T.C SÜLEYMAN DEMİREL ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

T.C SÜLEYMAN DEMİREL ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ TÜRKİYE DE PİRİNÇ BİTİ (Sitophilus oryzae, Coleoptera: Curculionidae ) POPÜLASYONLARINDA ENDOSİMBİYONT BAKTERİ Wolbachia ENFEKSİYONUNUN BELİRLENMESİ Kübra TÜRKMEN Danışman Prof. Dr. Erhan KOÇAK YÜKSEK LİSANS TEZİ TARIMSAL BİYOTEKNOLOJİ ANABİLİMDALI ISPARTA-2018

2018 [Kübra TÜRKMEN]

İÇİNDEKİLER Sayfa İÇİNDEKİLER... i ÖZET... ii ABSTRACT... iii TEŞEKKÜR... iv ŞEKİLLER DİZİNİ... v ÇİZELGELER DİZİNİ... vi SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ... vii 1.GİRİŞ... 1 2.LİTERATÜR ÖZETLERİ... 8 2.1.Ülkemizde Yapılan Bazı Çalışmalar... 8 2.2. Yurtdışında Yapılan Bazı Çalışmalar... 10 3.MATERYAL VE METOT... 18 3.1. Meteryal... 18 3.2. Metot... 19 3.2.1. Depolardan buğday örneklerinin toplanması... 19 3.2.2. Sitophilus oryzae nin elde edilmesi... 20 3.2.3. Genomik DNA izolasyonu... 20 3.2.4. PCR amplifikasyonu... 22 4.ARAŞTIRMA BULGULARI... 23 5.TARTIŞMA VE SONUÇLAR... 26 6.KAYNAKLAR... 29 ÖZGEÇMİŞ... 36 i

ÖZET Yüksek Lisans Tezi TÜRKİYE DE PİRİNÇ BİTi (Sitophilus oryzae L., Coleoptera: Curculionidae ) POPÜLASYONLARINDA ENDOSİMBİYONT BAKTERİ WOLBACHİA ENFEKSİYONUNUN BELİRLENMESİ Kübra TÜRKMEN Süleyman Demirel Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Tarımsal Biyoteknoloji Anabilim Dalı Danışman: Prof. Dr. Erhan KOÇAK Sitophilus oryzae L. (Coleoptera: Curculionidae ) başta mısır olmak üzere tüm hububat çeşitlerinde zararlıdır. Hububat danelerinde beslenmeleri sonucu üründe kalite ve ağırlık yönünden kayıplar meydana getirir. Endosimbiyont bakteri olan Wolbachia, eklembacaklıların %66 sında tespit edilmiş olup konukçularının üremesi üzerinde partenogenesis, erkek öldürücülük, feminizasyon ve sitoplazmik uyumsuzluk şeklinde üreme bozukluğuna neden olan önemli bir bakteridir. Çalışmada Ege (İzmir ve Manisa), İç Anadolu (Ankara ve Konya), Karadeniz (Samsun), Güneydoğu Anadolu (Diyarbakır ve Şanlıurfa) ve Akdeniz (Adana) bölgelerinden toplam 12 lokasyondan S. oryzae popülasyonları toplanmış ve moleküler yöntemler ile Wolbachia varlığı araştırılmıştır. Çalışmada DNA ekstrasyonunu takiben PCR reaksiyonları wsp primerleriyle taranmıştır. Jel görüntülerine göre, taranan 120 örnekten 118 (%98,33) inde Wolbachia tespit edilmiştir. Şanlıurfa ve Adana (Çukurköprü) da %90 oranında, Manisa, İzmir, Ankara (Haymana-Karakeçeli), Diyarbakır, Samsun, Konya (Merkez-Alibey Köy) ve Adana (Ceyhan) illerinde ise %100 oranında Wolbachia varlığı tespit edilmiştir. Bu çalışma ülkemizde S. oryzae üzerinde Wolbachia varlığının belirlendiği ilk çalışmadır. Anahtar Kelimeler: Wolbachia, Endosimbiyont, wsp, Sitophilus oryzae, Türkiye. 2018, 36 sayfa ii

ABSTRACT M.Sc. Thesis DETERMINATION OF ENDOSYMBIONT BACTERIA Wolbachia INFECTIONS IN RICE WEEVIL (Sitophilus oryzae L., Coleoptera: Curculionidae ) POPULATIONS FROM TURKEY Kübra TÜRKMEN Süleyman Demirel University Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Agricultural Biotechnology Supervisor: Prof. Dr. Erhan KOÇAK Sitophilus oryzae L. (Coleoptera: Curculionidae ) is the harmful insect for grains especially corn. A result of consuming grain seeds it leads to quality and weight loss in products. Wolbachia, an endosimbiyont bacteria, has been found in 66% of arthropods, and causes various reproduction disorders including partenogenesis, male lethality, feminisation and cytoplasmic incompatibility. In the present study, S. oryzae populations were collected from 12 locations in Agean region (Izmir and Manisa), Central Anatolia region (Ankara and Konya), Black Sea region (Samsun), South-Eastern region (Diyarbakir and Şanlıurfa) and Mediterranean region (Adana). Existence of Wolbachia was investigated through molecular methods. Specifically the PCR reactions following DNA extraction were scanned with Wsp primers. According to gel displays, Wolbachia was determined in 118 out of 120 samples. In particular, the samples in Şanlıurfa and Adana (Cukurkopru) contained Wolbachia as 90%, and the samples in Manisa, Izmir, Ankara (Haymana-Karakeceli), Diyarbakir, Samsun, Konya (Merkez-Alibey Köy) and Adana (Ceyhan) contacted Wolbachia as 100%. The study is the first study on determination of Wolbachia in S. oryzae populations in Turkey. Keywords: Wolbachia, Endosymbiont, wsp, Sitophilus oryzae, Turkey. 2018, 36 pages iii

TEŞEKKÜR Bu araştırma için beni yönlendiren, karşılaştığım zorlukları bilgi ve tecrübesi ile aşmamda yardımcı olan değerli Danışman Hocam Prof. Dr. Erhan KOÇAK a teşekkürlerimi sunarım. Tezimin her aşamasında beni yalnız bırakmayan aileme, yüksek lisans arkadaşım İlyas KARAMAN a sonsuz sevgi ve saygılarımı sunarım. Kübra TÜRKMEN ISPARTA, 2018 iv

ŞEKİLLER DİZİNİ Sayfa Şekil 1. Wolbachia nın sınıflandırmadaki yeri... 3 Şekil 2. İkiye bölünerek çoğalan bir Wolbachia görüntüsü (Skala bar=0.5 μm) 4 Şekil 3. Sitophilus oryzae (Coleoptera Curculionidae)... 18 Şekil 4. Sitophilus oryzae nin yumurta, larva ve pupası (Coleoptera: Curculionidae)... 19 Şekil 5. Süleyman Demirel Üniversitesinde ayrılıp, kavanozlanan Sitophilus oryzae örnekleri... 20 Şekil 6. Sitophilus oryzae örneklerinden elde edilen genomik DNA bant görüntüsü. 1-10: İzmir, 11-20: Ankara, 21-30: Diyarbakır ve 31-40: Konya 21 Şekil 7. İllere göre Sitophilus oryzae de belirlenen Wolbachia oranı... 23 Şekil 8. Sitophilus oryzae bireylerinde % 100 oranındaki Wolbachia varlığı belirlenen iller. a) Manisa, b) İzmir, c) Ankara (Haymana), d) Ankara (Karakeçeli), e) Konya (Alibeyköy), f) Konya (Merkez), g) Samsun (Bafra Un), h) Samsun (Pak Un), i) Diyarbakır ve j) Adana (Ceyhan) 24 Şekil 9. Sitophilus oryzae bireylerinde % 90 oranındaki Wolbachia varlığı belirlenen iller. a) Adana (Çukurköprü) ve b) Şanlıurfa... 25 v

ÇİZELGELER DİZİNİ Sayfa Çizelge 1. Farklı konukçularda Wolbachia enfeksiyonlarının özellikleri... 5 Çizelge 2. Arthropod gruplarında görülen Wolbachia fenotipleri... 6 Çizelge 3. Sitophilus oryzae üzerinde Wolbachia taraması için yapılan PCR döngü programı... 22 vi

SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ CI Sitoplazmik Uyumsuzluk (Cytoplasmic Incapability) CTAB Cetyltrimethlyammonium Bromide DNA Deoksiribonükleik Asit FtsZ Septum Formasyonuna Neden Olan Gen (Filamenting Temperature Sensitive Mutant Z) HRM Yüksek Çözünürlüklü Erime (High Resolution Melting) ml Mililitre mm Milimetre MDA Çoklu Yer Değiştirme Amplifikasyonuna (Multiple Displacement Amplification) MK Erkek Öldürücülük (Male Killing) orf7 Bakteriyofaj Lokusu PI Partenogenesis (Partenogenesis Induction) PCR Polimeraz zincirleme Tepkimesi (Polymerase Chain Reaction) RFLP Kısıtlama Fragmanı-Uzunluğu Polimorfizmi (Restriction Fragment-Length Polymorphism) SOPE Sitophilus oryzae Primer Endosimbiyontu (S. oryzae Principal Endosymbiont) TUİK Türkiye İstatistik Kurumu Wsp Wolbachia Surface Protein µm Mikrometre vii

1. GİRİŞ Hızla artan dünya nüfusuna yeterli ve dengeli beslenebileceği kaynakların sağlanması günümüzün önde gelen sorunlarından biridir. İlaveten, kullanılabilir tarım alanları nüfus artışına paralel olarak artmamakta, aksine her geçen gün tarım yapılabilen alanlar daralmaktadır. Hububat, insanların temel besin kaynağını oluşturan ürünler içerisinde ilk sıradadır. Ülkemiz topraklarının yaklaşık %32 si (24.3 milyon hektar) tarım yapılabilir özelliktedir. Tarım alanlarının %67.5 i (16.4 milyon hektar) tarla ziraatına ayrılmıştır. Tarla ziraat alanının %73 üne (12 milyon hektar) hububat ekilmektedir. Hububat ekim alanı içerisinde yaklaşık %67.5 lik pay ile ilk sırada buğday, %25 lik payla ikinci sırada arpa ve %5 lik payla üçüncü sırada mısır gelmektedir. Buğdayın tüketimi gelişmiş ülkelerde daha az olmasına karşın, ülkemizde ve milli gelir düzeyi düşük olan ülkelerde oldukça fazladır (Anonim, 2015). Ülkemizde 2017 yılı TÜİK verilerine göre, yaklaşık 77 milyon dekar alanda, 21. 5 milyon ton buğday üretimi yapılmıştır (TÜİK, 2018). Birim alandan elde edilen ürün miktarının arttırılması birinci derecede önemli olmakla birlikte; üretimden tüketime kadar ürünün uygun bir şekilde korunması da büyük önem taşımaktadır. Tarımsal ürünlerin hasattan tüketimlerine kadar en az düzeyde kayıpla korunması bir zorunluluktur. Genellikle depolanmış ürünlerde hayvansal kökenli organizmalar önemli oranlarda ürün kayıpları meydana getirmektedir. Dünya üzerinde genel olarak depolanmış hububatlardaki böcek zararı, modern depolama tekniklerinin kullanılmadığı ülkelerde %10-40 civarındadır (Shayaa vd., 1997). Yıldırım vd. (2001) ülkemiz depolarındaki eksiklikler nedeniyle bu oranın %100 e kadar ulaşabildiğini bildirmektedirler. Bu zarar oranı bulaşma düzeyine göre daha da artabilmektedir. Ülkemiz iklim özellikleri ve üretim çeşitliliği nedeniyle çok sayıda depolanmış ürün zararlısının gelişmesine olanak vermektedir. Zararlılar depolanmış ürünlerde doğrudan ve dolaylı şekilde zarar verebilmektedir. Üründe beslenmeleri sonucu, üründe ağırlık kayıplarına, tohumluk özelliğinin düşmesine, kalite ve besin değerlerinde olumsuz değişimlere yol açarak ticari değerinin düşmesine neden olmaktadır (Boxall, 2001). Ürünlerdeki kayıpların engellenmesi için zararlı böcek popülasyonlarının kontrol altına alınması gerekmektedir. 1

Önemli ambar zararlılarından birisi de pirinç biti Sitophilus oryzae L. (Coleoptera: Curculionidae) dir. Ülkemizde yapılan çalışmalarda, S. oryzae nin hemen hemen tüm illerde belirlendiği ve diğer Sitophilus türlerinden daha yaygın ve yoğun popülasyon oluşturduğu görülmektedir (Aydemir, 2008; Bağcı vd., 2014). Dünya nın hemen her yerinde bulunmasına rağmen soğuk iklime fazla dayanıklı olmadığı için sıcak bölgelerde daha yaygın olarak bulunmakta ve büyük zararlar yapmaktadır. Pirinç, buğday, arpa, mısır, sorgum ve diğer tahıl türlerinde zararlı olmaktadır (Özer, 1957; Esin, 1958; Erakay, 1982). Tahıllarda taneleri yiyerek beslenmeleri sonunda üründe kalite ve ağırlık yönünden kayıplar meydana getirmektedir (Anonim, 2008). Zararı hem ergin hem de larvalar yapmaktadır. Larva tanenin içinde yaşamakta ve iç kısmını yemekte, erginler ise taneyi dışardan kemirerek zarar yapmaktadır. Bu zararlı, yoğun olduğunda tanenin sadece parçalanmış kabukları kalmakta, üründe kızışma ve küflenmeye sebep olmaktadır. Ayrıca zarar yaptığı taneler diğer sekonder zararlılar için ortam oluşturmaktadır. Bu tür kırma ve un mamullerinde de zarar yapabilmektedir (Yıldırım vd., 2001). Son yıllarda yapılan çalışmalarda kimyasal mücadele yerine alternatif mücadele yöntemleri ön planda tutulmaya başlanmıştır (Vigneron vd,. 2012; Li vd., 2015). Bu çalışma konularından birisi de endosimbiyont bakterilerdir. Üzerinde en çok çalışma yapılan bakteri ise canlılarda üreme bozukluğuna neden olan Wolbachia olduğu görülmektedir. Wolbachia alternatif mücadelede potansiyeli olan bir etmen olarak görülmektedir (Dunn vd., 2001; Sinkins ve O Neill, 2000). Wolbachia sp., ilk kez 1924 yılında Herting ve Wolbach tarafından sivrisineğin (Culex pipiens, Diptera: Culicidae) üreme dokularında saptanmıştır. Bunun ilk tanımlanması 1936 yılında Wolbachia pipientis olarak Herting tarafından yapılmıştır (Merçot ve Poinsot, 2009). Sadece dişi bireylerin sitoplazmaları ile taşınan Wolbachia nın 1999 yılında yapılan bir çalışmada somatik dokularda da bulunduğu belirlenmiştir (Dobson vd., 1999). Wolbachia, Rickettsiaceae familyasına ait, gram negatif bir alfaprotoeobakteridir (Breitschwerdt, 2007) (Şekil 1). 2

Wolbachia böceklerde hücre içi simbiyotik bir bakteri olup Coleoptera, Diptera, Hymenoptera, Homoptera, Lepidoptera ve Orthoptera takımları dahil böcek türlerinin %16.9'undan fazlasında tespit edilmiştir (Werren vd., 1995a). Yapılan araştırmalarda 63 arthropod türünden (Aracnida 2, İnsecta 61) 48 inde (%76), 20 filarial nematod türünün 18 inde (%90) Wolbachia varlığı belirlenmiştir. Bütün Arthropodların ise %20 sinde Wolbachia nın bulunduğu düşünülmektedir (Sinkins ve O Neill, 2000; Bandi vd., 2001; Hise vd., 2004; Kozek, 2005; Hilgenboecker vd., 2008). Şekil 1. Wolbachia nın sınıflandırmadaki yeri (Breitschwerdt, 2007) Wolbachia, ikiye bölünerek çoğalır (Şekil 2). Yaşam döngüsü Clamidya ların yaşam döngüsü ile benzerlik göstermektedir. Çoğalmaları, sırasıyla küçük form, yoğun form ve basillar form olmak üzere üç farklı morfolojik evreden oluşur (Kozek, 2005). 3

Şekil 2. İkiye bölünerek çoğalan bir Wolbachia görüntüsü (Skala bar=0.5 μm) (Kozek, 2005) Üreme sistemlerinde yaşayan bakteri bir konukçudan diğerine yumurta sitoplazması yolu ile taşınmaktadır. Wolbachia enfeksiyonu nadiren horizontal taşınmalarına rağmen anadan yavruya vertikal olarak taşınmakta ve konukçu üremesini birkaç yolla değiştirmektedir (Bandi vd., 1998; Stevens vd., 2001; Kozek, 2005) (Çizelge 1). Vertikal olarak iletilen endosimbiyontların frekanslarını artırmalarının iki yolu vardır, ya konukçunun uygunluğunu doğrudan arttırır ya da dişilerin çoğalmasını sağlayarak konukçuyu manipüle etmektir. İkinci tip genellikle üreme uyumsuzluğu olarak tanımlanır ve alfaprotoeobakteri Wolbachia en iyi anlaşılan örneğidir (Fein ve Perlman, 2004). 4

