Doç. Dr. Mahfuz ELMASTAŞ 2010 Her hakkı saklıdır

MÜHRÜSÜLEYMAN (Polygonatum orientale) BİTKİSİNİN İN VİTRO ANTİOKSİDAN KAPASİTESİNİN İNCELENMESİ VE BAZI VİTAMİN İÇERİKLERİ Elif AKTÜRK Yüksek Lisans Tezi Kimya Anabilim Dalı Doç. Dr. Mahfuz ELMASTAŞ 2010 Her hakkı saklıdır

T.C. GAZİOSMANPAŞA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ KİMYA ANABİLİM DALI YÜKSEK LİSANS TEZİ MÜHRÜSÜLEYMAN (Polygonatum orientale) BİTKİSİNİN İN VİTRO ANTİOKSİDAN KAPASİTESİNİN İNCELENMESİ VE BAZI VİTAMİN İÇERİKLERİ Elif AKTÜRK TOKAT 2010 Her hakkı saklıdır

i ÖZET Yüksek Lisans Tezi MÜHRÜSÜLEYMAN (Polygonatum orientale) BİTKİSİNİN İN VİTRO ANTİOKSİDAN KAPASİTESİNİN İNCELENMESİ VE BAZI VİTAMİN İÇERİKLERİ Elif AKTÜRK Gaziosmanpaşa Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Kimya Anabilim Dalı Danışman: Doç. Dr. Mahfuz ELMASTAŞ Bu çalışmada; mührüsüleyman bitkisinin 2007 ve 2009 yıllarında toplanan kök kısmının serbest radikal (DPPH ) giderme aktivitesi, indirgeme gücü aktivitesi, metal şelat oluşturma aktivitesi, süperoksit anyon radikali giderme aktivitesi, total antioksidan aktivite testileri ile bu bitkinin antioksidan kapasitesi araştırılmıştır. Ayrıca, total fenolik bileşik tayini, vitamin E ve toplam karotenoid miktarları belirlenmiştir. Mührü süleymanın hem metanol/metilen klorür ekstresi hem de su ile hazırlanan ekstreleri antioksidan aktiviteye sahip standartlarla karşılaştırıldığında serbest radikal giderme aktivitesine sahip olmadığı görülmüştür. İndirgeme gücü aktivitesinin yok denecek kadar az olduğu anlaşılmıştır. Metal şelat oluşturma aktivitesi ve süperoksit anyon radikali giderme aktiviteleri incelendiğinde özellikle 2007 yılında toplanan kısmın su ekstresinin standartlara çok yakın olduğu diğer ekstrelerinde bu aktiviteyi gösterdiği görülmüştür. Ferik tiyosiyanat metoduna göre total antioksidan aktiviteyi 2007 yılının metanol/metilen klorür ekstresi aktivite göstermiştir. Yapılan çalışmada, toplam fenolik bileşik miktarı 2009 metanol/metilen klorür ekstresinde (09 MS) 1,58 mg/kg bitki, 2009 su ekstresinde (09 MS SS) 1,26 mg/kg bitki, 2007 metanol/metilen klorür ekstresinde (07 MS) 1,80 mg/kg bitki, 2007 su ekstresinde (07MS SS) 1,35 mg/kg bitki olarak bulunmuştur. Yapılan çalışmada elde edilen vitamine miktarları: 09 MS 30mg/kg bitki, 09 MS SS 0,0652 mg/kg bitki, 07 MS 11,82 mg/kg bitki, 07 MS SS Yapılan analizler sonucunda elde edilen toplam karotenoid 09 MS 0,0988 mg/g bitki bulunmuşken, 07 MS karotenoid bulunmamıştır. 2010, 53 sayfa Anahtar kelimeler: Antioksidan, Mührüsüleyman, Polygonatum orientale

ii ABSTRACT Ms Thesis INVESTIGATION IN VITRO ANTIOXIDANT CAPACITY AND SOME VITAMIN CONTENT OF POLYGONATUM ORIENTALE Elif AKTÜRK Gaziosmanpaşa University Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Chemistry Supervisor : Associate Prof. Dr. Mahfuz ELMASTAŞ In this study, antioxidant capacity of root collected in 2007 and in 2009 of Polygonatum orientale was evaluate by free radical (DPPH ) scavenging activity, reducing power activity, metal chelating activity, superoxide anion radical scavenging activity, total antioxidant activity tests. In addition, amount of total phenolic compounds, vitamin E and total carotenoid were determined. Both of water and methanol/methylene chloride extracts have not free radical scavenging activity and reduction power activity when compared with standards. According to obtained data the plant, especially collected in 2007 have metal chelating activity and superoxide anion radical scavenging activity. Methanol/methylene chloride extract collected in 2007 have total antioxidant activity. Total amount of phenolic compounds in methanol/methylene chloride extract collected in 2009 (09 MS) 1.58 mg/kg plant, in 2009 the water extract (09 MS SS) 1.26 mg/kg plant, 2007 methanol/methylene chloride extract (07 MS ) 1.80 mg/kg plant, in 2007 the water extract (07MS SS) 1.35 mg/kg were found. Obtained data in the study, the amount of vitamine 09 MS 30 mg/kg plants, 09 Ms SS 0.0652 mg/kg plants, 07 MS 11.82 mg/kg plants, 07 MS SS 0.0096 mg/kg plant were found. As a result of total carotenoid analysis 0.0988 mg/g plant in 09 MS was found. But carotenoid in 07 MS was not found. 2010, 53 pages Keywords: Antioxidant, Mührüsüleyman, Polygonatum orientale

iii TEŞEKKÜR Yüksek lisans eğitimim süresince bilgi ve deneyimlerini benden esirgemeyen, büyük ilgi ve anlayışıyla her türlü problemin üstesinden gelmemde bana yardımcı olan, sabırla beni dinleyip olumlu yönlendirmeleriyle yanımda olan danışman hocam sayın Doç. Dr. Mahfuz ELMASTAŞ a teşekkürlerimi sunarım. Ders ve tez dönemlerinde deneyimlerinden faydalandığım ve fikirleri bana yol gösterici olan çok değerli hocam sayın Yard. Doç. Dr. Yakup BUDAK a sonsuz teşekkürlerimi sunarım. Bitkiyi toplayan sayın Öğretim Görevlisi Hasan Basri Karayel e, tür teşhisini yapan sayın Prof. Dr. Ali ÇIRPICI ya emeklerinden dolayı çok teşekkür ederim. Deneysel çalışmaların yapılmasında ve çalışmanın her safhasında yardımlarını esirgemeyen Uzman Nusret Genç e teşekkürlerimi sunarım. Hayatımın her döneminde maddi ve manevi desteğini hiçbir zaman esirgemeyen bana inanan ve başarılarımla gurur duyan aileme ve varlığından güç aldığım sevgili nişanlım Uzman Recep BOZDEMİR e en içten teşekkürlerimi sunarım. Elif AKTÜRK Tokat, 2010

iv İÇİNDEKİLER İçindekiler Sayfa ÖZET... i ABSTRACT...ii TEŞEKKÜR...iii İÇİNDEKİLER... iv KISALTMALAR LİSTESİ...vi ŞEKİLLER LİSTESİ...viii ÇİZELGELER LİSTESİ...ix 1. GİRİŞ... 1 2. KAYNAK ÖZETLERİ... 4 2.1. Mührüsüleyman (P. orientale) Bitkisinin Genel Özellikleri... 4 2.2. Reaktif Oksijen Türleri (ROS) ve Etkileri... 5 2.2.1. Reaktif Oksijen Türleri (ROS)... 6 2.2.1.1. Süperoksit Radikali (O 2 )... 6 2.2.1.2. Hidrojen Peroksit (H 2 O 2 )... 8 2.2.1.3. Hidroksil Radikali (OH )... 9 2.2.2. Hücrede Reaktif Oksijen Türlerinin (ROS) Kaynağı... 9 2.2.3. Serbest Oksijen Radikallerinin Etkileri... 14 2.2.3.1. Serbest Radikallerin Lipidlere Etkileri... 16 2.2.3.2. Serbest Radikallerin Proteinlere Etkileri... 18 2.2.3.3. Serbest Radikallerin Nükleik Asitler ve DNA'ya Etkileri... 18 2.2.3.4. Serbest Radikallerin karbonhidratlara Etkileri... 19 2.3. Antioksidan Savunma Sistemleri... 19 2.3.1. Endojen Antioksidanlar... 22 2.3.1.1. Enzim Olan Endojen Antioksidanlar... 22 2.3.1.2. Enzim Olmayan Endojen Antioksidanlar... 22 2.3.1.3. Eksojen Antioksidanlar... 23 2.3.1.4. Vitamin Eksojen Antioksidanlar... 23 2.3.1.5. Fenolik Bileşikler... 23 2.3.2. Oksidatif Stres... 24 2.4. Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi (HPLC)... 25 2.4.1. HPLC Sisteminde Pompa... 27 2.4.1.1. Taşıyıcı Faz Programlaması... 28 2.4.2. Örneğin kolona verilmesi (Enjeksiyon)... 29 2.4.3. Kolon... 29 2.4.4. Dedektör... 30 2.4.4.1. Infrared (IR) Absorbans Dedektörleri... 31 2.2.4.2. Floresans Dedektörleri... 31 2.2.4.3. UV Absorbans Dedektörleri... 32 2.2.4.4. Kırılma İndisi Dedektörleri... 32 3. MATERYAL VE METOT... 33 3.1. Materyal... 33

v 3.2. Kullanılacak Kimyasal Madde, Malzeme ve Cihazlar... 33 3.3. Metot... 33 3.3.1. İndirgeme Gücü... 34 3.3.2. Serbest Radikal (DPPH) Giderme Aktivitesi... 35 3.3.3. Süperoksit Anyon Radikali Giderme Aktivitesi... 36 3.3.4. Total Antioksidan Aktivitenin Belirlenmesi... 37 3.3.5. Total Fenolik Bileşik Tayini... 37 3.3.6. Metal Şelatlama Aktivitesi... 38 3.3.7. E Vitamininin (α-tokoferol) ün HPLC ile Kantitatif Tayini... 38 3.3.8. Karotenoid (A vitamini) Spektroskopik Yöntemle Analizi... 39 4. BULGULAR... 40 4.1. İndirgeme Gücü... 40 4.2. Serbest Radikal (DPPH) Giderme Aktivitesi... 41 4.3. Süperoksit Radikali Giderme Aktivitesi... 42 4.4. Total Antioksidan Aktivitenin Belirlenmesi... 42 4.5. Total Fenolik Bileşik Tayini... 43 4.6. Metal Şelatlama Aktivitesi... 44 4.7. E Vitamini Tayini... 45 5. SONUÇ... 48 KAYNAKLAR... 50 ÖZGEÇMİŞ... 53

vi KISALTMALAR LİSTESİ Kısaltma Açıklama FRAP İndirgeme Gücü Testi ROS Reaktif Oksijen Türleri ETS Elektron Taşıma Sistemi SOD Süperoksit Dizmutaz CAT Katalaz GSH Glutatyon GSH-Px Glutatyon Peroksidaz DPPH 1,1,Difenil 2-pikril hidraliz BHA Bütillenmiş Hidroksi Anisol BHT Bütillenmiş Hidroksi Toluen H 2 O 2 Hidrojen Peroksit UV Ultraviyole Işınları DNA Deoksiribonükleik Asit ADP Adenozin di fosfat O 2 O 3 CCl 4 HOBr HOI HOCl LOOH Süperoksit radikali Ozon Karbon tetraklorür Hipobromik asit Hipoiyodik asit Hipoklorik asit Lipid hidroperoksit LOO Lipid peroksit radikalleri L Lipid serbest radikalleri OH Hidroksil radikali NO 2 CCl 3 Azot dioksit radikali Triklorometil serbest radikali RCOO Organik peroksitler RS Tiyil radikalleri R Organik radikaller ONOO Peroksinitrit NO 3 NO 2 NO 2 + Nitrat Azot dioksit Nitronyum iyonu RSO 2

vii Tiyil peroksit radikalleri RO Alkoksi radikalleri ROO Peroksit radikalleri RA Rromatoit artritte IgG İmmünoglobülin MDA Malondialdehit po 2 Parsiyel oksijen basıncı

viii ŞEKİLLER LİSTESİ Şekil Sayfa Şekil 2. 1. Mührüsüleyman bitkisinin görünümü... 4 Şekil 2. 2. Stoplazmik membrandaki nötrofillerin bir kısmı... 12 Şekil 2. 3. Serbest radikallerin nötralizasyonu... 12 Şekil 2. 4. Serbest radikallerin hücreye etkileri... 15 Şekil 2. 5. Reaktif oksijen türlerinin zararı... 15 Şekil 2. 6. Yağ asidi zincirinin bir lipid radikali niteliği kazanması... 16 Şekil 2. 7. Lipid peroksidasyonu... 17 Şekil 2. 8. Malondialdehit (MDA)... 17 Şekil 2. 9. Antioksidanların hücredeki etkileri... 20 Şekil 2. 10. Oksidatif stres... 25 Şekil 2. 11. Karışımların ayrılması ve bileşenlerin kalitatif ve kantitatif Analizlerinde kullanılan HPLC cihazı... 26 Şekil 2. 12. HPLC cihazında kullanılan kolonları... 30 Şekil 3. 1. Demir ferrosiyanür oluşumu... 35 Şekil 4. 1. Standart ve numunelerin çeşitli konsantrasyonlardaki metal şelat oluşturma aktiviteleri. (09MS M: 2009 yılında toplanan mührüsüleymanın metanol/metilenklorür ekstresi; 09MS SS: 2009 yılında toplanan mührüsüleymanın saf su ekstresi; 07MS M: 2007 yılında toplanan mührüsüleymanın metanol/metilenklorür ekstresi; 07MS SS: 2007 yılında toplanan mührüsüleymanın saf su ekstresi)... 40 Şekil 4. 2. Standart ve numunelerin belirli konsantrasyonlarının % DPPH giderme aktiviteleri... 41 Şekil 4. 3. Standart ve numunelerin % süperoksit anyon radikali giderme aktiviteleri.. 42 Şekil 4. 4. Mührüsüleyman bitkisinin total antioksidan aktivitesi... 43 Şekil 4. 5. Mührüsüleyman bitkisinin kök kısmının metal şelatlama aktivitesi... 44 Şekil 4. 6. E vitamini kalibrasyon grafiği.... 45 Şekil 4. 7. E vitaninin farklı derişimlerdeki (10, 50, 250, 1000 ppm) kromatogrmaları 45

ix ÇİZELGELER LİSTESİ Çizelge...Sayfa Çizelge 4. 1. Mührüsüleyman bitkisinin kök kısmının toplam fenolik bileşik miktarı.. 43 Çizelge 4. 2. HPLC pompa programı... 46 Çizelge 4. 3.Mührüsüleyman bitkisinin kök kısmının vitamin E miktarı... 46

