Doç. Dr. Mahfuz ELMASTAŞ 2010 Her hakkı saklıdır

MÜHRÜSÜLEYMAN (Polygonatum orientale) BİTKİSİNİN İN VİTRO ANTİOKSİDAN KAPASİTESİNİN İNCELENMESİ VE BAZI VİTAMİN İÇERİKLERİ Elif AKTÜRK Yüksek Lisans Tezi Kimya Anabilim Dalı Doç. Dr. Mahfuz ELMASTAŞ 2010 Her hakkı saklıdır

T.C. GAZİOSMANPAŞA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ KİMYA ANABİLİM DALI YÜKSEK LİSANS TEZİ MÜHRÜSÜLEYMAN (Polygonatum orientale) BİTKİSİNİN İN VİTRO ANTİOKSİDAN KAPASİTESİNİN İNCELENMESİ VE BAZI VİTAMİN İÇERİKLERİ Elif AKTÜRK TOKAT 2010 Her hakkı saklıdır

i ÖZET Yüksek Lisans Tezi MÜHRÜSÜLEYMAN (Polygonatum orientale) BİTKİSİNİN İN VİTRO ANTİOKSİDAN KAPASİTESİNİN İNCELENMESİ VE BAZI VİTAMİN İÇERİKLERİ Elif AKTÜRK Gaziosmanpaşa Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Kimya Anabilim Dalı Danışman: Doç. Dr. Mahfuz ELMASTAŞ Bu çalışmada; mührüsüleyman bitkisinin 2007 ve 2009 yıllarında toplanan kök kısmının serbest radikal (DPPH ) giderme aktivitesi, indirgeme gücü aktivitesi, metal şelat oluşturma aktivitesi, süperoksit anyon radikali giderme aktivitesi, total antioksidan aktivite testileri ile bu bitkinin antioksidan kapasitesi araştırılmıştır. Ayrıca, total fenolik bileşik tayini, vitamin E ve toplam karotenoid miktarları belirlenmiştir. Mührü süleymanın hem metanol/metilen klorür ekstresi hem de su ile hazırlanan ekstreleri antioksidan aktiviteye sahip standartlarla karşılaştırıldığında serbest radikal giderme aktivitesine sahip olmadığı görülmüştür. İndirgeme gücü aktivitesinin yok denecek kadar az olduğu anlaşılmıştır. Metal şelat oluşturma aktivitesi ve süperoksit anyon radikali giderme aktiviteleri incelendiğinde özellikle 2007 yılında toplanan kısmın su ekstresinin standartlara çok yakın olduğu diğer ekstrelerinde bu aktiviteyi gösterdiği görülmüştür. Ferik tiyosiyanat metoduna göre total antioksidan aktiviteyi 2007 yılının metanol/metilen klorür ekstresi aktivite göstermiştir. Yapılan çalışmada, toplam fenolik bileşik miktarı 2009 metanol/metilen klorür ekstresinde (09 MS) 1,58 mg/kg bitki, 2009 su ekstresinde (09 MS SS) 1,26 mg/kg bitki, 2007 metanol/metilen klorür ekstresinde (07 MS) 1,80 mg/kg bitki, 2007 su ekstresinde (07MS SS) 1,35 mg/kg bitki olarak bulunmuştur. Yapılan çalışmada elde edilen vitamine miktarları: 09 MS 30mg/kg bitki, 09 MS SS 0,0652 mg/kg bitki, 07 MS 11,82 mg/kg bitki, 07 MS SS Yapılan analizler sonucunda elde edilen toplam karotenoid 09 MS 0,0988 mg/g bitki bulunmuşken, 07 MS karotenoid bulunmamıştır. 2010, 53 sayfa Anahtar kelimeler: Antioksidan, Mührüsüleyman, Polygonatum orientale

ii ABSTRACT Ms Thesis INVESTIGATION IN VITRO ANTIOXIDANT CAPACITY AND SOME VITAMIN CONTENT OF POLYGONATUM ORIENTALE Elif AKTÜRK Gaziosmanpaşa University Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Chemistry Supervisor : Associate Prof. Dr. Mahfuz ELMASTAŞ In this study, antioxidant capacity of root collected in 2007 and in 2009 of Polygonatum orientale was evaluate by free radical (DPPH ) scavenging activity, reducing power activity, metal chelating activity, superoxide anion radical scavenging activity, total antioxidant activity tests. In addition, amount of total phenolic compounds, vitamin E and total carotenoid were determined. Both of water and methanol/methylene chloride extracts have not free radical scavenging activity and reduction power activity when compared with standards. According to obtained data the plant, especially collected in 2007 have metal chelating activity and superoxide anion radical scavenging activity. Methanol/methylene chloride extract collected in 2007 have total antioxidant activity. Total amount of phenolic compounds in methanol/methylene chloride extract collected in 2009 (09 MS) 1.58 mg/kg plant, in 2009 the water extract (09 MS SS) 1.26 mg/kg plant, 2007 methanol/methylene chloride extract (07 MS ) 1.80 mg/kg plant, in 2007 the water extract (07MS SS) 1.35 mg/kg were found. Obtained data in the study, the amount of vitamine 09 MS 30 mg/kg plants, 09 Ms SS 0.0652 mg/kg plants, 07 MS 11.82 mg/kg plants, 07 MS SS 0.0096 mg/kg plant were found. As a result of total carotenoid analysis 0.0988 mg/g plant in 09 MS was found. But carotenoid in 07 MS was not found. 2010, 53 pages Keywords: Antioxidant, Mührüsüleyman, Polygonatum orientale