Çizelge 1. Farklı konukçularda Wolbachia enfeksiyonlarının özellikleri (Pfarr ve Hoerauf, 2006) Konukçu Symbiosis Taşınması Etkileri Lokalizasyonu Arthropodlar Çoğunlukla parazit, bazı durumlarda mutualist Vertikal ve horizontal Nematodlar Mutualist Vertikal CI, MK, partenogenesis, feminizasyon, oogenesis Embriyogenesis, larval gelişim ve erginin yaşamını devam ettirebilmesi Ovaryumlar, testisler, embriyo, vücut boşlukları Ovaryumlar, embriyolar ve hipoderma Wolbachia türleri, partenogenetik dişilerin üretilmesini sağlayarak, seksüel erkeklerle çiftleşir ve diploid dişiler meydana getirirler (Stouthamer vd., 1990; Werren, 1997; Dunn vd., 2001; Doran ve Moore, 2001). Wolbachia, enfekte ettiği dişi yumurtaları gelişimine devam ederken, erkek yumurtaları öldürmektedir (Merçot ve Poinsot 2009). Erkek konukçuların ölümü, dişi olan kardeşlerinin hayatta kalma oranını artırmakta ve Wolbachia ile enfekteli dişilerin hayatta kalma şansı da artmaktadır (Bandi vd., 2001, Doran ve Moore 2001, Zimmer, 2001, Charlat vd., 2003). Konukçularının feminizasyonunu teşvik eden bezlerin gelişimini engelleyerek erkekleri dişilere dönüştürür ve bazı Wolbachia ırkları, androjen bezler ve androjen hormon üzerinde etkili olarak feminizasyona neden olurken, bazı ırklar sadece androjen bez gelişimini engelleyerek feminizasyona neden olur (Charlat ve Merçot, 2000; Doran ve Moore, 2001; Werren, 1997; Juchault vd., 1994). Wolbachia, konukçu hormonlarını dişi gibi değiştirerek yumurta ürettirmektedir (Werren, 1997; Bandi vd., 2001; Charlat vd., 2003; Gotoh vd., 2003). Konukçu popülasyonunda hızlı şekilde yayılması ve konukçularının üremesi üzerine olan etkisi nedeniyle Wolbachia enfeksiyonları, bitki zararlıları ve vektör mücadelesinde güçlü bir potansiyel olarak görülmektedir (Dunn vd., 2001; Sinkins ve O'Neill, 2000). Bazı çalışmalarda depolanmış ürün zararlıları ile mücadelede 5

Wolbachia nın önemi vurgulanmış ve mücadeleye yönelik kullanılması amaçlanmıştır (Kageyama vd., 2010; Vigneron vd., 2012; Li vd., 2015). Kageyama vd. (2010) endosimbiyont bakteri olan Wolbachia nın maternal olarak iletildiğini ve omurgasızların üreme sisteminde çeşitli varyasyonlara neden olduklarını belirtmişlerdir. Böceklerin üreme sistemi üzerine etkisi önemli olduğu için Wolbachia nın zararlıların kontrol altına alınmasında önemli bir yere sahip olduğunu vurgulamışlardır. Zhang vd. (2010) nin yaptığı çalışmada ABD nin sekiz eyaletinde Conotrachelus nenuphar (Curculionidae) popülasyonlarında Wolbachia enfeksiyonunun dağılımı incelenerek popülasyonların %97.8 inde Wolbachia tespit edilmiş ve Curculionidae popülâsyonları arasında üreme uyumsuzluğuna neden olabileceği bildirilmiştir. Chen vd. (2012) Wolbachia nın oosit üretimi için gerekli olduğunu belirtmişlerdir. Çizelge 2. Arthropod gruplarında görülen Wolbachia fenotipleri (Islam, 2007) Wolbachia fenotipi Sitoplazmik uyumsuzluk (Cytoplasmic incompatibility: CI) Partenogenesis teşviki induction: PI) (Partenogenesis Dişileşme (Feminization: F) Erkek öldürme (Male killing: MK) Arthropod Diptera Lepidoptera Homoptera Coleoptera Hymenoptera Isopoda Acari Heteroptera Arachnida Hymenoptera Collembola Acari Thysanoptera Isopoda Lepidoptera Hemiptera Coleoptera Diptera Lepidoptera Hymenoptera Heddi vd. 1998 yılında yapmış oldukları çalışmada; S. oryzae primer endosimbiyontu SOPE (γ-proteobacteria) ve Wolbachia (α-proteobacteria) nın, dişilerin doğurganlığını büyük ölçüde geliştirerek larva gelişim zamanını kısalttığını, aynı zamanda konukçunun uçuş yeteneklerini artırarak vitamin teminini 6

etkinleştirdiğini ve böylece Sitophilus popülasyonlarının davranışını etkilediği belirlemişlerdir. Wolbachia nın horizontal olarak taşınması sitoplazmik uyuşmazlığa bağlı olarak türleşme sürecini hızlandıracağı düşünülmektedir (Heddi vd., 1999; Carvalho vd., 2014). Wolbachia enfeksiyonunun manipüle edilmesi; tıp, veterinerlik ve tarımsal alanlarda önemli olan zararlı arthropod türlerinin biyolojik mücadelesi için kullanılabilecek önemli bir yöntemdir (Pourali vd., 2009). Heddi vd. (1999) Sitophilus türlerindeki Wolbachia varlığının çevre dostu stratejilerin geliştirilmesi için gelecekteki çalışmaları yönlendireceğini belirtmektedirler. Önemli bir depolanmış ürün zararlısı olan S. oryzae de Wolbachia saptanmış olması bu zararlıya karşı bu simbiyontun mücadelede doğrudan veya dolaylı olarak kullanılabilirliğini akla getirmektedir. Dünyada S. oryzae de Wolbachia varlığının belirlenmesi konusunda çok sayıda çalışma bulunmaktadır (Werren vd., 1995b; Kageyama vd., 2010; Henri ve Mouton 2011; Carvalho vd., 2014; Li vd., 2015; Fein ve Perlman 2004) ancak ülkemizde bu tür üzerinde henüz bir çalışma yapılmamıştır. 7

2.LİTERATÜR ÖZETLERİ 2.1. Ülkemizde Yapılan Bazı Çalışmalar Güz vd. (2012) nin yaptığı çalışmada bir buğday zararlısı Eurygaster integriceps Puton (Heteroptera: Scutelleridae) in, önemli yumurta parazitoidi olan Trissolcus türlerinde Wolbachia enfeksiyonu varlığını tespit etmişlerdir. Wolbachia dış yüzey proteini (wsp) kodlayan gene ait DNA dizileri kullanılarak bakteri enfeksiyonu varlığı doğrulanmış aynı zamanda bakterinin streynleri belirlenmiştir. Yapılan filogenetik analizler sonucunda Trissolcus türlerinde belirlenen Wolbachia ırklarının genetik olarak birbirine benzediğini ve süpergrup B ye dahil olduğunu belirlemişlerdir. Farklı Trissolcus popülasyonlarındaki enfeksiyon durumunun belirlenmesi ve Wolbachia enfeksiyonunun yol açtığı uyuşmazlık nedeninin belirlenmesinin süne mücadelesinde oldukça önemli olduğunu belirtmişlerdir. Yıldırım vd. (2013), Kayseri ilinden toplanan Culex pipiens örneklerinde Wolbachia enfeksiyonunu araştırmak için yapmış oldukları çalışmada; her birinde 6-15 adet C. pipiens türü içeren 10 adet genomik DNA havuzu materyal olarak seçilmiştir. Genomik DNA havuzları Wolbachia yüzey protein (wsp) gen bölgesinin amplifikasyonu açısından incelenmiştir. Bu gen bölgesinin sekansı yüksek değişiklik göstererek farklı Wolbachia ırkları arasındaki filogenetik ilişkilerin analizinde kullanılabilmektedir. Havuzlardan genomik DNA ekstraksiyonu sonrasında wsp gen bölgesinin 590-632 bp'lik kısmını amplifiye eden Wolbachia spesifik primerler ile PCR analizleri yapmışlardır. PCR analizleri ile incelenen 10 havuzun 6'sı (%60) pozitif bulunmuştur. İncelenen havuzlarda Wolbachia ile minimum enfeksiyon oranı %5.08 olarak belirlenmiştir. 8