1 1. GİRİŞ Canlıların yaşamlarını devam ettirebilmeleri için gerekli olan enerji ihtiyacını karşılayabilmeleri alınan besinlerin metabolizmaya girişi ile mümkün olmaktadır. Vücut tarafından alınan besinlerin enerjiye dönüştürülmesi için oksijen gereklidir. Katabolizma sırasında harcanan oksijenin bir dezavantajı reaktivitesi çok yüksek olan reaktif oksijen ara ürünleri (ROS) olarak bilinen zararlı bazı radikallerin meydana gelmesidir. Bu radikallerin üretimi stres durumlarında artış gösterir ve vücutta birçok hastalığın da sebebidir. Bu nedenle strese dayalı hastalıklar başta olmak üzere bir hastalık tedavisinde preperatif antioksidan maddelerin kullanılması hekimler tarafından tavsiye edilmektedir. Günümüzde kanserle serbest radikaller arasındaki ilişki yapılan deneylerle ispat edilmiştir. Bilindiği gibi serbest radikaller yani süper oksit ve hidroksil radikali gibi maddeler canlı organizmalarda ve dokularda diğer madde ve gruplarla reaksiyona girerek hücre içerisinde istenmeyen toksik maddeler oluşturabilirler. Bu ürünler vücuda zararlı olup çeşitli mekanizmalarla hücre harabiyetini tetikler sonrada hücre ölümüne yol açarlar (Gordon, 1996). Günümüzde, özellikle gıda sanayisinde, yağlı gıda mamullerin oksidasyonu ve lipit peroksidasyonu önlemek amacıyla kullanılmakta olan bütillenmiş hidroksi tolien (BHT), bütillenmiş hidroksi anisol (BHA), gallat türevleri ve tert-bütil hidro kinon (TBHQ) gibi antioksidan maddelerinin toksik etkilerinden şüphelenilmektedir. Bu antioksidan gıda katkı maddelerinin toksik, kanserojen ve gastrit yapıcı özelliklerinden dolayı bebek mamaları ve çocuk gıdalarında kullanılmasına izin verilmemektedir (Türk Gıda Kodeksi, 1997). Ayrıca, antimikrobiyal olarak nitrit, nitrat, benzoik asit, sorbik asit, kükürt dioksit kullanılmaktadır. Nitrat ve nitrit insan metabolizmasının boşaltım ürünleridir ve vücutta birikmesi reaktif azot türlerine (RNS) dönüşmektedir. RNS de ROS gibi yüksek reaktiviteye sahip olduğundan biyomoleküllerle reaksiyona girerek romatizmal hastalıklar, parkinson, kansere ve hücre harabiyetine sebep olmaktadır (Kotsonis ve ark., 2001). Antibakteriyal olarak kullanılan benzoik asit ve benzoik asit türevleri ise nörolojik hastalıklara neden olmasının yanında kanserojen olduğu bilinmektedir. Bu amaçla gıda sanayisinde kullanılan kimyasal maddelerin büyük kısmı toksik, nörölojik dejenerasyon, kanserojen vb. istenilmeyen etkilere sahiptirler (Türk

2 Gıda Kodeksi, 1997). Bu nedenle; son yıllarda yeni, daha güvenli ve ucuz antioksidan ve antimikrobiyal maddelerin bulunması için doğal ürünler üzerinde yaygın çalışmalar yapılmaktadır (Amakura ve ark., 2002; JECFA, 1996; Kahl, 1984; Goda, 1994). Çağımızda bitkisel kaynaklara dayanan doğal ürünlerin üretim teknolojisinin geliştirilmesi ve üretilen ürünlerinin sanayinin çeşitli alanlarında kullanımı, insan sağlığı ve çevre koruması açısından en önemli teknolojik araştırmaların merkezinde yer almaktadır (Baytop, 1999). Bugün Avrupa da çevre kirliliğinin önlenmesi ve insan sağlığının korunması açısından sanayinin çeşitli alanlarında doğal katkı maddelerin kullanımı fevkalade önem taşıyan bir konu durumundadır. Fakat Avrupa nın bitki örtüsü bu problemin çözümünde yetersiz olduğundan araştırma konusunun güneydoğu (Çin, Hindistan) ve güney- Amerika ülkelerine kaydığını söyleyebiliriz. Bu ülkelerde doğal ürünler konusunda araştırma geliştirme etkinliklerinin hızla gelişmesi sonucunda üretilen bitkisel ürünler dünya pazarlarını işgal etmiş durumdadır. Türkiye ise bitki örtüsüne göre hiçte güney doğu ve güney Amerika ülkelerinden geri kalmamaktadır. Bu gibi ülkelerden farklı olarak Türkiye de daha da önemli çeşitli amaçlarla kullanılabilen bitki varlığının olduğunu söyleyebiliriz (Baytop, 1999). Antioksidanlar vücutta çok kısa ömürlü fakat reaktif olan serbest radikaller ile savaşırlar. Eğer serbest radikaller nötralize edilmezlerse vücutta ciddi hasarlara neden olabilirler. Sürekli gelişmekte olan teknoloji, oluşan çevre kirliliği, sigara, UV vb. pek çok etken sürekli olarak toksik maddelerle karşı karşıya kalmamıza neden olmaktadır. Bu olumsuz faktörler insanlarda serbest radikallerin üretimini hızlandırarak genetik hastalıklar başta olmak üzere çeşitli hastalıkların ortaya çıkmasına neden olur. Bu hastalıklara çözüm getirmek, öncelikle bu hastalıkların oluşumunu engellemekle gerçekleşebilir. Bunun için de ilaçlardan ziyade alınan besinler önem kazanmaktadır. Serbest radikallerin etkilerini önleyen ve gıdalarda bulunması gereken C vitamini ve E vitamini kanser ve kalp hastalıklarının oluşumunu önlemektedir (Bagchi ve ark., 1998). Besinlerin dışında dışarıdan yapılacak takviyelerin de yararlı olduğu yapılan doz tespit

3 çalışmalarıyla anlaşılmıştır. Ancak vücudun hassas dengesi alınacak aşırı dozlarla bozulabilmekte, bunun sınırının konabilmesi gerekmektedir (Bagchi ve ark., 1997). Mührüsüleyman (Polygonatum orientale), çiçekli bitkilerin Ruscaceae familyasına dahil olan ve yaklaşık elli türü olan bir bitki cinsidir.. Mührüsüleyman türlerinin bazıları şifalı bitkiler arasında sayılmakta, özellikle P. sibiricum türü geleneksel Çin tıbbında bitki çayı olarak kullanılmaktadır. Bazı mührüsüleyman türleri kuşkonmaz gibi pişirildikten sonra yenebilir. Mührüsüleyman (P. orientale), çok yıllık bir bitki olup, 30-80 cm boyunda yay gibi eğik bir şekilde, toplu halde kümeler oluşturan bir bitkidir. Yaprakları oval şekilde, kenarları bütün dipten başa doğru paralel derin damarlı değişken sıra ile gövdeye dizilmiş ve de hemen hemen sapsızdır. Çiçekleri 3-5 tanesi bir arada sarkık vaziyette, uzun bir çan şeklinde, beyazımsı yeşil renkte ve kısa saplıdır. Mührüsüleymanın, kullanılan iki önemli türü mevcuttur, bunlarda multiflorum kümeler halinde ve oldukça çok yaygın olarak kullanılır. Kuzey Anadolu ormanlarında yabani olarak kendiliğinden yetişir. Mührüsüleyman, genellikle kökleri olmak üzere menopozdan kırık kemiklere kadar çeşitli durumlarda kullanılır. Deri üzerine uygulandığında köklerin kesik ve çürüklerin, deri tahrişleri ve iltihaplarının iyileşmesini hızlandırdığı söylenmektedir. Akne, deri lekesi ve her türlü deri kusurlarında yüzü yıkamak için kullanılır. Bitki çayı olarak kullanıldığında menopoz, hazımsızlık, diyabet, kırık kemikler, uykusuzluk, böbrek ağrıları ve hatta kısırlık gibi durumlara iyi geldiği söylenmektedir. Bir bileşiğin veya ham ekstrenin antioksidan aktiviteye sahip olduğunu belirleyebilmek için en az üç farklı test yapılmalı ve sonuçlar birbirini desteklemelidir. Bu nedenlerden dolayı; bu çalışmada Mührüsüleymanın köklerinin antioksidan kapasitesini; total antioksidan aktivitesi, serbest radikal giderme aktivitesi, süperoksit anyon radikali giderme aktivitesi, metal şelat oluşturma aktivitesi, indirgeme gücü aktivitesi gibi farklı antioksidan testler uygulayarak analiz etmeyi ve toplam fenolik bileşik miktarlarını tayin etmeyi, vitamin E ve toplam karotenoid miktarını belirleyerek uygulama amaçlarına uygun veriler sunmak amaçlanmıştır.

4 2. KAYNAK ÖZETLERİ 2.1. Mührüsüleyman (P. orientale) Bitkisinin Genel Özellikleri Mührüsüleyman (P. orientale), çiçekli bitkilerin Ruscaceae familyasına dahil olan ve yaklaşık elli türü olan bir bitki cinsidir. Mührüsüleyman türlerinin bazıları şifalı bitkiler arasında sayılmakta, özellikle P.sibiricum türü geleneksel Çin tıbbında bitki çayı olarak kullanılmaktadır. Şekil 2. 1. Mührüsüleyman bitkisinin görünümü Mührüsüleyman (P. orientale), çok yıllık bir bitki olup, 30-80 cm boyunda yay gibi eğik bir şekilde, toplu halde kümeler oluşturan bir bitkidir. Yaprakları oval şekilde, kenarları bütün dipten başa doğru paralel derin damarlı değişken sıra ile gövdeye dizilmiş ve de hemen hemen sapsızdır. Çiçekleri 3-5 tanesi bir arada sarkık vaziyette, uzun bir çan şeklinde, beyazımsı yeşil renkte ve kısa saplıdır. Mührüsüleymanın, kullanılan iki önemli türü mevcuttur, bunlarda multiflorum kümeler halinde ve oldukça çok yaygın olarak kullanılır. Kuzey Anadolu ormanlarında yabani olarak kendiliğinden yetişir (Baytop. T, 1999).

5 2.2. Reaktif Oksijen Türleri (ROS) ve Etkileri Havasız yerde yaşayamayız. Yaşamımızı sürdürmek için havanın moleküler oksijenini (O 2 ) tükettiğimizi biliyoruz. Total oksijen tüketimimizin %90' ından fazlasından elektron taşıma zinciri (solunum zinciri), %5-10' undan da diğer oksijen gerektiren reaksiyonlar sorumludur. Elektron taşıma zincirinde moleküler oksijen, yakıtlardan (glukoz, yağ asidi ve amino asitlerin karbon iskeleti) türeyen NADH ve FADH 2 ' den elektronları alarak suya indirgenir. Bu yolda oksijen molekülünün kuvvetli oksitleyici gücü, ATP'nin yüksek enerjili fosfat bağı haline dönüştürülür. Moleküler oksijen gerektiren fakat ATP' nin oluşumu reaksiyonuyla eşleşmeyen diğer reaksiyonlar, aminoasitlerin katabolizması, ilaçların detoksifikasyonu ve steroid hormonların sentezi gibi spesifik metabolik yollar için önemlidirler. Bu reaksiyonlarda diğer oksidazlar (oksijeni suya veya hidrojen perokside indirgeyen enzimler) ve oksijenazlar (oksijeni okside olan moleküle bağlayan enzimler) görev alırlar (Dawn ve ark., 1996; Akkuş, 1995; Tietz, 1995; Burtis ve Ashwood, 1999). Moleküler oksijen (O 2 ), paralel spin durumlu iki ortaklanmamış (eşleşmemiş) elektrona sahiptir. Ortaklanmamış (eşleşmemiş) elektron içeren atom, atom grubu veya moleküller serbest radikal olarak tanımlanırlar. Ancak Fe 3+, Cu 2+, Mn 2+ ve Mo 5+ gibi geçiş metalleri de ortaklanmamış elektronlara sahip oldukları halde serbest radikal olarak kabul edilmezler, fakat serbest radikal oluşumunda önemli rol oynarlar. Serbest radikaller pozitif yüklü (katyon), negatif yüklü (anyon) veya elektriksel olarak nötral olabilirler. Serbest radikal tanımına göre moleküler oksijen, bir biradikal (diradikal) olarak değerlendirilir. Biradikal oksijen, radikal olmayan maddelerle yavaş reaksiyona girdiği halde diğer serbest radikallerle kolayca reaksiyona girer. Biradikal oksijenin elektronlarından birinin enerji alarak kendi spininin ters yönünde olan başka bir orbitale yer değiştirmesiyle singlet oksijen oluşur. Singlet oksijen, eşleşmemiş elektronu olmadığı için radikal olmayan reaktif oksijen molekülüdür, delta ve sigma olmak üzere iki şekli vardır. Organizmada geçiş metallerini (Fe 2+ ve Cu + gibi metaller) içeren enzimler vasıtasıyla moleküler oksijene tek elektronların transferi suretiyle oksidasyon reaksiyonları

6 meydana gelir. Moleküler oksijen, biradikal doğasının bir sonucu olarak yüksek derecede reaktif oksijen türleri (ROS) oluşturma eğilimindedir (Dawn ve ark., 1996; Akkuş, 1995; Tietz, 1995; Burtis ve Ashwood, 1999). 2.2.1. Reaktif Oksijen Türleri (ROS) Reaktif oksijen türleri (ROS), normal oksijen metabolizması sırasında az miktarda oluşan süperoksit radikali (O 2 ), hidrojen peroksit (H 2 O 2 ) ve hidroksil radikali (OH )'dir. O 2 e - O 2 moleküler oksijen süperoksit radikali e -,2H + H 2 O 2 e -, H + H 2 O + OH hidroksil radikali e -, H + H 2 O Reaktif oksijen türleri, çeşitli serbest radikallerin oluştuğu serbest radikal zincir reaksiyonlarını başlatabilirler ve hücrede karbon merkezli organik radikaller (R ), peroksit radikalleri (ROO ), alkoksi radikalleri (RO ), tiyil radikalleri (RS ), sülfenil radikalleri (RSO ), tiyil peroksit radikalleri (RSO 2 ) gibi çeşitli serbest radikallerin oluşumuna neden olurlar (Dawn ve ark., Allan ve Colleen, 1996; Akkuş, 1995; Tietz, 1995; Burtis ve Ashwood, 1999). 2.2.1.1. Süperoksit Radikali (O 2 ) Süperoksit radikali (O 2 ) hemen tüm aerobik hücrelerde moleküler oksijenin (O 2 ) bir elektron alarak indirgenmesi sonucu oluşur. İndirgenmiş geçiş metallerinin otooksidasyonu süperoksit radikali meydana getirebilir. Fe 2+ + O Fe 3+ 2 + O 2 Cu + + O 2 Cu 2+ + O 2