iii TEŞEKKÜR Yüksek lisans eğitimim süresince bilgi ve deneyimlerini benden esirgemeyen, büyük ilgi ve anlayışıyla her türlü problemin üstesinden gelmemde bana yardımcı olan, sabırla beni dinleyip olumlu yönlendirmeleriyle yanımda olan danışman hocam sayın Doç. Dr. Mahfuz ELMASTAŞ a teşekkürlerimi sunarım. Ders ve tez dönemlerinde deneyimlerinden faydalandığım ve fikirleri bana yol gösterici olan çok değerli hocam sayın Yard. Doç. Dr. Yakup BUDAK a sonsuz teşekkürlerimi sunarım. Bitkiyi toplayan sayın Öğretim Görevlisi Hasan Basri Karayel e, tür teşhisini yapan sayın Prof. Dr. Ali ÇIRPICI ya emeklerinden dolayı çok teşekkür ederim. Deneysel çalışmaların yapılmasında ve çalışmanın her safhasında yardımlarını esirgemeyen Uzman Nusret Genç e teşekkürlerimi sunarım. Hayatımın her döneminde maddi ve manevi desteğini hiçbir zaman esirgemeyen bana inanan ve başarılarımla gurur duyan aileme ve varlığından güç aldığım sevgili nişanlım Uzman Recep BOZDEMİR e en içten teşekkürlerimi sunarım. Elif AKTÜRK Tokat, 2010

iv İÇİNDEKİLER İçindekiler Sayfa ÖZET... i ABSTRACT...ii TEŞEKKÜR...iii İÇİNDEKİLER... iv KISALTMALAR LİSTESİ...vi ŞEKİLLER LİSTESİ...viii ÇİZELGELER LİSTESİ...ix 1. GİRİŞ... 1 2. KAYNAK ÖZETLERİ... 4 2.1. Mührüsüleyman (P. orientale) Bitkisinin Genel Özellikleri... 4 2.2. Reaktif Oksijen Türleri (ROS) ve Etkileri... 5 2.2.1. Reaktif Oksijen Türleri (ROS)... 6 2.2.1.1. Süperoksit Radikali (O 2 )... 6 2.2.1.2. Hidrojen Peroksit (H 2 O 2 )... 8 2.2.1.3. Hidroksil Radikali (OH )... 9 2.2.2. Hücrede Reaktif Oksijen Türlerinin (ROS) Kaynağı... 9 2.2.3. Serbest Oksijen Radikallerinin Etkileri... 14 2.2.3.1. Serbest Radikallerin Lipidlere Etkileri... 16 2.2.3.2. Serbest Radikallerin Proteinlere Etkileri... 18 2.2.3.3. Serbest Radikallerin Nükleik Asitler ve DNA'ya Etkileri... 18 2.2.3.4. Serbest Radikallerin karbonhidratlara Etkileri... 19 2.3. Antioksidan Savunma Sistemleri... 19 2.3.1. Endojen Antioksidanlar... 22 2.3.1.1. Enzim Olan Endojen Antioksidanlar... 22 2.3.1.2. Enzim Olmayan Endojen Antioksidanlar... 22 2.3.1.3. Eksojen Antioksidanlar... 23 2.3.1.4. Vitamin Eksojen Antioksidanlar... 23 2.3.1.5. Fenolik Bileşikler... 23 2.3.2. Oksidatif Stres... 24 2.4. Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi (HPLC)... 25 2.4.1. HPLC Sisteminde Pompa... 27 2.4.1.1. Taşıyıcı Faz Programlaması... 28 2.4.2. Örneğin kolona verilmesi (Enjeksiyon)... 29 2.4.3. Kolon... 29 2.4.4. Dedektör... 30 2.4.4.1. Infrared (IR) Absorbans Dedektörleri... 31 2.2.4.2. Floresans Dedektörleri... 31 2.2.4.3. UV Absorbans Dedektörleri... 32 2.2.4.4. Kırılma İndisi Dedektörleri... 32 3. MATERYAL VE METOT... 33 3.1. Materyal... 33

v 3.2. Kullanılacak Kimyasal Madde, Malzeme ve Cihazlar... 33 3.3. Metot... 33 3.3.1. İndirgeme Gücü... 34 3.3.2. Serbest Radikal (DPPH) Giderme Aktivitesi... 35 3.3.3. Süperoksit Anyon Radikali Giderme Aktivitesi... 36 3.3.4. Total Antioksidan Aktivitenin Belirlenmesi... 37 3.3.5. Total Fenolik Bileşik Tayini... 37 3.3.6. Metal Şelatlama Aktivitesi... 38 3.3.7. E Vitamininin (α-tokoferol) ün HPLC ile Kantitatif Tayini... 38 3.3.8. Karotenoid (A vitamini) Spektroskopik Yöntemle Analizi... 39 4. BULGULAR... 40 4.1. İndirgeme Gücü... 40 4.2. Serbest Radikal (DPPH) Giderme Aktivitesi... 41 4.3. Süperoksit Radikali Giderme Aktivitesi... 42 4.4. Total Antioksidan Aktivitenin Belirlenmesi... 42 4.5. Total Fenolik Bileşik Tayini... 43 4.6. Metal Şelatlama Aktivitesi... 44 4.7. E Vitamini Tayini... 45 5. SONUÇ... 48 KAYNAKLAR... 50 ÖZGEÇMİŞ... 53

