KLONLAMA VEKTÖRLERİ DR. ONUR YILMAZ ADÜ ZİRAAT FAKÜLTESİ ZOOTEKNİ BÖLÜMÜ BİYOMETRİ & GENETİK ABD

Ebat: px

Şu sayfadan göstermeyi başlat:

Download "KLONLAMA VEKTÖRLERİ DR. ONUR YILMAZ ADÜ ZİRAAT FAKÜLTESİ ZOOTEKNİ BÖLÜMÜ BİYOMETRİ & GENETİK ABD"

Volkan Yakin
5 yıl önce
İzleme sayısı:

1 KLONLAMA VEKTÖRLERİ DR. ONUR YILMAZ ADÜ ZİRAAT FAKÜLTESİ ZOOTEKNİ BÖLÜMÜ BİYOMETRİ & GENETİK ABD

2 Vektörler, kendilerine eklenen yabancı DNA parçasını konakçı hücreye taşıyan ve burada çoğalmasını sağlayan küçük DNA parçalarıdır.

3 Kendini ve taşıdığı herhangi bir DNA parçasını bağımsız olarak replike edebilmelidir. Klonlanacak DNA parçasının insersiyonuna olanak tanıyan birçok tanıma dizisi içermelidir. ori

4 Vektörde seçicilik sağlayan marker genler bulunmalıdır. Bunlar, vektör taşıyan ve taşımayan konak hücreleri ayırmak için gereklidir. Bunlar; antibiyotik direnç genleri ya da koloni rengini değiştirecek genler olabilir. Vektör ve vektörün taşıdığı DNA parçası konaktan kolaylıkla ayrıştırılabilmelidir.

5 Plasmidler Bakteriyofajlar Cosmidler Bakteri Yapay Kromozomları (BAC) Maya Yapay Kromozomları (YAC) Memeli Yapay Kromozomları (MAC) İnsan Yapay Kromozomları (HAC) İfade Vektörleri

6 Günümüzde en sık kullanılan vektörler Plasmid Bakteriyofaj Cosmid Yapay Kromozomal vektörlerdir

7 Joshua Lederberg ( ) Professor of genetics at the University of Wisconsin. Conducts research in the genetics of E. coli and Salmonella as well as on antibody formation. Discovers and names plasmids, particles of DNA in bacterial cells that replicate separately from chromosomal DNA

8 Plasmid, çoğu bakteri türünde doğal olarak bulunan, Bağımsız olarak replike olabilen, Bakterinin kendi kromozomu dışındaki çift zincirli halkasal veya süper sarmallı DNA molekülleridir.

9 Plazmid varlığı genellikle bulunduğu bakteriye avantaj sağlar. Bunlar; antibiyotiklere, ağır metallere ve olumsuz çevre şartlarına direnç sağlayan genleri taşıyabilir.

10 Klonlama vektörleri olarak kullanılan ilk plazmidler 1970 li yıllarda kullanılan ve E. coli de doğal olarak bulunan bakteriyel plazmidlerdi.

11 Klonlanmak istenen DNA fragmanını, plazmid vektöre aktarmak için restriksiyon enzimleri kullanılır. yabancı DNA segmenti hedef DNA fragmanı aynı restriksiyon enzimi ile kesim hedef DNA nın plazmid vektöre aktarılması rekombinant plazmid Plazmid vektör

12 Restriksiyon enzimleri ile kesilerek doğrusal hale getirilen plazmid ile aynı yapışkan uçlara sahip yabancı DNA fragmanı birbirlerine kolayca tutunur ve birlikte tekrar halkasal forma dönerler. EcoRI Yapışkan uçlar

13 Her restriksiyon enzimi yapışkan yapışkan uçlar üretir mi?

14 DNA ligaz enzimi, plazmid DNA'sı ile hedef DNA fragmanının birbirlerine kovalent olarak sıkı bir şekilde bağlanmasını sağlar. hedef DNA fragmanı DNA ligaz rekombinant plazmid

15 Oluşturulan rekombinant DNA kendisini alabilecek ve replikasyonuna olanak sağlayacak uygun bir alıcı hücreye aktarılır.

16 pbr322 plazmidinin alıcı hücresi bu plazmidlerin ait olduğu E. coli pub110 plazmidi için uygun alıcı hücre Bacillus subtilis 'tir.

17 ori Amp R ori Amp R. Plazmidi alamayan E. coli ölür Plazmid vektör + DNA fragmanının Plasmid vektöre eklenmesi Rekombinant plazmid E.coli ile plazmid CaCl2 ve ampisilinli nütrient agarda inkübasyon Plazmidi alan E. coli yaşar Klonlanacak DNA fragmanı Plazmidin replikasyonu üreme

18 Yabancı DNA fragmanı, direnç genlerinden birini kodlayan bölge içerisine yerleştirilirse, bu direnç geni insersiyonel olarak inaktive olur. DNA fragmanlarının plazmide bağlanması

20 puc18 plazmid vektörü ampisilin direnç genine ve β- galaktozidaz enzimini kodlayan lacz gen bölgesine sahiptir. Bu plasmidi barındıran E.coli ler ampisilin ve X gal içeren besi yerinde üreyerek mavi renk verirler. Hedef DNA nın bu bölgeye eklenmesi bu genin transkripsiyonunu durdurur.

