B ProbeTec ET Mycobacterium tuberculosis Complex Kompleksi (DTB) Direkt Tespit Reaktif Paketi

B ProbeTec ET Mycobacterium tuberculosis Complex Kompleksi (DTB) Direkt Tespit Reaktif Paketi 3300759JAA(04) 2015-07 Türkçe KULLANIM AMACI BD ProbeTec ET Sistemi ile birlikte kullanılan BD ProbeTec ET Mycobacterium tuberculosis Kompleksi (DTB) Direkt Tespit Reaktif Paketi, Mycobacterium tuberculosis kompleks DNA sının sputa, indüklenmiş sputa, respiratuar yıkamalar ve diğer respiratuar örnekleri gibi dekontamine edilmiş, dijeste klinik solunum yolu örneklerinin içinden doğrudan ve kalitatif olarak tespit edilmesi için Zincir Ayrıştırma Amplifikasyonu (SDA) sağlar. BD ProbeTec ET Mycobacterium tuberculosis Kompleksi (DTB) Direkt Tespit Testi, tüberkülozu olduğu düşünülen tedavi edilmemiş hastalardan elde edilen örneklerin değerlendirilmesi amacıyla doğrudan test uygulaması gerçekleştirmek için kullanılır. Tedavi edilmemiş hastalar şu şekilde sınıflandırılır: (1) anti-tüberküloz tedavisi uygulanmamış hastalar; (2) bu tipteki bir tedavinin son 12 ay içinde uygulanmadığı hastalar veya (3) tedavinin 7 günden kısa bir dönem süresince uygulanıldığı hastalar. ÖZET VE AÇIKLAMA Dünya nüfusunun yaklaşık üçte birlik kısmı Mycobacterium tuberculosis taşımaktadır ve %10 luk bölümü hayatlarının bir döneminde hastalığı geliştirme riskine sahiptir. 1,2 Dünya çapında yılda yaklaşık 3 milyon insanın ölümüne neden olan tüberküloz, ölüme sebebiyet veren bulaşıcı hastalıklar arasında ilk sırada yer alır. 1,3 M. tuberculosis organizmasının yavaş çoğalma özelliği klinik tanılama ve tedavi süreçlerini geciktirir ve bu da hastalığın yayılmasına katkıda bulunur. ABD deki Hastalık Kontrol ve Önlenme Merkezleri, laboratuvarların tanısal mikobakteri testlerinde en hızlı yöntemleri kullanabilmeleri için gerekli olan her türlü çabanın gösterilmesini önermiştir. 3 DNA amplifikasyon teknikleri (SDA gibi), klinik örneklerdeki M. tuberculosis kompleks DNA sının hızlı bir şekilde tespit edilmesine olanak tanır ve böylece daha hızlı bir tıbbi müdaheleyi mümkün kılar. The Mycobacterium tuberculosis kompleksi (DTB) reaktif paketi, BD ProbeTec ET Sistemi ile birlikte kullanılır. Test sistemi amplifikasyon yöntemi olarak homojen SDA teknolojisini, Mycobacterium tuberculosis kompleksinin dekontamine edilmiş, dijeste respiratuar örneklerden (NALC-NaOH sedimentleri) doğrudan tespit edilmesi için de floresan enerji transferini (ET) kullanır. Mycobacterium tuberculosis kompleksi; M. tuberculosis, M. bovis, M. bovis BCG, M. africanum, ve M. microti den oluşur. 4,5 PROSEDÜR İLKELERİ BD ProbeTec ET Mycobacterium tuberculosis Kompleksi (DTB) Testi, amplifikasyon primerleri ve floresan etiketli dedektör sondasını kullanarak hedef DNA nın eş zamanlı amplifikasyonu ile tespitini temel almaktadır. 6-8 SDA reaktifleri tek kullanımlık iki ayrı mikro kuyucukta kurutulmuştur. İşlenen NALC-NaOH sedimenti, amplifikasyon primerlerini, floresan etiketli detektör sondasını ve amplifikasyon için gerekli diğer reaktifleri içeren Hazırlama İşlemi Mikro Kuyucuğuna eklenir. İnkübasyondan sonra, reaksiyon karışımı SDA için gerekli iki enzimi (DNA polimeraz ve restriksiyon endonükleaz) içeren Amplifikasyon İşlemi Mikro Kuyucuğuna aktarılır. Amplifikasyon İşlemi Mikro Kuyucukları kontaminasyonu önlemek için kapatılır ve reaksiyonun amplifiye ürünlerin oluşumu açısından izlendiği, ısıl olarak kontrol edilen floresan okuyucularda inkübe edilir. Her reaksiyon, bir Dahili Amplifikasyon Kontrolünü (IAC) koamplifiye eder ve tespit eder. Bu kontrolün amacı amplifikasyon reaksiyonun doğruluğunu onaylamak ve işlenen örnekteki potansiyel inhibisyonun tespit edilmesini sağlamaktır. Sonuçlar bir algoritma yoluyla pozitif, negatif veya belirlenemeyen olarak raporlanır. REAKTİFLER VE MATERYALLER Her BD ProbeTec ET Mycobacterium tuberculosis Kompleksi (DTB) Direkt Tespit Reaktif Paketi şunları içerir: DTB Hazırlama İşlemi Mikro Kuyucukları, 3 x 32: 4 Oligonükleotidler 7,6 pmol; dntp 37.6 nmol; Detektör sondaları 30 pmol; Sentetik Oligonükleotid 10.500 kopya DTB Amplifikasyon İşlemi Mikro Kuyucukları, 3 x 32: Restriksiyon enzimi 25,5 ünite; DNA Polimeraz 8 ünite; dntps 10 nmol Aksesuarlar: 10 Muhafaza, 8 Atık Çantası, 16 Kilit Her BD ProbeTec ET Mycobacterium tuberculosis Kompleksi (DTB) Direkt Tespit Reaktif Paketi şunları içerir: DTB Yıkama Tamponu 1 - üre içeren 225 ml lik solüsyon; CAPS Tamponu; dimetil sülfoksit; gliserol ve sodyum hidroksit; DTB Lizis Tamponu 2 50 ml lik potasyum hidroksit solüsyonu; DTB Nötralizasyon Tamponu 3 - bisin içeren 150 ml lik solüsyon, potasyum hidroksit, dimetil sülfoksit, gliserol ve %0,03 Proclin (koruyucu). Her BD ProbeTec ET Mycobacterium tuberculosis Kompleksi (DTB) Direkt Tespit Reaktif Paketi şunları içerir: DTB Pozitif Kontrolü - kurutulmuş somon testis DNA sı 5 µg ve reaksiyon başına 750 kopya sentetik oligonükleotid toplamda 5250 kopya. DTB Negatif Kontrolü - kurutulmuş somon testis DNA sı 5 µg. Cihaz, ekipman ve sarf malzemeleri: BD ProbeTec ET cihazı ve cihaz plağı, BD ProbeTec ET Hazırlama ve Isıtma İşlemi Isıtıcısı, BD ProbeTec ET Fırın veya örneği minimum 30 dakika ve maksimum 35 dakika için 101 C ± 1 C ye ısıtabilen genel amaçlı laboratuvar fırın, BD ProbeTec ET Sonik Banyo ve sonik banyo eki, BD ProbeTec ET Pipetör ve güç kaynağı, 2 ml lik Örnek Tüp Rafı, Temizleme Pipet Rafı, 2 ml lik Örnek Tüpleri ve Kapakları, 2 ml lik Kapaklar ve BD ProbeTec ET Aksesuar Kiti, CultureSwab EZ Swabları. 1

