3M PETRİFİLM E.KOLİ/KOLİFORM SAYIM PLAKALARI 3M Petrifilm E.Koli/Koliform Sayım Plakaları hem E.Koli, hem de diğer koliformların tespiti için dizayn edilmiştir. Basit bir tek testle 24 ila 48 saat içerisinde sonuçlar elinize ulaşabilmektedir. Bu yöntem klasik metoda göre bir çok gereklilikleri ortadan kaldırdığından büyük kolaylık ve ekonomik avantaj sağlar. 3M petrifilm plakalarıyla analiz yapma, ekipman, işlenmemiş gıda, son ürün ve üretim ortamının kontrol edilmesi için gerekli en uygun ve kullanışlı yöntemdir. İş gücü tasarrufu ve diğer avantajları sayesinde kritik kontrol noktalarının denetlenmesi daha sık olarak yapılabilmekte ve bu durum ürün kalitesinin artmasında doğrudan etkili olmaktadır. Genel Özellikler: > Bir plaka ile iki test Escherichia coli ve coliform sayımı. > E.Coli'yi saptamak için beta-glucuronidase göstergesi içerir. > Sonuçlar 24-48 saat içinde alınır. 3M Petrifilm E.Koli Koliform Sayım Plakaları Ürün Kodu: Ambalaj Şekli: 0 6404 50 adet/paket 0 6414 500 adet/paket Analiz Süresi: 35 C'de 48 saat (24 saat sonra Coliform sayılabilir) 3M PETRİFİLM E.KOLİ VE KOLİFORM SAYIM PLAKALARI YORUMLAMA KILAVUZU! Bu kılavuz, 3M Petrifilm E. Koli ve Koliform Sayım Plakaları'nın sonuçlarını yorumlamanıza yardımcı olmak üzere hazırlanmıştır. Ayrıntılı bilgi için lütfen size en yakın 3M Mikrobiyoloji Ürünleri temsilcisine danışınız. Petrifilm EC plakalarında VRB besinleri, soğuk suda eriyen jel bileşeni, glükoronidaz faaliyet göstergesi BCIG ve kolonilerin sayılmasını sağlayan tetrazoliyum göstergesi bulunmaktadır. Üst tabaka, laktozu fermente eden koliformların ve E. Coli'nin ürettiği gazı tutar. Hem inkübasyon süresi ve sıcaklığı, hem de Petrifilm EC plakalarını yorumlama, seçilen yönteme göre değişir. Bu nedenle, biraz farklı sonuçlar elde edilebilir. En yaygın yöntemlerde kullanılan inkübasyon sıcaklıkları, paket içindeki prospektüste belirtilmiştir, örnekler bu kılavuzun teknik bölümünde verilmiştir. Köpük barajındaki kolonileri saymayın, çünkü bunlar ortamın seçme etkisinden ötürü yok olur. Laboratuvarda genelde uygulanan süreye ve sıcaklığa uyun. E.Koli ve koliform için en yaygın olarak kullanılan sıcaklıklar: 35, 37, 42, 44 veya 44.5 C, süre 24-48 saat. Şekil 1: Gaz üreten koloni sayısı: 4 E.Koli: E.Koli, Mor Kırmızı Safra (VRB) besinleri içeren ortamlarda ürer. E.Koli'lerin çoğu (yaklaşık %97'si) beta-glükoronidaz içerir.bu madde Petrifilm EC plakasında bulunanbcig gösterge boyası ile reaksiyona girer, sonuçta koloni mavi veya kırmızı-mavi renge dönüşür. E.Koli'lerin yaklaşık %95'i laktozdan gaz üretir, bu durum sıkışan gazın içinde (yaklaşık bir koloni çapı içinde) görülen kolonilerle gösterilir. Bkz. Daire l. E.Koli kolonileri mavi
veya kırmızı-mavi renk ile gösterilir ve gaz üretir, gaz içermeyen mavi veya kırmızı-mavi kolonileri sayın. Bkz. Daire 2. Bazı validasyon işlemlerinde bu yorumlama yöntemi değiştirilmiştir: AOAC, AFNOR, NMKL ve EMMAS kuruluşları, belirli bazı koşullar altında Petrifilm EC plakalarının kullanılması için validasyon veya değerlendirme vermiştir. Bkz. sayfa 2 ve 3. Not Çoğu E.coli 0157:H7 türleri olağandışıdır, > 44.5 C sıcaklıkta üremezler, glükoronidaz negatiftir, bu nedenle mavi çökelti oluşturmazlar. Bunlar E.coli olmayan koliformlar (kırmızı renkli, gazlı) olarak görülür. Koliformlar: Petrifilm EC plakaları, koliformları