7 Süperoksit radikali kendisi direkt olarak zarar vermez. Bu radikal anyonun asıl önemi, hidrojen peroksit kaynağı olması ve geçiş metalleri iyonlarının indirgeyicisi olmasıdır. Süperoksit radikali düşük ph değerlerinde daha reaktifdir, oksidan perhidroksi radikali (HO 2 ) oluşturmak üzere protonlanır. +H + O 2 HO 2 Süperoksit radikali ile perhidroksi radikali birbirleriyle reaksiyona girince biri okside olur diğeri indirgenir. Bu dismutasyon reaksiyonunda moleküler oksijen ve hidrojen peroksit meydana gelir. HO 2 + O 2 + H + O 2 + H 2 O 2 Süperoksit radikali hem oksitleyici hem indirgeyici özelliğe sahiptir. Örneğin ferrisitokrom c ya da nitroblue tetrazolium ile reaksiyonunda indirgeyici olarak davranarak bir elektron kaybeder ve moleküler oksijene okside olur. sit c(fe 3+ ) + O O 2 2 + sit c (Fe 2+ ) Süperoksit radikali epinefrinin oksidasyonunda oksidan olarak davranarak bir elektron alır ve hidrojen perokside (H 2 O 2 ) indirgenir. Süperoksit radikalinin fizyolojik bir serbest radikal olan nitrik oksit (NO ) ile birleşmesi sonucu bir reaktif oksijen türü olan peroksinitrit (ONOO ) meydana gelir. Peroksinitrit, nitrit (NO 2 ) ve nitrat (NO 3 ) oluşturmak üzere metabolize edilir. Peroksinitrit, azot dioksit (NO 2 ), hidroksil radikali (OH ), nitronyum iyonu (NO + 2 ) gibi toksik ürünlere dönüşebilir ki nitrik oksitin (NO ) zararlı etkilerinden peroksinitrit sorumludur (Dawn ve ark., 1996; Akkuş, 1995; Tietz, 1995; Burtis ve Ashwood, 1999).

8 2.2.1.2. Hidrojen Peroksit (H 2 O 2 ) Hidrojen peroksit (H 2 O 2 ), süperoksidin çevresindeki moleküllerden bir elektron alması veya moleküler oksijenin çevresindeki moleküllerden iki elektron alması sonucu oluşan peroksitin iki proton (H + ) ile birleşmesi sonucu meydana gelir. O 2 + e - + 2H + H 2 O 2 O 2 + 2e - + 2H + H 2 O 2 Biyolojik sistemlerde hidrojen peroksidin asıl üretimi, süperoksidin (O 2 ) dismutasyonu ile olur. İki süperoksit molekülü, süperoksidin dismutasyonu reaksiyonunda iki proton alarak hidrojen peroksit ve moleküler oksijeni oluştururlar. 2O 2 + 2H + H 2 O 2 + O 2 Bu reaksiyon, radikal olmayan ürünler meydana geldiğinden dismutasyon reaksiyonu olarak bilinir, ya spontan gerçekleşir ya da süperoksit dismutaz (SOD) enzimi tarafından katalizlenir. Spontan dismutasyon ph 4,8' de en hızlıdır, enzimatik dismutasyon ise spontan dismutasyonun nispeten yavaş olduğu nötral ya da alkali ph' da daha belirgindir. Hidrojen peroksit bir serbest radikal olmadığı halde reaktif oksijen türleri (ROS) kapsamına girer ve serbest radikal biyokimyasında önemli bir rol oynar. Çünkü Fe 2+ veya diğer geçiş metallerinin varlığında Fenton reaksiyonu sonucu, süperoksit radikalinin (O 2 ) varlığında Haber-Weiss reaksiyonu sonucu en reaktif ve zarar verici serbest oksijen radikali olan hidroksil radikali (OH ) oluşturur. F e n t o n r e a k si y o n u F e 2+ + H 2 O 2 F e 3+ + O H + O H - Haber-weiss reaksiyon O 2 + H 2 O 2 H + O 2 + H 2 O + OH

9 Süperoksit radikalinin yağda çözünürlüğü sınırlı olduğu halde hidrojen peroksit yağda çözünür. Bu nedenle hidrojen peroksit kendisinin oluştuğu yerden uzakta olan fakat Fe 2+ içeren membranlarda hasar oluşturabilir (Dawn ve ark., 1996; Akkuş, 1995; Tietz, 1995; Burtis ve Ashwood, 1999). 2.2.1.3. Hidroksil Radikali (OH ) Hidroksil radikali (OH ), Fenton reaksiyonu ve Haber-Weiss reaksiyonu sonucu hidrojen peroksitten oluşmaktadır. Ayrıca suyun yüksek enerjili iyonize edici radyasyona maruz kalması sonucunda oluşur. Hidroksil radikali son derece reaktif bir oksidan radikaldir, yarılanma ömrü çok kısadır. Hidroksil radikali olasılıkla reaktif oksijen türlerinin (ROS) en güçlüsüdür. Oluştuğu yerde tiyoller ve yağ asitleri gibi çeşitli moleküllerden bir proton kopararak tiyil radikalleri (RS ), karbon merkezli organik radikaller (R ), organik peroksitler (RCOO ) gibi yeni radikallerin oluşmasına ve sonuçta büyük hasara neden olur (Dawn ve ark., Akkuş, 1995; Tietz, 1995; Burtis ve Ashwood, 1999). R-SH + OH RS + H 2 O -CH 2 - + OH -CH + H 2 O 2.2.2. Hücrede Reaktif Oksijen Türlerinin (ROS) Kaynağı Hücrede normal metabolik yollardaki enzimatik reaksiyonlarda enzimlerin aktif yerinde ara ürünler olarak devamlı şekilde serbest radikaller oluşabilir. Bazen bu serbest radikal ara ürünler enzimlerin aktif yerinden sızarlar, moleküler oksijenle kazara etkileşirler ve sonuçta serbest oksijen radikalleri oluşur. Normalde hücrelerde en büyük serbest oksijen radikali kaynağı mitokondriyal elektron taşıma zincirinden sızıntıdır. Mitokondri iç zarında yerleşmiş oksidatif fosforilasyon zinciri bileşenleri büyük oranda indirgendiği zaman mitokondriyal süperoksit radikal üretimi artar (Dawn ve ark., 1996; Akkuş, 1995; Tietz, 1995; Burtis ve Ashwood, 1999). Endoplazmik retikulum ve nükleer

10 membranda serbest radikal üretimi, membrana bağlı sitokromların oksidasyonundan kaynaklanır. Birçok enzimin katalitik döngüsü sırasında da serbest radikaller ortaya çıkar. Bu enzimlerden biri ksantin oksidazdır. Ksantin oksidaz hasarlanmamış dokularda bir dehidrojenaz olarak vardır, pürinlerin yıkılım yolunda hipoksantinden ksantin ve ksantinden ürik asit oluşumu basamaklarında elektron akseptörü olarak moleküler oksijenden (O 2 ) daha çok NAD + kullanır. Oksijensizliğe bağlı olarak ADP'nin ATP'ye fosforilasyonunun azaldığı durumlarda (iskemi durumlarında) ADP yıkılır ve pürin bazı, ksantin oksidazın bir oksidaz olarak etkili olmasıyla hipoksantine dönüştürülür. Ksantin oksidazın oksidaz olarak aktivite göstermesi durumunda hipoksantin ksantine ve ksantin ürik aside dönüşürken moleküler oksijen kullanılmakta, moleküler oksijen hidrojen perokside indirgenmektedir. İskemi durumlarında oksijen seviyesi düşük olduğundan önemli hasar olmaz. Ancak oksijen seviyesi reperfüzyon sırasında normale dönünce iskemi yerinde ksantin oksidaz etkisiyle fazla miktarda hidrojen peroksit (H 2 O 2 ) ve süperoksit radikali (O 2 ) oluşur, bunların etkisiyle de iskemi/reperfüzyon hasarı denen durum ortaya çıkar. Ksantin oksidazın özellikle intestinal mukoza hücrelerinde görülen iskemi/reperfüzyon hasarında önemli faktör olduğu düşünülmektedir (Dawn ve ark., 1996; Akkuş, 1995; Tietz, 1995; Burtis ve Ashwood, 1999). Aldehit oksidaz yapı itibariyle ksantin oksidaza benzer, substratlarının çoğu aynıdır ve süperoksit radikali (O 2 ) üretir. Dihidroorotat dehidrojenaz, flavoprotein dehidrojenaz, aminoasit oksidaz ve triptofan dioksijenaz gibi enzimler de serbest radikal oluşmasına neden olurlar. Peroksizomlar çok önemli hücre içi hidrojen peroksit (H 2 O 2 ) kaynağıdırlar. Peroksizomlardaki D-amino asit oksidaz, ürat oksidaz, L-hidroksil asit oksidaz ve yağ asidi açil-coa oksidaz gibi oksidazlar, süperoksit üretmeden bol miktarda hidrojen peroksit (H 2 O 2 ) üretimine neden olurlar. Ancak peroksizomlarda, hidrojen peroksidin suya ayrışmasını katalizleyen katalaz (CAT) enziminin aktivitesi de çok yüksek olduğundan peroksizomlardan sitozole ne kadar hidrojen peroksit (H 2 O 2 ) geçtiği bilinmemektedir. Hayvan hücrelerinde askorbik asit, tiyoller, adrenalin ve flavin koenzimleri gibi bazı bileşiklerin otooksidasyonu da süperoksit radikalinin (O 2 ) bir

11 başka kaynağıdır. Araşidonik asit metabolizması da reaktif oksijen metabolitlerinin önemli bir kaynağıdır. Fagositik hücrelerin uyarılması, fosfolipaz ve protein kinazın aktivasyonuna ve plazma membranından araşidonik asidin serbestleşmesine yol açar. Araşidonik asidin enzimatik oksidasyonuyla da çeşitli serbest radikal ara ürünleri meydana gelirler. Araşidonik asit metabolizması sonucu serbest radikal üretimine "enzimatik lipid peroksidasyonu" denir. PGA, PGE 1 ve PGE 2 'nin burun mukozası damarlarında vazokonstriksiyona neden olduğu bilinmektedir. Özellikle demir ve bakır olmak üzere geçiş metalleri, fizyolojik şartlarda elektron alış verişi şeklinde gerçekleşen oksidoredüksiyon reaksiyonlarında görev alırlar. Geçiş metalleri bu özellikleri nedeniyle serbest radikal reaksiyonlarını hızlandıran katalizör vazifesi görürler. Demir ve bakır, tiyollerden tiyil sentezini H 2 O 2 ve O 2 den OH sentezini katalizlerler (Dawn ve ark., 1996; Akkuş, 1995; Tietz, 1995; Burtis ve Ashwood, 1999). R- SH + C u 2+ R S + H + + C u + H 2 O 2 + F e 2+ F e 3+ + O H + O H - F e, C u O 2 + H 2 O 2 O H + O H + O 2 Mn 2+ nın O 2 tarafından oksidasyonu Mn 3+ veya Mn-Oksijen kompleksinin oluşumunu sağlar, bunlar da O 2 den daha çok oksitleyicidirler. Metal iyonlarının serbest radikal reaksiyonlarındaki asıl önemi lipid peroksidasyonundaki etkileriyle ilgilidir. Geçiş metalleri lipid peroksidasyonunu başlatmaktan çok, sentezlenmiş olan lipid hidroperoksitlerinin (LOOH) parçalanmalarını ve lipid peroksidasyonunun zincir reaksiyonlarını katalize ederler. Böylece daha az zararlı olan radikalleri daha zararlı hale getirirler. L i p i d - O O H + F e 2+ (Cu + ) L ip i d - O + F e 3 + ( C u 2 + ) + O H - L i p id - O O H + F e 3+ ( C u 2+ ) L ip i d - O O + F e 2+ ( C u + ) + H +

12 Aktive olmuş makrofajlar, nötrofiller ve eozinofillerde fagositik solunumsal patlama sırasında da çeşitli serbest radikaller oluşur. Şekil 2. 2. Stoplazmik membrandaki nötrofillerin bir kısmı Fagositlerin uyarılması, heksoz monofosfat şantı yoluyla glukozun oksidasyonunda artışa yol açar. Solunumsal patlama sırasında elektron vericisi olarak NADPH kullanılır ve moleküler oksijenin (O 2 ) süperoksit radikaline (O 2 ) indirgenmesi sonucu NADP + üretimi artar ve heksoz monofosfat yolu aktive olur. Heksoz monofosfat yolunun aktivasyonuna neden olan NADP + nin diğer kaynağı hidrojen peroksidin (H 2 O 2 ) detoksifikasyonundan sorumlu olan glutatyon peroksidaz-glutatyon redüktaz sistemidir. Şekil 2. 3. Serbest radikallerin nötralizasyonu

13 Nötrofiller ve monositlerin primer lizozomal granüllerinde Fe-hem içeren miyeloperoksidaz enzimi bulunur. Çeşitli uyarıcıların etkisiyle fagositler miyeloperoksidaz içeren granüllerini ekstrasellüler aralıktaki fagositik vakuol içine boşaltırlar. Miyeloperoksidaz, hidrojen peroksit (H 2 O 2 ) varlığında klorür, iyodür ve bromürün oksidasyonunu katalizleyerek hipoklorik asit (HOCl), hipoiyodik asit (HOI) ve hipobromik asit (HOBr) oluşturur. Bu bileşikler ve bunların tuzları güçlü oksidanlardır, biyolojik olarak önemli moleküllerle reaksiyona girerek mikroorganizmayı etkileyen toksik ajanlar meydana getirirler. Bazı yabancı toksik maddeler hücrede serbest radikal üretimini artırırlar. Bu maddeler ya doğrudan serbest radikal üretirler ya da serbest radikallerin ortadan kaldırılmasını sağlayan antioksidan aktiviteyi düşürürler. Bu tip maddeler dört grupta toplanabilirler: a) Toksinin kendisi bir serbest radikaldir. Örneğin kirli havanın koyu rengini veren azot dioksit gazı (NO 2 ) böyle bir maddedir. Azot dioksit (NO 2 ) etkili bir lipid peroksidasyonu başlatıcısıdır. Lipid-H + NO 2 Lipid + HNO 2 b) Toksin bir serbest radikale metabolize olur. Örneğin kuru temizlemede kullanılan toksik bir madde olan karbon tetraklorür (CCl 4 ), karaciğerde sitokrom p450 tarafından triklorometil serbest radikaline (CCl 3 ) dönüştürülür. Triklorometil serbest radikali de moleküler oksijenle (O 2 ) etkileşerek peroksil serbest radikali (CCl 3 O 2 ) oluşturur. P-450 CCl 4 CCl 3 + Cl - CCl 3 + O 2 CCl 3 O 2 Triklorometil serbest radikali (CCl 3 ) ve peroksil serbest radikali (CCl 3 O 2 ) kuvvetli lipid peroksidasyonu başlatıcısıdırlar. Böylece reaktif serbest radikal üretimi karaciğerde antioksidan savunmaları aşar, sellüler membranlarda oksidatif yıkım ve ciddi doku hasarı meydana gelir (Çinkılıç, 2009).