Şaki ve Şimşek (2014) tarafından yapılan çalışmada Elazığ'da farklı tür erkek ve dişi sineklerde Wolbachia spp' nin PCR kullanılarak taranması amaçlanmıştır. Çalışmada 33 dişi ve 15 erkek Musca spp., 30 dişi ve yedi erkek Lucilia sericata (Diptera: Calliphoridae), 16 dişi ve dört erkek Calliphora vicinia (Diptera: Calliphoridae), bir dişi ve dört erkek Sarcophaga haemorrhoidalis (Diptera: Sarcophagidae) ile 27 dişi ve 10 erkek Chrysomia albiceps (Diptera: Calliphoridae) kullanılmıştır. Genomik DNA izolasyonunun ardından Wolbachia wsp genini çoğaltan spesifik primerler ile PCR yapılmıştır. Çalışma neticesinde pozitif kontrol örneğinde 630 bp'lik bant gözlenirken, negatif kontrol ve test edilen örneklerde pozitiflik belirlenememiştir. Tunçbilek vd. (2015) Antalya ilinden temin ettikleri S. granarius, S. zeamais ve parazitoit Lariophagus distinguendus de hücre içi simbiyotik bakterilerin varlığını moleküler yöntemler ile tespit etmişlerdir. Çalışmada Wolbachia enfeksiyonu varlığını wspec spesifik primeri ile 53 C de, Arsenophonus varlığını Ars spesifik primeri ile 52 C de ve Spiroplasma varlığını 63F-TK55 spesifik primeri ile 55 C sıcaklıkta PCR yaparak taramışlardır. Antalya dan temin edilen S. granarius, S. zeamais ve parazitoit L. distinguendus de 16S rdna dizilimine dayanan filogenetik analiz sonucuna göre Wolbachia varlığını tespit etmişlerdir. S. granarius un test edilen tüm bireyleri Wolbachia ve Arsenophonus için pozitif çıkarken, hem Wolbachia hem Spiroplasma parazitoit L. distinguendus için pozitif çıkmıştır. S. zeamais için taranan endosimbiyontlarda pozitif sonuç elde edilmemiştir. Tunçbilek ve Bakir, (2016) Rhagoletis cerasi nin kiraz zararlısı olduğunu, gün geçtikçe mücadele yönteminin etkili ve geniş spektrumlu ilaçların piyasadan kaldırılması ile çok daha zorlaştığını, insan ve çevre açısından mikrobiyal simbiyotik canlılarla mücadelenin daha sağlıklı bir durum olduğunu belirtmişlerdir. R. cerasi erişkinleri barsak ve üreme bakterileri için 16S ribozomal RNA geni ile PCR taraması yapmışlar, her ne kadar Cardinium, Hamiltonella, Ricketsia ve Arsenophonus tespit edilmemiş olsa da popülasyon da Wolbachia enfeksiyonu tespit ettiklerini bildirmişlerdir. Amaçlarının ise sempozyumlar da biyolojik mücadele kaynaklarının bilincini artırmak olduğunu belirtmişlerdir. Karaman ve Koçak (2017) Türkiye'de buğdayın en önemli zararlısı olan Süne türü E. integriceps (Hemiptera: Scutelleridae) de Wolbachia enfeksiyonu taramasını 9

yapmışlardır. Çalışmalarında, E. integriceps türünün ülkede yayılış gösterdiği Güneydoğu Anadolu, Doğu Anadolu, Akdeniz ve Marmara bölgelerinden Adıyaman, Ağrı, Bingöl, Bursa, Çanakkale, Diyarbakır, Edirne, Elazığ, Kahramanmaraş, Kırklareli, İçel, Sakarya, Siirt, Şırnak ve Tunceli illerinden toplanan erkek ( ) bireylerinde, endosimbiyont bakteri Wolbachia nın moleküler yöntemler ile tespiti ve popülasyonlardaki yaygınlık oranını belirlemişlerdir. Toplam 15 ilden 150 bireyde çalışma yürütmüşlerdir. Çalışmalarında DNA ekstraksiyonunu izleyen PCR reaksiyonlarını yeni tasarlanan wsp primerleri ile taramışlar ve agaroz jelde görüntüleyerek, Wolbachia varlığını tespit etmişlerdir. Elde edilen PCR reaksiyonlarından sekans yaparak Wolbachia varlığını kesin olarak ortaya koymuşlardır. Jel görüntülerine göre, taranan 150 örneğin 142 tanesinde (%94.66) Wolbachia enfeksiyonu tespit etmişlerdir. Bulunma oranını, Marmara Bölgesinin beş ilinde %98, Akdeniz Bölgesinde iki ilde %85, Güneydoğu Anadolu Bölgesinde dört ilde %95, Doğu Anadolu Bölgesinde dört ilde ise %95 olarak vermişlerdir. Wolbachia bulunma oranı %100 olarak tespit edilen iller ise Ağrı, Bursa, Çanakkale, Edirne, Elazığ, Kırklareli, Siirt, Şırnak ve Tunceli olarak belirlenmiştir. Bu çalışmanın E. integriceps türünde Wolbachia varlığının ve yayılış oranının belirlendiği ilk çalışma konumunda olduğunu belirtmişlerdir. 2.2. Yurtdışında Yapılan Çalışmalar Hsiao ve Hsiao (1985) Amerika da yonca hortumlu böceği (Hypera postica) nin üç farklı ırkından batı ırkında Wolbachia nın olduğunu fakat doğu ve Mısır ırklarında olmadığını belirtmişlerdir. Batı ırkı dişileri ile doğu ırkı veya Mısır ırkı erkekleriyle çaprazlandığında döl meydana gelirken, doğu ve Mısır ırklarının çaprazlanması sonucunda ise döl meydana gelmemiştir. Araştırmacılar bu bulgulardan hareketle Wolbachia nın dişiler tarafından aktarıldığını belirtmişlerdir. Werren vd. (1995b) yapmış oldukları çalışmada arthropodlarda Wolbachia enfeksiyonu taraması yapmışlardır. S. oryzae de Wolbachia enfeksiyonunun varlığını tespit etmek için revize edilen 16S rdna ve FtsZ primerleri kullanmışlardır. Analiz sonucu Wolbachia varlığını 16S rdna ve FtsZ arasında uyum olduğunu belirlemişlerdir. Wolbachia nın konukçunun üreme sisteminde sitoplazmik uyumsuzluk, partenogenezis ve feminizasyon gibi değişikliklere neden olduğunu ve canlı üzerinde horizontal olarak transfer edildiğini tespit etmişlerdir. 10

Werren (1997) e göre arthropodlarda, tür içindeki yeni Wolbachia enfeksiyonları horizontal taşınma sonucu bulaştığını belirtmiştir. Araştırmacı, FtsZ geni kullanılarak yapılan çalışmaların, Wolbachia nın türler arasında horizontal olarak taşındığını, endosimbiyotik bakterilerin konukçular ve hatta taksonlar arası taşındığını bildirmektedir. Arthropodların %15-20 sinde Wolbachia varlığı tespit edilebilineceğini ve bunun küçümsenmeyecek öneme sahip olduğu belirtmiştir. Heddi vd. (1999) yapmış oldukları çalışmada Wolbachia nın S. oryzae nin tüm vücuduna (foliküler hücreler, oosit, testis, bağırsak ve bakteri lenfositleri gibi) yayıldığını tespit etmişlerdir. Bununla birlikte Wolbachia yoğunluğunun dokudan dokuya değiştiğini, germ hücrelerinde yoğun fakat diğer dokularda az olduğunu belirlemişlerdir. Bu bulgulara paralel olarak dokularda gözlenen zayıf floresan sinyalleri germ hücreleri ile karşılaştırıldığında, Wolbachia nın ana hücreyi etkileyerek aktif olarak gelişmekte olan testislerdeki spermleri değiştirdiğini vurgulamışlardır. McGraw ve O'Neill (1999) böceklerin üreme sistemlerinde yaşayan Wolbachia nın bir konukçudan diğerine yumurta sitoplazması ile taşındığını, bakterinin dişiden yavruya vertikal olarak aktarıldığını ve konukçu üremesini birkaç yolla değiştirdiğini, nadiren horizontal olarak aktarıldıklarını bildirmişlerdir. Meer vd. (1999) Wolbachia'nın genellikle sitoplazmik uyumsuzluğa neden olduğunu belirterek wsp geninin 16S veya FtsZ gibi daha önce dizilenen genlerden çok daha hızlı bir oranda geliştiğini göstermiş ve bu genin Wolbachia nın alt bölümlerine ayrılmasında önemli olduğunu belirtmişlerdir. Sinkins ve O'Neill (2000) Wolbachia nın coccoid veya bacilliform şeklinde olup, iki membranlı ve ortalama 0.8-1.5 µm uzunluklarda olup Rickettsiaceae familyası içinde yer aldığını, ayırıcı bir özelliklerinin de insanlarda hastalığa neden olmaması olduğunu ve bu bakterilerin endosimbiyont veya parazitlik etkileriyle omurgasız hayvanlarda bulunduklarını bildirmişlerdir. Jeyaprakash ve Hoy (2000) Amerika da yapmış oldukları çalışmada arthropodlarda Wolbachia enfeksiyonu taraması için wsp primerini kullanmışlardır. Curculionidae familyasından Diaprepes abbreviatus, Pachnaeus litus ve Anthonomus eugenii 11