Gerekli Fakat Sağlanmamış Malzemeler: 12.200 x g kapasiteli aerosol içeren ve standart rotorlarla beraber Mikrosantrifüj (Eppendorf Model 5417C Mikrosantrifüj gibi), vorteks karıştırıcı, tek kullanımlık eldivenler, 100 µl, 500 µl, 600 µl ve 1 ml lik aerosole dayanıklı uçlu pipetler, %1 (v/v) sodyum hipoklorit ve Alconox*, 3 DTB Tampon aktarımını saklayabilecek kapasitedeki steril kaplar, zamanlayıcı, tüberkülosidal dezenfektan, absorban pedler/gazlı bez, kalibre edilmiş termometre. * %1 (h/h) sodyum hipoklorit çözeltisinin 1 litresine 7,5 g Alconox ekleyin ve karıştırın. Her gün yenisini hazırlayın. Saklama ve İşleme Gereklilikleri: DTB Reaktif Paketleri 2 33 C de saklanabilir. Son kullanım tarihi geçen açılmamış Reaktif Paketlerini kullanmayın. Açılan bir torba mikro kuyucuklar uygun şekilde kapatıldıkları sürece 4 hafta boyunca veya daha önce geliyorsa son kullanma tarihine kadar stabildir. Dondurmayın. DTB işlem reaktifleri 2 33 C de saklanabilir. Son kullanma tarihi geçen reaktifleri kullanmayın. Dondurmayın. DTB Kontrolleri 2 33 C de saklanabilir. Son kullanma tarihi geçen Kontrolleri kullanmayın. Dondurmayın. UYARILAR VE ÖNLEMLER: In vitro Diyagnostik Kullanım içindir. 1. M. tuberculosis kompleksinin kan, CSF, dışkı veya idrar gibi örnekleri içeren ancak bunlarla sınırlı olmayan non- respiratuar örneklerden tespit edilmesi için uygulanan bu testin performansı belirlenmemiştir. BD ProbeTec ET DTB Testinin performansı, bu ambalaj ekinde açıklananların dışında kalan yöntemlerle işlenen örnekler için değerlendirilmemiştir. 2. Isıtmayı durdurma aşamasında yer alan çalışma ve işleme adımları, bir Sınıf II Biyolojik Güvenlik Kabininde (Class II Biological Safety Cabinet - BSC) gerçekleştirilmelidir. Isıtmayı durdurma aşamasından önceki örnek santrifüjü yalnızca aerosol içeren rotor kullanılarak gerçekleştirilmelidir. Aerosol içeren rotor yalnızca BSC içinde açılmalıdır. Isıtmayı durdurma aşamasından sonra BSC dışında gerçekleştirilen örnek santrifüjü için yalnızca standart rotoru kullanın. 3. İşlenen tüm örneklere, tuberculosis den (MOTT) başka bir mikobakteri varlığı olup olmadığını belirlemek için kültivasyon ve antimikobakteriyel duyarlılık testi uygulayın, M. tuberculosis kompleksinin alttürlerini tespit edin ve/veya viabiliteyi değerlendirin. 4. Örneklerde Hepatit B virüsü ve İnsan İmmün Yetmezlik Virüsü (HIV) de dahil olmak üzere patojenik mikroorganizmalar bulunabilir. Bu yüzden, örnekler enfeksiyonmuş gibi yerleşik laboratuvar prosedürleri 9,10,11 ve/veya kurumsal düzenlemeler kullanılarak işlenmelidir. 5. Farklı lot numaralarına sahip kitlerdeki Mikro Kuyucukları, Kontrolleri veya işlem tamponlarını birbirleriyle değiştirmeyin veya karıştırmayın. 6. Kullanılmış pipet uçlarını, örnek tüplerini, Hazırlama muhafazalarını ve diğer tek kullanımlık malzemeleri atarken belirlenen laboratuvar uygulamalarını kullanın. 7. İşlenmiş örnekleri Hazırlama İşlemi Mikro Kuyucuklarına aktarmak için ve örneklerin Hazırlama İşlemi Mikro Kuyucuklarından Amplifikasyon İşlemi Mikro Kuyucuklarına aktarılması için sadece BD ProbeTec ET Pipetörü ve BD ProbeTec ET Pipet uçlarını kullanın. 8. Kullanılmamış Hazırlama İşlemi Mikro Kuyucukları ve Amplifikasyon İşlemi Mikro Kuyucuklarını içeren reaktif torbaları açıldıktan sonra dikkatlice tekrar kapatılmalıdır. Reaktif torbalarını tekrar kapatmadan önce torbada desikant bulunduğundan emin olun. 9. Amplifikasyon Mikro Kuyucuklarını içeren plak, BD ProbeTec ET Hazırlama ve Isıtma İşlemi Isıtıcısından BD ProbeTec ET Cihazına taşınmadan önce Amplifikasyon kilidi kullanılarak düzgün şekilde KAPATILMALIDIR. Cihazın ve çalışma alanının amplifikasyon ürünleriyle kontamine olmaması için kilitleme şarttır. Kilitleme malzemesini mikro kuyucuklardan gerekmedikçe çıkarmayın. 10. 6 sütunu aşan bir test plağı (> 48 örnek ve Kontrol) için olası kontaminasyonun önüne geçmek amacıyla, bir TAM parça Amplifikasyon kilidi kullanılmalıdır. 11. Çalışma alanının amplifikasyon ürünleriyle kontamine olmasının önüne geçmek için, test bitiminde kilitlenmiş Amplifikasyon İşlemi Mikro Kuyucuklarını atmak amacıyla sağlanan Atık Çantalarını kullanın. 12. Örneklerin çapraz kontaminasyonunun önüne geçmek için, örnek işleme ve test prosedürleri sırasında belirtilen adımlarda ELDİVEN DEĞİŞTİRİN. Eldivenler örnekle temas ederse, diğer örneklerin kontamine olmasını önlemek için eldivenleri derhal değiştirin. 13. Çalışma alanının veya ekipmanın örneklerle kontamine olması halinde, kontamine olan alanı %1 (v/v) sodyum hipoklorit ve Alconox çözeltisiyle iyice temizleyin ve deiyonize/steril saf suyla iyice durulayın. İşleme devam etmeden önce yüzeylerin tamamen kurumasını bekleyin. 14. Tüm çalışma alanını sayaç kapakları ve cihaz yüzeyleri her gün %1 (v/v) sodyum hipoklorit ve Alconox çözeltisi ile temizleyin. Deiyonize/steril saf suyla iyice durulayın. Diğer testlere devam etmeden önce yüzeyin tamamen kurumasını bekleyin. 15. Sıvı kalıntısı (sıvının Hazırlama İşlemi Mikro Kuyucuğundan Amplifikasyon İşlemi Mikro Kuyucuğuna aktarılmasından sonra) içeren Hazırlama İşlemi Mikro Kuyucukları hedef kontaminasyon kaynağı oluştururlar. Hazırlama İşlemi Mikro Kuyucuklarını atmadan önce plak kilidini dikkatle kapatın. 16. Ultrasonlar AÇIKKEN, ellerinizi veya parmaklarınızı sonik banyonun içine sokmayın. Bunu yapmak cilt rahatsızlıklarına ve olası cilt tahrişine neden olabilir. Yumuşak dokularda uzun süreli hasar da gözlenebilir. 17. Sonik Banyonun sıcaklığını kontrol etmek için cıvalı termometre kullanmayın. Bu amaç için dijital bir termometre temin edilmiştir. 18. BD ProbeTec ET cihazına temizlemeyle giderilemeyen şekilde sıvı dökülmesi veya cihazın DNA ile kontamine olması gibi beklenmedik durumlar oluştuğunda Teknik Servis i arayın. 19. Genel amaçlı bir laboratuvar fırınını kullanırken, fırının kullanıcı kılavuzundaki uygun çalıştırma talimatları ve güvenlik önlemlerini takip edin. 20. Isıtmayı durdurma sırasında ve/veya sonrasında örnek işleme için tesis edilen laboratuvar prosedürlerini kullanın. 2

Kat. No. Açıklama 240862 BBL MycoPrep Örnek Dijestiyon/Dekontaminasyon Kiti, on adet 75 ml lik NALC-NaOH solüsyonu şişesi ve 5 paket fosfat tamponu. 240863 BBL MycoPrep Örnek Dijestiyon/Dekontaminasyon Kiti, on adet 150 ml lik NALC-NaOH solüsyonu şişesi ve 10 paket fosfat tamponu. Tehlikelidir H314 Ciddi cilt yanıklarına ve göz hasarına yol açar. P260 Tozunu/dumanını/gazını/sisini/buharını/spreyini solumayın. P280 Koruyucu eldiven/koruyucu kıyafet/göz koruyucu/yüz koruyucu kullanın. P264 Elleçlemeden sonra ile iyice yıkayın. P303+P361+P353 DERİ (veya saç) İLE TEMAS HALİNDE İSE: Kirlenmiş tüm giysilerinizi hemen kaldırın/çıkartın. Cildinizi su/duş ile durulayın. P405 Kilit altında saklayın. P501 İçeriği/kabı ulusal/ bölgesel/yerel/uluslararası yönetmeliklere göre atın. Kat. No. Açıklama 440643 BD ProbeTec ET Mycobacterium tuberculosis Kompleksi (DTB) Direkt Tespit Örnek İşlem Kiti. Uyarı H315 Cilt tahrişine yol açar. H319 Ciddi göz tahrişine yol açar. H335 Solunum yolu tahrişine yol açabilir. P280 Koruyucu eldiven/koruyucu kıyafet/göz koruyucu/yüz koruyucu kullanın. P264 Elleçlemeden sonra ile iyice yıkayın. P312 İyi hissetmiyorsanız, bir ZEHİR DANIŞMA MERKEZİ ile veya bir doktorla irtibata geçin. P405 Kilit altında saklayın. P403+P233 İyi havalandırılmış bir