vi KISALTMALAR LİSTESİ Kısaltma Açıklama FRAP İndirgeme Gücü Testi ROS Reaktif Oksijen Türleri ETS Elektron Taşıma Sistemi SOD Süperoksit Dizmutaz CAT Katalaz GSH Glutatyon GSH-Px Glutatyon Peroksidaz DPPH 1,1,Difenil 2-pikril hidraliz BHA Bütillenmiş Hidroksi Anisol BHT Bütillenmiş Hidroksi Toluen H 2 O 2 Hidrojen Peroksit UV Ultraviyole Işınları DNA Deoksiribonükleik Asit ADP Adenozin di fosfat O 2 O 3 CCl 4 HOBr HOI HOCl LOOH Süperoksit radikali Ozon Karbon tetraklorür Hipobromik asit Hipoiyodik asit Hipoklorik asit Lipid hidroperoksit LOO Lipid peroksit radikalleri L Lipid serbest radikalleri OH Hidroksil radikali NO 2 CCl 3 Azot dioksit radikali Triklorometil serbest radikali RCOO Organik peroksitler RS Tiyil radikalleri R Organik radikaller ONOO Peroksinitrit NO 3 NO 2 NO 2 + Nitrat Azot dioksit Nitronyum iyonu RSO 2

vii Tiyil peroksit radikalleri RO Alkoksi radikalleri ROO Peroksit radikalleri RA Rromatoit artritte IgG İmmünoglobülin MDA Malondialdehit po 2 Parsiyel oksijen basıncı

viii ŞEKİLLER LİSTESİ Şekil Sayfa Şekil 2. 1. Mührüsüleyman bitkisinin görünümü... 4 Şekil 2. 2. Stoplazmik membrandaki nötrofillerin bir kısmı... 12 Şekil 2. 3. Serbest radikallerin nötralizasyonu... 12 Şekil 2. 4. Serbest radikallerin hücreye etkileri... 15 Şekil 2. 5. Reaktif oksijen türlerinin zararı... 15 Şekil 2. 6. Yağ asidi zincirinin bir lipid radikali niteliği kazanması... 16 Şekil 2. 7. Lipid peroksidasyonu... 17 Şekil 2. 8. Malondialdehit (MDA)... 17 Şekil 2. 9. Antioksidanların hücredeki etkileri... 20 Şekil 2. 10. Oksidatif stres... 25 Şekil 2. 11. Karışımların ayrılması ve bileşenlerin kalitatif ve kantitatif Analizlerinde kullanılan HPLC cihazı... 26 Şekil 2. 12. HPLC cihazında kullanılan kolonları... 30 Şekil 3. 1. Demir ferrosiyanür oluşumu... 35 Şekil 4. 1. Standart ve numunelerin çeşitli konsantrasyonlardaki metal şelat oluşturma aktiviteleri. (09MS M: 2009 yılında toplanan mührüsüleymanın metanol/metilenklorür ekstresi; 09MS SS: 2009 yılında toplanan mührüsüleymanın saf su ekstresi; 07MS M: 2007 yılında toplanan mührüsüleymanın metanol/metilenklorür ekstresi; 07MS SS: 2007 yılında toplanan mührüsüleymanın saf su ekstresi)... 40 Şekil 4. 2. Standart ve numunelerin belirli konsantrasyonlarının % DPPH giderme aktiviteleri... 41 Şekil 4. 3. Standart ve numunelerin % süperoksit anyon radikali giderme aktiviteleri.. 42 Şekil 4. 4. Mührüsüleyman bitkisinin total antioksidan aktivitesi... 43 Şekil 4. 5. Mührüsüleyman bitkisinin kök kısmının metal şelatlama aktivitesi... 44 Şekil 4. 6. E vitamini kalibrasyon grafiği.... 45 Şekil 4. 7. E vitaninin farklı derişimlerdeki (10, 50, 250, 1000 ppm) kromatogrmaları 45

ix ÇİZELGELER LİSTESİ Çizelge...Sayfa Çizelge 4. 1. Mührüsüleyman bitkisinin kök kısmının toplam fenolik bileşik miktarı.. 43 Çizelge 4. 2. HPLC pompa programı... 46 Çizelge 4. 3.Mührüsüleyman bitkisinin kök kısmının vitamin E miktarı... 46