saymak için de kullanılabilir. ISO standartlarında, koliformlar yönteme özgü belirli bazı ortamlarda çoğalan bakteriler olarak tanımlanmaktadır. ISO 4832 yönteminde koliformlar koloni sayım tekniği uygulanarak sayılır, koloninin büyüklüğüne ve laktoz (VRBL) ağar ile VRB üzerinde asit üretimine dayanılarak saptanır. Söz konusu asit üreten koliformlar, Petrifilm EC plakalarında gaz içeren ya da içermeyen kırmızı koloniler (yaklaşık bir koloni çapı içinde) halinde gösterilir. Bkz. 3 no.lu daire. ISO 4831 yönteminde ise koliformlar En Olası Sayı (MPN) yöntemi ile sayılır, çoğalma oranına ve belirli bir et suyu içinde laktozdan gaz üretme özelliklerine dayanılarak saptanır. Petrifilm EC plakalarında bu koliformlar gaz ile bağlantılı kırmızı koloniler (yaklaşık bir koloni çapı içinde) halinde gösterilir. Bkz. 4 no.lu daire. AOAC INTERNATIONAL ile A.B.D. Gıda ve İlaç Dairesi tarafından hazırlanan Bakteriyolojik Analitik Kitabı'nda (BAM) koliformlar şu şekilde tanımlanmaktadır: Metabolik fermantasyon sırasında laktozdan asit ve gaz üreten gramnegatif çubuk bakteriler. Petrifilm EC plakasında üreyen koloniler asit üretir, bu asit jel rengini koyulaştırır. Koliform kolonileri çevresinde kalan gaz (yaklaşık bir koloni çapı içinde), koliformları gösterir. Bkz. 4 no.lu daire. 3M Petrifilm E.coli ve Koliform Sayım Plakaları Şekil 2: Çoğalma yok E.coli sayısı = O Geri planda kabarcıklar olması jelin özelliğidir, E.coli veya koliform çoğalmasının sonucu değildir. Geri plandaki gaz kabarcıkları küçük ile iğne başı kadar arasında değişir, biçimleri düzensizdir, bunlara bağlı koloniler yoktur. Bkz. l no.lu kare. Şekil 3: E.coli sayısı = 13 Gaz üreten koliform sayısı: 28 VRB ağar plakalarında olduğu gibi, Petrifilm EC plakaları için tavsiye edilen sayım alanı (toplam koloni nüfusu) 15-150 arasıdır. Köpük barajında meydana gelen kolonileri saymayın, çünkü bunlar ortamın seçici etkisiyle yok olur. Bkz. l no.lu daire.
Şekil 4: E.coli sayısı = 3 Kolonideki tüm mavi renkler (maviden kırmızımaviye kadar), E.coli varlığını gösterir. Kolonilerin oluşturduğu mavi çökeltiyi görmek için önden aydınlatma gerekebilir. l no.lu daire, arkadan aydınlatma yapıldığında görülen kırmızı-mavi koloniyi göstermektedir. 2 no.lu daire, aynı koloninin önden aydınlatma yapıldığında nasıl göründüğünü göstermektedir. Bu durumda mavi çökelti daha belirgin görünmektedir. Şekil 5: E.coli sayısı = 20 Yaklaşık toplam sayı: 150 Petrifilm EC plakasının yuvarlak çoğalma alanı yaklaşık 20 cm2 yüzölçümündedir. 150'den fazla koloni içeren plakalarda yaklaşık sayım yapılabilir, bunun için bir veya daha fazla kare içindeki kolonileri sayın ve kare başına ortalama sayıyı hesaplayın. Sonra bu ortalama sayıyı 20 ile çarpın, böylece Petrifilm EC plakası başına yaklaşık sayı bulunur. Sayımı doğru yapabilmek için numuneyi tekrar sulandırmanız tavsiye edilir. Sayılamayacak Kadar Çok (TNTC) Plakalar Sayımı doğru yapabilmek için numuneyi tekrar sulandırmanız tavsiye edilir. 6 Şekil 6: Sayı ~10 8 Şekil 7: Sayı - 10 Sayılamayacak kadar çok koloniler bulunan Petrifilm EC plakalarında aşağıda belirtilen özelliklerinden biri veya birkaçı bulunur: Çok sayıda küçük koloni, çok sayıda gaz kabarcığı, jel renginin koyulaşarak kırmızıdan mor-maviye dönüşmesi. Yüksek konsantrasyonda E.coli bulunduğu için üreme alanının rengi mormaviye dönüşür.