14 c) Toksinin metabolizması sonucu serbest oksijen radikali meydana gelir. Örneğin özellikle karaciğerde biriken paraquat bir serbest radikale indirgendikten sonra tekrar yükseltgenerek rejenere edilirken oksijen indirgenir ve böylece bol miktarda süperoksit radikali (O 2 ) üretilmiş olur. d) Toksin antioksidan aktiviteyi düşürür. Örneğin parasetamolün karaciğerde sitokrom P450 tarafından metabolizması antioksidan aktivitede önemli yeri olan glutatyonla reaksiyona giren bir ürün oluşturarak sonuçta glutatyonun miktarını azaltır (Dawn ve ark., 1996; Akkuş, 1995; Tietz, 1995; Burtis ve Ashwood, 1999). 2.2.3. Serbest Oksijen Radikallerinin Etkileri Reaktif oksijen türlerinin (ROS) oluşumu enflamasyon, radyasyon, yaşlanma, normalden yüksek parsiyel oksijen basıncı (po 2 ), ozon (O 3 ) ve azot dioksit (NO 2 ), kimyasal maddeler ve ilaçlar gibi bazı uyarıların etkisiyle artar. Serbest radikaller hücrelerin lipid, protein, DNA, karbohidrat ve enzim gibi tüm önemli bileşiklerine etki ederler. Süperoksit radikali (O 2 ) ve hidroksil radikali (OH ) sitoplazma, mitokondri, nükleus ve endoplazmik retikulum membranlarında lipid peroksidasyonunu başlatır. Membranlarda lipid peroksidasyonu meydana gelmesi sonucu membran geçirgenliği artar. Serbest radikallerin etkisiyle proteinlerdeki sistein sülfhidril grupları ve diğer aminoasit kalıntıları okside olarak yıkılır, nükleer ve mitokondriyal DNA okside olur (Dawn ve ark., 1996; Akkuş, 1995; Tietz, 1995; Burtis ve Ashwood, 1999).

15 Şekil 2. 4. Serbest radikallerin hücreye etkileri Serbest oksijen radikallerinin tüm bu etkilerinin sonucunda hücre hasarı olur. Hücrede reaktif oksijen türlerinin (ROS) ve serbest radikallerin artışı hücre hasarının önemli bir nedenidir. İskemi sonrasında reperfüzyon da reaktif oksijen türlerinin (ROS) artışına bağlı olarak iskeminin oluşturduğu hücre hasarını artırır. Şekil 2. 5. Reaktif oksijen türlerinin zararı

16 Serbest oksijen radikallerinin neden olduğu hücre hasarının birçok kronik hastalığın komplikasyonlarına katkıda bulunduğu düşünülmektedir. Aterogenez, amfizem/bronşit, Parkinson hastalığı, Duchenne tipi musküler distrofi, gebelik preeklampsisi, serviks kanseri, alkolik karaciğer hastalığı, hemodiyaliz hastaları, diabetes mellitus, akut renal yetmezlik, Down sendromu, yaşlanma, retrolental fibroplazi, serebrovasküler bozukluklar, iskemi/reperfüzyon injürisi gibi durumlarda serbest oksijen radikallerinin neden olduğu hücre hasarı söz konusudur. 2.2.3.1. Serbest Radikallerin Lipidlere Etkileri Lipidler serbest radikallerin etkilerine karşı en hassas olan biyomoleküllerdir. Hücre membranlarındaki kolesterol ve yağ asitlerinin doymamış bağları, serbest radikallerle kolayca reaksiyona girerek peroksidasyon ürünleri oluştururlar. Poliansatüre yağ asitlerinin oksidatif yıkımı lipid peroksidasyonu olarak bilinir. Lipid peroksidasyonu kendi kendini devam ettiren zincir reaksiyonu şeklinde ilerler ve oldukça zararlıdır. Hücre membranlarında lipid serbest radikalleri (L ) ve lipid peroksit radikallerinin (LOO ) oluşması, reaktif oksijen türlerinin (ROS) neden olduğu hücre hasarının önemli bir özelliği olarak kabul edilir. Serbest radikallerin sebep olduğu lipid peroksidasyonuna "nonenzimatik lipid peroksidasyonu" denir. Hücre membranlarında lipid peroksidasyonuna uğrayan başlıca yağ asitleri poliansatüre yağ asitleridir. Lipid peroksidasyonu genellikle yağ asitlerindeki konjuge çift bağlardan bir elektron içeren hidrojen atomlarının çıkarılması ve bunun sonucunda yağ asidi zincirinin bir lipid radikali niteliği kazanmasıyla başlar. Şekil 2. 6. Yağ asidi zincirinin bir lipid radikali niteliği kazanması

17 Lipid radikali (L ) dayanıksız bir bileşiktir ve bir dizi değişikliğe uğrar. Lipid radikallerinin (L ) moleküler oksijenle (O 2 ) etkileşmesi sonucu lipid peroksit radikalleri (LOO ) oluşur. Lipid peroksit radikalleri (LOO ), membran yapısındaki diğer poliansatüre yağ asitlerini etkileyerek yeni lipid radikallerinin oluşumuna yol açarken kendileri de açığa çıkan hidrojen atomlarını alarak lipid peroksitlerine (LOOH) dönüşürler ve böylece olay kendi kendini katalizleyerek devam eder. Şekil 2. 7. Lipid peroksidasyonu Lipid peroksidasyonu sonucu oluşan lipid peroksitlerinin (LOOH) yıkılımı geçiş metalleri iyon katalizini gerektirir. Plazma membranı ve subsellüler organel lipid peroksidasyonu serbest radikal kaynaklarının hepsiyle uyarılabilir ve geçiş metallerinin varlığında artar. Lokal olarak hidrojen peroksitten (H 2 O 2 ) Fenton reaksiyonu sonucu hidroksil radikali (OH ) oluşması zincir reaksiyonunu başlatabilir. Lipid peroksitleri (LOOH) yıkıldığında çoğu biyolojik olarak aktif olan aldehitler oluşur. Bu bileşikler ya hücre düzeyinde metabolize edilirler veya başlangıçtaki etki alanlarından diffüze olup hücrenin diğer bölümlerine hasarı yayarlar. Üç veya daha fazla çift bağ içeren yağ asitlerinin peroksidasyonunda malondialdehit (MDA) (Şekil 2.8) meydana gelir. Şekil 2. 8. Malondialdehit (MDA)

18 Malondialdehit (MDA) kanda ve idrarda ortaya çıkar, yağ asidi oksidasyonunun spesifik ya da kantitatif bir indikatörü olmamakla beraber lipid peroksidasyonunun derecesiyle iyi korelasyon gösterir. Bu nedenle biyolojik materyalde malondialdehit (MDA) ölçülmesi lipid peroksit seviyelerinin indikatörü olarak kullanılır. Nonenzimatik lipid peroksidasyonu çok zararlı bir zincir reaksiyonudur. Direkt olarak membran yapısına ve ürettiği reaktif aldehitlerle indirekt olarak diğer hücre bileşenlerine zarar verir. Böylece doku hasarına ve birçok hastalığa neden olur (Dawn ve ark., 1996; Akkuş, 1995; Tietz, 1995; Burtis ve Ashwood, 1999). 2.2.3.2. Serbest Radikallerin Proteinlere Etkileri Proteinler serbest radikallere karşı poliansatüre yağ asitlerinden daha az hassastırlar. Proteinlerin serbest radikal harabiyetinden etkilenme derecesi amino asit kompozisyonlarına bağlıdır. Doymamış bağ ve kükürt içeren triptofan, tirozin, fenilalanin, histidin, metiyonin, sistein gibi aminoasitlere sahip proteinler serbest radikallerden kolaylıkla etkilenirler. Bu etki sonucunda özellikle sülfür radikalleri ve karbon merkezli organik radikaller oluşur. Serbest radikallerin etkileri sonunda, yapılarında fazla sayıda disülfit bağı bulunan immünoglobülin G (IgG) ve albümin gibi proteinlerin tersiyer yapıları bozulur, normal fonksiyonlarını yerine getiremezler. Prolin ve lizin reaktif oksijen türleri (ROS) üreten reaksiyonlara maruz kaldıklarında nonenzimatik hidroksilasyona uğrayabilirler. Hemoglobin gibi hem proteinleri de serbest radikallerden önemli oranda zarar görürler. Özellikle oksihemoglobinin süperoksit radikali (O 2 ) veya hidrojen peroksitle (H 2 O 2 ) reaksiyonu methemoglobin oluşumuna neden olur (Dawn ve ark., 1996; Akkuş, 1995; Tietz, 1995; Burtis ve Ashwood, 1999). 2.2.3.3. Serbest Radikallerin Nükleik Asitler ve DNA'ya Etkileri İyonize edici radyasyonla oluşan serbest radikaller DNA'yı etkileyerek hücrede mutasyona ve ölüme yol açarlar. Hidroksil radikali (OH ) deoksiriboz ve bazlarla kolayca reaksiyona girer ve değişikliklere yol açar. Aktive olmuş nötrofillerden kaynaklanan hidrojen peroksit (H 2 O 2 ) membranlardan kolayca geçerek ve hücre

19 çekirdeğine ulaşarak DNA hasarına, hücre disfonksiyonuna ve hatta hücre ölümüne yol açabilir. Süperokside (O 2 ) maruz kalan DNA molekülleri hayvanlara enjekte edildiklerinde daha fazla antijenik özellik gösterirler ki bu oldukça önemli bir etkidir, çünkü otoimmün bir hastalık olan sistemik lupus eritematozusta (SLE) ve romatoit artritte (RA) dolaşımda anti-dna antikorlar bulunur (Dawn ve ark., 1996; Akkuş, 1995; Tietz, 1995; Burtis ve Ashwood, 1999). 2.2.3.4. Serbest Radikallerin karbonhidratlara Etkileri Serbest radikallerin karbohidratlara etkisiyle çeşitli ürünler meydana gelir ve bunlar, çeşitli patolojik süreçlerde önemli rol oynarlar. Diyabet ve diyabet komplikasyonlarının gelişimi, koroner kalp hastalığı, hipertansiyon, cilt hastalıkları, romatoit artrit, behçet hastalığı, çeşitli deri ve göz hastalıkları, kanser gibi birçok hastalıkta ve yaşlılıkta serbest radikal üretiminin arttığı, antioksidan savunma mekanizmalarının yetersiz olduğu gösterilmiştir. Ancak bu hallerde serbest radikal artışının sebep mi yoksa sonuç mu olduğu tam olarak bilinmemektedir (Dawn ve ark., 1996; Akkuş, 1995; Tietz, 1995; Burtis ve Ashwood, 1999). 2.3. Antioksidan Savunma Sistemleri Reaktif oksijen türlerinin (ROS) oluşumunu ve bunların meydana getirdiği hasarı önlemek için birçok savunma mekanizmaları vardır. Bu mekanizmalar "antioksidan savunma sistemleri" veya kısaca "antioksidanlar" olarak bilinirler.

20 Şekil 2. 9. Antioksidanların hücredeki etkileri Antioksidanlar dört ayrı şekilde etki ederler; Serbest oksijen radikallerini etkileyerek onları tutma veya daha zayıf yeni moleküle çevirme toplayıcı etkidir. Antioksidan enzimler, trakeobronşiyal mukus ve küçük moleküller bu tip etki gösterirler. Serbest oksijen radikalleriyle etkileşip onlara bir hidrojen aktararak aktivitelerini azaltma veya inaktif şekle dönüştürme bastırıcı etkidir. Vitaminler, flavanoidler bu tarz bir etkiye sahiptirler. Serbest oksijen radikallerini bağlayarak zincirlerini kırıp fonksiyonlarını engelleyici etki zincir kırıcı etkidir. Hemoglobin, seruloplazmin ve mineraller zincir kırıcı etki gösterirler. Serbest radikallerin oluşturdukları hasarın onarılması onarıcı etkidir. Antioksidan sistem; serbest radikalleri hücre zarına, nükleik asitlere (DNA) ve hücre bileşenlerine saldırmadan kendine çeker ve bağlar. Günümüzde antioksidanların gıda sanayinde kullanımı oldukça yaygın olup hemen hemen tükettiğimiz her ürüne

21 antioksidan maddeler katılmaktadır. Bunlar gıdaları bozulmaya karşı korumakta olup onların daha uzun süreli saklanmasını sağlar, bunlardan bazıları bütillenmiş hidroksi toluen (BHT) ve bütillenmiş hidroksi anisol (BHA) bileşikleridir ancak bunların toksik etkilerinden şüphelenilmektedir. Bu nedenle son yıllarda yeni, daha güvenli ve ucuz antioksidan maddelerin bulunması için doğal ürünler üzerinde yaygın çalışmalar yapılmaktadır (Dawn ve ark., 1996; Akkuş, 1995; Tietz, 1995; Burtis ve Ashwood, 1999). Antioksidanlar vücutta çok kısa ömürlü fakat saldırgan olan serbest radikaller diye adlandırılan moleküllerle savaşırlar. Eğer serbest radikaller nötralize edilmezlerse vücutta ciddi hasarlara neden olabilirler. Sürekli gelişmekte olan teknoloji, oluşan çevre kirliliği, sigara, UV vb. pek çok diğer etken sürekli olarak çeşitli toksik maddelerle karşı karşıya kalmamıza neden olmaktadır. Bu etkiler kendini serbest radikal oluşumuyla gösterir. Tüm bu nedenlerden dolayı dış etkilerle oluşan hastalıklar artmakta, genetik hastalıkların da çevresel etkilerle daha çok belirginleşmesine neden olmaktadır. Bu hastalıklara çözüm getirmek öncelikle bu hastalıkların oluşumunu engellemekle gerçekleşebilir. Bunun için de ilaçlardan öte alınan besinler önem kazanmaktadır. Serbest radikallerin etkilerini önleyen ve gıdalarda bol miktarda bulunması gereken C vitamini ve E vitamini kanser ve kalp hastalıkları gibi toplumda erken ölümlerin başlıca nedenleri olan hastalıkların oluşumunu önlemektedir. Besinlerin dışında dışarıdan yapılacak takviyelerin de yararlı olduğu yapılan doz tespit çalışmalarıyla anlaşılmıştır. Ancak vücudun hassas dengesi alınacak aşırı dozlarla bozulabilmekte, bunun sınırının konabilmesi gerekmektedir (Dawn ve ark., 1996; Akkuş, 1995; Tietz, 1995; Burtis ve Ashwood, 1999).