1 1. GİRİŞ Canlıların yaşamlarını devam ettirebilmeleri için gerekli olan enerji ihtiyacını karşılayabilmeleri alınan besinlerin metabolizmaya girişi ile mümkün olmaktadır. Vücut tarafından alınan besinlerin enerjiye dönüştürülmesi için oksijen gereklidir. Katabolizma sırasında harcanan oksijenin bir dezavantajı reaktivitesi çok yüksek olan reaktif oksijen ara ürünleri (ROS) olarak bilinen zararlı bazı radikallerin meydana gelmesidir. Bu radikallerin üretimi stres durumlarında artış gösterir ve vücutta birçok hastalığın da sebebidir. Bu nedenle strese dayalı hastalıklar başta olmak üzere bir hastalık tedavisinde preperatif antioksidan maddelerin kullanılması hekimler tarafından tavsiye edilmektedir. Günümüzde kanserle serbest radikaller arasındaki ilişki yapılan deneylerle ispat edilmiştir. Bilindiği gibi serbest radikaller yani süper oksit ve hidroksil radikali gibi maddeler canlı organizmalarda ve dokularda diğer madde ve gruplarla reaksiyona girerek hücre içerisinde istenmeyen toksik maddeler oluşturabilirler. Bu ürünler vücuda zararlı olup çeşitli mekanizmalarla hücre harabiyetini tetikler sonrada hücre ölümüne yol açarlar (Gordon, 1996). Günümüzde, özellikle gıda sanayisinde, yağlı gıda mamullerin oksidasyonu ve lipit peroksidasyonu önlemek amacıyla kullanılmakta olan bütillenmiş hidroksi tolien (BHT), bütillenmiş hidroksi anisol (BHA), gallat türevleri ve tert-bütil hidro kinon (TBHQ) gibi antioksidan maddelerinin toksik etkilerinden şüphelenilmektedir. Bu antioksidan gıda katkı maddelerinin toksik, kanserojen ve gastrit yapıcı özelliklerinden dolayı bebek mamaları ve çocuk gıdalarında kullanılmasına izin verilmemektedir (Türk Gıda Kodeksi, 1997). Ayrıca, antimikrobiyal olarak nitrit, nitrat, benzoik asit, sorbik asit, kükürt dioksit kullanılmaktadır. Nitrat ve nitrit insan metabolizmasının boşaltım ürünleridir ve vücutta birikmesi reaktif azot türlerine (RNS) dönüşmektedir. RNS de ROS gibi yüksek reaktiviteye sahip olduğundan biyomoleküllerle reaksiyona girerek romatizmal hastalıklar, parkinson, kansere ve hücre harabiyetine sebep olmaktadır (Kotsonis ve ark., 2001). Antibakteriyal olarak kullanılan benzoik asit ve benzoik asit türevleri ise nörolojik hastalıklara neden olmasının yanında kanserojen olduğu bilinmektedir. Bu amaçla gıda sanayisinde kullanılan kimyasal maddelerin büyük kısmı toksik, nörölojik dejenerasyon, kanserojen vb. istenilmeyen etkilere sahiptirler (Türk

2 Gıda Kodeksi, 1997). Bu nedenle; son yıllarda yeni, daha güvenli ve ucuz antioksidan ve antimikrobiyal maddelerin bulunması için doğal ürünler üzerinde yaygın çalışmalar yapılmaktadır (Amakura ve ark., 2002; JECFA, 1996; Kahl, 1984; Goda, 1994). Çağımızda bitkisel kaynaklara dayanan doğal ürünlerin üretim teknolojisinin geliştirilmesi ve üretilen ürünlerinin sanayinin çeşitli alanlarında kullanımı, insan sağlığı ve çevre koruması açısından en önemli teknolojik araştırmaların merkezinde yer almaktadır (Baytop, 1999). Bugün Avrupa da çevre kirliliğinin önlenmesi ve insan sağlığının korunması açısından sanayinin çeşitli alanlarında doğal katkı maddelerin kullanımı fevkalade önem taşıyan bir konu durumundadır. Fakat Avrupa nın bitki örtüsü bu problemin çözümünde yetersiz olduğundan araştırma konusunun güneydoğu (Çin, Hindistan) ve güney- Amerika ülkelerine kaydığını söyleyebiliriz. Bu ülkelerde doğal ürünler konusunda araştırma geliştirme etkinliklerinin hızla gelişmesi sonucunda üretilen bitkisel ürünler dünya pazarlarını işgal etmiş durumdadır. Türkiye ise bitki örtüsüne göre hiçte güney doğu ve güney Amerika ülkelerinden geri kalmamaktadır. Bu gibi ülkelerden farklı olarak Türkiye de daha da önemli çeşitli amaçlarla kullanılabilen bitki varlığının olduğunu söyleyebiliriz (Baytop, 1999). Antioksidanlar vücutta çok kısa ömürlü fakat reaktif olan serbest radikaller ile savaşırlar. Eğer serbest radikaller nötralize edilmezlerse vücutta ciddi hasarlara neden olabilirler. Sürekli gelişmekte olan teknoloji, oluşan çevre kirliliği, sigara, UV vb. pek çok etken sürekli olarak toksik maddelerle karşı karşıya kalmamıza neden olmaktadır. Bu olumsuz faktörler insanlarda serbest radikallerin üretimini hızlandırarak genetik hastalıklar başta olmak üzere çeşitli hastalıkların ortaya çıkmasına neden olur. Bu hastalıklara çözüm getirmek, öncelikle bu hastalıkların oluşumunu engellemekle gerçekleşebilir. Bunun için de ilaçlardan ziyade alınan besinler önem kazanmaktadır. Serbest radikallerin etkilerini önleyen ve gıdalarda bulunması gereken C vitamini ve E vitamini kanser ve kalp hastalıklarının oluşumunu önlemektedir (Bagchi ve ark., 1998). Besinlerin dışında dışarıdan yapılacak takviyelerin de yararlı olduğu yapılan doz tespit