bireylerinde Wolbachia enfeksiyonu tespit etmişlerdir. Laboratuvardaki 47 bireyden 37 sinin (%80) pozitif, araziden toplanan 17 bireyden 11 inin ( %65) pozitif çıktığını belirtmişlerdir. Heddi vd. (2001) Wolbachia nın S. oryzae üzerinde horizontal ve vertikal olarak vücut hücreleri boyunca aktarıldığını, konukçunun fizyolojisini etkilemediği fakat üremeyi değiştirdiğini bildirmektedirler. Rokas vd. (2002) çalışmalarında iki Wolbachia geni (wsp ve FtsZ) için PCR analizi ve dizi analizi yapmışlardır. Wolbachia enfeksiyonu ve yaygınlığı 64 türde (toplam 906 bireyde) saptanmıştır. Bu çalışma sonucunda aynı wsp dizisine sahip olan Wolbachia ile enfekteli olan gal yapıcı olan ve başkalarının yuvalarında yaşayan gal yaban arısı gallwasps (Hymenoptera; Cynipidae) bulunmuştur. Bu konukçular aynı kominitenin üyeleri olmamasına rağmen, iki tropik grup arasında horizontal taşınım sıklığının tartışılmasına neden olmuştur. Gotoh vd. (2003) yaptıkları çalışmada Wolbachia nın kırmızıörümcek Tetranychus kanzawai türündeki vertikal taşınımını araştırmışlardır. Dişileri Wolbachia ile enfekteli T. kanzawai bireylerinin, enfekteli veya enfektesiz olup olmamasına bakılmadan erkek bireylerle çiftleştirildiğinde enfekteli nesil ürettikleri, enfektesiz dişilerin ise Wolbachia enfeksiyonu bulunmayan nesil ürettikleri görülmüştür. Shen vd. (2003) S. oryzae üzerinde az sayıda moleküler çalışmanın olduğunu belirtmişlerdir. Yedi hafta tetrasiklin ile muamele edilmiş buğday unu ile beslenen erişkin pirinç bitlerinde dört geni saptayabilmek için 18S rrna, P Gase, SOPE 16S rrna ve Wolbacia 16S rrna ile PCR analizi yapmışlardır. Simbiyont genlerinin bir kaç hafta antibiyotik tedavisinden sonra kaybolurken, poligalakturonoz geni 18S rrna geninde tetrasiklin ile muamele sonuna kadar varlığını sürdürdüğünü tespit etmişlerdir. Yani organizmaların S. oryzae ile genetik orijini olmadığını belirlemişlerdir. Fein ve Perlman (2004) İsrail de 99 arthropod ve akar türünde özel olarak tasarlanmış 16S rdna primeri ile Wolbachia ve Cardinium taraması yapmışlardır. Taranan arthropodların %24 ünde Wolbachia varlığını bulmuşlardır ve Coleoptera takımından; Callosobruchus chinensis, Oxythyrea noemi, Oryzophilus surinamensis, 12

S. oryzae ve Coccotrypes dectyliperda da Wolbachia enfeksiyonu tespit etmişlerdir. Taranan türlerin %6 sı Cardinium için pozitif çıkarken %24 ü Wolbachia için pozitif çıktığını belirtmişlerdir. Sanogo ve Dobson (2004) Culex cinsine bağlı türlerdeki Wolbachia enfeksiyonu arasındaki farklılığın tespiti için ilk kez moleküler markörler tanımlanmaya çalışmışlar ve Culex türleri arasındaki bakteriyofaj lokusunu (orf7) kopyalayarak dizilemişlerdir. Çalışma sonunda orf7 lokusunda Wolbachia nın kuvvetli olan bir kalıtsal materyal olduğunu belirtmişlerdir. Mikac (2007) yapmış olduğu çalışmada Avustralya popülasyonlarındaki Liposcelis bostrychophila (Psocoptera: Liposcelididae) de Wolbachia enfeksiyonu varlığını spesifik wsp primeri, 16S rdna, 16S A ve 16S B primerlerini kullanarak PCR ile taramış ardından çoklu yer değiştirme amplifikasyonuna (MDA) maruz bırakmıştır. Her biri Avustralya veya İngiltere den 50 örnekten oluşan havuzlar elde etmiştir. MDA ya maruz bırakılanlarda Wolbachia elde RFLP (Restriction Fragment-Length Polymorphism) tekniği ile İngiltere ve Avustralya popülasyonlarında Wolbachia varlığını tespit etmiştir. Bu çalışma Avustralya daki L. bostrychophila de birden fazla Wolbachia enfeksiyonu için ilk kanıt olmuştur. Son vd. (2008) ABD' nin beş farklı lokasyonundan toplanan Otiorhynchus sulcatus (Coleoptera: Curcilionidae)'u süpergrup B Wolbachia enfekte etmişlerdir. Tetrasikline maruz bırakılan preovipozisyon dönemindeki O. sulcatus un yumurtadan çıkan dişilerinin fizyolojik özelliklerinde bir değişiklik olmadığını ve Wolbachia nın her hangi bir etkiye sahip olmadığını belirtmişlerdir. Bu bulgular, yumurta gelişiminin engellemede O. sulcatus fizyolojisi üzerindeki toksik etkilerden ziyade Wolbachia üzerindeki antibiyotik etkisinden kaynaklandığını bulmuşlardır. Wolbachia nın O. sulcatus yumurtalarının normal gelişimi için gerekli olabileceğini ve O. sulcatus ekolojisi için bu bulguların etkilerini tartışmaya açık olduğunu belirtmişlerdir. Werren vd. (2008) Wolbachia nın, arthropodlar ve nematodlarda yaygın hücre içi bir bakteri türü olduğunu belirtmişlerdir. Alfa-proteobakteria olan Wolbachia yumurta vasıtasıyla, vertikal olarak iletildiğini ve konukçu üzerinde feminizasyon, partenogenez, erkek öldürme ve sitoplazmik uyuşmazlık gibi canlıların üremesi 13

üzerine etkileri olduğunu bildirmişlerdir. Ayrıca türler arası horizontal olarak taşınabildiklerini çeşitli omurgasız hayvan popülasyonlarında yaygın bir dağılıma neden olduğu belirtmişlerdir. Kageyama vd. (2010) endosimbiyont bakteri olan Wolbachia nın maternal olarak iletildiğini ve omurgasızların üreme sisteminde çeşitli varyasyonlara neden olduklarını belirtmişlerdir. Böceklerin üreme sistemi üzerine etkisi önemli olduğu için Wolbachia nın zararlıların kontrol altına alınmasında önemli bir yere sahip olduğunu vurgulamışlardır. Bu çalışmada depolanmış ürün zararlıları ile Wolbachia arasındaki ilişkiyi incelemişlerdir. Çalışmalarını, PCR ve Wolbachia nın sekansı yapılarak dış yüzey protein (wsp) genini belirleyerek Coleoptera, Psocoptera, Lepidoptera ve Hymenoptera dan 59 türden 18 türün Wolbachia ile enfekteli olduğu ve bunlardan 14 türde Wolbachia wsp gen dizileri ile belirlenmiştir. Araştırmacılar, veri tabanlarına göre Wolbachia nın birden fazla konukçuda bulunduğunu ve zararlılarda Wolbachia nın bulunmasının zararlılarla mücadelede kullanılabileceğini belirtmişlerdir. Yapmış oldukları bu çalışma içerisinde S. oryzae nin Tsukuba, Ibaraki, Japonya ve İtalya popülasyonlarında Wolbachia varlığı tespit edilmemişken, S. zeamais Tsukuba, Ibaraki ve Japonya da tespit edilmiştir. S. granarius için UK lokasyonundan toplanan örneklerin taraması sonucunda ise Wolbachia varlığı tespit edilmemiştir. Pourali vd. (2009) İran ın Huzistan Eyaletinde bazı arthropod ve Nematodlarda Wolbachia taramasında 16S rdna primeri kullanmışlar ve 430bp lık bant büyüklüğünü Wolbachia için geçici olarak pozitif saymışlardır. Ardından Wolbachia varlığını teyit etmek için wsp primerini kullanmışlar ve 632bp lık bant görüntüsü elde etmişlerdir. Wolbachia için toplam 770 arthropod (22 tür) ve 41 nematod (altı tür) taramışlardır. Sonuç olarak, yedi arthropod türünde ve bir nematod türünde olmak üzere toplam 167 arthropod (%14.08) örneği pozitif çıkmıştır. Lachowska vd. (2010) Avrupa daki depolanmış ürün zararlılarında Wolbachia nın süpergrup ve filogenetik analizi 16S rdna, ftsz, wsp ve hcpa dizileri temelinde belirlenmiş ve 16 türü (%40) Wolbachia tarafından enfekte olduğu belirlenmiştir. Bunların altısı yalnızca A sınıfı süpergruba (tüm enfekte türlerin % 15'i, enfekte türlerin % 37.5'i), dördü de yalnızca süpergrup B (sırasıyla % 10 ve % 25) de yer aldığını, Wolbachia süpergrup frekansları arasında herhangi bir fark tespit 14