8 Şekil 8: Sayı ~ 10 Yüksek konsantrasyonda koliformlar (E.coli değil), üreme alanının rengini koyu kırmızıya dönüştürür. E.coli bulunup bulunmadığını belirlemek için tekrar sulandırmak gerekir. 8 Şekil 9: Sayı ~ 10 Pseudomonas gibi koliform olmayan organizmalar çok sayıda varsa, Petrifilm EC Plakalarındaki jelin rengi sarıya dönüşebilir. Gıda maddeleri tanecikleri düzensiz biçimlidir, gaz kabarcıkları ile bağlantılı değildir. Bkz. l no.lu daire. Şekil 11'de kabarcık biçimlerinin nasıl farklı olabildiği görülmektedir. Bazen gaz koloniyi dağıtır, bu nedenle koloni kabarcığı çevreler. Bkz. l ve 2 no.lu daireler. Petrifilm EC plakasına yanlış aşılama yapılırsa veya numune içinde kalmış hava varsa, farklı biçimlerde kabarcıklar oluşabilir. Bunlar düzensiz biçimlidir, koloniler ile bağlantılı değildir. Bkz. 3 no.lu daire. Köpük barajında oluşan kolonileri saymayın, çünkü bunlar ortamın etkisi ile yokolur. Kabarcıklar Koloni ile bağlantılı çeşitli kabarcık şekillerinin örnekleri gösterilmiştir. Bunların tümü sayılmalıdır
3M PETRİFİLM E.KOLİ/KOLİFORM SAYIM PLAKALARI KULLANIM NOTLARI! Uyarılar, sınırlı garanti, sınırlı haklar, depolama ve imha konularında ayrıntılı bilgi ve Kullanım Talimatları için ürün prospektüsüne bakınız. DEPOLAMA 1Açılmamış paketleri < 8 C sıcaklıkta dondurun veya buzdolabında saklayın. Paket üzerinde belirtilen kullanım tarihine uyun. 2 Açılmış paketi tekrar kapatmak için kenarı üzerine katlayın ve bantla yapıştırın. 3 Açılıp kapatılmış paketleri < 25 C sıcaklıkta ve < %50 bağıl nemde saklayın. Açılmış paketleri buzdolabına koymayın. Petrifilm plakalarını paketi açmanızdan itibaren bir ay içinde kullanın. NUMUNE HAZIRLAMA 4 Gıda maddesini tartarak veya pipet ile alarak uygun bir steril kutunun (örneğin sindirim torbası, sulandırma şişesi, Whirl-Pak torbası vb.) içine koyun. 5 Aşağıda belirtilen steril sulandırıcılardan birini uygun miktarda ekleyin: Butterfield fosfat tamponu (IDF fosfat tamponu, KH^PC^, 0.0425 g/l, ph 7.2), %0.1 pepton suyu, Pepton tuzu sulandırıcı (ISO yöntemi 6887), tuzlu su eriyiği (%0.85-0.90) veya arıtılmış su. Sitrat, bisülfit veya thiosülfat içeren tamponlar kullanmayın. Bunlar çoğalmayı engelleyebilir. Sulandırılmış numuneyi ph 6.6-7.2'ye ayarlayın: Asit ürünleri için NaOH l N kullanın Alkalin ürünleri için HC1 l N kullanın. 6 Numuneyi ilgili işleme göre karıştırın veya homojen yapın.
İNOKÜLASYON 7 Petrifilm plakasını düz bir yüzeye koyun. Üstteki tabakayı kaldırın. 8 Bir pipeti Petrifilm plakasına dikey şekilde tutarak 1 ml. numuneyi alt tabakanın ortasına koyun. 9 Üst tabakayı dikkatle aşağı çekerek yapıştırın, içinde hava kabarcığı kalmamasına dikkat edin. Üst tabakanın aniden düşmemesine dikkat edin. 10 Yayıcıyı düz tarafı aşağı bakacak şekilde üst tabakada inokülüm üstüne yerleştirin. 11 Yayıcıyı elinizle bastırın ve jel oluşmadan önce numuneyi yuvarlak alanın üzerine dağıtın. Yayıcıyı bükmeyin, kaydırmayın. 12 Yayıcıyı kaldırın. En az 1 dakika süreyle jelin katılaşmasını bekleyin.
İNKÜBASYON YORUMLAMA 13 Plakaları şeffaf yanları yukarı bakacak şekilde ve üst üste en fazla 20 tane olacak şekilde inkübe edin. Inkübasyon süresi ve sıcaklığı, kullanılan yönteme göre değişir. En çok kullanılan onaylı yöntemler: 14 Petrifilm plakaları, standart koloni sayma aleti veya ışıklı büyülteç ile sayılabilir. Sonuçları yorumlamak için bkz. "Yorumlama Kılavuzu" başlıklı bölüm. 15 Kolonileri analiz etmek için ayırmanız gerekebilir. Üst tabakayı kaldırın ve koloniyi jelden çıkarın. AOAÇ Resmi Yöntemi 991.14: Koliform için 35 C ± 1 C sıcaklıkta 24 + 2 saat süreyle inkübe edin; E.coli için 35 C ± 1 C sıcaklıkta 48 ± 2 saat süreyle inkübe edin. AFNOR validasyonlu yöntemi 3M 01/4-09/92: E.coli için 42 C ± 1 C sıcaklıkta 24 ± 2 saat süreyle inkübe edin. Inkübasyon sırasında meydana gelecek nem kaybını en aza indirmek için inkübatörü nemlendirmek gerekebilir. NMKL Yöntemi 147.1993: Koliform için 37 C + 1 C sıcaklıkta 24 + 2 saat süreyle inkübe edin; E.coli için 37 C ± l'c sıcaklıkta 48 ± 2 saat süreyle inkübe edin, Bkz. ürün prospektüsü. Ek Tavsiyeler:Petrifilm plakalarını birer birer aşılayın ve yayın.inkübasyon süresi ve sıcaklığı, uygulanan yönteme göre değişir; bkz. ürün prosp.ektüsü.