alanda depolayanız. Kabı sıkıca kapalı tutun. P501 İçeriği/kabı ulusal/bölgesel/yerel/uluslararası yönetmeliklere göre atın. Tehlikelidir H302 Yutulması halinde zararlıdır. H314 Ciddi cilt yanıklarına ve göz hasarına yol açar. P260 Tozunu/dumanını/gazını/sisini/buharını/spreyini solumayın. P280 Koruyucu eldiven/koruyucu kıyafet/göz koruyucu/yüz koruyucu kullanın. P264 Elleçlemeden sonra ile iyice yıkayın. P303+P361+P353 DERİ (veya saç) İLE TEMAS HALİNDE İSE: Kirlenmiş tüm giysilerinizi hemen kaldırın/çıkartın. Cildinizi su/duş ile durulayın. P405 Kilit altında saklayın. P501 İçeriği/kabı ulusal/ bölgesel/yerel/uluslararası yönetmeliklere göre atın. Uyarı H302 Yutulması halinde zararlıdır. P264 Elleçlemeden sonra ile iyice yıkayın. P301+P312 YUTULDUĞUNDA: kendinizi iyi hissetmiyorsanız ULUSAL ZEHİR DANIŞMA MERKEZİNİN 114 NOLU TELEFONUNU veya doktoru/hekimi arayın. P501 İçeriği/kabı ulusal/bölgesel/yerel/uluslararası yönetmeliklere göre atın. ÖRNEK TOPLAMA VE KULLANMA Tüm örnekler, CDC Clinical Microbiology Procedures Handbook veya kendi laboratuvarınızın prosedür kılavuzu tarafından önerilen şekilde toplanmalı ve taşınmalıdır. 1,8 DİJESTİYON, DEKONTAMİNASYON VE KONSANTRASYON Örnekler CDC ye ait Public Health Mycobacteriology: A Guide for the Level III Laboratory tarafından önerilen NALC-NaOH yöntemi kullanılarak işlenmelidir. 1 Mikobaktariyel örneklerin işlenmesi için alternatif olarak BBL MycoPrep kitini kullanın. (bkz. Ticari Takdim Şekli ). NOT: Eğer BD ProbeTec ET Testi hemen uygulanmazsa, NALC/NaOH sedimentleri aşağıdaki gibi saklanabilir: (a) 2 8 C de 5 güne kadar. (b) 5 günden daha uzun bir süre için -20 C veya daha düşük bir sıcaklıkta (döngüsel olmayan) üç aya kadar. Dondurulmuş sedimentler BD ProbeTec ET DTB testi öncesinde oda sıcaklığında çözülmelidir. 3

ÖRNEK HAZIRLAMA PROSEDÜRÜ A. BD ProbeTec ET DTB Örnek İşleme Hazırlığı BSC nin Dışında 1. Örnek işleme tamponu oda sıcaklığında olmalı ve kullanılmadan önce iyice karıştırılmalıdır. Stok tamponların kontaminasyonunu önlemek için, yeterli miktardaki tamponu uygun şekilde etiketlenmiş steril kaplara aşağıda açıklanan şekilde aktarın: a. DTB Yıkama Tamponu 1 - işlenecek NALC-NaOH sedimenti başına 1 ml artı pipetleme işlemini kolaylaştırmak için fazladan 1 2 ml. b. DTB Lizis Tamponu 2 - işlenecek NALC-NaOH sedimenti ve kontroller başına 0,1 ml artı pipetleme işlemini kolaylaştırmak için fazladan 0,5 1 ml. c. DTB Nötralizasyon Tamponu 3 - işlenecek NALC-NaOH sedimenti ve kontroller başına 0,6 ml artı pipetleme işlemini kolaylaştırmak için fazladan 0,5 1 ml. d. Tamponların kontaminasyonunu önlemek için - artan tamponu şişelere geri boşaltmayın. 2. Örnek tüpleriyle temin edilen etiketleri kullanın ve işlenecek her NALC-NaOH sedimenti için bir 2 ml lik Örnek Tüpünü etiketleyin. 3. Örnek Tüplerinin kapaklarını çıkarın ve her tüpe DTB Yıkama Tamponu 1 den 1,0 ml dağıtın. Kapakları yeniden takın. 4. Örnek Tüplerini BSC ye götürün. B. NALC-NaOh Sediment Örneklerinin BD ProbeTec ET DTB Testi için İşlenmesi - BSC nin içinde NOT: Örneklerin aktarımına hazırlanırken, biyolojik tehlikeli sıvılar için bir atık konteyneri hazırlayın. 1. İlk NALC-NaOH sedimentini 5 saniye boyunca vorteksleyin. 2. Yeni bir aerosole dirençli uçla hazırlanmış bir pipetör kullanarak, NALC-NaOH sedimentinin 500 µl sini uygun şekilde etiketlenen 1 ml DTB Yıkama Tamponu 1 içeren Örnek Tüpüne aktarın. 3. Tüpün kapağını sıkıca kapatın. 4. Her NALC-NaOH sedimenti için 1 3 arası adımları tekrar edin. 5. ELDİVENLERİ DEĞİŞTİRİN. 6. Her Örnek Tüpünü 5 saniye süreyle vorteksleyin. 7. Her tüpü aerosol içeren rotorun içine yerleştirin ve aerosol içeren kapağı sıkıca sabitleyin. Rotorun dış yüzeyini havlu veya anti-mikrobiyal çözeltiyle ıslatılmış gazlı bez kullanarak silin. 8. Aerosol içeren rotoru mikrosantrifüje aktarın. Örnekleri 12.200 x g de 3 dakika boyunca santrifüjleyin. NOT: Yetersiz santrifüj yanlış negatif sonuçlarına yol açacağı için belirlenen santrifüj koşulları takip edilmelidir. 9. Santrifüjden hemen sonra, rotoru mikrosantrifüjden dikkatlice çıkarın (aerosol sıkma kilidini parçalamadan) ve BSC ye geri götürün. 10. Aerosol içeren kapağı çıkarın ve süpernatant ve sediment karışmasını minimum düzeyde tutmak için özen göstererek örnekleri rotordan derhal çıkarın. 11. İlk tüpün kapağını açın ve süpernatantı BSC deki atık sıvı konteyneri içine aktarın. Yavaş bir ters çevirme hareketi uygulayın ve ters çevrilen tüpe aşağıya doğru bir vurma hareketi uygulayarak işlemi bitirin. NOT: Sediment zaman içinde çözülebilir. 9, 10 ve 11. adımları geciktirmeden uygulayın. 12. Kapağı sıkıca kapatın ve tüpü 2 ml lik Örnek Tüp Rafına yerleştirin. 13. Tüm örnekler için 11 ve 12. adımları tekrarlayın. 14. ELDİVENLERİ DEĞİŞTİRİN. C.1. Örnek Isıtma - BD ProbeTec ET Fırını. NOTLAR: Örnek tüplerinin sıkıca kapatıldığından emin olun. Örnekleri fırında ısıtmadan önce, Örnek Tüpü kapaklarını, O-halkalarının uygun şekilde oturduğunu doğrulamak için gözlerinizle inceleyin. O-halkası oturmamış veya eksik gibi görünüyorsa yeni bir kapakla değiştirin. İlgili tedbir ve uyarıları da içeren eksiksiz bir çalışma talimatı listesi için, BD ProbeTec ET Sistemi Kullanıcı Kılavuzuna bakın. 1. 2 ml lik Örnek Tüp Rafını fırına yerleştirin ve kapıyı kapatın. 2. RUN #01 i (Program #01) seçin. OK (Tamam) tuşuna basın. 3. Programı başlatmak için START (BAŞLAT) tuşuna basın. 4. Isıtma döngüsü başladığında aşağıdaki adımları uygulayın: a. BD ProbeTec ET Sonik Banyosunu hazırlayın. Bunun için yapmanız gerekenler: (1) Sonik Banyo ekini banyoya yerleştirin. (2) Sonik Banyoyu Maksimum gösterge çizgisine kadar sıcak musluk suyuyla doldurun. (NOT: Deiyonize su kullanılmamalıdır). (3) Sıcaklığı 65 ºC ye ayarlayın ve ısıtıcıyı açın. (4) Sonik banyo kapağı kapalı durumdayken 60 dakika (varsayılan ayar) boyunca ultrasonları yürütün. b. Standart rotoru mikrosantrifüjün içine sabitleyin. 5. Isıtma döngüsünün 15. dakikasından sonra sıcaklığın 95 C olarak okunduğunundan emin olmak için fırının harici termometresini kontrol edin ve kaydedin. 4