edilmediğini, her iki süpergrubun hepsinde olduğunu, çalışılan dört gen arasında sınırlı bir uyum söz konusu olduğunu belirtmişlerdir. Bu sonuçlar türler arasında Wolbachia nın horizontal iletimini ve farklı türler arasındaki rekombinasyonunu göstermişlerdir. Zhang vd. (2010) nın yaptığı çalışmada ABD nin sekiz eyaletinde Conotrachelus nenuphar (Curculionidae) popülasyonlarında Wolbachia enfeksiyonunun dağılımı incelenmiştir. İnceleme sonucunda popülasyonların %97.8 inde Wolbachia ya özgü wsp geni tespit edilmiştir. Sonuç olarak Wolbachia enfeksiyonunun Curculionidae popülâsyonları arasında üreme uyumsuzluğuna neden olabileceğini bildirmişlerdir. Henri ve Mouton (2011) yapmış oldukları çalışmada depo ürün zararlısı olan S. oryzae üzerinde Wolbachia varlığını belirlenmesi ve doğurduğu sonuçları öğrenmek amaçlanmıştır. Wolbachia nın üreme bozukluğuna neden olduğunu, mevcut raporda, yüksek çözünürlüklü erime (HRM: High Resolution Melting ) analizine dayanan ve büyük ölçekli çalışmalar için klasik yöntemlerden daha ucuz ve hızlı olan popülasyon çalışmaları için yeni bir araç kullanımını önermişlerdir. HRM nin tekli enfeksiyon durumunda polimorfizmi tespit etmek için güçlü bir araç olduğunu belirtmişlerdir. HRM nin Wolbachia tür çeşitliliği olmadan çalışmak için yararlı, hızlı ve güvenilir bir teknik olduğunu ortaya koymuşlardır. İçinde S. oryzae nin de bulunduğu Avustralya dan toplanılan popülasyonlarda wsp geni ile Wolbachia enfeksiyonunun %73-99.7 oranında olduğunu tespit etmişlerdir. Chen vd. (2012) Lissorhoptrus oryzophilu (Coleoptera: Curculionidae) de Wolbachia enfeksiyonu durumunu ve konukçu üzerinde üremede ne gibi değişikliklere yol açtığını taramışlardır. Çin de beş popülasyonda parthenogenetik durumunu, Güneydoğu Teksas ta biseksüel durumunu incelemişlerdir. Tüm popülasyonlar Wolbachia tarafından enfekte edilmiş ve her popülasyondaki örnekleri tek bir Wolbachia ırkı ile bulaştırmışlardır. Çok odaklı dizi tipleme sistemine dayanan filogenetik analizler, yerli olmayan L. oryzophilus'taki Wolbachia'nın, yerli böceklerde olanlardan uzaklaştığını tespit etmişlerdir. Tetrasiklin ile muamele edilenlerde partenogenetiklik durumunun azaldığı ve yumurta gelişimini engellediğini bulurken çalışma sonuçlarının Wolbachia nın oosit üretimi için gerekli olduğunu belirtmişlerdir. 15

Vigneron vd. (2012) S. oryzae de endosimbiyont ve patojenlerin konukçu üzerindeki etkilerini araştırmışlardır. Simbiyotik canlılar S. oryzae üzerindeki patojenlere karşı mücadele ederken bağışıklık sisteminin zayıfladığı tespit edilmiştir. Sonuç olarak simbiyotik canlıların S. oryzae üzerinde patojenlere karşı mücadele ederken böceğin yaşam standartlarını düşürdüğü gözlemlenmiştir. Böylece konukçu bağışıklığı üzerine yeni perspektiflerin bulunduğunu ortaya koymuşlardır. Bu sebeple endosimbiyontlar ve patojenler sayesinde böcek direncinin azaldığı mücadele yöntemlerinin artmakta olduğunu bildirmişlerdir. Wolbachia nın alternatif olarak biyolojik mücadelede önemli bir yere sahip olduğunu belirtmişlerdir. Carvalho vd. (2014) dünya nın farklı ülkelerinden toplanan 11 S. zeamais popülasyonu (Meksika, Panama, Peru, Hindistan, Tayland, Brezilya (Ipojuka), Brezilya (Votuporanga) Mozambik, Avusturalya, Kolombiya ve Amerika) ve 16 S.oryzae (Brezilya (Sao Borja), Brezilya (Cascavel), Grek, Peru, Avustralya, İran, Ekvator, Amerika, Birmanya, Tobago, Hindistan, Egito, Gürcistan, Brezilya (Curitiba), Maputo ve Peru (Lima) popülasyonunda Wolbachia varlığı tespiti için 16S rdna primerini kullanılmıştır. Sonuçlara bakıldığında S. zeamais in %81.8 i Wolbachia ile enfekteliyken S.oryzae de bulaşmanın %43.75 olduğunu tespit etmişlerdir. Çalışmada tropik ve subtropik ortamdan temin edilen pirinç bitlerinin Wolbachia enfeksiyonu varlığı ile bağıntılı olduğunu bildirmişlerdir. Wolbachia enfeksiyonunun S. oryzae üzerinde horizontal olarak taşındığını belirtmişlerdir. Lu vd. (2014) ABD, Taghai ve Çin de yaptıkları çalışmada, Lissorhoptrus oryzophilus erginlerinin bağırsaklarından klonlanmış gen parçalarından bakteriyel 16S rrna dizilerinin endosimbiyont bakteriler arasındaki filogenetik benzerliğini araştırmışlardır. Nardonella ya en yakın olan 16S rrna geni phylotype olarak belirlemişlerdir. Nardonella nın sağlıklı konukçu büyümesi ve gelişimi, normal vücut ağırlığı, vücut boyu, vücut rengi ve büyüme hızı için yararlı bir endosimbiyont olduğunu belirtmişlerdir. Tespit edilen en baskın bakterilerin Pantoe ve Wolbachia olduğunu bildirmişlerdir. Iwase vd. (2015) bu çalışmada, Japonya'nın kuzeyinde bulunan Kyushu adasında, Hypera postica istilası nedeniyle Wolbachia enfeksiyon durumunu belirlemişlerdir. 1982 den 2015 e kadar farklı zaman dilimlerinde toplanmış olan örnekler PCR amplifikasyonuna tabii tutularak Wolbachia enfeksiyonu taranmış, ancak pozitif bir 16

sonuç elde edememişlerdir. En son mısır üzerinde örnek toplama işleminden sonra, yapılan taramalarda süpergrup-b Wolbachia varyantı bulunduğu bildirilmiştir. Li vd. (2015) depolanmış ürün zararlılarından 38 (16 farklı ülke 88 popülasyon) tür elde edip wsp primeri ile tarama yapmışlardır. Coleoptera takımından; Kanada, Almanya, Yunanistan, İspanya ve Amerika dan temin edilen Lasioderma serricorne, Kanada ve Amerika dan temin edilen Stegobium paniceum, Kanada dan temin edilen S. oryzae, Tayland dan temin edilen S. zeamais, Amerikadan temin edilen Attagenus unicolor, Kanada dan temin edilen Dermestes lardarius, Kanada dan temin edilen Oryzaephilus mercator, Kanada, Yunanistan, İspanya ve Amerika dan temin edilen Oryzaephilus surinamensis ve Kanada, Çin, Danimarka, İngiltere, Fransa, Almanya, Yunanistan, İtalya, Portekiz, İspanya ve Amerika dan temin edilen Tribolium confusum da Wolbachia enfeksiyonu gözlemlenirken, Hymenoptera takımından Kanada dan temin edilen Trichogramma deion da ve Lepidoptera takımında Kanada dan temin edilen Ephestia kuehniella da Wolbachia enfeksiyonu varlığı tespit edilmiştir. Avustralya, Kanada, Yunanistan, Myanmar, İspanya ve Trinidad dan temin edilen S. oryzae de Wolbachia varlığı gözlemlenmemiştir. Wsp gen dizilimine dayanan filogenetik analiz sonucuna göre Wolbachia enfeksiyonlarını süpergrup-a ve süpergrup-b üyeleri olarak tanımlayarak S.oryzae nin süpergrup- B de yer aldığını belirlemişlerdir. Yapmış oldukları çalışmada Wolbachia nın bulunduğu canlının üreme sistemini etkilediğini belirtmişlerdir. Wolbachia nın zararlı türlerin kontrol altına alınabilmesini için önemli olduğunu belirtmişlerdir. 17