22 2.3.1. Endojen Antioksidanlar 2.3.1.1. Enzim Olan Endojen Antioksidanlar Enzimatik antioksidan savunma mekanizması; vücuttaki bazı enzimler serbest radikalleri etkisiz hale getirmede etkili olmaktadır. Bu enzimler, 2.3.1.2. Enzim Olmayan Endojen Antioksidanlar Seratonin ve melatonin Seruloplazmin Transferrin Miyoglobin Hemoglobin Ferritin Bilirubin Glutatyon

23 Sistein Metiyonin Ürat Laktoferrin Albümin 2.3.1.3. Eksojen Antioksidanlar Eksojen antioksidanlar, vitaminler, ilaçlar ve gıda antioksidanları olmak üzere sınıflandırılabilirler 2.3.1.4. Vitamin Eksojen Antioksidanlar α-tokoferol (vitamin E) β-karoten Askorbik asit (vitamin C) Folik asit (folat) 2.3.1.5. Fenolik Bileşikler Bitkisel kökenli bütün gıdalarda daima farklı nitelikte ve miktarda çeşitli fenolik bileşikler bulunmaktadır. Fenolik bileşikler meyve ve sebzelerin kendilerine özgü buruk tadını verir. Fenolik maddeler meyve ve sebzelerde çok az bulunmalarına rağmen meyve ve sebze işleme teknolojisi bakımından değişik sorunlara neden oldukları için önemlidir. Fenolik bileşikler gıdalarda renk değişimlerine neden olur. Bunlar arasında en önemlisi esmerleşmelerdir.

24 Gıda bileşeni olarak fenolik bileşikler: İnsan sağlığı açısından işlevleri Tat ve koku oluşumundaki etkileri Renk oluşumu ve değişimine katılmaları Antimikrobiyal ve antioksidatif etki göstermeleri Fenoloksidaz enzimlerinin etkisiyle enzimatik renk esmerleşmelerine neden olmaları Çeşitli gıdalarda saflık kontrol kriteri olmaları gibi pek çok açıdan önem taşımaktadırlar. Fenolik maddeler bitkiler aleminde oldukça yaygın olarak az veya çok bulunur. Bazı meyve ve sebzeler kesildiği veya zedelendiği zaman bir süre sonra okside olarak renklerin değişip esmerleştiği gözlenir. Örneğin, elma, ayva patates gibi. Renk değişimi gözlenenlerde polifenol oksidaz enzimleri aktivitesi fazla, bunun yanında askorbik asit miktarlarıda düşüktür. Esmerleşme görülmeyen meyve ve sebzelerde ya askorbik asit miktarı çok yüksek ve bunun yanında polifenol oksidaz aktivitesi çok düşük veya yoktur. Gıdalarda enzimatik esmerleşme, genellikle kalite kaybı olarak değerlendirilmekte ve bu nedenle meyve ve sebzelerin işlenmeleri sırasında fenolik maddelerin oksidasyonları çeşitli yöntemlerle önlenmeye çalışılmaktadır. 2.3.2. Oksidatif Stres Hücrede normal metabolik yollardaki enzimatik reaksiyonlarda enzimlerin aktif yerinde ara ürünler olarak devamlı şekilde serbest radikaller oluştuğunu biliyoruz. Bazen bu serbest radikal ara ürünler enzimlerin aktif yerinden sızmakta, moleküler oksijenle kazara etkileşerek serbest oksijen radikalleri oluşturmaktadırlar. Hücrede oluşan reaktif oksijen türleri (ROS), "antioksidan savunma sistemleri" veya kısaca "antioksidanlar" olarak bilinen mekanizmalarla ortadan kaldırılırlar. Ancak bazen hücresel savunma mekanizması vasıtasıyla ortadan kaldırılandan daha fazla reaktif oksijen türleri (ROS) oluşabilir. Organizmada Hücresel savunma mekanizması

25 vasıtasıyla ortadan kaldırılandan daha fazla reaktif oksijen türlerinin (ROS) meydana gelmesi oksidatif stres olarak tanımlanır. Şekil 2. 10. Oksidatif stres Oksidatif stresin, serbest oksijen radikallerinin neden olduğu hücre hasarıyla birçok kronik hastalığın komplikasyonlarına katkıda bulunduğu düşünülmektedir. Aterogenez, amfizem/bronşit, Parkinson hastalığı, Duchenne tipi musküler distrofi, gebelik preeklampsisi, serviks kanseri, alkolik karaciğer hastalığı, hemodiyaliz hastaları, diabetes mellitus, akut renal yetmezlik, Down sendromu, yaşlanma, retrolental fibroplazi, serebrovasküler bozukluklar, iskemi/reperfüzyon injürisi gibi durumların patogenezinde oksidatif stresin rolünden söz edilmektedir (Dawn ve ark., 1996; Akkuş, 1995; Tietz, 1995; Burtis ve Ashwood, 1999). 2.4. Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi (HPLC) Sıvı kromatografisi de gaz kromatografisi gibi bir ayırma yöntemidir. Bir sıvıda çözülmüş ayrılacak bileşikler, bir kolonda bulunan genellikle katı bir destek üzerindeki durucu faz ile etkileşmelere girerek kolon içinde farklı hızda ilerler, kolonu değişik

26 zamanlarda terk ederler ve böylece birbirlerinde ayrılırlar. Burada her şey gaz kromatografisindeki gibidir, ancak taşıyıcı faz sıvıdır. Sıvı kromatografisi uzun yıllar öncesinden beri bilinmesine rağmen gelişmesi hızlı olmamış; ancak yeni kolon maddelerinin bulunması, yüksek taşıyıcı faz hızları kullanılmasıyla ayırmaların kısa zamanda gerçekleştirilmesi ve kolonların defalarca kullanılması sayesinde kullanım alanı son yıllarda genişlemiştir. Şekil 2. 11. Karışımların ayrılması ve bileşenlerin kalitatif ve kantitatif Analizlerinde kullanılan HPLC cihazı HPLC günümüzde ilaç, yiyecek ve tarım kimyasalları, çevre kimyası, biyokimya, polimer kimyası ve adli tıp alanlarında çok kullanılan bir yöntemdir. Sıvı kromatografisinde taşıyıcı faz, pompa ile kolona basılarak yüksek taşıyıcı faz hızı sağlanmakta, ayırma çabuk ve tam olarak gerçekleşmektedir. Sıvı kromatografisinde adsorban tanecik büyüklüğü 3-10 µm dir. Durgun faz olarak kullanılan parçacık boyutlarının önemli ölçüde küçültülmesi sonucu hareketli faz ile etkileşen sabit faz yüzey alanı büyür ve böylece kolonun etkinliği arttırılmış olur. HPLC hareketli faz durgun faz ilişkisine göre dörde ayrılır: Dağılma kromatografisi(sıvı-sıvı kromatografisi) Adsorpsiyon kromatografisi(sıvı-katı kromatografisi) İyon kromatografisi

27 Jel kromatografisi HPLC nin diğer kromatografi türlerinden üstünlükleri şunlardır: HPLC kolonu, rejenerasyon olmaksızın pek çok kez kullanılabilir. Böylece kolonlarda gerçekleştirilen ayırma, eski yöntemlerle elde edilenden çok daha çeşitlidir. Bu teknik kullanıcının becerisine daha az bağımlıdır ve tekrarlanabilirlik daha yüksektir. Nicel analiz için de kullanılabilir. Analiz süresi çok kısadır. Duyarlılık çok yüksektir.(10 µg lık bir örnek bile, floresans veya elektron yakalama dedektörleri kullanılarak tayin edilebilir.) En önemlisi HPLC ile GC, GC-MS gibi cihazlardan farklı olarak oda koşullarında (25ºC de) analitin kimyasal yapısını bozmadan, maddeleri parçalamadan çalışabilmekteyiz. HPLC sistemi şu bölümlerden oluşur: Çözücü depoları Pompalar Sıvı faz programlayıcı Enjeksiyon bölümü (örnek girişi) Kolon Dedektör Yazıcı 2.4.1. HPLC Sisteminde Pompa Pompa sabit hızda motor pistonu gibi gidip gelmekte ve sübaplar yardımıyla kolona gönderilecek sıvı, devamlı olarak önce pompaya alınmakta, sonra kolona sabit akış hızında basılmaktadır; bu kolonda kesikli bir akış oluşturmaktadır. Kesikli akışı önlemek için iki adet bu tip pompa paralel çalıştırılmakta; bir tanesi emme yaparken, diğeri kolona taşıyıcı fazı basmaktadır; yani iki pompa hareketi arasında 180ºC faz

28 olmaktadır. Burada az da olsa sıvıda darbeli bir akış vardır. Daha geliştirilmiş pompa sisteminde üç adet bu tip pompa paralel çalışmakta ve pompa hareketleri arasında 120ºC faz farkı olmaktadır. Bu sistemde darbeli akış daha çok önlenmiştir. Böyle çalışan pompalar devamlı sıvıyı alıp verdikleri için sıvı alma kapasiteleri sınırlı olmamakta, pompalara verilen sıvı istenildiğinde kolayca değiştirilmekte ve iç hacimleri küçük olduğundan yeni sıvı faz tarafından kolayca yıkanıp temizlenmektedir. Pompaların yapıldığı malzeme, kullanılan sıvı fazdan etkilenmemelidir, örneğin HCL ve HBr, paslanmaz çelikte dahi korozyona neden olduğu için kullanılmaz. 2.4.1.1. Taşıyıcı Faz Programlaması Akış kontrolü ve programlama sistemi, akış hızını giriş ve çıkış basınçları arasındaki farktan kontrol eder. HPLC de sisteme verilmeden önce taşıyıcı fazın içinde, çözünmüş bütün gazlar, uzaklaştırılmalıdır. Aksi halde çözünmüş gazlar(bilhassa hava) sistemin düşük basınçlı kısmı olan dedektörlerde, kabarcık oluşturur; bu ise dedektörden çok hatalı değerler alınmasına neden olur. Taşıyıcı fazdan gaz uzaklaştırma işlemi ısıtma veya vakum uygulanarak gerçekleştirilir. Sıvı içinden He gazı geçirmek de iyi sonuç verir, Helyumun organik çözücülerde çözünürlüğü az olduğu için havayı sürükleyerek uzaklaştırır ve pozitif He basıncı altında tutulması sıvıda kabarcık oluşmasını önler. Kolonlar genellikle 10-60ml/saat akış hızında çalışır. Bu akış hızlarını elde etmek için taşıyıcı faza uygulanan basınç 30-400 atm arasında değişir. Sıvı kromatografisinde taşıyıcı faz olarak tek bir çözücü kullanılırsa, örnekteki bileşenlerin ayrılması izokrotik elüsyon olarak adlandırılır. Taşıyıcı fazın bileşiminin sürekli değiştirilerek bileşenlerin ayrılması ise gradient elüsyon (basamaklı elüsyon) olarak adlandırılır. Sıvı faz programlamasının yararları şöyle sıralanabilir: Toplam analiz süresi kısalır. Karışımın bileşenlere ayrılması daha kesin ve düzgün olur. Pik şekli düzelir. Analiz duyarlılığı artar.

29 İyi bir taşıyıcı faz şu özelliklere sahip olmalıdır: Durucu fazın özelliklerini değiştirmemelidir. Ayrılacak karışımdaki bileşiklerin hepsini çözmelidir. Çözücü karışımları kullanılacaksa birbiriyle tamamen karışabilir olmalarına dikkat edilmelidir. Düşük viskozlukta olmalıdır. Gerektiğinde ayrılan bileşikten kolayca uzaklaştırılabilmeli(kolayca buharlaştırılabilmelidir.) Kullanılan dedektöre uygun olmalıdır. Sıvı kromatografisinde taşıyıcı faz olarak tek bir çözücü kullanılırsa, örnekteki bileşenlerin ayrılması izokrotik elüsyon olarak adlandırılır. Taşıyıcı fazın bileşiminin sürekli değiştirilerek bileşenlerin ayrılması ise gradient elüsyon (basamaklı elüsyon) olarak adlandırılır. 2.4.2. Örneğin kolona verilmesi (Enjeksiyon) Numune enjeksiyonu yüksek basınçta yapılır. Enjekte edilen numune, yüksek basınçta hareket eden hareketli faza karışır ve kolonun üstüne hareketli fazda karışmış halde ulaşır. Ayrılacak karışım, sisteme kolondaki durucu fazı bozmayacak şekilde iki türlü verilir: 1) Taşıyıcı faz akış halindeyken, 2) Taşıyıcı faz akışı durdurularak. HPLC de kesinliği azaltan en önemli faktör, numunenin kolona enjeksiyonunda yapılan hatadır. Başka bir deyişle enjeksiyonun tekrarlanabilir yapılamamasıdır. Bu hata kolonun aşırı yüklenmesinden meydana gelen bant genişlemesiyle daha da belirgin hale gelir. İlave edilecek numune miktarı birkaç µl ile 500 µl ye kadar değişebilir. 2.4.3. Kolon Ayırmanın başarılı veya başarısız olması kolon seçimine bağlıdır. Kolonların iç çapları 0,5-6 mm arasında değişir. Kolonlar paslanmaz çelikten yapılmıştır, kıvrılmadan düz

30 olarak kullanılırlar ve uzunlukları 3 cm 3 m arasında değişir. Kolon ne kadar uzun olursa o kadar iyi ayırma yapar, ancak çalışma basıncı ve süresi fazla olur. Kolon girişine takılan, aynı durucu fazı içeren bir bölüm de taşıyıcı faz ve örnekteki tozlardan, parçacıklardan korur ve koruyucu kolon olarak adlandırılır. Kolonun çıkış ucunda, kolon dolgu maddesinin dedektöre gitmesini önlemek için, poröz metal bir süzgeç bulunur. Şekil 2. 12. HPLC cihazında kullanılan kolonları İyi bir kolon dolgu maddesi; Hem hareketli faz çözücülerine hem de örnek çözeltilere karşı inert olmalıdır. Geniş yüzey alanına, düzgün olarak dağılmış ve hareketli faza kolay erişebilir açık yapısal yüzeye sahip olmalıdır. Yüksek basınç ve yüksek akış hızlarından etkilenmemelidir. Kararlı olmalıdır. 2.4.4. Dedektör Sıvı kromatografisinde detektörün amacı kolondan çıkan sıvının bileşimini gözlemek ve meydana gelen değişikliği kaydediciye iletmektir. İdeal bir dedektör şu özelliklere sahip olmalıdır Düşük gürültü seviyesine sahip olması nedeniyle ayrılan bileşenlerin küçük miktarları gözlenebilir olmalıdır. Hızlı ayrılan pikleri kaydetmek için süratli cevap zamanına sahip olmalıdır. Bütün çözünenlere cevap verir veya tahmin edilebilir bir seçiciliğe sahip olmalıdır.

