Biyoteknoloji ve Genetik I Hafta 12 Prokaryotlarda Gen İfadesinin Düzenlenmesi Prof. Dr. Hilal Özdağ A.Ü Biyoteknoloji Enstitüsü Merkez Laboratuvarı Tel: 2225826/125 Eposta: hilalozdag@gmail.com
Gen İfadesi Transkripsiyon Translasyon
Prokaryotik Hücre Nükleoid Bölge Ribozom Besin Granülü Flagellum Kapsül Hücre duvarı Plazmid DNA Sitoplazma Plazma membranı
Gen İfadesi 20. yy ın başından beri organizmaların metabolizmalarının nasıl düzenlediğine dair araştırmalar sürmektedir. Sınırlı bilgi ve teknolojinin varlığında başlayan bu araştırmalarda bakteriler en baştan beri (ve bugüne kadar) en iyi model organizmalar olmuştur. Gen ifadesine dair veriler öncelikle biyokimyasal analizlerden elde edilmiştir.
Gen İfadesi 1900 lerin başında bakterilerin ortamda laktoz varken gerekli enzimleri sentezlediğini, ortamda laktoz yokken bu enzimlerin sentezlenmediği tespit edilmiş ve bu durum adaptif (fakültatif) enzim kavramını ortaya çıkarmıştır. Bu enzimlere daha sonraları durumu daha iyi açıkladığı düşünülen indüklenebilir enzimler denmiştir. Sürekli sentezlenen enzimlere ise konstitütif denmektedir.
Gen İfadesi Araştırmalar en önemli sonuçlarını 1946 da Jacques Monod nun çalışmaları ile vermeye başlıyor. Ardından Joshua Lederberg, François Jacob ve Andre L woff un katkıları sürecin deşifre edilmesinde önemli rol oynuyor. Bu araştırmalarla şekillenen operon modelinde aynı süreçte beraber çalışan çalışan enzimleri kodlayan genler (poli sistronik) kümeler halinde organize olur.
Gen İfadesi Bu genler tek bir düzenleyici birim tarafından koordine edilir. Bu düzenleyici bölge düzenledikleri genlerin üst kısımlarında yer alır (cis-acting bölge). Bu bölgenin regülatör işlevi bu bölgeye bağlanan moleküllerin etkisi (trans-acting elements) ile devreye girer.
Operon www.nature.com
Operon
Operon
Gen İfadesi 1900 lerin başında bakterilerin ortamda laktoz varken gerekli enzimleri sentezlediğini, ortamda laktoz yokken bu enzimlerin sentezlenmediği tespit edilmiş ve bu durum adaptif (fakültatif) enzim kavramını ortaya çıkarmıştır. Bu enzimlere daha sonraları durumu daha iyi açıkladığı düşünülen indüklenebilir enzimler denmiştir. Sürekli sentezlenen enzimlere ise konstitütif denmektedir.
PCR ve DNA Dizi Analiz Öncesi Dönemde Araştırma Yaklaşımları Biyokimyasal bulgular Haritalama çalışmaları Mutant suşların oluşturulması ve fonksiyonel sonuçların irdelenmesi Sahte uyarıcıların bulunuşu (laktozun kükürtlü analoğu izopropiltiyogalaktozit_iptg) ile substrat olmaksızın uyarılma mekanizmasının çalışılmasını sağlamıştır.
PCR ve DNA Dizi Analiz Öncesi Dönemde Araştırma Yaklaşımları Regülatör bölgeler tanımlanırken yine mutantlardan ve haritalamadan yararlanılmıştır. Laktoz ortamda olmasa da enzimlerin sentezlenmesine yol açan mutasyonların bulunduğu bölgelerin (laci - ) yapısal genlerin yakınında ancak farklı bir bölgede olduğu tanımlanmıştır. laci geni baskılayıcı gen olarak adlandırılır.
PCR ve DNA Dizi Analiz Öncesi Dönemde Araştırma Yaklaşımları Benzer etki gösteren diğer konstitütif mutasyonların yine yapısal genlerin hemen yakınındaki operatör bölgede yer aldığı tespit edilmiştir (laco c ). E. coli hücresinde 10 kopyadan fazla bulunmayan baskılayıcı molekülün izolasyonu kolay olmamıştır. 1966 da Gilbert ve Müller-Hill bu molekülü kısmen saflaştırmış ve dansite gradient çalışması ile DNA ya bağlandığını da göstermişlerdir. 1996 yılında Lewis, Lu ve ark, baskılayıcı komplekslerin kristal yapılarını açıklayarak operon modelini yapısal olarak doğrulamışlardır.
Lac Operonu Yüksek ve konstitütif ifade Düşük glukoz Laktoz + Yüksek glukoz Laktoz - Düşük bazal seviyede ifade wikimedia.org Düşük glukoz Laktoz - Yüksek glukoz Laktoz +
Lac Operonu www.nature.com
Klonlamada Pratik Bir Belirteç Mavi Beyaz Seçimi
Klonlamada Pratik Bir Belirteç Mavi Beyaz Seçimi TA Klonlama lacz geni içinde çoklu klonlama bölgesi ve antibiyotik direnç geni içeren plazmid + PCR Ürünü Plazmidin ligasyon sonrası bakteri hücresine transformasyonu
Triptofan Operonu
Triptofan Operonu http://pathmicro.med.sc.edu/mayer/genreg7.jpg
Triptofan Operonu www.nature.com