6. Fırın ısıtma döngüsünün sonunda bir bip sesi duyulacaktır ve LCD ekran programın bitmiş (DONE) olduğunu belirtecektir. OPEN DOOR (Kapıyı Açma) tuşuna basarak kapı mandalını açın ve 2 ml lik Örnek Tüp Rafını çıkarın. NOT: Örnek Tüplerde bulunan tüm mikobakteriler artık cansız olarak değerlendirilir ve bunu izleyen manipülasyonlar BSC dışında görülebilir. Örnekler hala potansiyel biyolojik tehlikeye sahip olarak değerlendirilmelidir. C.2. Örnek Isıtma İşlemi Genel Amaçlı Laboratuvar Fırını NOTLAR: Örnek Tüplerinin sıkıca kapatıldığından emin olun. Örnekleri fırında ısıtmadan önce, Örnek Tüpü kapaklarını, O-halkalarının uygun şekilde oturduğunu doğrulamak için bakarak inceleyin. O-halkası oturmamış veya eksik gibi görünüyorsa yeni bir kapakla değiştirin. İlgili tedbir ve uyarıları da içeren eksiksiz çalıştırma talimatları için fırının kullanıcı kılavuzuna bakın. 1. 2 ml lik Örnek Tüp Rafını fırına yerleştirin ve kapıyı kapatın. 2. Örnek sıcaklığı minimum 30 ve maksimum 35 dakika içinde 101 C ± 1 C ye ulaşmalıdır. Uygun süre ve sıcaklık inkübasyonu talimatlarını takip edin. 3. Örnekler fırında ısıtılırken aşağıdaki adımları gerçekleştirin: a. BD ProbeTec ET Sonik Banyosunu hazırlayın. Bunun için yapmanız gerekenler: (1) Sonik Banyo ekini banyoya yerleştirin. (2) Sonik Banyoyu Maksimum gösterge çizgisine kadar sıcak musluk suyuyla doldurun. (NOT: Deiyonize su kullanılmamalıdır). (3) Sıcaklığı 65 C ye ayarlayın ve ısıtıcıyı açın. (4) Sonik banyo kapağı kapalı durumdayken 60 dakika (varsayılan ayar) boyunca ultrasonu çalıştırın. b. Standart rotoru mikrosantrifüjün içine sabitleyin. 4. Fırın ısıtma döngüsünün sonunda, 2 ml lik Örnek Tüpü Rafını çıkarın. UYARI: Sıcak Örnek Rafını uygun Kişisel Koruyucu Ekipman (PEE) olmadan elinize almayın. Aksi takdirde yanıklara neden olabilir. NOT: Örnek Tüplerinde bulunan tüm mikobakteriler artık cansız olarak değerlendirilir ve bunu izleyen manipülasyonlar BSC dışında görülebilir. Örnekler hala potansiyel biyolojik tehlikeye sahip olarak değerlendirilmelidir. D. Örnek Lizisi BD ProbeTec ET Sonik Banyo UYARI: Ultrasonlar AÇIKKEN, ellerinizi veya parmaklarınızı sonik banyonun içine sokmayın. Bunu yapmak cilt rahatsızlıklarına ve olası cilt tahrişine neden olabilir. Yumuşak dokularda uzun süreli hasar da gözlenebilir. UYARI: Sonik Banyonun sıcaklığını kontrol etmek için cıvalı termometre kullanmayın. Bu amaç için dijital bir termometre temin edilmiştir. NOT: İlgili tedbir ve uyarıları da içeren eksiksiz bir çalışma talimatı listesi için, BD ProbeTec ET Sistemi Kullanıcı Kılavuzuna bakın. 1. Örnek Tüplerini standart rotorla mikrosantrifüjün içine yerleştirin. 2. Kapağı kapatın ve santrifüje 10 saniye süreyle puls uygulayın. 3. Tüpleri santrifüjden çıkarın ve tüp kapaklarını yoğunlaşma olup olmadığını görmek için inceleyin. Yoğunlaşma gözleniyorsa santrifüjü tekrar edin. 4. Tüpleri 2 ml lik Örnek Tüp Rafına tekrar yerleştirin. 5. İlk tüpün kapağını çıkarın. Aerosole dirençli bir pipet ucuyla hazırlanmış bir pipetör kullanarak DTB Lizis Tamponu 2 nin 100 µl sini tüpe dağıtın. Kapağı örnek tüpüne takın ve sıkıştırın. 6. Her örnek için yeni bir uç kullanarak adımları tüm örnekler için tekrarlayın. 7. ELDİVENLERİ DEĞİŞTİRİN. 8. Her tüpü 5 saniye süreyle vorteksleyin. Tüpler 2 ml lik Örnek Tüp Rafına tekrar yerleştirildiklerinde, tüp kapaklarının sıkıca kapanmış olduğundan emin olun ve tüp çıkıntısı rafın çentiğine oturacak şekilde tüpü itin. Bu, tüpleri azami ultrasonik enerji maruziyeti için uygun şekilde yönlendirir. 9. Ultrasonları KAPAYIN ve su seviyesinin Sonik Banyo eki üzerindeki Minimum ve Maksimum gösterge çizgileri arasına denk geldiğini doğrulayın. Sıcak musluk suyunu gerekli şekilde azaltın veya ekleyin. Sonik banyo sıcaklığını, sıcaklığın 65 +/- 5 C olduğundan emin olmak için dijital termometreyle ölçün. Termometreyi banyodan çıkarın. 10. 2 ml lik Örnek Tüp Rafını Sonik Banyo Ekinin içine aktarın. Sonik banyo kapağını kapatın. 11. Sonik banyo sayacını 45 dakikaya ayarlayın, ultrasonları AÇIN. 12. Sonikasyonun sonunda sonik banyoyu KAPATIN ve 2 ml lik Örnek Tüp Rafını çıkarın. Rafı kuruması için absorban kağıt havluların üzerine yerleştirin. E. Örnek Nötralizasyonu 1. Örnek Tüplerini standart rotorla mikrosantrifüjün içine yerleştirin. 2. Kapağı kapatın ve santrifüje 10 saniye süreyle puls uygulayın. 3. Tüpleri santrifüjden çıkarın ve tüp kapaklarını yoğunlaşma olup olmadığını görmek için inceleyin. Yoğunlaşma gözleniyorsa santrifüjü tekrar edin. 4. Tüpleri Temiz Pipet Rafına yerleştirin. 5. İlk tüpün kapağını çıkarın. Aerosole dirençli bir uçla hazırlanmış bir pipetör kullanarak DTB Nötralizasyon Tamponu 3 ün 600 µl sini tüpe dağıtın. Kapağı örnek tüpüne takın ve sıkıştırın. 5

6. Her tüp için yeni bir uç kullanarak adımları tüm örnekler için tekrarlayın. 7. ELDİVENLERİ DEĞİŞTİRİN. 8. Her tüpü 5 saniye süreyle vorteksleyin. 9. Tüplere yukarda yer alan 1 3 arası adımları takip ederek puls santrifüjü uygulayın. 10. Tüpleri Temiz Pipet Rafına tekrar yerleştirin. 11. İşlenilen örnekler artık BD ProbeTec ET Sisteminde test edilmek için hazırdır. NOT: Test hemen uygulanmazsa, örnekler aşağıda açıklanan şekilde saklanabilir: a) 18 33 C de 12 saate kadar. b) 2 8 C de 4 güne kadar. Örnekler test öncesinde ve örneği minimum 30 dakika ve maksimum 35 dakika için 101 C ± 1 C ye ısıtabilen BD ProbeTec ET Fırını veya genel amaçlı laboratuvar fırınında içinde yeniden ısıtılmalıdır. c) - 20 C veya daha düşük bir sıcaklıkta (döngüsüz) 3 aya kadar. Dondurulmuş örnekler test öncesinde oda sıcaklığında çözülmeli ve örneği minimum 30 dakika ve maksimum 35 dakika için 101 C ± 1 C ye ısıtabilen BD ProbeTec ET Fırını veya genel amaçlı laboratuvar fırınında içinde yeniden ısıtılmalıdır. d) Tüpler yeniden ısıtıldıktan sonra, (yukarda b ve c adımlarında) standart rotoru kullanarak tüpleri mikrosantrifüjün içine yerleştirin. Kapağı kapatın ve santrifüje 10 saniye süreyle puls uygulayın. Tüpleri santrifüjden çıkarın ve yoğunlaşma olup olmadığını görmek için tüp kapaklarını inceleyin. Yoğunlaşma gözleniyorsa santrifüjü tekrar edin. Tüpleri Temiz Pipet Rafına yerleştirin. Örnekler artık BD ProbeTec ET Sisteminde test edilmek için hazırdır. TEST PROSEDÜRÜ A. Cihazın Hazırlanması 1. Cihazı açın ve teste başlamadan önce ısınmasına izin verin. a. Hazırlama ve Isıtma İşlemi Isıtıcısının ısınması ve stabilizasyonu yaklaşık 90 dakika sürer. Hazırlama ve Isıtma İşlemi Isıtıcısının Hazırlama bileşeni için ayarlanan sıcaklık değeri 72,5 C dir. Hazırlama ve Isıtma İşlemi Isıtıcısının Isıtma bileşeni için ayarlanan sıcaklık değeri 54 C dir. b. BD ProbeTec ET cihazı yazılım kontrolü altındadır ve ısınması yaklaşık olarak 30 dakika sürer. 