3 çalışmalarıyla anlaşılmıştır. Ancak vücudun hassas dengesi alınacak aşırı dozlarla bozulabilmekte, bunun sınırının konabilmesi gerekmektedir (Bagchi ve ark., 1997). Mührüsüleyman (Polygonatum orientale), çiçekli bitkilerin Ruscaceae familyasına dahil olan ve yaklaşık elli türü olan bir bitki cinsidir.. Mührüsüleyman türlerinin bazıları şifalı bitkiler arasında sayılmakta, özellikle P. sibiricum türü geleneksel Çin tıbbında bitki çayı olarak kullanılmaktadır. Bazı mührüsüleyman türleri kuşkonmaz gibi pişirildikten sonra yenebilir. Mührüsüleyman (P. orientale), çok yıllık bir bitki olup, 30-80 cm boyunda yay gibi eğik bir şekilde, toplu halde kümeler oluşturan bir bitkidir. Yaprakları oval şekilde, kenarları bütün dipten başa doğru paralel derin damarlı değişken sıra ile gövdeye dizilmiş ve de hemen hemen sapsızdır. Çiçekleri 3-5 tanesi bir arada sarkık vaziyette, uzun bir çan şeklinde, beyazımsı yeşil renkte ve kısa saplıdır. Mührüsüleymanın, kullanılan iki önemli türü mevcuttur, bunlarda multiflorum kümeler halinde ve oldukça çok yaygın olarak kullanılır. Kuzey Anadolu ormanlarında yabani olarak kendiliğinden yetişir. Mührüsüleyman, genellikle kökleri olmak üzere menopozdan kırık kemiklere kadar çeşitli durumlarda kullanılır. Deri üzerine uygulandığında köklerin kesik ve çürüklerin, deri tahrişleri ve iltihaplarının iyileşmesini hızlandırdığı söylenmektedir. Akne, deri lekesi ve her türlü deri kusurlarında yüzü yıkamak için kullanılır. Bitki çayı olarak kullanıldığında menopoz, hazımsızlık, diyabet, kırık kemikler, uykusuzluk, böbrek ağrıları ve hatta kısırlık gibi durumlara iyi geldiği söylenmektedir. Bir bileşiğin veya ham ekstrenin antioksidan aktiviteye sahip olduğunu belirleyebilmek için en az üç farklı test yapılmalı ve sonuçlar birbirini desteklemelidir. Bu nedenlerden dolayı; bu çalışmada Mührüsüleymanın köklerinin antioksidan kapasitesini; total antioksidan aktivitesi, serbest radikal giderme aktivitesi, süperoksit anyon radikali giderme aktivitesi, metal şelat oluşturma aktivitesi, indirgeme gücü aktivitesi gibi farklı antioksidan testler uygulayarak analiz etmeyi ve toplam fenolik bileşik miktarlarını tayin etmeyi, vitamin E ve toplam karotenoid miktarını belirleyerek uygulama amaçlarına uygun veriler sunmak amaçlanmıştır.

4 2. KAYNAK ÖZETLERİ 2.1. Mührüsüleyman (P. orientale) Bitkisinin Genel Özellikleri Mührüsüleyman (P. orientale), çiçekli bitkilerin Ruscaceae familyasına dahil olan ve yaklaşık elli türü olan bir bitki cinsidir. Mührüsüleyman türlerinin bazıları şifalı bitkiler arasında sayılmakta, özellikle P.sibiricum türü geleneksel Çin tıbbında bitki çayı olarak kullanılmaktadır. Şekil 2. 1. Mührüsüleyman bitkisinin görünümü Mührüsüleyman (P. orientale), çok yıllık bir bitki olup, 30-80 cm boyunda yay gibi eğik bir şekilde, toplu halde kümeler oluşturan bir bitkidir. Yaprakları oval şekilde, kenarları bütün dipten başa doğru paralel derin damarlı değişken sıra ile gövdeye dizilmiş ve de hemen hemen sapsızdır. Çiçekleri 3-5 tanesi bir arada sarkık vaziyette, uzun bir çan şeklinde, beyazımsı yeşil renkte ve kısa saplıdır. Mührüsüleymanın, kullanılan iki önemli türü mevcuttur, bunlarda multiflorum kümeler halinde ve oldukça çok yaygın olarak kullanılır. Kuzey Anadolu ormanlarında yabani olarak kendiliğinden yetişir (Baytop. T, 1999).