21 Bu durumda E.coli kolonileri beyaz renkte olacaktır Ap dirençli, lac negatif beyaz koloni RE ile kesim DNA fragmanlarının plazmide bağlanması Ap dirençli, lac pozitif mavi koloni

22 Mavi-beyaz tarama yönteminde kullanılan puc serisi plazmidler aynı zamanda çoklu klonlama bölgesine sahiptirler.

23 Bu tür vektörler, alıcı hücre tarafından aktive edilebilecek promotor bölgelerini de taşırlar. Böylece plazmidin ekspresyon şansı arttırılmış olur.

25 Bakterileri enfekte eden virüslerdir. Tüm virüsler gibi basit bir yapıya sahiptirler. Genellikle baş, boyun, kuyruk ve kuyruk fibrillerinden oluşmakla birlikte filamentöz yapıda olanları da vardır

26 Bakteriyofajlar, enfekte ettikleri bakteride litik ve lizojenik olmak üzere iki farklı hayat döngüsüne sahiptirler Litik Lizojenik λ-dna profaj

27 En çok çalışılmış bakteriyofajlardan birisi E. coli ye ait lambda (λ) bakteriyofajıdır.

28 Bakteriyofaj DNA sının her iki ucunda (5 uçlarında) 12 bazlık ve birbirinin tamamlayıcısı olan nükleotid dizileri mevcuttur. Bu uçlar tıpkı restriksiyon enzimi kesimi sonucu oluşan yapışkan uçlara benzer (cos-cohesive end) λ Faj Genomu cos cos

29 Bu yapışkan uçlar sayesinde doğrusal yapıda olan faj genomu, bakteri hücresine girdiğinde halkasal hale gelir. Bağlanma bölgesi, plazmidlerde olduğu gibi ligaz enzimleri sayesinde onarılır. Konak genomu Halkasal faj genomu

30 Bakteriyofaj genomuna eklenecek hedef DNA nın büyüklüğü en fazla 20 kb kadar olabilir.

32 Kosmid vektörler, bir bakteriye ait ve replikasyon orijin bölgesine sahip plasmidle, buna birleştirilmiş lambda fajı yapışkan ucundan (cos, cohesive ends) oluşturulmuşlardır

33 35-40 kb uzunluğunda yabancı bir DNA fragmanını kabul edebilir ve alıcı hücreye aktarabilir. Restriksiyon enzimiyle kesim ve hedef DNA fragmanı ile ligasyondan sonra oluşan DNA, λ faj partiküllerine paketlenir. MCS cos Yabancı DNA fragmanı Amp r kozmid Ori Amp r MCS cos ori Amp r cos ori

34 Daha büyük DNA parçalarının (1 Mb dan daha fazla) klonlanmasına olan ihtiyaç duyulması yapay kromozom vektörlerinin geliştirilmesine neden olmuştur. İlk olarak Saccharomyces cerevisiae da geliştirilmiştir. Bu mayanın genomu temel alınarak inşa edilen rekombinant kromozomlar (yeast artifical chromosomes,yac s). Önceleri genetik inceleme için Daha sonra çok büyük DNA parçalarının klonlanmasında kullanılmıştır:

35 Yapay kromozomlarda maya genomuna ait telomer, sentromer, otonom olarak çoğalan diziler (ARS) izole edilmiş ve plazmid üzerinde birleştirilmiştir.

36 Bakteriyel yapay kromozomlar YAC lardan daha küçük DNA fragmanları ( kb) taşıyabilen klonlama vektörlerdir. Buna rağmen çok önemli bazı avantajlara sahiptirler. YAC lar, kararsız bir yapıya sahip olduklarından çoğalma sırasında taşıdıkları DNA fragmanlarını kaybedebilmektedirler. Bakteriyel yapay kromozomlar ise hem oldukça kararlı bir yapıya sahiptirler hem de E. coli gibi çok hızlı ve kolaylıkla üreyen bir bakterinin tranformasyon kolaylığına sahiptirler.

Benzer belgeler

VEKTÖRLER Halime Nebioğlu

VEKTÖRLER Halime Nebioğlu İstanbul Üniversitesi Gen klonlamasında kullanılan aracı moleküllere vektör denir. Vektörler konakçı organizmada, konakçı organizmadan bağımsız olarak replikasyon (çoğalma) gösterirler.