlarına ait verilere varyans analizi uygulanmıştır. Varyans analiz sonuçlarına göre fidanlara uygulanan ABA ve prolinin içsel GA 3 miktarına etkisi istatistiksel önemde (%0.1) olmakla birlikte, sulama işlemi istatistiksel önemde değildir. İki uygulama arasındaki ilişki ise yine istatistiksel anlamda önemlidir (%0.1). Bu varyans sonuçlarına göre içsel GA 3 miktarı üzerinde; sulamanın, ABA ve prolin uygulamasına etkisi Duncan testi ile belirlenmiştir. Buna göre %75 lik sulamada en yüksek GA 3 içeriği kontrol grubunda (6 no lu uygulama), en düşük GA 3 içeriği ise 1µM prolin uygulamasında (5 no lu uygulama) olmuştur. % 75 lik sulama da istatistik anlamda 3 farklı grup oluşmuştur. 22

Çizelge 14. Fidanlıktaki defne fidanlarının yapraklarındaki içsel giberelik asit miktarlarının varyans analiz tablosu Table 14. The variance analysis of leaf gibberelic acid (GA 3 ) content of seedlings in nursery Analizi yapılan karakter: GA 3 VARYANS ANALİZ TABLOSU Varyasyon kaynağı Serbestlik derecesi Kareler toplam Kareler ortalaması Hesaplanan F Alfa tipi hata ihtimali Tekerrür 2 12.839 6.419 0.054ns 0.9374 Faktör-A 5 4092.532 818.506 6.909*** 0.0003 Faktör-B 2 554.569 277.285 2.341ns 0.1099 A*B 10 7562.530 756.253 6.384*** 0.0001 Hata 34 4027.966 118.470 Genel 53 16250.436 306.612 Çizelge 15. Fidanlık denemesinde ABA-prolin ve sulama uygulamalarının fidanların yapraklarındaki içsel giberelik asit miktarları üzerine etkisinin Duncan çoklu testi Table 15. Results of Duncan multiple range test for irrigation and ABA-proline on leaf gibberelic acid (GA 3 ) content of seedlings in nursery Fidanlık GA 3 miktarı Duncan çoklu testi %75 SULAMA %50 SULAMA %25 SULAMA 6 39.360 a 1 33.000 ab 4 22.767 abc 5 56.460 a 6 27.220 b 2 9.230 bc 2 30.767 a 6 18.410 ab 5 18.027 ab 2 18.767 bc 1 7.387 c 3 5.317 b 3 5.867 c 3 2.017 c 4 3.767 b 5 5.407 c 4 1.307 c 1 1.837 b Hko=118.470 dir. ABA1+ Prolin ABA2+ Prolin 1 33.000 a 3 30.767 a 2 7.387 b 1 18.767 ab 3 1.837 b 2 9.230 b Hko=118.470 dir. Fidanlık GA 3 miktarı Duncan çoklu testi ABA1 ABA2 Prolin Kontrol 1 5.867 a 3 5.317 a 2 2.017 a 1 22.767 a 3 3.767 b 2 1.307 b 2 56.460 a 3 18.027 b 1 5.407 b 1 39.360 a 2 27.220 ab 3 18.410 b 23