5 2.2. Reaktif Oksijen Türleri (ROS) ve Etkileri Havasız yerde yaşayamayız. Yaşamımızı sürdürmek için havanın moleküler oksijenini (O 2 ) tükettiğimizi biliyoruz. Total oksijen tüketimimizin %90' ından fazlasından elektron taşıma zinciri (solunum zinciri), %5-10' undan da diğer oksijen gerektiren reaksiyonlar sorumludur. Elektron taşıma zincirinde moleküler oksijen, yakıtlardan (glukoz, yağ asidi ve amino asitlerin karbon iskeleti) türeyen NADH ve FADH 2 ' den elektronları alarak suya indirgenir. Bu yolda oksijen molekülünün kuvvetli oksitleyici gücü, ATP'nin yüksek enerjili fosfat bağı haline dönüştürülür. Moleküler oksijen gerektiren fakat ATP' nin oluşumu reaksiyonuyla eşleşmeyen diğer reaksiyonlar, aminoasitlerin katabolizması, ilaçların detoksifikasyonu ve steroid hormonların sentezi gibi spesifik metabolik yollar için önemlidirler. Bu reaksiyonlarda diğer oksidazlar (oksijeni suya veya hidrojen perokside indirgeyen enzimler) ve oksijenazlar (oksijeni okside olan moleküle bağlayan enzimler) görev alırlar (Dawn ve ark., 1996; Akkuş, 1995; Tietz, 1995; Burtis ve Ashwood, 1999). Moleküler oksijen (O 2 ), paralel spin durumlu iki ortaklanmamış (eşleşmemiş) elektrona sahiptir. Ortaklanmamış (eşleşmemiş) elektron içeren atom, atom grubu veya moleküller serbest radikal olarak tanımlanırlar. Ancak Fe 3+, Cu 2+, Mn 2+ ve Mo 5+ gibi geçiş metalleri de ortaklanmamış elektronlara sahip oldukları halde serbest radikal olarak kabul edilmezler, fakat serbest radikal oluşumunda önemli rol oynarlar. Serbest radikaller pozitif yüklü (katyon), negatif yüklü (anyon) veya elektriksel olarak nötral olabilirler. Serbest radikal tanımına göre moleküler oksijen, bir biradikal (diradikal) olarak değerlendirilir. Biradikal oksijen, radikal olmayan maddelerle yavaş reaksiyona girdiği halde diğer serbest radikallerle kolayca reaksiyona girer. Biradikal oksijenin elektronlarından birinin enerji alarak kendi spininin ters yönünde olan başka bir orbitale yer değiştirmesiyle singlet oksijen oluşur. Singlet oksijen, eşleşmemiş elektronu olmadığı için radikal olmayan reaktif oksijen molekülüdür, delta ve sigma olmak üzere iki şekli vardır. Organizmada geçiş metallerini (Fe 2+ ve Cu + gibi metaller) içeren enzimler vasıtasıyla moleküler oksijene tek elektronların transferi suretiyle oksidasyon reaksiyonları

6 meydana gelir. Moleküler oksijen, biradikal doğasının bir sonucu olarak yüksek derecede reaktif oksijen türleri (ROS) oluşturma eğilimindedir (Dawn ve ark., 1996; Akkuş, 1995; Tietz, 1995; Burtis ve Ashwood, 1999). 2.2.1. Reaktif Oksijen Türleri (ROS) Reaktif oksijen türleri (ROS), normal oksijen metabolizması sırasında az miktarda oluşan süperoksit radikali (O 2 ), hidrojen peroksit (H 2 O 2 ) ve hidroksil radikali (OH )'dir. O 2 e - O 2 moleküler oksijen süperoksit radikali e -,2H + H 2 O 2 e -, H + H 2 O + OH hidroksil radikali e -, H + H 2 O Reaktif oksijen türleri, çeşitli serbest radikallerin oluştuğu serbest radikal zincir reaksiyonlarını başlatabilirler ve hücrede karbon merkezli organik radikaller (R ), peroksit radikalleri (ROO ), alkoksi radikalleri (RO ), tiyil radikalleri (RS ), sülfenil radikalleri (RSO ), tiyil peroksit radikalleri (RSO 2 ) gibi çeşitli serbest radikallerin oluşumuna neden olurlar (Dawn ve ark., Allan ve Colleen, 1996; Akkuş, 1995; Tietz, 1995; Burtis ve Ashwood, 1999). 2.2.1.1. Süperoksit Radikali (O 2 ) Süperoksit radikali (O 2 ) hemen tüm aerobik hücrelerde moleküler oksijenin (O 2 ) bir elektron alarak indirgenmesi sonucu oluşur. İndirgenmiş geçiş metallerinin otooksidasyonu süperoksit radikali meydana getirebilir. Fe 2+ + O Fe 3+ 2 + O 2 Cu + + O 2 Cu 2+ + O 2

7 Süperoksit radikali kendisi direkt olarak zarar vermez. Bu radikal anyonun asıl önemi, hidrojen peroksit kaynağı olması ve geçiş metalleri iyonlarının indirgeyicisi olmasıdır. Süperoksit radikali düşük ph değerlerinde daha reaktifdir, oksidan perhidroksi radikali (HO 2 ) oluşturmak üzere protonlanır. +H + O 2 HO 2 Süperoksit radikali ile perhidroksi radikali birbirleriyle reaksiyona girince biri okside olur diğeri indirgenir. Bu dismutasyon reaksiyonunda moleküler oksijen ve hidrojen peroksit meydana gelir. HO 2 + O 2 + H + O 2 + H 2 O 2 Süperoksit radikali hem oksitleyici hem indirgeyici özelliğe sahiptir. Örneğin ferrisitokrom c ya da nitroblue tetrazolium ile reaksiyonunda indirgeyici olarak davranarak bir elektron kaybeder ve moleküler oksijene okside olur. sit c(fe 3+ ) + O O 2 2 + sit c (Fe 2+ ) Süperoksit radikali epinefrinin oksidasyonunda oksidan olarak davranarak bir elektron alır ve hidrojen perokside (H 2 O 2 ) indirgenir. Süperoksit radikalinin fizyolojik bir serbest radikal olan nitrik oksit (NO ) ile birleşmesi sonucu bir reaktif oksijen türü olan peroksinitrit (ONOO ) meydana gelir. Peroksinitrit, nitrit (NO 2 ) ve nitrat (NO 3 ) oluşturmak üzere metabolize edilir. Peroksinitrit, azot dioksit (NO 2 ), hidroksil radikali (OH ), nitronyum iyonu (NO + 2 ) gibi toksik ürünlere dönüşebilir ki nitrik oksitin (NO ) zararlı etkilerinden peroksinitrit sorumludur (Dawn ve ark., 1996; Akkuş, 1995; Tietz, 1995; Burtis ve Ashwood, 1999).