31 HPLC dedektörleri iki çeşittir 1) Genel dedektörler 2) Seçici dedektörler Genel dedektörler, hareketli faz ve örnek çözeltisinin kırılma indisi, dielektrik sabiti, yoğunluk gibi özelliklerini ölçen detektörlerdir. Seçici detektörler, yalnız örnek çözeltisi için duyarlık ve seçicilik gösterir. 2.4.4.1. Infrared (IR) Absorbans Dedektörleri Dalga sayıları 4000-700 cm ¹ aralığında olan cihazlardır. Numune kapları pencereleri kuvarstan değil, sodyum veya kalsiyum klorürden yapılır. Bir infrared cihazı basit olarak bir dalga boyunda çalışabildiği gibi, çeşitli dalga boylarında da çalışabilir. Çeşitli dalga boylarında çalışabilmesi için elüentin akışı belirli sürelerle durdurulur tekrar başlatılır. Infrared dedektörleri kullanılmasının en büyük handikapı çok kullanılan alkol, su gibi çözücülerin verdiği ve geniş bir alan kaplayan hidrojen bağı pikleridir. Bu piklerin ortaya çıkışı IR dedektörleri kullanılmasını sınırlı hale getirir. 2.2.4.2. Floresans Dedektörleri Floresans metodunun başlıca avantajı, herhangi bir absorbans metodundan en az 10 defa daha hassas olmasıdır. Çalışma ilkesi, bileşiğin güçlü soğurma yapabilecek bir dalga boyunda ışınlanmasına ve yayınlanan ışımanın dedekte edilmesine dayanır. Bütün organik bileşikler, floresan olmadığından, bu tip dedektörler, aromatik bileşikler, proteinler ve nükleik asitlerin analizi için çok duyarlı sonuçlar verirler.

32 2.2.4.3. UV Absorbans Dedektörleri Kolondan çıkan sıvı (elüent) kuvarstan yapılmış küçük bir küvetten geçirilir. Küvetin bir tarafından gönderilen belirli dalga boyundaki ışıma diğer tarafa konan duyar bir dedektör tarafından algılanır. Küvetten geçen ışıma, sıvı tarafından soğurulursa dedektöre gelmez ve bu bir sinyal oluşturur, elektronik devrelerde yükseltilen bu sinyal kaydediciye verilir. Burada istenilen dalga boyundaki ışıma, optik filtre kullanılarak veya monokromotördden elde edilir. Ayırma yapılacak bileşiklere bağlı olarak çeşitli dalga boylarında ışımaya duyarlı dedektörler kullanılabilir. Civa lambası 254 nm dalga boyunda ışıma yayar ve aromatik bileşikler, konjuge alkenler ve karbonil bileşikleri için uygundur. Çinko lambası, 214 nm dalga boyunda ışıma yayar ve aklanlar hariç bütün organik bileşikler dedekte edilebilir. Günümüzde diyot lambalı dedektörler de kullanılmaya başlanmıştır. Duyarlığı derişime bağlı olduğundan kantitatif analizde en iyi sonuç UV-görünür bölge dedektörleri ile alınır ve 10 8 M derişiminde bileşikler dedekte edilebilir. 2.2.4.4. Kırılma İndisi Dedektörleri Çalışma prensibi, kolondan hareketli fazla beraber ayrılacak bileşik çıktığında taşıyıcı faz sıvısının kırılma indisinin değişmesine dayanır. Bu dedektörde sıvının kırılma indisi devamlı gözlenir ve meydana gelen değişiklik bir dedektörle elektronik sinyal haline çevrilir, elektronik sistemlerde yükseltilip kaydediciye verilir. Bu tip dedektörlerle her türlü bileşik gözlenir. Ancak sıcaklık değişmelerine çok duyarlıdır; çünkü kırılma indisi sıcaklıkla değişir. Kolon siteminde ve dedektörde sıcaklık kontrolü yapılması gerekir. Diğer bir istenmeyen tarafı da, taşıyıcı fazla çıkan bileşikler kırılma indisini hep aynı yönde değiştirmez; bazı bileşikler arttırır, bazıları azaltır. Bu nedenle kaydediciye her zaman pozitif sinyal gitmediğinden kaydedilen kromatogramda pikler pozitif yönde olduğu kadar negatif yönde de olur.

33 3. MATERYAL VE METOT 3.1. Materyal Çalışmamız için gerekli Mührüsüleyman (Polygonatum orientale) bitkisi Kütahya İli nin Gediz ilçesinde haziran ayında toplanmıştır. Tür teşhisi Marmara Üniversitesi Fen Edebiyat Fakültesi Öğretim Üyesi Sayın Prof. Dr. Ali ÇIRPICI tarafından yapılmıştır. (İSTF 31938) 3.2. Kullanılacak Kimyasal Madde, Malzeme ve Cihazlar Etanol (Tekkim), 1,1-Difenil 2-pikril hidrazil (DPPH) (Sigma), Metanol (Merck), Linoleik asit (Sigma), Metiyonin, FeCl 3 (Sigma), FeCl 2 (Sigma), NaOH (Sigma), Aseton, Petrol Eteri (Merck), Ferrozin (Sigma), Riboflavin, FeCl 2.4H 2 O(Sigma), Na 2 CO 3 (Sigma), Gallik asit(merck), K 3 Fe(CN) 6 (Sigma-Aldrich), Potasyum dihidrojen fosfat, Folin-ciocalteus reaktivi (Sigma-Aldrich), Tween-20(Sigma-Aldrich), Dipotasyum hidrojen fosfat, BHT, BHA, α-tokoferol Amonyum Tiyosiyanat (Sigma), Beher, Balon, Vezin Kabları vb. laboratuar malzemeleri. Evaporatör(Heidolph Laborata 4001-efficient), ph metre, Mikro pipet, Manyetik karıştırıcı, Satrifuj (EBA-21 Hettich Zen Trifugen), UV spektrometre (Jasco V-530), HPLC cihazı (Perkin Elmer Series 200 pompa Series200), GC-MS (Perkin Elmer Clarus 500 ) 3.3. Metot Bu çalışmada Mührüsüleyman (P. orientale) bitkisinin kök kısmı analiz edilmiştir. Mührüsüleyman bitkisini hem metanol/metilen klorür (1/1) hem de su ekstresinin antioksidan kapasitesi çalışılmıştır. Mührüsüleyman bitkisinin kökü güneş görmeyen yerde iyice kurutulmuştur ve toz haline getirildikten sonra metanol/metilen klorür ekstraksiyonu için 30 gr öğütülmüş Mührüsüleyman 150 ml çözücüde (1:1 metanol/ metilen klorür) numunelerin ekstraktları hazırlanmıştır. Su ekstresini hazırlamak için 5

34 gr mührüsüleyman 50 ml saf su ile ekstrakt hazırlanmıştır. Çözücüler uzaklaştırılarak ham ekstre elde edilmiştir. Elde edilen her bir ekstraktın total antioksidan aktivitesi (Mitsuda ve ark., 1996), serbest radikal (DPPH ) giderme aktivitesi (Blois, 1958), Metal şelat oluşturma aktivitesi (Carter, 1971), Süperoksit Anyon Radikali Giderme Aktivitesi (Beauchamp ve Fridovich, 1971), İndirgeme gücü aktivitesi (Oyaızu, 1986), in vitro olarak ölçülmüştür ve total fenolik bileşik tayini spektroskopik olarak (Slinkard ve Singleton, 1977) yapılmıştır. Bu aktivitelerin her biri α-tokoferol (vitamin E), bütillenmiş hidroksi toluen (BHT) ve bütillenmiş hidroksi anisol (BHA) gibi antioksidan maddelerin antioksidan aktiviteleri ile karşılaştırılmıştır. Antioksidan testleri Mührüsüleyman bitkisinin kök kısmı için üç tekrar yapılarak sonuçların ortalaması alınmıştır. 3.3.1. İndirgeme Gücü Bitki ekstraktlarının total indirgenme gücü Oyaizu metodu kullanılarak belirlenmiştir (Oyaizu, 1986). 40, 80, ve 120 µl hacimlerindeki bitki ekstresinin (1 mg/ml) sudaki çözeltileri üzerine toplam hacim 2,5 ml olacak şekilde 0,2 M fosfat (KH 2 PO 4 ) tamponu (ph: 6,6) ve 2,5 ml potasyum ferrisiyanür K 3 Fe(CN) 6 (%1 lik) çözeltileri ilave edilmiştir. İyice vortekslendikten sonra 20 dk 50 o C lik su banyosunda inkübe edilmiştir. Daha sonra %10 luk trikloroasetik asit (TCA) çözeltisinden 2.5 ml bu karışıma eklenmiştir ve 10 dk 3000 rpm de santrifüj edilmiştir. Santrifüjlenen karışımdan 2,5 ml alınıp üzerine 0,5 ml %1 lik demir(iii) klorür (FeCl 3 ) çözeltisi eklenerek vortekslenmiştir. Daha sonra UV-Vis spektroskopisi kullanılarak 700 nm de absorbansları ölçülmüştür. Kontrol ekstre dışında kalan kısımdır (2,5 ml tampon ile başlanır ve sırayla işlemler devam eder) α-tokoferol, BHT, BHA standartlarına da aynı işlemler yapılmıştır. Reaksiyonlar sonrasında oluşan demir ferrosiyanür kompleksi (Şekil 3.1) miktarına göre antioksidan maddenin indirgeme gücü hakkında yorum yapılmaktadır. Demir

35 ferrosiyanür kompleksi 700 nm de absorbans verir; absorbans ile antioksidan aktivite doğru orantılı olarak değişmektedir. Fe(CN) 6 3- + Antioksidan Fe(CN) 6 4- + Antioksidan + + Fe 3+ Fe 4 [Fe(CN) 6 ] 3 Şekil 3. 1. Demir ferrosiyanür oluşumu 3.3.2. Serbest Radikal (DPPH) Giderme Aktivitesi Bitki kökünün serbest radikal (DPPH : 1,1-Difenil 2-pikril hidrazil) giderme aktiviteleri Blois (1958) metoduna göre yapılmıştır. Stok çözeltilerden 50 µl, 100 µl, 200 µl mikropipetle deney tüplerine alınmıştır ve standartlardan da (BHT, BHA,α-Tok) 50 µl, 100 µl ve 200 µl alınmıştır. Daha sonra hepsi etanolle 500 µl ye tamamlanmıştır. Toplam hacim 3 ml olacak şekilde tekrar etanol ilave edilmiştir. Daha sonra iki tane kontrol (3 ml etanol+1 ml DPPH çöz.) çözeltisi hazırlanmış ardından tüplerin hepsine kör hariç 1 ml DPPH çözeltisinden eklenmiştir. Toplam hacim 4 ml olacak şekilde etil alkol ilave edilmiştir. Işık görmeyen yerde otuz dakika inkübe edildikten sonra 517 nm de absorbans okunmuştur. Kör çözelti etil alkol, kontrol çözelti numunesiz çözeltidir (Blois, 1958). DPPH (1,1-Difenil 2-pikril hidrazil) serbest bir radikaldir, bir elektron veya hidrojen radikali alarak stabil diamanyetik molekül haline gelir. Bu metod, koyu menekşe renkli olan DPPH çözeltisinin, sistem içindeki herhangi bir molekül tarafından elektron transferi olduğunda renginin açılması ve bu renk değişikliğinin UV spektrometre ile

36 ölçülmesi esasına dayanmaktadır. Renk ne kadar açılır ve çözelti absorbansı ne kadar düşük çıkarsa serbest radikal giderme aktivitesi o kadar artmaktadır. Aşağıdaki formül kullanılarak % DPPH aktivitesi hesaplanmıştır. DPPH giderme aktivitesi (%) = [(A 0 -A 1 /A 0 )x100)] A 0 : Kontrol Reaksiyonunun Absorbansı A 1 : Bitki Ekstraktlarının Absorbansı 3.3.3. Süperoksit Anyon Radikali Giderme Aktivitesi Ekstrelerden 50 µl, 100 µl ve 200 µl olmak üzere farklı hacimlerde stok çözeltiler hazırlanmıştır ve bu hazırlanan ekstreler 500 µl olacak şekilde üzerlerine (ph 7,8) fosfat tamponundan ilave edilmiştir. Daha sonra hepsine kontrol 1, kontrol 2 ve kör dahil olmak üzere (0.05M,1 ml) metiyonin ilave edilmiştir. Sonra (1.5x10-5 M,1 ml) riboflavin eklenmiştir. Daha sonra tekrar stok çözeltilerle 1,5 ml daha (kör ve kontrollere 2 ml) tampon çözeltisi ilave edilmiştir. En son 5x104 M.1 ml NBT ilave edilmiştir. Hepsi vortekslenmiş ve 20 UV lik ışık kabininde 25 o C de 20 dk floresans ışıkta bekletildikten sonra ardından 560 nm de absorbanslarına bakılmıştır. Kör: Ekstre yok, ışık görmemiş, 1 ml metiyoninin, 1 ml riboflavin, 2 ml tampon, 1 ml NBT Süperoksit giderme aktiviteleri riboflavin- metiyonin- ışık- NBT metoduna göre yapılmıştır (Beauchamp ve Fridovich, 1971). Süperoksit radikalleri (O - 2 ) riboflavin /metiyonin/ışık sisteminde oluşturulup oluşan süperoksit radikalleri NBT yi NBT 2+ ye yükseltgemesi esasına dayanmaktadır. Oluşan formazan (NBT 2+ ) ise 560 nm de maksimum absorbans vermektedir. Sonuçlar antioksidan etkiye sahip olan bütillenmiş hidroksi anisol (BHA) ve α-tokoferol gibi standart antioksidan maddelerle karşılaştırılmıştır. 2 O 2 - + 2 H + H 2 O 2 + O 2 % Süperoksit Anyon Radikali Giderme Aktivitesi = [(A 0 -A 1 /A 0 )X100)]