2. Hazırlama ve Isıtma İşlemi Isıtıcısının sıcaklıkları teste başlamadan önce kontrol edilmelidir. Hazırlama İşlemi ısıtıcısının termometresi 72 73 C yi göstermelidir. Isıtma İşlemi ısıtıcısının termometresi 53,5 54,5 C yi göstermelidir. 3. BD ProbeTec ET ekranında görüntülenen sıcaklığı kontrol edin. Sıcaklık 47,5 55,0 C olarak okunmalıdır. B. BD ProbeTec ET Pipetör BD ProbeTecET Pipetör tuş takımı fonksiyonlarına ilişkin detaylı açıklamalar için BD ProbeTec ET Sistemi Kullanıcı Kılavuzuna başvurun. DTB Testinin gerçekleştirilmesi için aşağıdaki programlar gereklidir. Program 1 işlenen örneklerdeki sıvıyı Hazırlama İşlemi Mikro Kuyucuklarına aktarır. Program 5 Hazırlama İşlemi Mikro Kuyucuklarındaki sıvıyı Amplifikasyon İşlemi Mikro Kuyucuklarına aktarır. Pipetörü şu şekilde programlayın: Program 1: 1. Pipetörü AÇIN. Pipetör bir kez bip sesi verir, ZERO (Sıfır) yanıp söner, Software Version # (Yazılım Sürüm No.) yanıp söner ve bir kez daha bip sesi verir. 2. Mavi Prog (Program) tuşuna basın. Program 1 i seçmek için 1 görüntülenene kadar Vol (Hacim) tuşuna basın. Enter a (Giriş) basın. 3. Programlama moduna girmek için, Prog (Program) tuşuna basın ve tuşu basılı tutun. Prog tuşundan parmağınızı çekerken aynı zamanda pipetin ucuyla veya bir atacın ucuyla Special Function Key e (Özel Fonksiyon Tuşu) basın. 4. Fill e (Doldur) basın. 200 görüntülenene kadar yukarı okuna basın. Enter a (Giriş) basın. 5. Disp e (Dağıt) basın. 150 görüntülenene kadar yukarı ok tuşuna basın. Enter a (Giriş) basın. 6. Purge e (Temizle) basın. Enter a (Giriş) basın. 7. Programı kaydetmek ve çıkmak için Enter a (Giriş) bir kez daha basın. Programlamanın tamamlandığını belirten bir bip sesi duymanız gerekir. 8. Adımlar arasında ilerlemek için tetikleyiciye basarak programınızı doğrulayın. Her adımda, aspirasyon/dağıtım hızını Vol (Hacim) tuşunu kullanarak ayarlayın. Her adımda Hız göstergesi görüntülenir. Hız göstergesini Fill (Doldur) ve Disp (Dağıt) adımları için 2 kare ve Purge (Temizle) için 3 kare gösterecek şekilde ayarlamak üzere Vol (Hacim) tuşunu kullanın. Program 5 1. Prog (Program) Tuşuna basın. Program 5 i seçmek için 5 görüntülenene kadar Vol (Hacim) Tuşuna basın. Enter a (Giriş) basın. 2. Programlama moduna girmek için, Prog (Program) tuşuna basın ve tuşu basılı tutun. Prog (Program) tuşundan parmağınızı çekerken aynı zamanda pipetin ucuyla veya bir atacın ucuyla Special Function Key e (Özel Fonksiyon Tuşu) basın. 3. Fill e (Doldur) basın. 100 görüntülenene kadar yukarı okuna basın. Enter a (Giriş) basın. 4. Disp e (Dağıt) basın. 100 görüntülenene kadar yukarı ok tuşuna basın. Enter a (Giriş) basın. 5. Mix e (Karıştır) basın. 50 görüntülenene kadar yukarı ok tuşuna basın. Enter a (Giriş) basın. 6

6. Programı kaydetmek ve çıkmak için Enter a (Giriş) bir kez daha basın. Programlamanın tamamlandığını belirten bir bip sesi duymanız gerekir. 7. Adımlar arasında ilerlemek için tetikleyiciye basarak programınızı doğrulayın. Her adımda, aspirasyon/dağıtım/karıştırma hızını Vol (Hacim) tuşunu kullanarak ayarlayın. Her adımda Hız göstergesi görüntülenir. Hız göstergesini aspirasyon ve dağıtım fonksiyonları için 2 kare gösterecek şekilde ayarlamak üzere Vol (Hacim) tuşunu kullanın. Karışım hızını 3 kare gösterecek şekilde ayarlamak için Vol (Hacim) tuşunu kullanın. Programın Gözden Geçirilmesi Programlar prosedüre başlanmadan önce gözden geçirilmelidir. Programları gözden geçirmek için, pipetörü AÇIN. Mavi Prog (Program) Tuşuna basın. Gözden geçirilecek programı temsil eden numara görüntülenene kadar Vol (Hacim) tuşuna basın. Enter (Giriş) tuşuna basın. Programda adım adım ilerlemek için pipetör tetikleyicisini kullanın. Program 1: Bu program 200 µl çeker ve 150 µl dağıtır. Pipetör ekranında aşağıdaki ifade görüntülenmelidir: Fill 200 µl S II (200 µl doldur) Dispense 150 µl S II (150 µl dağıt) Purge S III (Temizle) Program 5 i de aynı şekilde gözden geçirin: Program 5: Bu program 100 µl çeker; 100 µl dağıtır ve 50 µl yi üç kez karıştırır. Pipetör ekranında aşağıdaki ifade görüntülenmelidir: Fill 100 µl S II (100 µl doldur) Dispense 100 µl S II (100 µl dağıt) Mix 50 µl S III (50 µl karıştır) Zero (Sıfır - yanıp söner) C. Plak Yerleşimi Plak Yerleşim Raporu, test türü (türleri), örnek tanıtıcısı, kontrol lotu numaraları ve kit lotu numaraları sisteme girildikten sonra BD ProbeTec ET cihazı tarafından oluşturur. Plak Yerleşim Raporu test edilecek her plak için örneklerin ve kontrollerin fiziki yerleşimini gösterir. Bu konumlandırma Hazırlama İşlemi Mikro Kuyucuğu ve Amplifikasyon İşlemi Mikro Kuyucuğu plaklarının her ikisi tarafından da kullanılır. DTB Testi için, Hazırlama İşlemi Mikro Kuyucukları katı, turuncu renkteki mikro kuyucuk stripleridir. Amplifikasyon İşlemi Mikro Kuyucukları turuncu çizgili mikro kuyucuk stripleridir. D. Test Kontrollerinin Hazırlanması NOT: BD ProbeTec ET DTB Kontrolleri, DTB Lizis Tamponu 2 ve DTB Nötralizasyon Tamponu 3 kullanımdan önce oda sıcaklığında olmalıdır. Daha önceden örnek işlemesi için aktarılan tamponları kullanın. Kullanmadan önce iyice karıştırın. 1. Her test çalışması (test edilecek plak) için, bir DTB Negatif Kontrol Tüpü ve bir DTB Pozitif Kontrol Tüpü hazırlayın. Bir plak birden fazla DTB Reaktif Paketi lot numarası içeriyorsa, kontroller her lot için test edilmelidir. 2. Negatif Kontrol Tüpünün kapağını çıkarın: a. Yeni bir pipet ucu kullanarak DTB Lizis Tamponu 2 nin 100 µl sini dağıtın. b. Yeni bir pipet ucu kullanarak DTB Nötralizasyon Tamponu 3 ün 600 µl sini dağıtın. 3. Tüpün kapağını sıkıca kapatın ve 5 saniye süreyle vorteksleyin. 4. Pozitif Kontrol Tüpünün kapağını çıkarın: a. Yeni bir pipet ucu kullanarak DTB Lizis Tamponu 2 nin 100 µl sini dağıtın. b. Yeni bir pipet ucu kullanarak DTB Nötralizasyon Tamponu 3 ün 600 µl sini dağıtın. 5. Tüpün kapağını sıkıca kapatın ve 5 saniye süreyle vorteksleyin. 6. Kontrol tüplerini standart rotorla mikrosantrifüjün içine yerleştirin. Kapağı kapatın ve santrifüje 10 saniye süreyle puls uygulayın. Tüpleri santrifüjden çıkarın ve temiz Pipet Rafına yerleştirin. E. Test Prosedürü 1. İlk çalıştırma için örnek tüplerinin kapaklarını ve kontrolleri çıkarıp atın. 2. ELDİVENLERİ DEĞİŞTİRİN. 3. Plak Yerleşim Raporunu bir kılavuz olarak kullanarak Hazırlama İşlemi Mikro Kuyucuk plağını hazırlayın. 4. Hazırlama İşlemi Mikro Kuyucuk torbasını aşağıdaki şekilde tekrar kapatın. a. Torbayı düz bir yüzeye koyun. Açık ucu bir elinizle düz şekilde tutun. b. Basınç uygulayarak parmağınızı kilidin dışından torbanın bir ucundan diğer ucuna doğru kaydırın. c. Torbayı kapalı olduğundan emin olmak için kontrol edin. 5. BD ProbeTec ET Pipetörde Program 1 i seçin. 6. Pipet uçlarını takın. Boşluk topuzunu tamamen dışarı çekerek pipetörü genişletin. NOT: Sızıntıyı önlemek için uçların pipetöre tamamen yerleştiğinden emin olun. NOT: Örnekleri çekerken, pipet uçlarını tıkayabilecek ve test sonuçlarını etkileyebilecek olan debris toplanmasından kaçınmaya özen gösterin. 7. 1. örnek sütunundan 200 µl çekin. 8. Pipeti yavaşça çekin, pipet uçlarıyla kuyucukların kenarlarına dokunun ve Hazırlama İşlemi Mikro Kuyucuklarındaki ilk sütuna (1 A-H) 150 µl dağıtın. NOT: Doğruluk ve kesinlik sağlamak ve çapraz kontaminasyonu önlemek için sıvıların mikro kuyucukların iç duvarlarına dağıtılması önemlidir. 7