8 2.2.1.2. Hidrojen Peroksit (H 2 O 2 ) Hidrojen peroksit (H 2 O 2 ), süperoksidin çevresindeki moleküllerden bir elektron alması veya moleküler oksijenin çevresindeki moleküllerden iki elektron alması sonucu oluşan peroksitin iki proton (H + ) ile birleşmesi sonucu meydana gelir. O 2 + e - + 2H + H 2 O 2 O 2 + 2e - + 2H + H 2 O 2 Biyolojik sistemlerde hidrojen peroksidin asıl üretimi, süperoksidin (O 2 ) dismutasyonu ile olur. İki süperoksit molekülü, süperoksidin dismutasyonu reaksiyonunda iki proton alarak hidrojen peroksit ve moleküler oksijeni oluştururlar. 2O 2 + 2H + H 2 O 2 + O 2 Bu reaksiyon, radikal olmayan ürünler meydana geldiğinden dismutasyon reaksiyonu olarak bilinir, ya spontan gerçekleşir ya da süperoksit dismutaz (SOD) enzimi tarafından katalizlenir. Spontan dismutasyon ph 4,8' de en hızlıdır, enzimatik dismutasyon ise spontan dismutasyonun nispeten yavaş olduğu nötral ya da alkali ph' da daha belirgindir. Hidrojen peroksit bir serbest radikal olmadığı halde reaktif oksijen türleri (ROS) kapsamına girer ve serbest radikal biyokimyasında önemli bir rol oynar. Çünkü Fe 2+ veya diğer geçiş metallerinin varlığında Fenton reaksiyonu sonucu, süperoksit radikalinin (O 2 ) varlığında Haber-Weiss reaksiyonu sonucu en reaktif ve zarar verici serbest oksijen radikali olan hidroksil radikali (OH ) oluşturur. F e n t o n r e a k si y o n u F e 2+ + H 2 O 2 F e 3+ + O H + O H - Haber-weiss reaksiyon O 2 + H 2 O 2 H + O 2 + H 2 O + OH

9 Süperoksit radikalinin yağda çözünürlüğü sınırlı olduğu halde hidrojen peroksit yağda çözünür. Bu nedenle hidrojen peroksit kendisinin oluştuğu yerden uzakta olan fakat Fe 2+ içeren membranlarda hasar oluşturabilir (Dawn ve ark., 1996; Akkuş, 1995; Tietz, 1995; Burtis ve Ashwood, 1999). 2.2.1.3. Hidroksil Radikali (OH ) Hidroksil radikali (OH ), Fenton reaksiyonu ve Haber-Weiss reaksiyonu sonucu hidrojen peroksitten oluşmaktadır. Ayrıca suyun yüksek enerjili iyonize edici radyasyona maruz kalması sonucunda oluşur. Hidroksil radikali son derece reaktif bir oksidan radikaldir, yarılanma ömrü çok kısadır. Hidroksil radikali olasılıkla reaktif oksijen türlerinin (ROS) en güçlüsüdür. Oluştuğu yerde tiyoller ve yağ asitleri gibi çeşitli moleküllerden bir proton kopararak tiyil radikalleri (RS ), karbon merkezli organik radikaller (R ), organik peroksitler (RCOO ) gibi yeni radikallerin oluşmasına ve sonuçta büyük hasara neden olur (Dawn ve ark., Akkuş, 1995; Tietz, 1995; Burtis ve Ashwood, 1999). R-SH + OH RS + H 2 O -CH 2 - + OH -CH + H 2 O 2.2.2. Hücrede Reaktif Oksijen Türlerinin (ROS) Kaynağı Hücrede normal metabolik yollardaki enzimatik reaksiyonlarda enzimlerin aktif yerinde ara ürünler olarak devamlı şekilde serbest radikaller oluşabilir. Bazen bu serbest radikal ara ürünler enzimlerin aktif yerinden sızarlar, moleküler oksijenle kazara etkileşirler ve sonuçta serbest oksijen radikalleri oluşur. Normalde hücrelerde en büyük serbest oksijen radikali kaynağı mitokondriyal elektron taşıma zincirinden sızıntıdır. Mitokondri iç zarında yerleşmiş oksidatif fosforilasyon zinciri bileşenleri büyük oranda indirgendiği zaman mitokondriyal süperoksit radikal üretimi artar (Dawn ve ark., 1996; Akkuş, 1995; Tietz, 1995; Burtis ve Ashwood, 1999). Endoplazmik retikulum ve nükleer