37 3.3.4. Total Antioksidan Aktivitenin Belirlenmesi Bitki ekstraktının antioksidan aktivitesini belirlemek için tiyosiyanat metodu kullanılmıştır. (Mitsuda ve ark., 1996). 1 mg/ml konsontrasyonda olacak şekilde hazırlanan stok çözeltiden, 0,5 ml alınarak vezin kaplarına ilave edilmiştir, üzerine 0,017 M 2,5 ml linoleik asit ve 0,04 M 2.4 ml tampon çözelti (ph:4.0, fosfat tamponu) eklenmiştir. Bu işlemler standartlar (BHA, BHT ve α-tokoferol) içinde yapılmıştır. Karışımlar 37 o C de 5-6 saat süreyle inkübasyona bırakılmıştı. Daha sonra deney tüplerine 4,7 ml etanol eklenmiş ve körede 4,8 ml etanol eklenmiştir. Üzerine vezin kaplarındaki numunelerden 100 µl eklenmiştir. Sonra hazırlanan bu deney tüplerinin her birine 100 µl FeCl 2 çözeltisi ilave edilmiştir ardından %30 luk 100 µl amonyum tiyosiyanat eklenerek vortekslenmiştir. Vezin kapları tekrar etüve bırakılmıştır. En sonunda vortekslenen çözeltilerin 500 nm de absorbansları okunmuştur ve bu işlemler her 6 saatte bir tekrar edilmiştir. Kontrol çözelti olarak 2,5 ml linoleik asit üzerine 0,04 M 2,5 ml tampon çözelti konulmuştur. Kör ise numune dışındaki çözeltilerdir (etanol, amonyum tiyosiyanat). Lipid peroksidasyon yüzdesi şu formülle bulunur (Mitsuda ve ark., 1996). % inhibisyon= ( A 0 -A 1 ) / A 0 x 100 A 0 : kontrol reaksiyonun absorbansı A 1 : numunelerin absorbansı. 3.3.5. Total Fenolik Bileşik Tayini Bitki ekstreleride total fenolik bileşik tayini Folin-Ciocalteus reaktifi ile yapılmıştır (Slinkard ve Singleton, 1977). Gallik asit standart olarak kullanılmıştır. 50 ml lik balon jojelere 1 ml numunelerden + 45 ml saf su ilave edilmiştir. Bu balon jojelerin hepsine Folin-Ciocalteus reaktifinden 1 ml eklenmiştir. Daha sonra hepsine %2 lıik 3 ml Na 2 CO 3 eklenmiş ve karanlıkta 2 saat bekletilmiştir. Kör olarak; 45 ml su + 1 ml folin ciocalteu + 3 ml Na 2 CO 3 (%2 lik) ile 50 ml ye su ile seyreltilmiştir. Fenolik bileşik tayininde gallik asitle hazırlanan standartlar ekstreler gibi inkübe edilmiştir. Total fenolik bileşik miktarı kalibrasyon eğrisi kullanılarak hesaplanmıştır. A= 0.001 x Pyrocatechol(µg) + 0.0033

38 3.3.6. Metal Şelatlama Aktivitesi Mührüsüleyman bitkisinin (kök) metal şelatlama aktivitesi Carter tarafından belirlenen metotla yapılmıştır (Carter, 1971). 40, 80 ve 120 µl lik konsantrasyonlardaki numuneler üzerine toplam hacmi 4 ml olacak şekilde etanol ilave edilmiştir. Daha sonra sırayla 2 µm 0,05 ml FeCl 2 ve 5 µm 0,2 ml ferrozin eklenmiştir. 10 dk oda sıcaklığında bekletilmiştir. Kör için 2 µm 0,05 ml FeCl 2 üzerine toplam hacim 4 ml olacak kadar etil alkol eklenmiştir. Standartlarada (α-tokoferol, BHA, BHT) aynı işlemler uygulanmıştır. 562 nm de spektrofotometrede ölçümler alınmıştır. Metal Şelatlama Yüzdesi = ( A 0 A 1 ) / A 0. 100 A 0 : Kontrol Absorbansı A 1 : Numune Absorbansı 3.3.7. E Vitamininin (α-tokoferol) ün HPLC ile Kantitatif Tayini Kantitatif analiz Perkin Elmer Series 200 pompa ve Series 200 UV detektör e sahip HPLC sistemi ile yapılmıştır. Hareketli faz olarak asetonitril (Çözücü A) (Merck, HPLC grade) ve deiyonize su (Çözücü B) kullanılmıştır. Ayrım için Dynex C18 ( 4.6 x 150 mm, 0.5 µm partikül büyüklüğü) kolon kullanılmıştır. Çalışma 295 nm de ( Berenguer ve ark., 2002) yapılmıştır. Hareketli faz programı Çizelge 4.1 de verilmiştir. Standart olarak α-tokoferol (e vitamini) kullanılmıştır. Standartın metanolde 15 mg/ml stok çözeltileri hazırlanmıştır. Bu stok çözeltilerden seyreltme ile (metanol ile) 10, 50, 250 ve 1000 ppm lik derişimlerden 20 µl hacimli enjektör ile cihaza verilmiştir. Şekil 4.8 de verilmiştir Metanol/metilen klorür ve saf suda bulunan Mührüsüleyman bitki kökünün numuneleri petrol eteri ile ekstrakte edilmiştir. Üst faz (petrol eteri fazı) alınmıştır. Evaporatörde çözücü uzaklaştırılmıştır. Ham ekstrelere 1 ml petrol eteri ilave edilmiş ve süzüntü 0,22µm naylon membrandan (Chrom tech.) geçirildikten sonra 20 µl alınarak direkt olarak analiz edilmiştir.

39 3.3.8. Karotenoid (A vitamini) Spektroskopik Yöntemle Analizi Karotenoid miktarı Elif ve arkadaşları (2010) tarafından kullanılan metoda göre yapılmıştır. 2007 ve 2009 yıllarına ait öğütülmüş Mührüsüleyman bitki köklerinden 0,2 gr tartıldı %80 lık 5 ml asetonda homojenize edilmiştir. 5 dk vortekslendikten sonra 3000 rpm de 10 dk santrifüj edilmiştir. Süpernatant kısımdan 1mL alınınarak 9 ml saf su ilavesiyle 10 kat seyreltilmiştir. Hazırlanan numuneler 645 nm, 663 nm ve 450 nm de absorbansları ölçülerek kaydedilmiştir. Kör olarak %80 lık aseton kullanılmıştır. Kl a =12,7 A 663-2,69 A 645 }Arnon denklemi Kl b =22,9 A 645-4,68 A 663 }Arnon denklemi Karotenoid=4,07 A 450 - (0,0435 kla miktarı+0,3367 kl a miktarı) }Jaspars denklemi

40 4. BULGULAR 4.1. İndirgeme Gücü İndirgeme gücü analizinde Mührüsüleyman bitkisine ait kök kısmının ortamdaki Fe 3+ iyonlarını Fe 2+ ye indirgeyerek ortamda serbest radikal oluşumunu engellemede etkili olduğu ölçümlerin α-tokoferol standardıyla karşılaştırılmasıyla belirlenmiştir. Mührüsüleyman bitkisini hem metanol/metilen klorür ekstrelerinde hem de suyla hazırlanan ekstrelerinde indirgeme gücü aktivitesi standartla karşılaştırıldığında aktivitenin yok denecek kadar az olduğu görülmüştür (Şekil 4.1). 09 MS 09 MS SS 07 MS 07 MS SS α-tokoferol 0,8 0,7 Absorbans (700 nm) 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0 5 10 15 20 25 30 35 Konsantrasyon (µg/ml) Şekil (4. 1-4. 5 ) Standart ve numunelerin çeşitli konsantrasyonlardaki metal şelat oluşturma aktiviteleri. (09MS M: 2009 yılında toplanan mührüsüleymanın metanol/metilenklorür ekstresi; 09MS SS: 2009 yılında toplanan mührüsüleymanın saf su ekstresi; 07MS M: 2007 yılında toplanan mührüsüleymanın metanol/metilenklorür ekstresi; 07MS SS: 2007 yılında toplanan mührüsüleymanın saf su ekstresi). Polygonatum türleri ile ilgili yapılan antioksidan aktivite çalışmalarında metal şelatlama aktiviteleri çalışılmamıştır (Liu ve ark., 2008; Jeon ve ark., 2004).

41 4.2. Serbest Radikal (DPPH) Giderme Aktivitesi Mührüsüleyman bitkisinin % DPPH radikali giderme aktiviteleri analiz edilmiş ve pozitif kontrol olarak BHT ile kıyaslanmıştır. Bitkiye ait kök sonuçları standart olarak kullanılan BHT ile karşılaştırıldığında serbest radikal giderme aktivitesi düşük olduğu görülmüştür. BHT nin serbest radikal giderme aktivitesi % 80 90 iken ekstrelerimizin aktiviteleri %10 nun altında olduğu şekil 4.2de görülmektedir. Bu nedenle bitki kök kısmının ekstresinde serbest radikal giderme aktivitesine çok düşük olduğu gözlemlenmiştir. 09 MS M 09 MS SS 07 MS M 07 MS SS BHT DPPH Giderme Aktivitesi (%) 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0 10 20 30 40 50 Konsantrasyon (µg/ml) Şekil 4. 2. Standart ve numunelerin belirli konsantrasyonlarının % DPPH giderme aktiviteleri Şengül ve arkadaşları (2009) tarafından yapılan çalışmada bazı tıbbi bitkilerin antimikrobiyal ve antioksidan aktiviteleri çalışılmıştır. Bu çalışmada incelenen bitkilerden birisi Polygonatum multiflorumun antimikrobiyal ve antioksidan aktiviteleri çalışılmış elde edilen sonuçlara göre antioksidan aktivitesinin olmadığı antimikrobiyal aktivitesinin az olduğu rapor edilmiştir. Bu tür her ne kadar bizim çalıştığımız tür

42 değilse de aynı familyadan olan Polygonatum multiflorumun antioksidan aktivitesinin olmaması bizim çalışmamızın sonuçlarıyla benzerlik göstermektedir. 4.3. Süperoksit Radikali Giderme Aktivitesi Süperoksit anyon radikali giderme aktivitesi analizinde ise Mührüsüleyman bitkisine ait kök ekstrelerimiz standartlarla karşılaştırıldığında 07 MS SS α-tokoferol standardı ile aynı aktiviteye sahiptir. Süperoksit anyon giderme aktivitesi yüzde olarak sıralaması şu şekildedir. BHA>BHT>O7 MS SS=α-Tok.>09 MS>07 MS>09 MS SS (Şekil 4.4.). 90,0 Süperoksit Anyon Radikali Giderme Aktivitesi (%) 80,0 70,0 60,0 50,0 40,0 30,0 20,0 10,0 0,0 09 MS 09 MS SS 07 MS 07 MS SS BHT BHA α-tokoferol Ekstrakt ve Standartlar Şekil 4. 3. Standart ve numunelerin % süperoksit anyon radikali giderme aktiviteleri 4.4. Total Antioksidan Aktivitenin Belirlenmesi Linoleik asit peroksidasyonunun temeline dayanılarak yapılan total antioksidan aktivite testi Mührüsüleyman bitkisinin kök kısmına uygulanmıştır. Belirli inkubasyon sürelerine karşılık ölçülen absorbans değerleri aşağıda Şekil 4.5 te verilmiştir. Ekstrelerimiz standartlarla karşılaştırıldığında sadece 07 MS ekstresinin total antioksidan aktiviteye sahip olduğu görülmüştür. Fakat diğerler ekstrelerin total antioksidan aktiviteleri düşük olduğu görülmüştür.

43 2,5 09 MS 09 MS SS 07 MS 07 MS SS BHT α-tok Kontrol Absorbans (500 nm) 2 1,5 1 0,5 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 İnkübasyon Zamanı (h) Şekil 4. 4. Mührüsüleyman bitkisinin total antioksidan aktivitesi 4.5. Total Fenolik Bileşik Tayini Mührüsüleyman bitkisine ait kök kısmının fenolik bileşik miktarı tayini yapılmıştır. Fenolik bileşiklerin tayininde gallik asit kullanılarak elde edilen kalibrasyon grafiği kullanılmıştır (Y=0,046X; R 2 :0,963). Fenolik bileşik miktar tayini Gallik aside eşdeğer gram olarak hesaplanmıştır. Çizelge 4. 1. Mührüsüleyman bitkisinin kök kısmının toplam fenolik bileşik miktarı Ekstre Adları Fenolik Bileşik Miktarı (mg Gallik aside eşdeğer/kg bitki) 09MS 1,58 09MS SS 1,26 07MS 1,80 07MS SS 1,35

44 4.6. Metal Şelatlama Aktivitesi Mührüsüleyman bitkisinin ekstraktları ve standartlar metal şelatlama aktivitesi Carter tarafından belirlenen metotla yapılmıştır. Metal şelatlama aktivitesi yüzdesine bakıldığı zaman 07 MS SS ekstresi standartlarla hemen hemen aynı aktiviteye sahip olduğu görülmüştür. Diğer ekstrelerinde bu aktiviteyi gösterdiği sonucuna varılmıştır. 09 MS 09 MS SS 07 MS 07 MS SS BHT BHA α-tokoferol 90 80 Metal Şelatlama Aktivitesi (%) 70 60 50 40 30 20 10 0 0 5 10 15 20 25 30 35 Konsantrasyon (µg/ml) Şekil 4. 5. Mührüsüleyman bitkisinin kök kısmının metal şelatlama aktivitesi

45 4.7. E Vitamini Tayini Y=(4391,289323) R 2 =0,997036 Şekil 4. 6. E vitamini kalibrasyon grafiği. Şekil 4. 7. E vitaninin farklı derişimlerdeki (10, 50, 250, 1000 ppm) kromatogramları

46 Çizelge 4. 2. HPLC pompa programı Zaman Akış hızı Asetonitril (%) Metanol (%) (dak) (ml/dak) 1. adım 20 1 50 50 2. adım 5 1 0 100 Dalga boyu: 295 nm Çizelge 4. 3.Mührüsüleyman bitkisinin kök kısmının vitamin E miktarı Ekstre Adları Vitamin E Miktarı (ppm) 09MS 166,89 09MS SS 0,003 07MS 67,36 07MS SS 0,0042 Mührüsüleyman bitkisinin kök kısmının vitamin E içeriği HPLC ile analiz edilmiştir. Elde edilen sonuçlara göre metanol/metilen klorürü ekstrelerinin hem 2009 hem de 2007 yıllarda toplanan bitkilerde vitamin E miktarı yüksek bulunurken her iki yıla ait su ekstrelerinde vitamin E çok az bulunmuştur. Bu bitki ile ilgili daha önce vitamin E analizi yapılmamıştır. Liu ve arkadaşları (2008) yaptıkları çalışmada Polygonatum cyrtonema lektininin apoptosis çalışmasında elde ettikleri sonuca göre P. cyrtonema lektininin apoptosisini tetiklediğini ve bunu da mitokondride üretilen reaktif oksijen türlerinin p38-p53 pathwayinde aktivitesini arttırarak bu işi yaptığını rapor etmişlerdir.buradan anlaşılan şu ki P. cyrtonema antioksidan değil proantioksidandır.