9. Uçları atın. Pipetleme tetiğini bırakarak pipetörü sıfırlayın. 10. Yeni uç takın, pipetörü genişletin ve 2. örnek sütunundan 200 µl çekin. 11. Pipetörü yavaşça çekin, pipet uçlarıyla kuyucukların kenarlarına dokunun ve Hazırlama İşlemi Mikro Kuyucuklarındaki 2. sütuna (2 A-H) 150 µl dağıtın. NOT: Kontaminasyona neden olacağından pipetörü örneklerin veya mikro kuyucukların üzerinde çekmeyin. Ani hareketler damlama ve aerosollere neden olabilir. 12. Uçları atın. NOT: Çalışma alanını kontamine edebileceğinden uçları atarken damlama ve aerosol olmamasına özen gösterin. 13. Çalışma için kalan örnekleri aktararak devam edin. 14. Hazırlama İşlemi Mikro Kuyucuk plağını Hazırlama İşlemi kapağıyla kapatın ve plağı oda sıcaklığında en az 20 dakika inkübasyona bırakın. (İnkübasyon 6 saat sürebilir.) NOT: İşlenilen örnekleri yeni kapaklar kullanarak kapatın. ELDİVENLERİ DEĞİŞTİRİN. 15. Hazırlama işlemi inkübasyonu sonrasında Amplifikasyon İşlemi Mikro Kuyucuk plağını hazırlayın. Amplifikasyon İşlemi Mikro Kuyucuklarını bir plakta Plak Yerleşim Raporuna uygun şekilde konfigüre edin (hazırlama işlemi plağıyla aynı şekilde). Amplifikasyon İşlemi Mikro Kuyucuk torbasını adım 4 te açıklanan şekilde tekrar kapatın. 16. Hazırlama İşlemi Mikro Kuyucuk plağının kapağını çıkarın ve plağı Hazırlama İşlemi Isıtıcısına aktarın. Amplifikasyon İşlemi Mikro Kuyucuk plağını ön ısıtma işlemi için DERHAL Isıtma İşlemi Isıtıcısına yerleştirin. 17. Zamanlayıcıyı 10 dakikaya ayarlayın. (NOT: Bu adım zaman açısından kritiktir.) 18. 10 dakikalık (+/- 1 dak.) inkübasyon sonrasında pipetörde Program 5 i seçin. 19. Derhal pipet uçlarını takın ve Hazırlama İşlemi Mikro Kuyucuğu plağının 1. sütunundan 100 µl çekerek Amplifikasyon İşlemi Mikro Kuyucuğu plağının 1. sütununa aktarın. Pipet uçlarının kuyucukların kenarlarına dokunmasını sağlayın ve sıvıyı dağıtın. Dağıtma işleminden sonra pipetörün kuyucuklardaki sıvıyı otomatik olarak karıştırmasına izin verin. 20. Uçları atın. Yeni uç takın ve Hazırlama İşlemi Mikro Kuyucuklarındaki reaksiyon karışımını Amplifikasyon İşlemi Mikro Kuyucuklarına sütun sütun aktarmaya, her sütun için yeni uçlar kullanarak devam edin. 21. Son sütun da aktarıldığında, bir Amplifikasyon İşlemi kilidinin desteğini çıkarın. (Bir Amplifikasyon İşlemi Kilidi [1/2] 6 sütunu kapsayacaktır, plak 6 sütunu aşarsa bir tam kilit KULLANILMALIDIR.) Kilidi kenarlarından tutun ve mikro kuyucukların üzerine uygulayın. Kilidin uygulanmasıyla ilgili olarak ısıtma işlemi ısıtıcısı yönergelerine bakın. Tüm mikro kuyucukların tamamen kilitlenmesini sağlamak için kilidi aşağı doğru bastırın. 22. BD ProbeTec ET kullanıcı arabiriminde taşıyıcıyı dışarı çıkarın, kapıyı ve plak kapağını açın. Kapatılan Amplifikasyon İşlemi Mikro Kuyucuğu plağını DERHAL (30 sn. içinde) BD ProbeTec ET Cihazına aktarın ve çalışmayı başlatın. (Detaylı bilgi için BD ProbeTec ET Sistemi Kullanıcı Kılavuzuna başvurun.) 23. Çalışmayı başlattıktan sonra, temizlik prosedürünün aşağıdaki kısmını tamamlayın: a. Hazırlama İşlemi Mikro Kuyucuğu plağını amplifikasyon kilidiyle kilitleyin ve plağı Hazırlama ve Isıtma İşlemi Isıtıcısından çıkarın. (Plağı çıkarmak için ısıya dayanıklı eldiveni kullanın - sıcaklık 70 C yi aşmaktadır.) b. Plağı tezgah üzerinde 5 dakika süreyle soğumaya bırakın. Hazırlama İşlemi Mikro Kuyucuklarını biyolojik tehlike atığı konteynerinde imha edin. c. Metal plağı temizleyin: Plağı %1 (v/v) sodyum hipoklorit ve Alconox çözeltisiyle temizleyin. Plağı steril saf su veya deiyonize suyla durulayın. Plağı temiz bir havluya sarın ve tekrar kullanmadan önce tamamen kurumasını bekleyin. 24. Çalışma tamamlandığında, sonuçların bir çıktısı alınır. 25. Plak taşıyıcısını yuvadan çıkarın, kapıyı açın ve plağı çıkarın. Kapağı kapatın ve plak yuvasını tekrar cihazın içine yerleştirin. 26. Kilitli Amplifikasyon İşlemi Mikro Kuyucuklarını plaktan çıkarın. Dikkat: Kilitleme Malzemelerini Mikro Kuyucuklardan Çıkarmayın. Kilitli mikro kuyucuklar, kilidin üst ve altından tutularak ve plağın dışına, yukarı doğru kaldırılarak bir birim olarak kolayca çıkarılabilir. Kilitli mikro kuyucukları Atık Çantasına yerleştirin. Çantayı kapatın. 27. Metal plağı temizleyin: Plağı %1 (v/v) sodyum hipoklorit ve Alconox çözeltisiyle temizleyin. Plağı steril saf su veya deiyonize suyla durulayın. Plağı temiz bir havluya sarın ve tekrar kullanmadan önce tamamen kurumasını bekleyin. 28. Günün son çalıştıma işleminden sonra, aşağıdaki temizleme prosedürlerini uygulayın: a. Tezgahları %1 (v/v) sodyum hipoklorit ve Alconox çözeltisiyle temizleyin. Çözeltinin çalışma yüzeylerinin üzerinde 2 3 dakika boyunca kalmasına izin verin, ardından steril saf su veya deiyonize suyla silin. b. Örnek Tüpü Rafını ve Şeffaf Pipet Rafını 60 saniyeyi aşmamak koşuluyla %1 (v/v) sodyum hipoklorit ve Alconox çözeltisine batırarak temizleyin. Steril saf su veya deiyonize suyla iyice durulayın ve havayla kurumaya bırakın. c. Hazırlama ve Isıtma İşlemi Isıtıcısının ve BD ProbeTec ET Cihazının dış yüzeylerini %1 (v/v) sodyum hipoklorit ve Alconox çözeltisi ile temizleyin. Yüzeyleri steril saf su veya deiyonize suyla silin. d. Pipetör tutacağını (YALNIZCA TUTACAĞI) %1 (v/v) sodyum hipoklorit ve Alconox çözeltisiyle temizleyin. Tutacağı steril saf su veya deiyonize suyla silin ve temiz bir havluyla silerek kurulayın. e. Pipetörü tekrar şarj edin. f. Kapalı Atık Çantasını ve biyolojik tehlike atığını kontamine atık malzemelere ilişkin prosedürlere uygun şekilde atın. 8