3.MATERYAL VE METOT 3.1. Materyal Çalışmanın ana materyalini pirinç biti Sitophilus oryzae oluşturmaktadır. Sistematikteki yeri Şube: Arthropoda Sınıf: Insecta Takım: Coleoptera Familya: Curculionidae Cins: Sitophilus Tür: Sitophilus oryzae (L). Tanımı: Pirinç biti erginleri, iyi gelişmiş alt kanatları ile uçma yeteneğine sahiptir. Yumurtalar parlak beyaz renktedir. Larva, beyaz sarımsı renkli, 2.5-3.0 mm boyda ve bacaksızdır. Başları kahverengi olup daima kıvrık olarak durur. Pupa, önce beyaz, sonra sarımsı renkli olup, 3.5-4.5 mm boydadır. Ergin, rengi kırmızımsı esmer ile kahverengi arasında değişir. Boyu 2.5-4.0 mm dir. Baş hortum gibi uzamış olup, ucunda ağız parçaları yer almaktadır. Pronotum ve kın kanatlar üzerinde uzunca derin çukurcuklar bulunur. Kın kanatlar üzerinde dört tane kırmızımtırak sarı leke vardır (Anonim, 2008). Şekil 3. Sitophilus oryzae ergini (Coleoptera Curculionidae) (Anonim, 2008) Biyolojisi: Pupa döneminden çıkan erginler bir hafta sonra çiftleşir ve yumurta bırakmaya başlar. Yumurtalarını mısır tanesinin genellikle embriyo kısmına yakın yerlerden ağız parçaları ile açtıkları deliklere bırakırlar. Ergin dişi, bu deliği ağzından 18

salgıladığı bir madde ile kapatır. Larva ve pupa dönemini tane içinde geçirir. Erginler 6-8 ay yaşarlar ve bu süre içinde 120-180 yumurta bırakır. Yılda 5-6 döl verir. Bu türde kanatlar gelişmiş olduğundan uçabilirler ve yaz aylarında tarlada bulunan tahıl koçanları üzerindeki tanelere yumurta bırakırlar. Hasatla birlikte ambara geçerek burada zararlı olur (Yıldırım vd., 2001; Anonim, 2008). Şekil 4. Sitophilus oryzae nin yumurta, larva ve pupası (Coleoptera: Curculionidae) (Anonim, 2017) 3.2. Metot 3.2.1. Depolardan buğday örneklerinin toplanması Örnekleme bir seferde ve en uzun depolama döneminde yapılmıştır. Örnekleme için Z biçiminde gezilerek ilgili deponun üst, orta ve taban kısmı olmak üzere üç bölgeden el sondasıyla veya depolanış biçimine göre yapılmıştır. Örnekleme sonrası yaklaşık 3-5 kg hububat örneği alınmıştır (Anonim, 2013). Aşağıda belirtilen illerdeki Toprak Mahsulleri Ofisi (TMO) ve özel hububat depolarından S. oryzae alınmıştır. İç Anadolu Bölgesi: Ankara (Haymana ve Karakeçeli), Konya (Merkez ve Alibeyköy) Ege Bölgesi: Manisa (Kaldere), İzmir (Merkez) Akdeniz Bölgesi: Adana (Ceyhan ve Çukurköprü) Karadeniz Bölgesi: Samsun (Bafra Bereket Un ve Bafra Pak Un) Güneydoğu Anadolu Bölgesi: Şanlıurfa ve Diyarbakır (Özyıldızlar Un Fabrikası). 19

3.2.2. Sitophilus oryzae nin elde edilmesi Sitophilus oryzae nin kültüre alınmasında sağlam, beyaz yumuşak ekmeklik buğday kullanılmıştır. Buğdaylar 1 litrelik cam kavanozlara yaklaşık 300-400 g konulduktan sonra cam kavanozların kapakları yaklaşık 0.5-1 mm çapında delinerek hava sirkülasyonu sağlanmıştır. Bu kavanozlar küvetlere alınmış ve dip kenarlarına sıvı vazelin sürülmüştür. Kavanozlar 25±1 o C sıcaklık ve % 65±5 orantılı nem koşullarına ayarlanmış böcek yetiştirme odasına yerleştirilmiştir (Pimentel vd., 2008). İlk 10 birey elde edildikten sonra çalışmaya alınmıştır. S. oryzae örnekleri stereoskopik mikroskop yardımıyla ayrılmıştır. Toplanılan böceklerin teşhisinde Hill (2002) den yararlanılmıştır. Şekil 5. Süleyman Demirel Üniversitesi nde ayrılıp, kavanozlanan Sitophilus oryzae örnekleri 3.2.3. Genomik DNA izolasyonu Türkiye nin 12 farklı lokasyonundan elde edilen S. oryzae popülasyonları yüzey sterilizasyonu için bir gece -20 C %95 etanolde bekletilmiş akabinde DNA ekstrasyon işlemi gerçekleştirilmiştir. Pourali vd. (2009) yapmış oldukları çalışmada %95 etanol içerisinde -20 C de uzun süre saklanan örneklerde wsp geninin amplikasyonu için gerekli olan DNA nın bozulmasından dolayı Wolbachia tespit edilme oranının düştüğünü belirlemişlerdir. Her ilden 10 birey olmak üzere toplam 120 örnekte Wolbachia varlığı araştırılmıştır. Bunun için Mouton vd. (2003), Gueguen vd. (2010) ve Mouton vd. (2009) yapmış 20

oldukları çalışmalarında, genomik DNA izolasyonu sırasında DNA ekstrasyon kit yöntemini kullanmışlardır. Ancak kit yönteminin pahalı olmasından dolayı bu çalışmada genomik DNA izolasyonu için Saghai-Maroof vd. (1984) nin kullandığı CTAB (Cetyltrimethlyammonium bromide) solüsyonu yöntemi revize edilerek izolasyon yapılmıştır. Örnekler eppendorf tüplerine alınarak 200 μl CTAB eklendikten sonra ezme çubukları ile iyice ezilmiştir. Ezme çubukları ile ezildikten sonra tekrar 200 μl CTAB eklendikten sonra içerisine 20 μl proteinaz K eklenip tüpün ağzı parafilmlenerek 65 C sıcaklığındaki su banyosunda 24 saat bekletilmiştir. Su banyosundan çıkarılan örneklerin içerisine RNAaz eklenilerek 5dk oda sıcaklığında bekletilmiştir. 14.000 devirde 5dk santrifüje tabi tutulup 1.5 μl eppendorf tüplerinde üst kısımda kalan sıvı yeni tüpe alınmıştır. Yeni tüpe alınan örneklerin üzerine 500 μl 24:1 lik Cloroformisoamylalchol eklenilerek elle hafifçe çalkalanmıştır. 18.000 devirde 10 dk santrifüje tabi tutulan örneklerin üst kısmında kalan sıvı tekrar yeni eppendorf tüplerine alınmıştır. 500 μl 24:1 Cloroformisoamylalchol eklenmiştir. Tekrardan 18.000 devir 10 dk santrifüje tabi tutulan örneklerin üst kısmında kalan sıvı yeni eppendorf tüplerine alınmıştır. 400 μl önceden soğutulmuş isopropanol eklenip - 80 C de yaklaşık olarak 60 dk bekletilmiştir. -80 C den alınan örnekler 18.000 devirde 30 dk santrifüje tabi tutulmuştur. %70 lik soğuk etanolden 500 μl eklenip 18.000 devirde 5 dk santrifüjlerenek yıkama işlemi gerçekleştirilmiştir. Bu işlemin iki kez uygulanmasıyla genomik DNA nın temizlenmesi sağlanmıştır. Etanolden genomik DNA pelleti arındırılıp ve pelletin büyüklüğüne göre yaklaşık olarak 20 50 μl arasında ultrasaf su eklenmiş, böylece genomik DNA elde edilmiştir. DNA nın uygunluğunu kontrol etmek için, genomik DNA lar %1 lik agaroz jele yüklenmiştir. 80 voltda 10 dk koşturularak spektrofotometre cihazı ile görüntü alınmıştır. Nanodrop cihazında da genomik DNA miktarı nanogram değerinden tespit edilmiştir. Değerlerin yaklaşık olarak 500-1800 nanogram arasında olduğu görülmüştür. 21