10 membranda serbest radikal üretimi, membrana bağlı sitokromların oksidasyonundan kaynaklanır. Birçok enzimin katalitik döngüsü sırasında da serbest radikaller ortaya çıkar. Bu enzimlerden biri ksantin oksidazdır. Ksantin oksidaz hasarlanmamış dokularda bir dehidrojenaz olarak vardır, pürinlerin yıkılım yolunda hipoksantinden ksantin ve ksantinden ürik asit oluşumu basamaklarında elektron akseptörü olarak moleküler oksijenden (O 2 ) daha çok NAD + kullanır. Oksijensizliğe bağlı olarak ADP'nin ATP'ye fosforilasyonunun azaldığı durumlarda (iskemi durumlarında) ADP yıkılır ve pürin bazı, ksantin oksidazın bir oksidaz olarak etkili olmasıyla hipoksantine dönüştürülür. Ksantin oksidazın oksidaz olarak aktivite göstermesi durumunda hipoksantin ksantine ve ksantin ürik aside dönüşürken moleküler oksijen kullanılmakta, moleküler oksijen hidrojen perokside indirgenmektedir. İskemi durumlarında oksijen seviyesi düşük olduğundan önemli hasar olmaz. Ancak oksijen seviyesi reperfüzyon sırasında normale dönünce iskemi yerinde ksantin oksidaz etkisiyle fazla miktarda hidrojen peroksit (H 2 O 2 ) ve süperoksit radikali (O 2 ) oluşur, bunların etkisiyle de iskemi/reperfüzyon hasarı denen durum ortaya çıkar. Ksantin oksidazın özellikle intestinal mukoza hücrelerinde görülen iskemi/reperfüzyon hasarında önemli faktör olduğu düşünülmektedir (Dawn ve ark., 1996; Akkuş, 1995; Tietz, 1995; Burtis ve Ashwood, 1999). Aldehit oksidaz yapı itibariyle ksantin oksidaza benzer, substratlarının çoğu aynıdır ve süperoksit radikali (O 2 ) üretir. Dihidroorotat dehidrojenaz, flavoprotein dehidrojenaz, aminoasit oksidaz ve triptofan dioksijenaz gibi enzimler de serbest radikal oluşmasına neden olurlar. Peroksizomlar çok önemli hücre içi hidrojen peroksit (H 2 O 2 ) kaynağıdırlar. Peroksizomlardaki D-amino asit oksidaz, ürat oksidaz, L-hidroksil asit oksidaz ve yağ asidi açil-coa oksidaz gibi oksidazlar, süperoksit üretmeden bol miktarda hidrojen peroksit (H 2 O 2 ) üretimine neden olurlar. Ancak peroksizomlarda, hidrojen peroksidin suya ayrışmasını katalizleyen katalaz (CAT) enziminin aktivitesi de çok yüksek olduğundan peroksizomlardan sitozole ne kadar hidrojen peroksit (H 2 O 2 ) geçtiği bilinmemektedir. Hayvan hücrelerinde askorbik asit, tiyoller, adrenalin ve flavin koenzimleri gibi bazı bileşiklerin otooksidasyonu da süperoksit radikalinin (O 2 ) bir

11 başka kaynağıdır. Araşidonik asit metabolizması da reaktif oksijen metabolitlerinin önemli bir kaynağıdır. Fagositik hücrelerin uyarılması, fosfolipaz ve protein kinazın aktivasyonuna ve plazma membranından araşidonik asidin serbestleşmesine yol açar. Araşidonik asidin enzimatik oksidasyonuyla da çeşitli serbest radikal ara ürünleri meydana gelirler. Araşidonik asit metabolizması sonucu serbest radikal üretimine "enzimatik lipid peroksidasyonu" denir. PGA, PGE 1 ve PGE 2 'nin burun mukozası damarlarında vazokonstriksiyona neden olduğu bilinmektedir. Özellikle demir ve bakır olmak üzere geçiş metalleri, fizyolojik şartlarda elektron alış verişi şeklinde gerçekleşen oksidoredüksiyon reaksiyonlarında görev alırlar. Geçiş metalleri bu özellikleri nedeniyle serbest radikal reaksiyonlarını hızlandıran katalizör vazifesi görürler. Demir ve bakır, tiyollerden tiyil sentezini H 2 O 2 ve O 2 den OH sentezini katalizlerler (Dawn ve ark., 1996; Akkuş, 1995; Tietz, 1995; Burtis ve Ashwood, 1999). R- SH + C u 2+ R S + H + + C u + H 2 O 2 + F e 2+ F e 3+ + O H + O H - F e, C u O 2 + H 2 O 2 O H + O H + O 2 Mn 2+ nın O 2 tarafından oksidasyonu Mn 3+ veya Mn-Oksijen kompleksinin oluşumunu sağlar, bunlar da O 2 den daha çok oksitleyicidirler. Metal iyonlarının serbest radikal reaksiyonlarındaki asıl önemi lipid peroksidasyonundaki etkileriyle ilgilidir. Geçiş metalleri lipid peroksidasyonunu başlatmaktan çok, sentezlenmiş olan lipid hidroperoksitlerinin (LOOH) parçalanmalarını ve lipid peroksidasyonunun zincir reaksiyonlarını katalize ederler. Böylece daha az zararlı olan radikalleri daha zararlı hale getirirler. L i p i d - O O H + F e 2+ (Cu + ) L ip i d - O + F e 3 + ( C u 2 + ) + O H - L i p id - O O H + F e 3+ ( C u 2+ ) L ip i d - O O + F e 2+ ( C u + ) + H +