47 Jeon ve arkadaşları (2004) tarafından yapılan çalışmada yüksek kolestrol diyetle beslenen tavşanlarda Polygonatum kök bitkilerinin antioksidan savunma sistemleri üzerindeki etkileri çalışılmıştır.bu çalışmada yüksek kolestrol diyetle beslenen tavşanların bir grubuna vitamin E diğer gruba Polygonatum köklerinin ekstresi verilmiş ve katalaz, süperoksit dismutaz glutatyon peroksidaz, H 2 O 2 ve MDA analizleri yapılmıştır.katalaz aktivitesinin hem vitamin E hem de Polygonatum kökü ekstraktı verilen her iki grupta da karaciğer katalaz aktivitesini arttırmış iken SOD ve glutatyon peroksidaz aktivitelerini değiştirmemiştir.karaciğer mitokondriyal H 2 O 2 düzeyi vitamin E ve Polygonatum kökü ekstraktı verilen gruplar kontrol grubuyla karşılaştırıldığında H 2 O 2 miktarının kontrol grubundan daha düşük olduğu ve bu düşüşün istatistiki olarak anlamlı olduğu görülmüştür.bu çalışmada elde edilen sonuçlara bakıldığında Polygonatum kökü ekstraktının hiper kolestrollü diyetle beslenen tavşanlarda antioksidan savunma sistemi üzerinde pozitif bir etkisinin olduğu anlaşılmıştır.bu çalışma MDA seviyesiyle H 2 O 2 seviyesinin düşük olduğu görülmüştür.bu çalışma sonuçları bizim elde ettiğimiz çalışma sonuçları ile uyumlu değildir.bunun sebebi bizim çalışmamızda Polygonatum kökünün in vitro antioksidan aktivitesi incelenmiştir fakat Jeon ve arkadaşları Polygonatum kökü ekstraktını tavşanlara vererek tavşanlardaki antioksidan enzimler çalışılmıştır.aynı parametreler çalışılmadığı için farklı sonuçlar ve farklı yorumlar yapılabilir. Belki in vivo ortamda bu enzimlerin aktivitesinin artması antioksidan aktivitesi olmayan bileşiklerden de kaynaklanabilir.

48 5. SONUÇ Bu çalışmada Mührüsüleyman bitkisinin antioksidan kapasitesi, fenolik bileşik, toplam karotenoid miktarı ve vitamin E içerikleri analiz edilmiştir. Bu çalışmada bulunan sonuçlar değerlendirildiğinde aşağıdaki sonuçlar elde edilmiştir. 1- Mührüsüleymanın su ve organik çözücü ekstrelerinde serbest radikal (DPPH) giderme aktivitesi incelendiğinde bitkinin serbest radikal giderme aktivitesi göstermediği anlaşılmıştır. 2- Mührüsüleymanın su ve organik çözücü ekstrelerinde indirgeme gücü aktivitesi incelendiğinde elde edilen sonuçlar standartlarla karşılaştırıldığında aktivitenin yok denecek kadar az olduğu anlaşılmıştır. 3- Mührüsüleymanın su ve organik çözücü ekstrelerinde metal şelat oluşturma aktivitesi incelendiğinde 07 MS SS ekstresinin standartlara çok yakın olduğu, diğer ekstrelerinde bu aktiviteyi gösterdiği sonucuna varılmıştır. 4- Mührüsüleymanın su ve organik çözücü ekstrelerinde süperoksit anyon radikali giderme aktivitesi göstermiştir, özellikle 07 MS SS ekstresinin en yüksek aktiviteye sahip olduğu gözlenmiştir. 5- Mührüsüleymanın su ve organik çözücü ekstrelerinde total antioksidan aktiviteyi 07 MS MM ekstresi göstermiştir. 6- Mührüsüleymanın su ve organik çözücü ekstrelerinde total fenolik bileşik tayinine bakıldığı zaman organik çözücü ekstresinde fenolik bileşik miktarının su ekstresinden daha yüksek olduğu gözlenmiştir. Fakat sonuçların bütününe bakıldığı zaman bitkimizde fenolik bileşik miktarının az olduğu sonucuna varılmıştır. 7- Yapılan testlerin sonuçlarına bir bütün olarak bakıldığında Mührüsüleyman bitkisinin kök kısmının iyi bir antioksidan kapasiteye sahip olmadığı anlaşılmıştır. 8- Bu bitkinin kök kısımlarında başka kimyasal analizler ve diğer biyolojik aktivite testleri yapılabilir. Çünkü bu bitkinin kimyasal bileşenleri ve biyolojik aktivite testleri şimdiye kadar detaylı bir araştırma yapılmamıştır.

49 9- Bu çalışmada antioksidan aktivitesi bilinen vitamin E analizini HPLC ile toplam karotenoid miktarı analizi spektroskopik yöntemle yapılmıştır. Yapılan analizler sonucunda vitamin E miktarı az bulunmuştur. Toplam karotenoid miktarı analizi sonucuna bakıldığında 2009 yılına ait Mührüsüleyman bitki ekstresinde azda olsa olduğu tespit edilmiştir.

50 KAYNAKLAR Arnon, 1949 Copper Enzymes in isolated Chloroplast.Polyhenol_oxidase in Beta vulgaris. Plant. Physiol. 24,1_15 Akkuş, İ., (1995). Serbest Radikaller ve Fizyopatolojik Etkileri. Mimoza Yayınları, Konya. Al-İsmail, K. M., Talal, A., (2003). A Study of the effect of water and alcohol extracts of some. Bagchi, D., Krohn, R.L., Bagchi, M., (1997). Oxygen free radical scavenging abilities of vitamins C and E, and a grape seed proanthocyanidin extract in vitro. Research Comminications in Molecular Pathology and Pharmacology. 95: 179-189 Bagchi, D., Garg, A., Krohn, R.L., (1998). Protective effects of grape seed proanthocyanidins and selected antioxidants against TPA-induced hepatic and brain lipid peroxidation and DNA fragmentation, and peritoneal macrophage activation in mice. General Pharmacology-The Vascular System 30: 771-776 Baytop, T. (1999). Therapy with medicinal plants in Turkey (Past and Present). Nobel Tıp Kitapevleri, İstanbul. Belguendouz, L., Fremont, L., Gozzelino, M.T. (1998). Interaction of transresveratrol with plasma lipoproteins. Biochemical Pharmacology. 55: 811-816. Blois, M. S. (1958). Antioxidant determinations by the use of a stable free radical. Nature 26: 1199 1200. Burtis C. A., Ashwood E. R. (1999). Tietz Textbook of Clinical Chemistry. W.B. Saunders Company. Philadelphia, Pennsylvania. Clement, M.V., (1998). Chemopreventive agent resveratrol, a natural product derived from grapes, triggers CD95 signaling-dependent apoptosis in human tumor cells. Blood 92: 996-1002 Çavdar, C., Sifil, A., Çamsarı, T., (1997). Turkish Nephrology Association. Reactıve Oxygen Partıcles and Antıoxıdant Defence. Çinkılıç, S. (2009). Papatya (Matricaria chamomilla) İn Vitro Anioksidan Kapasitesi Dawn B. M., Allan D. M., Colleen M. S. (1996). Basic Medical Biochemistry a Clinical Approach. Lippincott Williams & Wilkins. Baltimore, Maryland. Dragland, S., Seneoo, H.,Wake, K., Holte, K., Blomhoff, R. (2003). Several culinary and medicinal herbs are important sources of dietary antioxidants. J Nutr, 133: 128-190. El-Agbar, Z.A., Shakya, A.k., Khalaf, N.A., Al-Haroon, M., (2008). Comparative antioxidant activity of some edible plants. 32(3): 193-196. Elmastaş M., Demirtaş I., Işıldak Ö., Aboul-Enein, H.Y. (2006). Antioxidant Activity of S-Carvone Isolated from Spearmint (Mentha Spicata L.). Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies, 29: 1465 1475. Elmastaş M., Öztürk L., Gökçe, I., Erenler, R., Aboul-Enein, H.Y., (2004). Determination of antioxidant activity of marshmallow flower (Althaea officinalis L.). Analytical Letters 37(9): 1859-1869. Gordon, M., Khatib, K., Billany. M.R., Sugden. J.K., (1996).Alcohols and ethanolamines as hydroxyl radical scavengers. İnternational Journal of Pharmaceutich, 137(2): 143-137.

51 Jeon, SM., Lee, MK., Park, YB., Park, HM., Choi, MS., 2004. Polygonatum rhizoma affects antioxidant defense systems without changing mrna expression in diet-induced hypercholesterolemic rabbits, Journal Of Medicinal Food 7 (3), 358-365. Lee, K.G., Shibamoto, T., (2002). Determination of antioxidant potantial of volatileextracts isolated from various herbs and spices. J Agric Food Chem 50: 4947-4952. Lis-Balcin, M., Deans, S.G., Eagleshame, M., (1998). Relationship betveen bioaktivity and chemical composition of commercial eccential oils.flavour Fragrance J 13: 98-104. Liu, B., Cheng, Y., Zhang, B., Bian, H.J., Bao, J-K., 2008. Polygonatum cyrtonema lectin induces apoptosis and autophagy in human melanoma A375 cells through a mitochondria-mediated ROS p38 p53 pathway, Cancer Letters, 275 (2009), 54 60. Mann, C., Staba, E.J., (1986). The chemistry.pharmocology,and commercial formilations of Chamomile.In Herbs,Spices,and Medicnal Plants:Recent Advances in Botany,Horticulture,and Pharmocology Volume 1,Craker LE,Simon JE(eds).Oryx Press;Phoenix, 235-280. Mccord, J., (1985). Oxygen derived free radicals in postischemic tissue injury.n Eng J Med 312:159-163. Mckay, D.L., Blumberg, J., (2006). A Review of the Bioactivity and Potential Health Benefitsof Chamomile Tea. Phytotherapy Research. 20: 519-506. Miguel, J., Fleming,J., (1982). Antioxidation,metabolic rate,and aging in Drosophila,Arch Geron Geriatr; 1-159 Mindell, E., (2003). Çeviren: Yeşim Özkardeşler Şallı. Anti-Aging Mucizesi Prestij yayınları. Mitsuda H., Yuasumoto K., Iwami K. (1996). Antioxidation action of indole compounds during the autoxidation of linoleic acid. Journal of Japanese Society of Food and Nutrition (Eiyo to Shokur). 19: 210 214. Owlia, P., Rasooli, I., Saderi, H., (2007). Research Journal of Biological Sciences. Antistreptococcal and Antioxidant. Research Journal of Biological Sciences 2 (2): 155-160. Oyaizu, M.(1986). Studies on products of browing reaction-antioxidative activities products browing reaction prepared from glucosamine. Japanese Journal of Nutrition. 44: 307-315. Öztürk,N., Tunalıer, Z., 2002. Antioksidan Etki ve fenolik Bileşikler, Anadolu Üniversitesi, Eskişehir. Öztürk ve Demir 2001 The effects of Vinasse one Sone Growth Paameters of Algae. Freseniss Environmental Bulletin; 10(10):766_771 Pierre, S., Crosbie, L., Duttaroy, A.K., (2005). İnhibitory effect of aqueous extracts of some herbs on human platelet aggregation in vitro.platelets 16:469-473.Plants as antioxidants and antimicrobial on long-term storage of anhydrous butter fat.dirasat Agric Sci 30:330-337.Products of German chamomile.medicina (Kaunas) 39: 127-131. Şengül, M., Yıldız, H., Güngör, N., Çetin, B., Eser, Z., Ercişli, S., 2009. Total Phenolic Content, Antioxidant and Antimicrobial ActivIties of Some MedicIinal Plants. Pakistan Journal of Pharmaceutical Sciences, 22 (1), 102-106.

Tietz, N.W., (1995). Clinical Guide to Laboratory Tests. W.B. Saunders Company. Philadelphia, Pennsylvania. Türk Gıda Kodeksi Yönetmeliği. Resmi Gazete, 16 Kasım 1997. 23172 52

53 ÖZGEÇMİŞ Kişisel Bilgiler Adı Soyadı : Elif AKTÜRK Doğum Tarihi ve Yer: Ordu 02.04.1982 Medeni Hali: Bekar Yabancı Dili: İngilizce Telefon : 05364900967 e-mail: polimer_52@hotmail.com Eğitim Derece Eğitim Birimi Mezuniyet Tarihi Yüksek Lisans Gaziosmanpaşa Üniversitesi 2008-2010 Lisans Gaziosmanpaşa Üniversitesi 2000-2007 Lise Ordu Atatürk Lisesi 1996-1999 İş Deneyimi Yıl Yer Görev 2007-2008 Ordu Vekil Öğretmenlik 2008-2009 Tokat Vekil Öğretmenlik