Kalite Kontrol BD ProbeTec ET DTB Kontrol Seti ayrı olarak temin edilir. Her test çalışmasında ve her yeni reaktif lotu numarası için bir pozitif ve bir negatif kontrol bulunmalıdır. Kontroller tesadüfi olarak konumlandırılabilir. DTB pozitif kontrolü, reaktif hatalarını, gerekli prosedür unsurlarının tamamlanmasını (pipetleme ve inkübasyon), amplifikasyonu ve saptamayı izlemek içindir. DTB negatif kontrolü reaktif ve/veya ortam kontaminasyonunu izlemek içindir. DTB pozitif ve DTB negatif kontrolü örnek sonuçlarının raporlanması için sırasıyla pozitif ve negatif olarak test edilmelidir. Kontroller beklenen performansı göstermezse, test çalıştırması geçersiz sayılır ve cihaz hasta sonuçlarını raporlamaz. QC (Kalite Kontrol) beklenen sonuçları vermezse, yeni bir kontrol seti, yeni mikro kuyucuklar ve işlenen örnekleri kullanarak tüm çalışmayı tekrarlayın. Tekrarlanan QC (Kalite Kontrol) beklenen sonuçları vermezse Teknik Servis i arayın (bkz. Sonuçların Yorumlanması ). Kontrollerin hazırlanmasına ilişkin açıklamalar için TEST PROSEDÜRÜ nün D Bölümüne başvurun. Kontroller hazırlandıktan sonra, TEST PROSEDÜRÜ nün E Bölümünde açıklanan şekilde test etmeye devam edin. Hazırlama İşlemi Mikro Kuyucuklarının içine bir Dahili Amplifikasyon Kontrolü (IAC) yerleştirilmiştir. IAC, örnek matriksinin varlığında amplifiye olan nükleik asit hedefi içerir. IAC nin tasarlanma amacı, amplifikasyon reaksiyonun doğruluğunu onaylamak ve işlenen örnekteki potansiyel inhibisyonun tespit edilmesini sağlamaktır. Örnek İşleme Kontrolü: Örnek işlemenin etkinliğini test etmek için, bir prosedür kontrolünün yerel düzenlemelere uygun şekilde rutin olarak test edilmesi gereklidir. Prosedür kontrolü M. tuberculosis in süspansiyonundan oluşur (örn. American Type Culture Collection, H37Ra ATCC 25177). Süspansiyon aşağıdaki gibi hazırlanmalıdır: 1. Organizmanın McFarland No. 1 süspansiyonunu hazırlayın. 2. McFarland süspansiyonunu Bovin Albümi içinde 1:100 oranında inceltin (FractionV), (örn. 0,1 ml lik McFarland süspansiyonunu 9,9 ml lik Bovin Albümin içine pipetleyin ve iyice karıştırın). 3. 1,0 ml lik aktarımlar -20 C veya daha düşük bir sıcaklıkta dondurulabilir (döngüsel olmayan). 4. Hücre süspansiyonu, BD ProbeTec ET sisteminde test edilecek rutin bir örnek gibi hazırlanmalıdır. DNA Kontaminasyonu Varlığının İzlenmesi: BD ProbeTec ET DTB testinin ilk çalıştırılmasından önce ve bunu takip eden süre içinde ayda en az bir kere olmak üzere, çalışma alanında ve ekipman yüzeylerinde DNA kontaminasyonu varlığının izlenmesi için aşağıdaki test prosedürü uygulanmalıdır. Kontaminasyonun bir sorun oluşmadan önce tespit edilebilmesi için ortamın izlenmesi önemlidir. 1. Test edilecek her alan* için bir CultureSwab EZ swabı kullanın. 2. Swab uygulaması yapılacak her alan için bir Örnek Tüpünü etiketleyin ve DTB Lizis Tamponu 2 den 100 µl ve DTB Tamponu 3 ten 600 µl yi her tüpe pipetleyin. 3. İlk swabı Örnek Tüpündeki tampon karşımına batırın ve ilk alanı geniş bir süpürme hareketiyle silin. 4. Swabı tampon karışımı içinde karıştırın, swabı sıkın, tüpün kapağını kapatın ve 5 saniye süreyle vorteksleyin. Swabları atın. 5. Swab uygulanan her alan için bu işlemi tekrarlayın. 6. Tüpleri Örnek Tüpü Rafına yerleştirin ve fırında ısıtın (ÖRNEK HAZIRLAMA PROSEDÜRÜNÜN C bölümü). 7. Tüpler ısıtılırken, swab uygulanan yüzeylerdeki tampon karışımı kalıntısını ortadan kaldırmak için suyla ıslatılmış temiz havlular kullanın. 8. Isıtmadan sonra, tüpleri standart rotorla mikrosantrifüjün içine yerleştirin, kapağı kapatın ve 10 saniye süreyle spin puls uygulayın. 9. Tüpleri santrifüjden çıkarın ve kapaklarını yoğunlaşma olup olmadığını görmek için inceleyin. Yoğunlaşma gözleniyorsa santrifüjü tekrar edin. 10. Tüpleri, Şeffaf Pipet Rafına yerleştirin ve TEST PROSEDÜRÜyle devam edin. * Test edilmesi önerilen alanlar şunlardır: fırının yüzeyi, sonik banyo, 2 ml lik Örnek Tüpü Rafı, Şeffaf Pipet Rafı, Hazırlama ve Isıtma İşlemi Isıtıcısı, siyah mikro kuyucuklar plağı, pipetör tutacağı, cihazın dokunma tuşları, cihazın tuş takımı ve çalışma tezgahı. Bir alan pozitif sonuç verirse, bu alanı %1 (v/v) sodyum hipoklorit ve Alconox çözeltisi ile temizleyin. Tüm alanın ağartıcı çözeltisiyle ıslatıldığından emin olun ve ağartıcı çözeltinin yüzey üzerinde en az 2 dakika boyunca veya kuruyana kadar kalmasına izin verin. Gerektiğinde ağartıcı çözeltisinin fazlasını temiz bir havluyla alın. Alanı deiyonize su veya steril saf suyla ıslatılmış temiz bir havluyla silin ve yüzeyi kurumaya bırakın. Alanı tekrar test edin. Negatif sonuç alana kadar bu işlemi tekrarlayın. Kontaminasyon sorunu çözülemezse, daha fazla bilgi için Teknik Servisi arayın. TEST SONUÇLARININ YORUMLANMASI DTB Test Sonucu Pozitif Negatif Belirlenemeyen Önerilen Rapor Probe assay positive for the presence of M. tuberculosis complex DNA. AFB culture pending. (M. tuberculosis kompleks DNA sının varlığı için sonda testi pozitif. AFB kültürü beklemede.) Probe assay negative for the presence of M. tuberculosis complex DNA. AFB culture pending. (M. tuberculosis kompleks DNA sının varlığı için sonda testi negatif. AFB kültürü beklemede.) İşlenilen örnekle sonda testini tekrarlayın. Pozitif veya negatifse yukarda açıklanan uygun durumu kullanın. Hala belirlenemiyorsa rapor şu şekilde olur: Initial and repeat probe assay result is indeterminate. Please submit a new specimen for testing. AFB culture pending. (Başlangıç ve tekrar sonda testlerinin sonucu belirlenemiyor. Lütfen test için başka bir örnek alın. AFB kültürü beklemede.) PROSEDÜRÜN KISITLI OLDUĞU ALANLAR 1. Bu yöntem yalnızca sputum (indüklenmiş veya ekspektore), bronkoalveolar, bronşiyal ve trakeyal aspirat gibi respiratuar örneklerle test edilmiştir. Diğer örnek türleriyle performansı test edilmemiştir. 9