Şekil 6. Sitophilus oryzae örneklerinden elde edilen genomik DNA bant görüntüsü. 1-10: İzmir, 11-20: Ankara, 21-30: Diyarbakır ve 31-40: Konya 3.2.4. PCR amplifikasyonu Sitophilus oryzae den elde edilen genomik DNA örneklerinde Wolbachia enfeksiyonunun taranması amacıyla evrensel Wolbachia primeri (Zhou vd., 1998) wsp81f (5'TGG TCC AAT AAG TGA TGA AGA AAC3') ve wsp691r (5' AAA AAT TAA ACG CTA CTC CA3') kullanılmıştır. Bu primerler tek tek Wolbachia türlerine bağlı olarak 590-630 bp arasında değişen DNA parçasını çoğaltmaktadır. PCR için kullanılan 0.2 lik PCR tüplere sırası ile 5 µl 2X AmpMaster Taq Mix, 0.5 µl wsp 81 F primer, 0.5 µl wsp 691 R primer, 2.5 µl distile su ve 0.5 µl genomik DNA eklenen tüpler PCR cihazına yerleştirilmiştir. Örneklere 45 C-55 C ve 50 C- 60 C arasında gradient PCR ı uygulanarak, 55 C de primerin bağlanma derecesinin en uygun sıcaklık olduğu tespit edilmiştir. PCR işlemi Zhou vd. (1998) nin izlediği protokole revize edilerek gerçekleştirilmiştir (Çizelge 3). Takiben PCR ürünleri PRONASAFE ile boyalı %1.5 lik agaroz jelde yürütüldükten sonra UV transilluminatörde görüntülenmiştir. Çizelge 3. Sitophilus oryzae üzerinde Wolbachia taraması için yapılan PCR döngü programı PCR döngüsü İşlemi Sıcaklık ( C) Süre Döngü Ön denatürasyon 95 2 dk 1 Denatürasyon 95 10 sn Bağlanma 55 10 sn Uzama 72 15 sn Son uzama 72 2 dk 1 35 22

4. ARAŞTIRMA BULGULARI Ülkemizde Ege (İzmir, Manisa/Kaldere), İç Anadolu (Ankara/Haymana ve Karakeçili, Konya/Merkez ve Alibeyköy), Karadeniz (Samsun/Bafra Bereket Un ve Bafra Pak Un), Güneydoğu Anadolu (Diyarbakır/ Özyıldızlar Un Fabrikası, Şanlıurfa Merkez) ve Akdeniz (Adana/Ceyhan ve Çukurköprü) bölgelerinden toplam 12 lokasyondan S. oryzae örnekleri toplanmıştır. Moleküler tekniklerin uygulanması sonucu elde edilen jel görüntülerine göre, taranan 120 örnekten 118 inde (%98,33) Wolbachia tespit edilmiştir. Şanlıurfa ve Adana (Çukurköprü) da %90 oranında Wolbachia varlığı saptanmışken, Manisa, İzmir, Ankara, Diyarbakır, Samsun, Konya ve Adana illerinden elde edilen diğer 10 popülasyonda ise Wolbachia varlığı %100 olarak tespit edilmiştir (Şekil 7). %100 %90 %80 %70 %60 %50 %40 %30 %20 %10 %0 Toplam Örnek Sayısı Enfekteli Örnek Sayısı Şekil 7. İllere göre Sitophilus oryzae de belirlenen Wolbachia oranları Çalışma sonucunda bazı illerde S. oryzae de Wolbachia bulunma oranı %100 iken (Şekil 8), bazı illerde ise %90 olmuştur (Şekil 9). 23

a b 590 bp c d e f g h i j Şekil 8. Sitophilus oryzae bireylerinde %100 oranındaki Wolbachia varlığı belirlenen iller. a) Manisa, b) İzmir, c) Ankara (Haymana), d) Ankara (Karakeçeli), e) Konya (Alibeyköy), f) Konya (Merkez), g) Samsun (Bafra Un), h) Samsun (Pak Un), i) Diyarbakır ve j) Adana (Ceyhan) 24

a b 590 bp Şekil 9. Sitophilus oryzae bireylerinde %90 oranındaki Wolbachia varlığı belirlenen iller. a) Adana (Çukurköprü) ve b) Şanlıurfa Çalışma sonucunda S. oryzae de Ege Bölgesi, İç Anadolu Bölgesi ve Karadeniz Bölgesinde %100, Güneydoğu Anadolu Bölgesi ve Akdeniz Bölgesinde %90 oranında Wolbachia enfeksiyonu tespit edilmiştir. Yapmış olduğumuz çalışmada S. oryzae de cinsiyet belirlemeden rastgele örnekler seçilerek Wolbachia enfeksiyonu taranmış ve işlemlere tabii tutulmuştur. Bu nedenle bant parlaklıklarında farklılıklar söz konusudur. 25

5. TARTIŞMA VE SONUÇLAR Bu tez S.oryzae türünde Wolbachia varlığının ve yayılış oranının Türkiye de belirlendiği ilk çalışma niteliğindedir. Türkiye genelinden toplanan S. oryzae türünde Wolbachia enfeksiyonunun belirlenmesi amacıyla yaptığımız bu çalışma Arthropoda şubesine bağlı birçok canlı türünde varlığını göstermiş ve çoğu bilim insanı tarafından literatüre geçirilmiştir. Çalışma sonucunda ülke genelinde S. oryzae de Wolbachia bulunma oranı ortalama %98.34 olarak bulunmuştur. S. oryzae de yapılan çalışmalarda Werren vd. (1995b), Heddi vd. (1999), Heddi vd. 2001, Shen vd. 2003 Fein ve Perlman 2004 yaptıkları çalışmada S. oryzae de Wolbachia enfeksiyonunu tespit etmişlerdir. Henri ve Mouton (2011) S. oryzae nin de bulunduğu Avustralya dan toplanılan popülasyonlarda wsp geni ile Wolbachia enfeksiyonunun %73-99.7 oranları arasında olduğunu tespit etmişlerdir. Aynı gen bölgesinde tarama yapılan bir başka çalışma ise Kageyama vd. (2010) nindir. İçerisinde S. oryzae nin de bulunduğu Tsukuba, Ibaraki, Japonya ve İtalya popülasyonlarında Wolbachia varlığını tespit edememişlerken, Carvalho vd. (2014) dünyanın farklı ülkelerinden toplanan 16 S. oryzae popülasyonunun %43.75 inin Wolbachia ile enfekli olduğunu tespit etmişlerdir. Bunların bulaşık olma durumunun özellikle tropik ve subtropik bölgede S. oryzae deki Wolbachia enfeksiyonunun bağlantılı olduğunu belirtmişlerdir. Ülkemiz iklim koşulu açısından Wolbachia enfeksiyonu için elverişlidir. Li vd. (2015) Kanada dan temin edilen S. oryzae de Wolbachia enfeksiyonu tespit ederken, Avustralya, Kanada, Yunanistan, Myanmar, İspanya ve Trinidad dan temin edilen S. oryzae de Wolbachia enfeksiyonu olmadığını belirlemişlerdir. Sıcaklık, besin kalitesi ve yoğunluk gibi çevresel faktörler konukçudaki simbiyont yoğunluğunu ve anneden yavruya simbiyont aktarımını etkilemektedir (Hoffmann vd., 1990; Sinkins vd., 1995). Çalışma bulgularımıza göre, S. oryzae popülasyonlarının çevre şartlarından olumsuz etkilenmediğini söyleyebiliriz. Sitoplazmik uyumsuzluk erkek bireyle bağlantılı olduğu için, erkek bireylerin yaşı arttıkça Wolbachia aktarma ihtimali düşmekte ve bulaşma oranı azalmaktadır (Berticat vd., 2002). Drosophila- Wolbachia etkileşimleri ile ilgili son zamanlarda yapılan çalışmalara bakıldığında; maternal olarak bulaşabilen bu simbiyont virülansının hem laboratuvar hem de saha popülasyonlarında çok hızlı bir şekilde 26