2. Negatif bir sonuç hedef organizma konsantrasyonunun, test duyarlılığının altında var olma ihtimalini dışarda bırakmaz. 3. Diğer tanı amaçlı testlerde olduğu gibi, DTB Testinden gelen sonuçlar da doktorun kullanabileceği diğer laboratuvar verileri ve klinik verilerle ilişkili olarak yorumlanmalıdır. 4. The DTB Testi, M. tuberculosis kompleksi üyeleri arasında farklılaşmaz M. tuberculosis, M. bovis, M. bovis BCG, M. africanum, ve M. microti. 5. Testin optimum performans göstermesi için örneğin doğru şekilde toplanması ve işlenmesi gerekir. 6. Yetersiz santrifüj yanlış negatif sonuçlarına yol açacağı için belirlenen santrifüj koşulları takip edilmelidir. 7. DTB Testi IS6110 ek sırası eksik olan M. tuberculosis kompleks varyantlarını tespit etmez. 8. DTB Testinin kullanımı, test prosedürü ve BD ProbeTec ET Sistemi hakkında eğitim almış personel ile sınırlanmıştır. 9. Mycobacterium tuberculosis kompleks organizmalarından gelen nükleit asitler antimikrobiyal tedavi sonrasında da ortamda kalabileceği için DTB Testi, tedavinin başarılı olup olmadığını değerlendirmek için kullanılamaz. 10. DTB Testi, antimikrobiyal hassasiyet testinde kültivasyonun yerini almak için kullanılmaz. 11. DTB Testi kalitatif sonuçlar sağlar. MOTA sonucunun büyüklüğüyle pozitif örnekte bulunan hücre sayısı arasında herhangi bir ilişki kurulmamalıdır. 12. M. tuberculosis kompleksi sonda sırası, IS6110, yalnızca M. tuberculosis, M. bovis, M. bovis BCG, M. africanum, ve M. microti içindir. 13. DTB Testi, IS6110 sırasını içerebilecek olan non-tuberculous mycobacteria örnek varyantlarını tespit edecektir. 14. Testin tahminleyici değeri belirli bir popülasyonda hastalığın görülme sıklığına bağlıdır. 15. Antimikrobiyal tedavi veya ko-enfekte örnekler gibi diğer potansiyel değişkenlerin etkisi tespit edilmemiştir. 16. Genel amaçlı bir laboratuvar fırınını kullanırken, örneklerde bulunan tüm mikobakterileri cansız hale getirmek için örnek tüplerindeki sıvının en az 30 dakika içinde 101 C ± 1 C lik bir sıcaklığa erişmesini sağlayın. BEKLENEN SONUÇLAR İki farklı coğrafi bölgede bulunan klinik çalışma alanlarından gelen 986 hastadan toplanan toplam 1157 örnek BD ProbeTec ET DTB Testi ile test edilmiştir. Başlangıç MOTA sonuçlarının frekans dağılımı Şekil 1 de gösterilmiştir. BD ProbeTec ET DTB sonuçları, TB ve aside dirençli basil (AFB) smear sonuçlarıyla karşılaştırmalı olarak verilmiştir. Bir referans TB sonucu, bir mycobacterial kültür sonucunu veya tablo gözden geçirmesiyle gerçekleştirilen hasta tanılamasını baz alır. Mycobacterium tuberculosis kompleksinin varlığı veya yokluğu, örneğe ait BD ProbeTec ET DTB MOTA sonuçlarının önceden belirlenen eşik değeri ile ilişkilendirilmesiyle belirlenir. MOTA sonucu reaksiyonun sonucu olarak üretilen sinyalin büyüklüğünün belirlenmesi için kullanılan bir ölçüttür. MOTA sonucunun büyüklüğü örnekte bulunan organizma miktarını göstermez. Tüm hesaplamalar cihaz yazılımı tarafından otomatik olarak gerçekleştirilir. İki alanda test edilen örnekler, BD ProbeTec ET tarafından pozitif, negatif veya bilinmeyen olarak tanımlandı. Orijinal testte yalnızca bir örnek bir bilinmeyeni açığa çıkardı. Bu örnek tekrar edildiğinde negatif olarak çözümlendi. Şekil 1: DTB MOTA Sonuçlarının Frekans Dağılımı 900 800 700 600 792 Frekans 500 400 300 200 184 100 0 31 10 12 1 36 6 3 82 2 < 3.400 3.400 19.999 20.000 39.999 40.000 59.999 60.000 79.999 80.000 Referans TB (-) Referans TB (+) DTB MOTA Smear ve Referans TB Sonucu 0 3.399 3.400 19.999 20.000 39.999 40.000 59.999 60.000 79.999 80.000 Smear (+) TB (+) 2 1 19 144 60 1 Smear (+) TB ( ) 18 0 1 1 0 0 Smear ( ) TB (+) 29 11 17 40 22 1 Smear ( ) TB ( ) 774 10 0 5 1 0 10

PERFORMANS ÖZELLİKLERİ KLINIK DEĞERLENDIRME BD ProbeTec ET DTB Testi, tüberkülozun %9,2 ile %34,1 oranları arasında görüldüğü, coğrafi olarak iki farklı klinik bölgede değerlendirilmiştir. 986 hastadan alınan toplam 1157 örnek DTB Testi ile test edilmiş ve sonuçlar mikobakteriyal kültivasyonla karşılaştırılmıştır. BD ProbeTec ET DTB Testi sonuçları Tablo 1 de (örnek bazlı) ve Tablo 2 de (hasta bazlı) verilmiştir. Sonuçlar smear statüsüne göre ayrılmıştır. Bir hastadan alınan tüm örnekler o hastayı sınıflandırmak için kullanılmıştır. Hasta başına örnek sayısı bir ile üç aralığında değişmiştir. Bir veya daha fazla pozitif DTB sonucu elde edilen bir hasta, DTB pozitif olarak tanımlanmıştır. MTB kompleksi için bir veya daha fazla pozitif kültivasyon sonucu elde edilen bir hasta, kültür pozitif olarak tanımlanmıştır. Tablo 1: DTB Sonucunun Örnek Bazlı Olarak Başlangıç Kültivasyon Sonucuyla Karşılaştırılması DTB Sonuçları Smear Sonuçları Kültür (+) Kültür ( ) (+) Smear (+) 223 4 Smear ( ) 88 19 ( ) Smear (+) 2 18 Smear ( ) 29 774 Tablo 2: DTB Sonucunun Hasta Bazlı Olarak Başlangıç Kültivasyon Sonucuyla Karşılaştırılması DTB Sonuçları Smear Sonuçları Kültür (+) Kültür ( ) (+) Smear (+) 192 3 Smear ( ) 82 16 ( ) Smear (+) 2 17 Smear ( ) 23 651 Başlangıç kültivasyon sonuçlarıyla karşılaştırıldığında 54 tutarsız DTB sonucu bulundu. Tüm tutarsız sonuçlara tanılama uygulamak için hasta tablosu gözden geçirmesi kullanılmıştır. Bir referans TB sonucu, bir mycobacterial kültür sonucunu veya tablo gözden geçirmesiyle gerçekleştirilen hasta tanılamasını baz alır. BD ProbeTec ET DTB Testi sonuçları Tablo 3 de (örnek bazlı) ve Tablo 4 de (hasta bazlı) referans TB sonuçlarıyla karşılaştırmalı olarak verilmiştir. Sonuçlar smear statüsüne göre ayrılmıştır. Tablo 3: DTB Sonucunun Örnek Bazlı Olarak Referans TB Sonucuyla Karşılaştırılması DTB Sonuçları Smear Sonuçları Referans TB (+) Referans TB ( ) (+) Smear (+) 225 2 Smear ( ) 91 16 ( ) Smear (+) 2 18 Smear ( ) 29 774 Tablo 4: DTB Sonucunun Hasta Bazlı Olarak Referans TB Sonucuyla Karşılaştırılması DTB Sonuçları Smear Sonuçları Referans TB (+) Referans TB ( ) (+) Smear (+) 193 2 Smear ( ) 83 15 ( ) Smear (+) 2 17 Smear ( ) 23 651 Tahmini performans parametreleri Tablo 5 de başlangıç kültivasyon ve referans TB sonuçları ile karşılaştırmalı olarak verilmiştir. Duyarlılık parametreleri smear sonuçlarına göre ayrılmıştır. Tablo 5: Tahmini DTB Testi Performansı BD ProbeTec ET Kültivasyon Sonucuyla Karşılaştırmalı Toplam Duyarlılık Smear (+) Duyarlılık Smear ( ) Duyarlılık Özgünlük BD ProbeTec ET Referans TB Sonucuyla Karşılaştırmalı Toplam Duyarlılık Smear (+) Duyarlılık Smear ( ) Duyarlılık Özgünlük 90.9% 99.1% 75.2% 97.2% 91.1% 99.1% 75.8% 97.8% Analitik Çalışmalar Kesinlik: Kesinlik panelleri üç alanda test edildi (iki harici ve bir dahili). Her panel iki negatif, iki düşük pozitif (95 CFU/mL) ve iki orta yüksek pozitif (1000 CFU/mL) örneğinden oluşuyordu. Pozitif örnekler, bir negatif NALC-NaOH sediment havuzunun bilinen miktarlardaki Mycobacterium tuberculosis ile güçlendirilmesiyle hazırlandı. Örnekler altı farklı çalışmada tekrarlar halinde test edildi. Her çalışmada pozitif ve negatif test kontrolleri de dahil edildi. Bölgeler veya günler arası herhangi bir farklılık gözlemlenmediğinden, tüm bölgelerden alınan veriler Tablo 6 da birleştirilmiş olarak gösterilmiştir. 11